CN107541482B - 一种构建大肠杆菌高效分泌表达转肽酶Sortase A的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种构建大肠杆菌高效分泌表达转肽酶SortaseA的方法，属于基因工程领域。本发明成功实现了SortaseA在大肠杆菌中的高效分泌表达，解决了目前已有报道中该酶无法分泌表达且胞内表达水平较低的问题。在摇瓶水平，所得SortaseA产量可达90.2mg/L，胞外酶活水平可达34.2U/mL；为后续SortaseA的工业化生产奠定了基础。

Description

一种构建大肠杆菌高效分泌表达转肽酶Sortase A的方法

技术领域

本发明涉及一种构建大肠杆菌高效分泌表达转肽酶Sortase A的方法，属于基因工程领域。

背景技术

Sortase A是一类介导革兰氏阳性菌细胞壁锚定蛋白与细胞壁共价结合的转肽酶，近些年其在生物技术领域的应用吸引了越来越多的关注。自从2004年首次报道应用Sortase A作为一种蛋白质或多肽的连接工具以来，Sortase A参与的连接反应迅速成为一个研究热点，已被广泛应用于生物化学、蛋白质组学、生物医药以及生物工程技术等领域。但到目前为止，关于Sortase A高效表达和工业化生产的研究却很少，酶的表达方式仍主要局限于大肠杆菌的胞内表达。Sortase A的胞内表达存在以下几个主要的缺陷：(1)产率较低：在已有的报道中，最高产率仅为76.9mg/L；(2)胞内表达的Sortase A易在菌体内形成包涵体，且纯化前还需要经过耗时且成本较高的细胞破碎步骤。因此，构建Sortase A的大肠杆菌高效分泌表达菌株能解决该酶胞内表达时存在的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题首先是提供一种高效分泌表达Sortase A(转肽酶)的重组大肠杆菌，用于实现Sortase A的高效生产。

所述重组大肠杆菌是以pET22a为表达载体，并利用载体上自带的PelB信号肽构建携带编码Sortase A的基因的重组表达载体，将重组表达载体与分子伴侣pG-Tf2质粒共同转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

在本发明的一种实施方式中，所述编码Sortase A的基因来源于金黄色葡萄球菌。

在本发明的一种实施方式中，所述编码Sortase A的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明还提供一种应用所述重组大肠杆菌分泌表达Sortase A的方法，以2-5％的接种量将培养好的种子接种至TB培养基中；采用的发酵条件为：发酵温度28-30℃、诱导培养24-36h、诱导剂IPTG浓度100mM/L、诱导时机OD₆₀₀＝0.6-0.8。所述TB培养基的配方是：蛋白胨12.0g/L，酵母粉24.0g/L，甘油4.0g/L，KH₂PO₄ 2.31g/L、K₂HPO₄ 12.54g/L，pH 7.0。

本发明成功实现了Sortase A在大肠杆菌中的高效生产，解决了目前已有报道中该酶表达水平较低的问题，在7L发酵罐中进行发酵所得Sortase A产量可达295.2mg/L，单位质量菌体酶活可达4845U/mg。

附图说明

图1不同信号肽介导的Sortase A分泌表达效果比较(黑色柱状图：Sortase A的胞外酶活；白色柱状图：Sortase A的分泌表达量)

具体实施方式

具体实施方式

重组大肠杆菌高效分泌Sortase A的方法为：以2％的接种量将培养好的种子(LB培养基)接种至装液量为50mL的500mL三角瓶中；发酵培养基为TB培养基(蛋白胨12.0g/L，酵母粉24.0g/L，甘油4.0g/L，KH₂PO₄ 2.31g/L、K₂HPO₄ 12.54g/L，pH 7.0)；采用的发酵条件为：发酵温度30℃、诱导培养36h、诱导剂IPTG浓度100mM/L、诱导时机OD₆₀₀＝0.6。

Sortase A纯化方法：诱导36h后的菌液于4℃，9000rpm离心3min后取上清，即为粗酶液。粗酶液中的Sortase A用His Tag标签蛋白螯合磁珠(海狸纳米科技有限公司)进行纯化，具体操作步骤参看磁珠使用说明。

蛋白含量的测定：使用碧云天生物技术研究所研发的Bradford蛋白浓度测定试剂盒进行检测，具体操作步骤参看试剂盒使用说明。

Sortase A酶活测定方法：利用Sortase A能够切断肽段LPXTG序列中Thr和Gly之间肽键的原理，合成了特异性底物Dabcyl-QALPETGEE-Edans(d-QALPETGEE-e)(吉尔生化有限公司)，其中Edans(e)是荧光基团，而Dabcyl(d)是淬灭基团。当该底物未被Sortase A切断时，Edans(e)在激发状态下发生荧光共振能量转移，其发出的荧光被临近的Dabcyl(d)吸收并以热的形式散发，荧光被淬灭，无法检测到荧光。而当Sortase A将底物切割成两段之后，Edans(e)与Dabcyl(d)分离，不再发生淬灭，即可检测到其荧光值。因此可通过Edans(e)荧光强度的变化来检测Sortase A的酶活性。检测方法是在96孔板中加入200μL反应缓冲液，4μL d-QALPETGEE-e底物(1.25g/L)，10μL Sortase A粗酶液。混合液于Synergy^TM H4全功能酶标仪(BioTek)中37℃下进行动力学反应1h，在激发波长350nm、发射波长495nm下检测荧光强度的变化情况。单位体积菌体Sortase A酶活计算公式如下：

其中A代表单位质量菌体Sortase A酶活(U/mL)，I₆₀为反应60min结束时的荧光强度值，I₀为动力学反应开始时的荧光强度值，V_S为Sortase A酶液样品总体积(mL)，V_L为Sortase A酶液样品检测加样量(μL)。

实施例1 Sortase A高效分泌表达的实现

以金黄色葡萄球菌的基因组为模版，以srt-F和srt-R(表1)引物扩增得到去除N端信号肽的srtA基因(SEQ ID NO.1)，克隆至质粒pET22a的Nco I/Bam HI位点，获得pET22a-PelB-srtA载体。再分别以大肠杆菌基因组为模版，以OmpA-F和OmpA-R、TorA-F和TorA-R、DmsA-F和DmsA-R、FdnG-F和FdnG-R(表1)引物扩增到OmpA、TorA、DmsA和FdnG四种信号肽的编码基因，并利用OmpA-SrtA-F和OmpA-SrtA-R、TorA-SrtA-F和TorA-SrtA-R、DmsA-SrtA-F和DmsA-SrtA-R、FdnG-SrtA-F和FdnG-SrtA--R(表1)引物扩增到可以与四种信号肽的编码基因进行融合的srtA基因片段。利用融合PCR技术，获得OmpA-SrtA、TorA-SrtA、DmsA-SrtA、FdnG-SrtA四个片段，并在Nde I/Bam HI位点替换pET22a-PelB-srtA载体上的PelB信号肽，分别得到pET22a-OmpA-srtA、pET22a-TorA-srtA、pET22a-DmsA-srtA、pET22a-FdnG-srtA四个载体。所有载体经测序验证正确之后，分别转化至大肠杆菌表达宿主E.coli BL21(DE3)。

将五种不同信号肽介导分泌的Sortase A表达菌株活化后诱导表达，检测胞外Sortase A的含量和酶活。结果(图1)表明PelB信号肽介导的Sortase A胞外表达效果最好，重组大肠杆菌Sortase A的分泌表达量可以达到37.4mg/L，胞外酶活水平为11.7U/mL。

在使用最佳信号肽的基础上，经大肠杆菌密码子偏好性分析发现，srtA基因中存在7个稀有密码子(Gly₉₀、Arg₉₉、Leu₁₁₀、Gly₁₁₉、Ile₁₅₈、Arg₁₅₉、Leu₁₆₉)。因此利用Takara公司的定点突变试剂盒及设计的特异性突变引物(表2)，对pET22a-PelB-srtA载体上srtA基因的这7个密码子进行了点突变(Gly₉₀:GGA→GGT；Arg₉₉:AGA→CGT；Leu₁₁₀:CTA→CTG；Gly₁₁₉:GGA→GGT；Ile₁₅₈:ATA→ATT；Arg₁₅₉:AGA→CGT；Leu₁₆₉:CTA→CTG)。突变后的载体经测序验证正确之后，转化至大肠杆菌表达宿主E.coli BL21(DE3)。密码子优化后Sortase A的分泌表达量和胞外酶活分别提高了76.2％(65.9mg/L)和55.6％(18.2U/mL)(表3)。

实施例2 分子伴侣共表达提高Sortase A分泌表达水平

以携带pET22a-PelB-srtA载体的E.coli BL21(DE3)菌株出发，制备感受态后，分别将五种不同的分子伴侣共表达质粒(pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2和pTf16转化至菌株。将五种不同分子伴侣共表达的菌株活化后诱导表达，检测胞外Sortase A的含量和酶活。结果(表3)表明pG-Tf2共表达的效果最好，Sortase A的分泌表达量进一步提高到90.2mg/L，胞外酶活水平进一步提高至34.2U/mL。

表1 不同信号肽介导Sortase A分泌菌株构建所用引物

表2 Sortase A密码子优化所用引物

表3 不同策略提高Sortase A分泌效果

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种高效分泌表达Sortase A的重组大肠杆菌，其特征在于，以pET22a为表达载体，并利用载体上自带的PelB信号肽构建携带编码Sortase A的基因的重组表达载体，将重组表达载体与分子伴侣pG-Tf2质粒共同转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，所述编码Sortase A的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种高效分泌表达Sortase A的重组大肠杆菌，其特征在于，所述编码Sortase A的基因来源于金黄色葡萄球菌。

3.一种构建权利要求1-2任一所述的重组大肠杆菌的方法，其特征在于，以pET22a为表达载体，并利用载体上自带的PelB信号肽构建携带编码Sortase A的基因的重组表达载体，将重组表达载体与分子伴侣pG-Tf2质粒共同转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

4.一种应用权利要求1-2任一所述的重组大肠杆菌分泌表达Sortase A的方法，其特征在于，以2-5％的接种量将培养好的种子接种至TB培养基中；采用的发酵条件为：发酵温度28-30℃、诱导培养24-36h、诱导剂IPTG浓度100mM/L、诱导时机OD₆₀₀＝0.6-0.8。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述TB培养基的配方是：蛋白胨12.0g/L，酵母粉24.0g/L，甘油4.0g/L，KH₂PO₄ 2.31g/L、K₂HPO₄ 12.54g/L，pH 7.0。

6.权利要求1-2任一所述的重组大肠杆菌在蛋白或多肽修饰中的应用。

7.一种编码Sortase A的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

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