JP5044085B2 - 原核宿主細胞における組換えタンパク質の生産 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、宿主細胞における改良されたコドンの使用及び／又は希に存在するコドン（rarely occurring codon）をコードするｔＲＮＡの発現による、原核宿主細胞中で異種組換えタンパク質を生産するための有利な方法に関する。多数の細菌、特にグラム陽性細菌が、例えば異種組換えタンパク質、例えば分泌タンパク質を菌体内毒素を有しない環境下で生産するための宿主細胞として使用されてきた（参考文献８、９、１９）。例えば、肉及び魚の発酵用に食品工業で使用されている細菌スタフィロコッカス・カルノサス（Ｓ．カルノサス）（Staphylococcus carnosus）は、この目的に適した細菌である。この細菌は、その上清中に毒性因子及びタンパク質分解活性を有さず、多量のタンパク質を分泌することができる（１０）。更に、宿主細胞によりコードされて分泌されるタンパク質の量は少量であり、このことが生成タンパク質の精製をより容易にする。細菌酵素（７、４、１７）が例えばＳ．カルノサス中で組換え的に生成されかつ発現させられてきている。例えばストレプトコッカス（Streptococcus）タンパク質Ｇ等の抗原をその表面上に発現する組換えＳ．カルノサス株は、生ワクチンとして特に有望である（５、１２）。
多くの細菌系の１つの重大な不利益は、当該細菌系がヒト遺伝子におけるコドン優先度（codon preference）とは非常に異なる、希に存在するコドン（rare codon）を使用することである。大腸菌（E. coli）中の希に存在するコドンの存在は、組換え遺伝子の遅延した又は減少した発現を導いた（２、６）。それゆえ、本発明の課題は、先行技術の不利益を克服すること及び改善された性質を有する原核生物発現系を提供することである。
【０００２】
発明の詳細な説明
前述の課題は、本願の特許請求の範囲及び発明の詳細な説明の範囲内で解決される。
特許請求の範囲又は発明の詳細な説明における単数形又は複数形の使用は、どんな場合であっても本発明を限定することを意図するものではなく、本発明は代替の形態をも含んでいる。
本発明は、原核宿主細胞中で異種組換えタンパク質を生産する方法であって、宿主細胞遺伝子に対する宿主細胞によるコドンの使用を決定し、宿主細胞内で異種組換えタンパク質をコードする核酸配列中にある宿主細胞中にまれに存在するコドンを頻繁に存在するコドン（frequent codon）で置換し、組換えタンパク質をコードする核酸で宿主細胞を形質転換し、組換え核酸を発現させることを特徴とする方法に関する。本発明の方法を用いると、従来技術から既知の方法と比較して、有意に良好な異種タンパク質の発現速度を達成することができる。本発明の方法は、原核生物の表面に組換えタンパク質を発現させるのに特に有利である。なぜなら、原核細胞の細胞壁への共有結合性固着（covalent anchoring）は無傷のＣ末端に依存するところ、無傷のＣ末端が存在せず分泌性の切断タンパク質が本発明の方法では生産されないからである。
【０００３】
「異種」とは、原核宿主細胞中のタンパク質が天然タンパク質ではないこと、すなわち当該タンパク質が当該宿主細胞に特有のタンパク質として存在していることを意味する。「組換え」とは、分子生物学的方法により生産されることを意味する。異種組換えタンパク質は、当業者に既知の全てのタンパク質であってよく、例えば、インシュリン、ｈＧＨ、ｔＰＡ、サイトカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、インターフェロン（ＩＦＮ）α、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮΩ、ＩＦＮτ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＴＲＡＩＬ；Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１及びＶＥＧＦである。原核宿主細胞は、当業者に既知の全ての宿主細胞であってよく、特にグラム陽性及びグラム陰性の宿主細胞である。例えば、大腸菌（Escherichia coli）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、ストレプトミセス（Streptomyces）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、好ましくはスタフィロコッカス（Staphylococcus）、例えばスタフィロコッカス・カルノサス（Staphylococcus carnosus）、特に公的収集機関、例えば the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germanyから入手可能なもの例えば、ＴＭ３００株（ＤＳＭ ４６００、４６０１又は４６０２）である。
本発明の方法の範囲内において、最初に、宿主細胞の基本コーディング遺伝子配列中のできるだけ多くの天然タンパク質について、コドン、すなわちコーディングヌクレオチドトリプレットの使用を分析する。例示として、宿主生物スタフィロコッカス・カルノサスＴＭ３００株（１０）について５１遺伝子のコドン頻度を分析した。分析結果を下記表１に示す。
【０００４】
表１
【０００５】
例えば、ブトウ球菌（Staphylococci）のコーディング配列は約３０％という非常に低いＧ＋Ｃ含量を有し、Ａ＋Ｔに富むコドンが好ましいことが見いだされた。それゆえ、本発明にしたがう２つの方法により、組換えタンパク質、例えばｈＧＨの生産量が増加する。（ｉ）コーディング遺伝子配列中の希に存在するコドンを頻繁に存在するコドンで交換すること（実施例１も参照のこと）及び／又は（ｉｉ）希に存在するｔＲＮＡを発現させること（実施例２も参照のこと）。
それゆえ本発明は、異種組換えタンパク質を生産する方法であって、Ｓ．カルノサスについては表１に示されるように、本発明にしたがうその他全ての宿主細胞についても同様に、希に存在するコドンの一部又は全部を頻繁に存在するコドンで置換する、例えば、表１に示される分析結果にしたがいＧｌｕコドンＧＡＧをＧＡＡで置換する、又は、ＬｅｕコドンＣＴＣ、ＣＴＧ及びＣＴＡをＴＴＡ、ＴＴＧ又はＣＴＴで置換することを特徴とする方法に関する。
それゆえ本発明は、異種組換えタンパク質を原核宿主細胞中で生産する方法であって、宿主細胞遺伝子に対する宿主細胞によるコドンの使用を決定し、希に存在するコドンに特異的なｔＲＮＡをコードする核酸を有する宿主細胞を組換えタンパク質をコードする核酸で形質転換し、組換え核酸を発現させることを特徴とする方法（実施例２も参照）に関する。当業者は、遺伝子又はｃＤＮＡを分析することにより（又はｍＲＮＡを逆転写することにより）、宿主細胞の希に存在するコドンを決定することができる。例えば表１に示される宿主細胞Ｓ．カルノサスＴＭ３００株（１０）について決定を行った。本発明は、宿主細胞中の希に存在するｔＲＮＡの１つ〜全てに対し、ｔＲＮＡ又はこれをコードする核酸を導入することを含む。前記の宿主細胞は希に存在するコドンに特異的なｔＲＮＡを有しているので、本発明にしたがう異種組換えタンパク質は従来技術の既知の方法よりも大量に発現する。この驚くべき本発明の有利な特性は実施例２においても示される。大量の発現は、前記の方法単独又は異種タンパク質をコードする核酸中の、宿主細胞に対しては希に存在するコドンを頻繁に存在するコドンで置換することと組み合わせることにより起こるだろう。
【０００６】
それゆえ本発明は、宿主細胞中の異種組換えタンパク質をコードする核酸において、希に存在するコドンを頻繁に存在するコドンにより置換し、かつ、宿主細胞を希に存在するコドンをコードするｔＲＮＡ及び組換えタンパク質をコードする核酸で形質転換することを特徴とする好ましい方法を含んでいる。
本発明は、宿主細胞中で使用されかつ１５％未満の平均頻度を有するコドンを少なくとも１５％の平均頻度を有するコドンで置換することを特徴とする好ましい方法、好ましくは宿主細胞中で使用されかつ７〜１２％の平均頻度を有するコドンを１２％をこえる平均頻度を有するコドンで置換することを特徴とする方法、特に好ましくは宿主細胞中で使用されかつ７〜１０％の平均頻度を有するコドンを７％をこえる又は１０％をこえる平均頻度を有するコドンで置換することを特徴とする方法を含んでいる。別の好ましい態様は、宿主細胞中に最も低い頻度で存在するコドンを当該宿主細胞中で最も頻繁に存在するコドンで置換することを特徴とする好ましい方法である。前記の最も低い頻度で存在するコドンが発現につき絶対的に必須である場合、当該コドンの置換は除外されるだろう。
更に本発明は、宿主細胞中で使用されかつ１０％未満の平均頻度を有するコーディング核酸コドンを少なくとも１０％の平均頻度を有するコドンで置換することを特徴とする好ましい方法を含んでいる。
更に本発明は、宿主細胞が、公的な収集機関、例えばthe Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germanyから入手可能な大腸菌、例えば大腸菌Ｋ１２ ＪＭ１０７株（ＤＳＭ３９５０）であることを特徴とする好ましい方法を含んでいる。
更に本発明は、宿主細胞がスタフィロコッカス属から選ばれる宿主細胞であることを特徴とする好ましい方法を含んでいる。
更に本発明は、宿主細胞がスタフィロコッカス・カルノサスであることを特徴とする方法（実施例１及び２参照）を含んでいる。
本発明の好ましい方法において、組換えタンパク質は抗体タンパク質である。抗体タンパク質とは、フラグメント、例えば、Ｆａｂフラグメント（抗原結合性フラグメント）、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆｖフラグメント（可変部分のフラグメント）又は単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ミニボディ（minibody）、ジアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）及びテトラボディ（tetrabody）をも意味する。
【０００７】
本発明の好ましい方法において、組換えタンパク質はインシュリンである。
本発明の好ましい方法において、組換えタンパク質は組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰａ）である。
本発明の好ましい方法において、組換えタンパク質はヒトタンパク質である。
本発明の好ましい方法において、組換えタンパク質は成長ホルモンである。
本発明の特に好ましい態様において、組換えタンパク質はヒト成長ホルモン（ｈＧＨ、実施例１及び２参照）である。
本発明の別の好ましい方法は、Ｇ又はＣに富むコドンをＡ又はＴを含むコドンで置換することを特徴とする。これは、Ｇ又はＣをより含むコドンをＧ又はＣの代わりにＡ又はＴを含むコドンで置換することを意味し、コドンがＧ又はＣを独占的に含んでいなければならないということを意味するものではない（後述する本発明の最も好ましい態様を参照）。
本発明の方法では、後述する好ましい態様における特定のコドンだけでなく、希に存在することが見いだされたコドンの全てを頻繁に存在するコドンで置換してもよい（例えば、表１を参照）。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＧＣＣがＧＣＡにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＴＧＣがＴＧＴにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＧＡＣがＧＡＴにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＧＡＧがＧＡＡにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＴＴＣがＴＴＴにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＧＧＧがＧＧＴにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＣＡＣがＣＡＴにより置換されていることを特徴とする。
【０００８】
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＡＴＡがＡＴＴにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＡＡＧがＡＡＡにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＣＴＣがＴＴＡにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＡＡＣがＡＡＴにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＣＣＣがＣＣＡにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＣＡＧがＣＡＡにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＣＧＧがＣＧＴにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＴＣＧがＴＣＡにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＡＣＣがＡＣＡにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＧＴＣがＧＴＴにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＴＡＣがＴＡＴにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＴＧＡがＴＡＡにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の好ましい方法は、宿主細胞をＡＧＧ−ｔＲＮＡ又はＡＧＡ−ｔＲＮＡをコードする核酸及び組換えタンパク質をコードする核酸で形質転換することを特徴とする。
【０００９】
更に本発明は、組換え異種タンパク質をコードする核酸分子であって、宿主細胞中に希に存在する少なくとも１つのコドンが、当該宿主細胞中に頻繁に存在する少なくとも１つのコドンにより置換されていることを特徴とする核酸分子を含んでいる。例示を目的として、表１で宿主細胞Ｓ．カルノサスについてのコドンを分析した。本発明は、核酸分子であって、Ｓ．カルノサスについて又は本発明のその他全ての宿主細胞についても同様に、希に存在するコドンの一部又は全部が頻繁に存在するコドンにより置換されている、例えばＧｌｕコドンＧＡＧがＧＡＡにより置換されている、ＬｅｕコドンＣＴＣ、ＣＴＧ及びＣＴＡがＴＴＡ、ＴＴＧ又はＣＴＴにより置換されていることを特徴とする核酸分子を含んでいる。
本発明は、組換え異種タンパク質をコードする核酸分子であって、宿主細胞中で使用されかつ１５％未満の平均頻度を有するコドンが少なくとも１５％の平均頻度を有するコドンにより置換されていることを特徴とする核酸分子、好ましくは宿主細胞中で使用されかつ７〜１２％の平均頻度を有するコドンが１２％をこえる平均頻度を有するコドンにより置換されていることを特徴とする核酸分子、特に好ましくは宿主細胞中で使用されかつ７又は１０％の平均頻度を有するコドンが７％をこえる又は１０％をこえる平均頻度を有するコドンにより置換されていることを特徴とする核酸分子を含んでいる。別の好ましい態様は、組換え異種タンパク質をコードする核酸分子であって、宿主細胞中に最も低い頻度で存在するコドンが当該宿主細胞中で最も頻繁に存在するコドンにより置換されていることを特徴とする核酸分子である。
それゆえ本発明は、好ましい態様において、宿主細胞中で使用されかつ１０％未満の平均頻度を有するコドンが少なくとも１０％の平均頻度を有するコドンにより置換されていることを特徴とする核酸分子に関する。
更に本発明は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードすることを特徴とする核酸分子に関する。
【００１０】
更に本発明は、以下の配列：
により示される配列若しくはその部分配列、ストリンジェントな条件下で前記配列とハイブリダイズすることができる核酸、前記配列の対立遺伝子変異体（allelic variant）若しくは機能変異体又は縮重コードに基づく核酸変異体からなる群より選ばれるヌクレオチドを含むことを特徴とする核酸分子に関する。本発明の範囲内にあるＮは当業者に既知の全てのヌクレオチドを意味する。
【００１１】
更に本発明は、配列番号１：
のヌクレオチド配列によりコードされる核酸分子に関する。
前記の本発明の核酸分子は、配列番号２：
の本発明のアミノ酸配列を有するｈＧＨをコードしている。
【００１２】
更に本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターに関する。
本発明の別の重要な態様は、本発明の核酸分子又は本発明のベクターを含む宿主細胞である。
本発明の別の重要な態様は、宿主細胞であって、当該宿主細胞中に希に存在するコドンをコードする１以上のｔＲＮＡ分子を含む宿主細胞である。
スタフィロコッカス属の宿主細胞が好ましい。スタフィロコッカス・カルノサス、例えばＴＭ３００株（ＤＳＭ４６００、４６０１又は４６０２）が特に好ましい。
以下の実施例は本発明の理解を容易にすることを意図するものであり、どんな場合であっても本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではない。
【００１３】
実施例１：Ｓ．カルノサス特異的コドンを使用した合成ｈＧＨ遺伝子の構築
タンパク質の例として、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をＳ．カルノサスＴＭ３００株中で発現させた。
成熟ｈＧＨのコドン使用とＳ．カルノサスにおいて示されるコドン使用との比較は、成熟ｈＧＨのコドンのうちの５１コドン（全コドン数の２７％を表す）が、Ｓ．カルノサスでのコドン頻度が７％以下のコドンを構成することを示している（表２）。エンテロキナーゼ切断部位を成熟ｈＧＨのＤＮＡ配列の５’末端に導入して、Ｓ．カルノサス特異的コドンを用いてｈＧＨを合成した。合成遺伝子中のコドンは、Ｓ．カルノサス遺伝子中における頻度とほぼ同じ頻度で使用した。Ｓ．カルノサスより１０％未満の頻度で使用されるコドンについては、制限切断部位を導入するために必要なものを除いて使用しなかった（表２を参照）。
【００１４】
表２
ｈＧＨ ｃＤＮＡ及び本発明の合成ｈＧＨ ＤＮＡにおけるコドンの数
１ ｈＧＨ ｃＤＮＡ中のコドンの数
２ 合成ｈＧＨ ＤＮＡ（本発明）中のコドンの数
【００１５】
合成ｈＧＨ ＤＮＡ配列配列は、インビトロでハイブリダイズ及び結合したオリゴヌクレオチドをオーバーラップさせることにより合成した。得られたＤＮＡフラグメントを大腸菌プラスミドｐＳＬ１１９０（３）へクローニングし、配列決定により検証し、ｈＧＨ発現カセット中に挿入して、ＮｓｉＩとＰｓｔＩ切断部位との間のｈＧＨ ｃＤＮＡを置き換えた（図１）。新規な発現カセットをＢｇｌＩＩ−ＣｌａＩフラグメントとして単離し、ブトウ球菌（Staphylococci）発現ベクターｐＴＸ１５のコンパチブルなＢａｍＨＩ及びＮａｒＩ切断部位へクローニングし、プロトプラスト形質転換によりＳ．カルノサス ＴＭ３００を形質転換した。得られた発現ベクターにおいて、ｌｉｐ−ｈＧＨ融合遺伝子はｐＴＸ１５のｘｙｌプロモーターの制御下で発現した。０．５％キシロースを栄養培地へ添加することによりｘｙｌプロモーターのリプレッサーであるＸｙｌＲを不活性化した後、発現を得た。インビトロでのクローニング及び配列決定は標準的な方法（１）により行った。ｈＧＨ遺伝子の発現は、正確なＮ末端を有する成熟ｈＧＨを融合タンパク質から遊離させることを許容するエンテロキナーゼ切断部位を含むスタフィロコッカス・ハイカス（Staphylococcus hyicus）由来のｌｉｐ−シグナル及びプロペプチドとの融合物として行った（図１）。得られた発現ベクターｐＴＸ−ＬｉｐＰ−ｈＧＨ４は、成熟ｈＧＨのコドン使用以外はベクターｐＴＸ−ＬｉｐＰ−ｈＧＨ２と同一である。前記プラスミドのうちの１つを含むＳ．カルノサス株を、発現ベクターのｘｙｌプロモーターを活性化するために０．５％キシロースを補充した改変ＬＢ培地（１％ダイズ抽出物、０．５％酵母抽出物、０．５％ ＮａＣｌ）中で培養した。改良ｈＧＨ ＤＮＡの使用は、Ｓ．カルノサスにおけるｈＧＨ産生効率に対し顕著な効果を有した。Ｌｉｐ−ｈＧＨ収率は少なくとも２倍に改善し、切断Ｌｉｐ−ｈＧＨタンパク質の量は有意に減少した（図２、トレース２及び３）。切断Ｌｉｐ−ｈＧＨタンパク質は、細胞外タンパク質分解活性の結果物ではない。なぜなら、Ｌｉｐ−ｈＧＨはＳ．カルノサスの上清中で安定であるからである。Ｓ．カルノサス（ｐＴＸ−ＬｉｐＰ−ｈＧＨ４）の上清中における切断タンパク質の存在の減少は、ｈＧＨが最適化ＤＮＡ配列により早く翻訳されるため、細胞膜を通して分泌される前に細胞内プロテアーゼが当該タンパク質を切断する機会が少なくなったことを示している。
【００１６】
実施例２：ｈＧＨ ｃＤＮＡ中に希に存在するコドンに特異的なｔ−ＲＮＡの同時発現
アルギニンコドンＡＧＧは、Ｓ．カルノサス遺伝子中に極めて希に存在し、アルギニンコドンのわずか０．８％において使用される。対応するｔＲＮＡ遺伝子はＳ．カルノサス中で同定されていない。それゆえ、本発明者等はＡＧＧコドンに対する大腸菌ｔＲＮＡをＳ．カルノサス中で発現させた。コドンＡＧＧ／ＡＧＡ及びＡＧＧに対するｔＲＮＡをコードする大腸菌遺伝子ａｒｇＵ及びａｒｇＷを、その天然のプロモーター及びターミネーターと共に、プラスミドｐＵＢＳ５２０又はｐＳＢ１０１（２、１６）へクローニングした。フラグメントをＳａｌＩ−ＳｐＨＩフラグメント（ａｒｇＵ）及びＸｍａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント（ａｒｇＷ）として単離し、シャトル（転移）ベクターｐＲＢ５７２（４）の対応の制限切断部位へクローニングした。得られたプラスミドｐＲＢａｒｇＵ及びｐＲＢａｒｇＷで、ｈＧＨ ｃＤＮＡを発現するＳ．カルノサス（ｐＴＸ−ＬｉｐＰ−ｈＧＨ２）を形質転換した。
得られたＳ．カルノサス株の上清におけるタンパク質パターンは、Ｓ．カルノサス（ｐＴＸ−ＬｉｐＰ−ｈＧＨ４）と同等であり、Ｌｉｐ−ｈＧＨタンパク質の産生が増大しかつ切断タンパク質の産生は低下した。それゆえ、本発明したがう希に存在するｔＲＮＡの発現は、例えばＳ．カルノサスにおけるヒトタンパク質調製に対し有利な特性を有している。
【００１７】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】 図１はプラスミドｐＴＸ−ＬｉｐＰ−ｈＧＨ２又はｐＴＸ−ＬｉｐＰ−ｈＧＨ４におけるＬｉｐ−ｈＧＨ融合物の発現を示す。遺伝子融合物は、スタフィロコッカス・ハイカス由来のシグナルペプチド（ＳＰ）及びプロペプチド（ＰＰ）並びに成熟タンパク質のｈＧＨ部分（黒色）をコードするＤＮＡ配列から構成され、ｘｙｌプロモーター（灰色の三角として示される）により転写される。ｈＧＨ ｃＤＮＡ又は合成ＤＮＡ配列をＮｓｉＩ切断部位とＰｓｔＩ切断部位との間に挿入した。図中の遺伝子の下部に示されるように、ｈＧＨ ＤＮＡ配列の５’末端を、エンテロキナーゼ切断部位「ＤＤＤＤＫ」、続いて成熟ｈＧＨ配列をコードするように修飾した。
【図２】 図２はＳ．カルノサス上清中におけるＬｉｐ−ｈＧＨ融合タンパク質の検出を示す。等量の上清を、１５％アクリルアミドを含有するＴｒｉｓ−グリシンゲル中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、クーマシーブルーで染色した。トレース１〜５は、空の対照ベクターｐＴＸ１６（１５）、ｐＴＸ１５の誘導体（トレース１）、改良ｈＧＨ遺伝子を有するプラスミドｐＴＸ−ＬｉｐＰ−ｈＧＨ４（トレース２）、ｈＧＨ ｃＤＮＡを有するｐＴＸ−ＬｉｐＰ−ｈＧＨ２（トレース３）、ｐＴＸ−ＬｉｐＰ−ｈＧＨ２＋ｐＲＢａｒｇＵ（トレース４）及びｐＴＸ−ＬｉｐＰ−ｈＧＨ２＋ｐＲＢａｒｇＷ（トレース５）を含むＳ．カルノサス株の上清を含んでいる。標準タンパク質及びその分子量（ｋＤａ）は左側に示されている。上清を、トリクロロ酢酸を用いた沈殿により濃縮した。従来技術の標準的方法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
【図３】 図３は本発明のｈＧＨヌクレオチド配列及びアミノ酸配列（ＬｉｐＰ−ｈＧＨ４、配列番号３）を示す。関連する制限切断部位には一本下線を付した。シャイン−ダルガーノ配列には二本下線を付した。シグナルペプチダーゼ１及びエンテロキナーゼ切断部位には波線下線を付した。ＢｇｌＩＩ部位とＮｄｅＩ部位との間及びＮｓｉＩ部位とＰｓｔＩ部位との間の領域のみを合成的に作成し、最適化した。残りの部分はスタフィロコッカス・ハイカス由来のシグナルペプチド及びプロペプチドのオリジナルの配列から構成される。
【配列表】
本発明は、宿主細胞における改良されたコドンの使用及び／又は希に存在するコドン（rarely occurring codon）をコードするｔＲＮＡの発現による、原核宿主細胞中で異種組換えタンパク質を生産するための有利な方法に関する。多数の細菌、特にグラム陽性細菌が、例えば異種組換えタンパク質、例えば分泌タンパク質を菌体内毒素を有しない環境下で生産するための宿主細胞として使用されてきた（参考文献８、９、１９）。例えば、肉及び魚の発酵用に食品工業で使用されている細菌スタフィロコッカス・カルノサス（Ｓ．カルノサス）（Staphylococcus carnosus）は、この目的に適した細菌である。この細菌は、その上清中に毒性因子及びタンパク質分解活性を有さず、多量のタンパク質を分泌することができる（１０）。更に、宿主細胞によりコードされて分泌されるタンパク質の量は少量であり、このことが生成タンパク質の精製をより容易にする。細菌酵素（７、４、１７）が例えばＳ．カルノサス中で組換え的に生成されかつ発現させられてきている。例えばストレプトコッカス（Streptococcus）タンパク質Ｇ等の抗原をその表面上に発現する組換えＳ．カルノサス株は、生ワクチンとして特に有望である（５、１２）。
多くの細菌系の１つの重大な不利益は、当該細菌系がヒト遺伝子におけるコドン優先度（codon preference）とは非常に異なる、希に存在するコドン（rare codon）を使用することである。大腸菌（E. coli）中の希に存在するコドンの存在は、組換え遺伝子の遅延した又は減少した発現を導いた（２、６）。それゆえ、本発明の課題は、先行技術の不利益を克服すること及び改善された性質を有する原核生物発現系を提供することである。
【０００２】
発明の詳細な説明
前述の課題は、本願の特許請求の範囲及び発明の詳細な説明の範囲内で解決される。
特許請求の範囲又は発明の詳細な説明における単数形又は複数形の使用は、どんな場合であっても本発明を限定することを意図するものではなく、本発明は代替の形態をも含んでいる。
本発明は、原核宿主細胞中で異種組換えタンパク質を生産する方法であって、宿主細胞遺伝子に対する宿主細胞によるコドンの使用を決定し、宿主細胞内で異種組換えタンパク質をコードする核酸配列中にある宿主細胞中にまれに存在するコドンを頻繁に存在するコドン（frequent codon）で置換し、組換えタンパク質をコードする核酸で宿主細胞を形質転換し、組換え核酸を発現させることを特徴とする方法に関する。本発明の方法を用いると、従来技術から既知の方法と比較して、有意に良好な異種タンパク質の発現速度を達成することができる。本発明の方法は、原核生物の表面に組換えタンパク質を発現させるのに特に有利である。なぜなら、原核細胞の細胞壁への共有結合性固着（covalent anchoring）は無傷のＣ末端に依存するところ、無傷のＣ末端が存在せず分泌性の切断タンパク質が本発明の方法では生産されないからである。
【０００３】
「異種」とは、原核宿主細胞中のタンパク質が天然タンパク質ではないこと、すなわち当該タンパク質が当該宿主細胞に特有のタンパク質として存在していることを意味する。「組換え」とは、分子生物学的方法により生産されることを意味する。異種組換えタンパク質は、当業者に既知の全てのタンパク質であってよく、例えば、インシュリン、ｈＧＨ、ｔＰＡ、サイトカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、インターフェロン（ＩＦＮ）α、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮΩ、ＩＦＮτ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＴＲＡＩＬ；Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１及びＶＥＧＦである。原核宿主細胞は、当業者に既知の全ての宿主細胞であってよく、特にグラム陽性及びグラム陰性の宿主細胞である。例えば、大腸菌（Escherichia coli）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、ストレプトミセス（Streptomyces）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、好ましくはスタフィロコッカス（Staphylococcus）、例えばスタフィロコッカス・カルノサス（Staphylococcus carnosus）、特に公的収集機関、例えば the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germanyから入手可能なもの例えば、ＴＭ３００株（ＤＳＭ ４６００、４６０１又は４６０２）である。
本発明の方法の範囲内において、最初に、宿主細胞の基本コーディング遺伝子配列中のできるだけ多くの天然タンパク質について、コドン、すなわちコーディングヌクレオチドトリプレットの使用を分析する。例示として、宿主生物スタフィロコッカス・カルノサスＴＭ３００株（１０）について５１遺伝子のコドン頻度を分析した。分析結果を下記表１に示す。
【０００４】
表１
例えば、ブトウ球菌（Staphylococci）のコーディング配列は約３０％という非常に低いＧ＋Ｃ含量を有し、Ａ＋Ｔに富むコドンが好ましいことが見いだされた。それゆえ、本発明にしたがう２つの方法により、組換えタンパク質、例えばｈＧＨの生産量が増加する。（ｉ）コーディング遺伝子配列中の希に存在するコドンを頻繁に存在するコドンで交換すること（実施例１も参照のこと）及び／又は（ｉｉ）希に存在するｔＲＮＡを発現させること（実施例２も参照のこと）。
それゆえ本発明は、異種組換えタンパク質を生産する方法であって、Ｓ．カルノサスについては表１に示されるように、本発明にしたがうその他全ての宿主細胞についても同様に、希に存在するコドンの一部又は全部を頻繁に存在するコドンで置換する、例えば、表１に示される分析結果にしたがいＧｌｕコドンＧＡＧをＧＡＡで置換する、又は、ＬｅｕコドンＣＴＣ、ＣＴＧ及びＣＴＡをＴＴＡ、ＴＴＧ又はＣＴＴで置換することを特徴とする方法に関する。
それゆえ本発明は、異種組換えタンパク質を原核宿主細胞中で生産する方法であって、宿主細胞遺伝子に対する宿主細胞によるコドンの使用を決定し、希に存在するコドンに特異的なｔＲＮＡをコードする核酸を有する宿主細胞を組換えタンパク質をコードする核酸で形質転換し、組換え核酸を発現させることを特徴とする方法（実施例２も参照）に関する。当業者は、遺伝子又はｃＤＮＡを分析することにより（又はｍＲＮＡを逆転写することにより）、宿主細胞の希に存在するコドンを決定することができる。例えば表１に示される宿主細胞Ｓ．カルノサスＴＭ３００株（１０）について決定を行った。本発明は、宿主細胞中の希に存在するｔＲＮＡの１つ〜全てに対し、ｔＲＮＡ又はこれをコードする核酸を導入することを含む。前記の宿主細胞は希に存在するコドンに特異的なｔＲＮＡを有しているので、本発明にしたがう異種組換えタンパク質は従来技術の既知の方法よりも大量に発現する。この驚くべき本発明の有利な特性は実施例２においても示される。大量の発現は、前記の方法単独又は異種タンパク質をコードする核酸中の、宿主細胞に対しては希に存在するコドンを頻繁に存在するコドンで置換することと組み合わせることにより起こるだろう。
【０００６】
それゆえ本発明は、宿主細胞中の異種組換えタンパク質をコードする核酸において、希に存在するコドンを頻繁に存在するコドンにより置換し、かつ、宿主細胞を希に存在するコドンをコードするｔＲＮＡ及び組換えタンパク質をコードする核酸で形質転換することを特徴とする好ましい方法を含んでいる。
本発明は、宿主細胞中で使用されかつ１５％未満の平均頻度を有するコドンを少なくとも１５％の平均頻度を有するコドンで置換することを特徴とする好ましい方法、好ましくは宿主細胞中で使用されかつ７〜１２％の平均頻度を有するコドンを１２％をこえる平均頻度を有するコドンで置換することを特徴とする方法、特に好ましくは宿主細胞中で使用されかつ７〜１０％の平均頻度を有するコドンを７％をこえる又は１０％をこえる平均頻度を有するコドンで置換することを特徴とする方法を含んでいる。別の好ましい態様は、宿主細胞中に最も低い頻度で存在するコドンを当該宿主細胞中で最も頻繁に存在するコドンで置換することを特徴とする好ましい方法である。前記の最も低い頻度で存在するコドンが発現につき絶対的に必須である場合、当該コドンの置換は除外されるだろう。
更に本発明は、宿主細胞中で使用されかつ１０％未満の平均頻度を有するコーディング核酸コドンを少なくとも１０％の平均頻度を有するコドンで置換することを特徴とする好ましい方法を含んでいる。
更に本発明は、宿主細胞が、公的な収集機関、例えばthe Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germanyから入手可能な大腸菌、例えば大腸菌Ｋ１２ ＪＭ１０７株（ＤＳＭ３９５０）であることを特徴とする好ましい方法を含んでいる。
更に本発明は、宿主細胞がスタフィロコッカス属から選ばれる宿主細胞であることを特徴とする好ましい方法を含んでいる。
更に本発明は、宿主細胞がスタフィロコッカス・カルノサスであることを特徴とする方法（実施例１及び２参照）を含んでいる。
本発明の好ましい方法において、組換えタンパク質は抗体タンパク質である。抗体タンパク質とは、フラグメント、例えば、Ｆａｂフラグメント（抗原結合性フラグメント）、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆｖフラグメント（可変部分のフラグメント）又は単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ミニボディ（minibody）、ジアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）及びテトラボディ（tetrabody）をも意味する。
【０００７】
本発明の好ましい方法において、組換えタンパク質はインシュリンである。
本発明の好ましい方法において、組換えタンパク質は組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰａ）である。
本発明の好ましい方法において、組換えタンパク質はヒトタンパク質である。
本発明の好ましい方法において、組換えタンパク質は成長ホルモンである。
本発明の特に好ましい態様において、組換えタンパク質はヒト成長ホルモン（ｈＧＨ、実施例１及び２参照）である。
本発明の別の好ましい方法は、Ｇ又はＣに富むコドンをＡ又はＴを含むコドンで置換することを特徴とする。これは、Ｇ又はＣをより含むコドンをＧ又はＣの代わりにＡ又はＴを含むコドンで置換することを意味し、コドンがＧ又はＣを独占的に含んでいなければならないということを意味するものではない（後述する本発明の最も好ましい態様を参照）。
本発明の方法では、後述する好ましい態様における特定のコドンだけでなく、希に存在することが見いだされたコドンの全てを頻繁に存在するコドンで置換してもよい（例えば、表１を参照）。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＧＣＣがＧＣＡにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＴＧＣがＴＧＴにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＧＡＣがＧＡＴにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＧＡＧがＧＡＡにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＴＴＣがＴＴＴにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＧＧＧがＧＧＴにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＣＡＣがＣＡＴにより置換されていることを特徴とする。
【０００８】
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＡＴＡがＡＴＴにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＡＡＧがＡＡＡにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＣＴＣがＴＴＡにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＡＡＣがＡＡＴにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＣＣＣがＣＣＡにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＣＡＧがＣＡＡにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＣＧＧがＣＧＴにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＴＣＧがＴＣＡにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＡＣＣがＡＣＡにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＧＴＣがＧＴＴにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＴＡＣがＴＡＴにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の特に好ましい方法は、コドンＴＧＡがＴＡＡにより置換されていることを特徴とする。
本発明の別の好ましい方法は、宿主細胞をＡＧＧ−ｔＲＮＡ又はＡＧＡ−ｔＲＮＡをコードする核酸及び組換えタンパク質をコードする核酸で形質転換することを特徴とする。
【０００９】
更に本発明は、組換え異種タンパク質をコードする核酸分子であって、宿主細胞中に希に存在する少なくとも１つのコドンが、当該宿主細胞中に頻繁に存在する少なくとも１つのコドンにより置換されていることを特徴とする核酸分子を含んでいる。例示を目的として、表１で宿主細胞Ｓ．カルノサスについてのコドンを分析した。本発明は、核酸分子であって、Ｓ．カルノサスについて又は本発明のその他全ての宿主細胞についても同様に、希に存在するコドンの一部又は全部が頻繁に存在するコドンにより置換されている、例えばＧｌｕコドンＧＡＧがＧＡＡにより置換されている、ＬｅｕコドンＣＴＣ、ＣＴＧ及びＣＴＡがＴＴＡ、ＴＴＧ又はＣＴＴにより置換されていることを特徴とする核酸分子を含んでいる。
本発明は、組換え異種タンパク質をコードする核酸分子であって、宿主細胞中で使用されかつ１５％未満の平均頻度を有するコドンが少なくとも１５％の平均頻度を有するコドンにより置換されていることを特徴とする核酸分子、好ましくは宿主細胞中で使用されかつ７〜１２％の平均頻度を有するコドンが１２％をこえる平均頻度を有するコドンにより置換されていることを特徴とする核酸分子、特に好ましくは宿主細胞中で使用されかつ７又は１０％の平均頻度を有するコドンが７％をこえる又は１０％をこえる平均頻度を有するコドンにより置換されていることを特徴とする核酸分子を含んでいる。別の好ましい態様は、組換え異種タンパク質をコードする核酸分子であって、宿主細胞中に最も低い頻度で存在するコドンが当該宿主細胞中で最も頻繁に存在するコドンにより置換されていることを特徴とする核酸分子である。
それゆえ本発明は、好ましい態様において、宿主細胞中で使用されかつ１０％未満の平均頻度を有するコドンが少なくとも１０％の平均頻度を有するコドンにより置換されていることを特徴とする核酸分子に関する。
更に本発明は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードすることを特徴とする核酸分子に関する。
【００１０】
更に本発明は、以下の配列：
【００１１】
更に本発明は、配列番号１：
前記の本発明の核酸分子は、配列番号２：
【００１２】
更に本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターに関する。
本発明の別の重要な態様は、本発明の核酸分子又は本発明のベクターを含む宿主細胞である。
本発明の別の重要な態様は、宿主細胞であって、当該宿主細胞中に希に存在するコドンをコードする１以上のｔＲＮＡ分子を含む宿主細胞である。
スタフィロコッカス属の宿主細胞が好ましい。スタフィロコッカス・カルノサス、例えばＴＭ３００株（ＤＳＭ４６００、４６０１又は４６０２）が特に好ましい。
以下の実施例は本発明の理解を容易にすることを意図するものであり、どんな場合であっても本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではない。
【００１３】
実施例１：Ｓ．カルノサス特異的コドンを使用した合成ｈＧＨ遺伝子の構築
タンパク質の例として、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をＳ．カルノサスＴＭ３００株中で発現させた。
成熟ｈＧＨのコドン使用とＳ．カルノサスにおいて示されるコドン使用との比較は、成熟ｈＧＨのコドンのうちの５１コドン（全コドン数の２７％を表す）が、Ｓ．カルノサスでのコドン頻度が７％以下のコドンを構成することを示している（表２）。エンテロキナーゼ切断部位を成熟ｈＧＨのＤＮＡ配列の５’末端に導入して、Ｓ．カルノサス特異的コドンを用いてｈＧＨを合成した。合成遺伝子中のコドンは、Ｓ．カルノサス遺伝子中における頻度とほぼ同じ頻度で使用した。Ｓ．カルノサスより１０％未満の頻度で使用されるコドンについては、制限切断部位を導入するために必要なものを除いて使用しなかった（表２を参照）。
【００１４】
表２
ｈＧＨ ｃＤＮＡ及び本発明の合成ｈＧＨ ＤＮＡにおけるコドンの数
２ 合成ｈＧＨ ＤＮＡ（本発明）中のコドンの数
【００１５】
合成ｈＧＨ ＤＮＡ配列配列は、インビトロでハイブリダイズ及び結合したオリゴヌクレオチドをオーバーラップさせることにより合成した。得られたＤＮＡフラグメントを大腸菌プラスミドｐＳＬ１１９０（３）へクローニングし、配列決定により検証し、ｈＧＨ発現カセット中に挿入して、ＮｓｉＩとＰｓｔＩ切断部位との間のｈＧＨ ｃＤＮＡを置き換えた（図１）。新規な発現カセットをＢｇｌＩＩ−ＣｌａＩフラグメントとして単離し、ブトウ球菌（Staphylococci）発現ベクターｐＴＸ１５のコンパチブルなＢａｍＨＩ及びＮａｒＩ切断部位へクローニングし、プロトプラスト形質転換によりＳ．カルノサス ＴＭ３００を形質転換した。得られた発現ベクターにおいて、ｌｉｐ−ｈＧＨ融合遺伝子はｐＴＸ１５のｘｙｌプロモーターの制御下で発現した。０．５％キシロースを栄養培地へ添加することによりｘｙｌプロモーターのリプレッサーであるＸｙｌＲを不活性化した後、発現を得た。インビトロでのクローニング及び配列決定は標準的な方法（１）により行った。ｈＧＨ遺伝子の発現は、正確なＮ末端を有する成熟ｈＧＨを融合タンパク質から遊離させることを許容するエンテロキナーゼ切断部位を含むスタフィロコッカス・ハイカス（Staphylococcus hyicus）由来のｌｉｐ−シグナル及びプロペプチドとの融合物として行った（図１）。得られた発現ベクターｐＴＸ−ＬｉｐＰ−ｈＧＨ４は、成熟ｈＧＨのコドン使用以外はベクターｐＴＸ−ＬｉｐＰ−ｈＧＨ２と同一である。前記プラスミドのうちの１つを含むＳ．カルノサス株を、発現ベクターのｘｙｌプロモーターを活性化するために０．５％キシロースを補充した改変ＬＢ培地（１％ダイズ抽出物、０．５％酵母抽出物、０．５％ ＮａＣｌ）中で培養した。改良ｈＧＨ ＤＮＡの使用は、Ｓ．カルノサスにおけるｈＧＨ産生効率に対し顕著な効果を有した。Ｌｉｐ−ｈＧＨ収率は少なくとも２倍に改善し、切断Ｌｉｐ−ｈＧＨタンパク質の量は有意に減少した（図２、トレース２及び３）。切断Ｌｉｐ−ｈＧＨタンパク質は、細胞外タンパク質分解活性の結果物ではない。なぜなら、Ｌｉｐ−ｈＧＨはＳ．カルノサスの上清中で安定であるからである。Ｓ．カルノサス（ｐＴＸ−ＬｉｐＰ−ｈＧＨ４）の上清中における切断タンパク質の存在の減少は、ｈＧＨが最適化ＤＮＡ配列により早く翻訳されるため、細胞膜を通して分泌される前に細胞内プロテアーゼが当該タンパク質を切断する機会が少なくなったことを示している。
【００１６】
実施例２：ｈＧＨ ｃＤＮＡ中に希に存在するコドンに特異的なｔ−ＲＮＡの同時発現
アルギニンコドンＡＧＧは、Ｓ．カルノサス遺伝子中に極めて希に存在し、アルギニンコドンのわずか０．８％において使用される。対応するｔＲＮＡ遺伝子はＳ．カルノサス中で同定されていない。それゆえ、本発明者等はＡＧＧコドンに対する大腸菌ｔＲＮＡをＳ．カルノサス中で発現させた。コドンＡＧＧ／ＡＧＡ及びＡＧＧに対するｔＲＮＡをコードする大腸菌遺伝子ａｒｇＵ及びａｒｇＷを、その天然のプロモーター及びターミネーターと共に、プラスミドｐＵＢＳ５２０又はｐＳＢ１０１（２、１６）へクローニングした。フラグメントをＳａｌＩ−ＳｐＨＩフラグメント（ａｒｇＵ）及びＸｍａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント（ａｒｇＷ）として単離し、シャトル（転移）ベクターｐＲＢ５７２（４）の対応の制限切断部位へクローニングした。得られたプラスミドｐＲＢａｒｇＵ及びｐＲＢａｒｇＷで、ｈＧＨ ｃＤＮＡを発現するＳ．カルノサス（ｐＴＸ−ＬｉｐＰ−ｈＧＨ２）を形質転換した。
得られたＳ．カルノサス株の上清におけるタンパク質パターンは、Ｓ．カルノサス（ｐＴＸ−ＬｉｐＰ−ｈＧＨ４）と同等であり、Ｌｉｐ−ｈＧＨタンパク質の産生が増大しかつ切断タンパク質の産生は低下した。それゆえ、本発明したがう希に存在するｔＲＮＡの発現は、例えばＳ．カルノサスにおけるヒトタンパク質調製に対し有利な特性を有している。
【００１７】
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【図面の簡単な説明】
【図１】 図１はプラスミドｐＴＸ−ＬｉｐＰ−ｈＧＨ２又はｐＴＸ−ＬｉｐＰ−ｈＧＨ４におけるＬｉｐ−ｈＧＨ融合物の発現を示す。遺伝子融合物は、スタフィロコッカス・ハイカス由来のシグナルペプチド（ＳＰ）及びプロペプチド（ＰＰ）並びに成熟タンパク質のｈＧＨ部分（黒色）をコードするＤＮＡ配列から構成され、ｘｙｌプロモーター（灰色の三角として示される）により転写される。ｈＧＨ ｃＤＮＡ又は合成ＤＮＡ配列をＮｓｉＩ切断部位とＰｓｔＩ切断部位との間に挿入した。図中の遺伝子の下部に示されるように、ｈＧＨ ＤＮＡ配列の５’末端を、エンテロキナーゼ切断部位「ＤＤＤＤＫ」、続いて成熟ｈＧＨ配列をコードするように修飾した。
【図２】 図２はＳ．カルノサス上清中におけるＬｉｐ−ｈＧＨ融合タンパク質の検出を示す。等量の上清を、１５％アクリルアミドを含有するＴｒｉｓ−グリシンゲル中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、クーマシーブルーで染色した。トレース１〜５は、空の対照ベクターｐＴＸ１６（１５）、ｐＴＸ１５の誘導体（トレース１）、改良ｈＧＨ遺伝子を有するプラスミドｐＴＸ−ＬｉｐＰ−ｈＧＨ４（トレース２）、ｈＧＨ ｃＤＮＡを有するｐＴＸ−ＬｉｐＰ−ｈＧＨ２（トレース３）、ｐＴＸ−ＬｉｐＰ−ｈＧＨ２＋ｐＲＢａｒｇＵ（トレース４）及びｐＴＸ−ＬｉｐＰ−ｈＧＨ２＋ｐＲＢａｒｇＷ（トレース５）を含むＳ．カルノサス株の上清を含んでいる。標準タンパク質及びその分子量（ｋＤａ）は左側に示されている。上清を、トリクロロ酢酸を用いた沈殿により濃縮した。従来技術の標準的方法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
【図３】 図３は本発明のｈＧＨヌクレオチド配列及びアミノ酸配列（ＬｉｐＰ−ｈＧＨ４、配列番号３）を示す。関連する制限切断部位には一本下線を付した。シャイン−ダルガーノ配列には二本下線を付した。シグナルペプチダーゼ１及びエンテロキナーゼ切断部位には波線下線を付した。ＢｇｌＩＩ部位とＮｄｅＩ部位との間及びＮｓｉＩ部位とＰｓｔＩ部位との間の領域のみを合成的に作成し、最適化した。残りの部分はスタフィロコッカス・ハイカス由来のシグナルペプチド及びプロペプチドのオリジナルの配列から構成される。
【配列表】
Claims (6)
- スタフィロコッカス・カルノサス中で配列番号３の配列を含むLiｐP-hGH融合遺伝子を発現させる方法であって、
ヒト成長ホルモン（hGH）遺伝子を、スタフィロコッカス・ハイカスリパーゼ（LipP）のリップシグナル及びプロペプチドのコード配列に融合させ、前記LiP-hGH融合遺伝子が正確なN末端を有する成熟hGHの放出を許容する、LipPとｈGHの間のエンテロキナーゼ切断サイトを含んでおり、及び10％未満の平均頻度でスタフィロコッカス・カルノサス中で使用されるhGH遺伝子をコードするコドンが、少なくとも10％の平均頻度を有するコドンにより置き換えられ、及び／又は
前記スタフィロコッカス・カルノサスの宿主細胞が10％未満の平均頻度で用いられるコドンをコードするtRNA、複数のtRNA又はこれらをコードする核酸で形質転換される前記方法。 - hGHのG又はCに富むコドンを、A又はTを含むコドンで置換することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- スタフィロコッカス・カルノサスが、AGG-tRNA又はAGA-tRNAをコードする核酸で形質転換される、請求項１又は２に記載の方法。
- スタフィロコッカス・カルノサスが、コドンAGG/AGA及びAGGのためのtRNAをコードするE.coli遺伝子argU及びargWの核酸を用いて形質転換される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- LipP-hGH融合タンパクが、配列番号３の配列を含む核酸分子でコードされる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 配列番号３の配列を含む、LipP-hGH融合タンパクをコードする核酸分子。
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