CN110812249B - 一种光甘草定立方液晶纳米粒及其抗皮肤光损伤的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种制备光甘草定立方液晶纳米粒以及制备方法和在抗皮肤光损伤方面的应用。所述光甘草定立方液晶纳米粒的制备方法为：将甘油单油酸酯加热搅拌至完全融化后加入光甘草定，混合均匀后再加入泊洛沙姆407，混合均匀，作为油相；然后取水作为水相，缓缓加入S3产物中，经搅拌、超声处理，再高压均质，即得光甘草定立方液晶纳米粒。本发明制备的光甘草定立方液晶纳米粒能够显著增加光甘草定的水溶性，增加生物膜的黏附性，提高光甘草定的生物利用度，对皮肤光损伤、光老化具有很好的治疗作用和应用前景。且本发明技术实用性强，也为类似于光甘草定的难溶性中药成份外用治疗皮肤病提供了新思路与新方法。

Description

一种光甘草定立方液晶纳米粒及其抗皮肤光损伤的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种光甘草定立方液晶纳米粒及其抗皮肤光损伤的应用。
背景技术
皮肤光损伤主要是指紫外线对皮肤造成的短期急性或长期慢性损伤的反应。急性光损伤主要表现为皮肤红斑、水肿、水疱等症状。慢性光损伤即光老化，主要表现为皱纹、色斑及皮革样病变等。
光甘草定对光损伤表现出的大而深的皱纹、色斑、皮肤修复性增厚等症状具有预防与治疗作用，可以外用治疗光损伤。但是光甘草定水溶性差，不是理想的经皮药物。
目前常规做法是将光甘草定改性为水溶性光甘草定来扩大其应用范围，如专利201810878903.8公开了一种水溶性光甘草定的制备方法，声称利用先进的微囊包裹技术将油溶性光甘草定改变为水溶性产品；但是文中并没有任何的数据来证明这一点。更为关键的是，水溶性光甘草定在高潮环境下稳定性差，同样应用受到限制。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种能够改善增加光甘草定的水溶性，增加生物膜的黏附性，提高光甘草定的生物利用度及稳定性的纳米制剂。
本发明的目的是提供一种制备光甘草定立方液晶纳米粒的方法。
本发明另一目的是提供制备得到的光甘草定立方液晶纳米粒。
本发明再一目的是提供所述光甘草定立方液晶纳米粒在抗皮肤光损伤方面的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种光甘草定立方液晶纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
S1.将甘油单油酸酯(GMO)加热搅拌至完全融化；
S2.向S1产物中加入光甘草定，混合均匀；
S3.向S2产物中加入泊洛沙姆407，混合均匀，作为油相；
S4.取水作为水相，缓缓加入S3产物中，搅拌，超声处理；
S5.步骤S4的产物经高压均质即得光甘草定立方液晶纳米粒(GLA-LCNPs)；
其中，所述甘油单油酸酯可以替换为甘油单亚油酸酯(GMLO)、二甘油油酸酯(DGMO)、磷脂酰乙醇胺(PE)、二亚油酰磷脂酰乙醇胺(DLPE)、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱(POPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、四甲基三羟基十六烷、植烷三醇(phytantriol)或Tween-80；所述泊洛沙姆407可以替换为稳定剂聚乙烯醇 (PVA)。
优选地，甘油单油酸酯：光甘草定：泊洛沙姆407的质量比为1：0.05～0.1： 0.1～0.2。
更优选地，甘油单油酸酯：光甘草定：泊洛沙姆407的质量比为1：0.075： 0.15。
优选地，步骤S1中加热搅拌的条件为50～70℃恒温水浴磁力搅拌。
更优选地，步骤S1中加热搅拌的条件为60℃恒温水浴磁力搅拌。
优选地，步骤S2中混合的过程中加入磁转子使其混合均匀。
优选地，步骤S3中混合的方式为搅拌。
优选地，步骤S4中取60℃水作为水相。优选地，所用水为纯净水。
优选地，步骤S4中水的用量标准为甘油单油酸酯：水＝1g：40～60mL。
更优选地，步骤S4中水先预热至50～70℃。
优选地，步骤S4中搅拌的条件为800～1200r/min磁力搅拌条件下搅拌1～ 3h。
更优选地，步骤S4中搅拌的条件为1000r/min磁力搅拌条件下搅拌2h。
优选地，步骤S4所述超声处理的方式为探头超声，探头超声的条件为900～ 1000W条件下探头超声4～8min(更优选950W条件下探头超声6min)。
更优选地，步骤S4所述超声处理的方式为先普通超声分散后，再探头超声，所述超声分散的条件为：300～400W条件下超声分散10～30min(更优选360W 条件下超声分散20min)。
最优选地，步骤S4的方法为取60℃预热的纯净水作为水相，缓缓加入S3 产物中，然后转移容器，补加至处方量的纯净水，在1000r/min磁力搅拌条件下搅拌2h，超声分散20min后，探头超声6min。
优选地，步骤S5中高压均质的条件为600～1000bar压力下高压均质。
更优选地，步骤S5中高压均质的条件为800bar压力下高压均质。高压均质的次数为10～15次(最优选12次)。
由于光甘草定本身难溶于水，用单体直接制备传统的凝胶剂生物利用度不高。立方液晶纳米粒(LCNPs)指两亲性脂质在过量水相中形成含双连续水区和闭合脂质双层的结构，LCNPs所用的载体材料可生物降解；有增溶、提高药物稳定性、促进药物吸收的作用。本发明制备立方液晶纳米粒的辅料甘油单油酸酯的熔点为36～40℃，常温为白色蜡质糊状，粘性大，正式由于这一特点，制备成的立方液晶纳米粒具有较高的黏度，粘附性高，能够粘附于生物膜而发挥持久的疗效。本实验所制备的纳米制剂凝胶中光甘草定立方液晶纳米粒皮肤滞留量最优。
因此，由上述方法制备得到的光甘草定立方液晶纳米粒，以及其在制备抗皮肤光损伤药物方面的应用，也均应在本发明的保护范围之内。
本发明具有以下有益效果：
本发明制备的光甘草定立方液晶纳米粒能够显著增加光甘草定的水溶性，增加生物膜的黏附性，提高光甘草定的生物利用度。
通过观察光甘草定立方液晶纳米粒凝胶对豚鼠光老化模型的疗效，肯定了光甘草定对光老化的治疗作用。
本发明技术实用性强，为类似于光甘草定的难溶性中药成份外用治疗皮肤病提供了新思路与新方法。
附图说明
图1光甘草定立方液晶纳米粒粒径图。
图2光甘草定立方液晶纳米粒Zeta电位图。
图3为光甘草定立方液晶纳米粒透射电镜图。
图4为光甘草定醇质体粒径和电位。
图5为光甘草定醇质体电镜图片。
图6为光甘草定各种制剂在离体鼠皮中的滞留量。
图7为豚鼠照射笼状态。
图8为光老化严重程度评分标准。
图9为豚鼠光老化造模前后肉眼观察照片。
图10为豚鼠皮肤组织病理改变HE及MASSON染色图(正常对照组；模型组)。
图11为治疗各组模型豚鼠皮肤外观图(A高剂量组；B低剂量组；C阳性对照组；D基质组)。
图12为各治疗组豚鼠皮肤组织病理改变HE染色图。
图13为各治疗组豚鼠皮肤组织病理改变MASSON染色图。
图14为光老化各组皮肤含水百分量图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明将光甘草定分别制成纳米制剂醇质体和立方液晶纳米粒，并通过测定各纳米制剂中光甘草定在离体鼠皮中的滞留量，优选出适合光损伤经皮给药的纳米制剂。而后建立光损伤模型，通过观察优选制剂对豚鼠光损伤模型的治疗效果来评价药物的疗效。具体研究实验记载如下实施例所示。
以下实施例所用材料：
仪器：高效液相色谱仪LC-2030C(日本岛津)，ST125D型十万分之一分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)，FA1004型万分之一分析天平(上海舜宇横平科学仪器有限公司)，SCIENTZ-ⅡD型超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，BT-50型超声波分散器(丹东市百特仪器有限公司)， SZ-100纳米颗粒分析仪(HORIBA)，高压均质机(ATS)，十万分之一分析天平EX225DZH(奥豪斯仪器有限公司)，万分之一分析天平(上海精密科学仪器有限公司)，磁力搅拌器SP88857106(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)。
试剂：光甘草定对照品(纯度≥98％，天津一方科技有限公司)，光甘草定 (纯度≥90％，南京普怡生物科技有限公司)，乙腈(色谱纯，天津康科德有限公司)，甲醇(色谱纯，天津康科德有限公司)，冰乙酸(分析纯，天津市化学试剂供销公司)，无水乙醇(分析纯，天津市江天化工技术有限公司)，娃哈哈纯净水(天津娃哈哈桶装水有限公司)，卵磷脂(上海迈瑞尔化学技术有限公司)，胆固醇(天津虔诚伟业科技发展有限公司)，十八胺(上海源叶生物科技有限公司)，氢氧化钠(天津市风船化学试剂科技有限公司)，磷酸二氢钾(天津市风船化学试剂科技有限公司)，葡聚糖凝胶G-10、G-25、G-50(北京索莱宝科技有限公司(产地：Pharmacia)，甘油单油酸酯(GMO，天津希恩思生化科技有限公司)、泊洛沙姆407(上海爱纯生物科技有限公司)、氯化钠(天津博迪化工有限公司)、乙二胺四乙酸(EDTA，天津市风船化学试剂科技有限公司)、其余均为分析纯。
以下实施例中所用到的方法学考察：
检测波长的确定：将光甘草定对照品溶液在200～500nm波长范围内进行紫外扫描，确定光甘草定的检测波长。
色谱条件：光甘草定的色谱条件：流动相乙腈-水-冰乙酸(55:44:1)，流速为1mL/min，检测波长为280nm，Hypersil ODS色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，柱温为30℃，进样量为10μl。
标准曲线的建立：精密称取光甘草定标准品2.25mg，置于25mL容量瓶中，以甲醇定容，制得浓度为90mg/L的标准品储备液。将标准品储备液稀释，得到一系列浓度为90、45、30、20、10、5、1mg/L的光甘草定溶液，进行色谱分析。
精密度实验：取三个不同浓度(10mg/L、30mg/L、90mg/L)的光甘草定溶液，进行色谱分析，一日内分别测定6次，计算日内精密度；每个浓度连续测定3d，计算日间精密度，并计算RSD值
稳定性实验：取30mg/L的光甘草定溶液，在室温条件下分别放置0h、1h、 2h、3h、4h、5h、6h、12h、24h后进样，记录峰面积，并计算RSD值。
实施例1光甘草定立方液晶纳米粒的制备及优化
一、实验方法
1、光甘草定立方液晶纳米粒的制备
称取1g的甘油单油酸酯(GMO)，置于西林瓶中，60℃恒温水浴磁力搅拌器中加热至甘油单油酸酯(GMO)完全融化后，加入0.075g光甘草定，加入磁转子使其混合均匀，加入0.15g的泊洛沙姆407，再次搅拌使其混合均匀，作为油相。用注射器吸取少量的60℃恒温水浴锅中预热的纯净水作为水相，缓缓加入西林瓶中，后转移至锥形瓶中，补加纯净水至50mL，在1000r/min磁力搅拌条件下搅拌2h，360W条件超声分散20min后，950W条件探头超声6min。之后在800bar压力下高压均质12次，即得光甘草定立方液晶纳米粒 (GLA-LCNPs)。
2、光甘草定脂质立方液晶纳米粒粒径和电位的测定
精密移取光甘草定立方液晶纳米粒100μL，加入4mL纯净水摇匀，将样品置于一次性样品池(四面通过)中，测量光甘草定方液晶纳米粒的粒径以及分散指数。取适量的以上样品，置于电极池(石墨，6mm)中，测量光甘草定立方液晶纳米粒的电位。
3、光甘草定立方液晶纳米粒包封率的测定
采用超滤离心管法，取光甘草定立方液晶纳米粒液体0.4mL于30000超滤离心管中，加3.6mL 5％的丙二醇溶液，4000r/min离心30min，取下管液体，甲醇定容到25ml，过0.45μm微孔滤膜，高效液相色谱法(HPLC)测定，得光甘草定立方液晶纳米粒中游离药物的含量；取光甘草定脂质立方液晶纳米粒液 0.4mL，加5％的丙二醇溶液3.6mL，加甲醇适量超声10min，甲醇定容到25mL， 4000r/min离心30min，取上清液过0.45μm微孔滤膜，高效液相色谱法(HPLC) 测定得光甘草定立方液晶纳米粒中总药物的含量，最后根据公式1、公式2计算包封率与载药量。
公式1：包封率EE(％)＝(C总浓度-C％离)/C总浓度×100％
公式2：
Figure BDA0002223250260000061
4、光甘草定立方液晶纳米粒工艺优化
按照表1，精密称量各组分，置于西林瓶中，按照上述1制备光甘草定立方液晶纳米粒；按照上述3测定光甘草定立方液晶纳米粒的包封率，按照上述2测定光甘草定立方液晶纳米粒的粒径、电位以及分散指数。
表1光甘草定立方液晶纳米粒正交试验因素水平表
Figure BDA0002223250260000062
Figure BDA0002223250260000071
5、光甘草定立方液晶纳米粒最佳工艺优化验证
根据项下的实验结果，确定光甘草定立方液晶纳米粒的最佳制备工艺。按照最佳制备光甘草定立方液晶纳米粒，验证最佳工艺制备的光甘草定立方液晶纳米粒的包封率、载药量、粒径、电位和分散指数的指标。
6、光甘草定立方液晶纳米粒处方表
表2光甘草定立方液晶纳米粒处方
Figure BDA0002223250260000072
7、立方液晶纳米粒形态学观察
把立方液晶纳米粒稀释后滴加在覆有支持膜的铜网上，静置5min后用滤纸吸干，再滴加2％磷钨酸负染3min，烤灯烘干后，透射电镜观察其形态。
二、实验结果
1、光甘草定立方液晶纳米粒正交实验数据
制备的光甘草定立方液晶纳米粒进行包封率、载药量、粒径、电位和分散指数的测定，测定结果见表3。
表3光甘草定立方液晶纳米粒处方优化前各项测定结果表
Figure BDA0002223250260000073
Figure BDA0002223250260000081
2、光甘草定立方液晶纳米粒正交实验结果
应用综合加权评分法对正交实验结果进行综合分析，包封率(y1)、载药量 (y2)和粒径(y3)分别按35％、35％和30％的系数积分，综合评分 Y＝35*y1/97+35*y2/4.58+30*(1-y3/202.89)，结果见表4。
表4正交实验方案和结果
Figure BDA0002223250260000082
由表4极差分析可知，在以包封率、载药量与粒径为指标，甘油单油酸酯(A)、泊洛沙姆407(B)、光甘草定(C)、纯净水(D)四个实验因素的影响顺序为： D>A>C>B；综合个因素K值，确定了光甘草定醇质体最佳制备工艺。
3、方差分析
通过方差分析可知甘油单油酸酯(A)、光甘草定(C)、纯净水(D)对光甘草定醇质体的制备有显著的影响(P<0.01)结果见表5。
表5方差分析表
Figure BDA0002223250260000091
4、光甘草定立方液晶纳米粒最佳工艺优化验证
结果见表6和图1～2。
表6光甘草定立方液晶纳米粒处方优化后各项测定指标
Figure BDA0002223250260000092
5、通过透射电镜照片可观察到所制备的光甘草定立方液晶纳米粒大小均一、圆整度较好的类球形粒子。电镜照片见图3。
综上，通过正交设计的方法对光甘草定立方液晶纳米粒的处方进行优化，优化后的处方采用热处理高压均质联合应用的方法可制得符合条件的光甘草定立方液晶纳米粒的包封率为93.42±0.25％，载药量为5.72±0.36，粒径为149±0.47nm， Zeta电位为-48±0.62mV，透射电镜形态为类圆形的颗粒。
实施例2光甘草定立方液晶纳米粒的制备
称取1g的甘油单油酸酯(GMO)，置于西林瓶中，50℃恒温水浴磁力搅拌器中加热至甘油单油酸酯(GMO)完全融化后，加入0.1g光甘草定，加入磁转子使其混合均匀，加入0.2g的泊洛沙姆407，再次搅拌使其混合均匀，作为油相。用注射器吸取少量的50℃恒温水浴锅中预热的纯净水作为水相，缓缓加入西林瓶中，后转移至锥形瓶中，补加纯净水至60mL，在1000r/min磁力搅拌条件下搅拌2h，300W条件下超声分散30min后，900W条件下探头超声8min。之后在800bar压力下高压均质12次，即得光甘草定立方液晶纳米粒(GLA-LCNPs)。
实施例3光甘草定立方液晶纳米粒的制备
称取1g的甘油单亚油酸酯(GMLO)，置于西林瓶中70℃恒温水浴磁力搅拌器中加热至甘油单油酸酯(GMO)完全融化后，加入0.05g光甘草定，加入磁转子使其混合均匀，加入0.1g的稳定剂聚乙烯醇(PVA)，再次搅拌使其混合均匀，作为油相。用注射器吸取少量的70℃恒温水浴锅中预热的纯净水作为水相，缓缓加入西林瓶中，后转移至锥形瓶中，补加纯净水至40mL，在1000r/min磁力搅拌条件下搅拌2h，400W条件下超声分散10min后，1000W条件下探头超声 4min。之后在800bar压力下高压均质12次，即得光甘草定立方液晶纳米粒(GLA-LCNPs)。
实施例4制备光甘草定醇质体凝胶
1、实验方法
(1)制备方法
精密称量0.2010g卵磷脂、0.0200g胆固醇、0.0147g光甘草定、0.0097g十八胺各组分，加入3mL无水乙醇，置于磁力搅拌器上，水浴恒温30℃，200r/min，搅拌30min，缓慢加入PBS(pH＝6.8)，800r/min，继续搅拌60min，之后冰浴探头超声6min，高压均质3次。
(2)光甘草定醇质体破乳
精密移取光甘草定醇质体100μL，置于容量瓶中，加入甲醇，定容至5mL， 50W，超声15min，过0.45μm有机滤膜，进样，记录峰面积，测定光甘草定醇质体溶液中总光甘草定的含量。
(3)光甘草定醇质体包封率的测定
取2.5mL一次性注射器，将玻璃棉放置在注射器中，加葡聚糖凝胶大约到 2.5mL左右，2000r/min，离心3min，加PBS(pH＝6.8)后，离心，重复三次，微柱凝胶大概精密移取100μL光甘草定醇质体，置于微柱中，2000r/min，离心 3min，加PBS(pH＝6.8)，2000r/min，离心3min，离心2次。取离心液1mL，置于容量瓶中，加甲醇定容至5mL，50W，超声15min，过0.45μm有机滤膜，进行色谱分析，记录峰面积，根据公式3计算光甘草定醇质体的包封率。
公式3：
Figure BDA0002223250260000101
(4)光甘草定醇质体载药量的测定
将精密称取的卵磷脂、胆固醇、十八胺、光甘草定的重量求和，根据公式4 计算光甘草定醇质体的载药量。
公式4：
Figure BDA0002223250260000111
(5)光甘草定醇质体粒径、电位以及分散指数的测定
精密移取光甘草定醇质体100μL，加入4mL PBS(pH＝6.8)，振摇，备用。将样品置于一次性样品池(四面通过)中，测量光甘草定醇质体的粒径以及分散指数。取少量样品，置于电极池(石墨，6mm)中，测量光甘草定醇质体的电位。
(6)光甘草定醇质体工艺优化
按照表7，精密称量各组分，置于西林瓶中，测定上述制备的光甘草定醇质体的包封率、载药量、粒径、电位以及分散指数。
表7正交试验因素水平表
Figure BDA0002223250260000112
(7)光甘草定醇质体最佳工艺优化验证
根据实验结果，确定光甘草定醇质体的最佳制备工艺。按照最佳工艺制备光甘草定醇质体，验证最佳工艺制备的光甘草定醇质体的包封率、载药量、粒径、电位和分散指数的指标。
(8)光甘草定醇质体稳定性考察
按照最佳工艺制备光甘草定醇质体，分别在0，7，14，21，28d下测量其包封率，粒径，电位，分散指数，并记录其外观形态。
(9)醇质体形态的观察
把醇质体稀释后滴加在覆有支持膜的铜网上，静置5min后用滤纸吸干，再滴加2％磷钨酸负染3min，烤灯烘干后，透射电镜观察其形态。
2、实验结果
(1)光甘草定醇质体加样回收率
加样回收实验结果如表8显示，醇质体溶液中光甘草定含量分别为80％， 100％，120％的平均回收率分别为90.28％，97.78％，96.30％，其相对应的RSD 值分别为3.53％，3.55％，2.20％，其值均低于5％。加样回收实验结果表明在光甘草定含量为100％时，加样回收率最高。
表8光甘草定加样回收率实验结果
Figure BDA0002223250260000121
(2)光甘草定醇质体正交实验
以光甘草定醇质体中卵磷脂、胆固醇、光甘草定和无水乙醇为影响因素采用正交试验来优化制备工艺，按表9称取各组分后，按照上述步骤1(1)制备醇质体。
表9光甘草定醇质体各组分含量
Figure BDA0002223250260000122
Figure BDA0002223250260000131
/>
所制备的光甘草定醇质体进行包封率、载药量、粒径、电位和分散指数的测定，测定结果见表10。
表10光甘草定醇质体实验结果
Figure BDA0002223250260000132
(3)光甘草定醇质体正交实验结果：
应用综合加权评分法对正交实验结果进行综合分析，包封率(y1)、载药量 (y2)和粒径(y3)分别按35％、35％和30％的系数积分，综合评分 Y＝35*y1/98+35*y2/4.61+30*(1-y3/206.9)，结果见表11。
表11正交实验方案和结果
Figure BDA0002223250260000133
/>
Figure BDA0002223250260000141
由表11的极差分析可知，在以包封率、载药量与粒径为指标，卵磷脂(A)、胆固醇(B)、光甘草定(C)、无水乙醇(D)四个实验因素的影响顺序为：C>B>A>D；综合各因素K值，确定光甘草定醇质体最佳制备工艺为A1B2C3D2，即卵磷脂的量为0.2g、胆固醇的量为0.02g、光甘草定的量为0.015g、无水乙醇为3mL和 PBS为7mL。
(4)通过方差分析可知，卵磷脂(A)、胆固醇(B)、光甘草定(C)、无水乙醇(D)对光甘草定醇质体的制备有显著的影响(P<0.01)结果见表12。
表12方差分析表
Figure BDA0002223250260000142
(注：F0.01(2,2)＝5.526)
(5)光甘草定醇质体最佳工艺优化验证
精密称取光甘草定0.0147g、卵磷脂0.2010g、胆固醇0.0200g、十八胺0.0097g、无水乙醇3mL，上述步骤1(1)制备光甘草定醇质体，通过对光甘草定醇质体指标检测，最优工艺其综合得分率更高为87.88，结果见表13，粒径和电位见图 4。
表13光甘草定醇质体考察指标结果
Figure BDA0002223250260000143
Figure BDA0002223250260000151
根据实验结果可知：光甘草定醇质体最佳制备工艺优于正交实验中的各个处方，醇质体的粒径较小，包封率较高。
(6)形态观察
TEM观察光甘草定醇质体的形态时，镜下情况如图5所示，光甘草定醇质体颗粒为均匀的类球形，分布均匀。
综上，本实验采用注入法制备了光甘草定醇质体，采用正交设计实验优化了光甘草定醇质体处方，光甘草定醇质体优化工艺后得到最优工艺为光甘草定 0.0150g、卵磷脂0.2000g、胆固醇0.0200g、十八胺0.0010g、无水乙醇3mL， PBS至7mL。最优工艺制得的光甘草定醇质体综合得分率更高为87.88，所制得的醇质体的包封率为92.7±0.63％，载药量为5.55±0.04％，粒径为119.75±2.02nm，电位为3.5±0.75mv，透射电镜图片显示其形状为类球形。
实施例5制备光甘草定化合物凝胶
制备方法：精密称取光甘草定0.03g加水20mL，震摇均匀得光甘草定混悬液。称取卡波姆0.15g，加入5mL PBS(pH＝6.8)溶液，溶胀24h后，边加边搅拌，加入三乙醇胺15滴(约0.75mL)，搅拌均匀；将制备的20mL光甘草定混悬液缓慢加入到卡波姆溶液中，边加边搅拌均匀，现用现制。
实施例6光甘草定各制剂凝胶在离体鼠皮中的滞留量实验
测试实施例1、4、5制备的光甘草定的不同剂型在离体鼠皮组织中的滞留量。
滞留量的测试方法为：
取去毛的豚鼠，剪下腹部皮肤，除去皮下的脂肪组织，将处理好的豚鼠鼠皮角质层向上固定于Franz扩散池上，接收池中加入20％的乙醇-生理盐水溶液，使鼠皮内层完全与接受液接触，打开透皮仪并设定恒温37℃，保持恒定转速200 r/min，排尽接收池内的气泡后给药。扩散池供给鼠皮面积上分别加入0.5g已制备好的光甘草定化合物凝胶，各平行3组，分别在1，2，4，6，8，10，12h时段内对离体鼠皮进行Frank扩散实验。实验结束后，将不同时间段内透皮吸收结束的鼠皮去除皮肤上的残留药物，用生理盐水冲洗干净残留的不同剂型的药物，用滤纸吸干水分，剪碎，置于10ml离心管中，加入甲醇3ml，用组织匀浆机研磨成匀浆，在转速为2000r/min时涡旋5min，置于超声波清洗机中提取15min 后再次涡旋5min。离心机中5000r/min离心10min，取上层清液于进样瓶中， HPLC进样测定不同时间段内离体鼠皮中光甘草定滞留量。
结果如图6所示，可以看出光甘草定立方液晶纳米粒凝胶在皮肤中的累计滞留量最高，因此选择光甘草定立方液晶纳米粒凝胶作为治疗光损伤的外用制剂。
实施例7光甘草定立方液晶纳米粒对豚鼠皮肤光老化的治疗作用
1、建立豚鼠皮肤光老化模型
UVA联合UVB照射造模，图7为豚鼠照射笼状态。
(1)豚鼠皮肤光老化动物模型的鉴定：
肉眼观察：对照组豚鼠剃毛区皮肤未见明显变化；模型组与对照组相比，随照射时间的延长，皮肤光老化症状应逐渐加重，剃毛区裸露部位皮肤逐渐出现修复性增厚、色素沉着、皱纹、皮肤松弛、皮屑、皮革样外观等光老化症状。参照 Johnson等人制定的人类皮肤外源性光老化的评分标准，从以下几个方面对豚鼠进行光老化严重程度评分，评分标准如图8。
结果：模型组豚鼠在应用紫外灯照射18周后，肉眼观察，受照射部位皮肤表现为进行性厚度增加、弹性减退，皱纹形成并逐渐加深，皮革样外观，并伴有皮屑、色素沉着等改变，正常组豚鼠剃毛区皮肤没有明显变化如图9所示。肉眼结果表明，豚鼠皮肤光老化动物模型成功建立。
(2)组织学检查鉴定豚鼠光老化模型皮肤的病理改变
豚鼠空白组皮肤与受照射区皮肤均制成切片，HE染色，镜下观察可见，空白组皮肤各层结构完整，皮下毛囊和皮脂腺形态饱满、充盈，表皮较薄，真皮层厚度适中，纤维束排列有序且分布均匀，未见明显病理改变。模型组表皮不规则增厚、局部表皮角化不全，部分细胞空泡变、细胞核碎裂；真皮组织排列紊乱，血管扩张充血，少量炎性细胞浸润；毛囊受损，细胞变性，MASSON染色结果显示，空白组真皮层胶原纤维排列较为有序，且分布较均匀。模型组真皮层胶原纤维排列紊乱，且分布不均，染色深浅不一，如图10所示。结果均符合皮肤光老化典型的病理生理及组织学变化，可为进一步的研究提供实验基础。
紫外灯照射18周后，光老化动物模型成功。
2、药物治疗实验
对上述紫外灯照射18周后构建成功的光老化动物模型进行给药实验，给予光甘草定立方液晶纳米粒凝胶治疗。分为高剂量治疗组、低剂量治疗组、阳性对照组、凝胶基质组。
肉眼观察给药后各组豚鼠皮肤改变以及镜下观察光甘草定立方液晶纳米粒凝胶治疗光老化皮肤的病理组织改变。
3、实验结果
(1)肉眼观察给药后各组豚鼠皮肤改变
与模型组对比，高剂量治疗组皮肤改变如皱纹、皮革样外观、色素沉着等症状明显减轻，低剂量治疗组的皮肤改变处于高剂量治疗组和凝胶基质组之间。阳性对照组的皮肤改变亦非常明显，皱纹几乎消失，但仍有发红、毛细血管扩张等现象，这可能跟维甲酸类药物的皮肤刺激性有关，如图11所示。结果提示，光甘草定立方液晶纳米粒凝胶对皮肤光老化具有明显的治疗作用，而且避免了维甲酸类药物的皮肤刺激性等副作用。
另外，皮损处肉眼观察评分结果如表1所示：
表1皮损处肉眼观察评分结果表
组别 皱纹 弹性 粗糙 修复增厚变硬程度 总分
空白对照组 10 10 10 10 40
模型照组 0 0 0 0 0
阳性对照组 8 7 9 8 32
外用高剂量组 8 7 9 8 32
外用低剂量组 4 5 5 5 19
基质组 2 2 3 1 8
皮损处肉眼观察评分分值越低，光老化越严重。由表1可知外用高剂量组和阳性对照组的光老化程度均比模型组有明显的改善，外用低剂量组与模型组相比光老化程度略有改善，基质组与模型组相比，变化不大。
(2)镜下观察光甘草定立方液晶纳米粒凝胶治疗光老化皮肤病理组织改变
取各组剃毛区皮肤，制成切片、进行HE染色、MASSON染色镜下观察，与模型组相比，高剂量治疗组，表皮明显变薄，接近正常皮肤；真皮变厚，炎症细胞浸润减轻；弹性纤维减少，胶原纤维增多。低剂量治疗组虽然表皮稍有变薄，但炎细胞浸润依然明显；胶原纤维虽然增多，但仍可见弹性纤维不规则排列，呈团块状堆积。阳性对照组的光老化病理表现与模型组相比亦有改善，基质组未见明显改善，如图12和图13所示。结果表明，光甘草定立方液晶纳米粒凝胶对皮肤光老化具有明显的治疗作用。
(3)测定皮肤含水量
皮肤含水量的测试采用水份测定仪测定。第18周末，用水份测定仪测试豚鼠皮肤的含水量，并记录其值。
豚鼠皮肤含水量结果见图14，由图可知模型组与空白对照组相比含水量明显降低，且有显著性差异，阳性对照组和高剂量组与模型组相比含水量明显提高，且有显著性差异，低剂量组和模型组相比含水量有所提高。实验表明，光甘草定立方液晶纳米粒凝胶对光老化豚鼠皮肤含水量有提升的作用，且存在剂量依赖性。
综上实施例实验显示，本发明采用热处理高压均质联合应用的方法制备光甘草定立方液晶纳米粒，正交设计法进行光甘草定立方液晶纳米粒处方的优选，以包封率、载药量、粒径等为效应值优化立方液晶纳米粒的处方组成，透射电镜观察其形态。同时选取了四种纳米制剂作为光甘草定的载体，并利用Franz扩散装置考察光甘草定醇质体、立方液晶纳米粒中药物在离体鼠皮中的滞留量，优选出光甘草定经皮给药治疗光损伤的纳米制剂。
最后利用紫外线照射((UVA联合UVB照射造模))背部剃毛豚鼠建立皮肤光老化模型进行研究。将雌性豚鼠随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组、外用高剂量组、外用低剂量组、基质组，治疗2周后，通过肉眼观察、HE染色、 Masson染色等评价其治疗效果。结果显示，四种纳米制剂凝胶中鼠皮滞留量最高者为本发明所述的光甘草定立方液晶纳米粒凝胶；豚鼠皮肤光老化模型实验表明，本发明的光甘草定立方液晶纳米粒对皮肤光老化有明显的治疗效果，且疗效存在剂量依赖性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种光甘草定立方液晶纳米粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将甘油单油酸酯加热融化；
S2.向S1产物中加入光甘草定，混合；
S3.向S2产物中加入泊洛沙姆407，混合作为油相；
S4.取水加入S3产物中，搅拌，超声处理；
S5.步骤S4的产物经高压均质即得光甘草定立方液晶纳米粒；
其中，甘油单油酸酯：光甘草定：泊洛沙姆407的质量比为1：0.05～0.1：0.1～0.2；
步骤S1中加热搅拌的条件为50～70℃恒温水浴磁力搅拌；
步骤S4中搅拌的条件为：800～1200r/min磁力搅拌条件下搅拌1～3h。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S4所述超声处理的方式为探头超声，探头超声的条件为900～1000W条件下探头超声4～8min。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤S4所述超声处理的方式为先超声分散后，再探头超声，所述超声分散的条件为：300～400W条件下超声分散10～30min。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S5中高压均质的条件为600～1000bar压力下高压均质。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S2中混合的过程中加入磁转子使其混合均匀。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S3中混合的方式为搅拌。
7.根据权利要求1～6任一所述方法制备得到的光甘草定立方液晶纳米粒。
8.权利要求7所述光甘草定立方液晶纳米粒在制备抗皮肤光损伤药物方面的应用。
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光甘草定纳米结晶凝胶剂的制备与评价;胡进;《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》;20170315(第3期);第9页光甘草定纳米混悬液的制备及不同表面活性剂的筛选、第10-11页不同空间稳定剂的筛选、第19-20页在体皮肤透过性实验、第28-29页大鼠皮肤刺激性评价实验 *

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