CN113786354A - 一种n端改造的重组人纤连蛋白基多重乳液及制备方法 - Google Patents

一种n端改造的重组人纤连蛋白基多重乳液及制备方法 Download PDF

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Abstract

一种N端改造的重组人纤连蛋白基多重乳液及制备方法，首次利用自主研发的N端改造的重组人纤连蛋白纳米粒子与亲水性表面活性剂分子协同乳化制备水包油包水的多重乳液，N端改造的重组人纤连蛋白纳米粒子对形成的界面膜进行修饰，从而达到稳定外相界面膜的作用，进一步提高了多重乳液的稳定性，多重乳液的乳化粒径均一，无水油分离现象，放置3个月后仍能保持多重结构。本发明的制备方法简单，制备出稳定性较高、分散性良好的多重乳液，适合大规模生产。多重乳液特殊的水包油包水的三相结构，在内外相中添加不同种活性功效物质，从而生产出一系列功效不同的多重乳液，该技术可广泛应用于化妆品、食品、医药领域。

Description

一种N端改造的重组人纤连蛋白基多重乳液及制备方法
技术领域
本发明属于化妆品领域，尤其涉及一种N端改造的重组人纤连蛋白基多重乳液及制备方法。
背景技术
乳液是非常重要的化妆品护理产品，也是最重要的基础体系，它的特点是不仅能保持皮肤水分的平衡，而且还能补充重要的油性成分、亲水性保湿成分和水分，并能作为活性成分的载体，使之为皮肤吸收，达到调理和营养皮肤的目的。近年来，在油水混合方面通常的做法是利用表面活性剂形成乳状液，乳液的剂型可分为O/W型，W/O型，O/W/O型以及W/O/W型，其中利用表面活性剂形成的两膜三相（W/O/W）体系（图1）的多重乳液是当前具有缓释效果的新型策略。乳液分为两膜三相，包括内相、中间相和外相，在内相或者外相添加不同的活性物，既能保证活性物不相互发生作用，又能达到缓释的效果。特别是将一些性质不同的物质分别溶解在不同的相中，避免了活性物之间的相互作用，起到隔离、保护、控制释放、调节肤感等效果，因此W/O/W体系在化妆品等领域有广阔的应用价值。
由于多重乳液的特殊结构，在长期放置过程中，易发生内层液滴聚集长大，导致内相失稳，容易形成水包油乳液，另外界面膜之间由于表面张力的影响，易发生三相变两相的情况，严重影响多重乳液的稳定性。为了能够将该技术进行广泛应用，应优先解决体系稳定性的问题，目前有关W/O/W多重乳液体系稳定性的研究报道较少。
纤连蛋白是一种高分子糖蛋白，广泛存在于动物组织和组织液中，在机体生命活动中，参与细胞的粘附、增殖、迁移以及胚胎的发育。纤连蛋白由两个亚基通过C末端的二硫键交联而成，整个分子呈V型，与亲水性表面活性剂结合，能够形成致密的界面膜，促进W/O/W的外相界面膜的稳定。在油水界面的不可逆吸附所形成的的界面层赋予了乳液界面极高的稳定性，将纤连蛋白引入到多重乳液界面膜中，将能够解决多重乳液体系界面稳定性问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种N端改造的重组人纤连蛋白基多重乳液及制备方法，解决由于稳定性限制多重乳液在化妆品领域应用的问题，推广可应用于食品以及医药领域。
为了实现上述目的，本发明采用N端改造的重组人纤连蛋白纳米粒子与亲水性表面活性剂的协同稳固作用，对形成的界面膜进行修饰，从而达到稳定外相界面膜的作用，进一步得到一种纤连蛋白基W/O/W多重乳液。
本发明的第一目的在于提供一种N端改造的重组人纤连蛋白基多重乳液的配方，包括如下结构及成分：
所述多重乳液为水包油包水结构，包括外相、中间相和内相，其中外相与内相均为水相，中间相为油相；其中外相中含有去离子水、亲水性表面活性剂为丙烯酸（酯）类/C10-30 烷醇丙烯酸酯交联聚合物和聚丙烯酸酯交联聚合物-6、防腐剂尼泊金甲酯、pH调节剂三乙醇胺、外水相稳定剂；中间油相含有亲油性表面活性剂月桂基 PEG-9 聚二甲基硅氧乙基聚二甲基硅氧烷、油脂、防腐剂尼泊金丙酯；内水相含有去离子水、油相稳定剂七水硫酸镁。
所述油脂为聚二甲基硅氧烷、异壬酸异壬酯、乳木果油、棕榈酸乙基己酯中的任意一种或者几种的组合；
所述pH调节剂为三乙醇胺；
所述外水相稳定剂为N端改造的重组人纤连蛋白，分子量约为40kD，该纤连蛋白氨基酸序列包括：（1）N端的透皮功能短肽Transdermal peptide 1（TD-1）序列；（2）连接短肽序列；（3）纤连蛋白结构域。
进一步的，所述内水相中去离子水占中间相和内水相的总质量的百分比为35.2%-66.1%，内水相中七水硫酸镁占中间相和内水相的总质量的百分比为0.6%-1.0%。
进一步的，所述中间油相中月桂基 PEG-9 聚二甲基硅氧乙基聚二甲基硅氧烷占中间相和内水相的总质量的百分比为2%-5%，中间油相中聚二甲基硅氧烷占中间相和内水相的总质量的百分比为10%-20%，中间油相中异壬酸异壬酯占中间相和内水相的总质量的百分比为8%-15%，中间油相中乳木果油占中间相和内水相的总质量的百分比为3%-8%，中间油相中棕榈酸乙基己酯占中间相和内水相的总质量的百分比为10%-15%，中间油相中尼泊金丙酯占中间相和内水相的总质量的百分比为0.3%-0.8%。
进一步的，所述外水相中去离子水占外水相总质量的百分比97.995%-99.599%，外水相中丙烯酸（酯）类/C10-30 烷醇丙烯酸酯交联聚合物占外水相总质量的百分比0.1%-0.5%，外水相中聚丙烯酸酯交联聚合物-6占外水相总质量的百分比0.1%-0.5%，外水相中尼泊金甲酯占外水相总质量的百分比0.1%-0.5%，外水相中三乙醇胺占外水相总质量的百分比为0.1%-0.5%，外水相中纤连蛋白占外水相总质量的百分比为0.001%-0.005%。
进一步的，所述中间油相和内水相的质量比为5:5，外水相的质量与内水相和中间相之和的质量比值为8:2。
本发明的第二目的在于提供一种N端改造的重组人纤连蛋白基多重乳液及制备方法，包括如下步骤：
S1:W/O乳液的制备：将中间油相中的亲油性表面活性剂、油脂、防腐剂混合，将内水相中的去离子水和七水硫酸镁混合均匀，加热搅拌下将内水相加入到中间相中，均质成均一的稳定的油包水乳液；
S2:外水相的制备：将亲水性表面活性剂、防腐剂、pH调节剂，外水相稳定剂等加热搅拌均匀，调节pH值；
S3:W/O/W多重乳液的制备：将步骤S1得到的W/O乳液10-30%，步骤S2得到的外水相70-90%，在搅拌条件下混合均匀，即得W/O/W多重乳液。
进一步的，所述的步骤S1的加热温度为80-85℃；
进一步的，所述步骤S1的搅拌速度为300-500rpm/mim，搅拌时间为3-8min；
进一步的，所述步骤S1的均质速度为8-12Krpm/min，均质时间为2-5min；
进一步的，所述S2的加热温度为80-85℃；
进一步的，所述步骤S2的搅拌速度为300-500rpm/mim，搅拌时间为3-8min；
进一步的，所述步骤S2的pH值为6.0-6.5；
进一步的，所述步骤S3的搅拌速度为500-1000 rpm/mim，搅拌时间为5-15min。
本发明的第三目的在于提供一种N端改造的重组人纤连蛋白基多重乳液在功效型化妆品中的应用。
本发明相对于现有技术，具有如下优点及有益效果：
1.本发明首次利用N端改造的重组人纤连蛋白纳米粒子与亲水性表面活性剂分子协同乳化制备水包油包水的多重乳液，纤连蛋白纳米粒子对形成的界面膜进行修饰，从而达到稳定外相界面膜的作用，进一步提高了W/O/W多重乳液的稳定性；
2.本发明的基于纤连蛋白纳米粒子稳定的W/O/W多重乳液的乳化粒径均一，无水油分离现象，放置3个月后仍能保持多重结构；
3.本发明以一种新的制备工艺制备出稳定性较高、分散性良好的多重乳液，具有方法简单，适合大规模生产的特点；
4.本发明制备的W/O/W多重乳液可以利用特殊的多层结构，在内外相中添加多种活性功效物质，其具体添加物质可根据实际需要进行调整，从而生产出一系列功效不同的多重乳液，该技术在缓释方面有很好的效果，可广泛应用于化妆品、医药领域；应用于食品领域，可以较好的进行风味物质的保存。
附图说明
图1为W/O/W多重乳液结构示意图；
图2为重组人纤连蛋白连接结构示意图；
图3为本发明的制备过程流程图；
图4 为本发明的多重乳液的微观结构图；
图5 为本发明的多重乳液经高温测试后微观结构图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但发明要求保护的范围并不仅仅局限于实施例表述的范围。
纤连蛋白是一种多功能的糖蛋白，广泛地存在于细胞外基质、血浆及其他体液中，由上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、蜕膜细胞及绒毛外滋养细胞等表达，参与细胞的粘附、变形与分布及血管的形成。作为人体必需的一种大分子蛋白质，纤连蛋白整体约有440kDa大小，且常以蛋白质二聚体的形式存在，含有包括多个二硫键连接的复杂结构。其中四个主要的蛋白结构域分别承担装配、结合、生物活性和增效作用，从而形成一个庞大的功能性蛋白系统。在各个物种来源的纤连蛋白中，人源的纤连蛋白对人体的创面愈合、胚胎发育、抵御外界刺激、保护皮下组织等方面均有重要的作用，具有广阔的应用前景和巨大的市场潜力。但其生物学结构限制了体外大量制备有功效的人源纤连蛋白，增加了应用成本；同时，皮肤表面的物质屏障也阻碍了外源的纤连蛋白有效的透过皮肤、作用于靶点细胞，使得重组人源纤连蛋白的使用效果不佳。
本发明从纤连蛋白结构入手，截取并优化了其主要的功能结构域片段，减小了重组纤连蛋白的分子量，降低了重组蛋白的免疫原性，更有利于其体外表达及使用；此外，通过设计在N端添加一种透皮短肽TD-1，设计合适大小的连接肽连接纤连蛋白功能片段，使得改造后的重组人源纤连蛋白具有了更强的透皮功能；在N端添加引导序列和优化的连接肽也使得重组蛋白结构比其他改造方式更为舒展，增加了一定比例的极性氨基酸增大了重组蛋白的可溶表达量，便于进行后续的纯化及应用。同时，C端的功能域充分地暴露在外，能较好地在空间构象上相对独立，发挥其促进生长、增殖等活性，利于后续基于该重组纤连蛋白进行更多的蛋白质工程改造。
本发明中所用到的N端改造的重组人纤连蛋白为本实验室自主获得，它是一种改造的重组人纤连蛋白（rhFN1），其结构如图2所示，分子量约为40kD，氨基酸序列包括：（1）N端的透皮功能短肽Transdermal peptide 1（TD-1）序列；（2）连接短肽序列；（3）纤连蛋白结构域。
该N端改造的重组人纤连蛋白制备方法，具体包括以下步骤：
N1：构建：人工合成目的基因序列，根据商用载体pET28a的相关序列位置设计序列插入位点，使用限制性内切酶对载体进行线性化处理，并通过PCR扩增的方法扩增纤连蛋白结构域片段。将酶切后的载体与PCR产物DNA片段混匀后室温连接2~3小时，获得重组质粒rhFN1-pET28a(+)；
N2：表达：将重组质粒rhFN1-pET28a(+)转入大肠杆菌BL21(DE3)，获得阳性基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-rhFN1；经卡那霉素抗性LB平板筛选的阳性转化子，接种至10~15mL卡那霉素抗性的LB培养基中37℃过夜培养；
N3：诱导：次日进行转接，37℃、200rpm摇床震荡培养至对数生长期加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG) 0.2~1.0mM/L进行诱导发酵，20~37℃诱导1~5小时，离心收集菌体；
N4：鉴定：S3的诱导过程中对未诱导菌液、诱导完成的菌液分别取样1~3mL，4℃、14000×g、5~10min离心收集菌体，加入1~3mL Tris-Cl缓冲液(50mM, pH=8)复溶菌体，将菌体进行低温超声破碎，超声完成后，4℃、14000×g、5~10min离心分离上清及沉淀，用1~3mLTris-Cl(50mM, pH=8) 复溶沉淀；取未诱导菌液、诱导后菌液、破碎离心上清、破碎离心沉淀样品各10~50μL，加入5×蛋白电泳上样缓冲液，SDS-PAGE鉴定蛋白的表达情况；
N5：纯化：S3发酵菌体按1:10的比例用破菌buffer（50mM Tirs，1mM EDTA，50mMNaCl，0.5% Triton X-100，pH 7.0）重悬，重悬后的菌体高压均质（900bar两遍）破碎。14000rpm，25min，4℃离心，收集上清。上清0.45μm滤膜过滤后，过SP柱纯化，洗脱含有重组人纤连蛋白的组分。用He-A buffer（20mM Tirs，1mM EDTA，pH 7.5）调电导至7.0 mS/cm后上He柱纯化。洗脱后收集含有重组人纤连蛋白的目的峰，过Sephacryl S100柱完成纯化。SDS-PAGE鉴定纯化结果，电泳图显示得到的重组人纤连蛋白纯度大于95%。
本发明中一种N端改造的重组人纤连蛋白基多重乳液及制备方法是利用不同的表面活性剂形成的两膜三相体系，制备过程包括包括三个阶段：W/O乳液的制备、外水相的制备、W/O/W乳液的制备。（制备流程见图3）
实施例1：
（1）W/O乳液的制备：将3g的月桂基 PEG-9 聚二甲基硅氧乙基聚二甲基硅氧烷、与13g的聚二甲基硅氧烷、10g的异壬酸异壬酯、5g的乳木果油、13g的棕榈酸乙基己酯、0.5g尼泊金丙酯混合均匀，作为中间相；将54.7g的去离子水和0.8g的七水硫酸镁混合均匀作为内水相。在转速350rpm/min下将内水相加入到中间相中，搅拌时间为5min，开启均质，均质速度为10Krpm/min，均质时间为3min，形成稳定的油包水乳液。
（2）外水相的制备：将0.2g丙烯酸（酯）类/C10-30 烷醇丙烯酸酯交联聚合物、0.2g聚丙烯酸酯交联聚合物-6、0.25g尼泊金丙酯、0.2g三乙醇胺、0.002g N端改造的重组人纤连蛋白等混合，在转速350rpm/min下，搅拌时间5min，混合均匀，调节pH值为6.2左右。
（3）W/O/W多重乳液的制备：按照质量比，将步骤（1）得到的油包水乳液取出20%，步骤（2）得到的外水相取出80%，在转速700rpm/min下搅拌10min，混合均匀，既得W/O/W多重乳液。
对上述制备得到的多重乳液进行稳定性考察，稳定性考察分别在45℃放置3个月；-20℃放置1个月； -20℃冷冻24h，恢复至室温，再放置到45℃环境下24h，如此循环一个月。
新制备的乳液粒子为多重结构（图4），经高低温稳定性测试后，不分层，且保持多重结构（图5）。
实施例2：
（1）W/O乳液的制备：将3g的月桂基 PEG-9 聚二甲基硅氧乙基聚二甲基硅氧烷、与20g的聚二甲基硅氧烷、15g的异壬酸异壬酯、8g的乳木果油、15g的棕榈酸乙基己酯、0.5g尼泊金丙酯混合均匀，作为中间相，将37.7g的去离子水和0.8g的七水硫酸镁混合均匀作为内水相。在转速350rpm/min下将内水相加入到中间相中，搅拌时间为5min，开启均质，均质速度为10Krpm/min，均质时间为3min，形成稳定的油包水乳液。
（2）外水相的制备：将0.2g丙烯酸（酯）类/C10-30 烷醇丙烯酸酯交联聚合物、0.2g聚丙烯酸酯交联聚合物-6、0.25g尼泊金丙酯、0.2g三乙醇胺、0.002g N端改造的重组人纤连蛋白等混合，在转速350rpm/min下，搅拌时间5min，混合均匀。调节pH值为6.2左右。
（3）W/O/W多重乳液的制备：将步骤（1）得到的油包水乳液取出20%，步骤（2）得到的外水相取出80%，在转速700rpm/min下搅拌10min，混合均匀，既得W/O/W多重乳液。
对上述制备得到的多重乳液进行稳定性考察，稳定性考察分别在45℃放置3个月，-20℃放置1个月，恢复至室温，-20℃冷冻24h，恢复至室温，再放置到45℃环境下24h，如此循环一个月，多重乳液的多重结构明显，粒径变化不大。
试验例1 不同搅拌速度及搅拌时间对多重乳液结构的影响
（1）W/O乳液的制备：将3g的月桂基 PEG-9 聚二甲基硅氧乙基聚二甲基硅氧烷、13g的聚二甲基硅氧烷、10g的异壬酸异壬酯、5g的乳木果油、13g的棕榈酸乙基己酯、0.5g尼泊金丙酯混合均匀，作为中间相，将54.7g的去离子水和0.8g的七水硫酸镁混合均匀作为内水相。在转速350rpm/min下将内水相加入到中间相中，搅拌时间为5min，开启均质，均质速度为10Krpm/min，均质时间为3min，形成稳定的油包水乳液。
（2）外水相的制备：将0.2g丙烯酸（酯）类/C10-30 烷醇丙烯酸酯交联聚合物、0.2g聚丙烯酸酯交联聚合物-6、0.25g尼泊金丙酯、0.2g三乙醇胺、0.002g N端改造的重组人纤连蛋白等混合，在转速350rpm/min下，搅拌时间5min，混合均匀。调节pH值为6.2左右。
（3）W/O/W多重乳液的制备：按质量比，将步骤（1）得到的油包水乳液取出20%，步骤（2）得到的外水相取出80%，分别在转速500rpm/min、1000 rpm/min下搅拌5min、10min 、15min，混合均匀，即得W/O/W多重乳液。
表1 不同搅拌速度搅拌时间下多重乳液的粒径以及稳定性
Figure DEST_PATH_IMAGE001
搅拌速度与搅拌时间对于多重乳液的粒径有很大的影响，转速太小，不适合多重结构的形成，粒径偏大，转速过大，形成的多重结构粒径也偏大，转速过大，随着搅拌时间的加长，多重结构消失。
试验例2外相中不同重组人纤连蛋白纳米粒子添加量对多重乳液结构的影响
（1）W/O乳液的制备：将3g的月桂基 PEG-9 聚二甲基硅氧乙基聚二甲基硅氧烷、与13g的聚二甲基硅氧烷、10g的异壬酸异壬酯、5g的乳木果油、13g的棕榈酸乙基己酯、0.5g尼泊金丙酯混合均匀，作为中间相，将54.7g的去离子水和0.8g的七水硫酸镁混合均匀作为内水相。在转速350rpm/min下将内水相加入到中间相中，搅拌时间为5min，开启均质，均质速度为10Krpm/min，均质时间为3min，形成稳定的油包水乳液。
（2）外水相的制备：配置含0.2g丙烯酸（酯）类/C10-30 烷醇丙烯酸酯交联聚合物、0.2g聚丙烯酸酯交联聚合物-6、0.25g尼泊金丙酯、0.2g三乙醇胺的溶液，分别与0.001g、0.005g N端改造的重组人纤连蛋白混合，在转速350rpm/min下，搅拌时间5min，混合均匀。
（3）W/O/W多重乳液的制备：将步骤（1）得到的油包水乳液取出20%，步骤（2）得到的外水相取出80%，在转速700rpm/min下搅拌10min，混合均匀，既得W/O/W多重乳液。
表2为不同添加量的重组人纤连蛋白对多重乳液的粒径以及稳定性的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE002
N端改造的重组人纤连蛋白的添加对于体系的稳定有一定的增强作用，N端改造的重组人纤连蛋白的量过高时，多重乳液的粒径偏大，稳定性较好，重组人纤连蛋白的量过低时，多重乳液的粒径较好，稳定性稍差。
可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。

Claims (7)

1.一种N端改造的重组人纤连蛋白基多重乳液及制备方法，所述多重乳液为水包油包水结构，包括外相、中间相和内相，其中外相与内相均为水相，中间相为油相；其特征在于：所述外相中含有去离子水、亲水性表面活性剂为丙烯酸（酯）类/C10-30 烷醇丙烯酸酯交联聚合物和聚丙烯酸酯交联聚合物-6、防腐剂尼泊金甲酯、pH调节剂三乙醇胺、外水相稳定剂；所述中间油相含有亲油性表面活性剂月桂基 PEG-9 聚二甲基硅氧乙基聚二甲基硅氧烷、油脂、防腐剂尼泊金丙酯；所述内水相含有去离子水、油相稳定剂七水硫酸镁。
2.根据权利要求1所述的一种N端改造的重组人纤连蛋白基多重乳液及制备方法，其特征在于，所述外水相稳定剂为N端改造的重组人纤连蛋白。
3.根据权利要求1所述的一种N端改造的重组人纤连蛋白基多重乳液及制备方法，其特征在于，所述油脂为聚二甲基硅氧烷、异壬酸异壬酯、乳木果油、棕榈酸乙基己酯中的任意一种或者几种的组合。
4.根据权利要求1所述的一种N端改造的重组人纤连蛋白基多重乳液及制备方法，其特征在于，所述中间油相和内水相的质量比为5:5，外水相的质量与内水相和中间相之和的质量比值为8:2。
5.根据权利要求1所述的一种N端改造的重组人纤连蛋白基多重乳液及制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
S1:W/O乳液的制备：将中间油相中的亲油性表面活性剂、油脂、防腐剂混合，将内水相中的去离子水和油相稳定剂混合均匀，加热搅拌下将内水相加入到中间相中，均质成均一的稳定的油包水乳液；
S2:外水相的制备：将亲水性表面活性剂、防腐剂、pH调节剂，外水相稳定剂等加热搅拌均匀，调节pH值；
S3:W/O/W多重乳液的制备：将步骤S1得到的W/O乳液10-30%，步骤S2得到的外水相70-90%，在搅拌条件下混合均匀，即得W/O/W多重乳液。
6.根据权利要求5所述的一种N端改造的重组人纤连蛋白基多重乳液及制备方法，其特征在于，所述步骤S3的搅拌速度为500-1000 rpm/mim，搅拌时间为5-15min。
7.根据权利要求1-4任一项所述的一种N端改造的重组人纤连蛋白基多重乳液在功效型化妆品中的应用。
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