CN106046151A - 一种重组人源可溶高活性ⅰ型胶原蛋白及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组人源可溶高活性I型胶原蛋白及其制备方法，属于基因工程技术领域。该重组人源可溶高活性I型胶原蛋白基因有1008个碱基，编码一种含有335个氨基酸的蛋白质，分子量为31kDa，无信号肽序列，无内含子。其具体制备步骤为：大肠杆菌基因工程菌的构建；构建菌株的发酵培养；目的蛋白的诱导表达；目的蛋白的分离纯化。本发明采用的大肠杆菌表达系统，易于规模放大，生产成本低，产量高。纯化的I型胶原蛋白，用途广泛。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种重组人源可溶高活性Ⅰ型胶原蛋白及其制备方法。
背景技术
胶原蛋白(collagen)是细胞外基质的主要成分，约占胶原纤维固体物的85％，占动物体内蛋白质总量的25％～30％，它广泛存在于动物的结缔组织(骨、软骨、皮肤、腱、韧等)中，对机体和脏器起着支持、保护、结合，以及形成界隔等作用。目前，已发现的胶原蛋白有20多种，它们在动物体内有着不同生理功能，其中Ⅰ型胶原蛋白(以下所述胶原蛋白均指Ⅰ型胶原蛋白)分子长度约为300nm，直径约为115nm，呈棒状，由3条多肽链构成3股螺旋结构，即:2条αⅠ链，1条αⅡ链，αⅠ链和αⅡ链只是在氨基酸顺序上有微小差异.胶原蛋白特有的左旋α链相互缠绕构成胶原蛋白的右手复合螺旋结构，在螺旋区段，氨基酸呈现(Gly-X-Y)n周期性排列.胶原蛋白中，甘氨酸(Gly)含量较大约占30％，脯氨酸(Pro)和羟脯氨酸(Hyp)共占约25％，而一般动物蛋白质中羟脯氨酸含量极微少。可以说，羟脯氨酸是胶原蛋白特有的氨基酸，其含量多少与胶原蛋白的稳定性、变性温度成正性相关。同时，胶原蛋白具有很强的生物活性及生物功能，能参与细胞的迁移、分化和增殖，使动物的骨、腱、软骨和皮肤保持一定的机械强度.
胶原蛋白具有良好的生物学特性，可为表皮细胞的迁移、增殖铺垫支架，并提供良好的营养，同时促进皮肤及神经增长，有利于上皮细胞的增生修复，从而促进创面的愈合，可用于小型皮肤缺损修复及组织缺损修复。同时也可用于消除皮肤疤痕，使疤痕软化，并能逐渐被组织吸收而消退，减轻或消除皮肤皱纹。皮肤对胶原蛋白又有很好的吸收作用，当通过外源补充胶原蛋白几周后，体内成纤维细胞、脂肪细胞及毛细血管将向补充的胶原蛋白内移动，组合成自身的胶原蛋白，从而形成正常的结缔组织，使受损老化的皮肤得到填充和修复，达到延缓皮肤衰老的目的。胶原蛋白能直接渗入肌肤底层，且与周围组织的亲和性好。可协助细胞制造胶原蛋白的成胶原细胞，促使皮肤细胞正常成长。同时，胶原蛋白本身还具有消炎和更新肌肤的作用。本发明利用人源Ⅰ型胶原蛋白基因在大肠杆菌中复制表达，从而制备具有完全可溶高生物学活性功能的Ⅰ型胶原蛋白，该胶原蛋白可用于修复女性阴道由于干燥引起的瘙痒、灼热、皲裂等问题，还具有增加阴道弹性、减轻性交疼痛、提高性生活满意度；增加阴道分泌物，减少阴道炎症反应，提高阴道微环境湿润度，改善阴道干涩状态，维护阴道微环境pH，无过敏刺激反应及免疫排异反应。人源可溶高活性Ⅰ型胶原蛋白可用于化妆品与医疗耗材敷料的活性成分或添加剂，全球市场需求量大，产品资源十分稀缺，为了解决全球市场对人源可溶高活性Ⅰ型胶原蛋白的需求供给，我公司联合美国哈佛大学魏博士团队、山东农业大学于博士团队、中华生物医药研究院、香港医药有限公司、广东医保药业有限公司共同研究，创新了一种重组人源可溶高活性Ⅰ型胶原蛋白及其制备方法。
发明内容
本发明一方面涉及一种重组人源可溶高活性Ⅰ型胶原蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO:1所示。
本发明另一方面涉及编码该重组人源可溶高活性Ⅰ型胶原蛋白的基因Col1，所述基因Col1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
此外，本发明涉及制备该重组人源可溶高活性Ⅰ型胶原蛋白的方法，具体步骤为：
(1)基因克隆
A：采用酚氯仿抽提法提取人类全血的基因组DNA，备用；
B：根据已公布的人类全基因组序列，经生物信息学分析获得目的基因Col1的序列，设计特异引物对，经PCR克隆获得全长Col1基因；
(2)蛋白质表达及酶活测定
A：构建Col1基因原核表达载体，将目的Col1基因克隆至pET28a(+)载体中获得重组质粒；
B：用上述重组质粒转化大肠杆菌Escherichia coli(BL21(DE3))感受态细胞，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG)诱导表达；
C：表达产物酶活检测、SDS-GAGE分析及纯化。
进一步地，本发明制备重组人源可溶高活性Ⅰ型胶原蛋白步骤中使用的特异性引物对序列如SEQ ID No:3：CGCGGATCCATGGTCTGCCACAACGGCATG和SEQ ID No:4：CCGGAATTCTTAACCAGCCTGTCCATCGGC所示。
本发明所用的载体和宿主菌均常见，pET28a(+)为Col1基因表达载体，E.coliBL21(DE3)为该基因的表达宿主菌。其中由于BL21(DE3)是本领域的惯常写法，因此在说明书以及权利要求中未对(DE3)中的括号进行删除，以免造成指代不明确。
通过上述方法克隆的基因及其制备的蛋白质，为研究该类基因的功能及其编码的蛋白质酶活，乃至胶原蛋白的应用提供了一个重要基因及其操作技术。
采用本发明所述制备方法获得的人源Ⅰ型胶原蛋白的编码基因Coll具有1008个碱基对，与NCBI公布的人类基因组的胶原蛋白氨基酸序列比对，具有88％的同源性，将该基因原核表达获得的重组蛋白具有335个氨基酸残基，分子量为31kDa，无信号肽序列，无内含子，通过特异性酶活测定实验，证明了该基因编码的蛋白质具有胶原蛋白的生物活性，酶活力达到63IU/mg；并且该重组人源Ⅰ型胶原蛋具有较高的可溶性，这是之前的重组表达技术所不能达到的。
附图说明
图1：Col1基因重组表达载体示意图，其中Kan表示卡那抗性，MCS表示多克隆位点，BamHⅠ和EcoRⅠ为双酶切位点，Col1为目的基因；
图2：Col1基因PCR扩增示意图，其中1为核酸Marker；2为扩增获得的Col1基因；
图3：Col1原核表达诱导蛋白示意图，其中1为pET28a(+)-Col1重组菌IPTG诱导前；2-7为pET28a(+)-Col1重组菌IPTG诱导后，诱导获得34KDa大小的目的蛋白；8为标准蛋白Marker；
图4：Col1原核表达产物纯化示意图，其中1为Col1诱导前阴性对照；2为Col1诱导后蛋白液超声后上清；3为Col1诱导后蛋白液超声后沉淀；4为Ni-NTA亲和纯化后穿过液；5为纯化后的洗脱蛋白；6为标准蛋白Marker。
具体实施方式
本发明所提供的实施例，均按照常规条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(NewYork:Gold Spring Harbor Laboratory Press,1989)，或Draper,J等(Blackwell,科学出版社，1988)所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件。
实施例1:Col1基因克隆及测序
根据NCBI上公布的人类全基因组序列，经生物信息学分析获得目的Col1基因的DNA序列，设计特异引物，其序列如SEQ ID No:3及SEQ ID No:4所示，以人类全血基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增步骤如下：
PCR反应程序为：95℃10min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。
反应体系为：ddH2O(32.5μL)，10×buffer(5μL)，MgCl2(4μL)，dNTP(4μL)，Col1-F(1μL)，Col1-R(1μL)，DNA(2μL)，TaqE(0.5μL)。
PCR反应结束后，取10μL反应产物进行凝胶电泳，确定含有目的基因的电泳条带，送测序生物公司进行测序。将测序结果与NCBI公开的I型胶原蛋白序列比对，具有88％同源性，将该序列作为模板进行下一步的胶原蛋白原核表达。
实施例2：Coll基因原核表达载体构建
提取表达载体pET28a(+)质粒备用；将测序确定的目的基因纯化备用。
将目的基因和载体质粒进行双酶切，酶切体系为：目的片段/pET-28a(+)质粒10-20μg；
混合后于37℃水浴酶切4小时以上，然后通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化回收，待用。
将双酶切处理后的Coll基因和表达载体进行连接转化，其具体反应体系为：
将上述反应体系置于16℃水浴反应4小时后进行连接。
具体连接步骤为：
取水浴反应连接产物10μL加入到100μLDH5α感受态细胞中，放入42℃水浴中热激90sec，快速放入冰水中2min；加入800μL不含抗性LB培养基，37℃水浴1h以上；12000转/分离心2min，吸弃大部分上清培养基，剩余约100μL吹打悬浮沉淀；涂布含有卡那抗生素的LB琼脂平板，倒置平板37℃培养过夜。
重组质粒鉴定
从每一个培养平板上分别挑出五个菌落，接入5ml的LB培养基中，培养过夜，提取质粒备用。
PCR鉴定：取1μL质粒按前述基因扩增体系和步骤进行PCR，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测。
双酶切鉴定：按前述载体双酶切体系和步骤，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测。
测序鉴定：将PCR扩增产物和阳性菌落扩大培养后提取的质粒送测序公司测序检测。
目的蛋白试表达：
将阳性重组质粒转化表达宿主BL21(DE3)，涂于卡那抗性平板。
(1)从LB平板上分别挑取5个单克隆菌落，接入5ml LB(50mg/L Kan)的15ml离心管中，于37℃震荡培养OD值至0.6-0.8之间。
(2)每一个试管各取500μL菌液和15％的甘油1:1(V/V)混合后装至灭菌冻存管中，－80℃保存。
(3)每一个试管中取500μL菌液，做为诱导前对照。
(4)每一个试管中加入5μL IPTG(终浓度为1mM/L)，37℃200rpm诱导表达4个小时。
(5)诱导结束后分别取500μL的菌液，与诱导前菌液共离心，12000rpm，2分钟。
(6)弃掉上清，分别加入10μL 5×样品缓冲液，于100℃加热5分钟变性，上样前离心，12000rpm，5分钟。
(7)15％SDS-PAGE电泳分析表达结果。
蛋白表达条件优化：
在确定蛋白正常重组表达后，其可溶性越高，越利于纯化和后续研究。为了优化高效表达条件，在温度、诱导剂剂量、时间等进行优化筛选，确定最佳表达条件。具体操作为：
a.分别取5个含100ml LB(100mg/ml AMP)的250ml锥形瓶，编号1-5，然后分别加入重组的Col1-28a菌液1ml，37℃，200rpm振荡培养；
b.至菌液OD600约为0.6-0.8，对1-5号锥形瓶分别进行条件筛选
I.IPTG浓度和诱导时间不变，筛选适宜的诱导表达温度(依次为37℃、30℃、25℃、20℃、16℃)；
II.诱导温度和时间不变，筛选适宜的诱导剂浓度(IPTG浓度依次为0.2mM/L、0.4mM/L、0.6mM/L、0.8mM/L、1.0mM/L)；
III.诱导温度和IPTG浓度不变，筛选适宜的诱导时间(依次为1h，2h，4h，8h，16h)；
c.诱导后离心，4℃，5000rpm，6min，弃上清。
d.每100ml培养细胞沉淀，悬于10ml预冷的重悬液中，4℃下超声波进行细胞破碎(600W，每20sec间隔10sec共10次)，破碎后离心，4℃、15000rpm，30min。
e.1-5号样品分别取上清、沉淀，加入10μL的5×样品缓冲液，于100℃加热5分钟变性，上样前离心，12000rpm，5分钟。
f.15％SDS-PAGE电泳分析，确定可溶性蛋白表达的最佳条件。
通过对不同诱导温度、时间及诱导剂浓度等条件优化，结果于16℃，IPTG终浓度1mM/L，16h下，于pH8.5Buffer中，破菌后的上清液中Col1可溶性蛋白表达量较高，后续大量蛋白诱导可依照此条件进行。
表达蛋白的大量表达：
挑取阳性克隆，接种至含50mg/L卡那霉素的10ml LB培养基中，37℃震荡培养过夜至OD600＝0.6-0.8，然后按1：100接种至含50mg/L卡那霉素的1L LB培养基中，37℃震荡培养至OD600＝0.6-0.8。按照前述优化的表达条件进行，即冷却至16℃后，添加IPTG至1mM/L，培养16h，然后5000rpm，离心6分钟收集菌体，待用。
实施例3：目标蛋白纯化和质谱序列测定
取Col1菌液50ml，加入5ml甘油，20μLβ-巯基乙醇，250μL吐温-20，超声波破碎仪冰水浴下于300W条件下超声30分钟(超声3s间歇3s)后，菌液15000rpm离心20分钟，吸取上清待用，上清液及沉淀分别SDS-PAGE分析，确定目的蛋白以可溶的方式存在于上清液中。
取3mlNi-NTA凝胶树脂加至纯化柱中，用重悬液(20mM Tris，150mM NaCl，pH8.5)冲洗2-5个柱体积，将超声破碎菌离心后的上清液过纯化柱3次以上，再进行洗杂。先用基本洗杂液WBⅠ(20mM Tris，150mM NaCl，20mM Imidazole，pH8.5)洗杂200ml左右，然后依次用WBⅡ(20mM Tris，150mM NaCl，20mM Imidazole，1％Tween-20，pH8.5)、WBⅢ(20mM Tris，150mM NaCl，20mM Imidazole，1M Urea，pH8.5)、WBⅣ(20mM Tris，150mM NaCl，40mMImidazole，pH8.5)分别洗杂100ml左右，最后用洗脱液(20mM Tris，150mM NaCl，200mMImidazole，pH8.5)洗脱10ml左右，SDS-PAGE分析，结果蛋白纯度达95％以上。浓度用Bradford方法测定，浓度为6.85mg/ml。
将纯化获得的目标蛋白进行质谱测定，获得该重组表达蛋白具有335个氨基酸残基，具体序列如SEQ ID NO:1所示，分子量为31kDa，无信号肽序列，无内含子。
实施例4：胶原蛋白活性检测
胶原蛋白活性检测具体方法如下：
利用紫外吸收法检测蛋白样品浓度，包括对照人Ⅰ型胶原蛋白(sigma，C7774)，目的蛋白。具体为分别测定样品在215nm和225nm下的紫外吸收，利用检验公式C(μg/mL)＝144X(A215-A225)计算蛋白浓度。检测完蛋白浓度用PBS将所有待测蛋白浓度调整到0.5mg/ml。
向96孔板中分别加入100μl对照品、目的蛋白和空白PBS溶液对照，室温静置60min。
每孔加入105个培养状态良好的3T3细胞，37℃孵育60min后，每孔用PBS清洗4次。
用LDH检测试剂盒(Roche)检测OD492nm的吸光度。根据空白对照数值，计算细胞贴壁程度。细胞的贴壁率即为胶原蛋白活性。以人胶原蛋白贴壁率定义活性为50IU/mg，检测目的蛋白活性63IU/mg，所以本发明获得的重组人Ⅰ型胶原蛋白的生物学活性高于对照人Ⅰ型胶原蛋白活性。
由本发明方法所获得的重组人源性Ⅰ型胶原蛋白具有广泛的医药用途，可用于修复女性阴道由于干燥引起的瘙痒、灼热、皲裂等问题，还具有增加阴道弹性、减轻性交疼痛、提高性生活满意度；增加阴道分泌物，减少阴道炎性反应，提高阴道微环境湿润度，改善阴道干涩状态，维护阴道微环境pH，无过敏刺激反应及免疫排异反应。也可用作化妆品、医疗耗材敷料的活性成分或添加剂。
所有上述的首要实施这一知识产权，并没有设定限制其他形式的实施这种新产品和/或新方法。本领域技术人员将利用这一重要信息，上述内容修改，以实现类似的执行情况。但是，所有修改或改造基于本发明新产品属于保留的权利。
Claims (4)
1.一种重组人源可溶高活性Ⅰ型胶原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.编码如权利要求1所述的重组人源可溶高活性Ⅰ型胶原蛋白的基因，其特征在于所述基因序列如SEQ ID NO:2所示。
3.制备如权利要求1所述的重组人源可溶高活性Ⅰ型胶原蛋白的方法，其具体步骤为：
(1)基因克隆
A：采用酚氯仿抽提法提取人类全血的基因组DNA，备用；
B：根据已公布的人类全基因组序列，经生物信息学分析获得目的基因Col1的序列，设计特异性引物对，经PCR克隆获得全长Col1基因；
(2)蛋白质表达及酶活测定
A：构建Col1基因原核表达载体，将目的Col1基因克隆至pET28a(+)载体中获得重组质粒；
B：用上述重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷IPTG诱导表达；
C：表达产物酶活检测、SDS-GAGE分析及纯化。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于具体步骤中使用的所述特异性引物对序列如SEQID No:3和SEQ ID No:4所示。
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1229351 Country of ref document: HK |
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| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20161026 |
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