JP2632809B2 - グラム陽性菌の新規発現調節配列 - Google Patents
グラム陽性菌の新規発現調節配列Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明はグラム陽性菌用の新規発現調節DNA配列、そ
れらのDNA配列を含む発現ベクター、その発現ベクター
により形質転換した宿主、並びに新規発現コントロール
DNA配列、ベクターおよび形質転換株を用いて原核細胞
および真核細胞たん白質を生産する方法に関するもので
ある。
れらのDNA配列を含む発現ベクター、その発現ベクター
により形質転換した宿主、並びに新規発現コントロール
DNA配列、ベクターおよび形質転換株を用いて原核細胞
および真核細胞たん白質を生産する方法に関するもので
ある。
従来の組換えDNAの研究のほとんどはEscherichia col
i（E.coli）を用いて行なわれてきた。E.coliは、ペリ
プラズマ空間を含んで二層の膜を有するグラム陰性細菌
群に属する。E.coliが生産するたん白質の多くは、分泌
するとしてもこのペリプラズマ空間に分泌される。生細
胞から外部の生育培地中に分泌される物質はほとんどな
い。
i（E.coli）を用いて行なわれてきた。E.coliは、ペリ
プラズマ空間を含んで二層の膜を有するグラム陰性細菌
群に属する。E.coliが生産するたん白質の多くは、分泌
するとしてもこのペリプラズマ空間に分泌される。生細
胞から外部の生育培地中に分泌される物質はほとんどな
い。
一方、Bacillus subtilis（B.subtilis）は一層の細
胞膜を有するグラム陽性細菌群の一員である。従つて、
B.subtilisは生育培地中に多量のたん白質を分泌して生
産する。さらに、B.subtilisは非病源性であり、内毒素
を生産しないので、本細菌でたん白質を生産させるのは
有利である。その上、B.subtilsは今までに多く研究さ
れており、グラム陽性菌の中で遺伝研究の原型である。
胞膜を有するグラム陽性細菌群の一員である。従つて、
B.subtilisは生育培地中に多量のたん白質を分泌して生
産する。さらに、B.subtilisは非病源性であり、内毒素
を生産しないので、本細菌でたん白質を生産させるのは
有利である。その上、B.subtilsは今までに多く研究さ
れており、グラム陽性菌の中で遺伝研究の原型である。
E.coliを用いて遺伝子クローニングの一般的手法はB.
subtilisにも応用できるが、B.subtilisにクローン化し
た異種遺伝子の有用産物を生産し、生育培地中に分泌さ
せる試みは遅れており、有用なクローニングおよび発現
ベクターの一般的不足により特に困難であつた。この発
現ベクターの不足は、B.subtilisにおける異種DNAの転
写および翻訳開始シグナルの理解の不足により、一部説
明できる。従つて、よく知られているtrp（R.A.Hallewe
llおよびS.Emtage、Gene9巻27〜47頁〔1980年〕）、lac
（K.Itakuraら、Science198巻、1056〜1063頁〔1977
年〕:T.M.Robertsら、Proc.Nat.Acad.Sci.,USA76巻、55
96〜5600頁〔1979年〕）、lpp（N.Leeら、J.Bacteriol.
146巻、861〜866頁〔1981年〕:L.J.Zwiebelら、J.Bacte
riol.145巻、654〜656頁〔1981年〕およびK.Natamuraお
よびM.Inouye、Cell18巻、1109頁〔1979年〕）およびバ
クテリオフアージ入PL（H.Bernardら、Gene5巻、59〜76
頁〔1979年〕）の転写および翻訳システムはB.subtilis
では作用しない。従つて、StaphylococcusおよびStrept
ococcusのようなグラム陽性菌からのいくつかの薬剤耐
性遺伝子を除いて、原核細胞および真核細胞たん白質を
コードする外来遺伝子がBacillus、特にB.subtilis中で
発現されていない（A.T.GanesauおよびJ.A.Hoch編集、
“Genetics and Biotechnclogy";Academic Press〔1984
年〕および後述のJ.Palvaの学位論文の総説を参照）。
その上、発現量は一般的に少なく、その結果、Bacillus
subtilisのための有能なプロモーターを有するより良
い発現ベクターの開発が望まれてきた。
subtilisにも応用できるが、B.subtilisにクローン化し
た異種遺伝子の有用産物を生産し、生育培地中に分泌さ
せる試みは遅れており、有用なクローニングおよび発現
ベクターの一般的不足により特に困難であつた。この発
現ベクターの不足は、B.subtilisにおける異種DNAの転
写および翻訳開始シグナルの理解の不足により、一部説
明できる。従つて、よく知られているtrp（R.A.Hallewe
llおよびS.Emtage、Gene9巻27〜47頁〔1980年〕）、lac
（K.Itakuraら、Science198巻、1056〜1063頁〔1977
年〕:T.M.Robertsら、Proc.Nat.Acad.Sci.,USA76巻、55
96〜5600頁〔1979年〕）、lpp（N.Leeら、J.Bacteriol.
146巻、861〜866頁〔1981年〕:L.J.Zwiebelら、J.Bacte
riol.145巻、654〜656頁〔1981年〕およびK.Natamuraお
よびM.Inouye、Cell18巻、1109頁〔1979年〕）およびバ
クテリオフアージ入PL（H.Bernardら、Gene5巻、59〜76
頁〔1979年〕）の転写および翻訳システムはB.subtilis
では作用しない。従つて、StaphylococcusおよびStrept
ococcusのようなグラム陽性菌からのいくつかの薬剤耐
性遺伝子を除いて、原核細胞および真核細胞たん白質を
コードする外来遺伝子がBacillus、特にB.subtilis中で
発現されていない（A.T.GanesauおよびJ.A.Hoch編集、
“Genetics and Biotechnclogy";Academic Press〔1984
年〕および後述のJ.Palvaの学位論文の総説を参照）。
その上、発現量は一般的に少なく、その結果、Bacillus
subtilisのための有能なプロモーターを有するより良
い発現ベクターの開発が望まれてきた。
現在、塩基配列が明かにされている既知のBacillus s
ubtilisプロモーターとしては、vegプロモーター、tms
プロモーター、pen Pプロモーター（C.P.Moran Jr.ら、
Mol.Gen.Genetics186巻、339〜346頁〔1982年〕）、spo
VCプロモーター（C.P.Moran Jr.ら、Nucleic Acids Re
s.9巻、5979〜5990〔1981年〕）、spo VGプロモーター
（C.P.Moran Jr.ら、Cell25巻、783〜791頁〔1981
年〕）、φ29G3aプロモーター、φ29G3bプロモーター、
φ29G2プロモーター、φ29A1プロモーター（C.L.Murray
およびJ.C.Rabinowitz、J.Biol.Chem.257巻、1053〜106
2頁〔1982年〕）、PMG102プロモーター、PMG201プロモ
ーター（M.Z.Gilmanら、Nucleic Acids Res.9巻、5991
〜6000〔1981年〕）、spo1−15プロモーター（G.Lee
ら、J.Mol.Biol.139巻、407〜422頁〔1980年〕）、spo1
−16プロモーター（G.Leeら、Molec.Gen.Genetics、180
巻、57〜65頁〔1980年〕）、およびSPO2プロモーター
（R.G.Schonerら、Gene22巻、47〜57頁〔1983年〕）が
ある。これらの中ではSPO2プロモーター（R.G.Schoner
ら、前述）およびvegプロモーター（ヨーロッパ特許出
願公開番号116411）のみが実際に遺伝子発現に利用され
ている。
ubtilisプロモーターとしては、vegプロモーター、tms
プロモーター、pen Pプロモーター（C.P.Moran Jr.ら、
Mol.Gen.Genetics186巻、339〜346頁〔1982年〕）、spo
VCプロモーター（C.P.Moran Jr.ら、Nucleic Acids Re
s.9巻、5979〜5990〔1981年〕）、spo VGプロモーター
（C.P.Moran Jr.ら、Cell25巻、783〜791頁〔1981
年〕）、φ29G3aプロモーター、φ29G3bプロモーター、
φ29G2プロモーター、φ29A1プロモーター（C.L.Murray
およびJ.C.Rabinowitz、J.Biol.Chem.257巻、1053〜106
2頁〔1982年〕）、PMG102プロモーター、PMG201プロモ
ーター（M.Z.Gilmanら、Nucleic Acids Res.9巻、5991
〜6000〔1981年〕）、spo1−15プロモーター（G.Lee
ら、J.Mol.Biol.139巻、407〜422頁〔1980年〕）、spo1
−16プロモーター（G.Leeら、Molec.Gen.Genetics、180
巻、57〜65頁〔1980年〕）、およびSPO2プロモーター
（R.G.Schonerら、Gene22巻、47〜57頁〔1983年〕）が
ある。これらの中ではSPO2プロモーター（R.G.Schoner
ら、前述）およびvegプロモーター（ヨーロッパ特許出
願公開番号116411）のみが実際に遺伝子発現に利用され
ている。
このような状況下で、例えばBacillus、特にB.subtil
isのようなグラム陽性細菌で使用できるより良い遺伝子
発現システムを開発することは有利である。このような
観点から、本発明の一般的に使用し得る発現ベクターは
原核細胞および真核細胞たん白質をコードする遺伝子を
Bacillus、特にB.subtilisおよび他のグラム陽性宿主
中、グラム陰性菌由来の転写開始および終了DNA配列の
調節下ではじめて発現できるようになるため特に重要で
ある。
isのようなグラム陽性細菌で使用できるより良い遺伝子
発現システムを開発することは有利である。このような
観点から、本発明の一般的に使用し得る発現ベクターは
原核細胞および真核細胞たん白質をコードする遺伝子を
Bacillus、特にB.subtilisおよび他のグラム陽性宿主
中、グラム陰性菌由来の転写開始および終了DNA配列の
調節下ではじめて発現できるようになるため特に重要で
ある。
本発明は、具体的には、一方の末端付近にグラム陰性
細菌の転写開始DNA配列を、他方の末端付近にグラム陰
性またはグラム陽性菌由来の転写終了DNA配列を有し、
該転写開始DNA配列と転写終了DNA配列との中間にグラム
陽性またはグラム陰性菌由来のリボゾーム結合部位をコ
ードするDNA配列が原核細胞または真核細胞ポリペプチ
ドをコードする外来遺伝子に機能的に結合して有するグ
ラム陽性細菌用発現調節DNA配列、さらに、５′から
３′への下流方向にグラム陰性菌由来の転写開始DNA配
列、グラム陽性またはグラム陰性菌由来のリボゾーム結
合部位をコードするDNA配列およびグラム陰性またはグ
ラム陽性細菌由来の転写終了配列を機能単位に、公知の
DNA繰り換え技術により結合することにより成る、発現
調節DNAの配列の調製法を提供するものである。
細菌の転写開始DNA配列を、他方の末端付近にグラム陰
性またはグラム陽性菌由来の転写終了DNA配列を有し、
該転写開始DNA配列と転写終了DNA配列との中間にグラム
陽性またはグラム陰性菌由来のリボゾーム結合部位をコ
ードするDNA配列が原核細胞または真核細胞ポリペプチ
ドをコードする外来遺伝子に機能的に結合して有するグ
ラム陽性細菌用発現調節DNA配列、さらに、５′から
３′への下流方向にグラム陰性菌由来の転写開始DNA配
列、グラム陽性またはグラム陰性菌由来のリボゾーム結
合部位をコードするDNA配列およびグラム陰性またはグ
ラム陽性細菌由来の転写終了配列を機能単位に、公知の
DNA繰り換え技術により結合することにより成る、発現
調節DNAの配列の調製法を提供するものである。
さらに詳細には、本発明は以下の組み合わせより成る
ものである。
ものである。
（ａ） グラム陰性細菌由来の転写開始DNA配列（プロ
モーター）とグラム陽性細菌由来のリボゾーム結合部位
をコードするDNA配列およびグラム陰性細菌由来の転写
終了DNA配列。
モーター）とグラム陽性細菌由来のリボゾーム結合部位
をコードするDNA配列およびグラム陰性細菌由来の転写
終了DNA配列。
（ｂ） グラム陰性細菌由来の転写開始DNA配列（プロ
モーター）とグラム陰性細菌由来のリボゾーム結合部位
をコードするDNA配列およびグラム陰性細菌由来の転写
終了DNA配列。
モーター）とグラム陰性細菌由来のリボゾーム結合部位
をコードするDNA配列およびグラム陰性細菌由来の転写
終了DNA配列。
（ｃ） グラム陰性細菌由来の転写開始DNA配列（プロ
モーター）とグラム陰性細菌由来のリボゾーム結合部位
をコードするDNA配列およびグラム陰性細菌由来の転写
終了DNA配列、および （ｄ） グラム陰性細菌由来の転写開始DNA配列（プロ
モーター）とグラム陰性細菌由来のリボゾーム結合部位
をコードするDNA配列およびグラム陰性細菌由来の転写
終了DNA配列。
モーター）とグラム陰性細菌由来のリボゾーム結合部位
をコードするDNA配列およびグラム陰性細菌由来の転写
終了DNA配列、および （ｄ） グラム陰性細菌由来の転写開始DNA配列（プロ
モーター）とグラム陰性細菌由来のリボゾーム結合部位
をコードするDNA配列およびグラム陰性細菌由来の転写
終了DNA配列。
転写開始DNA配列に関連して用いている細菌由来とい
うのは（ａ）自然界に存在する細菌の転写開始配列およ
び、そのような転写開始DNA配列の一個または数個のヌ
クレオチドおよびリピートの置換或いは逆転を含むその
機能的変異種および（ｂ）化学的に合成した（合成）転
写DNA配列で細菌で転写開始可能なものより成る。
うのは（ａ）自然界に存在する細菌の転写開始配列およ
び、そのような転写開始DNA配列の一個または数個のヌ
クレオチドおよびリピートの置換或いは逆転を含むその
機能的変異種および（ｂ）化学的に合成した（合成）転
写DNA配列で細菌で転写開始可能なものより成る。
リボゾーム結合部位をコードするDNA配列に関連して
用いている細菌由来という言葉は、（ａ）自然界に存在
する細菌のリボゾーム結合部位をコードするDNA配列お
よび一個又はいくつかのヌクレオチドの置換または逆転
を含むその機能的変異種、および（ｂ）細菌中で翻訳開
始可能な化学的に合成した（合成）リボゾーム結合部位
をコードするDNA配列を含む。
用いている細菌由来という言葉は、（ａ）自然界に存在
する細菌のリボゾーム結合部位をコードするDNA配列お
よび一個又はいくつかのヌクレオチドの置換または逆転
を含むその機能的変異種、および（ｂ）細菌中で翻訳開
始可能な化学的に合成した（合成）リボゾーム結合部位
をコードするDNA配列を含む。
転写終了DNA配列に関連して用いられている細菌由来
という意味は、（ａ）自然界に存在する細菌転写終了DN
A配列および、その転写終了DNA配列の一個またはいくつ
かのヌクレチオドの置換あるいは逆転を含む機能的変異
種、および（ｂ）化学的に合成した（合成）転写終了DN
A配列で細菌中で転写を終了することの出来るものを含
む。
という意味は、（ａ）自然界に存在する細菌転写終了DN
A配列および、その転写終了DNA配列の一個またはいくつ
かのヌクレチオドの置換あるいは逆転を含む機能的変異
種、および（ｂ）化学的に合成した（合成）転写終了DN
A配列で細菌中で転写を終了することの出来るものを含
む。
好ましい適用においては、原核細胞または真核細胞の
たん白質をコードする遺伝子がBacillus、特にB.subtil
is、および他のグラム陽性菌中で大腸菌フアージT5また
はT7起源のプロモーターおよびE.coli起源のターミネー
ターの転写調節下で発現できる。
たん白質をコードする遺伝子がBacillus、特にB.subtil
is、および他のグラム陽性菌中で大腸菌フアージT5また
はT7起源のプロモーターおよびE.coli起源のターミネー
ターの転写調節下で発現できる。
本発明に於いてT5およびT7プロモーターは大腸菌フア
ージT5およびT7群のゲノムに存在するプロモーター機能
を仲介するDNA配列およびそのような配列由来の機能的
な組合せと定義される。
ージT5およびT7群のゲノムに存在するプロモーター機能
を仲介するDNA配列およびそのような配列由来の機能的
な組合せと定義される。
本発明に於いて有効なT5プロモーターはフアージの
“前初期”、“初期”および“後期”発現のプロモータ
ーであり、特にR.Gentzのハイデルべルグ大学学位論文
〔1984年〕に記載される以下の配列である。
“前初期”、“初期”および“後期”発現のプロモータ
ーであり、特にR.Gentzのハイデルべルグ大学学位論文
〔1984年〕に記載される以下の配列である。
PJ5、PN25、PN26、ＰD/E20、PG5、PG20、 PG22、PG25、PG28、PK28a、PK28b 本発明に於いて有効なT7プロモーターはフアージの
“初期”発現プロモーター、特にA1およびA2プロモータ
ー（D.K.HawleyおよびW.D.McClure、Nucleic Acids Re
s.11巻、2237〜2255頁〔1983年〕）である。
“初期”発現プロモーター、特にA1およびA2プロモータ
ー（D.K.HawleyおよびW.D.McClure、Nucleic Acids Re
s.11巻、2237〜2255頁〔1983年〕）である。
上述の好ましいT5またはT7プロモーターのいくつかの
DNA配列を下の第１表に示す。
DNA配列を下の第１表に示す。
第１表は本発明で用いられるプロモーターのヌクレオ
チド配列を示す。−50から＋10までの配列を示し、−35
のヘキサマーおよびその上流のA:T−豊富な領域を線で
囲んであり、−10ヘキサマーは上線を印してある。
チド配列を示す。−50から＋10までの配列を示し、−35
のヘキサマーおよびその上流のA:T−豊富な領域を線で
囲んであり、−10ヘキサマーは上線を印してある。
宿主中での翻訳開始に必要なリボゾーム結合部位をコ
ードするDNA配列は、（１）アミノ酸メチオニンのコド
ンであるATG翻訳開始コドン、（２）シヤイン ダルガ
ーノ（SD）配列として知られている16SリボゾームRNAの
３′−末端の塩基に相応する４〜12塩基の配列、および
（３）リンカー領域として知られるこれら２つの間の塩
基配列とから成る。
ードするDNA配列は、（１）アミノ酸メチオニンのコド
ンであるATG翻訳開始コドン、（２）シヤイン ダルガ
ーノ（SD）配列として知られている16SリボゾームRNAの
３′−末端の塩基に相応する４〜12塩基の配列、および
（３）リンカー領域として知られるこれら２つの間の塩
基配列とから成る。
本発で使用され、また本発明の一部を成しているリボ
ゾーム結合部位をコードするDNA配列はグラム陽性菌ま
たはグラム陽性菌由来でBacillus、特にB.subtilis、お
よび他のグラム陽性菌中で機能することの出来るリボゾ
ーム結合部位をコードするDNA配列より調製されるもの
で、既知のいくつかのものを含む（J.R.McLaughlinら、
J.Biol.Chem.256巻、11283〜11291頁〔1981年〕;C.P.Mo
ran Jr.ら、Mol.Gen.Genetics186巻、339〜346頁〔1982
年〕）。
ゾーム結合部位をコードするDNA配列はグラム陽性菌ま
たはグラム陽性菌由来でBacillus、特にB.subtilis、お
よび他のグラム陽性菌中で機能することの出来るリボゾ
ーム結合部位をコードするDNA配列より調製されるもの
で、既知のいくつかのものを含む（J.R.McLaughlinら、
J.Biol.Chem.256巻、11283〜11291頁〔1981年〕;C.P.Mo
ran Jr.ら、Mol.Gen.Genetics186巻、339〜346頁〔1982
年〕）。
しかしながら、本発明で使用される好ましいリボゾー
ム結合部位をコードする配列は下記の第２表に示す式で
表わされる可動性リボゾーム結合部位をコードする合成
のDNA配列（SRBS）である。
ム結合部位をコードする配列は下記の第２表に示す式で
表わされる可動性リボゾーム結合部位をコードする合成
のDNA配列（SRBS）である。
これらのSRBSは原核細胞または真核細胞ポリペプチド
をコードするいかなる遺伝子とも連動してBacillus、特
にB.subtilis、および他のグラム陽性菌中で機能できる
ように構築されている。そのような機能を保持すること
でSRBSは“移動可能”と言える。
をコードするいかなる遺伝子とも連動してBacillus、特
にB.subtilis、および他のグラム陽性菌中で機能できる
ように構築されている。そのような機能を保持すること
でSRBSは“移動可能”と言える。
転写終了DNA配列はグラム陰性細菌由来のターミネー
ターでBacillus、特にB.subtilis、および他のグラム陽
性菌で機能できるものから調製される。本発明で使用さ
れる好ましいグラム陰性菌ターミネーターとしては、E.
coli由来のターミネーターt0（M.Rosenbergら、Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA、73巻、717〜721頁〔1976年〕）、T
1、T2（J.Brosiusら、J.Mol.Biol.148巻、107〜127頁
〔1981年〕）、およびT7（J.J.DunnおよびF.W.Studie
r、Nucleic Acids Res.8巻、2119〜2132頁〔1980年〕）
がある。
ターでBacillus、特にB.subtilis、および他のグラム陽
性菌で機能できるものから調製される。本発明で使用さ
れる好ましいグラム陰性菌ターミネーターとしては、E.
coli由来のターミネーターt0（M.Rosenbergら、Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA、73巻、717〜721頁〔1976年〕）、T
1、T2（J.Brosiusら、J.Mol.Biol.148巻、107〜127頁
〔1981年〕）、およびT7（J.J.DunnおよびF.W.Studie
r、Nucleic Acids Res.8巻、2119〜2132頁〔1980年〕）
がある。
本発明の転写開始DNA配列、移動可能なリボゾーム結
合部位をコードする配列、および転写終了配列は、例え
ばヌクレオチド合成器のように相当するDNA配列の全化
学合成を含むDNA化学でよく知られる方法により得られ
る。
合部位をコードする配列、および転写終了配列は、例え
ばヌクレオチド合成器のように相当するDNA配列の全化
学合成を含むDNA化学でよく知られる方法により得られ
る。
本発明はさらに原核細胞および真核細胞たん白質をコ
ードする遺伝子を形成転換したBacillus、特にB.subtil
is、或いは他のグラム陽性菌中で発現するよう指示でき
る以下の配列を含む発現ベクターをも包含する：（ａ）
転写の下流方向に向つて次の単位を有するグラム陽性細
菌発現調節DNA配列：少なくとも一個のグラム陰性細菌
由来の転写開始DNA配列がグラム陽性菌又はグラム陽性
菌由来のリボゾーム結合部位をコードするDNA配列と結
合し、任意に原核細胞または真核細胞ポリペプチドをコ
ードする外来遺伝子、および転写終了DNA配列、（ｂ）
少なくとも一個のベクターの複製開始点、および（ｃ）
少なくとも一個の抗生物質耐性遺伝子。またこのようは
発現ベクターの製造方法をも包含する。
ードする遺伝子を形成転換したBacillus、特にB.subtil
is、或いは他のグラム陽性菌中で発現するよう指示でき
る以下の配列を含む発現ベクターをも包含する：（ａ）
転写の下流方向に向つて次の単位を有するグラム陽性細
菌発現調節DNA配列：少なくとも一個のグラム陰性細菌
由来の転写開始DNA配列がグラム陽性菌又はグラム陽性
菌由来のリボゾーム結合部位をコードするDNA配列と結
合し、任意に原核細胞または真核細胞ポリペプチドをコ
ードする外来遺伝子、および転写終了DNA配列、（ｂ）
少なくとも一個のベクターの複製開始点、および（ｃ）
少なくとも一個の抗生物質耐性遺伝子。またこのようは
発現ベクターの製造方法をも包含する。
転写開始DNA配列はグラム陽性菌プロモーターから得
られる。使用される好ましいグラム陰性菌プロモーター
は第１表に示す式を有する大腸菌フアージT5または大腸
菌フアージT7プロモーターである。リボゾーム結合部位
をコードするDNA配列は、グラム陽性菌またはグラム陰
性菌由来でBacillus、特にB.subtilis、および他のグラ
ム陽性菌中で機能することのできるリボゾーム結合部位
をコードするDNA配列より調製されるもので、既知のも
のを含む（J.R.McLaughlinら、前述;C.P.Moran Jr.ら、
Mol.Gen.Genetics、186巻、339〜346頁〔1982年〕）。
リボゾーム結合部位をコードする好ましいDNA配列は第
２表に示す式を有する、リボゾーム結合部位をコードす
る移動可能な合成DNA配列である。転写終了DNA配列は、
グラム陰性細菌由来でBacillues、特にB.subtilis、お
よび他のグラム陽性菌中で機能可能なターミネーターよ
り得られる。本発明で使用される好ましい転写終了DNA
配列としてはグラム陰性E.coliターミネーターt0（M.Ro
senbergら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA73巻、717〜721頁
〔1976年〕、T1、T2（J.Brodiusら、J.Mol.Biol.148
巻、107〜127頁〔1981年〕）、およびT7（J.J.Dunnおよ
びF.W.Studier、Nucleic Acids Res.8巻、2119〜2132頁
〔1980年〕）。複製開始点はグラム陰性菌および／また
はグラム陽性菌由来のものであり、従つて本発明の発現
ベクターはシヤトルベクターとして使用可能であり（S.
D.Ehrliclr、Proc.Natl.Acad.Sci.USA75巻、1433〜1436
頁〔1978年〕;J.Kreftら、Mol.Gen.Genetics162巻、59
〜67頁〔1978年〕;B.Michelら、Gene 12巻、147〜154頁
〔1980年〕）、E.coliおよびBacillus、特にB.subtilis
の両者で複製可能である。リボゾーム結合部位をコード
する合成DNA配列を大腸菌フアージT5のプロモーターに
結合して使用し、E.coliおよびB.subtilisの両方で複製
可能（シヤトルベクター）な好ましい発現ベクターは実
施例４および５、並びに実施例７〜10に記載されてい
る。
られる。使用される好ましいグラム陰性菌プロモーター
は第１表に示す式を有する大腸菌フアージT5または大腸
菌フアージT7プロモーターである。リボゾーム結合部位
をコードするDNA配列は、グラム陽性菌またはグラム陰
性菌由来でBacillus、特にB.subtilis、および他のグラ
ム陽性菌中で機能することのできるリボゾーム結合部位
をコードするDNA配列より調製されるもので、既知のも
のを含む（J.R.McLaughlinら、前述;C.P.Moran Jr.ら、
Mol.Gen.Genetics、186巻、339〜346頁〔1982年〕）。
リボゾーム結合部位をコードする好ましいDNA配列は第
２表に示す式を有する、リボゾーム結合部位をコードす
る移動可能な合成DNA配列である。転写終了DNA配列は、
グラム陰性細菌由来でBacillues、特にB.subtilis、お
よび他のグラム陽性菌中で機能可能なターミネーターよ
り得られる。本発明で使用される好ましい転写終了DNA
配列としてはグラム陰性E.coliターミネーターt0（M.Ro
senbergら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA73巻、717〜721頁
〔1976年〕、T1、T2（J.Brodiusら、J.Mol.Biol.148
巻、107〜127頁〔1981年〕）、およびT7（J.J.Dunnおよ
びF.W.Studier、Nucleic Acids Res.8巻、2119〜2132頁
〔1980年〕）。複製開始点はグラム陰性菌および／また
はグラム陽性菌由来のものであり、従つて本発明の発現
ベクターはシヤトルベクターとして使用可能であり（S.
D.Ehrliclr、Proc.Natl.Acad.Sci.USA75巻、1433〜1436
頁〔1978年〕;J.Kreftら、Mol.Gen.Genetics162巻、59
〜67頁〔1978年〕;B.Michelら、Gene 12巻、147〜154頁
〔1980年〕）、E.coliおよびBacillus、特にB.subtilis
の両者で複製可能である。リボゾーム結合部位をコード
する合成DNA配列を大腸菌フアージT5のプロモーターに
結合して使用し、E.coliおよびB.subtilisの両方で複製
可能（シヤトルベクター）な好ましい発現ベクターは実
施例４および５、並びに実施例７〜10に記載されてい
る。
本発明の発現ベクターは文献で公知のDNA組換え技術
を用いて構築され（Maniatisらの実験マニユアル“Mole
cular Cloning"、Cold Spring Harbor Laboratory、198
2年、参照）以下のステツプより成る。
を用いて構築され（Maniatisらの実験マニユアル“Mole
cular Cloning"、Cold Spring Harbor Laboratory、198
2年、参照）以下のステツプより成る。
（ａ） 既存のクローニングベクターに転写下流方向に
少なくとも一個のグラム陰性菌由来の転写開始DNA配列
と、グラム陽性菌またはグラム陽性菌由来のリボゾーム
結合部位をコードするDNA配列とを挿入し、 （ｂ） 該クローニングベクターに少なくとも一個の制
限酵素切断部位を該リボゾーム結合部位をコードするDN
A配列に隣接して組み入れ、 （ｃ） 該リボゾーム結合部をコードするDNA配列に隣
接する該制限酵素部位に、原核細胞または真核細胞ポリ
ペプチドをコードする少なくとも一個の外来遺伝子を挿
入し、そして、 （ｄ） 原核細胞または真核細胞ポリペプチドをコード
する該外来遺伝子の下流方向に少なくとも一個の転写終
了DNA配列を挿入する。
少なくとも一個のグラム陰性菌由来の転写開始DNA配列
と、グラム陽性菌またはグラム陽性菌由来のリボゾーム
結合部位をコードするDNA配列とを挿入し、 （ｂ） 該クローニングベクターに少なくとも一個の制
限酵素切断部位を該リボゾーム結合部位をコードするDN
A配列に隣接して組み入れ、 （ｃ） 該リボゾーム結合部をコードするDNA配列に隣
接する該制限酵素部位に、原核細胞または真核細胞ポリ
ペプチドをコードする少なくとも一個の外来遺伝子を挿
入し、そして、 （ｄ） 原核細胞または真核細胞ポリペプチドをコード
する該外来遺伝子の下流方向に少なくとも一個の転写終
了DNA配列を挿入する。
本発明の発現ベクターを構築するために用いるベクタ
ーは適当ないかなるベクター、コスミド、或いはフアー
ジで形質転換でき、宿主微生物中でそれ自体複製可能な
ものである。B.subtilisおよび／またはE.coliでのクロ
ーニングに適したプラスミドは、例えばManiatisらの実
験マニユアル“Molecular Cloning"（前述）およびJ.Pa
lvaの学位論文（ヘルシンキ大学）、1983年に記載され
ている。本発明の発現ベクターを構築するために使用さ
れるプラスミド由来の好ましいベクターはpVB110（T.J.
Gryczanら、J.Bacteriol、134巻、318〜329頁〔1978
年〕）、pDS5およびpDS6（D.Stueberら、EMBO J、３
巻、3143〜3143頁〔1984年〕）である。
ーは適当ないかなるベクター、コスミド、或いはフアー
ジで形質転換でき、宿主微生物中でそれ自体複製可能な
ものである。B.subtilisおよび／またはE.coliでのクロ
ーニングに適したプラスミドは、例えばManiatisらの実
験マニユアル“Molecular Cloning"（前述）およびJ.Pa
lvaの学位論文（ヘルシンキ大学）、1983年に記載され
ている。本発明の発現ベクターを構築するために使用さ
れるプラスミド由来の好ましいベクターはpVB110（T.J.
Gryczanら、J.Bacteriol、134巻、318〜329頁〔1978
年〕）、pDS5およびpDS6（D.Stueberら、EMBO J、３
巻、3143〜3143頁〔1984年〕）である。
p602およびp25のプラスミドは本発明のプラスミド性
シヤトルベクターの具体例である。それらの調製は実施
例１〜５および７〜10により詳細に記載されている。p2
5群の特に好ましいプラスミドを含有するB.subtilis菌
株（p25RBS I;p25RBS II;p25＊RBS IIで形質転換したB.
subtilis BR151）はゲツチンゲンのDeutsche Sammlung
vonMikroorganismen（DSM）に1985年６月20日、それぞ
れ寄託番号DSM3350、DSM3351およびDSM3352として寄託
されている。p602群の特に好ましいプラスミドを含有す
るB.subtilisの菌株（p602/18;p602/19;p602/20;p602/2
1で形質転換したB.subtilis BR151はゲツチンゲンのDeu
tsche Sammlung von Mikroorganismen（DSM）に1986年
５月14日付けで、それぞれ寄託番号DSM3723、DSM3724、
DSM3725およびDSM3726として寄託されている。
シヤトルベクターの具体例である。それらの調製は実施
例１〜５および７〜10により詳細に記載されている。p2
5群の特に好ましいプラスミドを含有するB.subtilis菌
株（p25RBS I;p25RBS II;p25＊RBS IIで形質転換したB.
subtilis BR151）はゲツチンゲンのDeutsche Sammlung
vonMikroorganismen（DSM）に1985年６月20日、それぞ
れ寄託番号DSM3350、DSM3351およびDSM3352として寄託
されている。p602群の特に好ましいプラスミドを含有す
るB.subtilisの菌株（p602/18;p602/19;p602/20;p602/2
1で形質転換したB.subtilis BR151はゲツチンゲンのDeu
tsche Sammlung von Mikroorganismen（DSM）に1986年
５月14日付けで、それぞれ寄託番号DSM3723、DSM3724、
DSM3725およびDSM3726として寄託されている。
本発明の発現ベクターに挿入される外来遺伝子はin v
ivoおよびin vitroで原核細胞または真核細胞ポリペプ
チドをコードする各種遺伝子（DNA遺伝子またはRNA遺伝
子のDNAコピー）から選ぶことができる。例えば、遺伝
子は酵素、ホルモン、免疫調節、抗ウイルス性、または
抗癌性を有するポリペプチド、抗体、抗原およびその他
の原核細胞または真核細胞由来のポリペプチドをコード
する。本発明で使用する好ましい外来遺伝子はE.coliの
クロラムフエニコール・アセチルトランスフエラーゼ
（cat）およびマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（dhf
r）の遺伝子である。
ivoおよびin vitroで原核細胞または真核細胞ポリペプ
チドをコードする各種遺伝子（DNA遺伝子またはRNA遺伝
子のDNAコピー）から選ぶことができる。例えば、遺伝
子は酵素、ホルモン、免疫調節、抗ウイルス性、または
抗癌性を有するポリペプチド、抗体、抗原およびその他
の原核細胞または真核細胞由来のポリペプチドをコード
する。本発明で使用する好ましい外来遺伝子はE.coliの
クロラムフエニコール・アセチルトランスフエラーゼ
（cat）およびマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（dhf
r）の遺伝子である。
本発明による改良発現調節システムを用いて発現され
得るたん白質の例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、クロ
ラムフエニコールアセチルトランスフエラーゼ、マラリ
ア表面抗原、IL−２、インタフエロンアルフア、ベー
タ、ガンマのようなリンフオカイン類、インシユリンお
よびインシユリン前躯体、成長ホルオン、テイシユ・プ
ラスミノーゲンアクチベーター、ヒトレニン或いはHTLV
−IIIたん白などがある。
得るたん白質の例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、クロ
ラムフエニコールアセチルトランスフエラーゼ、マラリ
ア表面抗原、IL−２、インタフエロンアルフア、ベー
タ、ガンマのようなリンフオカイン類、インシユリンお
よびインシユリン前躯体、成長ホルオン、テイシユ・プ
ラスミノーゲンアクチベーター、ヒトレニン或いはHTLV
−IIIたん白などがある。
本発明の発現ベクター、特にシヤトルベクターを用い
て原核細胞または真核細胞たん白をコードする遺伝子を
発現する方法はよく知られている（Maniatisら、前
述）。それは、目的のDNA配列が本発明の発現調節DNA配
列に機能的に挿入されている発現ベクターで適当な宿主
を形質転換し、生育の適当な条件下で宿主を培養し、培
養物から目的のポリペプチドを単離することにより成
る。本技術に熟練している者は本発明の範囲から出るこ
となく、個々の遺伝子の発現に最も効率のよい公知の方
法を選ぶことができる。
て原核細胞または真核細胞たん白をコードする遺伝子を
発現する方法はよく知られている（Maniatisら、前
述）。それは、目的のDNA配列が本発明の発現調節DNA配
列に機能的に挿入されている発現ベクターで適当な宿主
を形質転換し、生育の適当な条件下で宿主を培養し、培
養物から目的のポリペプチドを単離することにより成
る。本技術に熟練している者は本発明の範囲から出るこ
となく、個々の遺伝子の発現に最も効率のよい公知の方
法を選ぶことができる。
本発明で用いる特別の宿主の選択はこの分野で認めら
れている多くの要因に依存している。例えば、選んだ発
現ベクターとの適合性、雑種プラスミドによりコードさ
れるたん白質の毒性、目的たん白質の回収の容易さ、発
現の特徴、生物安全性およびコストなどである。これら
の一般的指針の範囲内で有用な宿主細菌はグラム陰性お
よびグラム陽性細菌、特にE.coliおよびB.subtilis菌株
である。本発明における最も好ましい宿主細胞はB.subt
ilis BR151（Bacillus Genetic Stock CenterにおいてB
GSC No.1A40として保存されている）である。しかしな
がら、他のB.subtilis菌株、例えばB.subtilis BD170
（Bacillus Genetic Stock CenterにてBGSC No.1A42と
して保存）およびB.subtilis JH646（Bacillus Genetic
Stock CenterにてBGSC No.1S9として保存）なども使用
できる。
れている多くの要因に依存している。例えば、選んだ発
現ベクターとの適合性、雑種プラスミドによりコードさ
れるたん白質の毒性、目的たん白質の回収の容易さ、発
現の特徴、生物安全性およびコストなどである。これら
の一般的指針の範囲内で有用な宿主細菌はグラム陰性お
よびグラム陽性細菌、特にE.coliおよびB.subtilis菌株
である。本発明における最も好ましい宿主細胞はB.subt
ilis BR151（Bacillus Genetic Stock CenterにおいてB
GSC No.1A40として保存されている）である。しかしな
がら、他のB.subtilis菌株、例えばB.subtilis BD170
（Bacillus Genetic Stock CenterにてBGSC No.1A42と
して保存）およびB.subtilis JH646（Bacillus Genetic
Stock CenterにてBGSC No.1S9として保存）なども使用
できる。
以下に続く実施例は以下の図面を参照してより詳細に
本発明を説明するためのものである。
本発明を説明するためのものである。
制限エンドヌクレアーゼは以下のように略称した。
E:EcoR I;Sm:Sma I;B:BamH I;S:Sal I;P:Pst I;H:Hind
III;Xh:Xho I;X:Xba I;K:Kpn I;Pv:Pvu II;A:Acc I;Sp:
Sph I;Bg:Bgl II;D;Dra I その他の略称は以下の通りである。
III;Xh:Xho I;X:Xba I;K:Kpn I;Pv:Pvu II;A:Acc I;Sp:
Sph I;Bg:Bgl II;D;Dra I その他の略称は以下の通りである。
Kan:カナマイシンヌクレオチジルトランスフエラーゼの
構造遺伝子； cat:クロラムフエニコールアセチルトランスフエラーゼ
の構造遺伝子； dhfr:マウス ジヒドロ葉酸レダクターゼの構造遺伝
子； bla:ベータ・ラクタマーゼ構造遺伝子； CAT:クロラムフエニコールアセチルトランスフエラーゼ
たん白； DHFR:ジヒドロ葉酸レダクターゼたん白； ori＋：グラム陽性菌複製開始点； ori−：グラム陰性菌複製開始点； SRBS:リボゾーム結合部位をコードする可動合成DNA配
列； RBS:リボゾーム結合部をコードするDNA配列； SD:シヤインダルガノ配列； t0、T1、T2、T7:転写ターミネーターt0、T1、T2、T7;お
よび （Ｈ）:Hind IIIの接着末端をHind III末端に結合してH
ind III部位をつぶしたもの。
構造遺伝子； cat:クロラムフエニコールアセチルトランスフエラーゼ
の構造遺伝子； dhfr:マウス ジヒドロ葉酸レダクターゼの構造遺伝
子； bla:ベータ・ラクタマーゼ構造遺伝子； CAT:クロラムフエニコールアセチルトランスフエラーゼ
たん白； DHFR:ジヒドロ葉酸レダクターゼたん白； ori＋：グラム陽性菌複製開始点； ori−：グラム陰性菌複製開始点； SRBS:リボゾーム結合部位をコードする可動合成DNA配
列； RBS:リボゾーム結合部をコードするDNA配列； SD:シヤインダルガノ配列； t0、T1、T2、T7:転写ターミネーターt0、T1、T2、T7;お
よび （Ｈ）:Hind IIIの接着末端をHind III末端に結合してH
ind III部位をつぶしたもの。
第１図：グラム陽性菌の（orit）およびグラム陰性菌の
（ori−）複製開始点と共にカナマイシン（kan）および
クロラムフエニコール薬剤耐性マーカーを含む基本的な
E.coli/B.subtilisシヤトルベクターp602/5の構築を示
す。この結果、本プラスミドはE.coliおよびB.subtilis
の両者でカナイマイシン耐性を示す。クロラムフエニコ
ール耐性はEco R I（Ｅ）とHind III（Ｈ）部位の間に
プロモーターを含むフラグメントを挿入することで出現
する。こゝで示すE.coli cat遺伝子は天然のリボゾーム
結合部位をコードするDNA配列を有する。
（ori−）複製開始点と共にカナマイシン（kan）および
クロラムフエニコール薬剤耐性マーカーを含む基本的な
E.coli/B.subtilisシヤトルベクターp602/5の構築を示
す。この結果、本プラスミドはE.coliおよびB.subtilis
の両者でカナイマイシン耐性を示す。クロラムフエニコ
ール耐性はEco R I（Ｅ）とHind III（Ｈ）部位の間に
プロモーターを含むフラグメントを挿入することで出現
する。こゝで示すE.coli cat遺伝子は天然のリボゾーム
結合部位をコードするDNA配列を有する。
第２図：一般の発現ベクターp602/7およびp602/25、並
びにリボゾーム結合部位をコードするDNA配列SRBS Iお
よびSRBS IIをそれぞれ有するベクターp602/7 RBS Iお
よびp602/7 RBS IIの構築を示す。リボゾーム結合部位
をコードするDNA配列SRBS IおよびSRBS IIを挿入するこ
とにより、野生型のcatリボゾーム結合部−DNA配列から
の天然のCATたん白とそれぞれSRBS I又はSRBS IIに由来
する融合CATたん白の２種のCATたん白質をE.coli中で合
成するようになる。B.subtilis中ではリボゾーム接合部
位−DNA配列、SRBS IおよびSRBS IIに起因する融合CAT
たん白のみ生産される。p602/7、p602/25、p602/7 RBS
Iおよびp602/7 RBS IIの全てのプラスミド共E.coliおよ
びB.subtilisの両方でクロラムフエニコール耐性を示
す。
びにリボゾーム結合部位をコードするDNA配列SRBS Iお
よびSRBS IIをそれぞれ有するベクターp602/7 RBS Iお
よびp602/7 RBS IIの構築を示す。リボゾーム結合部位
をコードするDNA配列SRBS IおよびSRBS IIを挿入するこ
とにより、野生型のcatリボゾーム結合部−DNA配列から
の天然のCATたん白とそれぞれSRBS I又はSRBS IIに由来
する融合CATたん白の２種のCATたん白質をE.coli中で合
成するようになる。B.subtilis中ではリボゾーム接合部
位−DNA配列、SRBS IおよびSRBS IIに起因する融合CAT
たん白のみ生産される。p602/7、p602/25、p602/7 RBS
Iおよびp602/7 RBS IIの全てのプラスミド共E.coliおよ
びB.subtilisの両方でクロラムフエニコール耐性を示
す。
第３図：大腸菌フアージT5プロモーターPEG25をリボゾ
ーム結合部位−合成DNA配列SRBS I,SRBS IIのそれぞれ
と結合して含有しているベクターp25RBS I.p25RBS IIお
よびp25＊RBS IIの構築を示す。ベクターp25RBS Iを含
有するB.subtilisの細胞はSRBS Iのすぐ下流付近に由来
するたん白とPG25のすぐ近くのリボゾーム結合部位に由
来するものと二つの融合CATたん白質を合成する。後者
のリボゾーム結合部位に由来するたん白合成はSRB IIの
上流に転写終了コドンを入れることにより除去され、そ
の結合p25＊RBS IIベクターが得られる。p25＊RBS IIを
含有する細胞はSRBS IIに由来する一つのCATたん白を合
成する。
ーム結合部位−合成DNA配列SRBS I,SRBS IIのそれぞれ
と結合して含有しているベクターp25RBS I.p25RBS IIお
よびp25＊RBS IIの構築を示す。ベクターp25RBS Iを含
有するB.subtilisの細胞はSRBS Iのすぐ下流付近に由来
するたん白とPG25のすぐ近くのリボゾーム結合部位に由
来するものと二つの融合CATたん白質を合成する。後者
のリボゾーム結合部位に由来するたん白合成はSRB IIの
上流に転写終了コドンを入れることにより除去され、そ
の結合p25＊RBS IIベクターが得られる。p25＊RBS IIを
含有する細胞はSRBS IIに由来する一つのCATたん白を合
成する。
第４図：発現ベクターp25RBS I,p25RBS IIおよびp25＊R
BS IIを含有するB,subtilis BR151で生産される全たん
白質を示す。SRBS IまたはSRBS IIに基づいて合成され
るCATたん白質の位置を“CAT"で示し、p25RBS IIを有す
る細胞のもう一つの融合CATたん白を“fCAT"で示した。
LYSは細胞融合を補助するため添加したリゾチームの位
置を示す。
BS IIを含有するB,subtilis BR151で生産される全たん
白質を示す。SRBS IまたはSRBS IIに基づいて合成され
るCATたん白質の位置を“CAT"で示し、p25RBS IIを有す
る細胞のもう一つの融合CATたん白を“fCAT"で示した。
LYSは細胞融合を補助するため添加したリゾチームの位
置を示す。
第５図：ベクターp25RBS I.p15RBS IIおよびp25＊RBS I
Iを含有するB.subtilis中でのCATたん白質合成を模式図
により示する。挿入した翻訳停止コドン によりPG25RBSからcat遺伝子までの翻訳継続を阻止でき
る。p25RBS IIではそのようなフレームの合つた停止コ
ドンが存在しないためcatたん白はRBSおよびSRBS IIの
両方から生成する。p25＊RBS IIにおけるHind III部位
の修飾の結果、SRBS IIのみから単一のCATたん白泣を生
成する。
Iを含有するB.subtilis中でのCATたん白質合成を模式図
により示する。挿入した翻訳停止コドン によりPG25RBSからcat遺伝子までの翻訳継続を阻止でき
る。p25RBS IIではそのようなフレームの合つた停止コ
ドンが存在しないためcatたん白はRBSおよびSRBS IIの
両方から生成する。p25＊RBS IIにおけるHind III部位
の修飾の結果、SRBS IIのみから単一のCATたん白泣を生
成する。
第６図：第１表に示したプロモーターのインビトロ系転
写解析を示す。“Ec"および“Bs"はそれぞれE.coliおよ
びB.subtilis RNAポリメラーゼによる解析を表わし、数
字は転写を行なわせた塩濃度を示す。プロモーターをク
ローン化したベクターで‘ovi'および‘bla'転写物が生
じている。‘veg'と示した列はB.subtilis vegプロモー
ター（S.F.J.Le GriceおよびA.L.Sonenshein,J.Mcl.Bio
l.,162巻,551〜564頁,1982年）のみの転写物を示す。横
に‘veg'と示してあるのは内部標準のvegプロモーターD
NAである。ＭはHpa IIで切断したpBR322の分子量マーカ
ーである。本研究で対応する大きさのバンドのみ示し
た。T5プロモーターPK28a/PK28bは両プロモーターが同
一の制限断片上に存在するため、これらのプロモーター
からの転写物には新しい２つのものが認められる。
写解析を示す。“Ec"および“Bs"はそれぞれE.coliおよ
びB.subtilis RNAポリメラーゼによる解析を表わし、数
字は転写を行なわせた塩濃度を示す。プロモーターをク
ローン化したベクターで‘ovi'および‘bla'転写物が生
じている。‘veg'と示した列はB.subtilis vegプロモー
ター（S.F.J.Le GriceおよびA.L.Sonenshein,J.Mcl.Bio
l.,162巻,551〜564頁,1982年）のみの転写物を示す。横
に‘veg'と示してあるのは内部標準のvegプロモーターD
NAである。ＭはHpa IIで切断したpBR322の分子量マーカ
ーである。本研究で対応する大きさのバンドのみ示し
た。T5プロモーターPK28a/PK28bは両プロモーターが同
一の制限断片上に存在するため、これらのプロモーター
からの転写物には新しい２つのものが認められる。
第７図：大腸菌フアージプロモーターPN25が合成リボゾ
ーム結合部位−DNA配列RBS II,9A（p602/18）またはRBS
II,3A＋5A（p602/19）に機能的に結合して有している
シヤトルベクターp602/18およびp602/19の構築を示す。
いずれの場合も合成リボゾーム結合部位−DNA配列を挿
入することにより合成リボゾーム結合部位のすぐ近くに
より融合CATたん白の合成を開始し、cat遺伝子の天然の
翻訳停止コドンで停止するようになる。p602/18およびp
602/19の両プラスミド共B.subtilisでクロラムフエニコ
ール耐性を示す。
ーム結合部位−DNA配列RBS II,9A（p602/18）またはRBS
II,3A＋5A（p602/19）に機能的に結合して有している
シヤトルベクターp602/18およびp602/19の構築を示す。
いずれの場合も合成リボゾーム結合部位−DNA配列を挿
入することにより合成リボゾーム結合部位のすぐ近くに
より融合CATたん白の合成を開始し、cat遺伝子の天然の
翻訳停止コドンで停止するようになる。p602/18およびp
602/19の両プラスミド共B.subtilisでクロラムフエニコ
ール耐性を示す。
第８図：大腸菌フアージプロモーターPN25が合成リボゾ
ーム結合部位のDNA配列RBS II（p602/20）またはRBS I
I,3A＋5A（p602/21）に機能的に結合して有しているシ
ヤトルベクターp602/20およびp602/21の構築を示す。い
ずれのプラスミドの場合も、合成リボゾーム結合部位−
DNA配列を挿入することにより、合成リボゾーム結合部
位のすぐ下流から融合DHFRたん白を合成し、dhfr遺伝子
の天然の翻訳停止コドンで停止するようになる。p602/2
0またはp602/21を含有するB.subtilisの細胞は10μg/ml
のトリメトプリムに耐性である。
ーム結合部位のDNA配列RBS II（p602/20）またはRBS I
I,3A＋5A（p602/21）に機能的に結合して有しているシ
ヤトルベクターp602/20およびp602/21の構築を示す。い
ずれのプラスミドの場合も、合成リボゾーム結合部位−
DNA配列を挿入することにより、合成リボゾーム結合部
位のすぐ下流から融合DHFRたん白を合成し、dhfr遺伝子
の天然の翻訳停止コドンで停止するようになる。p602/2
0またはp602/21を含有するB.subtilisの細胞は10μg/ml
のトリメトプリムに耐性である。
第９図：プラスミドp602/18,p602/19,p602/20およびp60
2/21を含有するB.subtilis BR151株により合成される全
たん白質を示す。‘Cell'と示してあるのはプラスミド
を含有しない細胞でのたん白合成を表わす。対照として
p25＊RBS IIからのCAT合成も示してある。融合CATたん
白CAT＊（p602/18およびp602/19由来）の位置および融
合DHFRたん白（p602/20およびp602/21から）の位置は図
示してある。
2/21を含有するB.subtilis BR151株により合成される全
たん白質を示す。‘Cell'と示してあるのはプラスミド
を含有しない細胞でのたん白合成を表わす。対照として
p25＊RBS IIからのCAT合成も示してある。融合CATたん
白CAT＊（p602/18およびp602/19由来）の位置および融
合DHFRたん白（p602/20およびp602/21から）の位置は図
示してある。
一般的な方法 別に記載していない限り、以下の方法は前述のManiat
isらにより記載されている通り行なつた;37℃に於ける
制限エンドヌクレアーゼ消化（100〜101頁）;37℃に於
ける細菌アルカリフオスフアターゼ（BAP）により脱り
ん酸化（133〜134頁）;CaCl2処理E.coli HB101細胞への
DNAの形質転換および100μg/mlのアンピシリン含有LB培
地を含む寒天平板上での形質転換株の選択（250〜251
頁）;DNAプラスミドの調製（86〜94頁）；一本鎖DNA末
端の14℃に於けるDNAポリメラーゼＩの大断片（クレナ
ウ断片）による充填（113〜114頁）；アガロスゲルによ
るDNAの分離および断片の精製（164〜167頁）；サブク
ローニングへの合成DNAリンカーの使用（392〜397
頁）；およびSDS/ポリアクリルアミドゲル電気永動（34
8〜349頁）。
isらにより記載されている通り行なつた;37℃に於ける
制限エンドヌクレアーゼ消化（100〜101頁）;37℃に於
ける細菌アルカリフオスフアターゼ（BAP）により脱り
ん酸化（133〜134頁）;CaCl2処理E.coli HB101細胞への
DNAの形質転換および100μg/mlのアンピシリン含有LB培
地を含む寒天平板上での形質転換株の選択（250〜251
頁）;DNAプラスミドの調製（86〜94頁）；一本鎖DNA末
端の14℃に於けるDNAポリメラーゼＩの大断片（クレナ
ウ断片）による充填（113〜114頁）；アガロスゲルによ
るDNAの分離および断片の精製（164〜167頁）；サブク
ローニングへの合成DNAリンカーの使用（392〜397
頁）；およびSDS/ポリアクリルアミドゲル電気永動（34
8〜349頁）。
B.subtilis細胞へのDNAの形質転換はS.Contenteおよ
びD.Dobnauにより記載されている通り（Mcl.Gen.Geneti
cs,167巻,251〜258頁〔1979年〕）で行なつた。
びD.Dobnauにより記載されている通り（Mcl.Gen.Geneti
cs,167巻,251〜258頁〔1979年〕）で行なつた。
E.coliおよびB.subtilisのRNAポリメラーゼによる試
験管内転写は次の組成を有する50μの反応液中で行な
つた:40mMトリス／塩酸、pH7.9;10mM MgCl2;0.1mM DTT;
0.1mM EDTA;50〜200mM NaCl;10％（V/V）グリセロール;
150μM ATP,GTP,CTP;50μM UTP;5μCi32P−UTP（〜3000
Ci/m mole、アマーシヤム・ブフラー、ブラウンシユバ
イク）;0.05p moleエンドヌクレアーゼ消化DNA;0.25p m
ole RNAポリメラーゼ。反応はRNAポリメラーゼの添加に
より開始し、37℃１〜５分間行なつた。合成されたRNA
はエタノール沈でんをくり返えすことにより単離し、8M
尿素含有の５または８％ポリアクリルアミド製0.4mm厚
さの高圧ゲル電気永動で分析した。電気永動後、ゲルを
乾燥し、コダツク社製Ｘ−OMAT XAR5のフイルムを用い
て室温でオートラジオグラフイーに供した。
験管内転写は次の組成を有する50μの反応液中で行な
つた:40mMトリス／塩酸、pH7.9;10mM MgCl2;0.1mM DTT;
0.1mM EDTA;50〜200mM NaCl;10％（V/V）グリセロール;
150μM ATP,GTP,CTP;50μM UTP;5μCi32P−UTP（〜3000
Ci/m mole、アマーシヤム・ブフラー、ブラウンシユバ
イク）;0.05p moleエンドヌクレアーゼ消化DNA;0.25p m
ole RNAポリメラーゼ。反応はRNAポリメラーゼの添加に
より開始し、37℃１〜５分間行なつた。合成されたRNA
はエタノール沈でんをくり返えすことにより単離し、8M
尿素含有の５または８％ポリアクリルアミド製0.4mm厚
さの高圧ゲル電気永動で分析した。電気永動後、ゲルを
乾燥し、コダツク社製Ｘ−OMAT XAR5のフイルムを用い
て室温でオートラジオグラフイーに供した。
実施例 １ シヤトルベクターp602/5の構築 （Ｉ） ２μｇのプラスミドpUB110を制御酵素Pvu IIで
完全消化する。８塩基Kpn IリンカーをPvu II末端に結
合する。結合後、DNAをKpn IおよびEco R Iで完全消化
する。得られたDNA消化物を１μg/mlのエチジウムブロ
ミド含有の低融解１％アガロースゲルで電気永動にかけ
る。70Vで２時間電気永動後、DNAバンドを螢光で確認
し、3.5Kbのバンドをゲルから切り出す。この3.5KbのEc
o R I/Kpn I断片を低温融解アガロースでさらに精製す
る。
完全消化する。８塩基Kpn IリンカーをPvu II末端に結
合する。結合後、DNAをKpn IおよびEco R Iで完全消化
する。得られたDNA消化物を１μg/mlのエチジウムブロ
ミド含有の低融解１％アガロースゲルで電気永動にかけ
る。70Vで２時間電気永動後、DNAバンドを螢光で確認
し、3.5Kbのバンドをゲルから切り出す。この3.5KbのEc
o R I/Kpn I断片を低温融解アガロースでさらに精製す
る。
（II） プラスミドpDS55μｇをDra Iで完全消化し、Dr
a I末端に放射活性のKpn Iオクタマーリンカーを結合す
る。結合生成物をさらに制限酵素Kpn IおよびXba Iで完
全消化し、６％ポリアクリルアミドゲル電気永動で分離
する。およそ1.2KbのKpn I/Xba I断片をオードラジオグ
ラフイーで位置の確認し、ゲルより切り出す。Kpn I/Xb
a I断片をさらにアクリルアミドゲルで精製する。
a I末端に放射活性のKpn Iオクタマーリンカーを結合す
る。結合生成物をさらに制限酵素Kpn IおよびXba Iで完
全消化し、６％ポリアクリルアミドゲル電気永動で分離
する。およそ1.2KbのKpn I/Xba I断片をオードラジオグ
ラフイーで位置の確認し、ゲルより切り出す。Kpn I/Xb
a I断片をさらにアクリルアミドゲルで精製する。
（III） ５μｇのプラスミドpDS5を制限エンドヌクレ
アーゼEco R IおよびXba Iで完全消化し、１μ/mlのエ
チジウムクロリド含有の１％低温融解アガロースゲル電
気永動で分離する。電気永動後、DNAバンドを螢光で確
認し、およそ900bpのEcoR I/Xba I断片を切り出す。Eco
R I/Xba I断片をさらに低温融解アガロースで精製す
る。
アーゼEco R IおよびXba Iで完全消化し、１μ/mlのエ
チジウムクロリド含有の１％低温融解アガロースゲル電
気永動で分離する。電気永動後、DNAバンドを螢光で確
認し、およそ900bpのEcoR I/Xba I断片を切り出す。Eco
R I/Xba I断片をさらに低温融解アガロースで精製す
る。
（IV） ステツプ（Ｉ）およびステツプ（III）の精製
したDNA断片の等量を結合し、結合生成物をE.coli AB/1
57株（Maniatisら、前述）のコンピーテント細胞に形質
転換する。形質転換株を10μg/mlカナマイシン含有のLB
寒天上にプレートする。カナマイシン耐性コロニーから
プラスミドDNAを単離し、制限酵素切断によりそれぞれ
の断片の挿入を確認する。このようにして得られるプラ
スミドをp602/5と命名する。p602/5の構築を第１図に図
示する。
したDNA断片の等量を結合し、結合生成物をE.coli AB/1
57株（Maniatisら、前述）のコンピーテント細胞に形質
転換する。形質転換株を10μg/mlカナマイシン含有のLB
寒天上にプレートする。カナマイシン耐性コロニーから
プラスミドDNAを単離し、制限酵素切断によりそれぞれ
の断片の挿入を確認する。このようにして得られるプラ
スミドをp602/5と命名する。p602/5の構築を第１図に図
示する。
実施例 ２ リボゾーム結合部位をコードする可動性合成DNA配列を
含む発現ベクターp602/7 RBS Iおよびp602/7 RBS IIの
構築 （Ｉ） ２μｇのプラスミドp602/5を制限エンドヌクレ
アーゼEco R IおよびHind IIIで完全消化し、およそ5.6
Kbのベクター由来DNA断片を得る。この断片を以下のDNA
配列を有するB.subtilisプロモーターPv IIを含む125bp
のEco R I/Hind III断片と結合する： 結合生成物をE.coli AB1157株に形質転換し、形質転
換株を50μg/mlのクロラムフエニコール含有LB寒天上で
選択する。クロラムフエニコール耐性コロニーについて
プロモーターPv IIが602/5プラスミドに挿入しているこ
とを確認のため分析する。
含む発現ベクターp602/7 RBS Iおよびp602/7 RBS IIの
構築 （Ｉ） ２μｇのプラスミドp602/5を制限エンドヌクレ
アーゼEco R IおよびHind IIIで完全消化し、およそ5.6
Kbのベクター由来DNA断片を得る。この断片を以下のDNA
配列を有するB.subtilisプロモーターPv IIを含む125bp
のEco R I/Hind III断片と結合する： 結合生成物をE.coli AB1157株に形質転換し、形質転
換株を50μg/mlのクロラムフエニコール含有LB寒天上で
選択する。クロラムフエニコール耐性コロニーについて
プロモーターPv IIが602/5プラスミドに挿入しているこ
とを確認のため分析する。
（II） ２μｇのプラスミドp602/7を制限酵素Hind III
で完全消化する。次の配列を有するリボゾール結合部位
をコードする可動性合成DNA配列SRBS IをHind IIIの部
位に結合する。結合生成分をE.coli AB1157株に形質転
換し、形質転換株を50μg/mlの クロラムフエニコール含有LB寒天上で選択する。クロラ
ムフエニコール耐性コロニーについて以下の方法により
ボゾーム結合部位をコードする可動合成DNA配列SRBS I
を含有するプラスミドの有無を分析する。
で完全消化する。次の配列を有するリボゾール結合部位
をコードする可動性合成DNA配列SRBS IをHind IIIの部
位に結合する。結合生成分をE.coli AB1157株に形質転
換し、形質転換株を50μg/mlの クロラムフエニコール含有LB寒天上で選択する。クロラ
ムフエニコール耐性コロニーについて以下の方法により
ボゾーム結合部位をコードする可動合成DNA配列SRBS I
を含有するプラスミドの有無を分析する。
ａ） SRBS IからのCAT融合たん白の合性能力 ｂ） 新たに獲得したSph I部位を有する組換えプラス
ミドの制限酵素分析 このような解析のできたプラスミドDNAをp602/7 RBS
Iと命名した。この後p602/7 RBS I DNAをB.subtilis BR
151株に形質転換し、クロラムフエニコール耐性コロニ
ー（この場合、10μg/mlのクロラムフエニコール耐性コ
ロニー）につき上記（II）のａ）およびｂ）により分析
してB.subtilis中でのSRBS Iの有効性を確認する。
ミドの制限酵素分析 このような解析のできたプラスミドDNAをp602/7 RBS
Iと命名した。この後p602/7 RBS I DNAをB.subtilis BR
151株に形質転換し、クロラムフエニコール耐性コロニ
ー（この場合、10μg/mlのクロラムフエニコール耐性コ
ロニー）につき上記（II）のａ）およびｂ）により分析
してB.subtilis中でのSRBS Iの有効性を確認する。
（III） プラスミドp602/7 RBS IをHind IIIおよびSph
Iで完全消化し、１μg/mlのエチジウムブロミド含有の
１％低温融解性アガロースゲルによる電気永動によりSR
BS Iと分離する。電気永動後、DNAを螢光で確認し、ゲ
ルより切り出す。続いてDNAをアガロースより精製す
る。以下の配列を有するSRBS IIと命名したリボゾーム
結合部位をコードする可動合成DNA配列をp602/7RBS Iの
Hind III/Sph I切断DNAと結合する。E.coli AB1157株を
本 結合混合物により形質転換し、形質転換株を50μg/mlの
クロラムフエニコール含有LB寒天上で選択する。クロラ
ムフエニコール耐性コロニーを以下の点によりSRBS II
存在の有無を分析する。
Iで完全消化し、１μg/mlのエチジウムブロミド含有の
１％低温融解性アガロースゲルによる電気永動によりSR
BS Iと分離する。電気永動後、DNAを螢光で確認し、ゲ
ルより切り出す。続いてDNAをアガロースより精製す
る。以下の配列を有するSRBS IIと命名したリボゾーム
結合部位をコードする可動合成DNA配列をp602/7RBS Iの
Hind III/Sph I切断DNAと結合する。E.coli AB1157株を
本 結合混合物により形質転換し、形質転換株を50μg/mlの
クロラムフエニコール含有LB寒天上で選択する。クロラ
ムフエニコール耐性コロニーを以下の点によりSRBS II
存在の有無を分析する。
ａ） 融合CATたん白の合成能力 ｂ） 新たにDra I部位を獲得した組換えプラスミドの
制限酵素解析 このような性状を確認したプラスミドDNAをp602/7 RB
S IIと命名した。プラスミドp602/7 RBS IIをB.subtili
s BR151株のコンピーテント細胞に導入し、形質転換株
を10μg/mlのクロラムフエニコール含有LB寒天上で選択
する。クロラムフエニコール耐性コロニーについて上記
ステツプ（III）ａ）およびｂ）に記載されるようにSRB
S IIの有効性を分析する。ベクターp602/7 RBS Iおよび
p602/7 RBS IIの構築を第２図に図示してある。
制限酵素解析 このような性状を確認したプラスミドDNAをp602/7 RB
S IIと命名した。プラスミドp602/7 RBS IIをB.subtili
s BR151株のコンピーテント細胞に導入し、形質転換株
を10μg/mlのクロラムフエニコール含有LB寒天上で選択
する。クロラムフエニコール耐性コロニーについて上記
ステツプ（III）ａ）およびｂ）に記載されるようにSRB
S IIの有効性を分析する。ベクターp602/7 RBS Iおよび
p602/7 RBS IIの構築を第２図に図示してある。
実施例 ３ 大腸菌フアージT5プロモーターPG25を有する発現ベクタ
ーp602/25の構築 （Ｉ） 2μｇのプラスミドp602/5を制限エンドヌクレア
ーゼEco R Iで完全消化する。その後、本DNAを大腸菌フ
アージT5プロモーターPG25（R.Gentz、前述）を含む250
bpのEco R I断片の等モル量と結合する。結合生成物を
E.coli AB1157株に導入し、形質転換株を100μg/mlのク
ロラムフエニコール含有のLB寒天上で選択する。クロラ
ムフエニコール耐性コロニーよりプラスミドDNAを分離
し、Eco R I消化またはDNA配列決定によりプロモータP
G25を含む250bp断片の存在を分析する。確認されたプラ
スミドDNAをp605/25と命名した。p602/25の構築を第２
図に図してある。
ーp602/25の構築 （Ｉ） 2μｇのプラスミドp602/5を制限エンドヌクレア
ーゼEco R Iで完全消化する。その後、本DNAを大腸菌フ
アージT5プロモーターPG25（R.Gentz、前述）を含む250
bpのEco R I断片の等モル量と結合する。結合生成物を
E.coli AB1157株に導入し、形質転換株を100μg/mlのク
ロラムフエニコール含有のLB寒天上で選択する。クロラ
ムフエニコール耐性コロニーよりプラスミドDNAを分離
し、Eco R I消化またはDNA配列決定によりプロモータP
G25を含む250bp断片の存在を分析する。確認されたプラ
スミドDNAをp605/25と命名した。p602/25の構築を第２
図に図してある。
実施例 ４ 大腸菌フアージT5プロモーターPG25とリボゾーム結合部
位をコードする可動合成DNA配列SRBS Iとを合せ有する
ベクターp25RBS Iの構築 （Ｉ） ２μｇのプラスミドp602/7 RBS Iを制限エンド
ヌクレアーゼHind IIIおよびBal IIで完全消化し、１μ
g/mlのエチジウムブロミドを含有する１％低温融解アガ
ロースゲルで電気永動して分画を行なう。電気永動の後
DNAバンドを螢光で確認し、およそ3.2kbの上のバンドを
切り出す。この断片をアガロースにより精製する。
位をコードする可動合成DNA配列SRBS Iとを合せ有する
ベクターp25RBS Iの構築 （Ｉ） ２μｇのプラスミドp602/7 RBS Iを制限エンド
ヌクレアーゼHind IIIおよびBal IIで完全消化し、１μ
g/mlのエチジウムブロミドを含有する１％低温融解アガ
ロースゲルで電気永動して分画を行なう。電気永動の後
DNAバンドを螢光で確認し、およそ3.2kbの上のバンドを
切り出す。この断片をアガロースにより精製する。
（II） ２μｇのプラスミドp602/25を同じように制限
酵素Hind IIIおよびBgl IIで完全消化し、エチジウムブ
ロミド含有の１％アガロースゲル電気永動で分画する。
DNAバンドを螢光で確認し、およそ2.6Kbの下のバンドを
切り出し、アガロースから精製する。
酵素Hind IIIおよびBgl IIで完全消化し、エチジウムブ
ロミド含有の１％アガロースゲル電気永動で分画する。
DNAバンドを螢光で確認し、およそ2.6Kbの下のバンドを
切り出し、アガロースから精製する。
（III） 上記実施例４の（Ｉ）および（II）で調製し
たDNA断片を各等モル量を結合し、結合生成物をE.coli
AB1157株に導入する。100μg/mlのクロラムフエニコー
ルに耐性なコロニーよりプラスミドDNAを分離し、250bp
のEco R Iバンドの存在を確認する。このように確認さ
れたプラスミドDNAをp25RBS Iと命名した。プラスミドp
25RBS Iの構築を第３図に図示した。
たDNA断片を各等モル量を結合し、結合生成物をE.coli
AB1157株に導入する。100μg/mlのクロラムフエニコー
ルに耐性なコロニーよりプラスミドDNAを分離し、250bp
のEco R Iバンドの存在を確認する。このように確認さ
れたプラスミドDNAをp25RBS Iと命名した。プラスミドp
25RBS Iの構築を第３図に図示した。
（IV） p25RBS Iを保有するE.coliよりプラスミドDNA
を単離し、B.subtilis BR151のコンピーテント細胞に導
入し、形質転換株を10μg/mlのクロラムフエニコール含
有LB寒天上で選択する。クロラムフエニコール耐性コロ
ニーよりプラスミドDNAを分離し、プラスミドp25RBS I
のB.subtilis中での構造を制限酵素解析で確認する。
を単離し、B.subtilis BR151のコンピーテント細胞に導
入し、形質転換株を10μg/mlのクロラムフエニコール含
有LB寒天上で選択する。クロラムフエニコール耐性コロ
ニーよりプラスミドDNAを分離し、プラスミドp25RBS I
のB.subtilis中での構造を制限酵素解析で確認する。
（Ｖ） プラスミドp25RBS Iを含有するB.subtilisのコ
ロニーを10μg/mlクロラムフエニコールを含むＬ−ブロ
ス中で培養し、合成した全たん白をSDS/ポリアクリルア
ミドゲル電気永動で分析した。大腸菌フアージT5プロモ
ーターPG25をリボゾーム結合部位の合成DNA配列SRBS I
と共に用いると、SRBS Iの近接で開始し、E.coli cat遺
伝子の天然の翻訳停止コマンドで停止する融合CATたん
白の合成が確認された。分析結果は第４図に示す。
ロニーを10μg/mlクロラムフエニコールを含むＬ−ブロ
ス中で培養し、合成した全たん白をSDS/ポリアクリルア
ミドゲル電気永動で分析した。大腸菌フアージT5プロモ
ーターPG25をリボゾーム結合部位の合成DNA配列SRBS I
と共に用いると、SRBS Iの近接で開始し、E.coli cat遺
伝子の天然の翻訳停止コマンドで停止する融合CATたん
白の合成が確認された。分析結果は第４図に示す。
実施例 ５ 大腸菌フアージT5プロモーターpG25およびリボゾーム結
合部位をコードする可動合成DNA配列RBS IIを含有する
ベクターp25RBS IIおよびp25＊RBS IIの構築 （Ｉ） ２μｇのプラスミドp602/7 RBS IIを制限エン
ドヌクレアーゼHind IIIおよびBgl IIで完全に消化し、
生成物を１μg/mlのエチジウムブロミド含有の１％低温
融解アガロースゲルによる電気永動で分画する。電気泳
動後、DNAバンドを螢光で確認し、およそ3.2Kbの上のバ
ンドを切り出してアガロースより精製する。
合部位をコードする可動合成DNA配列RBS IIを含有する
ベクターp25RBS IIおよびp25＊RBS IIの構築 （Ｉ） ２μｇのプラスミドp602/7 RBS IIを制限エン
ドヌクレアーゼHind IIIおよびBgl IIで完全に消化し、
生成物を１μg/mlのエチジウムブロミド含有の１％低温
融解アガロースゲルによる電気永動で分画する。電気泳
動後、DNAバンドを螢光で確認し、およそ3.2Kbの上のバ
ンドを切り出してアガロースより精製する。
（II） ２μｇのプラスミドp602/25を同様に制限酵素H
ind IIIおよびBgl IIで完全消化し、１μg/mlのエチジ
ウムブロミド含有の１％低温融解アガロースゲルで電気
永動して分画する。電気永動後、DNAバンドを螢光で確
認し、およそ2.6Kbの下のバンドを切り出してゲルから
精製する。実施例５の（Ｉ）および（II）で得られたDN
A断片の等モル量を結合し、結合生成物をE.coli AB1157
株に導入する。形質転換株を100μg/mlのクロラムフエ
ニコール含有LB寒天上で選択する。クロラムフエニコー
ル耐性コロニーからプラスミドDNAを分離し、大腸フア
ージT5プロモーターPG25および合成リボゾーム結合部位
−DNA配列SRBS IIの両方の存在を制限エンドヌクレアー
ゼ解析で確認する。確認されたプラスミドDNAをp25/RBS
IIと命名した。プラスミドp25RS IIの構築を第３図に
図示する。
ind IIIおよびBgl IIで完全消化し、１μg/mlのエチジ
ウムブロミド含有の１％低温融解アガロースゲルで電気
永動して分画する。電気永動後、DNAバンドを螢光で確
認し、およそ2.6Kbの下のバンドを切り出してゲルから
精製する。実施例５の（Ｉ）および（II）で得られたDN
A断片の等モル量を結合し、結合生成物をE.coli AB1157
株に導入する。形質転換株を100μg/mlのクロラムフエ
ニコール含有LB寒天上で選択する。クロラムフエニコー
ル耐性コロニーからプラスミドDNAを分離し、大腸フア
ージT5プロモーターPG25および合成リボゾーム結合部位
−DNA配列SRBS IIの両方の存在を制限エンドヌクレアー
ゼ解析で確認する。確認されたプラスミドDNAをp25/RBS
IIと命名した。プラスミドp25RS IIの構築を第３図に
図示する。
ベクターp25RBS IIを保有するB.subtilis中でのたん
白合成を第４図に示す。こゝで明かなように、プロモー
ターPG25を含むEco R I断片は余分のリボゾーム結合部
位を含有し、その結果cat遺伝子の端まで伸びた融合た
ん白を生成する。この直接の影響としてRBS IIの効率を
極端に低下させる。従つてPG25の近接リボゾーム結合部
位の翻訳フレームを次の様に改修してSRBS IIからのた
ん白合成を最大となるようにした。
白合成を第４図に示す。こゝで明かなように、プロモー
ターPG25を含むEco R I断片は余分のリボゾーム結合部
位を含有し、その結果cat遺伝子の端まで伸びた融合た
ん白を生成する。この直接の影響としてRBS IIの効率を
極端に低下させる。従つてPG25の近接リボゾーム結合部
位の翻訳フレームを次の様に改修してSRBS IIからのた
ん白合成を最大となるようにした。
（IV） ２μｇのプラスミドp25/RBS IIを制限エンドヌ
クレアーゼHind IIIで完全消化す売る。４つのdNTP存在
下DNAポリメラーゼクレナウ断片と反応させてHind III
末端を平滑末端とする。これらの平滑末端に12塩基対Hi
nd IIIリンカーを結合し、結合生成物をHind IIIで完全
消化する。このDNAを１μg/mlのエチジウムブロミド含
有の１％低温融解アガロースゲルの電気永動にて分画す
る。永動後DNAを螢光で確認し、ゲルより切り出してア
ガロースから精製する。得られるDNAを再び結合し、結
合生成物をE.coli AB1157株に導入する。形質転換株を1
00μg/mlのクロラムフエニコール含有LB寒天上で選択す
る。クロラムフエニコール耐性コロニーよりプラスミド
DNAを単離し、新たに出来たHind III部位を制限酵素解
析で確認する。このように確認されたプラスミドDNAをp
25＊RBS IIと命名した。プラスミドp25＊RBS IIの構築
を第３図に示す。
クレアーゼHind IIIで完全消化す売る。４つのdNTP存在
下DNAポリメラーゼクレナウ断片と反応させてHind III
末端を平滑末端とする。これらの平滑末端に12塩基対Hi
nd IIIリンカーを結合し、結合生成物をHind IIIで完全
消化する。このDNAを１μg/mlのエチジウムブロミド含
有の１％低温融解アガロースゲルの電気永動にて分画す
る。永動後DNAを螢光で確認し、ゲルより切り出してア
ガロースから精製する。得られるDNAを再び結合し、結
合生成物をE.coli AB1157株に導入する。形質転換株を1
00μg/mlのクロラムフエニコール含有LB寒天上で選択す
る。クロラムフエニコール耐性コロニーよりプラスミド
DNAを単離し、新たに出来たHind III部位を制限酵素解
析で確認する。このように確認されたプラスミドDNAをp
25＊RBS IIと命名した。プラスミドp25＊RBS IIの構築
を第３図に示す。
（Ｖ） プラスミドp25＊RBS IIをB.subtilis BR151株
のコンピーテント細胞に導入し、形質転換株を10μg/ml
クロラムフェエニコール含有LB寒天上で選択する。クロ
ラムフエニコール耐性コロニーからプラスミドDNAを単
離し、その構造がE.coliから単離したp25＊RBS IIと同
一であることを制限酵素解析により決定する。
のコンピーテント細胞に導入し、形質転換株を10μg/ml
クロラムフェエニコール含有LB寒天上で選択する。クロ
ラムフエニコール耐性コロニーからプラスミドDNAを単
離し、その構造がE.coliから単離したp25＊RBS IIと同
一であることを制限酵素解析により決定する。
（VI） B.subtilisのクロラムフエニコール耐性コロニ
ーの夫々を10μg/mlクロラムフエニコール含有Ｌ−ブロ
ス中で培養し、これらのコロニーにより合成される全た
ん白をSDS/ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析す
る。大腸菌フアージT5プロモーターPG25を合成リボゾー
ム結合部位−DNA配列SRBS IIと合わせて使用すると、SR
BS IIの近接の部位で翻訳が開始し、E.coli cat遺伝子
の天然の停止コドンで停止する融合CATたん白の合成が
確認できる。そのような分析結果は第５図に示す。
ーの夫々を10μg/mlクロラムフエニコール含有Ｌ−ブロ
ス中で培養し、これらのコロニーにより合成される全た
ん白をSDS/ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析す
る。大腸菌フアージT5プロモーターPG25を合成リボゾー
ム結合部位−DNA配列SRBS IIと合わせて使用すると、SR
BS IIの近接の部位で翻訳が開始し、E.coli cat遺伝子
の天然の停止コドンで停止する融合CATたん白の合成が
確認できる。そのような分析結果は第５図に示す。
実施例 ６ E.coliプロモーターのB.subtilis RNAポリメラーゼによ
るインビトロ解析 第１表に使用したプロモーターを示した。これらのプ
ロモーターの性能をインビトロの“ラン−オフ”転写に
より測定し、その結果を第６図に示す。それぞれのケー
スでプロモーターのB.subtilisδ55RNAポリメラーゼに
よる利用を異なるイオン強度で測定して200mM NaClに於
けるE.coli RNAポリメラーゼによる転写効率と比較し
た。転写測定の反応液はプロモーターの他に既にB.subt
ilisδ55RNAポリメラーゼにより効率よく利用されると
わかつているB.subtilisのvegプロモーターを含有する
（Maran Jr.ら、Mol.Gen.Genetics186巻、339〜346頁
〔1982年〕）。第６図のデータから明かなように、試験
したプロモーターは全てその程度は異なるがB.subtilis
RNAポリメラーゼにより確認される。大腸フアージT5プ
ロモーターPN26およびPK28a/PK28bの場合、転写はvegプ
ロモーターからの場合により強いかも知れない。さら
に、塩濃度のプロモーター効率に対する影響も明かであ
る。50mM NaClではB.subtilis RNAポリメラーゼは試験
したプロモーターから転写を開始するばかりか、pBR322
ベクターDNAの“bla"および“ori"プロモーターからも
開始する（予備試験ではプロモーターは全てpBR322由来
のベクターに挿入している：それらのプラスミドは切断
して常に350ヌクレオチドの“bla"転写物と大腸菌フア
ージT5プロモーターからの種々の長さの転写物を生成す
る。）。塩濃度が上がるに伴ない、プロモーターの効率
はvegと大腸菌フアージT5プロモーターの間ではつきり
と分かれる。第６図の結果が生菌中でも成り立つかどう
か調べるため大腸菌フアージT5プロモーター、或いは大
腸菌フアージT7のAlフロモーターがベクターp25＊RBS I
I（第３図）のPG25プロモーターの代わりとなり、B.sub
tilis中でCAT合成を確認できる。
るインビトロ解析 第１表に使用したプロモーターを示した。これらのプ
ロモーターの性能をインビトロの“ラン−オフ”転写に
より測定し、その結果を第６図に示す。それぞれのケー
スでプロモーターのB.subtilisδ55RNAポリメラーゼに
よる利用を異なるイオン強度で測定して200mM NaClに於
けるE.coli RNAポリメラーゼによる転写効率と比較し
た。転写測定の反応液はプロモーターの他に既にB.subt
ilisδ55RNAポリメラーゼにより効率よく利用されると
わかつているB.subtilisのvegプロモーターを含有する
（Maran Jr.ら、Mol.Gen.Genetics186巻、339〜346頁
〔1982年〕）。第６図のデータから明かなように、試験
したプロモーターは全てその程度は異なるがB.subtilis
RNAポリメラーゼにより確認される。大腸フアージT5プ
ロモーターPN26およびPK28a/PK28bの場合、転写はvegプ
ロモーターからの場合により強いかも知れない。さら
に、塩濃度のプロモーター効率に対する影響も明かであ
る。50mM NaClではB.subtilis RNAポリメラーゼは試験
したプロモーターから転写を開始するばかりか、pBR322
ベクターDNAの“bla"および“ori"プロモーターからも
開始する（予備試験ではプロモーターは全てpBR322由来
のベクターに挿入している：それらのプラスミドは切断
して常に350ヌクレオチドの“bla"転写物と大腸菌フア
ージT5プロモーターからの種々の長さの転写物を生成す
る。）。塩濃度が上がるに伴ない、プロモーターの効率
はvegと大腸菌フアージT5プロモーターの間ではつきり
と分かれる。第６図の結果が生菌中でも成り立つかどう
か調べるため大腸菌フアージT5プロモーター、或いは大
腸菌フアージT7のAlフロモーターがベクターp25＊RBS I
I（第３図）のPG25プロモーターの代わりとなり、B.sub
tilis中でCAT合成を確認できる。
実施例 ７ 大腸菌フアージT5プロモーターPN25と可動性リボゾーム
結合部位−合成DNA配列RBS II、9Aとを含有するベクタ
ーp602/18の構築 （Ｉ） ２μｇのプラスミドpDS5/RBS II、9Aを制限エ
ンドヌクレアーゼXho IおよびXba Iで完全１μg/mlのエ
チジウムブロミド含有１％低温融解アガロースゲルで電
気泳動にかけて分画する。電気泳動後、DNAバンドを螢
光で確認し、およそ1.0Kbの下の方のバンドを切り出
す。DNA断片をアガロースより精製する。
結合部位−合成DNA配列RBS II、9Aとを含有するベクタ
ーp602/18の構築 （Ｉ） ２μｇのプラスミドpDS5/RBS II、9Aを制限エ
ンドヌクレアーゼXho IおよびXba Iで完全１μg/mlのエ
チジウムブロミド含有１％低温融解アガロースゲルで電
気泳動にかけて分画する。電気泳動後、DNAバンドを螢
光で確認し、およそ1.0Kbの下の方のバンドを切り出
す。DNA断片をアガロースより精製する。
（II） ２μｇのプラスミドp25＊/RBS IIを同じように
制限酵素Xho IおよびXba Iで完全消化し、１μg/mlエチ
ジウムブロミド含有の１％低温融解性アガロースゲルで
分画する。螢光でDNAバンドを確認し、およそ4.6Kbの上
のバンドを切り出してアガロースより精製する。
制限酵素Xho IおよびXba Iで完全消化し、１μg/mlエチ
ジウムブロミド含有の１％低温融解性アガロースゲルで
分画する。螢光でDNAバンドを確認し、およそ4.6Kbの上
のバンドを切り出してアガロースより精製する。
（III） 実施例７（Ｉ）および（II）で調製したDNA断
片の等モル量を結合し、結合生成物をB.subtilis BR151
株のコンピーテント細胞に導する。10μg/mlのカナマイ
シンおよび10μg/mlのクロラムフエニコールに耐性な形
質転換株よりプラスミドDNAを単離し、1.0KbのXho I/Xb
a I断片の存在を分析する。確認されたプラスミドをp60
2/18と命名した。p602/18の構築を第７図に図示する。
片の等モル量を結合し、結合生成物をB.subtilis BR151
株のコンピーテント細胞に導する。10μg/mlのカナマイ
シンおよび10μg/mlのクロラムフエニコールに耐性な形
質転換株よりプラスミドDNAを単離し、1.0KbのXho I/Xb
a I断片の存在を分析する。確認されたプラスミドをp60
2/18と命名した。p602/18の構築を第７図に図示する。
（IV） プラスミドp602/18を含有するB.subtilisのコ
ロニーを10μg/mlクロラムフエニコール含有Ｌ−ブロス
中で培養し、培養物により生成された全たん白質をSDS/
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。大腸
菌フアージプロモーターPN25とリボゾーム結合部位をコ
ードする合成DNA配列RBS II、9A、とが利用されたこと
は、RBS II、9A、の近接に始まり、E.coli cat遺伝式の
天然の翻訳停止コドンで終了する融合CATたん白の合成
により確認される。分析結果は第９図に示す。
ロニーを10μg/mlクロラムフエニコール含有Ｌ−ブロス
中で培養し、培養物により生成された全たん白質をSDS/
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。大腸
菌フアージプロモーターPN25とリボゾーム結合部位をコ
ードする合成DNA配列RBS II、9A、とが利用されたこと
は、RBS II、9A、の近接に始まり、E.coli cat遺伝式の
天然の翻訳停止コドンで終了する融合CATたん白の合成
により確認される。分析結果は第９図に示す。
実施例 ８ 大腸菌フアージT5プロモーターPN25とリボゾーム結合部
位をコードする可動性合成DNA配列RBS II、3A＋5Aを含
むベクターp602/19の構築 （Ｉ） ２μｇのプラスミドpDS5/RBS II、3A＋5Aを制
限エンドクレアーゼXho IおよびXba Iで完全消化し、１
μg/mlのエチジウムブロミドを含む１％低温融解アガロ
ースゲルの電気泳動により分画する。電気泳動後、DNA
バンド螢光により検出し、およそ1.0Kbの下のバンドを
切り出す。本断片をアガロースより精製する。
位をコードする可動性合成DNA配列RBS II、3A＋5Aを含
むベクターp602/19の構築 （Ｉ） ２μｇのプラスミドpDS5/RBS II、3A＋5Aを制
限エンドクレアーゼXho IおよびXba Iで完全消化し、１
μg/mlのエチジウムブロミドを含む１％低温融解アガロ
ースゲルの電気泳動により分画する。電気泳動後、DNA
バンド螢光により検出し、およそ1.0Kbの下のバンドを
切り出す。本断片をアガロースより精製する。
（II） ２μｇのプラスミドp25＊RBS IIを同様に制限
酵素Xho IおよびXba Iで完全消化し、１μg/mlのエチジ
ウムブロミド含有の１％低温融解アガロースゲルの電気
泳動で分画する。DNAバンドを螢光により検出し、およ
そ4.7Kbの上部バンドを切り出してアガロースより精製
する。
酵素Xho IおよびXba Iで完全消化し、１μg/mlのエチジ
ウムブロミド含有の１％低温融解アガロースゲルの電気
泳動で分画する。DNAバンドを螢光により検出し、およ
そ4.7Kbの上部バンドを切り出してアガロースより精製
する。
（III） 実施例８の（Ｉ）および（II）で精製したDNA
断片を等モル量ずつ結合し、結合生成物をB.subtilis B
R151株コンピーテント細胞に導入する。10μg/mlのカナ
マイシンおよび10μg/mlのクロラムフエニコールに耐性
な形質転換株よりプラスミドDNAを精製し、1.0KbのXho
I/Xba I断片の存在を確認する。認識できたプラスミドD
NAをp602/19と命名した。p602/19の構築を第７図に示
す。
断片を等モル量ずつ結合し、結合生成物をB.subtilis B
R151株コンピーテント細胞に導入する。10μg/mlのカナ
マイシンおよび10μg/mlのクロラムフエニコールに耐性
な形質転換株よりプラスミドDNAを精製し、1.0KbのXho
I/Xba I断片の存在を確認する。認識できたプラスミドD
NAをp602/19と命名した。p602/19の構築を第７図に示
す。
実施例 ９ 大腸菌フアージT5プロモーターpN25およびリボゾーム結
合部位をコードする可動性DNA配列RBS IIを含有するベ
クターp602/20の構築 （Ｉ） ２μｇのプラスミドpDS82/RBS IIを制限酵素Xh
o IおよびXba Iで完全消化した後、１μg/mlのエチジウ
ムブロミドを含む１％低温融解アガロースゲルの電気泳
動で分画する。電気泳動後DNAバンドを螢光で検出し、
下のおよそ2.0Kbのバンドを切り出す。次にその断片を
アガロースより精製する。
合部位をコードする可動性DNA配列RBS IIを含有するベ
クターp602/20の構築 （Ｉ） ２μｇのプラスミドpDS82/RBS IIを制限酵素Xh
o IおよびXba Iで完全消化した後、１μg/mlのエチジウ
ムブロミドを含む１％低温融解アガロースゲルの電気泳
動で分画する。電気泳動後DNAバンドを螢光で検出し、
下のおよそ2.0Kbのバンドを切り出す。次にその断片を
アガロースより精製する。
（II） ２μｇのプラスミドp25＊RBS IIを同じように
制限酵素Xho IおよびXba Iで完全消化した後、１μg/ml
のエチジウムブロミド含有の１％低温融解アガロースゲ
ルの電気泳動で分画する。DNAバンドを螢光で検出し、
上のおよそ4.7Kbのバンドを切り出し、アガロースより
精製する。
制限酵素Xho IおよびXba Iで完全消化した後、１μg/ml
のエチジウムブロミド含有の１％低温融解アガロースゲ
ルの電気泳動で分画する。DNAバンドを螢光で検出し、
上のおよそ4.7Kbのバンドを切り出し、アガロースより
精製する。
（III） 実施例９の（Ｉ）および（II）で精製したDNA
断片の等モル量を結合し、結合生成物をB.subtilis BR1
51株のコンピーテント細胞に導入する。10μg/mlのカナ
マイシンおよび10μg/mlのトリメトプリムに耐性を示す
形質転換株よりプラスミドDNAを精製し、2.0KbのXho I/
Xba I断片の存在を分析する。そのような性質が認識さ
れたプラスミドDNAをp602/20と命名した。p602/20の構
築を第８図に示す。
断片の等モル量を結合し、結合生成物をB.subtilis BR1
51株のコンピーテント細胞に導入する。10μg/mlのカナ
マイシンおよび10μg/mlのトリメトプリムに耐性を示す
形質転換株よりプラスミドDNAを精製し、2.0KbのXho I/
Xba I断片の存在を分析する。そのような性質が認識さ
れたプラスミドDNAをp602/20と命名した。p602/20の構
築を第８図に示す。
（IV） プラスミドp602/20を含有するB.subtilisのコ
ロニーを10μg/mlのカナマイシンを含むＬ−ブロス中で
培養し、精製する全たん白質をSDS/ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で分析する。大腸菌フアージT5プロモータ
ーpN25とリボゾーム結合部位をコードする合成DNA配列R
BS IIの利用はRBS IIの近接から開始し、dhfr遺伝子の
天然の翻訳停止コドンで終了する融合DHFRたん白の合成
により確認できる。分析結果を第９図に示す。
ロニーを10μg/mlのカナマイシンを含むＬ−ブロス中で
培養し、精製する全たん白質をSDS/ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で分析する。大腸菌フアージT5プロモータ
ーpN25とリボゾーム結合部位をコードする合成DNA配列R
BS IIの利用はRBS IIの近接から開始し、dhfr遺伝子の
天然の翻訳停止コドンで終了する融合DHFRたん白の合成
により確認できる。分析結果を第９図に示す。
実施例10 大腸菌フアージT5プロモーターpN25とリボゾーム結合部
位をコードする可動性合成DNA配列RBS II、3A＋5Aを含
有するベクターp602/21の構築 （Ｉ） ２μｇのプラスミドpDS8/RBS II、3A＋5Aを制
限エンドヌクレアーゼXho IおよびXba Iで完全消化した
後、１μg/mlのエチジウムブロミドを含む１％低温融解
アガロースゲルの電気泳動にかけて分画する。電気泳動
後DNAバンドを螢光により検出し、下のおよそ2.0Kbの下
のバンドを切り出してアガロースから精製する。
位をコードする可動性合成DNA配列RBS II、3A＋5Aを含
有するベクターp602/21の構築 （Ｉ） ２μｇのプラスミドpDS8/RBS II、3A＋5Aを制
限エンドヌクレアーゼXho IおよびXba Iで完全消化した
後、１μg/mlのエチジウムブロミドを含む１％低温融解
アガロースゲルの電気泳動にかけて分画する。電気泳動
後DNAバンドを螢光により検出し、下のおよそ2.0Kbの下
のバンドを切り出してアガロースから精製する。
（II） ２μｇのプラスミドp25＊RBS IIを同様に制限
酵素Xho IおよびXba Iで完全消化し、消化物を１μg/ml
のエチジウムブロミド含有１％低温融解アガロースゲル
で分画する。電気泳動後、DNAバンドを螢光で検出して
下のおよそ2.0Kbのバンドを切り出し、アガロースより
精製する。
酵素Xho IおよびXba Iで完全消化し、消化物を１μg/ml
のエチジウムブロミド含有１％低温融解アガロースゲル
で分画する。電気泳動後、DNAバンドを螢光で検出して
下のおよそ2.0Kbのバンドを切り出し、アガロースより
精製する。
（III） 実施例10、（Ｉ）および（II）により精製し
たDNA断片を等モル量結合し、結合生成物をB.subtilis
BR151株コンピーテント細胞に導入する。10μg/mlのカ
ナマイシンおよび10μg/mlのトリメトプルムに耐性な形
質転換株よりプラスミドDNAを単離し、2.0KbのXho I/Xb
a I断片の存在を分析する。性質が確認されたプラスミ
ドDNAをp602/21と命名した。p602/21の構築を第８図に
図示する。
たDNA断片を等モル量結合し、結合生成物をB.subtilis
BR151株コンピーテント細胞に導入する。10μg/mlのカ
ナマイシンおよび10μg/mlのトリメトプルムに耐性な形
質転換株よりプラスミドDNAを単離し、2.0KbのXho I/Xb
a I断片の存在を分析する。性質が確認されたプラスミ
ドDNAをp602/21と命名した。p602/21の構築を第８図に
図示する。
（IV） プラスミドp602/21を含有するB.subtilisのコ
ロニーを10μg/mlカナマイシン含有のＬ−ブロス中で培
養し、合成された全たん白質をSDS/ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で分析する。大腸菌フアージT5のプロモー
ターpN25とリボゾーム結合部位をコードする合成DNA配
列RBS II、3A＋5Aの有効性はRBS II、3A＋5Aのすぐ近接
より開始し、dhfr遺伝子の天然の停止コドンで停止した
融合DHFRたん白の合成で確認される。分析の結果は第９
図に示す。
ロニーを10μg/mlカナマイシン含有のＬ−ブロス中で培
養し、合成された全たん白質をSDS/ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で分析する。大腸菌フアージT5のプロモー
ターpN25とリボゾーム結合部位をコードする合成DNA配
列RBS II、3A＋5Aの有効性はRBS II、3A＋5Aのすぐ近接
より開始し、dhfr遺伝子の天然の停止コドンで停止した
融合DHFRたん白の合成で確認される。分析の結果は第９
図に示す。
第１図は基本的なE.coli/B.subtilisシヤトルベクターp
602/5の構築を示す模式図である。 第２図は一般の発現ベクターp602/7およびp602/25、な
らびにベクター602/7 RBS Iおよびp602/7 RBS IIの構築
を示す模式図である。 第３図はベクターp25RBS I、p25RBS IIおよびp25＊RBS
IIの構築を示す模式図である。 第４図は発現ベクターp25RBS I、p25RBS II、およびp25
＊RBS IIを含有するB.subtilis BR151株で生産される全
たん白質を示す電気泳動パターンである。 第５図はベクターp25RBS I、p25RBS II、およびp25＊RB
S IIを含有するB.subtilis中で生産されるCATたん白質
合成を示す模式図である。 第６図は第１表に示したプロモーターのインビトロ系転
写解析を示す電気泳動パターンである。 第７図はシヤトルベクターp602/18およびp602/19の構築
を示す模式図である。 第８図はシヤトルベクターp602/20およびp602/21の構築
を示す模式図である。 第９図はプラスミドp602/18、p602/19、p602/20およびp
602/21を含有するB.subtilis BR151株により生産される
全たん白質を示す電気泳動パターンである。
602/5の構築を示す模式図である。 第２図は一般の発現ベクターp602/7およびp602/25、な
らびにベクター602/7 RBS Iおよびp602/7 RBS IIの構築
を示す模式図である。 第３図はベクターp25RBS I、p25RBS IIおよびp25＊RBS
IIの構築を示す模式図である。 第４図は発現ベクターp25RBS I、p25RBS II、およびp25
＊RBS IIを含有するB.subtilis BR151株で生産される全
たん白質を示す電気泳動パターンである。 第５図はベクターp25RBS I、p25RBS II、およびp25＊RB
S IIを含有するB.subtilis中で生産されるCATたん白質
合成を示す模式図である。 第６図は第１表に示したプロモーターのインビトロ系転
写解析を示す電気泳動パターンである。 第７図はシヤトルベクターp602/18およびp602/19の構築
を示す模式図である。 第８図はシヤトルベクターp602/20およびp602/21の構築
を示す模式図である。 第９図はプラスミドp602/18、p602/19、p602/20およびp
602/21を含有するB.subtilis BR151株により生産される
全たん白質を示す電気泳動パターンである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 Ｇｅｎｅ，26（1983），Ｐ．313−315 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｕｍ ｐ．，48（1983），Ｐ．233−244 Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅ ｓ．，12（1984），Ｐ．3585−601
Claims (24)
- 【請求項１】転写の下流方向に、 （ａ） 大腸菌ファージT5またはT7プロモーター； （ｂ） 式、 を有するシリソーム結合部位−コード合成DNA配列；並
びに （ｃ）E.coui由来t0、T1、T2またはT7ターミネーターを
含んでなるグラム陽性菌発現調節DNA配列。 - 【請求項２】大腸菌ファージT5プロモーターがPN25プロ
モーターである特許請求の範囲第１項に記載の発現調節
DNA配列。 - 【請求項３】大腸菌ファージT5プロモーターがPN26プロ
モーターである特許請求の範囲第１項に記載の発現調節
DNA配列。 - 【請求項４】大腸菌ファージT5プロモーターがPG25プロ
モーターである特許請求の範囲第１項に記載の発現調節
DNA配列。 - 【請求項５】大腸菌ファージT5プロモーターがPJ5プロ
モーターである特許請求の範囲第１項に記載の発現調節
DNA配列。 - 【請求項６】大腸菌ファージT5プロモーターがＰD/E20
プロモーターである特許請求の範囲第１項に記載の発現
調節DNA配列。 - 【請求項７】大腸菌ファージT5プロモーターがPK28aプ
ロモーターである特許請求の範囲第１項に記載の発現調
節DNA配列。 - 【請求項８】大腸菌ファージT5プロモーターがPK28bプ
ロモーターである特許請求の範囲第１項に記載の発現調
節DNA配列。 - 【請求項９】大腸菌ファージT7プロモーターがT7A1プロ
モーターである特許請求の範囲第１項に記載の発現調節
DNA配列。 - 【請求項１０】大腸菌ファージT7プロモーターがT7A2プ
ロモーターである特許請求の範囲第１項に記載の発現調
節DNA配列。 - 【請求項１１】バチルス・スブチリス（Bacillus subti
lis）において機能し得る特許請求の範囲第１項〜第10
項のいずれか１項に記載の発現調節DNA配列。 - 【請求項１２】式、 を有し、グラム陽性菌にて機能し得るリボソーム結合部
位−コード合成DNA配列。 - 【請求項１３】バチルス・スブチリスにて機能し得る特
許請求の範囲第12項に記載のリボソーム結合部位−コー
ド合成DNA配列。 - 【請求項１４】（ａ） 転写の下流方向に、大腸菌ファ
ージT5またはT7プロモーター；式、 を有するリボソーム結合部位−コード合成DNA配列；並
びにE.coli由来t0、T1、T2またはT7ターミネーターを含
んでなり、場合により、原核性または真核性ポリペプチ
ドをコードする外来遺伝子に機能可能に結合されるグラ
ム陽性菌発現調節DNA配列； （ｂ） 少なくとも１個の複写のベクターオリジン、並
びに （ｃ） 少なくとも１個の抗生物質耐性遺伝子 を含んでなる発現ベクター。 - 【請求項１５】E.coliおよびB.subtilisの株において複
写可能なプラスミド性シャトルベクターである特許請求
の範囲第14項に記載の発現ベクター。 - 【請求項１６】p25RBS Iである特許請求の範囲第14項ま
たは15項のいずれか一つに記載の発現ベクター。 - 【請求項１７】p25RBS IIである特許請求の範囲第14項
または15項のいずれか一つに記載の発現ベクター。 - 【請求項１８】p25＊RBS IIである特許請求の範囲第14
項または15項のいずれか一つに記載の発現ベクター。 - 【請求項１９】p602/18である特許請求の範囲第14項ま
たは15項のいずれか一つに記載のいずれか一つの発現ベ
クター。 - 【請求項２０】p602/19である特許請求の範囲第14項ま
たは15項のいずれか一つに記載の発現ベクター。 - 【請求項２１】p602/20である特許請求の範囲第14項ま
たは15項のいずれか一つに記載の発現ベクター。 - 【請求項２２】p602/21である特許請求の範囲第14項ま
たは15項のいずれか一つに記載の発現ベクター。 - 【請求項２３】（ａ） 転写の下流方向に、大腸菌ファ
ージT5またはT7プロモーター；式、 を有するリボソーム結合部位−コード合成DNA配列；並
びにE.coli由来t0、T1、T2またはT7ターミネーターを含
んでなり、場合により、原核性または真核性ポリペプチ
ドをコードする外来遺伝子に機能可能に結合されるグラ
ム陽性菌発現調節DNA配列； （ｂ） 少なくとも１個の複写のベクターオリジン、並
びに （ｃ） 少なくとも１個の抗生物質耐性遺伝子 を含んでなる発現ベクターを保有するB.subtitis形質転
換体。 - 【請求項２４】バチルス・スブチリスBR151株である特
許請求の範囲第23項に記載の形質転換体。
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