CN114159554A - 一种纤连蛋白-聚乙烯醇微球的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纤连蛋白‑聚乙烯醇微球的制备方法及其应用，该方法包括如下步骤：将石蜡和乳化剂混合，形成油相溶液，向油相溶液中滴加聚乙烯醇微球，65～75℃乳化；向乳化后的溶液中加入纤连蛋白，然后加入戊二醛和酸性溶液，离心分离沉淀，即得。本发明中制得的纤连蛋白‑聚乙烯醇微球透皮吸收率高，有效的保护了纤连蛋白，从而具有美白、抗衰、保湿、修复等功效，而且制备方法简单，无需赋形剂和增塑剂，容易实现，适合工业化生产。

Description

一种纤连蛋白-聚乙烯醇微球的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种纤连蛋白-聚乙烯醇微球的制备方法及其应用。
背景技术
纤连蛋白(fibronectin，FN)是一种广泛存在于血液、体液及各种组织中的高分子糖蛋白，分子质量为450ku。FN是由由两个分子质量为220ku的亚基通过链间二硫键连接而成。其亚基有6个致密的球状体，每一区均有特定的功能，可与特殊的配体结合，具有多种生物学功能。FN广泛参与多种生物反应过程，可调动单核吞噬细胞系统清除损伤组织有害物质，为细胞提供营养和信息通道。此外，FN也是国药监局《关于已使用化妆品原料名称目录的公告》(IECI2015版)中登记在册的合法合规原料，可以应用于化妆品中。然而，FN作为一种高分子糖蛋白，直接添加使用无法使皮肤吸收，不能产生其应有的有效使用效果。
聚乙烯醇(PVA)是由聚醋酸乙烯经醇解、水解或氨解而得的一种用途当广泛的水溶性高分子聚合物，结构式为－[CH2CH(OH)]n－，分子主链为碳链，每一个重复单元上含有一个羟基，聚乙烯醇分子间存在的氢键使其具有良好的化学稳定性和热稳定性，而其分子链上的大量-OH又使其具有较强的亲水性、成膜性、黏结力和乳化性，良好的耐油脂性和耐溶剂性，可以和甲醛、戊二醛、环氧氯丙烷、柠檬酸、酒石酸等发生化学交联反应，在生物医学和化妆品等众多领域具有广泛的应用。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种纤连蛋白-聚乙烯醇微球及其制备方法，本发明通过利用聚乙烯醇微球对纤连蛋白进行包封处理，从而保护纤连蛋白，防止其与其他物质相互干扰，也避免了其与外界因素的接触，降低了纤连蛋白降解或损伤的可能性，而且聚乙烯醇微球强化了纤连蛋白的透皮吸收效果，提高其效果的稳定性，降低其对皮肤的刺激性。
本发明的第一个方面，提供一种纤连蛋白-聚乙烯醇微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)将石蜡和乳化剂混合，形成油相溶液，向油相溶液中滴加聚乙烯醇微球，65～75℃乳化；
(2)向乳化后的溶液中加入纤连蛋白，然后加入戊二醛和酸性溶液，离心分离沉淀，即得。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述石蜡为液体石蜡。所述乳化剂包括SP-80、SP-60和SP-305中的至少一种，在本发明的一些实施方式中，所述乳化剂为SP-80。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述聚乙烯醇微球可以通过悬浮分散法或乳液聚合法制备得到，粒径分布在0.1μm-1200μm，具有高比表面积、强吸附性、良好的生物相容性和水溶性、安全、无毒、对皮肤无刺激、环境污染小等优点。
在本发明的一些优选实施方式中，所述聚乙烯醇微球的制备方法为：取1g聚乙烯醇(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)，在9mL去离子水中浸泡使其吸收水分至完全溶胀，再将溶液在80℃下搅拌至完全溶解，即得。
在本发明的一些优选实施方式中，所述聚乙烯醇微球为粒径为0.4～0.5μm的白色交联微球。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述酸性溶液包括盐酸。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述油相溶液与聚乙烯醇微球的体积比为：9～10:1～2。
在本发明的一些优选实施方式中，所述油相溶液与聚乙烯醇微球的体积比为：10:2。
其中，聚乙烯醇微球的浓度为0.11～0.23g/mL。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述聚乙烯醇微球、石蜡和乳化剂的加入量比例为：1～2g：50～100mL：2～4g。
在本发明的一些优选实施方式中，所述聚乙烯醇微球、石蜡和乳化剂的加入量比例为：1g：50mL：2g。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述聚乙烯醇微球、石蜡、乳化剂与体系中的水的比例为：1g:50mL:2g:9mL。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述纤连蛋白与聚乙烯醇微球的加入量比例为1～2mg：10～20g。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述聚乙烯醇微球中还含有牛血清白蛋白。
牛血清白蛋白主要起到蛋白质保护剂的作用，能够防止在制备过程中对于纤连蛋白的破坏。
在本发明的一些优选实施方式中，所述聚乙烯醇微球中还含有磷酸盐缓冲液。所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M，pH为6.5。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述制备方法还包括：(3)超声处理和整粒处理。
在本发明的一些优选实施方式中，所述超声功率200～400W，频率20～40KHz。
在本发明的一些优选实施方式中，所述整粒处理用于获得粒径统一的纤连蛋白-聚乙烯醇微球，采用的方法包括使用微孔滤膜挤压整粒。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述纤连蛋白为市售产品或提取制备得到。
在本发明的一些优选实施方式中，所述纤连蛋白提取自动物血。具体提取方法为：采集新鲜动物血，加入3.8％柠檬酸钠抗凝(动物血与柠檬酸钠的体积比为9：1)，1500rpm离心15min，收集上部血浆。向收集得到的血浆中加入硫酸铵至饱和度为30％，静置2h，过滤收集沉淀。用磷酸盐缓冲液再次溶解后，使用明胶-琼脂糖凝胶2B亲和层析柱分离提取，葡聚糖凝胶G75分子筛纯化，灭菌后得到纤连蛋白溶液。
在本发明的一些优选实施方式中，所述纤连蛋白-聚乙烯醇微球制备方法具体为：取液体石蜡，加入乳化剂SP-80，高速搅拌形成连续油相。将聚乙烯醇溶液缓慢滴加到油相中(油相与聚乙烯醇溶液的体积比为10:2)，在70℃下搅拌乳化得到分散均匀的含有聚乙烯醇的油包水体系。其中，聚乙烯醇颗粒、液体石蜡、乳化剂SP-80与水的固液比为1g:50mL:2g:9mL。将纤连蛋白溶液加入至含有聚乙烯醇的油包水体系中，然后加入戊二醛和盐酸，持续搅拌3h，离心分离出沉淀，洗涤后干燥即得纤连蛋白-聚乙烯醇微球。对纤连蛋白-聚乙烯醇微球进行超声处理(超声功率200～400W，频率20～40KHz)，0.45μm微孔滤膜挤压整粒，即得粒径均匀的纤连蛋白-聚乙烯醇微球。
发明人发现，本发明实施例中制备得到的纤连蛋白-聚乙烯醇微球可以促进细胞往色素沉积部位迁移，并刺激细胞分泌黑色素代谢酶，从而清除色斑；其还可以修复黑色素细胞，保证黑色素细胞的正常状态。而黑色素细胞正常分泌黑色素，由黑色素小体运送至表皮，起到防晒的作用。此外，纤连蛋白-聚乙烯醇微球可以调集周围正常的细胞去代替损伤的细胞，当皮肤内部缺乏保湿因子时，也可以刺激细胞分泌保湿因子并调动周围的保湿因子到皮肤，从而有效修复晒伤。本发明实施例中制备得到的纤连蛋白-聚乙烯醇微球还能够刺激细胞分泌胶原蛋白、弹性蛋白、网状纤维等，填充皮肤塌陷部位，刺激细胞分泌抗氧化酶，清除体内过多的自由基等。综上，本发明实施例中制备得到的纤连蛋白-聚乙烯醇微球具有清除色斑、防晒、晒后修复、保湿、抗衰祛皱、修复等多重功效，具有极高的应用前景。
本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述制备方法制得的纤连蛋白-聚乙烯醇微球。
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述微球纤连蛋白-聚乙烯醇微球为粒径0.4～0.5μm的白色交联微球。
本发明的第三个方面，提供含有本发明第二个方面所述纤连蛋白-聚乙烯醇微球的产品。
根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述产品包括化妆品或药品。
在本发明的一些优选实施方式中，所述化妆品包括液体类化妆品、乳液化妆品和膏霜类化妆品。
在本发明的一些优选实施方式中，所述液体类化妆品包括洗面乳、化妆水、精华液、原液、爽肤水。所述乳液化妆品包括蜜类、奶类、精华乳。所述膏霜类化妆品包括润面霜、遮瑕膏、精华霜、妆前霜。
在本发明的一些优选实施方式中，所述药品为外用型药物，包括贴剂、膏药、喷雾。
根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，按质量份计，所述产品的制备原料包括：0.1～0.2份甲酯，0.6～0.7份山梨坦硬脂酸酯，2.0～2.5份聚山梨醇酯-60，1～1.5份鲸蜡硬脂醇，3～4份聚二甲基硅氧烷，0.5～0.6份生育酚乙酸酯，5～5.5份白油，0.05～0.06份EDTA二钠，0.2～0.25份尿囊素，0.05～0.06份透明质酸钠，0.25～0.3份卡波941，0.2～0.25份烟酰胺，5～6份丙二醇，0.25～0.3份三乙醇胺，0.5～0.6份2-苯氧基乙醇，6～10份纤连蛋白-聚乙烯醇微球，0.2～0.3份酵母菌发酵滤液，0.05～0.1份七肽-6。
在本发明的一些优选实施方式中，按质量份计，所述产品的制备原料包括：0.1份甲酯，0.6份山梨坦硬脂酸酯，2.0份聚山梨醇酯-60，1份鲸蜡硬脂醇，3份聚二甲基硅氧烷，0.5份生育酚乙酸酯，5份白油，0.05份EDTA二钠，0.2份尿囊素，0.05份透明质酸钠，0.25份卡波941，0.2份烟酰胺，5份丙二醇，0.25份三乙醇胺，0.5份2-苯氧基乙醇，6份纤连蛋白-聚乙烯醇微球，0.2份酵母菌发酵滤液，0.05份七肽-6。
根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，按质量份计，所述产品的制备原料包括：0.03～0.04份EDTA二钠，0.05～0.06份透明质酸钠，0.2～0.25份尿囊素，0.05～0.06份卡波941，5～6份甘油，6～7份丙二醇，7～8份丁二醇，0.05～0.06份三乙醇胺，0.5～0.6份2-苯氧基乙醇，5～10份纤连蛋白-聚乙烯醇微球，0.5～0.6酵母菌发酵滤液，0.5～0.6份七肽-6。
在本发明的一些优选实施方式中，按质量份计，所述产品的制备原料包括：0.03份EDTA二钠，0.05份透明质酸钠，0.2份尿囊素，0.05份卡波941，5份甘油，6份丙二醇，7份丁二醇，0.05份三乙醇胺，0.5份2-苯氧基乙醇，5份纤连蛋白-聚乙烯醇微球，0.5酵母菌发酵滤液，0.5份七肽-6。
本发明的第四个方面，提供本发明第二个方面所述纤连蛋白-聚乙烯醇微球在制备药品或化妆品中的应用。
根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述药品或化妆品具有增强细胞修复、保水补湿和抑制黑色素生成的作用。
本发明制得的纤连蛋白-聚乙烯醇微球产品可以为冻干产品的形式。通过聚乙烯醇微球的包封的纤连蛋白可以提高纤连蛋白的稳定性和透皮吸收率，同时还可以增强纤连蛋白的防晒、晒后修复、保湿、抗衰祛皱、修复的作用，延长作用时间，降低了护肤品中纤连蛋白的添加量。
本发明的有益效果是：
(1)本发明提供的纤连蛋白-聚乙烯醇微球的制备方法是利用聚乙烯醇微球对动物血纤连蛋白进行包封，保护纤连蛋白，防止其与护肤品配方中其他物质的相互干扰，又避免与外界因素的接触，降低了被风干的可能性，还可以避免纤连蛋白的降解与变质，提高其本身的稳定性，并降低其对皮肤的刺激性。
(2)本发明提供的纤连蛋白-聚乙烯醇微球的制备方法制得的纤连蛋白-聚乙烯醇微球的透皮吸收率高，可以大大促进皮肤的吸收和利用，更有利于纤连蛋白发挥美白、保湿、修复、抗衰的作用。
(3)本发明的纤连蛋白采用可以自发地包裹在聚乙烯醇微球中，避免了添加赋形剂和增塑剂，工艺过程简单，容易实现，且非常容易放大，适合工业化生产。
附图说明
图1为本发明实施例中不同放置温度下纤连蛋白-聚乙烯醇微球的包封率。
图2为本发明实施例中纤连蛋白的三种溶液的头皮吸收能力对比。
图3为本发明实施例中纤连蛋白的三种溶液、空白组和阳性对照(10％胎牛血清)对细胞层划痕愈合情况的对比，其中，A为细胞层划痕的显微镜观测图；B为愈合率的对比图。
图4为本发明实施例中纤连蛋白的三种溶液与空白组的细胞粘附率对比。
图5为本发明实施例中对比例1～3与实施例1中的化妆品的效果测试结果，其中，A为角质层水分含量差异；B为黑色素含量变化率；C为皱纹占比。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
实施例1
本实施例提供了纤连蛋白-聚乙烯醇微球的制备方法，包括以下步骤：
1.纤连蛋白的制备：
采集新鲜动物血90mL，加入10mL 3.8％柠檬酸钠抗凝(动物血与柠檬酸钠的体积比为9：1)，1500rpm离心15min，收集上部血浆。向收集得到的血浆中加入硫酸铵至饱和度为30％，静置2h，过滤收集沉淀。用磷酸盐缓冲液再次溶解后，使用明胶-琼脂糖凝胶2B亲和层析柱分离提取，葡聚糖凝胶G75分子筛纯化，灭菌后得到纤连蛋白溶液。
2.聚乙烯醇体系的制备：
取1g聚乙烯醇(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)，在9mL去离子水中浸泡使其吸收水分至完全溶胀，再将溶液在80℃下搅拌至完全溶解，得到无色、透明且有一定粘度的质量比为10％的聚乙烯醇溶液。然后取液体石蜡，加入乳化剂SP-80，高速搅拌形成连续油相。将1mL聚乙烯醇溶液缓慢滴加到油相中(油相与聚乙烯醇溶液的体积比为10:2)，在70℃下搅拌乳化40min，得到分散均匀的含有聚乙烯醇的油包水体系。其中，在本实施例中，聚乙烯醇、液体石蜡、乳化剂SP-80与去离子水的固液比为1g:50mL:2g:9mL。
3.纤连蛋白-聚乙烯醇微球的制备：
取0.1mg步骤1制备得到的纤连蛋白溶于1mL磷酸盐缓冲液(0.1M，pH6.5)，加入0.1％的牛血清白蛋白溶液，充分混匀后向其中加入步骤2制备得到聚乙烯醇体系。然后向体系中加入0.05mL 50％戊二醛和0.04mL 1mol/mL盐酸，持续搅拌3h后，终止反应。1500rpm，离心15min分离出白色沉淀，去离子水反复洗涤后置于冷冻干燥箱中冻干48h后，即得载蛋白微球溶液(纤连蛋白-聚乙烯醇微球)。
4.对步骤3制备得到载蛋白微球溶液进行超声处理(超声功率200～400W，频率20～40KHz)，并用0.45μm微孔滤膜挤压整粒，即得粒径均匀的纤连蛋白-聚乙烯醇微球，制得后的纤连蛋白-聚乙烯醇微球可于4℃保存备用。
实施例2
本实施例提供了纤连蛋白-聚乙烯醇微球的制备方法，包括以下步骤：
1.纤连蛋白的制备：
采集新鲜动物血900mL，加入100mL 3.8％柠檬酸钠抗凝(动物血与柠檬酸钠的体积比为9：1)，1500rpm离心15min，收集上部血浆。向收集得到的血浆中加入硫酸铵至饱和度为30％，静置2h，过滤收集沉淀。用磷酸盐缓冲液再次溶解后，使用明胶-琼脂糖凝胶2B亲和层析柱分离提取，葡聚糖凝胶G75分子筛纯化，灭菌后得到纤连蛋白溶液。
2.聚乙烯醇体系的制备：
取10g聚乙烯醇(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)，在90mL去离子水中浸泡使其吸收水分至完全溶胀，再将溶液在80℃下搅拌至完全溶解，得到无色、透明且有一定粘度的质量比为10％聚乙烯醇溶液。然后取液体石蜡，加入乳化剂SP-80，高速搅拌形成连续油相。将10mL聚乙烯醇溶液缓慢滴加到油相中(油相与聚乙烯醇溶液的体积比为10:2)，在70℃下搅拌乳化40min，得到分散均匀的含有聚乙烯醇的油包水体系。其中，在本实施例中，聚乙烯醇颗粒、液体石蜡、乳化剂SP-80与去离子水的固液比为1g:50mL:2g:9mL。
3.纤连蛋白-聚乙烯醇微球的制备：
取0.5mg步骤1制备得到的纤连蛋白溶于10mL磷酸盐缓冲液(0.1M，pH6.5)，加入0.1％的牛血清白蛋白溶液，充分混匀后向其中加入步骤2制备得到聚乙烯醇体系。然后向体系中加入0.5mL 50％戊二醛和0.4mL 1mol/mL盐酸，持续搅拌3h后，终止反应。1500rpm，离心15min分离出白色沉淀，去离子水反复洗涤后置于冷冻干燥箱中冻干48h后，即得载蛋白微球溶液(纤连蛋白-聚乙烯醇微球)。
4.对步骤3制备得到载蛋白微球溶液进行超声处理(超声功率250W，频率35KHz)，并用0.45μm微孔滤膜挤压整粒，即得粒径均匀的纤连蛋白-聚乙烯醇微球，制得后的纤连蛋白-聚乙烯醇微球可于4℃保存备用。
纤连蛋白-聚乙烯醇微球的效果评估
1.纤连蛋白-聚乙烯醇微球稳定性测试：
本实施例采用高速离心法将实施例2制备得到的纤连蛋白-聚乙烯醇微球与游离纤连蛋白进行分离，以测定制备得到的纤连蛋白-聚乙烯醇微球的包封率，并以此评估纤连蛋白-聚乙烯醇微球的稳定性。
具体检测步骤为：取1mL实施例2制备得到的纤连蛋白-聚乙烯醇微球，加水溶解。低温高速(4℃、15000g/min)条件下离心30min，吸取上清液并用甲醇定容至1mL，使用Abbott诊断试剂盒(Abbott diagnostics test kits)测定纤连蛋白的含量(测定方法参考使用说明书，检测仪器为AEROSET自动生化分析仪)，测得的纤连蛋白含量记为W游。另取1mL纤连蛋白-聚乙烯醇微球加入甲醇稀释至5mL，超声3min，，使用Abbott诊断试剂盒测定纤连蛋白的含量(测定方法参考使用说明书)，测得的纤连蛋白含量记为W总。根据包封率公式计算纤连蛋白-聚乙烯醇微球的包封率。
包封率公式为：
Figure BDA0003367838490000081
根据上述包封率检测方法，分别测定实施例2制备得到的纤连蛋白-聚乙烯醇微球在4，25，35℃下、相对湿度75％条件下密闭放置0、7、15、30、60d、90d后的包封率，以0d时纤连蛋白-聚乙烯醇微球和游离的纤连蛋白含量为100％，与其他各时间纤连蛋白含量作比较，得出纤连蛋白含量随时间变化百分率。测定重复三次，取平均值。
结果如图1所示。
可以发现，即便保存温度达到4～25℃，相对湿度为75％的条件下，放置90d后，实施例2制备得到的纤连蛋白-聚乙烯醇微球的包封率虽然有所下降，但下降幅度不显著，证明采用上述实施例中的方法制备得到的纤连蛋白-聚乙烯醇微球对于纤连蛋白的稳定性具有较好的增强作用。在35℃放置条件下，虽然在10d后的包封率有明显下降，但其短效(10d内)的稳定性依然保持在一个较高水平。
2.纤连蛋白-聚乙烯醇微球的透皮吸收效果：
在本实施例中，使用小鼠皮肤作为试验材料，验证实施例2制备得到的纤连蛋白-聚乙烯醇微球的透皮吸收效果。
其中，小鼠离体皮肤的制备方法为：取20只Wistar雌性小鼠，鼠颈椎脱臼处死后，剪去腹部毛，分离腹部皮肤，用干净的脱脂棉蘸生理盐水小心地去除皮下组织和脂肪等。洗净后用滤纸吸干，用铝箔包裹后放入冰箱(-20℃)保存。实验前小鼠皮肤于室温下自然解冻，浸泡在生理盐水30min。每次实验前检查皮肤的完整性，选择完整皮肤进行实验。
纤连蛋白-聚乙烯醇微球透皮吸收效果的测定步骤为：将同一小鼠的鼠皮剪成大小适宜的3块，在透皮吸收试验装置(TP-6，天津市精拓仪器科技有限公司)接收室中注入生理盐水接收液6.87mL，将鼠皮置于透皮吸收试验装置的供给池与接收池结合处，角质层一面与供给池接触，使接收液液面完全与皮肤内层接触，用弹簧夹固定结合处。分别在三个扩散池内加入等量的纤连蛋白水溶液、纤连蛋白-脂质体(制备方法为取氢化卵磷脂、胆固醇、维生素E溶于适量三氯甲烷中，转移溶液至旋转瓶，于20～30℃、100～200r/min的条件下旋蒸去除三氯甲烷，形成均匀薄膜，将收集得到的纤连蛋白溶于磷酸盐缓冲液，并加入蛋白保护剂，充分混匀后加入得到的均质薄膜中，于40℃旋转蒸发水合一定时间，即得脂质体粗，再将其超声混匀，并用0.45μm微孔滤膜挤压整粒，即得)、实施例2制备得到的纤连蛋白-聚乙烯醇微球，平衡30min。开启电磁恒温搅拌器，温度设置为37℃±2℃，200r/min恒速搅拌，分别于0.5、1、2、4、6、8、10、12、14和24h从接收池中取样0.5mL，同时补加0.5mL生理盐水并排尽气泡。采用Abbott诊断试剂盒测定两个接收池中不同时间点的纤连蛋白含量计算每平方厘米皮肤中纤连蛋白的累积渗透量(Qn)。
累积渗透量的计算公式为：
Figure BDA0003367838490000091
式中，Cn表示第n个取样点测得的纤连蛋白浓度(mg/mL)；
Ck表示第n个取样点前所有取样点相对应测得的纤连蛋白浓度(mg/mL)；
Vn表示第n个取样点的接收液体积(mL)；
Vk表示第n个取样点前所有取样点相对应的取样体积(mL)；
S表示有效扩散面积(用于实际检测的鼠皮面积)。
结果如图2所示。
从结果可以发现，实施例2制备得到的纤连蛋白-聚乙烯醇微球的透皮吸收效果要优于纤连蛋白水溶液和纤连蛋白-脂质体，说明实施例2制备得到的纤连蛋白-聚乙烯醇微球相对于传统的纤连蛋白试剂具有更好的吸收效果，更有利于开发相关的药物及化妆品。
3.纤连蛋白-聚乙烯醇微球对人角质细胞迁移的影响：
为了进一步探究实施例2制备得到的纤连蛋白-聚乙烯醇微球对于皮肤的修复效果，本实施例以人角质细胞作为试验对象，检测其对于人角质细胞迁移的影响。
具体试验方法为：
取人角质细胞(HaCaT)种于6孔板中，待其贴壁长满孔底，用移液器吸头对人角质细胞层进行划痕处理，使孔底细胞层上出现一条空白(无细胞)的直线划痕，用磷酸盐缓冲液洗去由于划痕而悬浮的细胞。以等量的水、纤连蛋白水溶液、纤连蛋白-脂质体和10％的胎牛血清(阳性对照)作为对照，使用无血清的基础培养基稀释实施例2制备得到的纤连蛋白-聚乙烯醇微球至50％(v/v)，加入孔中，培养48h。
在培育开始0h、24h、48h分别对人角质细胞层进行拍照，使用识别软件计算划痕面积，计算划痕的愈合率。
愈合率计算公式为：
Figure BDA0003367838490000092
结果如图3所示。
从图3可以发现，使用阳性对照及实施例2制备得到的纤连蛋白-聚乙烯醇微球的组在24h后划痕区域基本消失或不明显，而使用水、纤连蛋白水溶液、纤连蛋白-脂质体的组则相对能够明显分辨出划痕。而且从愈合率印证上述结论，纤连蛋白-聚乙烯醇微球的愈合率虽然在一定程度上要弱于阳性对照，但相比于常规的纤连蛋白-脂质体以及纤连蛋白水溶液的愈合效果还是具有显著优势的，从而可以说明上述实施例制备得到的纤连蛋白-聚乙烯醇微球具有较好的细胞修复能力。
4.纤连蛋白-聚乙烯醇微球对人角质细胞的粘附效果：
具体试验方法为：
使用细胞粘附检测试剂盒(购于北京百奥莱博科技有限公司)中的包被液(100μL)包被96孔板，置于2-8℃过夜。移除包被液，用细胞粘附检测试剂盒中的洗涤液洗涤2-3次。取人角质细胞(HaCaT)培养，胰酶消化，PBS洗涤，然后取等量的水(空白对照)、纤连蛋白水溶液、纤连蛋白-脂质体和实施例2制备得到纤连蛋白-聚乙烯醇微球，用完全培养基稀释50％重悬。按5×104细胞/孔的密度将人角质细胞接种包被好的96孔板，4个复孔，37℃培养箱孵育0.5-1h。培养结束后取出培养板，弃去培养基(对照组细胞不弃去培养基)，用培养基洗涤2-3次后每孔加入100μL新鲜培养基。
每孔加入10μL细胞染色液B(取自细胞粘附检测试剂盒)，37℃孵育30min，测定OD450，计算细胞粘附率。
细胞粘附率计算公式为：
Figure BDA0003367838490000101
式中，待测细胞OD为弃去培养基测得的OD；
对照细胞OD为不弃去培养基测得的OD。
结果如图4所示。
由图4可以看出，使用实施例2制备得到纤连蛋白-聚乙烯醇微球后的细胞粘附率要显著优于纤连蛋白水溶液和纤连蛋白-脂质体，说明利用聚乙烯醇微球包被后的纤连蛋白可以更长时间的粘附于角质表面，从而延长其作用时间，更有效的发挥纤连蛋白的作用功效。
实施例3
本实施例提供了一种含有上述实施例中制备得到的纤连蛋白-聚乙烯醇微球的爽肤水，其具体组分及含量如表1所示。
表1纤连蛋白-聚乙烯醇微球爽肤水的组分含量
Figure BDA0003367838490000102
Figure BDA0003367838490000111
该爽肤水的制备方法如下：
按照表1中的组分含量，将A相中的组分混合，边搅拌边加热至85℃-90℃，均质1min，搅拌保温30min，自然冷却至60-65℃时加入B相中的组分，搅拌均匀，自然冷却至40℃时按照表1中的顺序依次加入C相中的组分，搅拌均匀即得。
实施例4
本实施例提供了一种含有上述实施例中制备得到的纤连蛋白-聚乙烯醇微球的乳液，其具体组分及含量如表1所示。
表2纤连蛋白-聚乙烯醇微球乳液的组分含量
Figure BDA0003367838490000112
Figure BDA0003367838490000121
该乳液的制备方法如下：
按照表2中的组分含量，将A相中的组分混合后加热到80-85℃，使其完全溶解。然后将B相中的组分混合后加热到90-95℃，分散均匀后保温30min。将A相加入B相中，均质2-3min，搅拌保温30min，室温冷却至60-65℃后加入C相中的组分，搅拌均匀，室温冷却至45℃时按照表1中的顺序依次加入D相中的组分，搅拌均匀即得。
对比例1
对比例1中的乳液组分和制备方法同实施例4，区别在于：对比例1中不含有实施例2制得的纤连蛋白-聚乙烯醇微球。
对比例2
对比例2中的乳液组分和制备方法同实施例4，区别在于：对比例2中使用等量的纤连蛋白原液替代实施例4中的实施例2制得的纤连蛋白-聚乙烯醇微球。
对比例3
对比例3中的乳液组分和制备方法同实施例4，区别在于：对比例3中使用等量的纤连蛋白-脂质体(来源同上述实施例)替代实施例4中的实施例2制得的纤连蛋白-聚乙烯醇微球。
含有纤连蛋白-聚乙烯醇微球的化妆品的使用效果
以实施例4制得的含有纤连蛋白-聚乙烯醇微球的乳液为检测样品，检测其实际使用效果。
试验方法为：
随机选择200名成年女性受试者参加测试，50人为一组将其随机分为四组，分别使用对比例1～3和实施例4中的乳液，每日早晚各使用一次，检测周期为4周。
检测指标包括皮肤角质层水分含量、黑色素含量和皱纹占比情况。
角质层水分含量的检测方法参考QBT4256-2011化妆品保湿功效评价指南。
黑色素含量的检测方法参考T/ZHCA001-2018化妆品美白祛斑功效测试方法。
皱纹比例的检测方法参考T/ZHCA006-2019化妆品抗皱功效测试方法。
结果如图5所示。
由图5可以看出，使用对比例1～3和实施例4中的乳液4周后，受试者的角质层水分含量、黑色素含量和皱纹比例存在显著差异。4周后，使用普通水乳(对比例1)的受试者皮肤状况几乎没有什么改善，皮肤角质层水分含量、黑色素含量变化(其中，初始值得差异是由于个体差异导致)和皱纹占比情况均维持在固定的水平。使用直接添加纤连蛋白(对比例2)的受试者，其皮肤光泽及肤色有部分改善，但效果并不显著，对于黑色素产生的抑制效果相对较弱。使用对比例3和实施例4中的乳液的受试者均产生了显著的变化，但对比例3相对于实施例4而言，效果差异显著，使用实施例4的受试者不仅在皮肤光泽和肤色方面有明显的改善，而且皮肤皱纹、色素得到显著淡化，皮肤弹性也有所增强。对于对例3中的乳液，受试者的使用感受较相对实施例4较差，实施例4中的乳液更加清爽，且感觉舒适，无任何皮肤刺激性。说明基于上述实施例制备得到的纤连蛋白-聚乙烯醇微球制备得到的化妆品具有恢复皮肤自然弹性、防止皮肤皱纹和粗糙、提高皮肤水润度和淡化细纹等多重功效。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种纤连蛋白-聚乙烯醇微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)将石蜡和乳化剂混合，形成油相溶液，向油相溶液中滴加聚乙烯醇微球，65～75℃乳化；
(2)向乳化后的溶液中加入纤连蛋白，然后加入戊二醛和酸性溶液，即得。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述油相溶液与聚乙烯醇微球的体积比为：9～10:1～2。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯醇微球、石蜡和乳化剂的加入量比例为：1～2g：50～100mL：2～4g；所述纤连蛋白与聚乙烯醇微球的加入量比例优选为1～2mg：10～20g。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯醇微球中还含有质量浓度为0.001～0.01％的牛血清白蛋白溶液。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括：(3)超声处理和整粒处理。
6.权利要求1～5任一项所述的制备方法制得的纤连蛋白-聚乙烯醇微球，其特征在于，所述纤连蛋白-聚乙烯醇微球的粒径为0.4～0.5μm的交联微球。
7.一种产品，其特征在于，所述产品含有权利要求6所述纤连蛋白-聚乙烯醇微球。
8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，按质量份计，所述产品的制备原料包括：0.1～0.2份甲酯，0.6～0.7份山梨坦硬脂酸酯，2.0～2.5份聚山梨醇酯-60，1～1.5份鲸蜡硬脂醇，3～4份聚二甲基硅氧烷，0.5～0.6份生育酚乙酸酯，5～5.5份白油，0.05～0.06份EDTA二钠，0.2～0.25份尿囊素，0.05～0.06份透明质酸钠，0.25～0.3份卡波941，0.2～0.25份烟酰胺，5～6份丙二醇，0.25～0.3份三乙醇胺，0.5～0.6份2-苯氧基乙醇，6～10份纤连蛋白-聚乙烯醇微球，0.2～0.3份酵母菌发酵滤液，0.05～0.1份七肽-6。
9.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，按质量份计，所述产品的制备原料包括：
0.03～0.04份EDTA二钠，0.05～0.06份透明质酸钠，0.2～0.25份尿囊素，0.05～0.06份卡波941，5～6份甘油，6～7份丙二醇，7～8份丁二醇，0.05～0.06份三乙醇胺，0.5～0.6份2-苯氧基乙醇，5～10份纤连蛋白-聚乙烯醇微球，0.5～0.6酵母菌发酵滤液，0.5～0.6份七肽-6。
10.权利要求6所述纤连蛋白-聚乙烯醇微球在制备药品或化妆品中的应用；
所述药品或化妆品具有增强细胞修复、保水补湿和抑制黑色素生成的作用。
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