ES2264700T3

ES2264700T3 - Preparacion de una proteina recombinante en una celula huesped procariotica mediante el uso de un codon mejorado.

Info

Publication number: ES2264700T3
Application number: ES01955373T
Authority: ES
Inventors: Rolf-Gunther Werner; Klaus Bergemann; Friedrich Gotz; Andreas Peschel
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 2000-07-27
Filing date: 2001-07-21
Publication date: 2007-01-16
Anticipated expiration: 2021-07-21
Also published as: DE60119535D1; WO2002010411A3; CN1444655A; CN101525628A; MXPA03000427A; DE60119535T2; CN101525628B; CA2414978A1; EP1307569B1; CA2414978C; EP1307569A2; JP5044085B2; DE10037111A1; WO2002010411A2; JP2004504847A; ATE325880T1; DK1307569T3; AU2001277554A1

Abstract

Procedimiento para expresar un gen de fusión LipP-hGH en Staphylococcus carnosus, en el que un gen de hormona de crecimiento humana (hGH) se fusiona a la secuencia codificante de la señal lip y propéptido de Staphylococcus hyicus (LipP), y que comprende un sitio de corte de enteroquinasa entre LipP y hGH que permite la liberación de la hGH madura con el extremo N correcto, y en el que los codones que codifican el gen hGH que se utilizan en Staphylococcus carnosus con una frecuencia media de menos de 10% son reemplazados por codones con una frecuencia media de al menos 10%, y/o en el que dicha célula huésped de Staphylococcus carnosus se transforma con ARNt, ARNts o un ácido nucleico que los codifica, que codifican codones que se utilizan con una frecuencia media de menos de 10%.

Description

Preparación de una proteína recombinante en una célula huésped procariótica mediante el uso de un codón mejorado.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos ventajosos para preparar proteínas heterólogas en células huésped procarióticas mediante el uso mejorado de un codón y/o la expresión de ARNts que codifican codones que aparecen raramente en dicha célula huésped.

Antecedentes de la invención

Numerosas bacterias, por ejemplo particularmente bacterias Gram-positivas, ya han sido utilizadas como células huésped para la preparación de proteínas recombinantes heterólogas, por ejemplo proteínas secretadas, en un entorno exento de endotoxinas (referencias 8, 9, 19). La bacteria Staphylococcus carnosus (S. carnosus), por ejemplo, que se utiliza en la industria alimentaria para la fermentación de carne y pescado, es una bacteria adecuada para este fin. Está exenta de factores de virulencia y actividades proteolíticas en el material sobrenadante, y es capaz de secretar grandes cantidades de proteína (10). Además de ello, únicamente se secretan pequeñas cantidades de proteínas codificadas por la célula huésped, lo que facilita purificar la proteína producida.

Enzimas bacterianas (7, 4, 17), por ejemplo, ya han sido producidas de modo recombinante y expresadas en S. carnosus. Cepas de S. carnosus recombinantes que expresan antígenos tales como la proteína G de Streptococcus sobre su superficie, son particularmente prometedoras como vacunas vivas (5, 12). Por ejemplo, Liliquist et al, (5) describen la expresión de tres proteínas de unión a fibronectina heterólogas diferentes. Los vectores de expresión utilizados para la expresión comprenden el promotor, la secuencia señal y la secuencia propéptido procedente de una construcción de gen lipasa de S. hyicus, la cual fue optimizada para la expresión en S. carnosus.

La expresión de proteínas heterólogas de eucariotas superiores en S. carnosus también se describió en la técnica anterior. Pschorr et al (20), por ejemplo, han reseñado la expresión del dominio variable de inmunoglobulina (REIv - siglas en inglés) en S. carnosus. El REIv heterólogo se expresó como una proteína de fusión que consiste en una parte amino-terminal del pre-pro-péptido de la lipasa de S. hygicus, una etiqueta de afinidad de hexahistidina, seguida de la secuencia de reconocimiento de la proteasa IgA y REIv. El pre-pro-péptido de S. hygicus se utilizó para la secreción del REIv heterólogo en el sobrenadante del cultivo.

Un inconveniente crucial de numerosos sistemas bacterianos, incluido S. carnosus, es su uso como codones raros, que es muy diferente de la preferencia del codón en genes humanos. Por ejemplo, la presencia de codones raros en E. coli condujo a una expresión retardada y reducida de genes recombinantes (2, 6). En este contexto, Ikehara et al. (21) sintetizaron por vía química un gen de hormona del crecimiento humana (hGH - siglas en inglés) para la expresión en E. coli, en donde los codones de aminoácidos utilizados se seleccionaron principalmente de los encontrados en un gen para el factor de elongación Tu de E. coli.

El documento EP 373 365 describe transfecciones de E. coli con los genes de E. coli que codifican ARNts que reconocen los codones AGG y AGA e incorporan arginina durante la biosíntesis. Los codones para AGA y AGG son codones en E. coli que se utilizan raramente, por norma general,

El problema de la presente invención consiste, por lo tanto, en superar este inconveniente de la técnica anterior y proporcionar un sistema de expresión procariótico con propiedades mejoradas.

Descripción de la invención

El problema se resuelve dentro del alcance de las reivindicaciones y de la memoria descriptiva de la presente invención.

El uso del singular o plural de las reivindicaciones o en la memoria descriptiva no pretende ser limitativo de modo alguno, e incluye también la forma alternativa.

La invención se refiere a un procedimiento para preparar una proteína de fusión LipP-hGH en S. carnosus según se describe con mayor detalle en esta memoria, caracterizado porque se determina el uso del codón de la célula huésped para genes de la célula huésped, en el ácido nucleico que codifica la proteína recombinante heteróloga en la célula huésped codones que raramente aparecen son reemplazados por codones frecuentes, dicha célula huésped se transforma con dicho ácido nucleico que codifica la proteína recombinante y se expresa dicho ácido nucleico recombinante. Con el procedimiento descrito para la expresión de la proteína de fusión LipP-hGH en S. carnosus previsto en esta memoria es posible lograr una tasa de expresión significativamente mejor de las proteínas heterólogas en comparación con el procedimiento conocido de la técnica anterior.

Los procedimientos descritos en esta memoria acuerdo con la invención son también particularmente ventajosos para la expresión de proteínas recombinantes sobre la superficie de procariotas, ya que el anclaje covalente sobre la pared de la célula depende de los extremos C intactos que están ausentes de las proteínas truncadas secretadas, las cuales no se preparan por el procedimiento descrito en esta memoria.

Por heterólogo se quiere dar a entender que dicha proteína en dicha célula huésped procariótica no es nativa, es decir se produce en forma de una proteína peculiar para la célula huésped. "Recombinante" significa producido por métodos moleculares-biológicos. Una proteína recombinante heteróloga puede ser cualquier proteína conocida por una persona experta tal como, por ejemplo, insulina, hGH, tPA, citoquinas tales como, por ejemplo, interleucinas (IL) tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL--12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, interferón (IFN) alfa, IFN beta, IFN gamma, IFN omega o IFN tau, factor de la necrosis de tumores (TNF), TNF alfa y TNF beta, TRAIL; G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 y VEGF. Células huésped procarióticas pueden ser cualesquiera células huésped conocidas por la persona experta, en particular células huésped Gram-positivas y Gram-negativas. Éstas pueden ser, por ejemplo, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces, Proteus mirabilis o, preferiblemente, Staphylococcus tal como, por ejemplo, Staphylococcus carnosus en particular, según está disponible de colecciones públicas, por ejemplo la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania, por ejemplo la cepa TM300 (DSM 4600, 4601 ó 4602).

Dentro del alcance del procedimiento descrito en esta memoria, en primer lugar se analiza el uso de los codones, es decir los tripletes de nucleótidos codificantes, para dicha célula huésped para el mayor número posible de proteínas nativas en la secuencia del gen codificador básica. Las frecuencias de codones de 51 genes se analizaron para el orga-
nismo huésped Staphylococcus carnosus cepa TM300(10) a modo de ejemplo y se muestran en la siguiente Tabla 1:

TABLA 1

1

Se encontró que las secuencias codificadores de Staphylococci, por ejemplo, tienen un muy bajo contenido en G+C de aproximadamente 30%, y se prefieren los codones ricos en A+T. Por lo tanto, de acuerdo con la invención, la producción de hGH se incrementa de dos maneras: (i) intercambiando codones raros en la secuencia del gen codificador por los codones frecuentes (véase también el Ejemplo 1) y/o (ii) expresando ARNts raros (ARNt = ARN de transferencia; véase también el Ejemplo 2).

La presente memoria de patente describe también procedimientos para preparar una proteína recombinante heteróloga, en donde para S. carnosus, tal como se muestra en la Tabla 1, o de una manera similar para cualquier otra célula huésped descrita en esta memoria, algunos o la totalidad de los codones que aparecen raramente son reemplazados por codones frecuentes, por ejemplo de acuerdo con el análisis en la Tabla 1, el codón GAG de Glu es reemplazado por GAA, o los codones CTC, CTG y CTA de Leu son reemplazados por TTA, TTG o CTT.

La presente memoria de patente describe, además, un procedimiento para preparar una proteína recombinante heteróloga en una célula huésped procariótica, caracterizado porque se determina el uso del codón de la célula huésped para los genes de la célula huésped, dicha célula huésped con el ácido nucleico que codifica ARNt o ARNts específicos de codones que aparecen raramente se transforma con dicho ácido nucleico que codifica la proteína recombinante, y se expresa dicho ácido nucleico recombinante (véase también el Ejemplo 2). La persona experta puede determinar los codones raros de la célula huésped analizando los genes o los ADNcs (o por transcripción inversa del ARNm). Esto se ha realizado, por ejemplo, para la célula huésped S. carnosus cepa TM300 (10) en la Tabla 1. El procedimiento descrito en esta memoria incluye la introducción de ARNts o de ácido nucleico que codifica los mismos, para uno o la totalidad de los ARNts raros en la célula huésped. Dado que la célula huésped está equipada con ARNts que son específicos de codones raros, la proteína recombinante heteróloga de acuerdo con la invención se expresa en cantidades mayores que en el caso de procedimientos conocidos de la técnica anterior. Esta propiedad del procedimiento descrito en esta memoria, sorprendentemente ventajosa, se demuestra también en el Ejemplo 2. Se puede producir por sí misma o en unión con la sustitución de codones que son raros por codones frecuentes para la célula huésped en el ácido nucleico que codifica la proteína heteróloga.

Por lo tanto, la presente memoria de patente describe un procedimiento, que se caracteriza porque en el ácido nucleico que codifica la proteína recombinante heteróloga en la célula huésped, los codones que aparecen raramente son reemplazados por codones frecuentes, y dicha célula huésped se transforma con ARNt o ARNts que codifican codones que aparecen raramente y con dicho ácido nucleico que codifica la proteína recombinante.

La presente memoria de patente describe un procedimiento, que se caracteriza porque los codones que se utilizan en la célula huésped con una frecuencia media de menos de 15% son reemplazados por codones con una frecuencia media de al menos 15%; caracterizado preferiblemente porque los codones que se utilizan en la célula huésped con una frecuencia media de 7 a 12% son reemplazados por codones con una frecuencia media de más de 12%; caracterizado lo más preferiblemente porque codones que se utilizan en la célula huésped con una frecuencia media de hasta 7 ó 10% son reemplazados por codones con una frecuencia media de más de 7% o más de 10%. Otra realización preferida descrita en esta memoria es un procedimiento que se caracteriza porque el codón o los codones que se producen lo menos frecuentemente en dicha célula huésped son reemplazados por el codón o los codones que se producen lo más frecuentemente en dicha célula huésped. Una excepción puede ser si dichos codones son absolutamente esenciales para la expresión.

La invención tal como se describe en esta memoria se dirige a un procedimiento preferido de acuerdo con la invención, que se caracteriza porque los codones del ácido nucleico codificante que se utilizan en S. carnosus con una frecuencia media de al menos 10% son reemplazados por codones con una frecuencia media de al menos 10%.

El procedimiento descrito en esta memoria es aplicable a Escherichia coli, según está disponible de colecciones públicas, por ejemplo la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania, por ejemplo la cepa K12 JM107 (DSM 3950) de E. coli. El procedimiento descrito en esta memoria es también aplicable a una célula huésped del género Staphylococcus, preferiblemente a Staphylococcus carnosus (véanse también los Ejemplos 1 y 2).

El procedimiento descrito en esta memoria es también aplicable a la producción de una proteína recombinante tal como una proteína de anticuerpo. Por proteína de anticuerpo se quiere dar también a entender un fragmento, por ejemplo un fragmento Fab (en inglés, "Fragment antigen-binding = Fab"), un fragmento F(ab')_{2} y un fragmento Fv (en inglés: "fragment variable" = fragmento de la parte variable) o un Fv de cadena sencilla (scFv), minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos. La proteína recombinante también puede ser, por ejemplo, insulina, activador de plasminógeno del tejido (tPa), o una proteína humana, una hormona de crecimiento tal como una hormona del crecimiento humana (hGH, véanse los Ejemplos 1 y 2).

Otro procedimiento descrito en esta memoria se caracteriza porque los codones ricos en G o C son reemplazados por codones que contienen A o T. Esto significa que codones que contienen más G o C son reemplazados por codones que ahora contienen, por ejemplo, una A o una T en lugar de una G o C; no quiere decir que los codones tengan que contener ahora exclusivamente G o C (véanse las realizaciones más preferidas en lo que sigue).

En el procedimiento descrito en esta memoria todos los codones raros encontrados pueden ser reemplazados por codones frecuentes (véase, por ejemplo, la Tabla 1) y no solamente los especificados en las realizaciones preferidas dadas aquí en lo que sigue.

Otro procedimiento descrito en esta memoria se caracteriza porque el codón GCC es reemplazado por GCA.

Otro procedimiento descrito en esta memoria se caracteriza porque el codón TGC es reemplazado por TGT.

Otro procedimiento descrito en esta memoria se caracteriza porque el codón GAC es reemplazado por GAT.

Otro procedimiento descrito en esta memoria se caracteriza porque el codón GAG es reemplazado por GAA.

Otro procedimiento descrito en esta memoria se caracteriza porque el codón TTC es reemplazado por TTT.

Otro procedimiento descrito en esta memoria se caracteriza porque el codón GGG es reemplazado por GGT.

Otro procedimiento descrito en esta memoria se caracteriza porque el codón CAC es reemplazado por CAT.

Otro procedimiento descrito en esta memoria se caracteriza porque el codón ATA es reemplazado por ATT.

Otro procedimiento descrito en esta memoria se caracteriza porque el codón AAG es reemplazado por AAA.

Otro procedimiento descrito en esta memoria se caracteriza porque el codón CTC es reemplazado por TTA.

Otro procedimiento descrito en esta memoria se caracteriza porque el codón AAC es reemplazado por AAT.

Otro procedimiento descrito en esta memoria se caracteriza porque el codón CCC es reemplazado por CAA.

Otro procedimiento descrito en esta memoria se caracteriza porque el codón CAG es reemplazado por CAA.

Otro procedimiento descrito en esta memoria se caracteriza porque el codón CGG es reemplazado por CGT.

Otro procedimiento descrito en esta memoria se caracteriza porque el codón TCG es reemplazado por TCA.

Otro procedimiento descrito en esta memoria se caracteriza porque el codón ACC es reemplazado por ACA.

Otro procedimiento descrito en esta memoria se caracteriza porque el codón GTC es reemplazado por GTT.

Otro procedimiento descrito en esta memoria se caracteriza porque el codón TAC es reemplazado por TAT.

Otro procedimiento descrito en esta memoria se caracteriza porque el codón TGA es reemplazado por TAA.

Todavía otro procedimiento descrito en esta memoria se caracteriza porque la célula huésped se transforma con el ácido nucleico que codifica ARNt de AGG o ARNt de AGA y con dicho ácido nucleico que codifica la proteína recombinante.

La presente invención se refiere, además, a una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión lipP-hGH que comprende la secuencia de SEQ ID NO:3.

Ejemplo 1

Construcción de un gen hGH sintético con el uso de un codón específico para S. carnosus

Como un ejemplo de una proteína, hormona de crecimiento humana (hGH) se expresó en la cepa TM300 de S. carnosus.

La comparación del uso del codón de la hGH madura con el mostrado en S. carnosus demostró que 51 de los codones de la hGH madura, que representan el 27% del número total de codones, constituyen solamente el 7% o menos de la frecuencia de codones de S. carnosus (Tabla 2). Un sitio de corte de enteroquinasa se introdujo en el extremo 5' de la secuencia de ADN de hGH madura, y la hGH se sintetizó con el uso de un codón específico para S. carnosus. Los codones en el gen sintético se utilizaron en aproximadamente la misma frecuencia que en el gen de S. carnosus. No se utilizaron codones que fueron utilizados por S. carnosus en una frecuencia de menos de 10%, aparte de los que se necesitaban para introducir los sitios de corte por restricción (véase la Tabla 2).

TABLA 2 Número de codones en ADNc de hGH y en el ADN de hGH sintético de acuerdo con la invención

2

	^{1}número de codones en ADNc de hGH
	^{2}número en ADN de hGH sintético (de acuerdo con la invención).

La secuencia de ADN de hGH sintética se sintetizó a partir de oligonucleótidos solapantes que se hibridaron y ligaron in vitro. El fragmento de ADN resultante se clonó en el plásmido pSL1190 de E. coli (3), se verificó por secuenciación y se insertó en la casete de expresión de hGH con el fin de reemplazar el ADNc de hGH entre los sitios de corte NsiI y PstI (figura 1). La nueva casete de expresión se aisló en forma de un fragmento BglII-ClaI, se clonó en los sitios de corte BamHI y NarI compatibles del vector de expresión pTX15 de Staphylococcus y se transformó en TM300 de S. carnosus por transformación de protoplastos. En el vector de expresión obtenido, el gen de fusión lip-hGH se expresó bajo el control del promotor xyl de pTX15. Se obtuvo la expresión, después de la inactivación de XylR, el represor del promotor xyl, por la adición de xilosa al 0,5% al medio nutricio. La clonación y secuenciación in vitro se llevaron a cabo por métodos convencionales (1). La expresión del gen hGH se realizó como una fusión con la señal lip y el propéptido procedente de Staphylococcus hyicus, que contiene un sitio de corte de enteroquinasa que permite la liberación de la hGH madura con el extremo N correcto procedente de la proteína de fusión (figura 1). El vector de expresión pTX-LipP-hGH4 resultante es idéntico al vector pTX-LipP-hGH2, aparte del uso del codón de la hGH madura. Las cepas de S. carnosus que contienen uno de los plásmidos se cultivaron en un medio LB modificado (extracto de haba de soja al 1%, extracto de levadura al 0,5%, NaCl al 0,5%) suplementado con xilosa al 0,5%, para activar el promotor xyl de los vectores de expresión. El uso del ADN de hGH mejorado tiene un profundo efecto sobre la eficacia de la producción de hGH en S. carnosus. El rendimiento en Lip-hGH se mejoró al menos dos veces, y se redujo significativamente la cantidad de proteína Lip-hGH acortada (figura 2, pistas 2 y 3). Las proteínas Lip-hGH acortadas no son el resultado de actividades proteolíticas extracelulares, ya que la proteína Lip-hGH es estable en el sobrenadante de S. carnosus. La presencia reducida de las proteínas acortadas en el sobrenadante de S. carnosus (pTX-LipP-hGH4) demuestra que hGH es traducida más rápidamente por la secuencia de ADN utilizada y, así, da a las proteasas intracelulares una menor oportunidad para cortar la proteína antes de que sea secretada fuera de la membrana citoplásmica.

Ejemplo 2

Coexpresión de ARN-ts específicos para codones raros en ADNc de hGH

El codón AGG de arginina es extremadamente raro en genes de S. carnosus, ya que se utiliza en únicamente el 0,8% de los codones de arginina. Los correspondientes genes de ARNt en S. carnosus no han sido todavía identificados. Por lo tanto, los autores de la invención expresaron ARNts de E. coli para el codón AGG en S. carnosus. Los genes de E. coli argU y argW, que codifican los ARNts para los codones AGG/AGA y AGG, han sido clonados con sus promotores y terminadores naturales en los plásmidos pUBS520 o pSB101 (2, 16). Los fragmentos se aislaron en forma de fragmentos SalI-SpHI (argU) y XmaI-EcoRI (argW) y se clonaron en los correspondientes sitios de corte por restricción del vector lanzadera (de transferencia) pRB572 (4). Los plásmidos resultantes, pRBargU y pRBargW, se transformaron en S. carnosus (pTX-LipP-hGH2) que expresan ADNc de hGH.

Los patrones de proteínas en el sobrenadante de las cepas de S. carnosus obtenidos son equiparables a S. carnosus (pTX-LipP-hGH4) con una producción incrementada de la proteína Lip-hGH y menos proteínas truncadas. Por lo tanto, la expresión de ARNts raros de acuerdo con la invención tiene ventajosas propiedades para la preparación de proteínas humanas en S. carnosus, por ejemplo.

Leyendas relacionadas con las figuras

Fig. 1. Expresión de la fusión de Lip-hGH en los plásmidos pTX-LipP-hGH2 o pTX-LipP-hGH4. La fusión de los genes está constituida por las secuencias de ADN que codifican el péptido señal (SP) y el propéptido (PP) procedente de la lipasa de Staphylococcus hyicus y la parte de hGH de la proteína madura (en negro) y se transcribe por el promotor xyl (mostrado como un triángulo en gris). El ADNc de hGH o la secuencia de ADN sintética se insertó entre los sitios de corte NsiI y PstI. El extremo 5' de la secuencia de ADN de hGH se modificó de modo que codificara un sitio de corte de la enteroquinasa "DDDDK", seguido por la secuencia de hGH madura, tal como se muestra por debajo del gen.

Fig. 2. Detección de las proteínas de fusión Lip-hGH en el sobrenadante de S. carnosus. Cantidades iguales del sobrenadante se separaron por SDS-PAGE sobre geles de Tris-glicina que contenían 15% de acrilamida y luego se tiñeron con azul Coomassie. Las pistas 1-5 contienen sobrenadantes de cepas de S. carnosus que contienen el vector de control vacío pTX16 (15), un derivado de pTX15 (pista 1), los plásmidos pTX-LipP-

-hGH4 con el gen hGH mejorado (pista 2), pTX-LipP-hGH2 con el ADNc de hGH (pista 3), pTX-LipP-hGH2 más pRBargU (pista 4) y pTX-LipP-hGH2 más pRBargW (pista 5). Las proteínas convencionales y sus pesos moleculares (kDa) se muestran en el lado izquierdo. Los sobrenadantes se concentraron por precipitación con ácido tricloroacético. Se llevó a cabo SDS-PAGE por métodos convencionales de la técnica anterior.

Fig. 3. Secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la hGH de acuerdo con la invención (LipPhGH4, SEQ: ID-Nº 3)

Los sitios de corte por restricción relevantes están subrayados una vez y la secuencia de Shine-Dalgarno está subrayada dos veces. La peptidasa señal 1 y el sitio de escisión de la enteroquinasa están subrayados con una línea discontinua. Únicamente las regiones entre el sitio BglII y NdeI y entre el sitio NsiI y el sitio PstI han sido producidas sintéticamente y optimizadas. El resto consiste en la secuencia original de la señal y el propéptido de la lipasa procedente de Staphylococcus hyicus.

Bibliografía

1. Ausubel, F. M., R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith, y K. Struhl. 1990. Current protocols in molecular biology. John Wiley and Sons, Inc., Nueva York, NY.

2. Brinkmann, U., R. E. Mattes, y P. Buckel. 1989. High-level expression of recombinant genes in Eschericia coli is dependent on the availability of the dnaY gene product. Gene. 85:109-114.

3. Brosius, J. 1989. Superpolylinkers in cloning and expression vectors. DNA. 8:759-777.

4. Brückner, R. 1992. A series of shuttle vectors for Bacillus subtilis and Escherichia coli. Gene. 122:187-192.

5. Cano, F., S. Liljeqvist, T. N. Nguyen, P. Samuelson, J. Y. Bonnefoy, S. Stahl, y A. Robert. 1999. A surface-displayed cholera toxin B peptide improves antibody response using food-grade staphylococci for mucosal subunit vaccine delivery. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 25:289-298.

6. Del Tito, B. J., J. M. Ward, C. J. L. Hodgson, C. Gershater, H. Edwards, L. A. Wysocki, F. A. Watson, G. Sathe, and J. F. Kane. 1995. Effects of a minor isoleucyl tRNA on heterologous protein translation in Escherichia coli. J. Bacteriol. 177:7086-7091.

7. Demleitner, G., y F. Götz. 1994. Evidence for importance of the Staphylococcus hyicus lipase pro-peptide in lipase secretion, stability and activity. FEMS Microbiol. Lett. 121:189-198.

8. Gilbert, M., R. Morosoli, F. Shareck, y D. Kluepfel. 1995. Production and secretion of proteins by streptomycetes. Crit. Rev. Biotechnol. 15:13-39.

9. Götz, F. 1990. Development of a cloning system in Staphylococcus carnosus: Different processing of the Staphylococcus hyicus lipase in Staphylococcus carnosus and Staphylococcus hyicus, págs. 273-281. En R. P. Novick (ed.), Molecular biology of the staphylococci. VCH Publisher Inc., Nueva York, NY.

10. Götz, F. 1990. Staphylococcus carnosus: a new host organism for gene cloning and protein production. J. Appl. Bacteriol. Symp. Supl.:49S-53S.

11. Götz, F., y B. Schumacher. 1987. Improvements of protoplast transformation in Staphylococcus carnosus. FEMS Microbiol. Lett. 40:285-288.

12. Liljeqvist, S., F. Cano, T. N. Nguyen, M. Uhlen, A. Robert, y S. Stahl. 1999. Surface display of functional fibronectin-binding domains on Staphylococcus carnosus. FEBS Lett. 446:299-304.

13. Makrides, S. C. 1996. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Reviews. 60:512-538.

14. Nikoleit, K., R. Rosenstein, H. M. Verheij, y F. Götz. 1995. Comparative biochemical and molecular analysis of the Staphylococcus hyicus, Staphylococcus aureus and a hybrid lipase. Eur. J. Biochem. 228:732-738.

15. Peschel, A., B. Ottenwälder, y F. Götz. 1996. Inducible production and cellular location of the epidermin biosynthetic enzyme EpiB using an improved staphylococcal expression system. FEMS Microbiol. Lett. 137:279-284.

16. Schenk, P. M., S. Baumann, R. Mattes, y H. H. Steinbiss. 1995. Improved high level expression system for eucaryotic genes in Escherichia coli using T7 RNA polymerase and rare Arg-tRNAs.

17. Thumm, G., y F. Götz. 1997. Studies on prolysostaphin processing and characterization of the lysostaphin immunity factor (Lif) of Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus. Mol. Microbiol. 23:1251-1265.

18. Vance, M. L., y N. Mauras. 1999. Growth hormone therapy in adults and children. New Engl. J. Med. 341:1206-1216.

19. Wong, S. L. 1995. Advances in the use of Bacillus subtilis for the expression and secretion of heterologous proteins. Curr. Opin. Biotechnol. 6:517-522.

20. Pschorr, J., Bieseler B. Y Fritz H.-J. 1994. Production of the immunoglobulin variable domain REIv via a fusion protein synthesized and secreted by Staphylococcus carnosus. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 375:271-280.

21. Ikrhara M., Ohtsuka T., Tokunaga Y., et al. 1984. Síntesis of a gene for human growth hormone and its expression in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5956-5960.

<110> Boehringer Ingelheim International GmbH

\vskip0.400000\baselineskip

<120>

\vskip0.400000\baselineskip

<130>

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1 (SEQ:ID-NO.1)

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1383

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

3

\hskip1.2cm

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2 (SEQ:ID-NO.2)

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 448

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

5

6

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3 (SEQ:ID-NO.3)

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1383

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Homo sapiens flanqueada por una secuencia vectorial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

7

Claims

1. Procedimiento para expresar un gen de fusión LipP-hGH en Staphylococcus carnosus, en el que un gen de hormona de crecimiento humana (hGH) se fusiona a la secuencia codificante de la señal lip y propéptido de Staphylococcus hyicus (LipP), y que comprende un sitio de corte de enteroquinasa entre LipP y hGH que permite la liberación de la hGH madura con el extremo N correcto, y en el que los codones que codifican el gen hGH que se utilizan en Staphylococcus carnosus con una frecuencia media de menos de 10% son reemplazados por codones con una frecuencia media de al menos 10%, y/o en el que dicha célula huésped de Staphylococcus carnosus se transforma con ARNt, ARNts o un ácido nucleico que los codifica, que codifican codones que se utilizan con una frecuencia media de menos de 10%.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque los codones de hGH ricos en G o C son reemplazados por codones que contienen A o T.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque Staphylococcus carnosus se transforma con el ácido nucleico que codifica ARNt de AGG o ARNt de AGA.

4. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque Staphylococcus carnosus se transforma con el ácido nucleico de los genes argU y argM de E. coli, que codifican los ARNts para los codones AGG/AGA y AGG.

5. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la proteína de fusión LipP-hGH es codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de SEQ:ID NO 3.

6. Molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión LipP-hgG que comprende la secuencia de SEQ:ID NO 3.