CN104130994B - 来自冬虫夏草的丝氨酸蛋白酶、编码基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种来自冬虫夏草中国被毛孢参与水解大分子蛋白质生成小分子蛋白质的丝氨酸蛋白酶、编码基因及其应用。所述丝氨酸蛋白酶氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码基因如SEQ ID No.1所示。本发明从原理上对丝氨酸蛋白酶在中国被毛孢侵染蝙蝠蛾幼虫的过程进行了详细研究，提供了“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与侵染机制机理的丝氨酸蛋白酶及其编码基因，本发明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用来通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过调节蛋白水解酶基因的表达，赋予宿主丝氨酸蛋白酶的高表达性，为扩大丝氨酸蛋白酶的生物应用提供了有效途径，具有重大应用前景。

Description

来自冬虫夏草的丝氨酸蛋白酶、编码基因及其应用

(一)技术领域

本发明涉及来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢的丝氨酸蛋白酶、编码基因及其应用。

(二)背景技术

冬虫夏草(Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.)是冬虫夏草菌寄生在鳞翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆虫(Hepialus armoricanus Oberthur)幼虫上的子座及幼虫尸体上的复合体(包括子座和虫体)。冬虫夏草是一类珍惜的传统真菌药材资源，具有代谢产物和生物活性多样的特点，在生物医药领域展现出巨大的应用和发展前景。冬虫夏草以其多种药用功效广泛、明显而备受关注，在世界范围内备受推崇。中医认为，冬虫夏草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。现代药理学已证实，冬虫夏草具有免疫调节、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素样作用等广泛的生物活性。

冬虫夏草菌是一种子囊菌，在其生活史中具有分生孢子阶段(无性型)和子囊孢子阶段(有性型)。而在人工培养、液体发酵等实际生产中使用的是无性阶段的冬虫夏草菌，因而冬虫夏草无性型的鉴定非常重要。国内外学者在冬虫夏草资源调查、无性型确证、活性成分分离分析和作用机理、开发应用方面做了大量工作。冬虫夏草中国被毛孢已被证明是冬虫夏草的无性型存在形式，具有与天然冬虫夏草相同的活性成分和药效。

但是，对冬虫夏草中国被毛孢机制机理的研究几乎为空白，尤其在中国被毛孢侵染蝙蝠蛾幼虫的机制机理上，以及对丝氨酸蛋白酶在中国被毛孢侵染机制中的作用的研究。

丝氨酸蛋白酶广泛存在于动物、植物、细菌、病毒、真菌中，并且参与生命的各种反应，比如蛋白质翻译后后加工、细胞分裂、病原体感染、组织降解、细胞凋亡等，可见丝氨酸蛋白酶具有广泛的研究和应用价值。

丝氨酸蛋白酶是一类以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶，在生物有机体中起着重要而广泛的生理作用，还在胚胎发育、组织重建、细胞分化、血管形成和病原侵入等过程中都发挥着重要的作用。丝氨酸蛋白酶超家族的成员多而广，它们的活性部位都含Ser、His、Asp，并具有相同的催化机制，但是它们与底物结合部位的差异决定了各自对底物的专一性。

丝氨酸蛋白酶在结构上为全β蛋白，核心结构由两个非常相似的结构域(N结构域和C结构域)构成。由于两个结构域在结构上存在着差异，它们在功能和进化上的作用也就不同。

1986年，Gershenfeld HK等人在《Science》上发表论文，他们通过RNA杂交竞争协议从小鼠的细胞毒性T淋巴细胞互补DNA文库中分离出的克隆可以编码一个新的丝氨酸蛋白酶，并且对它进行了克隆，该基因的碱基序列编码约为25700道尔顿的氨基酸序列，25％至35％属于丝氨酸蛋白酶家族，保守的活性位点残基为His57，Asp102和Ser195的胰凝乳蛋白酶。Southern杂交分析表明，这个基因在人类，小鼠和鸡种保守。此丝氨酸蛋白酶可能在淋巴细胞的裂解和溶解级联有作用。

1999年，Kyoko Yamashiroa等人从人结肠腺癌细胞中克隆到了一个新的丝氨酸蛋白酶，该序列包括155bp的5’非编码区和一个位于551bp的3’非编码区后的732bp长的开放阅读框非编码区，预测的蛋白由244个氨基酸组成，和丝氨酸蛋白酶家族的其他成员显示一定的相似性，和发现的其他类似胰蛋白酶一样，这种酶含有作为必要的氨基酸残基的活性的催化三联体。

2003年，李文辉等人利用逆转录酶与聚合酶链反应相结合的RT-PCR法，扩增出5个竹叶青(Trimeresurus stejnegeri)蛇毒丝氨酸蛋白酶的cDNAs，将扩增的cDNA片段克隆入pGEM-T载体中，再经末端终止法测定核苷酸序列，推导出5个丝氨酸蛋白酶的全序列。5个丝氨酸蛋白酶分别含有1-6个N-型糖基结合位点，表明它们的计算分子量与纯化蛋白表观分子量之间的差异是由糖含量的不同造成，而其氨基酸序列相似度在60％-90％。

2004年，储卫华等人根据已发表的气单胞菌胞外蛋白酶基因核苷酸序列，设计和合成了一对引物，以嗜水气单胞菌AhJ-1的基因组DNA为模板，通过PCR技术，扩增到约900bp的丝氨酸蛋白酶基因片段，并克隆到质粒载体pGEM-T中进行测序和分析，结果表明扩增的丝氨酸蛋白酶基因片段与已发表的嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶Ahe2的同源性有87％，扩增片段编码343个氨基酸，推测的分子量为35700，计算机软件分析表明编码的氨基酸有较高的抗原性，可作为核酸疫苗的侯选基因片段。

2005年，李江等人从一株具有极强的降解羽毛能力的弗氏链霉菌菌株(Streptomyces fradiae var.k11)中纯化得到了一种丝氨酸蛋白酶SFP2。经蛋白测序，得到部分氨基酸序列，设计简并引物，PCR扩增得到部分基因序列，通过构建基因文库，获得了包括信号肽序列在内的完整的基因sfp2(EMBL收录号AJ784940)，开放阅读框全长924bp，包括114bp的信号肽编码序列和810bp的酶原编码序列，其中成熟蛋白编码基因长576bp，编码191个氨基酸，理论分子量为19.112kD。酶原编码基因和成熟蛋白编码基因均在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中得到了表达，酶原编码基因表达产物具有正常的生物学活性，证明了克隆基因的生物学功能。

2008年，雷迎峰等人在大肠杆菌中进行了HCVNS3/4A丝氨酸蛋白酶的表达并进行纯化。根据NS3与NS4A两者形成异源二聚体的结构要求，通过基因拼接的方法设计了单链NS3/4A丝氨酸蛋白酶的基因。合成相应引物，利用反转录PCR从HCV患者血液中扩增出该蛋白酶的编码基因，克隆入原核表达载体pRSET-A，将重组表达质粒pRSET-A-ns3/4a转化BL21(DE3)大肠杆菌，并诱导表达与纯化。成功地构建了重组表达质粒pRSET-A-ns3/4a，重组质粒转化的BL21工程菌经IPTG诱导表达后，表达产物经SDS-PAGE和Western-blot证实为NS3/4A丝氨酸蛋白酶，并用镍离子亲和层析方法获得纯化蛋白酶。获得的纯化NS3/4A丝氨酸蛋白酶为建立其酶活性测定系统奠定了基础。

2011年，王俊伟等人根据已经报道的少孢节丛孢菌丝氨酸蛋白酶基因序列，设计特异性引物，通过PCR技术对少孢节丛孢菌新疆分离株(XJ-XA)丝氨酸蛋白酶(命名为Aoz1)基因序列进行了扩增，并与国内外少孢节丛孢菌不同地域分离株相应序列进行了同源性分析，构建该基因系统进化树。结果显示，XJ-XA Aoz1基因全长为1344bp，包含2个外显子和1个63bp的内含子(第517～579位核苷酸)，编码426个氨基酸。系统发生分析发现，少孢节丛孢菌不同地域分离株Aoz1基因序列具有较高的亲缘性，与其他捕食线虫性真菌Aoz1基因亲缘性较远。此项研究为研发家畜线虫病生物防控制剂奠定了前期基础。

2012年，刘海明等人利用粉纹夜蛾Trichoplusia ni围食膜蛋白多克隆抗体筛选华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita中肠cDNA表达文库，首次得到编码华北大黑鳃金龟丝氨酸蛋白酶cDNA序列，命名为HoSP1(GenBank登录号为FJ573146)。序列分析表明，该基因长902bp，开放阅读框(ORF)长783bp，编码260个氨基酸，推测分子量和pI值分别为26.7kDa和4.19，不含有N-糖基化位点，但在Thr157处有一个O-糖基化位点,含有6个保守的半胱氨酸残基，组成3对二硫键，对于维持蛋白质的三级结构起着重要的作用。通过与几种丝氨酸蛋白酶的比对发现，该酶具有组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、丝氨酸(Ser)催化中心，与褐新西兰肋翅鳃金龟Costelytra zealandica的14种丝氨酸蛋白酶有明显的相似性，其中与CzSP3的序列一致性最高，为52.47％。把该基因与pET21b载体重组后，进行体外表达，以BTEE为底物，测得该酶的活力为0.0378μmol/mg·min。

2010年，Xiaoqing Zhang等人从食用菌真姬菇的新鲜子实体中分离到了一个28kDa的丝氨酸蛋白酶。根据N-末端测序序列，结合使用RACE和TAIL-PCR方法，成功克隆到了这个丝氨酸蛋白酶了基因。这个蛋白酶的序列含有19个氨基酸的信号肽序列，一个82个氨基酸的前区序列，诱导后的蛋白酶具有285个氨基酸和28.07kDa的分子量，并且拥有枯草杆菌蛋白酶家族(S8A)的三个活性位点特征。

2013年，Ying Huang等人从中华绒螯蟹中克隆到了一个域为特征的发夹状丝氨酸蛋白酶，并且对它进行了特性研究。

但是，目前NCBI数据库中目前还检索不到中国被毛孢中丝氨酸蛋白酶的基因相关信息。

(三)发明内容

本发明目的是针对以上存在的不足和需要解决的技术问题，对“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢侵染机制中的酶及其编码基因进行深入研究，提供了“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢侵染机制的一种丝氨酸蛋白酶、编码基因及其应用。

本发明采用的技术方案是：

来自冬虫夏草中国被毛孢参与水解大分子蛋白质生成小分子蛋白质的丝氨酸蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示(记为serA蛋白)。该酶可催化断裂大分子蛋白质中的肽键，使之成为小分子蛋白质。

SEQ ID No.1序列如下：PDLSPATVKI TNDDSPNKME NSWLLVWKNALADDAIKARRDDFAATLRKR NLGKRDVNGN TIPMEAIHYD IGSLRMTVCNADAKTMNLMV SNAIDAVDYV EANEWIDMFRTENETEAPPA VNATAVADGAEASPGEDGEG TVVYIVDTGI NVNHVAFEDR ATMIANLVRGESEQDLNGHGTHCAGSAAGK EIGVATKALI RGVKVLNAKG SGGGDSIIGG FRAACNDVKKNGFEGKCVVSMSLGTGRSNA INNAAKQMGQ CGCAIVVAAG NDGKDASTVSPASSDDVITV GATDARTNQL AAFSNTGPLVDISTNGVNVI SADANDITGTKELTGTSMSA PQIAGIALVA LNDVDLDCTI DCTDRMRDFLQKKAQQEKPIAISSGDSDTT PLQIDATDKA PTDPDGPTPI SKKGQQGKQG KKQTGQKGR*

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上，均属于本发明保护范围之列。具体的所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

本发明还涉及所述的丝氨酸蛋白酶在生物催化水解大分子蛋白质制备小分子蛋白质中的应用，优选所述丝氨酸蛋白酶能够断裂大分子蛋白质中的肽键，使之成为小分子蛋白质。由于昆虫幼虫的表皮主要由蛋白质和几丁质组成，虫生真菌在侵染昆虫幼虫的时候会分泌丝氨酸蛋白酶来降解虫体表皮的蛋白质，从而增加虫生真菌侵染力，可应用于生物防治害虫。所述的应用为：将含丝氨酸蛋白酶基因的重组工程菌经诱导培养获得的湿菌体用磷酸盐缓冲液(50mM、pH8.0)悬浮，超声细胞破碎后，取破碎混合液离心，取上清液作为催化剂，以10.00mg/mL酪素溶液为底物，40℃下水浴反应，反应结束后，将反应液离心，取上清液即获得含酪氨酸的混合液，将混合液分离纯化，获得酪氨酸，所述分离纯化的方法为本领域公知，通常采用亲和层析的方法；所述10.00mg/mL酪素溶液按如下步骤制备：取1.000g酪素用0.5mol/L的氢氧化钠水溶液润湿，加入pH值为8.0的PBS缓冲液，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100ml容量瓶中，用缓冲液稀释至刻度；所述氢氧化钠水溶液的体积用量以酪素质量计为5ml/g。

所述底物的用量以酪素质量计，所述酪素的初始浓度为5mg/mL(终浓度)，所述催化剂的体积用量以破碎前湿菌体的质量计为20g/L(终浓度)。

所述催化剂按如下方法制备：将含丝氨酸蛋白酶基因的重组工程菌接种于含终浓度50μg/ml的Kan抗性的LB液体培养基中，37℃、250r/min培养过夜，取1mL培养物，将其转接(体积接种量2％)于50mL含有50μg/ml Kan抗性的LB液体培养基中，37℃、250r/min培养至菌体浓度OD600为0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0.05mmol/L的IPTG诱导培养8h，收集湿菌体，将湿菌体在功率40％、破1s停1s条件下超声破碎(优选3次，每次5min)，取破碎混合液离心，取上清液即为催化剂。

本发明还涉及编码所述丝氨酸蛋白酶的基因。具体的，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示(记为serA基因，serA基因编码serA蛋白)。

由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的变位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。

所述的丝氨酸蛋白酶编码基因在构建能够生物催化水解大分子蛋白质制备小分子蛋白质的基因工程菌中的应用。所述的基因可用于构建能够生物催化断裂大分子蛋白质中的肽键，使之成为小分子蛋白质的基因工程菌，以扩大丝氨酸蛋白酶的应用。所述催化水解优选在40℃下进行。具体为：构建含有所述丝氨酸蛋白酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌(优选E.coli BL21(DE3))中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化获得含有丝氨酸蛋白酶基因的菌体细胞。

本发明的要点在于提供了SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，在已知该氨基酸序列和核苷酸序列的情况下，该氨基酸序列和核苷酸序列的获得，以及相关载体、宿主细胞的获得，对于本领域技术人员来说均是显而易见的。

能够提供本发明所述冬虫夏草丝氨酸蛋白酶及其编码基因的菌株为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)L0106，该菌种保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo：M2011278，已在先前申请的专利CN102373190A中披露。

本发明的有益效果主要体现在：本发明从原理上对丝氨酸蛋白酶在中国被毛孢侵染蝙蝠蛾幼虫的过程进行了详细研究，提供了“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与侵染机制机理的丝氨酸蛋白酶及其编码基因，本发明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用来通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过调节蛋白水解酶基因的表达，赋予宿主丝氨酸蛋白酶的高表达性，为扩大丝氨酸蛋白酶的生物应用提供了有效途径，具有重大应用前景。

(四)附图说明

图1为“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢总RNA的甲醛变性凝胶电泳图；

图2为中国被毛孢侵染蝙蝠蛾幼虫机制和过程注释图；

图3为丝氨酸蛋白酶基因PCR扩增产物凝胶电泳图；

图4为克隆载体pMD18-T Vector与表达载体pET-28a物理图谱；

图5为重组克隆质粒pMD18-T/serA物理图谱；

图6为重组表达质粒pET-28a/serA构建过程示意图；

图7为重组表达质粒pET-28a/serA物理图谱；

图8为丝氨酸蛋白酶蛋白的SDS-PAGE图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢的培养

菌株来源：首先从青海采集天然冬虫夏草，并将其带回杭州进行分离筛选，得到了L0106菌株，并经菌种鉴定该菌株为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)，该菌种保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2011278，已在先前申请的专利CN102373190A中披露。

将该菌种接种于斜面，培养基配方(此为固化之前的液体配方，按下述比例配制好之后再制成斜面)为：葡萄糖2.0％(w/v，1％表示100mL培养基中含有1g，下同)、玉米粉1.0％、土豆汁0.5％、糊精0.5％、酵母粉0.5％、麸皮1.0％、蚕蛹粉2.0％、蛋白胨1.0％、硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.05％、琼脂粉1.0％，余量为水；在12～16℃培养25天；然后将菌种接种于发酵培养基，培养基配方为葡萄糖1.0％、糖蜜1.0％、蚕蛹粉0.5％、黄豆饼粉1.0％、酵母膏0.5％、硫酸镁0.01％、磷酸二氢钾0.02％，余量为水；置于摇床上，温度12～16℃培养25天，培养结束后在无菌条件下，进行固液分离，并将固体置于无菌器具，备用。

实施例2：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢总RNA的提取

用TRIzol试剂提取总RNA，步骤具体为：

1)液氮研磨：取1g新鲜菌体放入研钵中，反复加入液氮充分研磨至粉末状，分装到预冷的1.5mL离心管中，加入1mL TRIzol试剂，混匀，冰上静置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。

2)RNA分离：加入0.2mL氯仿，用力震荡混匀15s，冰上静置2～3min，4℃、12000rpm离心15min，分层，取上层水相，约600μL。

3)RNA沉淀：加入500μL异丙醇，在冰上静置10min，4℃、12000rpm离心10min，弃上清。

4)RNA洗涤：加入1mL75％(v/v)乙醇，将沉淀悬起，冰上静置10min，4℃、7500rpm离心15min；重复上面洗涤步骤，再洗一遍。

5)溶解RNA：将离心管置于冰上敞开干燥5～10min，加适量DEPC水溶解。

实施例3：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢RNA样品测序

提取样品总RNA后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA。加入fragmentationbuffer将mRNA打断成短片段(200～700bp)，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(randomhexamers)合成第一条cDNA链，然后合成第二条cDNA链，再经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加polyA并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的测序文库用Illumina GA IIx进行测序。测序得到的原始图像数据经base calling转化为序列数据，即raw data或raw reads。除去原始测序reads中只含adaptor序列的reads，备以后续分析。

实施例4：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢RNA短读序列组装

使用短reads组装软件SOAPdenovo(Li,Zhu et al.De novo assembly of humangenomes with massively parallel short read sequencing[J].Genome Res,2010,20:265-272.)做转录组从头组装。SOAPdenovo首先将具有一定长度overlap的reads连成更长的不含N的Contig片段。然后将reads比对回Contig，通过paired-end reads确定来自同一转录本的不同Contig以及这些Contig之间的距离，SOAPdenovo将这些Contig连在一起，中间未知序列用N表示，这样就得到Scaffold。进一步利用paired-end reads对Scaffold做补洞处理，最后得到含N最少，两端不能再延长的Unigene序列。最后，将Unigene序列与蛋白数据库nr、Swiss-Prot、KEGG和COG做blastx比对(evalue<0.00001)，取比对结果最好的蛋白确定Unigene的序列方向。如果不同库之间的比对结果有矛盾，则按nr、Swiss-Prot、KEGG和COG的优先级确定Unigene的序列方向，跟以上四个库皆对比不上的Unigene用软件ESTScan(Iseli,Jongeneel et al.ESTScan:a program for detecting,evaluating,andreconstructing potential coding regions in EST sequences[J].In Proceedingsof9th International Conference on Intelligent Systems for MolecularBiology.AAAIPress,Menlo Park,CA,pp.1999,138-148.)预测其编码区并确定序列的方向。对于能确定序列方向的Unigene给出其从5'到3'方向的序列，对于无法确定序列方向的Unigene给出组装软件得到的序列。

实施例5：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢Unigene功能注释

功能注释信息给出Unigene的蛋白功能注释、Pathway注释、COG功能注释和GeneOntology(GO)功能注释。首先，通过blastx将Unigene序列比对到蛋白数据库nr、Swiss-Prot、KEGG和COG(evalue<0.00001)，得到跟给定Unigene具有最高序列相似性的蛋白，从而得到该Unigene的蛋白功能注释信息。根据KEGG注释信息能进一步得到Unigene的Pathway注释。将Unigene和COG数据库进行比对，预测Unigene可能的功能并对其做功能分类统计。根据nr注释信息，使用Blast2GO软件(Conesa,Gotz et al.Blast2GO:a universal toolfor annotation,visualization and analysis in functional genomics research[J].Bioinformatics,2005,21(18):3674-3676.)得到Unigene的GO注释信息。得到每个Unigene的GO注释后，用WEGO软件(Ye,Fang et al.WEGO:a web tool for plotting GOannotations[J].Nucleic Acids Research,2006,34:293-297.)对所有Unigene做GO功能分类统计，从宏观上认识该物种的基因功能分布特征。

实施例6：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢侵染机制和过程的分析

图2是中国被毛孢侵染蝙蝠蛾幼虫机制和过程注释图，每年7-8月冬虫夏草子实体成熟后，子蘘孢子弹出随雨水渗入土中，经过发育变化形成分生孢子。此时如附在蝙蝠蛾幼虫表，经2-3天后即开始萌发伸出芽管，通过酶和机械力的协同作用侵入幼虫体内。吸收体液养分生长并断裂成菌丝段，以酵母状出芽发迅速增值不断扩大体积。前期其代谢产物在血液中不断积累，造成血液酸碱度变化，使血液失去原有的透明性而变浑浊。但不产生毒素与寄主幼虫共生。后期，由于菌体增多，弥漫于幼虫血腔，肠道亦受机械封阻，血液梨花性质发生改变造成病理伤害，出现代谢紊乱，幼虫行动痴呆，不取食。这时菌丝体迅速向体表蔓延，在幼虫体表上出现细线稀疏的白色菌丝，菌丝体大量吸收幼虫体内水分，致使幼虫干硬僵死形成僵虫(即菌核)。通常，中国被毛孢会产生一些降解寄主昆虫的细胞壁、细胞膜和细胞内物质的酶，如几丁质酶、丝氨酸蛋白酶、脂酶等，以降解体壁含有的几丁质、蛋白质、类脂等成份，从而有利于侵袭。从中国被毛孢转录组测序以及注释信息中检测到了丝氨酸蛋白酶的Unigene。通过NCBI中的ORF Finder软件在线检测，找出了这个基因的开放阅读框(SEQ ID No.2)并得到了相应的蛋白质序列(SEQ ID No.1)。

实施例7：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢丝氨酸蛋白酶基因引物设计

运用GENE RUNNER引物设计软件根据预测得到的各基因开放阅读框DNA序列设计引物，用于克隆“百令”生产菌中国被毛孢合成代谢侵染机制的丝氨酸蛋白酶基因，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列如下所列：

serA基因：正向引物5’AGAGAATTCCCGGACCTGTCGCCGGCCAC3’

反向引物5’ATAGCGGCCGCTTACCGTCCTTTTTGCCC3’

serA基因长度为1290bp。

实施例8：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢cDNA第一链的制备

先按照实施例1提供的方法培养出中国被毛孢发酵菌丝体后，再按照实施例2所提供的方法对中国被毛孢进行总RNA的提取，得到总RNA后按下述进行“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢cDNA第一链的合成，用于后续各基因克隆实验。

采用PrimeScript1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(TaKaRa)从Total RNA中反转录合成cDNA第一链，实验步骤如下：

1)在Microtube管中配制下列混合液。

2)变性、退火操作有利于模板RNA的变性以及反转录引物和模板的特异性退火，可提高反转录反应效率，所以在PCR仪上进行变性、退火反应，条件设置如下：

65℃，5min

3)退火结束后离心数秒钟使模板RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底部。

4)在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。

5)在PCR仪上按下列条件进行反转录反应。

42℃ 15～30min

70℃ 15min

一般情况，在真核生物mRNA3’末端都有一个PolyA结构，A碱基的数量在十至几百个不等，利用这一结构可以利用Oligo(dT)引物，在反转录酶的作用下，以mRNA为模板合成cDNA第一链，本发明采用由TaKaRa独自开发的dT区域的序列(PrimeScript1st StrandcDNA Synthesis Kit中提供)为引物，如果获得的mRNA完整性较好，那么通过逆转录过程可以得到物种中所有酶蛋白编码基因的cDNA第一链。

实施例9：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢侵染机制丝氨酸蛋白酶基因的克隆、表达以及蛋白活力的检测

1、丝氨酸蛋白酶基因的PCR扩增

以实施例8中得到的cDNA第一链为模板，用实施例7中合成的丝氨酸蛋白酶基因引物：5’AGAGAATTCCCGGACCTGTCGCCGGCCAC3’和5’ATAGCGGCCGCTTACCGTCCTTTTTGCCC’进行PfuDNA聚合酶PCR扩增反应，条件设置如下：

Pfu PCR扩增反应体系：

Pfu DNA Ploymerase PCR扩增条件：

2、丝氨酸蛋白酶基因PCR产物凝胶电泳检测

具体检测方法为：

1)将配制好的0.9％的琼脂糖凝胶用微波炉加热使其溶解均匀；

2)取15mL凝胶，待琼脂糖凝胶冷却至50℃左右时，加入1μL染色液Gold view，混合均匀后倒入电泳琼脂糖凝胶板上，除去气泡后插入点样梳；

3)琼脂糖凝胶板上凝胶凝固后，小心取出点样梳，将胶板放入电泳槽中(点样孔一端靠近电泳槽的负极)，在电泳槽中加入TAE电泳缓冲液；

4)取5μL样品然后加入6×Loading Buffer1.5μL和ddH2O4μL混合后用移液枪上样，上样量为10μL；

5)连接电泳槽与电泳仪之间的电源线，正极为红色，负极为黑色；

6)开启电源，开始电泳，最高电压不超过5V/cm；

7)当样品跑过琼脂糖凝胶板的2/3时可终止电泳；

8)切断电源后，将琼脂糖凝胶板上凝胶取出放入凝胶成像仪中观察、拍照。

转录组测序预测丝氨酸蛋白酶基因的大小为1290bp，琼脂糖凝胶电泳结果表明已成功扩增出了丝氨酸蛋白酶基因，大小约为1300bp。图3为“百令”生产菌中国被毛孢侵染机制丝氨酸蛋白酶功能基因PCR产物凝胶电泳图。

3、丝氨酸蛋白酶基因PCR产物的加碱基A处理以及纯化

由于Pfu DNA聚合酶PCR产物末端为平端，所以在胶回收后还需进行加碱基A处理、纯化后才可用于T载体连接。胶回收产物加碱基A体系如下：

PCR仪中72℃加A碱基20min，最后用AxyPrep PCR清洁试剂盒纯化。

4、丝氨酸蛋白酶基因与克隆载体的连接

克隆载体pMD18-T Vector购自TaKaRa公司(TaKaRa code D101A)，其物理图谱见图4，将步骤3纯化后的丝氨酸蛋白酶基因与克隆载体连接构建重组质粒pMD18-T/serA，物理图谱见图5，连接体系和连接条件如下。

连接体系：

连接条件：16℃，16h；灭活：65℃，15min。

5、丝氨酸蛋白酶重组质粒pMD18-T/serA的转化

将重组质粒pMD18-T/serA转入大肠杆菌E.coli JM109中，构建携带丝氨酸蛋白酶基因的重组菌E.coli JM109/pMD18-T/serA，具体步骤为：1)将10μL反应体系(即步骤4的连接产物)转至感受态细胞E.coli JM109中，冰浴30min；2)热击：42℃，90s；3)冰浴：2～3min；4)加入800μL LB液体培养基，37℃，250rpm，1h；5)涂布LB平板(含Amp抗性，终浓度50μg/ml)；6)37℃培养箱培养过夜。

LB液体培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，溶剂为水，pH自然；LB平板为LB液体培养基+终浓度15g/L琼脂。

6、丝氨酸蛋白酶E.coli JM109/pMD18-T/serA阳性重组菌的筛选

菌落PCR可不必提取基因组DNA，而直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，该方法操作简便、快捷、可以快速鉴定菌落是否为含有目的质粒的阳性菌落，在转化鉴定中较为常见。实验中，将接种到液体培养基中对应的单菌落进行菌落PCR，以验证是否转入目的基因。首先，用牙签挑取单菌落加入含50μL无菌水的1.5mL离心管中，沸水浴30min，然后离心以上清作为模板，进行PCR扩增，PCR程序设定为Taq酶扩增一般程序。最后采用0.9％的琼脂糖凝胶电泳检测菌落PCR产物。

7、丝氨酸蛋白酶重组质粒pMD18-T/serA的测序

对菌落PCR检测出的阳性重组菌LB液体培养基培养过夜后，取4mL菌液提取质粒，方法按AxyPrep质粒DNA小量试剂盒提供的操作说明。测序由上海桑尼生物科技有限公司完成。经测序验证，序列SEQ ID No.2已重组至pMD18-T/serA中。

8、丝氨酸蛋白酶重组表达质粒pET-28a/serA的构建

实验根据外源基因在大肠杆菌中表达的原则，以及表达载体pET-28a和丝氨酸蛋白酶基因酶切位点比对情况，确定了serA用EcoRⅠ/NotⅠ双酶切位点，并对重组大肠杆菌E.coli JM109/pMD18-T/serA进行液体LB试管摇床培养、重组质粒提取。

丝氨酸蛋白酶基因的重组质粒pMD18-T/serA及表达载体pET-28a分别用EcoR Ⅰ/Not Ⅰ限制性内切酶在37℃分别酶切处理6h，酶切体系如下所示：

EcoR Ⅰ/Not Ⅰ双酶切体系：

酶切结束后，65℃灭活15min，然后分别用Axygen DNA凝胶回收试剂盒进行回收、纯化。

丝氨酸蛋白酶基因及表达载体pET-28a经双酶切、纯化后再用T4连接酶16℃连接过夜，构建重组表达质粒pET-28a/serA，其构建过程见图6，构建得到的重组表达质粒pET-28a/serA图谱见图7。连接体系组成如下：

连接体系：

9、丝氨酸蛋白酶重组表达质粒的转化以及阳性单克隆的筛选

将构建好的表达质粒热激转化至E.coli BL21(DE3)宿主菌中，然后涂布到含有卡那霉素(Kan)抗性(终浓度50μg/ml)的LB平板上，37℃培养过夜。从平板上随机挑选单菌落，以步骤7中合成的丝氨酸蛋白酶基因引物进行PCR扩增，挑选阳性克隆。

10、丝氨酸蛋白酶重组菌的诱导表达

将鉴定为阳性的单克隆接种于5mL含有Kan抗性(终浓度50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃、250r/min培养过夜。取1mL培养物，将其转接于50mL含有Kan抗性(终浓度50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃、250r/min培养至菌体浓度OD600约为0.6～0.8左右。向培养物中分别加入一定浓度(终浓度0.05mmol/L)的IPTG诱导培养8h。收集菌体供电泳分析以及酶活检测。

11、丝氨酸蛋白酶重组菌表达产物SDS-PAGE分析

以转入空载体的E.coli BL21(DE3)菌及未加入诱导剂IPTG的重组菌作为对照。鉴定为阳性的重组菌经IPTG诱导培养7h后，取0.5mL诱导培养物，离心收集菌体，重悬于50μL蒸馏水中，加入50μL上样缓冲液，混匀后煮沸10min，进行SDS-PAGE电泳分析，图8中的“A”泳道为大肠杆菌BL21(DE3)空细胞的SDS-PAGE图，“B”泳道为重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a加IPTG诱导后的SDS-PAGE图，“C”泳道为重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a/serA未加IPTG的对照SDS-PAGE图，“D”泳道即为重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a/serA表达的丝氨酸蛋白酶(经测序验证其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)的SDS-PAGE图。

12、丝氨酸蛋白酶重组菌的蛋白活力检测

(1)丝氨酸蛋白酶的蛋白活力检测

①10.00mg/mL酪素溶液的制备：称取酪素1.000g，准确至0.001g，用5ml的0.5mol/L的氢氧化钠水溶液(若为酸性蛋白酶则用浓乳酸2-3滴)润湿，加入pH值为8.0的PBS缓冲液约80ml，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100ml容量瓶中，用PBS缓冲液稀释至刻度，此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。

②0.4mol/L碳酸钠水溶液：准确称取无水碳酸钠42.4g，以蒸馏水溶解定溶至1000ml。

③0.4mol/L的三氯醋酸液：准确称取65.4g三氯醋酸，以蒸馏水溶解定溶至1000ml。

④100μg/ml酪氨酸标准溶液标准曲线的制备：

配制100μg/ml的酪氨酸标准溶液：准确称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，用1mol/L的盐酸水溶液60ml溶解后定容至100ml，即为1.00mg/mL的酪氨酸标准溶液。吸取1.00mg/mL酪氨酸标准溶液10.00ml，用0.1mol/L盐酸水溶液定容至100ml，即得100.0μg/ml L-酪氨酸标准溶液。按表1制作标准曲线，方程为：y＝0.0207x-0.021，R²＝0.9973，其中y为680nm下的吸光值，x为标准品的浓度。

表1酪氨酸标准曲线

试管号	1	2	3	4	5
						取100μg/ml酪氨溶液(ml)	0	1	2	3	4
蒸馏水(ml)	10	9	8	7	6

酪氨酸实际浓度(μg/ml)

0

10

20

30

40

分别取上述溶液各1.00ml(须做平行试验)，各加0.4mol/L碳酸钠水溶液5.00ml，福林试剂1.00ml，置于40℃水浴中显色20min，取出用分光光度计于波长680nm下测定其吸光度值，以不含酪氨酸的0管为空白管调零点，分别测定其吸光度值，以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。

粗酶液制备：称取步骤10收集的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a/serA湿菌体0.5g，用磷酸盐缓冲液(50mM、pH8.0)15mL悬浮，高压破碎仪(型号FS-600，上海生析超声仪器有限公司)在功率40％、破1s停1s条件下破碎3次(35Kpa)，每次5min，破碎混合液12000rpm离心10min后，取上清液即为粗酶液12.4ml。

丝氨酸蛋白酶转化体系：先将10.00g/ml酪素溶液放入40℃恒温水浴中，预热5min，取4支试管，各加入1ml粗酶液，取一支作为空白管，加2ml三氯乙酸，其他3管作为测试管各加入1ml预热后的酪素溶液，摇匀，40℃保温10min，取出试管，3支测试管中各加入2ml三氯乙酸，空白管中加1ml酪素。静置10min，离心，各取1ml上清液，分别加0.4mol/L的Na₂CO₃水溶液5ml、福林试剂1ml。在40℃显色20min。680nm处测OD值。

一个酶活性单位(U)定义为丝氨酸蛋白酶在40℃条件下，1min水解酪素产生1μmol酪氨酸的量。

检测丝氨酸蛋白酶酶活的空白对照为煮沸20min后失活的粗酶液替代酶液。另外，同样条件下也检测了E.coli BL21(DE3)和E.coli BL21(DE3)/pET-28a诱导后的粗酶液的活力，均未检测到丝氨酸蛋白酶酶活。

利用考马斯亮蓝法测得丝氨酸蛋白酶粗酶液中的蛋白含量为0.251mg/mL，通过Bandscan软件，对SDS-PAGE中的粗酶液条带含量进行分析，丝氨酸蛋白酶占总蛋白的14.2％，故参与催化反应的丝氨酸蛋白酶为0.251mg/mL×1mL×0.142＝0.036mg。根据酶活定义，丝氨酸蛋白酶的最大比酶活为：7.74μmol/(0.036mg×10min)＝21.5μmol/mg/min＝21.5U/mg。因此，上述丝氨酸蛋白酶重组菌所表达的丝氨酸蛋白酶的最大比酶活为21.5U/mg，上述反应的转化率为46.7％。比酶活计算公式为：比酶活＝酶活/漆酶的蛋白总量。转化率计算公式为：转化率＝(初始浓度-平衡浓度)/初始浓度。

Claims (9)

1.一种来自冬虫夏草的丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述丝氨酸蛋白酶氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.如权利要求1所述的丝氨酸蛋白酶在生物催化酪素制备酪氨酸中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：将含丝氨酸蛋白酶基因的重组工程菌经诱导培养获得的湿菌体用pH8.0磷酸盐缓冲液悬浮，超声破碎后，取破碎混合液离心，取上清液作为催化剂，以10.00mg/mL酪素溶液为底物，40℃下水浴反应，反应结束后，将反应液离心，取上清液即获得含酪氨酸的混合液；所述10.00mg/mL酪素溶液按如下步骤制备：取1.000g酪素用0.5mol/L的氢氧化钠水溶液润湿，加入pH值为8.0的PBS缓冲液，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100ml容量瓶中，用缓冲液稀释至刻度；所述氢氧化钠水溶液的体积用量以酪素质量计为5ml/g。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述底物的用量以酪素质量计，所述酪素的初始浓度为5mg/mL，所述催化剂的体积用量以破碎前湿菌体的质量计，终浓度为20g/L。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将含丝氨酸蛋白酶的重组工程菌接种于含终浓度50μg/ml的Kan抗性的LB液体培养基中，37℃、250r/min培养过夜，取培养物，以体积浓度2％接种量转接于含有50μg/ml Kan抗性的LB液体培养基中，37℃、250r/min培养至菌体浓度OD600为0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0.05mmol/L的IPTG诱导培养8h，收集湿菌体，将湿菌体在功率40％、破1s停1s条件下超声破碎，取破碎混合液即为催化剂。

6.一种编码权利要求1所述丝氨酸蛋白酶的基因。

7.如权利要求6所述的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。

8.如权利要求6或7所述的编码基因在构建能够生物催化酪素制备酪氨酸的基因工程菌中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的应用为：构建含有所述丝氨酸蛋白酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化获得含有丝氨酸蛋白酶基因的菌体细胞。