CN110721109A - 一种蛋白脂质体fnl的制备方法及其在化妆品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于涉及生物医药及化妆品领域，具体涉及脂质体制备技术领域，具体涉及动物血纤维连接蛋白脂质体的制备方法及获得产品的用途。本发明将动物血纤维连接蛋白加入氢化卵磷脂和胆固醇等物质中制成蛋白脂质体FNL，经脂质体包封后的纤连蛋白应用于护肤品中，可以较快地被皮肤吸收，经皮肤吸收后可以更好的发挥其美白、抗衰、保湿、修复等多重功效，为纤连蛋白进入高端化妆品展示了良好的应用前景。

Description

一种蛋白脂质体FNL的制备方法及其在化妆品中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药及化妆品领域，具体涉及脂质体制备技术领域，具体涉及纤维连接蛋白脂质体的制备方法及获得产品的用途。
背景技术
纤连蛋白(fibronectin，FN)是一种广泛存在于血液、体液及各种组织中的高分子糖蛋白，分子质量为450ku，由两个分子质量为220ku的亚基通过链间二硫键连接而成。其亚基有6个致密的球状体，每一区均有特定的功能，可与特殊的配体结合，具有多种生物学功能。FN广泛参与细胞迁移、黏附、增殖、止血及组织修复等过程，调动单核吞噬细胞系统清除损伤组织有害物质，为细胞提供营养和信息通道。FN可以促进细胞往色素沉积部位迁移，并刺激细胞分泌黑色素代谢酶，从而清除色斑；FN可以修复黑色素细胞，保证黑色素细胞的正常状态，黑色素细胞正常分泌黑色素，由黑色素小体运送至表皮，从而起到防晒的作用；FN可以调集周围正常的细胞去代替晒后皮肤损伤的细胞；当皮肤内部缺乏保湿因子时，FN可以刺激细胞分泌保湿因子并调动周围的保湿因子到皮肤；FN能够刺激细胞分泌胶原蛋白、弹性蛋白、网状纤维等，填充皮肤塌陷部位；FN能刺激细胞分泌抗氧化酶，清除体内过多的自由基等。综上，FN具有清除色斑、防晒、晒后修复、保湿、抗衰祛皱、修复等多重功效。因此，FN是国药监局《关于已使用化妆品原料名称目录的公告》(IECI2015版)中登记在册的合法合规原料，越来越多的FN被应用于化妆品中。然而，FN作为一种高分子糖蛋白，直接添加使用无法使皮肤吸收，无法达到应有的效果。
由于磷脂是两亲性的物质，具有亲水的头部和疏水的尾部。所以当磷脂分散于水中时，一方面亲水的头部伸入水相中，而疏水的尾部伸向空气中；另一方面亲水头部与亲水头部聚集在一起暴露于水相，而疏水尾部与疏水尾部聚集在一起避开水相，就这样自发聚集有序的排列成封闭的球形脂质体。由于脂质体具有亲水的头部和疏水的尾部构成的双分子层结构，所以可以包封水溶性和脂溶性的物质，扩大了一些不稳定活性物质的应用范围，因此被广泛应用于医学、食品及化妆品等各种领域中。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种蛋白脂质体FNL的制备方法，利用脂质体对纤连蛋白进行包封，保护纤连蛋白，防止其与配方中其他物质的相互干扰，又避免与外界因素的接触，降低了被风干的可能性，还可以避免纤连蛋白的降解与变质，提高其本身的稳定性，并降低其对皮肤的刺激性。
本发明提供了一种蛋白脂质体FNL的制备方法，包括以下步骤：
S1采集新鲜动物血，加入柠檬酸钠抗凝，离心，收集上部血浆。向收集到的血浆中加入硫酸铵至饱和度为30％，静置2小时，过滤收集沉淀并再次溶解后，亲和层析柱分离提取，分子筛纯化，除菌后得纤连蛋白溶液I；
S2取氢化卵磷脂、胆固醇、维生素E溶于适量三氯甲烷中，转移溶液至旋转瓶，于20～30℃、100～200r/min的条件下旋蒸去除三氯甲烷，形成均匀薄膜；
S3将步骤S1收集得到的纤连蛋白溶于磷酸盐缓冲液，并加入蛋白保护剂，充分混匀后加入步骤S2得到的均质薄膜中，于40℃旋转蒸发水合一定时间，即得脂质体粗品；所述磷酸盐缓冲液的用量为每0.1～10mg纤连蛋白使用10mL磷酸盐缓冲液；
S4将步骤S3得到的脂质体粗品超声混匀，并用0.45μm微孔滤膜挤压整粒，即得粒径均匀的蛋白脂质体FNL，于4℃保存。
进一步地，所述步骤S1动物血与3.8％柠檬酸钠抗凝剂的体积比为9：1，离心条件为1500rpm，离心时间为15min；所述的亲和层析柱是明胶-琼脂糖凝胶2B，所述的分子筛层析柱是葡聚糖凝胶G75。
进一步地，所述步骤S2中氢化卵磷脂、胆固醇、维生素E与三氯甲烷的固液比为5g:2g:1g:200ml。
进一步地，所述步骤S3中磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M，pH为6.5。
进一步地，所述步骤S5中的蛋白质保护剂为质量浓度为0.1％的牛血清白蛋白溶液。
进一步地，所述步骤S4中所述超声条件为功率200～400W，频率20～40KHz。
另外，本发明还提供了所述的蛋白脂质体FNL的制备方法制备得到的蛋白脂质体FNL在制备护肤品中的用途。
本发明制得的蛋白脂质体FNL可以为冻干产品的形式。通过脂质体的包封的纤连蛋白可以提高纤连蛋白的稳定性和透皮吸收率，同时还可以增强纤连蛋白的防晒、晒后修复、保湿、抗衰祛皱、修复的作用，延长作用时间，降低了护肤品中纤连蛋白的添加量。
总之，与现有技术相比，本发明提供的蛋白脂质体FNL的制备方法具有以下优势：
(1)本发明提供的蛋白脂质体FNL的制备方法是利用脂质体对动物血纤连蛋白进行包封，保护纤连蛋白，防止其与护肤品配方中其他物质的相互干扰，又避免与外界因素的接触，降低了被风干的可能性，还可以避免纤连蛋白的降解与变质，提高其本身的稳定性，并降低其对皮肤的刺激性。
(2)本发明提供的蛋白脂质体FNL的制备方法制得的蛋白脂质体FNL的透皮吸收率高，可以大大促进皮肤的吸收和利用，更有利于纤连蛋白发挥美白、抗衰、保湿、修复、抗衰的作用。
(3)本发明的纤连蛋白采用可以自发地包裹在磷脂双分子层，避免了添加赋形剂和增塑剂，工艺过程简单，容易实现，且非常容易放大，适合工业化生产。
附图说明：
图1为蛋白脂质体FNL的透皮吸收率图。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步描述本发明，本发明不仅仅限于以下实施例。在本发明的范围内或者在不脱离本发明的内容、精神和范围内，对本发明进行的变更、组合或替换，对于本领域的技术人员来说是显而易见的，且包含在本发明的范围之内。本发明的化妆品成分为常规的市售的成分。
实施例1、一种蛋白脂质体FNL的制备方法
S1采集新鲜动物血，加入3.8％柠檬酸钠抗凝(体积比为9：1)，1500rpm离心15min，收集上部血浆。向收集到的血浆中加入硫酸铵至饱和度为30％，静置2小时，过滤收集沉淀并再次溶解后，明胶-琼脂糖凝胶2B亲和层析柱分离提取，葡聚糖凝胶G75分子筛纯化，除菌后得纤连蛋白溶液I；
S2取氢化卵磷脂、胆固醇、维生素E溶于适量三氯甲烷中，转移溶液至旋转瓶，于20～30℃、100～200r/min的条件下旋蒸去除三氯甲烷，形成均匀薄膜；所述氢化卵磷脂、胆固醇、维生素E与三氯甲烷的固液比为5g:2g:1g:200ml；
S3取步骤S1收集得到的纤连蛋白0.1～10mg溶于10mL磷酸盐缓冲液(0.1M，pH6.5)，并加入0.1％的牛血清白蛋白溶液，充分混匀后加入步骤S2得到的均质薄膜中，于40℃旋转蒸发水合一定时间，即得脂质体粗品；
S4将步骤S3得到的脂质体粗品超声混匀(200～400W，频率20～40KHz)，并用0.45μm微孔滤膜挤压整粒，即得粒径均匀的蛋白脂质体FNL，于4℃保存。
实施例2、一种蛋白脂质体FNL的制备方法
S1采集新鲜动物血900mL，加入100mL 3.8％柠檬酸钠抗凝，1500rpm离心15min，收集上部血浆。向收集到的血浆中加入硫酸铵至饱和度为30％，静置2小时，过滤收集沉淀并再次溶解后，明胶-琼脂糖凝胶2B亲和层析柱分离提取，葡聚糖凝胶G75分子筛纯化，除菌后得纤连蛋白溶液I；
S2取氢化卵磷脂500mg、胆固醇200mg、维生素E100mg溶于20mL三氯甲烷中，转移溶液至旋转瓶，于25℃、140r/min的条件下旋蒸去除三氯甲烷，形成均匀薄膜；
S3取步骤S1收集得到的纤连蛋白0.5mg溶于10mL磷酸盐缓冲液(0.1M，pH6.5)，并加入0.1％的牛血清白蛋白溶液，充分混匀后加入步骤S2得到的均质薄膜中，于40℃旋转蒸发水合一定时间，即得脂质体粗品；
S4将步骤S3得到的脂质体粗品超声混匀(功率250W，频率35KHz)，并用0.45μm微孔滤膜挤压整粒，即得粒径均匀的蛋白脂质体FNL，于4℃保存。
实施例3、一种含有纤连接蛋白脂质体的防晒霜
所述防晒霜的配方如表1所示：
表1一种蛋白脂质体FNL的防晒霜
Figure BDA0002241801040000051
按表1的配方：将A1与A2单独加热至60℃，全部溶解后保温；将二氧化钛用超声波分散器均匀分散于去离子水中并加热至60℃保温，边搅拌边将B相其余成分加入，确保全部溶解之后在搅拌的条件下将B相加入己混好的(A1+A2)相乳化；然后加入C相，冷却至室温，停止搅拌，出料得样品。
实施例4、一种含有蛋白脂质体FNL的乳液
所述乳液的配方如表2所示：
表2一种含有蛋白脂质体FNL的乳液
Figure BDA0002241801040000052
按表2的配方：先将B相预混合，加热到80℃，用三乙醇胺调节pH，逐步加入预加热的A相成分，搅拌均匀，冷却后，逐步再加入C相成分，搅拌均匀。
试验例一、蛋白脂质体FNL的稳定性试验
1、试验材料：
实施例2制备得到的蛋白脂质体FNL。
2、试验方法：
2.1、稳定性考察：
将实施例2制备得到的蛋白脂质体FNL溶于水，将纤连蛋白水溶液于温度4，25，35℃下、相对湿度75％条件下密闭放置。分别于放置0、7、15、30、60d后，采用Abbott诊断试剂盒(Abbott diagnostics test kits，Abbott，USA)应用AEROSET自动生化分析仪(Abbott，USA)进行测定脂质体和水溶液中纤连蛋白的含量，以0d时脂质体和水溶液中纤连蛋白含量为100％，其他各时间纤连蛋白含量与之作比较，得出纤连蛋白含量随时间变化百分率。
以上测定重复三次，取平均值。
2.2、脂质体包封率的测定：
本试验选择高速离心法将蛋白脂质体FNL与游离纤连蛋白进行分离。移液管吸取蛋白脂质体FNL1ml置于离心管中，于低温高速(15000g/min)条件下离心30min，精密吸取上清液并用甲醇定容至1mL，采用Abbott诊断试剂盒测定纤连蛋白的含量，记为W游。再取1mL载药脂质体加入甲醇稀释至5ml，超声3min破乳，采用Abbott诊断试剂盒测定载药脂质体中纤连蛋白的含量，记为W总。计算出脂质体的包封率：
包封率(％)＝1-W游/W总*100％；
分别将上述经过实施例2制备的蛋白脂质体FNL置于温度4，25，35℃下、相对湿度75％条件下密闭放置。分别于放置后0、1、3、5、10、30、60、90d考察其包封率。
3、试验结果：
3.1、稳定性考察结果：结果表明，经温度35℃、相对湿度75％条件下，放置60d，纤连蛋白在脂质体复合物中的含量变化不大，而在水溶液中含量降低，证实用脂质体包封后，明显增强了纤连蛋白的稳定性。
3.2、脂质体包封率的测定结果如表3所示。
表3不同条件下蛋白脂质体FNL的包封率(％)考察
0天 1天 3天 5天 10天 30天 60天 90天
4℃ 76.30 75.90 73.62 72.25 69.93 64.36 57.19 54.56
25℃ 76.30 75.05 70.60 68.85 60.78 52.45 44.18 39.96
35℃ 76.30 73.29 67.54 58.81 47.34 30.25 23.95 18.58
试验例二、蛋白脂质体FNL的透皮吸收性
1、试验材料：
实施例2制备得到的蛋白脂质体FNL。
2、试验方法：
2.1、离体皮肤制备：20只Wistar雌性小鼠，将鼠断颈处死后，剪去腹部毛，分离腹部皮肤，用干净的脱脂棉蘸生理盐水小心地去除皮下组织和脂肪等。洗净后用滤纸吸干，用铝箔包裹后放入冰箱(-20℃)保存。实验前小鼠皮肤于室温下自然解冻，浸泡在生理盐水0.5h。每次实验前检查皮肤的完整性，选择完整皮肤进行实验。
2.2、透皮吸收测定：将同一小鼠鼠皮剪成大小适宜的2块，在接收室中注入生理盐水接收液6.87mL，将鼠皮置于透皮吸收试验装置的供给池与接收池结合处，角质层一面与供给池接触，使液面完全与皮肤内层接触，用弹簧夹固定结合处。分别在两个扩散池内加入等量的纤连蛋白水溶液，及实施例2制备得到的蛋白脂质体FNL，加样平衡30min。开启电磁恒温搅拌器，温度37℃±2℃，200r/min恒速搅拌，分别于0.5、1、2、4、6、8、12和24h从接收池中取样0.5mL，同时补加0.5mL生理盐水并排尽气泡。采用Abbott诊断试剂盒测定两个接收池中不同时间透皮液中蛋白质含量，计算每平方厘米皮肤中纤连蛋白的累积渗透量(Qn)。
Qn＝(CnVn+ΣCkVk)/S×100％
式中：Cn—第n个取样点测得的蛋白质浓度(mg/mL)；Ck—第n个取样点前所有取样点相对应测得的蛋白质浓度(mg/mL)；Vn—接收液体积(mL)；Vk—第n个取样点前所有取样点相对应的取样体积(mL)；S—有效扩散面积。
3、试验结果：
试验结果如图1所示。
试验例三、含蛋白脂质体FNL防晒霜的防晒性能测试
1、试验材料：
实施例3制得的含有蛋白脂质体FNL的防晒霜。
2、试验方法：
用美国Optometrics公司的SPF防晒指数测试仪测试不添加纤连蛋白的防晒霜、添加纤连蛋白纯品的防晒霜、实施例3制得的含有蛋白脂质体FNL的防晒霜其防晒效果。
3、试验结果：
不添加纤连蛋白的防晒霜SPF值为3.29，添加纤连蛋白纯品的防晒霜的SPF值为4.1，实施例3制得的含有纤连蛋白质脂质体防晒霜的SPF值为6.5。说明纤连蛋白被脂质体脂质体包埋后，其防晒性能得到了很大的提高。
试验例四、含蛋白脂质体FNL乳液试用效果实验
1、试验材料：
实施例4制得的含有蛋白脂质体FNL的乳液。
2、试验方法：
选择150名成年女性志愿者参加免费试用活动，随即分为三组，50人为一组，要求各组都每天早晚使用一次，按照常规方法使用三种不同的乳液，分别考察不添加纤连蛋白的乳液、添加纤连蛋白纯品的乳液、实例3制得的添加蛋白脂质体FNL的乳液这三种样品对使皮肤恢复自然弹性，防止皮肤皱纹和粗糙、滋润强度，淡化细纹等几个方面的改善情况并进行定期信息反馈。
3、试验结果：
100日后，使用普通乳液(也就是乳液中不添加纤连蛋白)的志愿者皮肤状况几乎没有什么改善；使用乳液中直接添加纤连蛋白的志愿者，其皮肤光泽及肤色有部分改善；使用乳液中添加纤连蛋白的志愿者，其不仅在皮肤光泽和肤色方面有明显的改善，而且皮肤皱纹、色素得到淡化，皮肤弹性也有所增强，而且志愿者对产品感觉舒适，也观察不出产品对皮肤的刺激。

Claims (7)

1.一种蛋白脂质体FNL的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1采集新鲜动物血，加入柠檬酸钠抗凝，离心，收集上部血浆。向收集到的血浆中加入硫酸铵至饱和度为30％，静置2小时，过滤收集沉淀并再次溶解后，亲和层析柱分离提取，分子筛纯化，除菌后得纤连蛋白溶液I；
S2取氢化卵磷脂、胆固醇、维生素E溶于适量三氯甲烷中，转移溶液至旋转瓶，于20～30℃、100～200r/min的条件下旋蒸去除三氯甲烷，形成均匀薄膜；
S3将步骤S1收集得到的纤连蛋白溶于磷酸盐缓冲液，并加入蛋白保护剂，充分混匀后加入步骤S2得到的均质薄膜中，于40℃旋转蒸发水合一定时间，即得脂质体粗品；所述磷酸盐缓冲液的用量为每0.1～10mg纤连蛋白使用10mL磷酸盐缓冲液；
S4将步骤S3得到的脂质体粗品超声混匀，并用0.45μm微孔滤膜挤压整粒，即得粒径均匀的蛋白脂质体FNL，于4℃保存。
2.如权利要求1所述的蛋白脂质体FNL的制备方法，其特征在于，所述步骤S1动物血与3.8％柠檬酸钠抗凝剂的体积比为9：1，离心条件为1500rpm，离心时间为15min；所述的亲和层析柱是明胶-琼脂糖凝胶2B，所述的分子筛层析柱是葡聚糖凝胶G75。
3.如权利要求1所述的蛋白脂质体FNL的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中氢化卵磷脂、胆固醇、维生素E与三氯甲烷的固液比为5g:2g:1g:200ml。
4.如权利要求1所述的蛋白脂质体FNL的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M，pH为6.5。
5.如权利要求1所述的蛋白脂质体FNL的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中的蛋白质保护剂为质量浓度为0.1％的牛血清白蛋白溶液。
6.如权利要求1所述的蛋白脂质体FNL的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中所述超声条件为功率200～400W，频率20～40KHz。
7.如权利要求1～6任一所述的蛋白脂质体FNL的制备方法制备得到的蛋白脂质体FNL在制备护肤品中的用途。
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