CN1054799A - 生物合成钴胺素和/或钴胺酰胺有关的多肽、编码这些多肽的dna序列、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及参预钴铵素和/或钴胺酰胺，特别是 辅酶B₁₂之生物合成的新多肽。本发明还涉及负素 表达这些多肽的遗传材料及其制备方法。此外，本发 明还涉及以DNA重组技术增加钴胺素特别是辅酶 B12之生产的方法。

Description

本发明涉及用于钴胺素和/或钴胺酰胺、特别是辅酶B₁₂生物合成的新的多肽。本发明还涉及表达这些多肽的相应基因材料，以及制备它们的方法。此外，本发明还涉及用重组DNA技术生产钴胺素、特别是辅酶B₁₂扩增方法。

维生素B₁₂属于B族维生素。它是一种重要的水溶性维生素，已确定其为恶性贫血症的治疗因子。一般说来，已知维生素B₁₂用于刺激人机体疲劳时的血细胞生成，还可用于治疗许多其他病症，这些病症包括肝昏迷、神经功能减退，或作为食欲刺激剂、强壮剂以及治疗皮肤病（Beck，1982，Frasèr et al.，1983）。在大规模饲料非反刍动物时，主要喂饲以植物蛋白质为主的食物，同时还必须添加一定量的维生素B₁₂，其量为每吨饲料10-15mg（Barrere et al.，1981）。

维生素B₁₂属于一类称为钴胺素的分子，其结构如图1所示。钴胺酰胺与钴胺素的区别在于其低级核苷酸碱基，对于特别由嗜热醋酸梭状芽胞杆菌（Clostridium thermoaceticum）和甲烷八迭球菌（Methanosarcina barkeri）合成的维生素B₁₂因子III来说，这种碱基不再是5，6-二甲基苯并咪唑，而是另外的碱基，如5-羟基苯并咪唑（Iron et al.，1984）。这些结构的相似性说明钴胺素与钴胺酰胺的生物合成代谢过程的主要部分是共同的。

几乎只由细菌按照复杂而又不十分清楚的过程合成钴胺素，该过程可分成四步（图2）：

ⅰ）合成尿卟啉原III，然后

ⅱ）将尿卟啉原III转化成钴啉酸，

ⅲ）将钴啉酸转化成钴啉醇酰胺，

ⅳ）加入特定的碱基（在合成钴胺素时为5，6-二甲基苯并咪唑）构成低级核苷酸环。

对于辅酶B₁₂来说，在合成咕啉核后不久，即有可能加入5′-脱氧腺苷基（Huennekens et al.，1892）。

在合成钴胺酰胺的情况下，只是合成步骤与加入的低级碱基有所不同。

既然钴胺素与血红素及叶绿素中的钴胺素都是共同的，所以钴胺素的生物合成的第一个步骤即为人们所熟知（Battersby  et  al.，1980）。

它相继介入δ-氨基-γ-酮戊酸合成酶（EC  2.3.137）、δ-氨基-γ-酮戊酸脱水酶（E.C.4.2.1.24）、胆色素原脱氨基酶（EC  4.3.1.8）和尿卟啉原III共合成酶（EC4.2.1.75），将琥珀酰CoA与甘氨酸转化成尿卟啉原III。然而，上述合成的第一个步骤是在某些微生物｛如大肠杆菌（Arissar  et  al.，1989）｝和产甲烷细菌（Kannanqaraet  al.，1989）中，借助于多酶复合物将谷氨酸转化成δ-氨基-γ-酮戊酸而实现的。

在尿卟啉原III与钴啉酸之间，迄今只纯化了三种中间体衍生物。问题在于因子FⅠ、FⅡ和FⅢ，它们分别是三种中间体前咕啉-1、前咕啉-2和前咕啉-3的氧化产物，而这三种中间体则相当于尿卟啉原Ⅲ的一、二和三甲基衍生物（图3）;这些中间体是甲基由SAM（S-腺苷-L-甲硫氨酸）相继转移到尿卟啉原Ⅲ的C2、C7和C20位上而得到的。除了由SAM在C17、C12、C1、C15和C5五个位置上进行甲基转移外，为得到钴啉酸的其他反应还包括除去C20上的碳、C12脱羧和插入钴原子（图4）。这些生物合成步骤可根据薛氏丙酸杆菌（Propionibacterium  Shermanii）或破伤风形梭状芽胞杆菌（Clostridicem  tetanomorphum）的无细胞提取物体外试验推测出来。在这些提取物中，钴啉酸可在厌氧条件下经保温后由尿卟啉原Ⅲ转化得到（Batterby  et  al.，1982）。迄今还未分离出前钴啉-3与钴啉酸之间的任何中间体，可接着保温钴胺素生产菌提取物而使其中间体转化成类咕啉。分离和鉴定这些中间体的困难在于：

ⅰ）它们的较大不稳定性，

ⅱ）它们对氧敏感，

ⅲ）它们在体内的积聚水平低。

在该方法的这个部分中，只对脱氮假单胞菌（Pseudomonas  denitri  ficans）的酶作过纯化和研究;其涉及称为SOMT的SAM：尿卟啉原Ⅲ基转移酶（Blanche  et  al.，1989）。

在钴啉酸与钴啉醇酰胺之间可进行下述反应：

ⅰ）加入5′一脱氧腺苷基（如涉及合成辅酶B12）

ⅱ）在七个羧基中的六个上加入胺基而酰胺化，

ⅲ）在最后一个羧基（吡咯环D的丙酸链）上加入R-1-氨基-2-丙醇而使之酰胺化（图2）。

迄今尚不清楚在酰胺化作用时是否真正地依次进行（Herbert  et  al.，1970）。此外，尚未描述该方法这部分的任何活性检测，但涉及加入5′-脱氧腺苷基则除外（Huennekens  et  al.，1982）。

钴胺素，如辅酶B12之生物合成的最后步骤包括图5中描述的四个相续阶段（huennekens  et  al.，1982）：

ⅰ）为得到钴啉醇酰胺磷酸酯，而使钴啉醇酰胺之氨基丙醇基上的羟基磷酸化，然后

ⅱ）与5′-三磷酸鸟苷反应而加入二磷酸鸟苷;所得化合物是GDP-钴啉醇酰胺（Friedmann，1975），

ⅲ）使之与从核黄素合成的5，6′-二甲基苯并咪唑反应，得到5′磷酸腺苷-钴胺素（Friedmann  et  al.，1968），

ⅳ）5′磷酸腺苷-钴啉醇酰胺经脱磷酸作用而产生辅酶B12（Schneider和Fuiedmann，1972）。

下面列举的是一些能产生钴胺素的细菌：

根瘤病土壤杆菌（Agrobacterium  tumefaciens）

放射形土壤杆菌（Agrobaterium  radiobacter）

巨大芽孢杆菌（Bacillus  megaterium）

粘土梭状芽孢杆菌（Clostridium  sticklandii）

假破伤风梭状芽孢杆菌（Clostridium  tetanomorphum）

嗜热醋酸梭状芽孢杆菌（Clostridium  thermoaceticum）

XG棒状杆菌（Corymebacterium  XG）

粘液真细菌（Eubacterium  limosum）

亲树甲烷杆菌（Methanobacterium  arbophilicum）

艾文维甲烷杆菌（Methanobacterium  ivanovii）

反刍甲烷杆菌（Methanobacterium  ruminantium）

热自养甲烷杆菌（Methanobacterium  thermoautotrophicum）

巴氏甲烷八叠球菌（Methanosarcina  barkeri）

薛氏丙酸杆菌（Propionobacterium  shermanii）

红色精朊细菌（Protaminobacter  ruber）

脱氮假单胞菌（Pseudomonas  denitrificans）

臭味假单胞菌（Pseudomonas  putida）

苜蓿根瘤菌（Rhizobium  melitoti）

球形红假单胞菌（Rhodopseudomonas  sphueroides）

鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella  typhimurium）

拉普特螺旋菌（Spirulina  platensis）

抗生链霉菌（Streptomyces  antibioticus）

生金雷素链霉菌（Streptomyces  aureofaciens）

烬灰链霉菌（Streptomyces  qriseus）

橄榄链霉菌（Streptomyces  olivaceus）

由于生物合成的机理非常复杂，所以工业上生辛钴胺素，特别是维生素B₁₂只采用微生物工艺。这种生产工艺是通过大量培养脱氮假单胞菌、薛氏丙酸杆菌和丙酸杆菌（Propionobacterum freudanreichii）进行的（Florent，1986）。工业生产使用的菌株可得自未驯化菌株，它们可经受到多次随机突变循环，然后从中选择优良的克隆以生产钴胺素（Florent，1986）。可使用致突变剂或紫外光处理等物理致突变方式使细菌获得突变（Barrere et al.，1981）。用这些经验方法，得到随机突变，进而改善钴胺素的生产。例如，Miller和Rosenblum（1960，美国专利2938822号）最初分离了脱氮假单胞菌作起始菌，用上述技术在十年里逐渐使微生物的生产能力由0.6mg/L增加到60mg/L（Florent，1986）。对于丙酸杆菌[P.Sh-ermanii（ATCC  13673）和P.freudenreichii（ATCC  6207）]，文献中似乎描述了其同样大小的产率，如曾述及其产率为65mg/L（见欧洲专利EP87920号）。然而，迄今还没有描述过任何一种筛选方法，以便在钴胺素生产中很容易地选择和定向筛选过量产生钴胺素的突变体或明显改善钴胺素生产能力的突变体。

在基因水平上，至今所作的工作很少。也已描述了巨大芽孢杆菌中基因cob（其可编码生物合成途径中所涉及的酶类）的克隆选择（Breg  et  al.，1986）。用具有巨大芽孢杆菌之不同DNA片段的质粒，根据巨大芽孢杆菌突变体cob的互补作用鉴定了11个互补群。这些基因集聚在12kb片段的相同座位（locus）上。

同样对鼠伤寒沙门氏菌（Salmonell  typhimurium）的cob基因进行了许多研究。尚没有描述过这些基因的克隆选择，但已证明钴胺素生物合成的几乎所有基因都积聚在染色体40与42之间（Jeter  et  al.，1987）。只有能将尿卟啉原Ⅲ转变成前卟啉-2的座位CysG不属于这组基因。然而，对该座位编码的基因活性，以及它们的生物化学性质还未曾描述过。

另外，表型与cob突变相联系。在鼠伤寒沙门氏菌和巨大芽孢杆菌中，cob突变体处于用乙醇胺作碳源或氮源的基本培养基中有再显示发育生长（Roof et al.，1988），这是因为乙醇胺的分解代谢酶，即乙醇胺氨解酶（EC4.3.1.7）需要辅助因子辅酶B₁₂，cob突变体不再合成辅酶B₁₂，所以用乙醇胺作碳源和/或氮源时，它们便不能生长了。鼠伤寒沙门氏菌的metE突变体只有依赖高半胱氨酸甲基转移酶（EC 2.1.1.13）的甲基钴胺素。鼠伤寒沙门氏菌metE的cob突变体对于甲硫氨酸是营养缺陷型的（Jeter et al.，1984）。

对于脱氮假单胞菌和根瘤土壤杆菌，至今还没描述过合成钴胺素时与总体缺陷相关的表型。

最后，人们通过用脱氮假单胞菌所作的研究（Cocmeron  et  al.，1989），已实现了对携带这种细菌cob基因之DNA片段的克隆选择，这些基因分布在四个至少30Kb  DNA的互补群中。用带有cob基因的脱氮假单胞菌的DNA片段，根据与根瘤土壤杆菌和臭味假单胞菌之cob突变体的异种互补作用鉴定出至少14个互补群。

但迄今还没纯化出任何这种基因，没有描述过任何有关核苷酸序列。同样地，也没有描述过任何对产物蛋白质的鉴定，以及产生这些基因产物的催化作用。此外，也未获得用重组DNA技术生产钴胺素的任何改进。在已克隆的菌株中，对巨大芽孢杆菌cob基因的扩增并没有达到改善钴胺素生产的目的（Brey  et  al.，1986）。对鼠伤寒沙门氏菌进行过生理学研究，以确定能观察到待研究的cob基因强烈转录的条件（Escalante  et  Roth，1987）。尽管该生物合成方法的基因比在培养的标准条件下得以更高表达，但在这些条件下并没有改善钴胺素的生产。

本发明涉及对编码多肽之DNA顺序的准确鉴定，所说的多肽与钴胺素和/或钴胺酰胺的生物合成有关联。本发明的主题在于这些DNA序列和由于基因编码的简并性而造成的所有同源DNA序列，以及可与这些序列或其片段杂交的和/或显示出有意义之同源性的，并编码钴胺素和/或钴胺酰胺生物合成所涉及之多肽的所有来源（天然的、合成的、重组的）的DNA序列。本发明还涉及含有这些DNA序列的基因。

用根据根瘤土壤杆菌和臭味假单胞菌之cob突变体的互补作用，由菌株MB580（US  3018225）衍生的工业菌株（脱氮假单胞菌SC510）分离得到本发明的DNA序列。可借助插入转座子Tn5衍生物用同位素扫描法精确地分析所得到的这些克隆。这些基因研究工作可在有限的范围内确定cob基因的位置，并能够测定它们的序列。而对开放区段的分析则能显示出这些DNA片段的编码区。

本发明还涉及根据这些核苷酸序列克隆其他细菌的cob基因。对于催化同样活性的蛋白质，其序列以岐异进化的形式得以保留（Wein-Hsiung  et  al.，1985）。本发明中已表明，不同微生物内编码钴胺素和/或钴胺酰胺生物合成所需之多肽的核苷酸序列之间存在着显著的同源性。而出现差异则是由于进行简并性造成的，即由于基因组密码简并性造成的，后者则与所研究的基因组中GC的百分率有关（Wein-Hsiung  et  al.，1985）。

根据本发明，与密码子的使用和所研究之细菌的DNA中GC百分比相适应，可使用一个或多个脱氮假单胞菌的DNA序列或这些序列的片段，或使用具有特性简并性的类似序列的探针。在这些条件下，有可能探查到探针与待研究细菌之基因组DNA片段间的特定杂交信号;这种杂交信号相当于探针与该细菌之等功能cob基因的杂交。然后即可分离，纯化并鉴定这些cob基因及其产物。本发明还提供一种通过杂交获得核苷酸序列以及所有微生物生物合成钴胺素和/或钴胺酰胺时所涉及之多肽的方法。

本发明还涉及一种重组DNA，该重组DNA至少含有一个编码生物合成钴胺素和/或钴胺酰胺有关之多肽的DNA序列，特别是有一个或多个处于表达信号控制下之序列的重组DNA。

在这方面，尤其可定位启动区之DNA序列的5′端。这些区域可以是与DDNA序列同源或异源的。具体地说，可使强细菌启动子，如色氨酸操纵子的Ptrp启动子或大肠杆菌之乳糖操纵子的Plac启动子。入噬菌体的左或右启动子、细菌噬菌体的强启动子（如棒状杆菌属）、革兰氏阴性细菌中的功能性启动子，如大肠杆菌的Ptac启动子、质粒TOL之二甲苯分解代谢基因的PxylS启动子、枯草芽胞杆菌之淀粉酶的Pamy启动子。还可列举出由酵母的糖酵群基因衍生的启动子，如编码磷酸甘油酸激酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、乳糖酶或烯醇酶之基因的启动子，当在真核生物宿主中引入重组DNA时，这些启动子均可使用。核糖体的固定同样位在DNA序列的5′侧，并且可能是同源或异源的，如入噬菌体之CⅡ基因的核糖体的固定位置。

转录终止所需的信号可位于DNA序列的3′侧。

另外，本发明的重组DNA可直接引入与选择之表达信号相容的宿主细胞内，或克隆到质粒载体上，以便将所述的DNA序列稳定地引入宿主细胞中。

本发明的另一个内容涉及如此制得的质粒，它们含有编码与生物合成钴胺素和/或钴胺酰胺有关之多肽的DNA序列。更确切地说，这些质粒还含有功能性复制系统和选择标志。

本发明还涉及其中已引入一个或多个如上限定的DNA序列或如上限定的质粒的宿主细胞。

本发明还涉及制备与生物合成钴胺素和/或钴胺酰胺有关之多肽的方法。根据该方法，用上面叙述的DNA序列转化宿主细胞，在能够表达所述序列的条件下培养已转化的细胞，然后回收所生成的多肽。

能用于这一目的宿主细胞可以是原核细胞、真核细胞、动物细胞或植物细胞。但最好是细菌细胞，特别是大肠杆菌、脱氮假单胞菌、根瘤病土壤杆菌或苜蓿根瘤菌细胞。

本发明之DNA序列的另一个应用，在于提供以DNA重组技术放大钴胺素和/或钴胺酰胺生产的方法。事实上，如果是由于生物合成过程中酶的活性限制了钴胺素和/或钴胺酰胺生物合成的代谢流，那么就可借助于DNA重组技术（基因扩增、用更有效的信号代替已有的转录-转译信号），通过增加该酶的表达来提高其活性，进而增加钴胺素和/或钴胺酰胺的生物合成能力。再有一种可能是通过生物化学调节因素来限制钴胺素和钴胺酰胺的生产。在这种情况下，可以体外特异地诱变一种或多种对应于调节酶的cob基因，以得到突变基因，使之去掉不利于生产能力的调节因素。

本发明的方法包括用如前定义的DNA序列转化钴胺素和/或钴胺酰胺的生产菌，或转化只能产生上述化合物的微生物（即在一个或多个步骤中生物合成酶有缺陷的微生物），进而在在能表达所述序列和合成钴胺素和/或钴胺酰胺的条件下培养这些微生物，最后回收钴胺素和/或钴胺酰胺产物。这样一种方法适用于本文第4页上列举的所有微生物，特别是脱氮假单胞菌、苜蓿根瘤菌或根瘤病土壤杆菌等微生物。对于最佳实施方案，所用微生物是脱氮假单胞菌，特别是菌株SC510。对于上述可能产生的微生物，所用DNA序列是那些相应于微生物不可能完成的生物合成步骤中的DNA序列。

按照本发明，并采用上面公开的各种策略，可使所有产生（或可能产生）钴胺素和/或钴胺酰胺之微生物的钴胺素和/或钴胺酰胺生产能力得到改善。为生产钴胺素和表达引入的DNA序列，只需在适当条件下培养这些已重组的微生物就够了。培养过程可间断或连续进行。可以工业水平已使用的方法纯化钴胺素（florent，1986）。这些方法包括：

ⅰ）增溶钴胺素并使之转变成氰基化物（如在亚硝酸钠存在下，用氰化钾加热处理发酵液），然后

ⅱ）以不同步骤纯化氰钴胺素，这些步骤例如是：

a）用不同的基质，如离子交换树脂amberliot  IRC50、Dowex1×2或amberlite  XAD2进行吸附，然后用水-乙醇或水-苯酚混合物淋洗，然后

b）有机溶剂提取，最后

c）或者加入反应物，或用适当溶剂稀释，或蒸发，使之从有机相中沉淀或结晶出来。

本发明还显示，有可能借助DNA重组技术改善钴胺素生产菌的钴胺素产率，同时兼获多重改进。所获得的第一方面改进已如上所述，继之还可借助DNA重组技术，如对钴胺素生物合成基因进行扩增，以在上述改进的基础上再次改进。

本发明的另一个内容涉及参予生物合成钴胺素和/或钴胺酰胺的多肽。已描述了这些多肽的氨基酸序列，以及它们的某些物理化学特性。酶促活性或这些特性分别与这些多肽序列相关联。具体地说，本发明涉及由上述DNA序列编码的、参予钴胺素和/或钴胺酰胺之生物合成过程的所有多肽、或其衍生物或这些多肽的片段。

此外，可利用前述杂交探针，由其他微生物分离的基因，去鉴定并分离其他微生物的同功能多肽。从而，本发明显示了脱氮假单胞菌的COB蛋白质序列与具有同类型活性其他微生物蛋白质序列是显著同源的。在不同微生物中完成相同催化反应的这些COB蛋白质之间，只是导致进化距离的变化（Wein-Hsiung  et  al.，1985）。本发明还涉及这些同功能多肽。

赋予特定的酶促活性，是基于按不同策略进行分析已得知的。对SAM（S腺苷-L-甲硫氨酸）的亲和性（体外试验）的研究可归因于一种能固定SAM的蛋白质，即甲基转移酶的活性，及其参予尿卟啉原Ⅲ与钴胺醇酰胺之间产生之甲基的转移步骤。估价这些多肽活性的另一种方法是检测积聚于不能表达这些多肽之突变体内的钴胺素生物合成途径的中间体（借助互补实验鉴定）。由这些分析可以推测出，所研究的多肽与所积聚的中间体底物有关，从而可定位并限定其在生物合成中的活性。本发明还涉及定量检测应用于所有钴胺素和/或钴胺酰胺生产菌株生物合成所需酶促活性的方法。基于这种定量检测，可得以纯化来自生产这些化合物之所有菌株的待测酶催活性。根据已纯化的活性，便可以测定所研究之COB蛋白质的NH₂末端顺序，或其亚单位的序列，从而得以鉴定编码所研究之活性的一个或多个结构基因。就脱氮假单胞菌来说，鉴定编码生物合成有关活性的结构基因，便可在发现每个NH₂末端序列时发现具有相同NH₂末端序列的COB蛋白质。

本发明还描述了在钴胺素生产菌株中，鉴定和检测生物合成钴胺素或其他类咕啉的中间体。如同它们在细胞内一样，在培养液中也检测到这些中间体。可检测到的中间体除钴啉酸外，还有钴啉酸单酰胺、钴啉酸二酰胺、钴啉酸三酸胺、钴啉酸四酰胺、钴啉酸五酰胺、钴啉胺酸、钴啉醇酰胺、磷酸钴啉醇酰胺、GDP-钴啉醇酰胺、磷酸辅酶B₁₂和辅酶B₁₂，即在钴啉酸之后，已发现了所有生物合成途径中的类咕啉。用这种技术也可检测到这些未腺苷化形式的产物。

本发明的其他内容和优点可具体体现在本文下述的附图和实施例中，这些实施例和附图只是阐述而不是限制本发明。

所用述语和缩写词的定义是：

ACDAS：钴啉酸a，c-二酰胺合酶

DNA重组：能使非天然的DNA序列在同一微生体内结合，或使DNA片段产生特异性诱变的技术组合。

ATP：5′-三磷酸腺苷

BSA：牛血清白蛋白

CLHP：高效液相层析

cluster：基因的组群

Cob：相当于钴胺素生产之减低水平（至少比对照组低10倍）的表型

Coden  stop：转译的终止密码子

Corrinoides：具有咕啉核的钴啉酸衍生物

dGTP：5′-三磷酸脱氧鸟苷

DMBI：二甲基苯并咪唑

dNTP：5′-三磷酸脱氧核苷

DTT：二硫苏糖醇

gene  cob：由尿卟啉原Ⅲ生物合成钴胺素时所涉及的基因

gene  cor：由尿卟啉原Ⅲ生物合成类唑啉时所涉及的基因

kb：千碱基

ORF：开放相

pb：碱基对

PPAHBY：带有氢化咕啉酸（acide  hydrogenobyrinique）的蛋白质

Proteine  COB：或者在生物合成钴胺素过程中作为催化剂，或者在cob基因调节系统中作为调节蛋白，或兼有两种作用的蛋白质。

Proteine  COR：或者在生物合成类咕啉过程中作为催化剂，或者在cor基因调节系统中作为调节蛋白，或者兼有两种功能的蛋白质。

SAM：S腺苷基-L-甲硫氨酸

SDS：十二烷基磺酸钠

SP2MT：SAM-L-甲硫氨酸：前咕啉-2甲基转移酶

SUMT：SAM：尿卟啉原Ⅲ甲基转移酶

UrogenⅢ：尿卟啉原Ⅲ

附图说图

图1：辅酶B₁₂的结构;其中，对于甲基钴胺素，5′脱氧腺苷基被甲基取代;对于氰基钴胺素，5′脱氧腺苷基被氰基取代;对于羟钴胺素，5′脱氧腺苷被羟基取代。

图2：钴胺素的生物合成及其生物合成的不同步骤。X：钴的轴向配位体;配位体a不同于配位体b。R：钴的配位体a，它限定了钴胺素的类型（见图1）。

图3：尿卟啉原Ⅲ、前咕啉-1、前咕啉-2和前咕啉-3的结构。

图4：尿卟啉原Ⅲ和钴啉酸的展开化学结构式。在尿卟啉原Ⅲ与钴啉酸之间，于C2、C7、C20、C17、C12、C1、C15和C5位上相继进行8次依赖SAM的甲基转移，在C12位进行一次脱羧，在C20位除去碳并嵌入钴原子。X：钴的轴向配位体;配位体a可与配位体b不同。

图5：生物合成钴胺素的最后几个步骤。为图面清楚起见，略去了咕啉核的细微结构。其中五个酶促步骤代表：1、钴胺酰胺激酶;2、磷酸钴胺酰胺鸟苷基转移酶;3、5′-磷酸钴胺合酶;4、5′-磷酸钴胺磷酸水解酶;5、烟酸核苷：DMBI磷酸核苷转移酶。

图6：5.4kb之ClaI-HindIII-HindIII-HindIII片段;8.7kb之EcoRI片段;4748pb之SalI-SalI-SalI-SalI-SalI-BglI和3855pb之SstI-SstI-BamHI片段的限制图。只示出20种限制酶，这些酶很少切断DNA。各酶的切割位点均用垂直短线示出。

图7：脱氮假单胞菌之双股5378pbCla-HindIII-HindIII-HindIII片段的核苷酸序列。上面一列从左向右看是5′至3′方向，此相应于图6所示限制图中片段的从左向右方向。发现ClaI位点处于23位（即酶切位点的起点），因为如此确定的序列中可找到便于在多位点中进行克隆选择的PstI、SalI和XbaI限制性位点。因此，ClaI-HindIII-HindIII-HindIII片段应由23位开始。

图8：脱氮假单胞菌的双股8753pb之EcoRI片段的核苷酸序列。位于上方的一股片段从左向左是5′至3′方向，这相应于图6所示限制图中之片段的从左到右方向。

图9：利用Staden和Maclachlan（1982）的程序，对读出5378pbclaI-HindIII-HindIII-HindIII-HindIII片段之序列的六个相根据所用密码子分析出编码相的概率。对于出现于同一编码链上的相，最可能的相是对应于由点连成线的、没有被coden  stop中断的相，该相位于该相概率线下方。

1、由核苷酸1至核苷酸1200的序列。基于分析，已鉴定出开放相1，它是从549位的ATG开始，终止在1011位的TGA。

2、由核苷酸1000至核苷酸2200的序列。基于分析，已鉴定出开放相2，它是从1141位的ATG开始到1981位的TGA终止。

3、由核苷酸1800至核苷酸3400的序列。基于分析，已鉴定出开放相3，它是从1980位的ATG开始到3282位的TGA终止。

4、由核苷酸3000至核苷酸4500的序列。基于分析，已鉴定出开放相4，它是从3281位的ATG开始到4280位的TGA终止。

5、由核苷酸3800至核苷酸5378的序列。基于分析，已鉴定出开放相5，它是从4284位的GTG开始到5253位的TGA终止。

图10：利用Staden和Maciachlan（1982）的程序，对读出8753pb之EcoRI片段的六个相根据所用密码分析出编码相的概率。对于出现在同一编码链上的相，最可能的相是相应于由点连成线的、没有被codens  stop中断的相。该相位于其概率线下方。

1、由核苷酸650至核苷酸1650的序列。基于这一分析，已鉴定出开放相6，它是由736位的ATG开始到1519位的TAG终止。

2、由核苷酸1400至核苷酸3100的序列。基于这一分析，已鉴定出开放相7，它是由1620位ATG开始到2997位TAG终止。

3、由核苷酸2700至核苷酸3700的序列。基于这一分析，已鉴定出开放相8，它是由3002位ATG开始到3632位TGA终止。

4、由核苷酸3500至核苷酸4100的序列。基于这一分析，已鉴定出开放相9，它是由3631位GTG开始到4366位TGA终止。

5、由核苷酸4150至核苷酸5150的序列。基于这一分析，已鉴定出开放相10，它是由4365位ATG开始到5127位TGA终止。

6、由核苷酸5000至核苷酸6000的序列。基于这一分析，已鉴定出开放相11，它是由5893位ATG开始，到5110位TAG终止。

7、由核苷酸5700至核苷酸7200的序列。基于这一分析，已鉴定出相12，它是由5862位的ATG，到7101位的TAA终止。

8、由核苷酸7000至核苷酸8000的序列。基于这一分析，已鉴定出开放相13，它是由7172位ATG开始，到7931位TTG终止。

图11：质粒pXL556、pXL545和pXL723的构建。从5.4kb片段切掉含cobA和cobE基因的2.4kb之claI-EcoRV片段，然后纯化。在EcoRV位点加入一个EcoRI“接头”，然后将该片段在ClaI-EcoRV位点之间插入pXL59中。如此构建的质粒命名为pXL556。pXL545的构建与之差不多：从5.4kb片段上切下1.9kb之ClaI-HindIII-HindIII片段，然后纯化。该片段只含cobE基因。在HindIII位点加入一个EcoRI“接头”，然后将该片段在ClaI-EcoRI位点间插入pXL59中。

按下述方法构建质粒pXL723：从5.4kb片段上切掉2.3kb之EcoRI-HindIII片段，纯化之，然后用大肠杆菌DNA聚合酶I的大片段填充末端。将该片段克隆到已用EcoRI消化过的pRK290中，然后用大肠杆菌的DNA聚合酶I大片段处理以填充末端。括号内所示的限制位点相当于用大肠杆菌DNA聚合酶之大片段处理后消失的位点。

1、RSF1010的PstI-SstI片段（De  Graff  et  al.，1978）;2、pACYC177的PstI-BamHI片段（Bagdasarian  et  al.，1981）;3、含有大肠杆菌乳糖操纵子而无其启动子，并含有操纵基因、转译起始位点和LacZ（Casadaban  et  al.，1983）之前8个非必需密码子的BamHI-SstI片段;4、臭味假单胞菌KT2440（Bagdasarian  et  al.，1981）的Sau3AI片段;Ori，复制原点;nic，松弛的位点;mob，流动所必需的座位;kmr，卡那霉素抗性基因（Bagdasarian  et  al.，1981）;B，BamHI;C，ClaI;E，EcoRI，H，HindIII;P.PstI;S，SstI;Sa，SalI;X，XhoI;Xb，XbaI。

图12：在5378bp片段中插入转座子Tn55pr和Tn5的研究。如图14所示，在质粒pXL723中插入转座子Tn5;将转座子Tn55pr插入菌株SBF27  Rifr的染色体中;按照卡那霉素抗性基因转录的方向，在插入序号下用箭头表示将携带卡那霉素抗性基因（1630到1631）的暗盒插入SC510Rifr染色体中。图中有由该序列推测出的开放相（从cobA到cobE）;转座子或卡那霉素抗性基因盒的多插入下的十或一号，表示该插入对不同突变体的互补作用是无活性的（-）还是有活性的（+）（在插入转座子Tn5的情况下），或表示因为插入而消除了本身会产生钴胺素之菌株的钴胺素生产能力。当重组突变体比衍生突变体合成钴胺素的合成水平低2倍以下时，即表明没有补偿作用。在其端部可看到的限制性位点代表质粒pXL545Ω、pXL1500、pXL1397和pXL302的插入段。可在有广泛宿主的质粒pXL435和pXL59（Cameron  et  al.，1989）中克隆这些插入段。

质粒pXL545Ω相当于图11中所描述的pXL545，但还具有pHP45Ω（Prentki  et  Krisch）的2kb  BamHI片段，pHP45Ω含有已克隆到pXL545之BamHI位点中的壮观霉素抗性基因。

质粒pXL1500相当于克隆到图30所示pKT230（Bagdasarian  et  al.，1981）之BamHI和SstI位点的、此图已示出的4.2kb  BglII-SstI位点;pXL1397相当于本图所示，已插入到图30所述pXL435（Camer  on  et  al.，1989）多位点之HindIII和SstI位点中的2.4kb  HindIII-SstI片段;质粒pXL302相当于本图所示，已插入到图30所述pXL59（Cameron  et  al.，1989）之EcoRI和HindIII位点中的2.3kb之EcoRI-HindIII片段，其中使用的HindIII位点是从pXL59之克隆多位点中选出的位点;pXL723与pXL545均如图11中所示。各插入之上方的+或-号，用以表示上述的染色体插入所研究的质粒有无互补作用。C，Cla;E，EcoRI;H，HindIII;Rv，EcoRV;Sau，Sau3AI;S，SstI。

图13：质粒pXL253和pXL365的构建。由质粒pXL151上切掉8.7kb的EcoRI片段，然后纯化之。克隆到pKT230的EcoRI位点，得到pXL253。将同一片段插入pRK290（Ditta  et  al.，1981）的EcoRI位点，以得到pXL367。1、RSF1010（De  Graff  et  al.，1978）的PstI-SstI片段。2、pACYC177（Bagdasarian  et  al.，1981）的PstI-BamHI片段;ori，复制原点;nic，松弛的位点;mob，游动所需的座位（Bagdasarian  et  al.，1981）;B，BamHI;C，ClaI;E，EcoRI;H，HindⅢ;P，PstI;S，SstI;Sa，SalI;X，XhoI;Xb，XbaI;tetr，四环素抗性基因;kmr，卡那霉素抗性基因。

图14：在克隆到pRK290（Ditta et al.，1980）中之8.7kb EcoRI片段内插入转座子Tn31acZ和Tn5的研究。与转座子Tn5的插入相反，着重在转座子Tn31acZ的插入。图上给出根据其序列（cobF到cobM）推测出的开放相，以及8组失活插入（标有序号1-8，在每个转座子的下面标有+或-号，以表明该插入对不同突变体的互补作用是失活（-）还是不失活）（+）。当重组突变体合成维生素B₁₂比衍生突变体菌株的合成水平低2倍以下时，即没有互补作用。这组失活插入相应于下列突变体：1，G615;2，G614和G616;3，G613和G614;4，G620;5，G638;6，G610和G609;7，G612;8，G611。这些突变体是已描述过的根瘤病土壤杆菌之cob突变株（Cameran et al.，1989）。该图下部示出了8.7kb片段的限制图。

图15：已标明5.4kb片段的各基因编码序列，它们分别是cobA至cobE。这些序列编码的蛋白质序列cobA至cobE示于相应编码序列的下方，即cobA至cobE。还分别列出了从cobA至cobE蛋白质的氨基酸组成（以含量和百分比计）、以及分子量、极性指数、等电点、纯化的蛋白质溶液（1mg/ml）于260nm和280nm处的光密度值。列出了各蛋白质（相当于cobA至cobE）的亲水性分布图，并根据Hopp和Wods（1981）程序进行了计算。正值相当于亲水蛋白质的区域。图中横座标标出氨基酸的位置，而纵座标上标出亲水性指数值;当这些值为正值时，该蛋白质的区域是亲水的。

图16：标出8.7kb片段上分别为cobF至cobM的各基因编码序列。由这些序列编码的蛋白质（COBF至COBM）序列示于这些序列的下面。该图的附注与图15相同。我们从736位的ATG开始蛋白质coBF;但751位的ATG则可能是该蛋白质的真正起始密码子。

图17：由钴啉酸a，c-二酰胺合酶催化的反应。ACDAS催化钴啉酸外周乙酸链a和c羧酸官能团的酰胺化作用，以得到钴啉酸二酰胺;酶催试验中使用的胺基团供体是L-谷氨酰胺，后者得自L-谷氨酸脱胺反应。X相当于钴的轴向配位体，各配位体可互不相同。

图18：由SP2MT催化的反应。SP2MT可催化SAM甲基向dihydrasirohydrochlorine或前咕啉-2转移，得到前咕啉-3。上述甲基转移到卟啉环的C20位上。

图19：氢化咕啉酸和氢化咕啉酸-a，c-二酰胺的结构。

图20：COBA和COBF蛋白质对SAM的亲合力。曲线显示以任意单位加到TSK-25柱上的各种蛋白质在出口处测得的放射活性。滞留时间以分钟表示。于10分30秒时间内观察到相当于游离SAM的放射活性峰。

图21：COBA和COBI之序列的比较。图中所示1，2和3区域显示出显著的同源性。符号＝位于完全相同的残基之间，符号-则在同源残基之间（HKR，LIVM，AGST，YFW，DEQNBZ，P，C）。

图22：脱氮假单胞菌之COBA蛋白质和大肠杆菌之CYSG蛋白质一级序列的比较。按照Kanehisa（1984）的程序将它们一一对齐。完全相同的残基之间标以＝号，同源残基之间标以-号（HKR，LIVM，AGS  T，YEW，DEQNBZ，P，C）。区域1、2、3相当于蛋白质间的强同源区域。

图23：大肠杆菌CYSG与脱氮假单脱菌COB蛋白质（COBA、COBF、COBI、COBJ、COBL和COBM）之序列的比较。这一比较是针对CYSG、COBA与COBI之间存在的强同源区域1、2和3的。图中标出了存在同源区域之蛋白质序列的位置。我们认为有下列同源的残基组群：HKR，LIVM，AGST，YEW，DEQNBZ，P，C。如果在同一位置找到至少三个同源残基，我们便将这些氨基酸划入框内。

图24：质粒pXL1148和pXL1149的构建。按下述程序构建pXL1148：纯化含cobH和cobI基因之8.7kb片段的1.9kbBamHI-BamHI-SstI-SstI片段，将XbaI和EcoRI“接头”分别接在末端BamHI和SstI位点上。然后在XbaI和EcoRI位点之间将该片段插入有广谱宿主的质粒pXL59（Cameron  et  al.，1989）中，得到质粒pXL1148。如果起始纯化的片段只是1.5kb的BamHI-BamHI-SstI片段，而不是还含有用于pXL1148的400pbSstI小片段，则可如构建pXL1148的同样方法构建pXL1149。然后使该片段在pXL59中受到同样的酶学处理和克隆。1，RSF1010（De  Graff  et  al.，1981）的PstI-SstI片段;2，pACY-C177（Bagdasarian  et  al.，1981）3，含有无启动子之大肠杆菌乳糖操纵子、操纵基因、转译起始位点和1acZ（Casadaban  et  al.，1983）之前8个非必需密码子的BamHI-SstI片段;4，臭味假单胞菌KT2440（Bagdasarin  et  al.，1981）;Ori，复制原点;nic，松弛的位点;Kmr，卡那霉素抗性基因;mob，移动所需的座位（Bagdasarian  et  al.，1981）;B，BamHI;C，ClaI;E，EcoRI;H，HindIII;P，PstI;S，SstI;Sa，SalI;X，XhoI;Xb，XbaI。

图25：按已述方法，用10%PAGE-SDS分析菌株SC510Rifr  pKT230、SC510Rifr  pXL1148、SC510Rifr  pXL1149的总蛋白质。细菌在PS4培养基中培养4天，然后分析所有溶胞产物的蛋白质。泳道1，SC510Rifr;泳道2，SC510Rifr  pXL1149;泳道3，SC510  Rifr  pXL1148;泳道4，SC510  Rifr  pKT230。图中示出了分子量标志物的分子量，及蛋白质COBI和COBH的迁移位置。

图26：质粒pXL1496和pXL1546的构建。质粒pXL1496可过表达大肠杆菌的COBF蛋白质，而质粒pXL1546可过表达脱氮假单胞菌的COBF蛋白质。从8.7kb片段上切掉2.2kb  EcoRI-XhoI片段并纯化之。将其克隆到噬菌体M13mp19的EcoRI位点，得到质粒pXL1405。然后，如前所述，经控制性诱变将NdeI位点引入该片段的733位;如此发现NdeI位点正好在推测的cobF基因的起始密码子上。所得到的新质粒被定名为pXL1406。1.5kb之NdeI-SphI-SphI片段含有从推测的起始密码子开始的cobF基因，用适当的酶进行部分消化后，纯化上述片段并与质粒pXL694的适当片段相连接（含有大肠杆菌表达信号（见正文）的120pbEcoRI-NdeI片段，含有氨苄青霉素抗性基因、同一质粒之复制功能及大肠杆菌rrnB操纵子之终止信号的3.1kbEcoRI-SphI片段已如文中所述）。如此构建的质粒定名为pXL1496。按下述方法构建pXL1546：用适当酶部分消化已纯化的2kbEcoRI-BamHI-BamHI片段;该片段含有大肠杆菌的表达信号，以及cobF基因和cobG基因的5′部分，如正文中所述，它们本身则接在大肠杆菌rrnB操纵子之终止信号的后面。将该片段克隆到图30所示多宿主质粒pKT230（Bagdasarian  et  al.，1987）中。B，BamHI;C，ClaI;E，EcoRI;H，HindIII;P，PstI;S，SstI;Sa，SalI;X，XhoI;Xb，XbaI;Kmr，卡那霉抗性基因;Amp，氨苄青霉素抗性基因。

图27：按已述方法，用10%PAGE-SDS分析菌株SC510Rifr、SC510Rifr  pKT230、SC510  Rifr  pXL1546的总蛋白质。将细菌在PS4培养基中培养4天，然后检测含总蛋白质的溶胞产物。泳道1，SC510  Rifr;泳道2，SC510  Rifr  pKT230;泳道3，SC510  Rifr  pXL1546。示出了分子量标志物的分子量及COBF蛋白质的迁移位置。

图28：按已述方法用10%  PAGE-SDS分析大肠杆菌菌株B和大肠杆菌菌株B  pXL1496的总蛋白质。泳道1，没有加色氨酸培养的大肠杆菌pXL1496;泳道2，有色氨酸时在同样条件下培养的大肠杆菌pXL1496;泳道3，没有加色氨酸培养的大肠杆菌;泳道4，有色氨酸时在同样条件下培养的大肠杆菌。示出了分子量标志物的分子量及COBF蛋白质的迁移位置。

图29：质粒pXL525和pXL368的构建。按下述方法构建pXL368：由质粒pXL556（B.Cameron  et  al.，1989）出发纯化2.4kbEcoRV-ClaI片段（含有cobA和cobE基因），如此可得到末端有BamHI位点和XbaI位点的片段;将该片段在BamHI和XbaI位点克隆到pXL203中。为了构建pXL525，在8.7kb之EcoRI片段的右端EcoRI位点加入XbaI“接头”;然后将2.4kb  EcoRI-XbaI与8.7kb  EcoRI-XbaI片段共克隆，以提供pXL556并含有cobA和cobE。示于括号内的限制性位点相当于用大肠杆菌DNA聚合酶之大片段处理后消失的位点。1，RSF1010（De  Graffet  al.，1981）的PstI-SstI片段;2，pACYC177（Bagdasarian  et  al.，1981）的PstI-BamHI片段;ori，复制原点;nic，松弛的位点;mob，移动所需的座位;kmr，卡那霉素抗性基因（Bagdasarian  et  al.，1981）;B，BamHI;C，ClaI;E，EcoRI;H，HindIII;P，PstI;S，SstI;Sa，SalI;X，XhoI;Xb，XbaI;tet，四环素抗性基因;Ampr和Amp，氨苄青霉素抗性基因。

图30：在革兰氏阴性菌中有广谱宿主的Q非相容性组群质粒。这些质粒已在文献中述及（Cameron  et  al.，1989），并可用于本发明。1，RSF1010（De  Graff  et  al.，1978）的PstI-SstI片段;2，pACYC177（Bagdasarian  et  al.，1981）的PstI-BamHI片段;3，含有大肠杆菌的无启动子之乳糖操纵子、操纵基因、转译起始位点和lacZ（Casadaban  et  al.，1983）之前8个非必需密码子的BamHI-SstI片段;4，臭味假单胞菌KT2440（Bagdasarian  et  al.，1981）的Sau3AI片段;ori，复制原点;nic，松弛的位点;kmr，卡那霉素抗性基因;smr，链霉素抗性基因;mob，移动所需的座位（Bagdasarian  et  al.，1981）;B，BamHI;C，ClaI;E，EcoRI;H，HindIII;P，PstI;S，SstI;Sa，SalI;X，XhoI;Xb，XbaI。

图31：不同类咕啉样品（1mg/份样品）在实施例7所述的分离系统中的滞留时间。所用柱子是Nucleosil  C-18柱（Macherey-Nagel）。根据各吸收峰，标示出上述类咕啉样品对应的数值。横轴为滞留时间，纵轴为371nm处的吸光率。1，钴啉酸;2，钴啉酸-a-酰胺;3，钴啉酸-9-酰胺;4，钴啉酸-a，g-二酰胺;5，钴啉酸-a-酰胺;6，钴啉酸c，g-二酰胺;7，钴啉酸a，c-二酰胺;8，钴啉酸a，c，g-三酰胺;9，钴啉酸四酰胺;10，钴啉酸五酰胺;11，钴啉胺酸;12，GDP-钴啉醇酰胺;13，磷酸钴啉醇酰胺;14，钴啉醇酰胺;15，s′-磷酸氰钴胺素;16，氰钴胺素。

图32：脱氮假单胞菌之双股4748  pb  SalI-SalI-SalI-SalI-BglI片段的核苷酸序列。高处的一股从左向右看是5′至3′方向，它相当于图6限制图中所示片段的由左向右方向。

图33：脱氮假单胞菌之双股3855pb  SstI-SstI-BamHI片段的核苷酸序列。处于高处的一股从左向右看是5′至3′方向，它相应于图6所示限制图中之片段的由左向右方向。

图34：利用Staden和Maclachlan（1982）和程序，根据所使用的密码子，分析读出的4748pb  SalI-SalI-SalI-SalI-SalI-BglI之六个相上编码相出现的概率。对于在同一编码链上出现的许多相，最可能是相当于由点连成线的、未被终止密码子隔断的相，其位于该相概率线下方。4a，对相当于核苷酸200至800之序列的分析。这一分析可鉴定出开放相14，它由660位的ATG开始，终止于379位的TGA。4b，对相当于核苷酸800-1500之序列的分析。这一分析可鉴定出开放相15，它开始于925位的GTG，终止在1440位的TAA。4c，对相当于核苷酸1450-2600之序列的分析。这一分析可鉴定出开放相16，它由1512位的ATG开始，终止于2510位的TGA。4d，对相当于核苷酸2500-4650之序列的分析。这一分析可鉴定出开放相17，它开始于2616位的GTG，终止于4511位的TGA。

图35：利用Staden和Maclachlan（1982）的程序，根据所使用的密码子，分析读出的3855pb  SstI-SstI-BamHI片段之六个相中编码相的概率。对于同一编码链上出现的许多相，最可能的相相当于由点形成线的、未被终止密码子隔断的相，其示于该相概率线下方。5a，对相当于核苷酸1至905之序列的分析。该分析可鉴定开放相18，它开始于809位的ATG，终止于108位的TGA。5b，对相当于核苷酸955至2105之序列的分析。该分析可鉴定出开放相19，它开始于1971位的ATG，终止于1063位的TGA。5c，相当于核苷酸2000至3300之序列的分析。该分析可鉴定出开放相20，它开始于2099位的ATG，终止于3115位的TAG。5d，对相当于核苷酸3250至3855之序列的分析。该分析可鉴定出开放相21，它开始于3344位的ATG，终止于3757位的TGA。

图36：由pXL154开始构建质粒pXL233、pXL843和pXL1558。以下述方式构建这些质粒。从pXL154上切掉含有已截短之cobS基因和上游序列的3.5kb之EcoRI片段，纯化后将其克隆到pKT230的EcoRI位点中。如此构建成称为pXL233的质粒。由pXL154开始，经部分消化切掉含cobT基因和下游序列的3.5kb之EcoRI-XhoI-XhoI片段，并纯化之。由pXL154开始，切掉含cobS基因及上游序列的4.3kb之EcoRI-EcoRI-EcoRI片段并纯化之，然后连接到上述3.5kb片段上。将如此制得的8kb  EcoRI-XhoI片段克隆到pXL59的EcoRI和SalI位点中，以得到质粒pXL843。按下述方法构建质粒pXL1558：从pXL154上切掉12kb之HindIII-HindIII片段并纯化之，然后用大肠杆菌DNA聚合酶I的大片段填充未端。用EcoRI消化克隆到pRK290（Ditta  et  al.，1981）中的这个插入段，然后用大肠杆菌DNA聚合酶的大片段处理，以得到恢复不受约束的未端。示于括号内的限制性位点相当于在克隆过程中消失的位点。1，RSF1010（Degraff  et  al.，1978）的PstI-SstI片段;2，pACYC177（Bagdasarian  et  al.，1981）的PstI-BamHI片段;B，BamHI;C，ClaI;E，EcoRI;H，HindIII;P，PstI;S，SstI;Sa，SalI;X，XhoI;Xb，XbaI;Tet，四环素抗性基因;kmr，卡那霉素抗性基因;Smr，氨苄青霉素抗性基因。

图37：在pXL154的12kb插入段HindIII-HindIII上插入转座子Tn5sp的研究。图解显示在克隆到pXL1558中的12kb之HindIII-HindIII插入段上插入转座子。菌株SC510  Rifr内有染色体插入即划入方框中，否则则引入菌株SBL27  Rifr中。在每处插入下方标示+或-号，以显示有此插入之菌株的cob表型。没有（或有）由质粒pXL1558∷Tn5sp所致互补作用的菌株G2035，在各插入下方标以-（或+）号。标出了同图36中所示的质粒插入段。质粒上方与转座子插入一一对齐的+（或-）号，图解显示突变菌株有或没有因质粒内转座子插入所致的互补作用。图中还标示了由该序列推测的开放相（ORF14至17）及相应的cob基因（cobB和cobT）。E，EcoRI;H，HindIII;X，XhoI。

图38：由pXL519开始构建质粒pXL1286、pXL1303、pXL1324、pXL1490B和pXL1557。在基因的组群限制图上部分有已测知序列的位置;此涉及3.9kb  SstI-SstI-BamHI片段。按下述方法构建这些质粒：由pXL519上切掉含有cobV及下游序列的2kbBglII-EcoRI片段，然后纯化并克隆到pKT230的BamHI和EcoRI位点，以得到质粒pXL1286。由pXL519上切掉含有被截短之cobV基因、cobU基因及下游序列的2.7kb  SstI-EcoRI片段，然后纯化并克隆到pKT230的SstI和EcoRI位点，以得到质粒pXL1324。由pXL519上切掉含截短之cobV基因及下游序列的1.6kb  SstI-SstI片段，然后纯化并克隆到pKT230的SstI位点，以得到质粒pXL1303。用BamHI完全消失并用SstI部分消化pXL519后，纯化3.85kb的SstI-SstI-BamHI片段，然后克隆到pKT230的BamHI和SstI位点上，以得到pXL1490B。按下述方法构建质粒pXL1557：由pXL519上切掉9kb的HindⅢ-BamHI片段，然后纯化并用大肠杆菌之DNA聚合酶的大片段充填未端。将该插入段克隆到已用EcoRI消化的pRK290（Ditta  et  al.，1981）中，然后用大肠杆菌DNA聚合酶的大片段处理，以产生不受约束的末端。标在括号内的限制性位点相当于克隆过程中消失的那些位点。1，RSF1010（Degraff  et  al.，1978）的PstI-SstI片段;2，pACYC177（Bagdasarian  et  al.，1981）的PstI-BamHI片段;B，BamHI;Bg，BglII;C，ClaI;E，EcoRI;H，HindIII;P，PstI;S，SstI;Sa，SalI;X，XhoI;Xb，XbaI;Tetr，四环素抗性基因;kmr，卡那霉素抗性基因;Smr，氨苄青霉素抗性基因。

图39：在pXL519之9kb  HindIII-BamHI插入段内插入转座子Tn5Sp的研究。图解显示了转座子被插入到已克隆到pXL1557上的9kb  HindIII-BamHI插入段中。菌株SC510  Rifr内有染色体插入的划入方框中，否则即为引入菌株SBL27  Rifr中。在每处插入下方标以+或-号，以显示有此插入之菌株的cob表型。没有（或有）由质粒pXL1557∷Tn5sp所致互补作用的G2040菌株，在各插入的下方标以-（或+）号。标出了如图6中所示的质粒插入段。质粒上方与转座子插入一一对齐的+（或-）号，图解显示突变菌株有或没有因质粒内转座子的插入所致的互补作用。图中还给出了由该序列推测出的开放相（ORF18至21），及相当的cob基因（cobU和cobV）。

图40：图示了编码各基因之4.8kb片段的序列，分别编码cobX、cobS和cobT。在cobX、cobS和cobT之编码序列的下面给出了由这些序列编码的COBX、COBS和COBT的氨基酸序列。有关说明同图15。

图41：显示了分别编码cobU和cobV基因之3.9kb片段的序列。在cobU和cobV之编码序列的下面给出了由这些序列编码之COBU和COBV的氨基酸序列。对该附图有关说明同图15。

图42：A、用10%  PAGE-SDS分析大肠杆菌BL21  pLysS  pET3b、大肠杆菌BL21  pLysS  pXL1937菌株的总蛋白质。泳道1，大肠杆菌BL21  pLysS  pET3b;泳道2，大肠杆菌BL21  pLysS  pXL1937。

B、用10%  PAGE-SDS分析大肠杆菌BL21、大肠杆菌BL21  pXL1874和大肠杆菌BL21  pXL1875菌株的总蛋白质。泳道1，大肠杆菌BL21;泳道2，大肠杆菌BL21  pXL1874;泳道3，大肠杆菌BL21  pXL1875。

列出了标记物的分子量。用箭头标示出相应于过表达到蛋白质的带。

克隆、分子生物学及生物化学的一般技术。

文献中已描述了有关的分子生物学经典方法，如将质粒DNA在氯化铯-溴乙锭梯度下离心，用限制酶消化、凝胶电泳、由琼脂糖凝胶中电洗脱DNA片段，以及在大肠杆菌内转化等（Maniatis  et  al.，1982;Ausubel  et  al.，1987）。

限制酶由New-England Biolabs、Bethesda Reseach Laborabories（BRL）或Amersham Ltd（Amersham）提供。寡核苷酸“接头”由Biolabs提供。对于连接，可在0.7%琼脂糖凝胶或8%丙烯酰胺凝胶上根据DNA片段大小分离之，然后用电洗脱法洗脱、用苯酚提取并用乙醇沉淀后，在T4噬菌体之DNA连接酶（Biolabs）存在下，在50mM Tris-HCl（pH7.4）、10mM MgCl₂、10mM DTT、2mM ATP的缓冲液中保温。必要时，可在缓冲液（含100mM甘氨酸、1mM MgCl₂、1mM ZnCl₂，pH10.5）中，用牛小肠碱性磷酸酶（CIP，Pharmacia）37℃下处理30分钟，使具有突出之5′末端的DNA片段脱磷酸。为了使突出的3′末端脱磷酸，可使用同样方法进行，但酶处理的条件是37℃下15分钟，然后于56℃下处理15分钟。在1% SDS和100mM NaCl存在下，将反应混合物于68℃加热15分钟，以使酶失活，然后用苯酚-氯仿提取并在乙醇中沉淀。用大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段（Biolabs）填充突出的5′末端。在含50mM Tris-HCl（pH7.2）、0.4mM dNTP、10mM MgSO₄、0.1mM DTT、50mg/ml BSA的缓冲液中，室温下反应30分钟。按照制造商推荐的方法，在T4噬菌体的DNA聚合酶（Biolabs）存在下，填充突出的3′末端。按照制造商推荐的方法，用核酸酶S1（BRL）作有限处理以消化突出的末端。按已述方法（Maniatis，1982），将寡核苷酸“接头”连接到该DNA片段的末端上。按照Tayler等人（1985）所述的方法，利用Amersham提供的药盒，对寡聚脱氧核苷进行体外诱变。对用于噬菌体M13衍生之复制形式的大肠杆菌TG1[D（lac  proA，B），SupE，thi，hsdD5/F′traD36，proA+，B+，lacIq，lacZDM15]，可使用该DNA连接物转化感受态菌株：大肠杆菌MC1060[D（lacIOPZYA）X74，gulU，galK，strAr，hsdR]。按照Birnboim和Doly（1979）所述的技术纯化质粒DNA。按照Klein等人（1980）的方法制得质粒DNA的微量制品。按已述方法（Cameron  et  al.，1989）制备革兰氏阴性菌的染色体DNA。按照已详细说明的方法（Rigby  et  al.，1977）经缺口转译制备放射活性探针。按已述方法（Cameron  et  al.，1989），在硝酸纤维素滤膜上进行DNA序列杂交和核酸固定。当发现所研究的重组体克隆的概率很小时，可按已述方法（Maniatis  et  al.，1982）在滤膜上杂交以找该克隆。用链终止法（Sanger  et  al.，1977）测定DNA片段的核苷酸序列。其中用7-脱氮-dGP代替dGTP，以避免进行丙烯酰胺凝胶电泳时因DNA中的高GC百分比例所造成的电泳带被压缩。细菌学中使用的培养基已在文献中述及（Maniatis  et  al.，1982）。在pS4培养基中培养的方法如文献所述（Cameron  et  al.，1989）;可按下述方法在pS4培养基中培养脱氮假单胞菌SC510和G2Rifr菌株：将在L培养基（Miller，1972）中作1/100稀释的饱和预培养物接种到含25mlPS4培养基的250ml培养瓶（Erlenmeyers）中，必要时其中还含有对各菌株所携带之质粒有选择性的抗生素，培养物于30℃下保温6天，然后分析之，以滴定钴胺素或参予合成过程之酶的酶促活性。于30℃下培养根瘤病土壤杆菌、臭味假单胞菌和苜蓿根瘤菌菌株;除特别指出者外，均在L培养基中培养。按已描述的方法（Cameron et al.，1989）结合细菌。按已描述的方法提取总蛋白（Ausubel et al.，1987）。按已描述的方法，在变性条件下以丙烯酰胺凝电泳法（SDS-PAGE）分析蛋白质（Ausubel et al.，1987）。分析中使用了利用Laemli不连续缓冲系统（Laemli，1970）的phast System装置（Pharmacia）;其中依据待分析蛋白质的分子量及其纯度来选用不同的凝胶：PhastGel梯度为8-25;均-PhastGel为12.5。按照制造商提供的说明书，借用商品名为PhastGel Blue R（Pharmacia）的考马斯亮兰或同时使用PhastGel银染色药盒（Pharmacia）的硝酸银进行染色。利用Edman降解技术，以自动序列测定仪（Applied Biosystems，407A型），并配合鉴定苯基酶硫因（phenylthiohydantoines）衍生物的CLHP装置，测定蛋白质的NH₂末端序列。

实施例1：分离含cob基因的脱氮假单胞菌的DNA片段

本实施例描述携带cob基因之脱氮假单胞菌DNA片段的分离。这些片段是依据根瘤病土壤杆菌和臭味假单胞菌之cob突变株的补偿试验得以证实的（Cameron  et  al.，1989）。

这些Cob突变株是按照Miller的技术（Miller  et  al.，1972）用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍进行诱变，或插入转座子Tn5而得到的。自此，已证实了不能合成钴胺素的菌株，特别是来自味假单胞菌的cob突变株G572，和根瘤病土壤杆菌的cob突变株G159、G161、G164、G169、G171、G258、G609、G610、G611、G612、G613、G614、G615、G616、G620、G634、G638、G643、G2034、G2035、G2037、G2038、G2039、G2040、G2041和G2042。

同时，在限制酶存在下，消化5μgDNA在有广泛宿主的可运动载体（pX59）中建立脱氮假单胞菌的基因组DNA库（Cameron  et  al.，1989）。

基于互补作用，已分离子许多能够与臭味假单胞菌及根瘤病土壤杆菌之cob突变体互补的质粒。其中应特别指出的是质粒pXL151、pXL154、pXL157和pXL519。

已分离了这些质粒，切割和纯化了DNA片段，并用限制性酶切法进行了分析。图6中示出了这些片段：5.4kb的ClaI-HindIII-HindIII-HindIII片段、8.7kb的EcoRI-EcoRI片段、4.8kb的SalI-SalI-SalI-SalI-SalI-BglI及3.9kb的SstI-SstI-BamHI片段。

实施例2：分离之DNA片段的序列分析

本实施例阐述了测定脱氮假单胞菌SC510的cob基因之DNA序列的方法。

2.1.5.4kb  ClaI-HindIII-HindIII-HindIII片段的DNA序列测定

实施例1中所述的质粒pXL157中含有该片段。切割后，在两个方向上将5.4kb片段的亚片段克隆到噬菌体M13mp18或M13mp19（Norrander  et  al.，1983），或M13tg130或M13tg131（Kieny  et  al.，1983）中。然后按Henikoff（1987）所述方法体外造成缺失。然后用“通用引物”作为以链终止反应进行合成的引发物，然后定出这些缺失的顺序。恢复这些不同的缺失部分即可确定5.4kb片段之两条链的总序列（图7）。该片段包括5378pb。图7所示的序列中，在ClaI位点之前有三个限制性位点（即Sst.SalI和XbaI），这三个位点是在克隆的多位点中为测定所研究之片段序列而出现的。当我们在本发明中提到这个CalI-HindIII-HindIII-HindIII片段的DNA序列中，即是指图7所示的序列，但前22个碱基并不与脱氮假单胞菌DNA相符（为此，限制性位的所有位置及开放相的起始位置都要参照图7中所列的序列）。

2.2.8.7kb  EcoRI-EcoRI片段的核苷酸序列

该片段包含在实施例1所述的pXL151中。其中EcoRI位点及其右侧相邻的70pb来自于载体pXL59，可通过在该载体内克隆脱氮段单胞菌SC510的Sau3AI片段而构建成pXL151。在切割之后，在两个方向上将8.7kb片段的亚片段克隆到噬菌体M13mp18或M13mp18（Norrander  et  al.，1983），或M13tg130或M13tg131（Kieny  et  al.，1983）中。然后按Henikoff的方法（1987）于体外造成缺失。用“通用引物”作为以链终止反应进行合成的引发物，然后定出这些缺失的顺序。根据这些不同缺失的恢复即可确定8.7kb片段之两条链的总序列（图8）。该片段包含8753pb。

2.3.4.8kb之SalI-SalI-SalI-SalI-BglI片段的序列分析该片段包含在实施例1所述的质粒pXL154中。分析程序与实施例2.2相同。图32中列出了4.8kb片段之两条链的总序列。该片段含4749pb。

2.4.3.9kb之SstI-SstI-BamHI片段的核苷酸序列

该片段包含在实施例1所述的质粒pXL519中。其序列分析程序与实施例2.2中所述相同。图33中列出了3.9kb片段之两条链的总序列。该片段含3855pb。

由这些核苷酸序列，得到有很少切点的酶切限制图（图6）。脱氮假单胞菌SC150之DNA有相当高比例的碱基GC（65.5%），并且在序列凝胶上以压缩的形式显现。可提供两种办法来避免这些问题：

ⅰ）在序列分析反应中用7-脱氮-dGTP代替dGTP，以尽可能地减小电泳时在序列凝胶中形成的二级结构;

ⅱ）测定两条链的序列

实施例3：分析这些核苷酸序列-确定开放相

5.6kb  ClaI-HindIII-HindIII-HindIII片段（图7）、8.7kbEcoRI-EcoRI片段（图8）、4.8kbSalI-SalI-SalI-SalI-SalI-BglI片段（图32）和3.9kbSstI-SstI-BamHI片段（图33）的核苷酸序列均可用于限定开放相。由于DNA链中GC的百分比例很高，且其开放相也是大量的，故很少能看到转译终止密码子。利用Staden和MacLachlan的方法（1982），根据所使用的密码子研究编码相出现的几率。这一概率是假单胞菌属细菌DNA序列上对已测定序列的基因密码子之使用的函数，故这些概率可比同一条链上的其他相有更好的概率并更好地表征开放相。

3.1.鉴定5.4kb  ClaI-HindIII-HindIII-HindIII片段之五个开放相的结构特征。它们被定名为相1至5，且在5.4kb片段之序列上的位置如下所述（在从ClaI位点到HindIII位点的5′-3′序列上）：

表：5.4kb  ClaI-HindIII-HindIII-HindIII片段之可能的开放相。该序列上的位置相当于图7中所示之序列上的位置。编码链为5′-3′的链，相当于图中上面的一条链。

图9中所示者代表编码相的开放相的概率，同时有对其他相（共五个相）所观察的概率。这五个相均编码在同一条链上。其中四个相（开放相1至4）具有转译偶联之编码的特征（Normak  et  al.，1983），即相X+1的转译起始密码子与相X的转译终止密码子或其邻近的密码子交迭。

3.2.鉴定8.7kb  EcoRI-EcoRI片段之八个相的特征。这些相分别被定名为相6至13，它们在该8.7kb片段之序列上的位置如下所述。

表：8.7kb  EcoRI片段之可能的开放相。该序列上的位置相当于图8所示序列上的位置;该图中上方的一条链为编码链。

图10中列出了这些开放相的概率，同时还列出了由其他相（共6个相）观察到的概率。除相11外，各相均以同一条链编码。其中四个相具有转译偶联之编码相的特征（Normark  et  al.，1983），即相X+1的转译起始密码子与相X的转译终止密码子或其邻近密码子相交迭。

3.3.鉴定4.8kb  SalI-SalI-SalI-SalI-SalI-BglI片段之四个开放相的特征。这些相被命名为相14-17，它们在4.8kb片段之序列上的位置如下所述（由SalI位点到BglI位点的序列5′-3′上）。

表：4.8kb  SalI-SalI-SalI-SalI-SalI-BglI片段之可能的开放相。该序列上的位置与图32上所示的位置相一致，其上方一条链为5′-3′方向。相15、16和17与相14相反，前者由上面一条链编码。

图34中列出了这些开放相的概率，同时给出其他相（共4个）所观察到的概率。相14、15、16和17由同一股链编码，而相14则由互补链编码。

3.4.鉴定3.9kb  SstI-SstI-BamHI片段之四个相的特征。这些相分别被命名为相18-21，它们在3.9kb片段之序列上的位置示于下表中。

表：3.9kb  SstI-SstI-BamHI片段之可能的开放相。该序列上的位置相当于图33所示的位置，图33中上面一条链的极向是5′-3′。相18和19与相20和21不同，前者由下面一条链编码。

图35中示出了这些开放相的概率，同时还有就其他相（共4个相）所观察到的概率。相19和20以不同的方式转录。

实施例4：对具有cob基因之DNA片段的遗传学研究

本实施例表明前面鉴定的不同开放相与在生物合成钴胺素和/或钴胺酰胺中涉及的、这些同样片段所具有的基因间的关系。这些基因在下述的遗传学研究中得以进一步鉴定。

4.1.对5.4kb片段的遗传学研究

质粒pXL723即含有2264pb  EcoRI-HindIII片段的质粒pRK290（Ditta  et  al.，1980），其相当于所研究的、克隆到pRK290之EcoRI位点中之片段的右侧部分（图11）。图11和12的附图说明中描述了用于这项研究的其他质粒（pXL302、pXL1397、pXL545、pXL545Ω、pXL556和pXL1500）的构建。

利用Bruijn和Lupski（1984）的技术，得到在pXL723上的插入。对质粒pXL723上转座子Tn5的插入进行选择，并图解显示在5.4kb片段中（图12）。pXL723补偿臭味假单胞菌的cob突变株G572和根瘤病土壤杆菌的cob突变株G634的缺陷。这些插入可分为两组失活的插入：或者是不能再使cob突变株G634得到补偿的插入，或者是消除cob突变株G634之补偿作用的插入（图12）。失活G572突变株之互补作用的插入图解显示于开放相4中（涉及插入15、27、68、81和97）;开放相4相当于cob基因。该基因被定名为cobC。失活突变株G634之互补作用的插入图解显示于相5中（即插入66和107，图12）;开放相5相当于cob基因。该基因被定名为cobD。另外完成了转座子Tn5Spr的插入。在实验室中构建转座子Tn5Spr并克隆到转座子Tn5（Jorgensen et al.，1979）的BamHI位点，该暗盒含有得自质粒pHP45Ω（Prentki et Krisch，1984）的壮观霉素抗性基因。在脱氮假单胞菌SBL27Rif 菌株的染色体中进行这些插入。菌株SBL27是脱氮假单胞菌经多次诱变产生的衍生株。在PS4培养基中，SBL27的钴胺素产率比SC510少9倍。在具有多转座子插入的菌株SBL27Rifr的10000个克隆上，其中有30个以上的克隆失去了合成钴胺素的能力。某些克隆具有本实施例中所研究之片段的插入。按照Southern的方法（Southern，1975）经限制性酶切分析，图解显示这些插入。在cob基因中可找到这些插入中之序号为2639的一个插入;该插入由具有含cobC基因之片段的质粒pXL302补偿（图12）。开放相3中有两处插入（定名为2636和2638）。这些突变在钴胺素生物合成中被阻断，它们可由含有开放相3的质粒pXL1397补偿，但不能由含有cobC和cobD基因的质粒pXL302补偿（图12）。这两处插入处于其他基因中。我们将cobB基因加入到开放相3内。2933插入是位于开放相2中;它可由含开放相2的质粒pXL1500补偿;该插入未能由含有基因cobB的质粒pXL1397补偿，而使cobB中的两处插入得到补偿。这里涉及到在另一个基因中的插入;我们将定名为cobA的基因加到开放相2中。

将得自质粒pUC4K的卡那霉素抗性基因暗盒（Barang et al.，1985）引入已克隆到质粒pUC8（Viera et Messing，1982）中之ClaI（该序列上的0位置）-RsaI（该序列上的1686位）片段的NotI位点;它涉及到位于相1中771位的NotI位点（见图7上的序列）;两处插入均保留相当于抗性基因暗盒的不同方向。将各自均具抗性基因暗盒之插入的片段克隆到质粒pRK404（Ditta et al.，）中，以得到质粒pXL1630和1631。通过接合转移，然后在对质粒没有选择性的抗生素（四环素）存在下，经一系列培养-稀释过程，将这些质粒引入脱氮假单胞菌的SC510Rif

菌株中，发现其中具有质粒片段与染色体片段交换和具有质粒丢失的双重重组体。两菌株的特征是：

ⅰ）在被命名为SC510：1631Rif

的菌株中，发现卡那霉素抗性基因暗盒在NotI位点（存在于相1中）被插入染色体内;卡那霉素抗性基因的转录极性与开放相1相反。

ⅱ）另一个被命名为SC510：1630Rif 的插入是在同一位点被插入抗性基因暗盒中，但抗性基因的转录具有与整个开放相1相同的极性。

这两个菌株的钴胺素合成率均至少比SC510低100倍。

质粒pXL545Ω相当于在BamHI位点插入了pHP45Ω质粒之壮观霉素抗性基因暗盒的质粒pXL545。该含有814pbClaI-HindIII片段（只有开放相1是完整的）的质粒（图12）只能使突变体SC510：1630Rif

得到补偿。既然该突变体可由仅含完整开放相1的质粒补偿，便足以确定为新基因。开放相1相当于合成钴胺素和/或钴胺酰胺中的基因。该基因被定名为cobE。质粒pXL545Ω对突变体SC510：1631Rif

没有补偿作用，这可能是由于下述事实：cobA、cobB、cobC、cobD和cobE或其部分均属于同样的操纵子，而且cobE中的插入保留了操纵子转录意义上的转录，但该插入只可由cobE基因的反向表达来补偿。与突变体SC510：1631Rif 相反，它只能由允许在cobA至cobE基因进行反向表达的质粒来补偿。

5.4kbClaI-HindIII-HindIII-HindIII片段含有分别定名为cobA、cobB、cobC、cobD和cobE的五个cob基因。

4.2.对8.7kb片段的遗传学研究

质粒pXL367是含有克隆到EcoRI位点中之8.7kbEcoRI片段的pRK290（Ditta  et  al.，1980）（图13）。

借助已描述过的技术，选择质粒pXL367上转座子Tn5的插入（Bruijn  et  Lupski，1984）。图解显示出8.7kb片段中的插入。按已述方法（Stachel  et  al.，1985），以同样方式得到转座子Tn31acZ的插入，并以图解显示之。也显示出29处转座子Tn5的插入和13处转座子Tn31acZ的插入。图14中列出了在8.7kb片段上这些插入的确切位置。这些质粒在8.7kb片段上各自都有一个唯一的插入，并通过接合转移被引入到根瘤病土壤杆菌之cob突变体G164、G609、G610、G611、G612、G613、G614、G615、G616、G620、G638中。这些突变体都是由质粒pXL367补偿的。曾研究过那些不再能补偿各突变体的插入。它们相当于负责补偿相应突变体之基因中的插入。图14中列出补偿有不同钴胺素（cob表型）生产特性之突变体的结果。如果重组突变体产生的钴胺素比没有质粒pXL367的同一突变体产率低2倍以下，即认为没有补偿作用。对于所研究的突变体G164、G609、G610、G611、G612、G613、G614、G615、G616、G620、G638，已观察到八类导致突变表型的、失活转座子的不同插入。这些不同类插入的特征在于具有这些同样插入的质粒pXL367，没有因插入而对一种或多种突变体产生补偿作用。每类相当于一个突变基因。已观察，到在同类中出现的插入是一些插入在另一些插入的一侧被定位的。所观察到的八类插入可限定八种基因。每类插入应被限定在含相应基因的最小片段内。与限制图相符，图14显示由各类插入限定的区域间有很好的相关性，而且也显示了前面描述的各开放相（实施例3）。事实上，对于每类插入来说，已证明转座子正是被插入到含在单一开放相中的8.7kb片段部分内。可见开放相和单一开放相与各类插间是相联系的。上面提到的各开放相可编码各个生物合成钴胺素和/或钴胺酰胺过程中所涉及的蛋白质。每种开放相均对应于参予钴胺素和/或钴胺酰胺生物合成的各不同的酶。这些开放相（即相6-13）分别被定名为cobF、cobG、cobH、cobI、cobJ、cobK、cobL和cobM。图14中列出了这些基因相对于其在限制图上的位置。

4.3.对4.8kb片段的遗传学研究

质粒pXL1558是含有克隆到pRK290（Ditta  et  al.，1980）之EcoRI位点中的pXL154（Cameron  et  al.，1989）之12kbHindIII-HindIII片段的质粒pRK290（图36）。本项研究中所使用的其他质粒（pXL233和pXL843）的构建已在图36的附图说明中述及。

在质粒pXL1558上制得Tn5Sp插入。首先构建含转座子Tn5Sp的菌株;这是借助质粒pRK2013Tn5Sp（Blanche  et  al.，1989）转化菌株C2110（Stachel  et  al.，1985）而实现的;具有复制原点COLE1的质粒pRK2013Tn5Sp在菌株C2110（polA-）中不能复制。转化后所得到的菌落是抗壮观霉素的，在它们染色体中有转座子Tn5Sp;然后分离菌落，并按已述方法（Miller，1972）在菌株MC1060中借助噬菌体P1转导转座子的插入。用质粒pXL1558转化菌株MC1060Tn5Sp;然后借助C600Rifr中的pRK2013，通过接合使质粒pXL1558游动。再选择四环素抗性接合体（对于质粒pXL1558）和壮观霉素抗性接合体（对于转座子）;这些接合体应含有插入了转座子Tn5Sp的质粒pXL1558。用限制性消化方法鉴定质粒pXL1558上之插入，准确地说是在12kb片段中之插入的特征;得到23处插入并图示于12kb片段上;图37中显示了这些片段上不同插入的位置。在pXL1558∷Tn5Sp接合转移并引入质粒pR751之后，在菌株SC510Rifr的染色体上引入这23处插入。质粒pR751是抗三甲氧苄二氨嘧啶的、与pXL1558有不相容性的同组质粒（incP，Thomas  et  Smith，1987）。如已描述的那样，利用标记物的交换技术，经双股同源重组，从对pXL1558无选择性（没有四环素），但对pR751和转座子有选择性（存在三甲氧苄二氨嘧啶和壮观霉素）的培养物中，获得具有染色体内pXL1558∷Tn5Sp之突变交换以及pXL1558分离（Schell  et  al.，1988）的菌株。如此选择的菌株的染色体内带有转座子。经Southern分析（Southern，1975）证实了其双股同源重组。用该方法已鉴定出12kb片段中的23个SC510Rifr∷Tn5Sp菌株。

另一方面，按照Southern方法（Southern，1975）经限制性酶切分析在图37中图示出其他的Tn5Sp插入，这些Tn5Sp插入是基于对菌株SBL27Rifr（Blanche  et  al.，1989）中的转座子进行随机诱变而得到的;所得菌株被定名为SBL27Rifr∷Tn5Sp1480。

依照已述的方案（Cameron  et  al.，1989），在PS4培养基中培养这24个菌株，以测定钴胺素的合成率，而cob表型则归属于维生素B₁₂比亲代SC510Rifr菌株（resp.SBL27Rifr）低1000倍以下的菌株（图37）。还观察到导致出现脱氮假单菌之cob表型的六个染色体插入;它涉及插入31.1、41.3、45、55、22.1和1480。

在具有cob表型为SC510Rifr∷Tn5Sp31.1、SC510Rifr∷Tn5Sp45、SBL27Rifr∷Tn5Sp1480的三个菌株中，经接合转移引入三个质粒pXL233、pXL837（Cameron  et  al.，）和pXL843。这三个突变株都有合成钴胺素能力方面的不同程度之补偿作用的特征。事实上，SBL27Rifr∷Tn5Sp1480是由pXL837和pXL843而不是由pXL233补偿的;突变株SC510Rifr∷Tn5Sp45只由pXL843补偿;而突变株SC510Rifr∷Tn5Sp31.1则由质粒pXL843及质粒pXL233补偿（见图37）。根据对三种突变体所作补偿试验的结果，所提供的材料可以得出这三种突变体不相同、且对于它们中的每一个来说，转座子Tn5Sp均插入不同的cob基因中的结论。

另一方面，通过接合转移，可将质粒pXL1558∷Tn5Sp41.3、pXL1558∷Tn5Sp45和pXL1558∷Tn5Sp22.1引入菌株G2035（Cameron  et  al.，1989）中，而没有使其得到补偿。与质粒pXL1558∷Tn5Sp31.1相反，质粒pXL1558可使该突变株得到补偿。

表型和补偿作用的数据可使我们限定这三类插入;其中每类都可由以下插入表示：第1类，31.1;第2类，45，41.3、55和22.1;第3类，1480。

对于每类插入，转座子总是被插入到单一开放相（如实施例3中限定的ORF14、ORF16和ORF17）中4.8kb片段的部分。各类插入均与单一开放相相关联。上面指出的开放相编码参予钴胺素和/或钴胺酰胺生物合成的蛋白质。将这些开放相（相14、16和17）分别定名为cobX、cobS和cobT。图37中给出了这些基因在限制性酶切图上的位置。开放相15不是cob基因。

4.4.对39kb片段的遗传学研究

质粒pXL1557是含有被克隆到pRK290（Ditta  et  al.，1980）中EcoRI位点之pXL519的9kbHindIII-BamHI片段的质粒pRK290（图38）。本项研究中使用的其他质粒（pXL1286、pXL1303、pXL1324）的构建已在图38的附图说明中述及。另外将质粒pXL519中的2kbBglII-XhoI片段（图33所示序列的位置251和2234）克隆到质粒pXL435（Cameron  et  al，.）的BamHI-SalI位点，以产生质粒pXL699。

按照实施例4.3.中所述的方法，在质粒pXL1557上制得Tn5Sp插入。选择称为pXL1557∷Tn5Sp的在质粒pXL1557上转座子Tn5Sp的插入。如4.3节所述，在pXL1557∷Tn5Sp接合转移并经双股同源重组以交换标记之后，将这些示于9kb片段上（图39）的插入引入SC510Rifr的染色体中。

用Southern的方法（Southern，1975）证实双股同源重组，从而鉴定出20个SC510Rifr∷Tn5Sp菌株。

另一方面，按照Southern的方法（Southern，1975），经限制性酶切分析在9kb片段上图示出通过对菌株SBL27Rifr（Blanche  et  al.，1989）中的转座子Tn5Sp进行随机诱变所得到的两处Tn5Sp插入，即图39中所示的插入1003和1147。

按照已述方案（Cameron et al.，1989），检测培养于PS4培养基中的22个菌株的钴胺素合成率。而cob表型则属于维生素B₁₂产率比亲代SC510Rifr（resp.SBL27 Rifr）低1000倍（resp.100）以下的菌株（图39）。通过脱氮假单胞菌中的cob表型表达仅有的4处插入1、1003、23和1147。

通过接合转移在具有cob表型SC510  Rifr∷Tn5Sp1、SBL27Rifr∷Tn5Sp1003、SC510  Rifr∷Tn5Sp23和SBL27  Rifr∷Tn5Sp1147的四个菌株中引入四个质粒pXL699、pXL1286、pXL1303和pXL1324。质粒pXL699可补偿前两个突变株（SC510Rifr∷Tn5Sp1、SBL27Rifr∷Tn5Sp1003），质粒pXL1303则不能;质粒pXL1324可补偿另外两个突变株（SC510  Rifr∷Tn5Sp23和SBL27  Rifr∷Tn5Sp1147），而质粒pXL1286则不能。

另一方面，通过接合转移将质粒pXL1557∷Tn5Sp引入菌株G2040中不能补偿之，而通过接合转移将质粒pXL1557、pXL1557∷Tn5Sp6A、pXL1557∷Tn5Sp54、pXL1557∷Tn5Sp48、pXL1557∷Tn5Sp21、pXL1557∷Tn5Sp8、pXL1557∷Tn5Sp23引入其中，则能够补偿之（见图39）。

根据表型和补偿数据可限定两类插入。对于各类插入，转座子总是被插入到包含在单一开放相中的39kb片段之一部分内（如实施例3中限定的ORF19和ORF20）。

各类插入均与开放相相关联。上面提到的开放相可编码参予钴胺素和/或钴胺酰胺之生物合成的蛋白质。这些开放相被定名为即相19和20的cobV和cobU。相18和21不是铵胺素生物合成中涉及的基因。图39中示出了这些基因相对于限制图中的位置。图解显示了基因cobU和cobV之间的插入48、21和8。

实施例5：基因和蛋白质

5.1.5.4kb片段

在5.4kbClaI-HindIII-HindIII-HindIII片段上限定了五个基因（cobA、cobB、cobC、cobD和cobE）。它们分别编码下列COB蛋白质：COBA、COBB、COBC、COBD和COBF。图15中显示了基因（cobA至cobE）的编码部分，以及蛋白质COBA至COBE的序列。还给出了各种蛋白质的性质（氨基酸组成、等电点、极性指数及亲水性曲线）。

5.2.8.7kb片段

在8.7kb片段上限定了八个基因。这些基因（cobF至cobM）分别编码下述COB蛋白质：COBF、COBG、COBH、COBI、COBJ、COBK、COBL、COBM。图16上描绘了这些基因（cobF至cobM）的编码部分，以及蛋白质COBF至COBM的序列。其中还给出了这些蛋白质的性质（氨基酸组成、分子量、等电点、极性指数及亲水性曲线）。

5.3.4.8kb片段

在4.8kbSalI-SalI-SalI-SalI-SalI-BglI上限定了三个基因（cobX、cobS、cobT）。它们分别编码下列蛋白质：COBX、COBS、COBT。图40上描绘了这些基因的编码部分，以及蛋白质COBX、COBS和COBT的序列。最好选择处于cobS之1512位的ATG，而不选择1485位的ATG（见图32）作为起始密码子。图中还给出了各蛋白质的性质（氨基酸组成、等电点、极性指数及亲水性曲线）。COBT具有相当于氨基酸214至305的相近亲水性。

5.4.3.9kb片段

在3.9kb之SstI-SstI-BamHI片段上限定了两个基因（cobU和cobV）。它们分别编码下列蛋白质：COBU和COBV。图41中描绘了这些基因的编码部分，以及蛋白质COBU和COBV的序列。其中还给出了这些蛋白质中每种蛋白质的性质（氨基酸组成、等电点、极性指数及亲水性曲线）。

根据用Hopp和Woods（1981）的程序获得的亲水性曲线可知，除COBV以外的所有COB蛋白质均与膜蛋白相反，都具有任意可溶性质，虽然也已证明其中没有大的疏水区域。既然已证明COBV有4个长的疏水区域（见图41），可知其或者是膜蛋白，或者是具有内部疏水区的胞浆蛋白质。

对于所有COB蛋白质的氨基酸序列，都指出甲硫氨酸为NH₂末端的第一个氨基酸。此可被认为是体内切割所致（Ben Bassat et Bauer，1984）。曾提出有关用甲硫氨酸氨肽酶切除NH₂末端甲硫氨酸的规则（Hirel et al.，1989）。

另外，按照Kanehisa（1984）的程序，将该蛋白质与Genpro的蛋白质相比较，后者是增加编码部分推测出200个以上氨基酸而得到的Genbak的蛋白质抽提部分（译本59）。除COBT外，利用Genbank的译本59上的参数，均不能证明有明显的同源性。事实上，蛋白质COBT在其位置（以氨基酸计）224和293之间存在一个“酸性氨基酸核心”（见图40）;该蛋白质的这个部分有多个氨基酸是谷氨酸或天冬氨酸残基;按照Kanehisa（1984）的程序，该酸性氨基酸核心可提供在该区域上的同源蛋白质，而其他这些同源蛋白质也具有其同样的酸性核心。有更好同源性的蛋白质是：恶性虐原虫的GARP蛋白（Triglia  et  al.，1988），大鼠心肌的肌钙蛋白T（Jin  et  Lin，1989），人和大鼠的胸腺素原（Eschenfeld  et  Berger，1986）与精胺相连之雄激素依赖性大鼠蛋白质（Chang  et  al.，1987），人、大鼠和鸡的“中等大小神经细丝亚单位”蛋白质（Myers  et  al.，1987;Levy  et  al.，1987;Zopf  et  al.，1987）。有关这些富酸性残基之核心的功能特性尚不明确;但这些酸性核心可以固定Co⁺⁺等金属阳离子，从而将钴之金属硫因的作用提供给蛋白质COBT，或使其与其他蛋白质相互作用。

实施例6：酶学研究

6.1.根据酶促活性鉴定COB蛋白质及其基因

本实施例说明由已纯化的蛋白质开始，在确定了其NH₂末端序列后，有可能在已确定序列的cob基因中找到相应的结构基因。

1、鉴定由基因cobA编码的蛋白质COBA

已描述过有关脱氮假单胞菌之SUMT的纯化（F.Blanche et al.，1989）。按照上述技术测定已纯化之蛋白质的NH₂末端序列。已鉴定出前10个氨基酸：

 1   2   3   4   5   6   7   8   9   10

Met Ile Asp Asp Leu Phe Ala Gly Leu Pro

蛋白质COBA的NH₂末端序列（图15）与此序列精确相符。以12.5%PAGE-SDS电泳估测的纯化之SUMT的分子量为30，000。由其序列推测的蛋白质COBA的分子量为29，234（图15）。NH₂末端序列及分子量间的一致性清楚地表明蛋白质COBA即相当于SUMT。基因cobA即是SUMT的结构基因。

2、鉴定由基因cobB编码的蛋白质COBB

a）钴啉酸a，c-二酰胺合酶活性的定量分析

本实施例说明未曾描述过的类咕啉生物合成途径中之酶促活性的测定。这涉及钴啉酸a，c-二酰胺合酶（ACDAS），它催化咕啉核或脱二钴咕啉上咕啉核之两个羧酸官能团在a和c位的酰胺化（图17）。NH₂基因的供体是L-谷氨酸，且该反应中每酰胺化一个羧酸官能团消耗1分子ATP。下述检测方法适用于钴啉酸的二酰胺化反应;对其稍加改进（特别是在330nm处检测CLHP分离物）即可应用于氢化咕啉酸的二酰胺化反应。

于30℃下将含有ATP（1mM）、AgCl₂（2.5mM）、谷氨酰胺（100μM）、钴啉酸（50μM）或氢化咕啉酸（50μM）、钴啉酸a，c-二酰胺合酶（约1活性单位）的保温混合物（250μl0.1MTris-HCl，pH8）保温1小时。保温结束后，向混合物内加入125μKCN水溶液（2.6g/L）和125μl0.2MHCl，然后于80℃加热10分钟，以5000×g离心5分钟。经CLHP分析50μl离心上清液。将样品注射到25cm的Nucleosr15-C₁₈柱上，用加在缓冲液A中的0-100%缓冲液B梯度洗脱30分钟;缓冲液A：0.1M磷酸钾（pH6.5）、10mMKCN;缓冲液B：0.1M磷酸钾（pH8），10mMKCN/乙腈（1/1）。根据其在371nm处的吸光率检测类咕啉。酶活性单位定义为在下述条件下，每小时合成1毫微摩尔酰胺基团所需的酶量。

b）脱氮假单胞菌之钴啉酸a，c-二酰胺合酶活性的纯化

本试验说明如何纯化参予钴胺素生物合成的脱氮假单胞菌之蛋白质。

从实施例6.1.2a）所述的定量检测开始，按下述方法纯化脱氮假单胞菌的钴啉酸a，c-二酰胺合酶：

在典型的纯化实验中，向菌株SC510Rif

内引入质粒pXL1500（参见实施例4.1对pXL1500的描述及附图12），将7克上述菌株的湿细胞悬浮在30ml0.1MTris-HCl（pH7.7）中，并于4℃下超声处理15分钟，然后以50，000×g离心1小时，以回收粗提物，取10ml该提取物注入已用同样缓冲液平衡过的MonoQHR10/10柱上。用KCl的线性梯度（0-0.5M）洗脱蛋白质。合并含酶活性部分（由实施例6.2b所述的试验证实）并浓缩到2.5ml。用1ml25mMTris-HCl（pH7.7）溶液稀释后，将蛋白质加入MonoQHR5/5柱上，利用上述KCl梯度（0-0.5M）分离之。合并各活性部分，在样品内加入1ml含1.7M硫酸铵的0.1M  Tris-HCl（pH7.7）溶液，然后在Phenyl-Superose（Pharmacia）柱上用硫酸铵递减梯度（1.0M-0M）进行层析分离。收集含所研究之活性的部分，并在Bio-GelHPHT（Bio-Rad）柱上用磷酸钾梯度（0-0.35M）进行层析分离。

经此步骤后，酶的纯度大于95%，PAG-SDS分析显示它不含有任何污染蛋白。这些蛋白质纯度可由NH₂末端序列的独特性得以证实。用该技术测得其分子量为45，000。下表中列出了ACDAS的纯化步骤，连同它们的纯化因数和产率。

表：ACDAS的纯化

纯化步聚	体积（ml）	蛋白质（mg）	比活性（单位／mg蛋白质	产率	纯化因数1
						粗提物MonoQ10/10MonoQ5/5Phenyl-SuperroseBio-GelHPHT	1012312	20015.13.750.8650.451	8.51082728501320	-96604335	-12.732100155

¹该因数是根据纯化过程中各部分的比活性的增加计算的

c）脱氮假单胞菌之钴啉酸a，c-二酰胺合酶的NH₂末端序列及编码该活性之脱氮假单肥菌结构基因的鉴定

本实施例旨在阐明如何根据参予钴胺素生物合成之蛋白质的NH₂末端序列鉴定编码该蛋白质的结构基因。

按前述方法，也确知了按实施例6.1.2b）中所述纯化的脱氮假单胞菌之钴胺酸a，c-二酰胺合酶的NH₂末端序列。鉴定出15个残基：

 1   2   3   4   5   6   7   8

Ser Gly Leu Leu Ile Ala Ala Pro

 9   10   11   12   13   14   15

Ala  Ser  Gly  Ser  Gly  Lys  Thr

蛋白质COBB的NH₂末端序列（图15）与该序列确切相符，如果是图15中给出的这个序列，则甲硫氨酸是在经直接序列分析测得之肽序列的前面。因此可知，氨基末端的甲硫氨酸肯定是在体内被甲硫氨酸肽酶切掉的（Ben Bassat et Bauer，1987）。由12.5%PAGE-SDS电泳估测纯化之ACDAS的分子量为45，000。由COBB蛋白质序列推算其分子量为45676（图15）。NH₂末端序列与分子量之间的一致性清楚地表明蛋白质COBB即相当于ACDAS。cobB基因是ACDAS的结构基因。

3、鉴定由基因cobI编码的蛋白质COBI

a）S-腺苷-L-甲硫氨酸：前咕啉-2转移酶活性的定量分析

本实施例说明未曾描述过之类咕啉生物合成途径中酶促活性的测定。这涉及S-腺苷-L-甲硫氨酸：前咕啉-2甲基转移酶（SP₂MT），该酶催化S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）的甲基转移到前咕啉-2上以得前咕啉3（图18）。因子II和III分别是由薛氏丙酸杆菌的细胞提取物纯化的前咕啉-2和前咕啉-3的氧化产物（Battersby et Mac Donald，1982;Scott et al.，1984）;前咕啉-2和前咕啉-3作为推想的生物合辅酶B₁₂的中间体已被确认，但此前还未曾象这样被纯化过。基于这一原因，也就未曾测知相应的活性。作为酶促反应底物的前咕啉2，其分子很小，即使有痕量氧存在也可使其自发地氧化，故不能保存（Battersby et MacDonald，1982）。该酶学试验的原理建立在下述其暂时存在之可能性上，即借助引入了质粒pXL1500之SC510菌株的酶提取物，可由SAM和δ-氨基-γ-酮戊酸即时生成前咕啉-2。应在严格的厌氧条件下进行保温。

在5mMDTT、1mMEDTA、100μM[甲基-3H]-SAM（1μCi）、0.8mMδ-氨基-γ-酮戊酸和6mM脱氮假单胞菌S510Rif

pXL1500菌株之粗制酶提取物存在下，于1ml0.1MTris-HCl（pH7.7）缓冲液中将含SP₂MT的部分30℃保温3小时。S510Rif pXL1500含有强活性SUMT（F.Blanche et al.，1989）。保温时产生的四吡咯化合物被固定在DEAE-Sephadex阴离子交换柱上，并在无氧条件下于含5%硫酸的甲醇中使之酯化。然后利用二氯甲烷/甲醇（98.3/1.7）作洗脱系统，在二氧化硅薄层上层析分离尿卟啉原III的二甲基与三甲基衍生物（F.Blanche et al.，1989）。由所得三甲基衍生物的量在所收集的甲基（二和三甲基）衍生物产物之总量中的比例（作为蛋白质量）来表示SP₂MT的活性。在所使用的检测条件下，试验中加入的SC510Rif

pXL1500的提取物没有显示出可检测的SP₂MT活性（试验中前咕啉-3产物与前咕啉-2产物的比例小于0.05）。

b）脱氮假单胞菌之S-腺苷-L-甲硫氨酸：前咕啉-2甲基转移酶的纯化

本试验说明当检测上述活性时，如何纯化参予钴胺素生物合成途径的脱氮假单胞菌蛋白质。

由含有质粒pXL253的SC510Rif细胞纯化其蛋白质。这涉及到插入了8.7kbEcoRI片段的质粒pKT230（图13）。在该典型纯化实验中，将50克引入了质粒pXL253之菌株SC510Rif 的湿细胞悬浮在250ml含0.1M磷酸钾（pH7.7）、5mMDTT中，并于4℃下超声处理15分钟。以50，000xg离心1小时，使其上清液通过DEAE-Sephadex柱（10ml凝胶）以除去四吡咯化合物。用0.1MKOH将如此制得之粗提物的pH调到pH7.7。收集在33%至45%硫酸铵饱和度间沉淀的蛋白质，并溶解于40ml0.1Tris-HCl（pH7.7）、5mMDTT溶液中。使溶液通过SephadexG-25柱，用10mMTris-HCl（pH7.7）、5mMDTT洗脱后，将收集的蛋白质注射到DEAE-Trisacryl-M柱上。再用0-0.25MKCl线性梯度洗脱蛋白质，合并含SP₂MT活性的部分并第二次通过上述的Sephadex G25柱。将蛋白质部分注射到已用10mMTris-HCl（pH7.7）、5mMDTT平衡过的Ultrogel HA（IBF）柱上。用含5mMDTT的0-50mM磷酸钾（pH7.8）线性梯度洗脱蛋白质。合并含有所研究之活性的部分，并注射到用50mMTris-HCl（pH7.7）、5mMDTT平衡过和MonoQHR5/5（Pharmacia）柱上。用kCl线性梯度（0-0.25M）洗脱SP₂MT。对MonoQ层析的流出物作PAGE-SDS（12.5%）电泳并用银盐显色，结果表明酶的纯度大于99%。此可由该蛋白质之NH₂末端序列的独特性得到进一步证实。在变性条件下（12.5%PAGE-SDS）作电泳分析，算得其分子量为26，500。下表示出了SP₂MT的各纯化步骤及其产率。

表：SP₂MT的纯化

¹此因数是根据蛋白质的产率计算的

c）SP₂MT的NH₂末端序列及对编码该活性之结构基因的鉴定

本实施例说明如何由参予生物合成途径之蛋白质的NH₂末端序列鉴定编码该蛋白质的结构基因。本实施例涉及SP₂MT的结构基因。

按前述技术确定了纯化之蛋白质NH₂末端的序列。鉴定出前15个氨基酸：

 1   2   3   4   5   6   7   8

Ser Gly Val Gly Val Gly Arg Leu

 9  10   11 12  13  14  15

Ile Gly Val Gly Thr Gly Pro

蛋白质COBI的NH₂末端序列（图16）与该序列准确相符，如果只是图16中给出的这个序列，则甲硫氨酸是在由核苷酸序列推导出的肽序列的前面。由此可知，氨基末端的甲硫氨酸肯定是在体内被甲硫氨酸氨肽酶切掉的（Ben Bassat et Bauer，1987）。经12.5%PAGE-SDS电泳估测纯化之SP₂MT的分子量为26，500。由氨基酸序列推算之蛋白质COBI的分子量为25，878（图16）。NH₂末端序列与分子量之间的一致性清楚地表明蛋白质COBI即相当于SP₂MT。cobI基因是SP₂MT的结构基因。

4、鉴定由基因cobH编码的蛋白质COBH

a）由脱氮假单胞菌重组菌株的培养物纯化携带氢化咕啉酸的蛋白质

本实施例说明如何纯化连接着从钴胺素生物合成途径之中间体衍生的中间产物或化合物的蛋白质。其涉及携带氢化咕啉酸的蛋白质（PPAHBY）。氢化咕啉酸相当于分子中心无钴原子的钴啉酸（图19）。它涉及生物合成的中间体，或者生物合成的付产物。整体考虑的理由是，连接生物合成之中间体，或者连接由该生物合成衍生之产物的蛋白质即为参予生物合成钴胺素的蛋白质。这里描述该蛋白质的纯化。对纯化过程的检测是检测与蛋白质连接之化合物的荧光。

用于纯化PPAHBY的菌株是脱氮假单胞菌菌株的衍生株;涉及到携带质粒pXL253的菌株SC510Rif 。还有在其EcoRI位点克隆了8.7kb片段的质粒pKT230（图13）。

在典型的纯化实验中，将50克菌株SC510Rif

pXL253的湿细胞（在PS4培养基中培养得到的）悬浮在200ml0.1M磷酸钾（pH7.7）缓冲液中并超声处理12分钟。以50，000xg离心1小时后，取上清液过DEAE-Sephadex柱（10ml凝胶）以除去四吡咯化合物。然后立即用1MKOH溶液将其pH调到7.7。离心收集在40-60%饱和度硫酸铵溶液中沉淀的蛋白质部分，并溶于50ml0.1MTris-HCl（pH7.7）溶液中。然后将样品注入到Ultrogel ACA54柱上（凝胶体积1000ml），用50mMTris-HCl（pH7.7）以60ml/小时的流速洗脱蛋白质。合并含待纯化的、用荧光检测（激发330nm，发射≥550mm）可见的蛋白质部分，并注射到用50nmTris-HCl（pH7.7）平衡过的DEAE-TrisacrylM柱上，然后用0-0.2MKCl梯度洗脱。合并有荧光的部分并通过已用10mMTris-HCl（pH7.7）平衡过的SephadexG25柱。将蛋白质部分注射到用10mMTris-HCl（pH7.7）平衡的UltrogelHA柱上，并用0-0.1M磷酸钾（pH7.7）梯度洗脱这些蛋白质。收集有荧光的部分并加到0.65M硫酸铵中，然后注射到已用0.65M硫酸铵中之10mM磷酸钾（pH7.7）平衡过的Phenyl Sepharose CL4B柱上。用0.65-0M硫酸铵线性梯度洗脱蛋白质。再合并这些含蛋白质的部分。如此得到的蛋白质的纯度高于99%（根据12.5%PAGE-SDS电泳及银盐显色结果）。由该蛋白质之NH₂末端序列的独特性可进一步证实其纯度。借助这一技术计算的分子量为22，000。

下表中列出了PPAHBY的纯化步骤及其产率。

表：PPAHBY的纯化

¹该因子是根据蛋白质的产率计算的。

b）携带氢化咕啉酸之蛋白质的NH₂末端序列及其结构基因的鉴定

本实施例说明如何以参予生物合成之蛋白质的NH₂末端序列来鉴定编码该蛋白质的结构基因。

按上述方法确定该蛋白质的NH₂末端序列。鉴定出了15个残基：

 1   2   3   4   5   6   7   8

Pro Glu Tyr Asp Tyr Ile Arg Asp

 9   10   11   12   13   14   15

Gly  Asn  Ala  Ile  Tyr  Glu  Arg

蛋白质COBH的NH₂末端序列（图16）与上示序列完全相符，如果只是图16上所示的序列，甲硫氨酸应在按前述序列测定法测定之肽序列的前面。由此可见，氨基末端甲硫氨酸肯定是在体内由甲硫氨酸氨肽酶切掉的（Ben Bassat et Bauer，1987）。第二个残基是脯氨酸，故这一切除事实也得到已描述之规律的证实（Hirel et al.，1989）。由12.5%PAGE-SDS电泳估测出纯化之PPAHBY的分子量为22，000。由其序列推算的蛋白质COBH的分子量为22，050（图16）。蛋白质COBH和PPAHBYNH₂末端序列和分子量之间的一致性清楚地表明了蛋白质COBH即相当于PPAHBY。cobH是PPAHBY的结构基因，并且该蛋白质参予钴胺素的生物合成。可以认为，如果在体内发现与蛋白质结合的氢化咕啉酸，则氢化咕啉酸或者是底物，或者是该COBH蛋白质催化之反应的产物或其类似物。

5、鉴定由基因cobU编码的蛋白质cobU

a）活性的定量检测

烟酸核苷酸：二甲基苯并咪唑磷酸核糖基转移酶（图5，反应5）。本实施例说明对直接参与钴胺素生物合成途径之酶活性的测定。它涉及烟酸核苷酸：二甲基苯并咪唑磷酸核糖基转移酶（NN：DMBI  PRT）（EC2.4.2.21）。在1mMNaMN（烟酸单核苷酸）和10mMDMBI存在下，在500ml0.1M甘氨酸：NaOH（pH9.7）缓冲液中将含有NN：DMBI  PRT活性（约1单位）的部分30℃保温8分钟。将反应混合物于80℃下加热10分钟，然后用4体积水稀释，并将100ml该溶液注射到15cmLHPNucleosil5-C8柱上，用0.1M磷酸钾（pH2.9）：乙腈（93：7）混合物以1ml/分钟的流速洗脱。用荧光分析法（激发：260nm;发射＞370nm）检测并定量分析5′-磷酸α-核糖。酶的活性单位定义为在上述条件下每小时产生1毫微摩尔5′-磷酸α-核糖所需要的酶量。

b）脱氮假单胞菌之NN：DMBI  PRT活性的纯化

本实验说明如何纯化参予钴胺素生物合成的脱氮假单胞菌蛋白质。从实施例6.1.5.a）所述的检测开始，按下述步骤纯化脱氮假单胞菌的NN：DBI PRT。在典型的纯化实验中，使用了10克按前述方法引入了质粒pXL1490B的菌株SC510Rif 的湿细胞。质粒pXL1490B如图38所示;该质粒是克隆繁殖pXL519（见图8）的BamHI-SstI-SstI片段得到的，它携带有脱氮假单胞菌的cobU和cobV基因。这些细胞是按已述方法在添加青紫霉素（｜lividomycin）的PS4培养基中，培养96小时后得到的。将细胞悬浮于25ml 0.1M Tris-HCl（pH7.2）缓冲液，并于4℃下超声处理15分钟。然后以50，000xg离心1小时以回收粗提物，并将该粗提物通过用同一缓冲液平衡过的DEAE-Tris-acrylM（IBF，France）柱。利用KCl梯度（0-0.6M）在MonoQ HR10/10柱上分离上述10%洗脱物（120mg蛋白质）。合并活性部分并用超离心法浓缩到2ml，与1体积30mM Tris-HCl（pH7.2）混合后，再在上述的MonoQHR5/5柱上第二次分级分离该样品。合并各活性部分，加硫酸铵到1M，并在Phenyl-Superose HR5/5柱上进行层析分离，用硫酸铵递减梯度（1M至OM）洗脱。收集含所研究之活性的各部分并用超离心法浓缩之，然后在Bio-Sil250凝胶过滤柱上层析，并用20mM磷酸钠-50mM硫酸钠（pH6.8）洗脱。

此步骤之后，酶的纯度达到95%。经PAGE-SDS分析，未见有任何污染蛋白质。这一纯度可由NH₂末端序列的独特性得到进一步证实。用该技术估测的分子量为35，000。下表显示了NN：DBI PRT的各纯化步骤及有关参数。

表：脱氮假单胞菌之NN：DBI  PRT的纯化

c）脱氮假单胞菌之NN：DBI PRT的NH₂末端序列及对编码该酶活性之脱氮假单胞菌结构基因的鉴定。按照上述技术，确定实施例6.1.5b）中纯化的脱氮假单胞菌之NN：DBI PRT的NH₂末端序列。

鉴定出前15个残基：

 1   2   3   4   5   6   7   8

Gly Leu Pro Phe Asp Asp Phe Arg

 9   10   11   12   13   14   15

Glu  Leu  Leu  Arg  Ser  Ala  Ser

蛋白质COBU的NH₂末端序列（图41）与该序列相符，如果只是图41中所示的序列，则甲硫氨酸是在以直接序列分析法测得之肽序列之第一个氨基酸的前面。由此可知，氨基未端的甲硫氨酸肯定是在体内被甲硫氨酸氨肽酶切掉了（Ben Bassat et Bauer，1987）。经12.5%PAGE-SDS电泳估测纯化之N-转糖苷酶的分子量为35，000。由氨基酸序列推算之蛋白质COBU的分子量为34，642（图41）。NH₂未端序列和分子量的一致性清楚地表明蛋白质COBU即相当于NN：DBI PRT。基因cobU是NN：DBI PRT的结构基因。

d）NN：DBI  PRT对DBI的特异性。本实施例旨在说明为合成上述核苷酸碱基，如何利用脱氮假单胞菌之NN：DBI的催化性质，研究脱氮假单胞菌NN：DBI  PRT充许在脱氮假单胞菌内生物合成各种钴胺酰胺的特异性。

用于合成钴胺素的酶的底物是5，6-二甲基苯并咪唑。苯并咪唑和5-甲基苯并咪唑分别是反应速度各自为157%和92%（与天然底物5，6-二甲基苯并咪唑相比）的反应底物，NaMN的浓度固定在2mM。对于苯并咪唑核底物来说，脱氮假单胞菌之NN：DBI  PRT的特异性很差。利用脱氮假单胞菌SC510  Rifr菌株（Cameron  et  al.，1989），在分别用苯并咪唑或5-甲基苯并咪唑代替5，6-二甲基并咪唑的PS4培养基中培养，可在该细菌中分别合成Coa-（苯并咪唑基）-cob-氰基钴胺酰胺、Coa-（5-甲基苯并咪唑基）-cob-氰基钴胺酰胺。肯定还可以用这种方法合成其他的钴胺酰胺。

6、鉴定由基因cobV编码的蛋白质COBV

本实施例说明如何定量检测脱氮假单胞菌中参予辅酶B₁₂生物合成途径的酶活性，以及该活性的部分纯化并如何得以鉴定脱氮假单胞菌中这种酶的结构基因。

a）GDP-钴啉醇酰胺：5′-磷酸a-核唑钴啉醇酰胺磷酸转移酶（即5′磷酸钴胺素合酶）活性的定量检测

本实施例说明与钴胺素生物合成途径直接相关之活性的检测方法。它涉及5′-磷酸钴胺素合酶（CPS）。在1mM EDTA、12.5mMMgCl₂、50m M5′-磷d-核唑及20m MGDP-钴啉醇酰胺（以5-脱氧-5′-腺苷基（Ado）或辅酶形式）存在下，于30℃黑暗条件下在500ml 0.3MTris-HCl（pH9.0）缓冲液中保温含CPS活性的部分（约5至10单位）。保温15分钟后，加入500ml 20mM氰化钾并将该溶液于80℃加热10分钟。离心除去沉淀物后，按前述方法检测存在于上清中的5′-磷酸维生素B₁₂。1单位5′磷酸钴胺素合酶定义为在上述条件下、每小时产生1毫微摩尔5′磷酸钴胺素所需的酶量。

b）5′磷酸钴胺素合酶的部分纯化

本实施例说明如何部分纯化参予钴胺素生物合成途径的脱氮假单胞菌的酶促活性。从上述的定量检测开始，进行5′-磷酸钴胺素合酶的纯化。为此，在一典型的纯化实验中，按前述方法在10克菌株SC510Rifr的湿细胞内引入质粒pXL1490B。该质粒pXL1490B已如图48中所示;其相当于克隆到pKT230中的3.85kb  SstI-SstI-BamHI片段。该质粒带有脱氮假单胞菌的基因cobU和cobV。脱氮假单胞菌SC510Rifr中存在这一质粒，可使CPS活性放大50倍;故有可能质粒pXL1490B所携带的插入段内含有CPS的结构基因;该基因只能是cobU或cobV。按前述方法，在添加青紫霉素的PS4培养基中培养后得到SC510RifrpXL1490B细胞。离心分离细胞后悬浮于25mlTris-HCl（pH8.3）-1mMEDTA缓冲液（缓冲液A）中，并于4℃下超声处理15分钟。以50，000xg离心1小时以回收粗提物，并使之通过用缓冲液A平衡的Sephadex  G25柱。合并含蛋白质的部分并注射到Superose12HR柱，然后用缓冲液A洗脱。回收排出部分，与等体积缓冲液A-1.0M硫酸铵混合并在Phenyl-Superose  HR  5/5柱上层析分离。用缓冲液A中的硫酸铵递减梯度（由0.5M至OM），再用OM硫酸铵单纯缓冲液A洗脱蛋白质，以得到5′-磷酸钴胺素合酶活性部分。按下表所述程序部分纯化含酶部分时，其纯化过程是基于开始时引入了75mg蛋白质而完成的。

表：脱氮假单胞菌之5′-磷酸钴胺素合酶的部分纯化

c）5′-磷酸钴胺素合酶的特异性

（Ado）GDP-钴啉醇酰胺的Km值为0.9mM。但其酶对于底物之形式（CN，aq）却具有相同的亲合性和实际上完全一样的反应速度。酶对5′-磷酸α-核唑的Km值约2.7mM。较纯的5′-磷酸钴胺素合酶制剂可催化（Ado）GDP-钴啉醇酰胺-5α-核唑的反应以产生辅酶B₁₂，在这些条件未见有任何5′-磷酸钴胺素的积聚。用于5″-磷酸α-核唑之酶的km值为7.8mM。在上述培养条件下，于PS4培养基中培养SC510 Rifr菌株生产钴胺素时，用CLHP层析法检测5′-磷酸α-核唑和α-核唑的细胞内浓度分别为30和700mM。这表明在没有5′-磷酸钴胺素参予的情况下，可通过5′-磷酸钴胺素合酶由（Ado）GDP-钴啉醇酰胺直接产生辅酶B₁₂。

在脱氮假单菌SC510 Rifr的培养物中没有5′-磷酸钴胺素的事实进一步证明了辅酶B₁₂是由（Ado）GDP-钴啉醇酰胺与5′-磷酸α-核唑在体内直接反应所产生的。

已观察到并在薛氏丙酸杆菌的体外实验中描述了这种直接反应（Ronzio  et  al.，1967;Renz，1968）。cobU或cobV只能作为CPS的结构基因，因为携带脱氮假单胞菌这两个cob基因的片段在脱氮脱假单胞菌中扩增可使CPS的活性增加50倍，且基因cobU是NN：DBIPRT的结构基因，而cobV是CPS的结构基因。

6.2.通过检测生物合成途径的中间产物来确定COB蛋白质的性质

本实施例旨在说明怎样可能将酶促活性归功于脱氮假单胞菌的COB蛋白质。该活性可根据在所提到的步骤中被阻断之一个或多个突变体积聚之生物合成中间产物数据推断出来。事实上，如果突变体积聚了某种生物合成的中间产物，那么很可能该突变体在利用上述中间体作底物的步骤中受到阻断。

1、蛋白质COBC和COBD的性质

已在实施例1和4中述及的cob突变体G643（根瘤病土壤杆菌）和G572（臭味假单胞菌）在相当于蛋白质COBC的步骤中被阻断。事实上，这两个突变体并不能由见于基因cobC中的转座子Tn5失活插入来补偿。按已述方法，将这两个菌株即G643和G572，以及未突变的亲代菌株[C5 δ-C9 Rif

和KT2440 Rif （Cameron et al.，1989）]在PS4′培养基（用于根瘤病土壤杆菌）和PS4′培养基（用于臭味假单胞菌）（PS4′和PS4″分别相当于钴含量各低100倍和1000倍的前述PS4培养基）中培养3天。向该培养物内加入⁵⁷CoCl₂（25ml培养物为2.5μCi/0.1μm）。分析细胞内类咕啉。亲代菌株不积聚其他类咕啉而只积聚辅酶B₁₂。两个突变株G643和G572则积聚腺苷化的钴啉胺酸，其比例分别为11%和6%。这些比例（以百分数计）是与亲代菌株合成辅酶B₁₂的水平相比较而计算出来的。除钴啉胺酸之外，突变株G643还积聚钴啉酸五酰胺，其比例为2%;钴啉酸五酰胺是钴啉酸前面的中间产物。研究这些突变株的行动可知它们是在合成钴啉胺酸之后被阻断的。所有这些cob突变体均在尿卟啉原III与钴啉醇酰胺之间，或在钴啉醇酰胺与钴啉素之间被阻断。突变体G643和G572在尿卟啉原III与钴啉醇酰胺之间被阻断。然而，如果这些突变体在钴啉醇酰胺之前被阻断并积聚这两种钴啉胺酸，则由它们编码的蛋白质只能参予催化钴啉胺酸通过氨基丙醇残基酰胺化，以产生钴啉醇酰胺的酶促（钴啉醇酰胺合酶）步骤;如果其本身不是氨基丙醇，它们还可参予反应底物的合成以提供氨基丙醇。基因cobC编码或者是钴啉醇酰胺合酶，或者是其亚单位的蛋白质。

用同样方法分析在相当于基因cobD的步骤中被阻断的根瘤病土壤杆菌的cob突变株G634。该突变株没有因基因cobD中的失活插入而得到补偿（实施例4.1.）。在该突变株内发现的唯一细胞内类咕啉是腺苷化的钴啉胺酸。如前所述的突变体一样，该突变体编码参予将钴啉胺酸转化为钴啉醇酰胺的蛋白质，或者可能编码合成其他反应底物的蛋白质。

这两种不同的基因（cobC和cobD）编码参予同一反应步骤的两种蛋白质。

2、蛋白质COBF和COBM的性质

基于实施例4.2中所述的研究工作，已研究了其中各基因均被阻断了的这些已知的根瘤病土壤杆菌突变体。这些突变体是：G612（cobF）、G615（cobG）、G616（cobH）、G613（cobI）、G611（cobJ）、G620（cobK）、G638（cobL）和G609（cobM）;括号内示出了负责补偿这些突变体的脱氮假单胞菌基因（实施例5），它们相当于该突变体中已突变的基因。已在加有标记钴的前述PS4培养基中培养了这些突变体。培养四天后，分析突变体细胞内的类咕啉和脱钴类咕啉含量。

表：脱氮假单胞菌8.7kb片段之基因内，被阻断的根瘤病土壤杆菌突变体积聚的中间产物

菌株	细胞内脱钴类咕啉（％）1HAB HABM HABD	细胞内类咕啉，（％钴啉醇酰胺）	巳突变基因
				C58-C9＊C612C615C616C613	100   100   100〈5    〈5    64〈5    〈5    8435   〈10   〈10〈5    〈5    57	辅酶B12100钴胺酰胺2.2辅酶B1234辅酶B1217辅酶B1213辅酶B12〈1	-cobF cobG cobH cobI

G611G620G638G609

〈5   〈5   6512   〈5   〈10〈5   〈5   47〈5   〈5   33

辅酶B12〈1辅酶B12〈1辅酶B12〈1辅酶B12〈1

cobJ cobK cobL cobM

HAB：氢化咕啉酸

HABM：氢化咕啉酸一酰胺

HABD：氢化咕啉酸二酰胺

＊ 事实上它涉及已描述过的菌株C58-C9Rif

Nal （Cameron et al.，1989）

1 这些数值均以未突变亲代菌株C58-C9 Rif Nal

中积聚的同一中间产物的百分数表示。

这些结果表明，所有突变体均没有积聚任何类咕啉（除基因cobF中失活的突变体（G612）外，它可积聚钴胺酰胺，但所达到的水平很低，只相当于未突变菌株合成之钴胺素的2.2%）。然而，某些突变体（G612、G615和G616）的钴胺素合成水平却在亲代菌株钴胺素水平的10%以上。或许是所有这些突变体至少在钴啉酸二酰胺之前都被阻断。所有这些突变体积聚的氢化咕啉酸和氢化咕啉酸二酰胺的量都比未突变菌株低;据此它们很可能在氢化咕啉酸之前被阻断。我们可以得出这样的结论，即所有基因（cobF至cobG）均编码参予氢化咕啉酸之前各合成步骤的蛋白质。人们知道，突变体G613于基因cobI中发生突变，而基因cobI是编码参予氢化咕啉酸之前合成步骤的SP₂MT的。从本实施例的结果看，这种突变体积聚中间产物的情况与该突变体的失活步骤完全一致，即是说在氢化咕啉酸之后它不积聚任何高出见于未突变菌株之积聚水平的中间产物。这一涉及基因cobF、cobJ、cobL和cobM的结果与实施例6.4的基因密切相关，后者编码可催化SAM依赖性甲基转移，并从而在氢化咕啉酸之前干预生物合成的蛋白质。除作为SP₂MT之结构基因的cobI之外，这些基因均在前咕啉-3之前参予合成途径。事实上正如也不是SUMT和SP₂MT的结构基因一样，它们是在前咕啉-3之后参予的（本发明述及的所有cob基因都在尿卟啉原III与钴胺素之间参予该生物合成途径）。基因cobF至cobH及cobJ至cobM均编码参予前咕啉-3和氢化咕啉酸之间的酶类。由于还未证明氢化咕啉酸是生物合成的中间产物，所以我们还试图重新找出突变体内积聚的更前面的类咕啉，即已公认为生物合成之中间体的钴啉酸二酰胺（Friedman，1975）。为此我们便可以说基因cobF至cobH和cobH至cobJ编码介入前咕啉-3和钴啉酸二酰胺之间的酶类。

3、蛋白质COBS和COBT的性质

实施例1和4.3中描述的突变体G2035在与蛋白质COBS相应的步骤中被阻断。实施例1中描述的突变体G2037在与蛋白质COBT相应的步骤中被阻断。在有放射活性钴⁵⁷CoCl₂存在的PS4′培养基（其中氯化钴浓度为PS4培养基的1/10）中培养这些菌株及其亲代菌株（根瘤病土壤杆菌C58 C9Rifr）共培养3天，并按照基本专利中已述及的方法分析了它们细胞内脱钴类咕啉及类咕啉含量。菌株G2035和G2037不积聚类咕啉，而且菌株G2035只积聚高浓度的氢化咕啉酸和氢化咕啉酸一酰胺与二酰胺（即高于由亲代菌株中测得的浓度）。该突变体可能是在氢化咕啉酸二酰胺之后及钴啉酸二酰胺之前的阶段被阻断。因此，基因cobS将编码干预氢化咕啉酸转化为钴啉酸二酰胺的酶蛋白;该蛋白质可能参予钴的插入，或未腺苷化之钴啉酸a，c-二酰胺的还原，或钴啉酸-a，c-二酰胺的腺苷化作用。相反地，突变体G2037将在氢化咕啉酸的上游步骤中被阻断。基因cobT则将编码氢化咕啉酸上游和前咕啉-3下游之酶促步骤中所涉及的蛋白质（也已鉴定了为介入前咕啉-3上游步骤的酶编码的其他结构基因）。正如实施例5.3中曾提到的那样，蛋白质COBT还有可能作为结合钴的蛋白质，和/或作为通过酸性核心而整合了其他蛋白质（一种或多种）的蛋白质参予生物合成途径。

4、蛋白质cobV的性质

实施例1和4.4中已描述了突变体G2039和G2040在与蛋白质COBV相对应的步骤中被阻断。将这些菌株及其亲代菌株在PS4′培养基中，在放射活性钴⁵⁷CoCl₂存在下培养3天，并按实施例9中所述方法分析细胞内脱钴类咕啉含量并测定类咕啉含量。突变株G2039和G2040可积聚钴啉胺酸、钴啉醇酰胺、磷酸钴啉醇酰胺和GDP-钴啉醇酰胺。这些突变体有可能在GDP-钴啉醇酰胺上游的酶促步骤中被阻断。基因cobV编码参予由GDP-钴啉醇酰胺转化为钴胺素之代谢步骤的酶（图5）。这一结果与以（Ado）GDP-钴啉醇酰胺作为底物之蛋白质COBV（CP5）的活性完全相符。

6.3.根据对SAM之亲合性的研究确定COB蛋白质的活性

本实施例说明如何有可能由脱氮假单胞菌的纯化之COB蛋白质开始，经体外实验证明其固定SAM的活性。如果COB蛋白质具有这样的活性，则表明这种COB蛋白质是该途径中的甲基转移酶，并参予在尿卟啉原III与钴啉酸之间产生的八个甲基的转移。

a）SAM在已纯化之蛋白质上的亲合性试验

本试验所依据的原理是钴胺素生物合成途径中的甲基转移酶肯定有一个SAM的固定位点。与没有特异地固定该SAM的所有蛋白质相比，应证明该位点对SAM有较高的亲合力。在过量放射标记之SAM存在下，保温待研究的蛋白质，然后用凝胶过滤层析法将其与游离的SAM分离开。由该蛋白质分子量部分重新测得的放射活性即相当于保温时被固定的SAM。层析应在2℃下进行，以便最大程度地限制分离期间SAM的释放。

将此蛋白质（约10μg）加在200μl含5mM[甲基-³H]-SAM（1μCi）的0.1MTris-HCl（pH7.7）中30℃保温10分钟。保温后立即取100μl混合物注入TSK-125柱（Bio-Red）上，以1ml/分钟的流速用50mM硫酸钠/20mM磷酸二氢钠（pH6.8）混合物通过该柱的分配阀进行洗脱。收集每管0.5ml洗脱物，并用液体闪烁计数仪计数。根据洗脱物在280nm处的吸收，直接得到蛋白质与SAM的滞留时间。

b）SAM在脱氮假单胞菌COBA和COBF上固定的体外研究

1、蛋白质COBF和COBA的纯化

按下述方法纯化脱氮假单胞菌的蛋白质COBF。在该典型纯化实验中，将5克在PS4中培养后得到的、已引入了质粒pXL1546（见实施例7.3）的菌株SC510 Rif

的湿细胞悬浮于30ml 0.1MTris-HCl（pH7.7）中，并于4℃下超声处理15分钟。然后以50，000xg离心1小时以回收粗提物，使上清通过DEAE-Sephadex柱（1ml凝胶），以除去其中的四吡咯化合物。然后将10mg蛋白质提取物入射到已用同种缓冲液平衡过的MonoQHR5/5柱上，并用KCl线性梯度（0至0.25M）洗脱蛋白质。在0.2MKCl时洗出蛋白质COBF。用0.1MTris-HCl（pH7.7）稀释2位后，过MonoQHR5/5柱进行第二次纯化。经PAGE-SDS电泳分离并用考马斯兰染色显现蛋白质。该技术也表明，在经过这些纯化步骤后，COBF的纯度约为95%。按前述方法测知已纯化之蛋白质的NH₂末端序列。两个NH₂末端序列同时显现在每一降解周期上;即占括号内所示比例的各序列：

序列1（34%丰度）

1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11

Ala  Glu  Ala  Gly  Met  Arg  Lys  Ile  Leu  Ile  Ile

序列2（66%丰度）

1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11

Met  Arg  Lys  Ile  Leu  Ile   Ile  Gly  Ile  Gly  Ser

如果只是按照已说明的规则（Ben Bassat et Bauer，1989）用甲硫氨酸氨肽酶切除氨基末端甲硫氨酸（Hirel et al.，1989），则序列1相当于图16所示之蛋白质COBF的NH₂末端序列。占更多量的序列2相当于同样的蛋白质，但其转译起始处并不在我们所提到的转译起始密码子ATG处，而是在编码相上游之第5位上图（16）。事实上，发现该序列的氨基酸确切地是从见于蛋白质COBF序列上的第二个甲硫氨酸（氨基酸序号6）开始的（图16）。据此，氨基末端甲硫氨酸未被切除便进一步证实了已述及的规则（Hirel et al.，1989）。在携带质粒pXL1546的菌株SC510 Rif

中有两个转译起始位点，一方面根据我们的构建，它相当于位于Shine和Delgarno序列之适当距离上的甲硫氨酸密码子，一方面则相当于可从图16所示基因cobF之序列上找到的第二个甲硫氨酸密码子。由此可见，蛋白质cobF可能开始于图16上指出的甲硫氨酸，即见于更远处第5位氨基酸的甲硫氨酸。

无论如何，这一结果已证明蛋白质COBF得到了表达，并且是以长出4个氨基酸的形式被表达的。纯化过程中已纯化了两种形式的蛋白质。在该实施例中，我们将已纯化的蛋白质COBF称为两种已纯化之蛋白质的混合物。

按已述方法（Blanche  et  al.，1989）纯化脱氮假单胞菌的蛋白质COBA。

2、SAM的固定

按前面实施例6.6a）中所述的方法研究SAM在两种蛋白质上的固定。以牛血清白蛋白和纯化的蛋白质COBH作为阴性对照。对于蛋白质COBA和COBF，当这些蛋白质从TSK-125柱中流出时可在柱出口处观察到放射活性峰（图20）。在这一实验中，蛋白质COBI具有固SAM的同样特性。相反地，对于BSA和蛋白质COBH则测不到这样的放射活性峰。这一试验证明SAM可于体外固定在蛋白质COBA、COBI和COBF上。这些结果还表明COBA、COBI和COBF都是SAM-甲基转移酶。这一结果与COBA和COBI的活性相符，尽管分别涉及脱氮假单胞菌的SUMT和SP₂MT。蛋白质COBF有可能是钴胺素生物合成途径中的SAM-甲基转移酶。本试验进一步证明COBF是一种甲基转移酶。

6.4.基于序列同源性的研究确定蛋白质的活性

本实施例说明如何通过比较脱氮假单胞菌之各COB蛋白质的序列找出作为钴胺素生物合成途径中SAM-甲基转移酶的COB蛋白质。

蛋白质COBI和COBA是生物合成途径中的两种SAM-甲基转移酶。依照Kanehisa程序（1984）比较这两种蛋白质。基于这种比较可确定出三个强同源的区域（图21）。在其中各个区域内，两种蛋白质间有45%以上严格同源性。COBA和CYSG之间同样存在三个强同源区域（图22）;其中COBA的同一区域与COBI存着强同源性。COBA、CYSG和COBI之间的强同源区域也与其他COB蛋白质有同源性。这里涉及的是蛋白质COBF、COBJ、COBL和COBM（图23）。就区域1而言，与所有Genpro蛋白质相比，蛋白质COBF、COBL和COBM具有显著的同源性，前者是依照Kanehisa的程序（1984）增加编码部分推测出200个以上氨基酸而得到的Genbak的蛋白质抽提部分（译本59）。对于区域2来说，与所有Genpro的蛋白质（译本59）相比，蛋白质COBJ、COBL和COBM具有显著的同源性。对于第三个同源区，与所有Genpro的蛋白质（译本59）相比，COBJ、COBL和COBM显著的同源性。该序列比较可证明COBF、COBJ、COBL和COBM这四种蛋白质间具有显著的同源性，其同源区保留了三种类型甲基转移酶COBA、COBI和COBF的序列。蛋白质COBG、COBH和COBK跟保留甲基化酶的区域没有明显的同源性。在区域1中，蛋白质COBF跟其他蛋白质没有显著同源性。上述同源性与所有这些蛋白质都是甲基转移酶这一可能性相符合。该结果可将有关这些蛋白质体外结合SAM的容量与所述及的COBF的生物化学数据联系起来（实施例6.3）。这些同源性一方面可证实COBF是钴胺素生物合成途径中的SAM-甲基转移酶，同时还证明COBJ、COBL和COBM也可能是该生物合成途径中的SAM-甲基转移酶。这些结果也显示脱氮假单胞菌COB蛋白质与其他微生物的同功能蛋白质间存在同源性。

实施例7-COB蛋白质的表达

本实施例说明扩增脱氮假单胞菌中的脱氮假单胞菌COB基因之结构基因而导致COB蛋白质活性的放大。

1、蛋白质COBA的表达

质粒pXL557相当于其中克隆了5.4kb片段中之2.4kb  BglII-EcoRV片段（分别为图7所示序列的80和2394位）的质粒pXL59。该片段含有基因cobA和cobE。

质粒pXL545只含有基因cobE。其构建如实施例4.1中所述。

经接合转移将这两个基因引入SC510 Rif

中。在PS4培养基中培养菌株SC510 Rif

、SC510 Rif

pXL59、SC510 Rif pXL557和SC510 Rif pXL545。4天后终止培养，并按已述的标准程序（F.Blanche et al.，1989）检测SUMT活性。其活性如下表所示。

表：SC510Rif

及其某些衍生株SUMT活性

由这些结果可清楚地看出，SC510 Rif

中只有质粒pXL557可引起SUMT活性的净增加（50倍）。这种增加导致cobA而不是cobE的扩增，因为质粒pXL545只扩增cobE，故不能提高SUMT活性。该结果进一步证实cobA是脱氮假单胞菌之SUMT的结构基因。结果还表明可以通过扩增脱氮假单胞菌之SUMT的结构基因来提高脱氮假单胞菌中的SUMT活性。

2、蛋白质COBI的表达

将来自8.7kb之DNA片段的、含有SP₂MT之结构基因（cobI）的片段克隆到在革兰氏阴性菌中拥有广泛宿主的质粒中，然后经接合转移将该质粒引入脱氮假单胞菌SC510Rif

中。与携带载体的菌株相比较，检测该菌株的S-腺苷-L-甲硫氨酸：前咕啉-2甲基转移酶活性。

由8.7kb片段开始，纯化含基因cobH和cobI的1.9kb  BamHI-BamHI-SstI-SstI片段。将“接头”XbaI和EcoRI分别连接到BamHI和SstI位点上，并用噬菌体T4的DNA聚合酶充填之。然后将该片段插入到具有广泛宿主之质粒pXL59的XbaI和EcoRI位点。它具有卡那霉素抗性。如此得到的质粒被定名为pXL1148（图24）。

另外构建一相似质粒：由8.7kb片段开始纯化只含完整基因cobH和cobI之5′部分的1.5kb  BamHI-BamHI-SstI片段。将“接头”XbaI和EcoRI分别连接到BamHI和SstI位点上，然后用噬菌体T4的DNA聚合酶填充或消化之。再将此片段插入到pXL59的EcoRI和XbaI位点中，得到质粒pXL1149。质粒pXL1148和pXL1149的差别在于pXL1148上存在含基因cobI之3′末端的0.3kb  SstI-SstI片段。与pXL1149相反，质粒pXL1148携带cobI的完整结构基因。这两个质粒都含有基因cobH。

经接合转移将这两个质粒引入SC510 Rif

中。在PS4培养基中培养菌株SC510 Rif

、SC510 Rif pX59、SC510 Rif

pXL1148和SC510 Rif

pXL1149。培养4天后收获细胞，并按实施例6.1.3a）中所述方法检测SP₂MT活性。

这些定量检测的结果连同实施例6.1.3a）中定义的SP₂MT活性如下表所示。

表：脱氮假单胞菌之各衍生株的SP₂MT活性

试验中加入500μg粗提物

活性以实施例6.1.3a）中限定的百分率表示。

只有质粒pXL1148带来SP₂MT活性的显著提高。相反地，质粒pXL1149没有给出与对照组SC510 Rif

和SC510 Rif

pXL59菌株不同的结果。pXL1148是唯一含基因cobI的质粒，而且只有它放大了SP₂MT活性;这一结果进一步证明脱氮假单胞菌的SP₂MT结构基因是基因cobI。此外，如果在变性条件下电泳分离（10%丙烯酰胺，PAGE-SDS）这些不同菌株的整个蛋白质，则只在有pXL1148的情况下观察到相当于分子量为25，000的蛋白质（图15）。该蛋白质与蛋白质COBI的分子量相符。质粒pXL1148可使被转化的脱氮假单胞菌过量产生蛋白质COBI。

3、COBF的表达

当大肠杆菌Ptrp启动子和λ噬菌体之CII基因的核糖体的固定位点位于基因cobF的上游时才能得以表达。如此得到的表达要比以同样之多拷贝质粒的简单基因扩增所观察到的表达水平高得多。

纯化与pXL1496相近的2kb EcoRI-BamHI-BamHI片段（图26）。该片段含有大肠杆菌的Ptrp启动子和在基因cobF上游的λ噬菌体cII基因之核糖体的固定位点。基因cobF的上游有大肠杆菌之rrnB操纵子的终止密码子。将该片段克隆到质粒pKT230的EcoRI-BamHI位点以得到pXL1546（图26）。pKT230是一个可在几乎所有革兰氏阴性菌中复制的不相容性Q组群的质粒（Bagdasarian et al.，1981）。该质粒具有卡那霉素抗性。通过接合将质粒pXL1546和pKT230引入SC510 Rif

中。按前述方法在PS4培养基中培养菌株SC510Rif

pKT230和SC510Rif

pXL1546。培养4天后，用10%的PAGE-SDS电泳分析各不同菌株的总蛋白质。如图27所示，可在SC510Rif

pXL1546的提取物中观察到过表达的分子量为32，000的蛋白质;这种蛋白质与由大肠杆菌BpXL1496过表达的蛋白质共迁移（实施例7.2.1）。此外，该蛋白质只在含pXL1546的菌株SC510Rif

中被表达，而在菌株SC510Rif 和SC510Rif

pKT230的总蛋白质中则未见有这种蛋白质。这种过表达的蛋白质即是蛋白质COBF。

4、COBH的表达

本实施例描述含基因cobH之脱氮假单胞菌之DNA片段的扩增。纯化该基因编码的蛋白质;其涉及也称为携带氢化咕啉酸的蛋白质COBH。实施例7.1.2中所述的质粒pXL1149，在得到8.7kb片段的DNA插入段上只含有完整的基因cobH。与载体相反，该质粒可在SC510Rif 中过表达分子量为22，000的蛋白质（图25）。

5、COBV的表达

本实施例描述由只携带cobV的质粒（pXL699，参见图38）放大磷酸辅酶B₁₂合酶活性。在SC877Rif

中借助质粒pXL699放大磷酸B₁₂的活性，与携带载体pXL453、pXL1303、pXL1324或pKT230的同样菌株相比，其可高出50倍。该质粒在其插入段只含有完整的cobV及ORF18和cobU的5′末端部分。可以肯定，该菌株（SC877Rif

pXL699）中可过表达蛋白质COBV;与菌株SC877Rif

相比，该过表达水平高50倍。

7.2.在大肠杆菌内的表达

本实施例说明怎样在大肠杆菌内过量产生脱氮假单胞菌的COB蛋白质。

1、COBF的表达

将大肠杆菌的Ptrp启动子和λ噬菌体之CII基因的核糖体的固定位点定位在cob基因的上游，从而得以实现过表达。将8.7kb  EcoRI片段中的2250pb  EcoRI-XhoI片段（即图8所示序列上0和2250位）克隆到噬菌体M13mp19（Norrander  et  al.，1983）的EcoRI和SalI位点之间。如此构建的质粒被定名为pXl1405。经定点诱变引入NdeI位点，以使该限制性位点后面的三个碱基（ATG）构成基因cobF的转译起始位点。这涉及修饰基因cobF中ATG前面的三个碱基，即以CAT代替GAA（G在图8所示序列的第733位）。再纯化含基因cobF的NdeI-SphI-SphI片段（图26）。然后将1.5kb片段克隆到质粒pXL694（Denefleet  al.，1987）的NdeI-SphI位点中。如此构建的质粒被定名为pXL1496（图26）。在基因cobF之前的120pbEcoRI-NdeI片段（来自pXL694）上存在适于大肠杆菌基因表达的调节信号。这些信号由大肠杆菌Ptrp启动子区域[-40+1]后者接着包含λ噬菌体CII基因之核糖体固定位点的73pb组成（Denefle  et  al.，1987）。在基因cobF的上游（HindIII-BamHI片段上）有大肠杆菌rrnB操纵子的终止信号。经转化将质粒pXL1496引入大肠杆菌菌株（Monod  et  Wollman，1947）中。按已述方法（Denefle  et  al.，1987），在Ptrp启动子被抑制（存在色氨酸）或不被抑制（无色氨酸）的条件下研究基因cobF的表达。在需要抑制Ptrp启动子的情况下，完成表达所用的培养基是添加了0.4%葡萄糖、0.4%酪蛋白氨基酸、10mM硫胺素和40μg/ml色氨酸的M9基本培养基（Miller，1972）。将大肠杆菌B  pXL1496菌株于37℃下培养在加有100μg氨苄青霉素的上述培养基中。如图28所示，当没有色氨酸时，可诱导分子量为32，000之蛋白质的表达。事实上，当用PAGE-SDS分析大肠杆菌B  pXL1496的总蛋白提取物时（图28），可以很清楚地观察到分子量32，000D的蛋白质约占总蛋白质的1-4%。在没有色氨酸的相似条件下培养大肠杆菌BpXL1496所得到的总蛋白提取物中，这种蛋白质的净含量则不大。在这些条件下表达的蛋白质之分子量接近于根据蛋白质氨基酸序列推算的蛋白质COBF的分子量（28，927D）（图16）。如此在大肠杆菌内表达的蛋白质即为蛋白质COBF。

2、COBT的表达

使cob基因的5′端与lac启动子及大肠杆菌之lacZ的前三个密码子融合，得以过量产生目的COB蛋白质。

在图32所示之4.8kb片段的序列上，2624位的EcoRI位点处含有基因cobT的第四个密码子。将pXL837的3.5kb  EcoRI-XbaI片段（见图36）克隆到pTZ18R或pTZ19R（Pharmacia）的EcoRI和XbaI位点中，以分别产生pXL1874或pXL1875;这两个质粒的不同在于被截短的基因cobT与大肠杆菌乳糖操纵子之启动子（Plac）有相对的取向。Plac在pXL1874上处于cobT的上游，而在pXL1875上则相反。在pTX18R的EcoRI-XbaI位点克隆pXL837的EcoRI-XbaI片段可在大肠杆菌β-半乳糖苷酶的前4个氨基酸与由其第4个密码子开始的基因cobT之间实现蛋白质融合。基因lacZ′cobT的表达是在lacZ之表达信号的控制下进行的。经转化作用将质粒pXL1874、pXL1875、pTZ18R引入大肠杆菌BL21菌株中。按已述方法（Maniatis  et  al.，1989）研究了基因cobT的表达。

如图42B所示，用PAGE-SDS方法分析BL21pXL1874的总蛋白提取物，发现只能由pXL1874表达的分子量为72，000的蛋白质占总蛋质的1-4%。在这些条件下表达的蛋白质的分子量，与根据图40所示蛋白质COBT之氨基酸序列推算的分子量（70335D）相近。本实验清楚地表明，由基因cobT第四个密码子上EcoRI位点开始的开放相可与见于基因cobT开放相协调表达。

3、被截短之蛋白质COBS的表达

BamHI位点相应于基因COBS之第45个密码子的位置。由pXL843上切掉含基因cobS之3′部分和该基因之下游序列的1.2kb  BamHI-BamHI片段，并将其克隆到质粒pEI-3b（Rosenberg  et  al.，1987）的BamHI位点中，得到pXL1937。使BamHI以一定方式定向，以使基因cobS之被截短的部分与噬菌体T7的主要衣壳蛋白质的前12个密码子或基因10（Rosenberg  et  al.，1987）相融合。该杂合基因处于噬菌体T7之F10启动子的控制下。经转化作用将质粒pXL1937连同pET-3b转化到大肠杆菌BL21  pLyS（W.Studier，个人通讯）中。在选择性培养基上再分离后，在L培养液中培养这两个菌株、直到D0610nm为1;此阶段将该培养基调到IPTG（异丙基-β-半乳糖苷）浓度为1mM，以诱导噬菌体T4之聚合酶的表达（Rosenberg  et  al.，1987）。将培养物于37℃保温3小时，然后制备细胞的溶胞产物。在变性条件下经PAGE电泳分离如此培养之细菌的总蛋白质。如图12A中所示，只有BL21  pLysS  pXL1937培养物能特异地过表达分子量为33，000的蛋白质。这一分子量与融合蛋白质的分子量（33KD）完全相符。该实验清楚地表明由位于基因cobS之第45个密码子处的BamHI位点开始的开放相可与见于基因cobS的开放相协调表达。

实施例8：用DNA重组技术扩大钴胺素生产

8.1.在脱氮假单胞菌中扩增

本实施例说明如何通过扩增脱氮假单胞菌SC510的cob基因来改善脱氮假单胞菌SC510Rif

菌株中钴胺素的生产。

a）经除去钴胺素生物合成中的限制性步骤来改善脱氮假单胞菌中钴胺素的产量。

本实施例说明如何通过扩增脱氮假单胞菌的cob基因得到以改善脱氧假单胞菌SC510Rif

菌株中的钴胺素产率。

这种改善是由除去生物合成途径中的限制性步骤而导致的。

实施例4.2中已描述了质粒pXL367（图13）。该质粒相当于其中插入了8.7kb之EcoRI片段的pRK290（Ditta et al.，1981）。质粒pXL367可导致菌株SC510Rif

中钴胺素之生物合成能力的改善。按照实施程序中所述的条件，在含PS4培养基的锥形瓶内培养菌株SC510 Rif

、SC510 Rif

pRK290和SC510 Rif pXL367。结果可观察到存在质粒pXL367的菌株之生物能力得到了改善。事实上，菌株SC510Rif

pRT290高30%。这种改善并不是因为脱氮假单胞菌之任何一个基因的扩增，而是由于8.7kbEcoRI片段上的基因得到特异性扩增所致。事实上，图11中所示的质粒pXL723没有给出任何改善，而且观察到用该质粒与菌株SC510Rif

和SC510Rif pRK290得有同样的生产滴度。

b）经除去钴胺素生物合成途径中的两个限速步骤来改善脱氮假单胞菌中辅酶B₁₂的生产。

本实施例说明如何通过扩增脱氮假单胞菌的cob基因来改善脱氮假单胞菌菌株的钴胺素产率。

将得自5.4kb片段（含有基因cobA和cobE）的2.4kb ClaI-EcoRV片段，与8.7kb EcoRI片段一起共克隆到有广泛宿主的质粒pXL203上。如此构建的质粒被定名为pXL525（图29）。通过接合将该质粒引入SC510Rif

中。菌株SC510Rif

pXL525的钴胺素产率比SC510Rif

pXL367高20%。扩增基因cobA和cobE得以除去SC510Rif

中之钴胺素生物合成途径的新的限速步骤。

本实施例中，通过相继除去两个限制性步骤而改善脱氮假单胞菌的SC510Rif

菌株。本实例表明，除去钴胺素生物合成途径中的两个限制性步骤可使产率得到进一步的改善。

8.2在根瘤病土壤杆菌中改善的钴胺素产率

本实施例说明通过扩增脱氮假单胞菌的cob基因来改善钴胺素生产菌的钴胺素产率。

所使用的菌株是革兰氏阴性菌的菌株;它涉及根瘤病土壤杆菌菌株。

通过接合转移，将实施例4.2和8.1中所述的质粒pXL367和pXL525，以及载体pRK290（Ditta et al.，1981）和质粒pXL369（图29）引入根瘤病土壤杆菌菌株C58-C9Rif （Cameron et al.，1989）中。按前述方法，在PS4培养基中30℃下培养菌株C58-C9Rif

、C58-C9Rif pRK290、C58-C9Rif

pXL367、C58-C9Rif

pXL368和C58-C9Rif pXL525。按前述方法定量检测钴胺素产率，结果如下表所示。

表：不同重组根瘤病土壤杆菌菌株之维生素B₁₂产物的滴度

如上表所示，在所利用的根瘤病土壤杆菌菌株中钴胺素的产率可得以改善。利用pXL367和pXL368这两个质粒改善了根瘤病土壤杆的钴胺素产率。这两个质粒分别含有8.7kbEcoRI片段（基因cobF至cobM）和2.4kbClaI-EcoRV片段（基因cobE至cobA）。它们分别使根瘤病土壤杆菌C58-C9Rif

的钴胺素产率提高1倍;这些结果表明，在扩增携带脱氮假单胞菌之cob基因的片段时，有可能改善根瘤病土壤杆菌菌株的钴胺素产率。这种情况可视为异源改善，即借助扩增其他菌株的cob基因来改善某一菌株的钴胺素生产能力。

由含有cob基因的脱氮假单胞菌的不同片段所带来的钴胺素产率的改善效果是可以累加的，即是说将分别克隆到pXL367和pXL368上的两个片段引入同一质粒上时，可观察到附加的改善效果，即质粒pXL525在根瘤病土壤杆菌C58-C9Rif

中带来的改善超过了各片段分别克隆到同样载体中所带来的改善作用。

8.3在苜蓿根瘤菌中改善钴胺素产率

本实施例说明对其他钴胺素生产菌之钴胺素生产能力的改善。

经接合转移将实施例8.2中所述的质粒pXL368及载体pRK290（Ditta et al.，1981）引入苜蓿根瘤菌菌株102F34Rif

（Leong et al.，1982）中。按已述方法在PS4培养基中30℃培养转移接合体：102F34Rif

、102F34Rif

pRK290和102F34Rif

pXL368。按前述方法定量检测钴胺素产物，结果如下表所示。

表：不同重组苜蓿根瘤菌菌株之钴胺素产物的滴度

从上表可以明显看出，所使用的苜蓿根瘤菌菌株的钴胺素产率得到了改善。质粒pXL368可改善所使用的苜蓿根瘤菌菌株的钴胺素产率。该质粒含有24kb之ClaI-EcoRV片段（基因cobA至cobE）;它使苜蓿根瘤菌菌株102F34Rif

的钴胺素产率提高到2倍。结果还表明，在扩增携带脱氮假单胞菌之cob基因的片段时，可改善苜蓿根瘤菌菌株的钴胺素产率。就这一情况来说，可以看作是异源改善，即可借助扩增其他菌株的cob基因来改善某菌株的钴胺素产率。

实施例9：类咕啉生产菌株之培养液和细胞内类咕啉和脱钴类咕啉的定量检测

本实施例说明如何能够鉴定与定量检测不同钴胺素生产菌株的不同类咕啉和脱钴类咕啉产物。该定量检测特别适于检测辅酶B₁₂。

按已述方法（Renz，1971）得到细胞的氰化物处理液（或只是细胞）。离心后，取一份上清液通过DEAE-Sephadex柱并用0.1M磷酸盐缓冲液洗脱。合并所收集的各部分并在Sep-PakC-18小柱（Waters）上脱盐。蒸发并在水中制成悬浮液（按已有类咕啉量，100μl/1ml）后，在Nucleosil  C-18柱（Macherey-Nagel）上以CLHP法鉴定并定量检测类咕啉。用含10mMKCN之0.1M磷酸钾缓冲液中的丙腈梯度（0%-100%）以1ml/分钟的流速洗脱。

借助BertholdLB505型检测仪检测371nm的紫外光和/或特异地检测⁵⁷Co（如果在有⁵⁷CoCl₂时培养），以显现类咕啉。还可通过与标准滞留时间相比较来鉴定之。同样地，可检测330nm紫外光来显现“无金属类咕啉”（氢化咕啉酸、氢化咕啉酸-酰胺和氢化咕啉酸二酰胺）。依靠这一技术，已分离出下列中间产物：钴啉酸、钴啉酸-酰胺、钴啉酸二酰胺、钴啉酸三酰胺、钴啉酸四酰胺、钴啉酸五酰胺、钴啉胺酸、钴啉醇酰胺、磷酸钴啉醇酰胺、GDP-钴啉醇酰胺、磷酸-B₁₂和维生素B₁₂。也分离了这些产物的腺苷化形式，并用这一技进行了测定。但实施中去掉了氰化的起始步骤，并使用未加KCN的缓冲液洗脱CLHP柱。图31中给出了由该系统分离并根据柱洗脱物的紫外吸收鉴定了有不同滞留时间的产物。

菌株SC510 Rif 的样品已于1990年6月30日保藏在Baarn的Centraal Bureau voor Schimmelcultures（Pays-Bas），其保藏登记号为CBS103.90。

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Claims (47)

1、DNA序列，其特征在于它编码介入钴胺素和/或钴胺酰胺生物合成的多肽。

2、根据权利要求1的DNA序列，其特征在于它选自图15、16、40和41中所示的基因cobA、cobB、cobC、cobD、cobE、cobF、cobG、cobH、cobI、cobJ、cobK、cobL、cobM、cobS、cobT、cobU、cobV、cobX，

由于遗传编码的简并性所产生的这些序列的同系物，

天然、合成或重组来源的序列，它们与这些DNA序列或其片段杂交和/或有显著的同源性，而且它们编码参予钴胺素和/或钴胺酰胺生物合成的多肽。

3、含有上述权利要求之一项的DNA序列的基因。

4、重组DNA，其特征在于它至少含有一个权利要求1至3之一项中所述的DNA序列。

5、根据权利要求4的重组DNA，其特征在于所说的DNA序列处于表达信号的控制之下。

6、根据权利要求5的重组DNA，其特征在于其表达信号可与该DNA序列同源或异源。

7、根据权利要求4至6中任一项的重组DNA，其特征在于它构成表达质粒的一部分。

8、质粒，其特征在于它至少含有一个编码参予钴胺素和/或钴胺酰生物合成之多肽的DNA序列。

9、根据权利要求8的质粒，其特征在于它含有

根据权利要求4至7中任一项的重组DNA，

复制系统

至少一个选择标志。

10、根据权利要求8的质粒，其特征在于它选自

含基因cobA、cobB、cobC和cobE的质粒pXL1500，

含基因cobC和cobD的质粒pXL723和pXL302，

含基因cobB和cobC的质粒pXL1397，

含基因cobA和cobE的质粒pXL368和pXL2557，

含基因cobE的质粒pXL545和pXL545Ω，

含基因cobF、cobG、cobH、cobI、cobJ、cobK、cobL、cobM的质粒pXL367和pXL253，

含基因cobH和cobI的质粒pXL1148，

含基因cobH的质粒pXL1149，

含基因cobF的质粒pXL1496和pXL1546，

含基因cobA、cobE、cobF、cobG、cobH、cobI、cobJ、cobk、cobL、cobM的质粒pXL525，

含基因cobX、cobS和cobT的质粒pXL843，

含基因cobV的质粒pXL699，以及

含基因cobU的质粒pXL1324。

11、细胞，其中引入了根据权利要求1至7中任一项的DNA序列或根据权利要求8至10中任一项的质粒。

12、多肽、其特征在于它参予钴胺素和/或钴胺酰胺的生物合成。

13、根据权利要求12的多肽，其特征在于它是由根据权利要求1至7中任一项的DNA序列编码的。

14、根据权利要求12的多肽，其特征在于它参予前咕啉-3向钴啉酸a，c-二酰胺的转化。

15、根据权利要求14的多肽，其特征在于它含有如图16和40中所示的COBF、COBG、COBH、COBJ、COBK、COBL、COBM、COBS和COBT的全部或部分肽序列。

16、根据权利要求14的多肽，其特征在于它催化前咕啉-3和钴啉酸之间的C₁、C₅、C₁₂、C₁₅或C₁₇位上的甲基转移。

17、根据权利要求16的多肽，其特征在于它催化图16所示的COBF、COBJ，COBL和COBM的全部或部分肽序列。

18、根据权利要求12的多肽，其特征在于它参予钴啉胺酸向钴啉醇酰胺的转化。

19、根据权利要求18的多肽，其特征在于它含有图15所示的COBC和COBD的全部或部分肽序列。

20、根据权利要求12的多肽，其特征在于它具有S-腺苷-L-甲硫氨酸：前咕啉-2甲基转移酶活性。

21、根据权利要求20的多肽，其特征在于它含有图16所示的COBI的全部或部分肽序列。

22、根据权利要求12的多肽，其特征在于它具有钴啉酸和/或氢化咕啉酸a，c-二酰胺合酶活性。

23、根据权利要求22的多肽，其特征在于它具有图15所示的COBB的全部或部分肽序列。

24、根据权利要求12的多肽、其特征在于它具有体内连接氢化咕啉酸的能力。

25、根据权利要求24的多肽，其特征在于它含有图16所示COBH的全部或部分肽序列。

26、根据权利要求12的多肽，其特征在于它含有图15所示COBE的全部或部分肽序列。

27、根据权利要求12的多肽，其特征在于它具有烟酸核苷酸：二甲基苯并咪唑磷酸核糖基转移酶活性。

28、根据权利要求27的多肽，其特征在于它含有图41所示COBU的全部或部分肽序列。

29、根据权利要求12的多肽，其特征在于它具有5′-磷酸钴胺素合酶活性。

30、根据权利要求29的多肽，其特征在于它含有图41所示的COBV的全部或部分肽序列。

31、根据权利要求12的多肽，其特征在于它含有图40所示之COBX的全部或部分肽序列。

32、根据权利要求13的多肽，其特征在于它选自图15、16、40和41中所示的蛋白质COBA、COBB、COBC、COBD、COBE、COBF、COBG、COBH、COBI、COBJ、COBK、COBL、COBM、COBS、COBT、COBU、COBV和COBX。

33、生产权利要求12至32的多肽的方法，其特征在于

将根据权利要求1至7的DNA序列或根据权利要求8至10的含上述序列的质粒引入宿主细胞，

在适于表达上述序列的条件下培养这样的重组细胞，以及

回收所产生的多肽。

34、根据权利要求33的方法，其特征在于宿主细胞可选自于原核生物、真核生物、动物或植物细胞。

35、根据权利要求34的方法，其特征在于宿主细胞是原始细菌或真细菌。

36、根据权利要求35的方法，其特征在于宿主细胞是大肠杆菌、脱氮假单胞菌、苜蓿根瘤菌或根瘤病土壤杆菌。

37、允许增加钴胺素和/或钴胺酰胺之产率的方法，其特征在于

将一个或多个编码参予钴胺素和/或钴胺酰胺生物合成之多肽的DNA序列引入有产生这些化合物之能力的这些化合物的生产微生物内，在适于合成钴胺素和/或钴胺酰胺与表达上述序列的条件下培养如此得到的微生物，

回收所产生的钴胺素和/或钴胺酰胺。

38、根据权利要求37的方法，其特征在于向微生物内引入一个或多个根据权利要求4至7之任一项的DNA序列或根据权利要求8至10的含有该序列的质粒。

39、根据权利要求38的方法，其特征在于向微生物内引入一个编码能催化钴胺素和/或钴胺酰胺生物合成途径中限速步骤之多肽的DNA序列。

40、根据权利要求38的方法，其特征在于向微生物内引入多个编码能催化钴胺素和/或钴胺酰胺生物合成途径中限速步骤之多肽的DNA序列。

41、根据权利要求37至40之一项的方法，其特征在于微生物选自于脱氮假单胞菌、苜蓿根瘤菌和根瘤病土壤杆菌。

42、根据权利要求41的方法，其特征在于微生物是脱氮假单胞菌。

43、根据权利要求42的方法，其特征在于微生物是脱氮假单胞菌SC510Rfi 。

44、根据权利要求37至43的方法，其特征在于向微生物内引入根据权利要求10的质粒。

45、根据权利要求37至44之一项的方法，其特征在于向脱氮假单胞菌菌株SC510 Rif

内引入质粒pXL525。

46、根据权利要求46至45的方法，其特征在于用下述方法回收所产生的钴胺素和/或钴胺酰胺;

增溶溶解，

转化成氰基化物形式，以及

纯化。

47、根据权利要求37至46的方法，其特征在于钴胺素是辅酶B₁₂。

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