NO316274B1 - Fremgangsmate til refolding av proteiner - Google Patents

Fremgangsmate til refolding av proteiner Download PDF

Info

Publication number
NO316274B1
NO316274B1 NO19952989A NO952989A NO316274B1 NO 316274 B1 NO316274 B1 NO 316274B1 NO 19952989 A NO19952989 A NO 19952989A NO 952989 A NO952989 A NO 952989A NO 316274 B1 NO316274 B1 NO 316274B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
polypeptide
accordance
seq
protein
polypeptide molecules
Prior art date
Application number
NO19952989A
Other languages
English (en)
Other versions
NO952989L (no
NO952989D0 (no
Inventor
Hans Christian Thogersen
Thor Las Holtet
Michael Etzerodt
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Anaphore Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DK13093A external-priority patent/DK13093D0/da
Priority claimed from DK13993A external-priority patent/DK13993D0/da
Priority claimed from PCT/GB1993/002492 external-priority patent/WO1994013804A1/en
Application filed by Hoffmann La Roche, Anaphore Inc filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of NO952989D0 publication Critical patent/NO952989D0/no
Publication of NO952989L publication Critical patent/NO952989L/no
Publication of NO316274B1 publication Critical patent/NO316274B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6435—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormones [GH] (Somatotropin)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6432—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21006—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21007—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/124—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes based on group I or II introns
    • C12N2310/1241—Tetrahymena
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/127—DNAzymes

Description

Oppfinnelsens område
Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte til generering av et bearbeidet hele av polypeptidmolekyler, hvor konformas]onstilstandene som er representert i det bearbeidede hele inneholder en vesent-
lig fraksjon polypeptidmolekyler i en spesiell foldet konformas]on, fra et opprinnelig hele av polypeptidmolekyler som har samme aminosyresekvens som det
bearbeidede hele av polypeptidmolekyler, idet de konformasjonstilstander som er representert i det opprinnelige hele inneholder en vesentlig fraksjon polypeptidmolekyler i ufoldete eller feilfoldete konformasjoner
Den foreliggende oppfinnelse vedrører rekombinant DNA-teknikk, spesielt protembearbeidingsteknikk for fremstilling av riktig foldete proteiner ved ekspresjon av gener eller genfragmenter i en vertsorganisme, heterolog eller homolog, som rekombinante protemprodukter, ved beskrivelse av nye, generelle prinsipper og metodikk for effektiv in vitro refolding av feilfoldete og/eller uløse-lige proteiner, inklusivt proteiner som inneholder disulfldbmdinger Oppfinnelsen vedrører dessuten refolding av ufoldete eller feilfoldete polypeptider av en vilkårlig annen opprinnelse Oppfinnelsen vedrører også nye former for kryptograferte gjenkjenningsseter for faktor Xa spalting av kimære proteiner, seter som bare ble gjenkjent etter derivatisering in vitro Det er også frembrakt to analoger av bovin koaguleringsfaktor Xa, som er egnet for tekniske anvendelser i liten, middels eller stor skala og som omfatter spesifikk spalting av kimære proteiner i seter som er utformet for spalting ved hjelp av faktor Xa. Endelig vedrører oppfinnelsen former for reversible disulfldblokkerende reagenser, som er anvendelige som hjelpeforbindelser til refolding av cysteinholdige proteiner, inklusivt en generell prøvemetode hvormed slike di-sulfidutskiftingsreagenser kan evalueres angående egnethet for dette spesielle formål
Generell bakgrunn for oppfinnelsen
Teknikker for fremstillingen av stort sett ethvert polypeptid ved innføring, ved rekombinante DNA-metoder, av et naturlig eller syntetisk DNA-fragment som koder for dette spesielle polypeptid i en egnet vert har vært under sterk utvikling i løpet av de siste 15 år og er for tiden vesentlige verktøyer for biokjemisk forskning og for et antall industrielle prosesser for fremstilling av høy-gradige proteinprodukter for biomedisinsk eller annen industriell anvendelse
Fire fundamentale egenskaper ved biologiske systemer gjør heterologisk produksjon av proteiner mulig
(i) Et proteins funksjonelle egenskaper er fullstendig spesifisert av dets tredimensjonale struktur, og er på grunn av de molekylære forhold i strukturen 'bestemt av kjemiske egenskaper som oppvises av spesifikke deler av denne struktur
(II) Et proteins tredimensjonale struktur er 3. sin tur spesifisert av sekvensmformasjonen representert ved det spesifikke sekvensielle arrangement av ammosyrerester 1 den eller de lineære polypeptidkjeder Strukturinforma-sjonen som foreligger 1 ammosyresekvensen hos et polypeptid er 1 seg selv tilstrekkelig, under gunstige betingelser, til å styre foldingsprosessen hvorav slutt-produktet er det fullstendig og riktig foldete protein (III) Den lineære sekvens av ammosyrerester 1 polypeptidkjeden er spesifisert av nukleotidsekvensen i den kodende region av det genetiske materiale som styrer enheten av polypeptidk]eden ved hjelp av cellemaskineriet Translasjonstabellen som styrer translasjon av nuklem-syresekvensmf ormasjon inn i aminosyresekvens er kjent og er nesten universell blant kjente organismer og gjør det følgelig mulig for nukleinsyresegmenter som koder for et vilkårlig polypeptidsegment å styre helet av polypeptid-produkt tvers over stort sett enhver artskrysningsbar-riere
(iv) Hver type organisme stoler på sitt eget karakteristiske mønster for genetiske elementer som foreligger i dets egne gener når det gjelder interaksjon med cellens molekylære maskineri, hvilket som respons på spesifikke intracellulære og ekstracellulære faktorer regulerer ekspresjonen av et gitt gen når det gjelder transskripsjon og translasjon
For å utnytte proteinsyntesemaskmeriet i en verts-celle eller -organisme for å oppnå vesentlig produksjon av et ønsket, rekombinant protemprodukt er det derfor nød-vendig å presentere DNA-segmentet som koder for det ønskede produkt for cellen som er fusjonert med kontroll-sekvenser som gjenkjennes av cellens genetiske kontroll-system
Den umiddelbare skjebne for et polypeptid som uttrykkes i en vert influeres av polypeptidets natur, vertens natur, samt av mulige stresstilstander hos verts-organismen som påkalles under produksjonen av et gitt polypeptid Et genprodukt som uttrykkes i en moderat grad og som ligner eller er identisk med et protein som vanligvis foreligger i vertscellen vil ofte gjennomgå normal bearbeidelse og akkumulering i det passende cellekammer eller -sekret, avhengig av hva som er den naturlige skjebne til dette endogene genprodukt Derimot aktiverer ofte et rekombinant genprodukt som er fremmed for cellen eller som produseres i store mengder ofte celleforsvars-mekanismer som ligner de som aktiveres ved varmesjokk eller eksponering for toksiske aminosyreanaloger, løs-ninger som har blitt utformet av naturen for å hjelpe cellen til å bli kvitt "feilt" polypeptidmatenale ved kontrollert, intracellulær proteolyse eller ved utskilling av uønsket polypeptidmatenale i lagrmgspartikler ("inklusjonslegemer") Det rekombinante protein i disse lagrmgspartikler er ofte anordnet i en feilfoldet og aggregert tilstand, hvorved det ble nødvendig å løse produktet under denaturerende og reduserende betingelser og deretter folde det rekombinante polypeptid ved m vitro metoder for å oppnå et nyttig protemprodukt
Ekspresjon av eukaryotiske gener i eukaryotiske celler muliggjør ofte direkte isolasjon av det riktig foldete og bearbeidede genprodukt fra cellekulturvæsker eller fra cellemateriale Denne fremgangsmåte benyttes ofte for å oppnå relativt små mengder av et protein for biokjemiske undersøkelser og utnyttes for tiden også industrielt for produksjon av et antall biomedisinske produkter Imidlertid er eukaryotisk ekspresjonsteknologi kostbar når det gjelder teknologisk kompleksitet, arbeids-og materialkostnader Dessuten er tidsskalaen for ut-viklingsfasen som er nødvendig for å danne et ekspresjonssystem i det minste atskillige måneder, også for fremstilling i laboratorieskala Naturen til og graden av ettertranslasjonell modifisering av det rekombinante produkt avviker ofte fra naturproduktets på grunn av at slike modifikasjoner er under indirekte genetisk kontroll i vertscellen Sekvenssignaler som påkaller en etter-syntetisk modifisering gjenkjennes ofte gjensidig blant eukaryoter, men tilgjengeligheten av passende modifika-sjonsenzymer er gitt av vertscellens natur og tilstand
Forskjellige strategier er blitt utviklet for ekspresjon av genprodukter i prokaryotiske verter, som er fordelaktige i forhold til eukaryotiske verter når det gjelder kapital-, arbeids- og materialbehov Stammer av eubakterien Escherichia coli foretrekkes ofte som vertsceller på grunn av at E coli er langt bedre karakterisert genetisk enn enhver annen organisme, også på det molekylære nivå
Prokaryotiske vertsceller har ikke det enzymatiske maskineri som er nødvendig for å utføre ettertranslasjonell modifikasjon, og et eukaryotisk genprodukt vil derfor nødvendigvis bli dannet i dets umodifiserte form Dessuten må produktet være syntetisert med et N-terminalt enkelttråd-overheng, hvorved minst en ytterligere metionmrest oppstår fra det nødvendige translasjons-lnitieringskodon, og omfatter oftere dessuten et N-terminalt segment som svarer til segmentet i et høyt uttrykt vertsprotem Generelle metoder til fjerning av slike N-terminale overheng ved sekvensspesifikk proteolyse i linkersegmenter som er innført i forbindelsespunktet mellom det N-terminale overheng og det ønskede polypeptid-produkt er blitt beskrevet (Enterokinase-cleavable linker sequence EP 03534, The Regents of the University of California, Factor Xa-cleavable linker sequence EP 161937, Nagai & Thøgersen, Innehaver Celltech Ltd )
I løpet av årene er betydelig anstrengelse blitt rettet mot utviklingen av strategier for heterolog ekspresjon i prokaryoter for å danne rekombinante proteinprodukter i en løselig form eller fusjonsprotemkonstruk-sjoner som muliggjør sekresjon fra cellen i en aktiv, eventuelt N-terminalt bearbeidet form, en anstrengelse som bare har resultert i begrenset suksess til tross for senere tids utviklinger på chaperonfeltet Typisk er det nødvendig med mye tid og anstrengelse for å utvikle og modifisere et ekspresjonssystem før sogar en liten mengde løselig og riktig foldet fusjonsprotemprodukt kan bli isolert Oftere er hele polypeptidproduktet anbrakt inne i vertscellen i en ukorrekt foldet tilstand i "mklusjons-legemer" Dette gjelder særlig ved ekspresjon av eukaryotiske proteiner som inneholder disulfldbroer
Tilgjengelige metoder for in vitro refolding av proteiner beskriver alle prosesser hvor proteinet i løsning eller ikke-spesifikt adsorbert på lonebytter-harpikser etc utsettes for løsningsmiddel hvis sammensetning gradvis forandres med tiden fra sterkt denaturerende (og eventuelt reduserende) til ikke-denaturerende i ett eneste trinn Dette utføres ofte ved tynning av en konsentrert løsning av protein inneholdende 6-8 M guanidin-hydroklorid eller urea i et stort volum ikke-denaturerende buffer, eller ved dialyse av en tynnet løsning av proteinet i den denaturerende buffer mot den ikke-denaturerende buffer Tallrike varianter av denne basisprosess er blitt beskrevet, såsom tilsetning av spesifikke ligander eller kofaktorer av det aktive protein og tilsetning av polymersubstanser, såsom polyetylenoksid (polyetylenglykol), som skal stabilisere den foldete struktur
Selv om det er funnet effektive varianter av den standard m vitro refoldingsprosess for et antall spesifikke proteinprodukter, inklusive proteiner som inneholder en eller flere disulf ldbmdmger, er utbyttene ved refolding oftere lave, og oppskalering er upraktisk og kostbar på grunn av den lave løselighet til de fleste ufull-stendig foldete proteiner, noe som medfører anvendelse av store volumer løsningsmiddel
Det felles karakteristikum for alle tradisjonelle in vitro refoldmgsprotokoller er at refolding forårsaket av plutselig eller gradvis reduksjon av denaturant utføres som en ett-trinnsoperasjon hvis utbytte deretter betraktes som det best oppnåelige for vedkommende protein
Det generelle område proteinfolding er oppsummert i en lærebok som nylig er utgitt av Thomas W Creighton ("Protein folding", utgiver T E. Creighton, Freeman 1992), og en mer spesifikk oversikt over praktiske metoder for protemrefolding ble publisert i 1989 av Råmer Jaenicke & Rainer Rudolph (p 191-223 i "Protein Structure, a practical approach", utgiver T E Creighton, IRL Press 1989) Blant de tallrike mer detaljerte publikasjoner kan oversikter over teknikkens stand, såsom de av Schein (C H Schem, Bio/Technology, Vol 8, 1990, p 308-317} eller
Buchner og Rudolph (J Buchner og R Rudolph, Bio/Technology, Vol 9, 1991, p 157-162) konsulteres
Som konklusjon er der et absolutt behov for generelt anvendelige metoder med høyt utbytte for refolding av u-eller feilfoldete proteiner fra forskjellige kilder, såsom prokaryotiske ekspresjonssystemer eller peptidsyntese
Oppsummering av oppfinnelsen
Det har ifølge den foreliggende oppfinnelse vist seg at utbytter ved refolding kan økes sterkt ved å ta hensyn til at proteinfoldingsprosessen er en kinetisk styrt prosess og at innbyrdes omdanning mellom foldete, ufoldete og feilfoldete former for proteiner er underlagt hysterese og tidsavhengige fenomener som kan utnyttes for å utforme en syklisk denaturerings-renatureringsprosess hvorved refoldet protemprodukt akkumuleres trinnvis i hver syklus på bekostning av ufoldete og feilfoldete former, slik at det dannes en ny refoldingsprosess med mye større poten-siale enn den grunnleggende, tradisjonelle løsning
Ved betegnelsen "foldet protein" menes et polypeptid i konformasjonstilstand(er) som svarer til den eller de som opptrer i proteinet i dets oiologisk aktive form, eller unike, stabile mellomprodukter som i etterfølgende trinn kan omdannes slik at de biologisk aktive arter dannes Det foldete proteins kovalente struktur når det gjelder tverrbmding mellom par av cystemrester i polypeptidet er identisk med strukturen til proteinet i dets biologisk aktive form
Følgelig menes med betegnelsen "ufoldet protein" et polypeptid i konformasjonstilstander som er mindre kompakte og veldefinerte enn tilstandene til det eller de
tilsvarende proteiner i dets biologisk aktive og følgelig foldete form Det ufoldete proteins kovalente struktur når det gjelder fornetning mellom par av cystemrester x polypeptidet kan være eller ikke være identisk med strukturen til proteinet i dets biologisk aktive form Nært beslektet med et ufoldet protein er et "feilfoldet protein", som er
et polypeptid i en konformasjonstilstand som faktisk er termodynamisk stabil, noen ganger sogar stabilere enn den eller de tilstander som tilsvarer proteinet i dets foldete form, men som ikke oppviser samme grad, om overhodet noen av det foldete proteins biologiske aktivitet Slik situa-sjonen er for det ufoldete protein kan den kovalente struktur når det gjelder tverrbinding mellom par av cystemrester i polypeptidet være den samme eller ikke som for det foldete protein
Med betegnelsen "refoldet protein" menes et polypeptid som er blitt omdannet fra en ufoldet tilstand til å oppnå dets biologisk aktive konformasjon og kovalente struktur når det gjelder tverrbinding mellom riktige par av cystemrester i polypeptidet Den nye, generelt anvendbare protemrefoldingsstrategi er blitt utformet på basis av følgende generelle egenskaper hos proteinstruktur
(a) Den lave løselighet av ufoldete proteiner utsatt for ikke-denaturerende løsningsmidler reflekterer en
viktig drivkraft som bevirker at polypeptidet enten danner den kompakte, riktig refoldete struktur eller at det feil-folder og danner dødendeaggregater eller -utfellinger, som ikke er i stand til å refolde og danne den riktige refoldete struktur under ikke-denaturerende betingelser i løpet av et fornuftig tidsrom
(b) Et nydannet dødendeaggregat denatureres lettere, dvs omdannes til en ufoldet form, enn det riktig refoldete protein på grunn av at det dødendete aggregats struktur er mer uordnet Sannsynligvis er feilfoldmg generelt også en kinetisk styrt prosess (c) Et ufoldet protein er ofte ikke (eller bare meget langsomt) i stand til å refolde til den riktig refoldete form i denatureringsmiddelnivåer som er nødvendig for å denaturere dødendeaggregater i løpet av et fornuftig tidsrom (d) Den bevismasse som er tilgjengelig for å under-støtte (b) omfatter detaljerte undersøkelser av foldings-og utfoldmgsmåter og mellomprodukter for atskillige modellprotexner Illustrerende er også den iakttakelse som er gjort for mange disulfldbundne proteiner at disulfid-bindmgenes stabilitet mot reduksjon ved begrensende konsentrasjoner av reduksjons- og denaturermgsmidler ofte er vesentlig forskjellig for hver disulfidbro i et gitt protein og at disulfldbroene i det foldete protein generelt er mye mindre utsatt for reduksjon eller disulfidut-skifting enn "ikke-naturlige" disulfldbindinger i et denaturert protein eller proteinaggregat
Den nye strategi for en refoldingsprosess illu-streres lettest ved hjelp av følgende teoretiske eksempel
Et hypotetisk protein, stabilt foldet i en ikke-denaturerende buffer "A" og stabilt utfoldet i den sterkt denaturerende buffer "B" (f eks en buffer som inneholder 6 M guanidm-HCl) eksponert for buffer A eller buffer B og deretter utsatt for inkubering ved mellomnivåer av denaturering i blandinger av buffere A og B
Nivåer på mellom f eks 100 og 75% B fører til omdanning av både foldet protein og dødendeaggregert protein til den utfoldete form i løpet av et kort tidsrom
Nivåer på mellom f eks 75-50% B fører til omdanning av nylig formet dødendeaggregat til den utfoldete form, mens nesten alt refoldet protein blir værende i en nativ-lignende struktur som er stabil i det minste i et tidsrom på timer, hvoretter det kan vende tilbake til den refoldete form ved fjerning av denatureringsmidlet
Nivåer på over 10% B hindrer hurtig dannelse av refoldet form fra ufoldet form
En forandring av løsningsmiddelsammensetning fra 100% B til 0% B omdanner ufoldet protein til dødende-aggregat (75% utbytte) og refoldet protein (25% utbytte)
La oss nå utsette en prøve av dette protein, opprinnelig i dets ufoldete form i 100% B, for en tidsserie av programmerte denaturerings-renatureringssykluser slik som vist i fig 1, hver bestående av en renatureringsfase (Fn) (under 10% B) og en denatureringsfase (Dn) Ved slutten av renatureringsfasen i syklus (i) forandres de-natureringsniiddelinnholdet til et nivå ^ % som er lavere enn denatureringsnivået i den foregående syklus Etter en kortvarig mkubering fjernes denatureringsmidlet igjen og den etterfølgende renatureringsfase FI+i påbegynnes Under forutsetning av at denatureringsnivået begynner på 100% B og k1 for hver syklus er konstant 4% vil denne fremgangsmåte danne en dempet serie av "denatureringstrmn" som dør ut etter 25 sykluser
Gjennom 25 sykluser, slik som beskrevet ovenfor, skrider akkumuleringen av refoldet protein frem på følgende måte
I syklusene 1 til 5 vil alt proteinet, både foldet og feilfoldet, bli ufoldet i hver av denatureringsfåsene D n
Syklusene 7-12 Dødendeaggregater vil bli omdannet til ufoldet protein i hvert trinn, mens protein som er ut-vinnbart som refoldet produkt vil akkumuleres i følgende mengder syklus etter syklus 25%, 44%, 58%, 68%, 76% og 82%
Ytterligere omdanninger finner ikke sted i syklusene 13-25
Den sykliske refoldingsprosess ville derfor ha bevirket et totalt refoldmgsutbytte på over 80%, mens tradisjonell en-trinns renaturering høyst ville bevirke et utbytte på 25%
Det vil forstås åt det er gjennomført et stort antall forenklende tilnærminger når det gjelder all eller ingen gradering av hvert karakteristikum for det hypotetiske proteins forskjellige konformasjonstilstander Det grunnleggende arbeidsprinsipp blir imidlertid værende lignende dersom et mer komplisert sett av antagelser inkorporeres i modellen
Arrangering av en praktisk oppsetning for etablering av en syklisk denaturerings/renatureringsprotemrefold-lngsprosess kan betraktes på mange måter
Proteinet i løsning ville f eks kunne holdes i et ultraflltreringsapparat, holdes i et dialyseapparat eller anbringes i én av fasene av et egnet, vandig tofasesystem Alle disse ville gjøre det mulig å styre konsentrasjonen
av lavmolekylære, kjemiske oppløste produkter i protein-løsningen ved hjelp av egnete innretninger
Alternativt vil proteinet kunne adsorberes på en
egnet overflate i kontakt med en væskefase hvis kjemiske sammensetning vil kunne reguleres avhengig av behovet En egnet overflate vil f eks kunne være et filtrerings-apparat, et hulfiberapparat eller et perleformet kromatografisk medium Adsorpsjon av proteinet på overflaten vil kunne formidles ved hjelp av ikke-spesifikke interak-
sjoner, f eks slik som beskrevet i WO 96/05809 (Thomas Edwin Creighton) ved folding av forenelige, kovalente bindinger mellom overflaten og proteinet, eller via spesifikke utforminger av affmitetshendler i et rekombinant derivat av proteinet som oppviser en spesifikk og denatureringsresistent affinitet overfor en egnet derivatisert overflate
Den spesifikke gjennomføring av den sykliske denaturerings-/renatureringsproteinrefoldingsprosess som er dannet for å undersøke potensialet til den generelle metode var basert på en utforming av spaltbare hybrid-protemer (EP 161937, Nagai & Thøgersen, Innehaver Celltech Ltd ) inneholdende en metallafflmtetshendelmodul
(EP 0282042 (Heinz Dobeli, Bernhard Eggimann, Reiner
Gentz, Erich Hochuli, Hoffmann-La Roche)) innført N-terminalt i det utformete faktor Xa-spaltmgssete Rekombinante proteiner av denne generelle utforming, adsorbert på nikkel-chelatdannende agarosekuler vil deretter kunne underkastes den foreliggende sykliske refoldingsprosess i en kromatografisk søyle som "refoldmgsreaktor" fuktet med en blanding av denaturerende og ikke-denaturerende buffere, levert ved hjelp av en rekke kalibrerte pumper hvis strømningshastigheter er tidsprogrammert ved hjelp av datastyring
Et generelt skjema av refolding i fast tilstand med-fører syklisermg av det immobiliserte protein slik som omtalt ovenfor eller på vilkårlig annen måte og reali-sering mellom denaturerende og ikke-denaturerende betingelser på en progressiv måte, hvorved konsentrasjonen av det denaturerende middel reduseres gradvis fra høye ut-gangsverdier mot null via en rekke av mange renaturermgs-denatureringssykluser Ved å gå frem på denne måte er det ikke nødvendig å bestemme nøyaktig hvilken begrensende de-naturermgsmiddelkonsentrasjon som er nødvendig for å oppnå økning av foldmgsutbytte i løpet av sykliseringen av det spesifikke protein som foreligger, på grunn av at den progressive rekke av sykluser vil gå gjennom (opptil) tre faser, en tidlig fase hvor foldet produkt som foreligger ved slutten av syklus (i) er fullstendig denaturert ved denatureringstrinnet av syklus (i+l), en mellomliggende, produktiv fase hvor refoldet protein akkumuleres i økende kvantum, og en sen fase hvor konsentrasjonen av denatu-reringsmiddel er for lav til å forurolige det refoldete protein eller eventuelle gjenværende feilfoldete strukturer Det å underkaste proteinet en fremskridende serie av denaturerings-renatureringssykluser slik som beskrevet ovenfor vil derfor omfatte atskillige produktive sykluser
For disulfidholdige proteiner kan progressiv denaturerings-renatureringssyklisering økes ved anvendelse av utstyr som ligner avansert kromatograflutstyr med on-line-fasiliteter for overvåking av buffersammensetninger i avløp fra foldmgsreaktor Informasjon om avløpssammen-setnmg når det gjelder reduksjonsmiddel og disulfidom-danningsreagenskonsentrasjonsprofil vil avsløre produktiv syklisering og vil derfor kunne benyttes som input i en intelligent prosessorenhet, noe som i sin tur regulerer progresjonen av denatureringsmiddelkonsentrasjon i en til-bakematmgssløyfe for å sikre at det meste av sykliser-mgsanstrengelsen forbrukes i den produktive fase av denaturerings-renatureringssyklusrekken Slik autoopti-malisermg av syklisermgsbetingelser vil være mulig på grunn av at det analytiske system kan benyttes til å måle graden og retningen av forandringer i redokslikevekt i bufferstrømmen, målingar som direkte reflekterer titrering av tiolgrupper/disulfidekvivalenter i den immobiliserte proteinprøve og derfor er direkte overførbar til gjennom-snittlig antall disulfldbmdinger som spaltes eller dannes i forskjellige faser av en syklus
Andre mulige inputs for den intelligente prosessor-styring av fremskridelsen av syklisering omfatter målinger av ligandbinding, substratomdanning, antistoffbindmgsevne samt ethvert annet samvirkende, løselig middel som sam-virker på distinkte måter med feil foldet og foldet protein, som i det avgjørende trinn av foldingsmåling vil kunne perkoleres gjennom refoldingsreaktoren og deretter overvåkes m-line i effluenten ved hjelp av egnet analytisk apparatur
Et intelligent overvåkings- og styresystem vil videre kunne anvende tilgjengelig informasjon for å dirigere anvendbare deler av reaktoreffluent i spill/ resirkuleringssubsystemer og derved minimalisere utgifter ved storskaladrift
Etter utførelse av foldmgsprosessen kan slutt-produktet elueres utfra affmitetsmatriksen i en konsentrert form, bearbeidet for å frigjøre det modne, autentiske protein ved spalting i det utformete protease-spaltmgssted og deretter underkastes sluttopparbeidelse under anvendelse av standardprotemrense- og håndtermgs-teknikker som er velkjente på området proteinkjemi
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Den foreliggende oppfinnelse er kjennetegnet ved at det opprinnelige hele av polypeptidmolekyler underkastes en serie på minst fem suksessive sykluser som hver omfatter en sekvens av 1) minst ett denatureringstrinn som omfatter betingelser som utøver en denaturerende og/eller utfoldende innvirkning på polypeptidmolekylene i helet slik at en fraksjon av polypeptidene i helet denatureres, etterfulgt av 2) minst ett renatureringstrinn som omfatter betingelser som har en renaturerende innvirkning på polypeptidmolekylene som har konformasjoner som er resultatet av det foregående trinn, slik at en fraksjon av de denaturerte og/eller ufoldete polypeptider i helet renatureres,
idet serien av minst fem suksessive sykluser er tilpasset slik at det bearbeidede hele av polypeptidmolekyler har en høyere fraksjon av polypeptidmolekyler i den spesielle foldete konformasjon enn
a) det opprinnelige hele, og
b) et tilsvarende opprinnelig hele som har vært
utsatt for bare en av syklusene
De foretrukne utførelsene av fremgangsmåten er angitt i krav 2-48
I beskrivelsen og kravene benyttes termen "hele" i den mening det har fått på området, dvs at den angir en samling molekyler som har stort sett felles trekk I begynnelsen ("et utgangshele") har de i det minste sin aminosyresekvens felles (og bibeholder selvfølgelig dette fellestrekk) Når helet av polypeptidmolekyler er blitt behandlet ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen (som resulterer i "et bearbeidet hele") vil konformasjonstil-standene representert i helet inneholde en vesentlig fraksjon av polypeptidmolekyler med en spesiell konformasjon Slik det vil forstås av diskusjonen som følger kan den vesentlige fraksjon av polypeptidmolekyler med en spesiell konformasjon i det bearbeidede hele variere avhengig av parametrene ved behandlingen ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, størrelsen på proteinet i den spesielle konformasjon, lengden og identiteten til ammosyresekvensen i molekylene etc I eksemplene som er rapportert her, hvor prosessparametrene ennå ikke er blitt optimalisert, varierte fraksjonen av polypeptidmolekyler med en spesiell konformasjon mellom 15% og 100% av helet, som i alle tilfeller er over det som ville kunne oppnås før den foreliggende oppfinnelse I eksempel 13 er det videre vist at rensing av polypeptidmolekylene før de underkastes fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen øker fraksjonen av polypeptidmolekyler med én spesiell konformasjon
"Denatureringstrinn" refererer til eksponering av et hele av polypeptidmolekyler i et tidsintervall for fysikalske og/eller kjemiske omstendigheter som utsetter helet av polypeptidmolekyler for betingelser som kjennetegnes av strengere denaturermgskraft enn de karakteriserende betingelser umiddelbart før denatureringstrinnet
Følgelig refererer termen "renaturenngstrinn" til eksponering av helet av polypeptidmolekyler i et tidsintervall for fysikalske og/eller kjemiske omstendigheter som utsetter helet av polypeptidmolekyler for betingelser som kjennetegnes ved mindre kraftig denaturermgskraft enn de karakteriserende betingelser umiddelbart før denatureringstrinnet
Det vil forstås at den "vesentlige fraksjon" som er nevnt ovenfor vil avhenge av størrelsen på helet av polypeptidmolekyler som utsettes for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen Dersom det bearbeidede hele av polypeptider består av monomere proteiner av relativt korte lengder og uten mtramolekylære disulfldbroer vil fremgangsmåten generelt resultere i meget høye utbytter, mens kompliserte molekyler (såsom polymere proteiner med en komplisert disulf ldbrotopologi) kan resultere i lavere utbytter, selv om betingelsene ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er helt optimaliserte
Et interessant aspekt ved oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte som er beskrevet ovenfor hvor det bearbeidede hele omfatter en vesentlig fraksjon av polypeptidmolekyler i en konformasjonstilstand hvor den vesentlige fraksjon utgjør mmst 1 vekt% av utgangshelet av polypeptidmolekyler Høyere utbytter foretrekkes, såsom minst 5%, mmst 10%, minst 20% og minst 25% av utgangshelet av polypeptidmolekyler Mer foretrukne er utbytter på minst 30%, såsom mmst 40%, 50%, 60%, 70% og mmst 80% Særlig foretrukne er utbytter på minst 85%, såsom 90%, 95%, 97% og sogar 99% Noen ganger iakttas det utbytter på nær 100%
Når polypeptidmolekylene i neiet inneholder cystein vil det bearbeidede hele omfatte en vesentlig fraksjon av polypeptidmolekyler i en spesiell, homogen konformasjon som i tillegg har stort sett identisk disulfidbrotopologi
I de fleste tilfeller vil polypeptidmolekylene som underkastes fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ha en aminosyresekvens som er identisk med sekvensen til et autentisk polypeptid, eller molekyler som omfatter en aminosyresekvens som tilsvarer sekvensen til et autentisk polypeptid bundet til ett eller to ytterligere polypeptidsegmenter
Med betegnelsen "autentisk protein eller polypeptid" menes et polypeptid med primær struktur, inneholdende N-og C-terminale strukturer, identisk med strukturen til det tilsvarende naturlige protein Termen omfatter også et polypeptid som har en kjent primærstruktur som ikke nød-vendigvis er identisk med strukturen til et naturlig protein, hvorved dette polypeptid er det tilsiktede sluttprodukt av en proteinsyntese
Med termen "naturlig protein" menes et protein slik det isoleres i sm biologisk aktive form fra en organisme hvor det foreligger, ikke som en følge av genetisk manipulering
Derimot er termen "kunstig protein eller polypeptid" slik den benyttes i den foreliggende oeskrivelse og krav ment å vedrøre et protein/polypeptid som ikke er tilgjengelig fra noen naturlige kilder, dvs ikke kan isoleres og renses fra noen naturlig kilde Et kunstig protein/polypeptid er følgelig resultatet av innblanding fra mennesker og kan f -eks være et produkt av rekombinant DNA-manipulering eller en form for peptidsyntese m vitro I overensstemmelse med definisjonene ovenfor kan et slikt kunstig protein være et autentisk protein, men ikke et naturlig protein
Oppfinnelsen vedrører således en fremgangsmåte hvor både naturlige proteiner og kunstige proteiner underkastes refoldingsprosessene som er beskrevet her
Slik det vil bli forklart mer detaljert nedenfor kan det være fordelaktig av forskjellige årsaker at det autentiske polypeptid er bundet til polypeptidsegmenter som har hjelpefunksjoner under sykliseringen og annen foregående eller etterfølgende bearbeidelse, f eks i form av "angrepspunkter" for binding av polypeptidet til en bærer, som løselighetsmodifiseringsmidler, som ekspre-sjonsboostere som har utøvet sin gunstige funksjon under translasjon av messenger-RNA etc Et slikt hjelpepoly-peptidsegment vil fortrinnsvis være bundet til det autentiske polypeptid via en spaltbar binding, og når to slike hjelpepolypeptidsegmenter er bundet til det autentiske polypeptid kan dette være via lignende spaltbare bindinger, som normalt vil bli spaltet samtidig, eller via forskjellige spaltbare bindinger som kan spaltes i en vilkårlig tidssekvens
I overensstemmelse med det som er forklart ovenfor antas det å være et nytt, karakteristisk hovedtrekk ved oppfinnelsen at sykliseringen (som slik som forklart ovenfor omfatter minst to suksessive sykluser) vil gi opphav til minst en begivenhet hvor et renatureringstrinn etter-følges av et denatureringstnnn nvor i det minste en vesentlig fraksjon av de refoldete polypeptider vil bli denaturert igjen
I de fleste tilfeller vil bearbeidelsen omfatte minst 3 sykluser, ofte minst 5 sykluser og enda oftere
minste 8 sykluser, såsom minst 10 sykluser, og i de fleste tilfeller minst 25 sykluser På den annen side vil serien av sykluser normalt ikke overskride 2 000 sykluser og vil ofte omfatte høyst 1 000 sykluser og oftere høyst 500
sykluser Antallet sykluser som benyttes vil avhenge delvis av mulighetene som er tilgjengelige med utstyret hvor sykliseringen utføres.
Dersom sykliseringsbehandlingen således utføres med polypeptidmolekyler som er immobilisert på en bærersøyle, noe som vil bli forklart mer detaljert nedenfor, vil hastigheten hvormed væskefasen i kontakt med søylen kan skiftes ut utgjøre én grense av det som realistisk kan oppnås På den annen side vil høytrykks-væskekromatografi (HPLC) utstyr gjøre det mulig med meget hurtig utskifting av væskemiljøet og derved gjøre syklusantall i området hundreder eller tusener realistisk
Annen betraktning som bestemmer det ønskelige antall sykluser er f eks iboende kinetiske parametre, såsom intern omdanning mellom cis- og transisomerer i prolin-rester, noe som vil ha tendens til å komplisere refor-delmg over de delvis foldede tilstander og følgelig normalt vil kreve tilbørlig fastleggelse av tidspunkt Et annet tidskritisk karakteristikum ligger i kinetikken ved disulfidomdanning {se diskusjonen nedenfor om disulfidom-danningssysterner)
Med tilbørlig hensyntagen til det ovennevnte vil sykliseringsseriene ofte omfatte høyst 200 sykluser, oftere høyst 100 sykluser og enda oftere høyst 50 sykluser
I overensstemmelse med det som er angitt ovenfor kan varigheten av hvert denatureringstrinn være en varighet
som under de spesielle betingelser som foreligger er minst 1 millisekund og høyst 1 time, og varigheten av hvert renatureringstrinn kan være en varighet som under de spesielle betingelser som foreligger er minst 1 sekund og høyst 12 timer
I de fleste utførelser av fremgangsmåten holdes denatureringsbetingelsene i hvert individuelt denatureringstrinn stort sett konstant i et tidsrom, og renaturermgs-betingelsene i hvert individuelt renatureringstrinn holdes stort sett konstant i et tidsrom, hvorved tidsrommene hvor betingelsene holdes stort sett konstant er adskilt med overgangsperioder hvor betingelsene forandres Overgangsperioden mellom trinnene hvor betingelsene holdes stort sett konstant kan ha en varighet som varierer over et bredt område, såsom mellom 0,1 sekund og 12 timer, og vil vanligvis bli nøye tilpasset til varighetene av denaturerings- og renatureringstnnnene
Med dette i tankene kan tidsrommet hvor denaturer-mgsbetmgelsene i et denatureringstrinn holdes stort sett konstant, f eks ha en varighet på minst 1 millisekund og høyst 1 time, som oftest høyst 30 minutter, og tidsrommet hvor renatureringsbetingelsene i et renatureringstrmn holdes stort sett konstant har en varighet på mmst 1 sekund og høyst 12 timer, ofte høyst 2 timer
I praksis vil tidsrommet hvor aenatureringsbeting-elsene i et denatureringstrinn holdes stort sett konstant ofte ha en varighet på mellom 1 og 10 minutter, og tidsrommet hvor renatureringsbetingelsene i et renatureringstrmn holdes stort sett konstant vil ofte ha en varighet på mellom 1 og 45 minutter
Av det som er anført ovenfor vil det forstås at justeringer av intervallene som er angitt ovenfor bør gjøres under hensyntagen til forandringen av kinetikk som fremkommer ved forandringen av fysikalske betingelser som polypeptidene utsettes for F eks kan trykket vær meget høyt (opptil 5 000 bar) ved anvendelse av et HPLC-system ved utøvelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, og under slike omstendigheter kan meget hurtige trinn bli gjennomført og/eller være nødvendige Dessuten er som det fremgår av eksemplene temperaturparameteren av viktighet idet noen proteiner bare vil refolde skikkelig ved tempe-raturer langt fra det fysiologiske område Både temperatur og trykk vil selvfølgelig ha en virkning på kinetikken i refoldmgsprose-ssen ifølge oppfinnelsen, og derfor er de ovenfor antydede tidsintervaller for renaturerings- og denatureringstrinn realistiske grenser for de mange mulige utførelsesformer av oppfinnelsen
For en gitt anvendelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen vil en fagmann på området være i stand til å bestemme passende betingelser basert f eks preliminære for-søk
Som antydet ovenfor er polypeptidmolekylene normalt i kontakt med en væskefase i denaturerings- og renaturer-mgstrinnene, hvorved væskefasen vanligvis er en vandig fase Dette betyr at reagenser eller hjelpesubstanser som anvendes i fremgangsmåten vanligvis vil være løst i væskefasen, vanligvis i den vandige fase Men dersom det er hensiktsmessig kan væskefasen også bestå av ett eller flere organiske løsningsmidler
I forbindelse med renaturering av proteiner er det velkjent å anvende et såkalt "chaperone" eller "chaperonekompleks" Chaperoner er en gruppe nylig beskrevne proteiner som viser et fellestrekk i sin evne til å øke refolding av ufoldete eller delvis ufoldete proteiner Ofte er chaperonene multimolekylære komplekser Mange av disse chaperoner er varmesjokkproteiner, noe som betyr at de m vivo funksjonerer som faktorer som utfører posttraumatisk "reparasjon" av proteiner som er blitt destabilisert av traumaen For å være i stand til å oppfylle denne funksjon har chaperoner tendens til å være mer stabile overfor traumatiske begivenheter enn mange andre proteiner og proteinkomplekser Selv om fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ikke avhenger av anvendelsen av et molekylært chaperone eller et molekylært chaperonekompleks er det selvfølgelig mulig å ha et egnet molekylært chaperone eller molekylært chaperonekompleks tilstede i minst ett renatureringstrinn, og det kan være foretrukket å ha et molekylært chaperone eller et molekylært chaperonekompleks tilstede under stort sett alle sykluser
Som nevnt ovenfor er polypeptidmolekylene fortrinnsvis stort sett begrenset til et miljø som muliggjør forandring eller utskifting av væskefasen stort sett uten innblanding av polypeptidmolekylene.
Dette kan oppnås på forskjellige måter F eks. kan polypeptidmolekylene befinne seg i et dialyseapparat, eller de kan være begrenset til en av fasene i et passende væskeformet tofasesystem Et slikt egnet vandig tofasesystem kan f eks inneholde en polymer valgt blant polyetylenoksid (polyetylenglykol), polyvinylacetat, dekstran og dekstransulfat I ett interessant arrangement inneholder en fase polyetylenoksid (polyetylenglykol), og den annen fase inneholder dekstran, hvorved polypeptidmolekylene vil være begrenset til den dekstranholdige fase
En annen måte til å unngå innblanding av polypeptidet er ha polypeptidmolekylene bundet til en fast eller halvfast bærer, såsom en fllteroverflate, en hulfiber eller et perleformet kromatografimedium, f eks en agarose, eller polyakrylamiddel, en fibrøs cellulose-matriks eller en HPLC eller FPLC (Fast Performance Liquid Chromatography) matriks Som en annen foranstaltning kan bæreren være en substans som har molekyler av en slik størrelse av molekylene med polypeptidmolekylene bundet til seg, løst eller dispergert i en væskefase, kan holdes tilbake ved hjelp av et filter, eller bæreren kan være en substans som er i stand til å danne miceller eller delta i dannelsen av miceller som muliggjør forandring av eller stort sett utskifting av væskefasen uten å blande inn micellene I tilfeller hvor de celledannende bestanddeler ville være tilbøyelige til å unnslippe fra systemet som monomerer, f eks når de ville være i stand i noen grad til å passere et ultrafilter som ble anvendt til begrensning av systemet kunne dette bli kompensert ved påfylling med ytterligere micelledannende monomer
Bæreren kan også være en vannløselig polymer som har molekyler av en størrelse som stort sett ikke vil være i stand til å passere gjennom porene i et filter eller annen innretning som anvendes for begrensning av systemet
Polypeptidmolekylene er hensiktsmessig ikke kovalent adsorbert på bæreren via en enhet som har affinitet til en bestanddel av bæreren En slik enhet kan f eks være en biotmgruppe eller en analog derav bundet til en arnu-no-syreenhet i polypeptidet, hvorved bæreren har avidin, streptavidm eller analoger derav bundet dertil til dannelse av et system med en sterk affinitet mellom de således modifiserte polypeptidmolekyler og den således modifiserte bærer Det vil forstås at affiniteten mellom det modifiserte polypeptid og den modifiserte bærer bør være tilstrekkelig stabil, slik at adsorpsjonen vil være stort sett upåvirket av denatureringsbetmgelsene Fjerningen av polypeptidmolekylene fra bæreren etter sykliseringen bør utformes under anvendelse av spesifikk spalting, slik som forklart i det etterfølgende
Et eksempel på en egnet ammosyrerest som biotmyl-gruppen kan være bundet til er lysin
En interessant måte å innføre en aminosyre på som har en enhet med affinitet til bæreren er CPY-syntese. CPY (karboksypeptidase Y) er kjent for å være i stand til å addere aminosyreamid uavhengig av naturen til aminosyre-amidets sidekjede
I en interessant utførelsesform er enheten som har affinitet til bæreren polypeptidsegmentet SEQ "ID nr 47, hvorved bæreren hensiktsmessig omfatter et nitriloeddik-syrederivat (NTA) ladet med Ni<++->ioner, f eks en NTA-agarosematriks som er blitt anbrakt i en løsning som inneholder Ni<++>
En viktig side ved oppfinnelsen vedrører nærværet av et egnet middel i polypeptidmolekylet som preparerer mole-kylet for senere spalting i to eller flere segmenter, hvor ett segment er et autentisk polypeptid slik som definert ovenfor Slike kombinerte polypeptidmolekyler (fusjons-polypeptidmolekyler) kan for dette formål omfatte et polypeptidsegment som er i stand til å dirigere foretrukket spalting ved hjelp av et spaltingsmiddel i en spesifikk peptidbinding Vedkommende polypeptidsegment kan være et som styrer spaltingen som et resultat av konformasjonen til segmentet som funksjonerer som et gjenkjenningssete for spaltingsmidlet
Det spaltingsstyrende polypeptidsegment kan f eks være i stand til å styre foretrukket spalting i en spesifikk peptidbinding ved hjelp av et spaltingsmiddel valgt blant cyanogenbromid, hydroksylamm, jodosobenzosyre og N-bromsuccinimid
Det spaltmgsstyrende polypeptidsegment kan være et som er i stand til å styre foretrukket spalting i en spesifikk peptidbinding ved hjelp av et spaltingsmiddel som er et enzym, og ett slikt mulig enzym er bovin enterokinase eller en analog -og/eller homolog derav
Det er en viktig side ved oppfinnelsen at spaltingsmidlet er enzymet bovin koaguleringsfaktor Xa eller en analog og/eller homolog derav (slike analoger vil bli diskutert mer detaljert lenger nede), og polypeptidsegmentet som styrer foretrukket spalting er en sekvens som gjenkjennes stort sett selektivt av bovin koagulerings-faktor Xa eller en analog og/eller homolog derav Viktige slike segmenter er polypeptidsegmenter som har en sekvens valgt blant SEQ ID nr 38, SEQ ID nr 40, SEQ ID nr 41 og SEQ ID nr 42
Et interessant trekk ved oppfinnelsen er muligheten til å maskere og demaskere polypeptidsegmenter når det gjelder deres evne til å styre spalting i en spesifikk peptidbinding, hvorved det oppnås at forskjellige segmenter av polypeptidet -kan spaltes på forskjellige stadier i syklusene
Når således polypeptidmolekylene omfatter et polypeptidsegment som in vitro kan omdannes til et derivatisert polypeptidsegment som er i stand til å styre foretrukket spalting ved hjelp av et spaltingsmiddel i en spesifikk peptidbinding blir en maskerings-/demaskerings-effekt slik som nevnt tilgjengelig En særlig foretrukket versjon av denne strategi er der hvor polypeptidsegmentet som kan omdannes in vitro kan omdannes til et derivatisert polypeptidsegment som gjenkjennes stort sett selektivt av bovin koaguleringsfaktor Xa eller en analog og/eller homolog derav
Det forventes at både cystem- og metioninrester kan omdannes til modifiserte rester, og disse modifiserte rester utgjør segmentene som har ammosyresekvenser valgt blant SEQ IR nr 43, SEQ ID nr 44, SEQ ID nr 45 samt SEQ ID nr 46 omdannbare m vitro til segmenter som gjenkjennes av bovin koaguleringsfaktor Xa eller en analog og/eller homolog derav
Ifølge oppfinnelsen er én mulig løsning som omfatter cysteinresten at et polypeptidsegment med ammosyresekvensen SEQ ID nr 43, eller SEQ ID nr 44, omdannes til et derivatisert polypeptid som gjenkjennes stort sett selektivt av bovin koaguleringsfaktor Xa, ved omsetning av cysteinresten med N-(2-merkaptoetyl)morfolyl-2-tiopyridyl-disulfid eller merkaptotioacetat-2-tiopyridyldisulfid
En mulig strategi ifølge oppfinnelsen som omfatter metionm er at et polypeptidsegment med aminosyresekvensen SEQ ID nr 45 eller SEQ ID nr 46 omdannes til et derivatisert polypeptid, som gjenkjennes stort sett selektivt av bovin koaguleringsfaktor Xa, ved oksidasjon av tioeterenheten i metioninsidegruppen til et sulfoksid eller sulfonderivat
Foretrukne utførelsesformer av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er de hvor de spaltingsstyrende segmenter med ammosyresekvensene SEQ ID nr 38, SEQ ID nr 40, SEQ ID nr 41 eller SEQ ID nr 42, eller de maskerte spaltingsstyrende segmenter med ammosyresekvensene SEQ ID nr 43, SEQ ID nr 44, SEQ ID nr 45 samt SEQ ID nr 46 er bundet N-termmalt til det autentiske polypeptid, på grunn av at det deretter ikke er nødvendig med noen ytterligere bearbeidelse annet enn den selektive spalting for å oppnå det autentiske polypeptid i løsning På den annen side vil en mulig årsak for å koble de spaltingsstyrende sekvenser i C-terminalenden av det autentiske polypeptid være at den riktige folding av polypeptidmolekylene er avhengig av en fri N-termmus i polypeptidmolekylene I et slikt tilfelle kan den del av den spaltingsstyrende sekvens som blir igjen etter spalting fjernes ved passende anvendelse av karboksypeptidaser A og B
Forandringen av betingelser i løpet av overgangsperioden mellom trinnene kan ifølge oppfinnelsen oppnås ved forandring av den kjemiske sammensetning av væskefasen som polypeptidmolekylene er i kontakt med Men således kan denaturering av polypeptidmolekylene oppnås ved å bringe polypeptidmolekylene i kontakt med en væskefase hvori minst en denaturerende forbindelse er løst, og renaturering av polypeptidmolekylene oppnås ved å bringe polypeptidmolekylene i kontakt med en væskefase som enten inneholder minst en løst denaturerende forbindelse i en slik konsentrasjon at kontakten med væskefasen vil være tilbøyelig til å renaturere istedenfor å denaturere helet av polypeptidmolekyler i deres respektive konformasjonstilstander som er resultatet av det foregående trinn, eller inneholder stort sett ingen denaturerende forbindelse
Uttrykket "denaturerende forbindelse" refererer til en forbindelse som når den er tilstede som ett av de opp-løste produkter i en væskefase som omfatter polypeptidmolekyler kan destabilisere foldete tilstander av polypeptidmolekylene, noe som fører til delvis eller fullstendig utfolding av polypeptidkjeden Den denaturerende effekt som bevirkes av en denaturerende forbindelse øker med økende konsentrasjon av den denaturerende forbindelse i løsningen, men kan dessuten økes eller modereres som følge av nærværet av andre oppløste produkter i løsningen, eller ved forandringer i fysikalske parametre, f eks temperatur eller trykk
Som eksempler på egnete denaturerende forbindelser for anvendelse i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan nevnes urea, guanidm-HCl, di-C]__g-alkylf ormamider, såsom dimetylformamid, samt di-C^-g-alkylsulfoner
Væskefasen som anvendes i minst ett av denatureringstrinnene og/eller i minst ett av renatureringstrinnene kan ifølge oppfinnelsen inneholde minst ett disulfid-om-danningssystem
"Disulfldomdannmgssysteraer" er redokssystemer som inneholder blandinger av reduserende og oksiderende midler hvis nærvær letter brytingen og dannelsen av disulfid-bindinger i et polypeptid eller mellom polypeptider.
Følgelig er "disulfidomdanningsraidler" eller "disulfidom-danningsforbindelser" slike reduserende og oksiderende midler som letter brytingen og dannelsen av disulfid-bmdinger i et polypeptid eller mellom polypeptider Ifølge en viktig side ved oppfinnelsen omfatter disulfidomdanningssystemet i den vandige fase som er i kontakt med proteinene som disulfidomdanningssystem en blanding av en merkaptan og dens tilsvarende disulfidforbindelse
Som eksempel kan alle cystemrester i polypeptidmolekylene være blitt omdannet til blandete disulfid-produkter av enten glutation, tiocholin, merkaptoetanol eller merkaptoeddiksyre under minst en av denaturermgs-/ renatureringssyklusene Et slikt omdannet polypeptid benevnes et "fullstendig disulfldblokkert polypeptid eller protein", og denne betegnelse refererer således til et polypeptid eller et protein hvor cysteinrestene er blitt omdannet til et blandet disulfid hvor hver cysteinrest er disulfidbundet til en merkaptan, f eks glutation Omdan-nelsen av cysteinrestene til blandete disulfldprodukter kan utføres ved omsetning av et fullstendig denaturert og fullstendig redusert hele av polypeptidmolekyler med et overskudd av en reaktant som er energirike, blandete disulf idforbindelser, såsom alifatisk-aromatiske disulfid-forbindelser, f eks 2-tiopyridylglutationyldisulfid, eller ved en vilkårlig annen egnet metode
Som eksempler på energirike, blandete disulfider, dvs blandete disulfider som har en relativt ustabil S-S-binding, kan det nevnes blandete disulfider som har den
generelle formel
hvor Ri er 2-pyridyl og hver av R2, R 3 og R4 er hydrogen eller en, eventuelt substituert, lavere aromatisk eller
alifatisk hydrokarbongruppe Eksempler på slike blandete disulfider er glutationyl-2-tiopyridyldisulfid, 2-tio-kolyl-2-tiopyridyldisulfid, 2-merkaptoetanol-2-tiopyridyl-disulfid og merkaptoacetat-2-tiopyridyldisulfid
I interessante utførelsesformer inneholder disulfidomdanningssystemet glutation, 2-merkaptoetanol eller tio-kolin, hver i blanding med dets tilsvarende, symmetriske disulfid
Egnetheten av en gitt blanding av tioler for anvendelse som selektivt reduserende og/eller disulfxdomdan-ningsystem i en syklisk refoldings/reoksidasjonsprosess for et spesifikt proteinprodukt kan utprøves direkte ved mkubermg av heler av prøver av en blanding av foldet og feilfoldet protein med en rekke tiolblandinger av atskillige forskjellige konsentrasjoner av denaturerings-middel, som utøver svake, middels eller sterke denaturerende virkninger på proteinet Etter inkubasjon låses deretter disulfldtopologien i hver prøve ved omsetning med et overskudd av tiolblokkeringsreaktant (f eks jodacet-amid) før hvert sett av prøver utsettes for SDS-PAGE under ikke-reduserende betingelser Materiale med riktige di-sulfidbroer og materiale i uønskede, kovalente, topologiske tilstander vil komme til syne i separate bånd og vil derfor muliggjøre kvantitativ bestemmelse av foldmgs-tilstand av proteinet pa tidspunktet for tiolblokkenng på grunn av at bare riktig, unikt disulfldbandet topoisomer kan tilsvare riktig foldet protein som foreligger ved slutten av mkubermg med tiol/disulfid og denaturerings-midler Dette sett av forsøk muliggjør identifisering av området av denatureringsmiddelnivåer hvor en gitt tiol-/ disulfidreaktant kan anvendes på fordelaktig måte som disulfidomdanningsmiddel, slik det røpes av foretrukket reduksjon og omdanning av feile disulfldbmdinger og lav tilbøyelighet til å redusere bindinger i det fullstendig foldete protein Denne reaktanttestmgsprosess kan benyttes som en generell prosess for utvelgelse av fordelaktige reduserende og/eller tiol-/disulfidomdannende midler Eksempel 12 viser anvendelse av denne analytiske prosess for å bestemme egnetheten for selektiv reduksjon av feilfoldete former av et modellprotem for 5 tiol-reaktanter og viser derved om prosessen ovenfor funksjonerer
Det vil forstås at den ovenfor beskrevne prosess for utvelgelse av egnete disulfidomdanningssystemer også kan benyttes for utvelgelse av andre materialer enn blandinger av tioler Enhver blanding som inneholder egnete reduksjons/oksidasjonsmidler kan evalueres i overensstemmelse med den ovenfor beskrevne prosess, og det valgte materiale i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen vil være et som oppviser den høyeste evne til preferensiell reduksjon av ukorrekt dannete disulfldbroer
En meget viktig side ved oppfinnelsen er således en fremgangsmåte for protemrefolding som beskrevet her hvor i det minste ett disulfidomdanningssystem i væskefase i minst ett renaturerings- og/eller denatureringstrinn er et system som er i stand til å redusere og/eller omdanne ukorrekt dannete disulfldbroer under betingelser når det gjelder konsentrasjon av det denaturerende middel hvor ufoldete og/eller feilfoldete proteiner denatureres og hvor der er stort sett ingen reduksjon og/eller omdanning av riktig dannete disulfldbroer
En interessant utførelsesform av oppfinnelsen er en fremgangsmåte slik som er beskrevet ovenfor hvor et disulf idomdanningssystem benyttes i mmst ett denaturerings-/renaturermgstrmn og resulterer i et forhold mellom den relative mengde av redusert/omdannet, innledningsvis ukorrekt dannete disulfldbroer og den relative mengde av redusert/omdannet, innledningsvis riktig dannete disulfld-broer på mmst 1,05 Forholdet vil fortrinnsvis være høyere, såsom 1,1, 1,5, 2,0, 3,0, 5,0, 10, 100, 100O, men også høyere forhold er realistiske og er følgelig særlig foretrukket ifølge oppfinnelsen
Med betegnelsene "innledningsvis ukorrekt/korrekt"
når det gjelder formen på disulfldbroer menes disulfldbro-topologi umiddelbart før disulfidomdanningssystemet utøver sine virkninger
Det vil forstås at forholdet må være større enn 1
for å muliggjøre den netto dannelse av korrekt formede di-sulfidbroer i en proteinprøve Vanligvis bør forholdet være så høyt som mulig, men sogar forhold som er marginalt over 1 vil muliggjøre den netto dannelse av korrekt formete disulfldbroer i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, idet den viktige parameter når det gjelder å sikre et høyt utbytte er antallet denaturermgs-/renatureringssykluser Forhold like over 1 krever at mange sykluser fullføres før det er oppnådd et betydelig utoytte av korrekt formete disulfldbroer, mens høye forhold bare krever et begrenset antall sykluser
I tilfeller hvor bare ett disulfidomdanningssystem skal benyttes kan et slikt disulfidomdanningssystem ifølge oppfinnelsen velges ved
1) inkubering av prøver av foldet og feilfoldet protein av den samme aminosyresekvens som proteinet som skal bearbeides ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen med en rekke disulfidomdanningssystemer med atskillige forskjellige konsentrasjoner av et valgt denaturerende middel, 2) bestemmelse for hver av de forskjellige konsentrasjoner av denaturerende middel evnen til hvert av disulf idomdanningssystemene til å redusere og/eller omdanne innledningsvis ukorrekt formete disulfldbroer uten vesentlig reduksjon og/eller omdanning av innledningsvis korrekt formete disulfldbroer slik som fastlagt ved beregning av forholdet mellom den relative mengde av redusert/omdannet, innledningsvis ukorrekt formete disulfldbroer og den relative mengde av redusert/omdannet og innledningsvis korrekt formete disulfldbroer, samt 3) utvelgelse som disulfidomdanningsystem X det disulf idomdanningsystem som har evnen til å redusere innledningsvis ukorrekt formete disulfldbroer uten vesentlig reduksjon og/eller omdanning av innledningsvis korrekt formete disulfldbroer i det videste område av konsentrasjoner av det valgte denaturerende middel
Alternativt kan det anvendes mer enn ett disulfidomdanningssystem, f eks i forskjellige sykluser i den sykliske refoldingsmetode ifølge oppfinnelsen, men også samtidig i de samme sykluser Dette vil f.eks være til-fellet når det er sannsynlig eller blitt fastlagt, f eks ved fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, at det totale utbytte av korrekt foldet protein med korrekt disulfidbrotopologi vil være høyere dersom det anvendes forskjellige disulfldomdannmgssystemer i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen
For å beregne det ovennevnte forhold mellom den relative mengde av reduserte/omdannede, innledningsvis ukorrekt formete disulfldbroer og den relative mengde av reduserte/omdannede, innledningsvis korrekt formete di-sulficibroer kan følgende fremgangsmåte benyttes Til den opprinnelige blanding av reaktanter i trinn 1) tilsettes det en kjent mengde radioaktivt merket, riktig foldet protein Når mengdene av korrekt og ukorrekt foldet protein bestemmes i trinn 2) (f eks ved hjelp av ilcke-reduserende SDS-PAGE) bestemmes innholdet av radio-aktivitet i den korrekt foldete proteinfraksjon også. Derved kan en fastsettelse av det nå ukorrekt foldete (men opprinnelig korrekt foldete) protein bestemmes parallelt med bestemmelsen av den totale fordeling av korrekt/ ukorrekt foldet protein Ovennevnte fordel kan følgelig beregnes som hvor C]_ og C2 er henholdsvis opprinnelig mengde og slutt-mengde av korrekt foldete proteiner, U-^ er mengden opprinnelig ukorrekt foldet protein og og A2 er radioakti-viteten 1 den opprinnelig korrekt foldete proteinfraksjon og 1 den til slutt korrekt foldete proteinfraksjon
I tillegg til denaturermgsmåtene som er nevnt ovenfor kan denaturering også oppnås eller økes ved senkning av væskefasens pH eller ved økning av vasskefasens pH
Polariteten til væskefasen som anvendes ved renatureringen kan ifølge oppfinnelsen være blitt modifisert ved tilsetning av et salt, en polymer og/eller en hydrofluorforbmdelse, såsom trifluoretanol
Ifølge oppfinnelsen kan denatureringen og renatureringen av polypeptidmolekylene også oppnås ved direkte forandringer av fysikalske parametre som polypeptidmolekylene utsettes for, såsom temperatur eller trykk, eller disse foranstaltninger kan benyttes for å øke eller mode-rere denatureringen eller renatureringen som resulterer av de andre foranstaltninger som er nevnt ovenfor
Men det vil forstås at en høyst viktig praktisk ut-førelsesform av fremgangsmåten utføres ved å foreta kjemiske forandringer av væskefasen ved forandring mellom en denaturerende løsning B og en renaturerende løsning A I dette tilfelle vil konsentrasjonen av en eller flere denaturerende forbindelser 1 B ofte justeres etter hver syklus, og som ett viktig eksempel vil konsentrasjonen av en eller flere denaturerende forbindelser 1 B bli minsket etter hver syklus, men 1 en annen viktig utførelsesform holdes konsentrasjonen av én eller flere denaturerende forbindelser 1 mediet B konstant 1 hver syklus
Denne utførelsesform av oppfinnelsen, hvor konsentrasjonen av denaturerende forbindelse(r) 1 medium B holdes konstant er særlig interessant når den mest produktive fase 1 sykliseringsprosessen (når det gjelder korrekt foldet protein) er blitt identifisert og det er ønskelig med produksjon av korrekt foldet protein 1 stor skala Slik det vil forstås er den eller de foretrukne konsentrasjoner av denaturerende forbindelse(r) i medium B i denne utførelsesform den eller de konsentrasjoner som det er fastlagt at sikrer maksimal produktivitet i syklisermgs-prosessen ifølge oppfinnelsen
Polypeptidmolekylene i helet som underkastes fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen har vanligvis en lengde på minst 25 ammosyrerester, såsom mmst 30 ammosyrerester eller mmst 50 ammosyrerester På den annen side har polypeptidmolekylene i helet vanligvis en lengde på høyst 5000 ammosyrerester, såsom høyst 2000 ammosyrerester eller høyst 1000 eller 800 ammosyrerester
Som det fremgår av eksempel 10 har fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen muliggjort produksjon av korrekt foldete diastoffmolekyler (diastoffer er beskrevet i Holliger et al , 1993)
En viktig side ved oppfinnelsen er en fremgangsmåte til fremstilling av korrekt.foldete diastoffmolekyler hvor et opprinnelig hele av polypeptidmolekyler som omfatter ufoldete og/eller feilfoldete polypeptider har en aminosyresekvens som er identisk med ammosyresekvensen i mono-merfragmentene i diastoffmolekylene underkastes en serie på minst to suksessive sykluser, som hver omfatter en sekvens av
<*> 1) minst ett denatureringstrinn som omfatter betingelser som utøver en denaturerende innvirkning på polypeptidmolekylene i helet, etterfulgt av 2) minst ett renatureringstrinn som omfatter betingelser som har en renaturerende innvirkning på polypeptidmolekyler som har konformasjoner som er resultatet av den foregående trinn,
hvorved seriene av sykluser er tilpasset slik at en vesentlig fraksjon av det opprinnelige hele av peptidmole-kyler omdannes til en fraksjon av korrekt foldete diastof fmolekyler
En slik fremgangsmåte for korrekt folding av dia-st of f er kan betraktes i enhver av de ovenfor beskrevne senarier og sider ved refoldingsmetoden ifølge oppfinnelsen, dvs når det gjelder valget av fysikalske/kjemiske betingelser samt sykliseringsplaner Men en viktig side ved fremgangsmåten for korrekt folding av diastoffer er en fremgangsmåte slik som identifisert ovenfor hvor polypeptidmolekylene er i kontakt med en væskefase som inneholder minst ett disulfidomdanningssystem i minst ett denaturermgs- eller renatureringstrinn Det foretrukne denaturerende middel som skal anvendes i en slik væskefase er urea, og det foretrukne disulfidomdanningssystem omfatter glutation som hovedreduksjonsmiddel
Omtale av figurene
Fig 1 Skjematisk gjengivelse av segment av et syklisk denaturerings-/renatureringstidsprogram
Løsningsmiddelsammensetning er uttrykt i form av en binær blanding av en ikke-denaturerende buffer A og en denaturerende buffer B uttrykt som relativt innhold av buffer B Tre konsekutive sykluser er representert, hver bestående av en renatureringsf ase F og en denaturenngs-fase D Forandringer i nivå av denaturermgskraft hos løsningsmiddelblandmgen i løpet av denatureringsfaser i konsekutive sykluser er angitt med k
Fig 2 Konstruksjon av ekspresjonsplasmider pT-^Hg FX-hp2m og pT7HgFX-m(J2m
De mangfoldiggjorte DNA-fragmenter som inneholder leserammene av humant og murint [^-mikroglobulin fra ammosyrerester fra Ile-^ til Metgg, fusjonert i 5'-enden med nukleotidsekvensene som koder for FXa-spaltmgssetet (SEQ ID nr 37), ble kuttet med restnksjonsendonukleaser Barn HI og Hmd III (levert av Boehringer, Tyskland) og ligert med T4 DNA ligase (levert av Boehringer, Tyskland) inn i Barn HI og Hind III kuttet pT^Hg under anvendelse av standard prosesser
Fig 3 Aminosyrer fra humant og munnt p2-mikroglobulin
A Beregnet aminosyresekvens i den fulle lengde av leserammen som koder for humant 32-mikroglobulin (SEQ ID nr 49) Ammosyrerest en (Ile) i det bearbeidete, modne protein er angitt B Beregnet aminosyresekvens for den fulle lengde av leserammen som koder for murint p2-mikroglobulin {SEQ ID nr 50) Ammosyrerest en (Ile) i det bearbeidete, modne protein er angitt Fig 4 Konstruksjon av ekspresjonsplasmidet pT7Hg FX-hGH Det mangfoldiggjorte DNA-fragment som inneholder leserammen av humant veksthormon fra aminosyrerestene fra Phe]_ til Phe]_gj_, fusjonert i 5'-enden med nukleotidsekvensen som koder for FXa-spaltingssetet IEGR (SEQ ID nr 38), ble kuttet med restnksjonsendonukleasene Barn HI og Hind III {levert av Boehringer, Tyskland) og ligert med T4 DNA ligase (levert av Boehringer, Tyskland) inn i Barn HI og Hind III kuttet pT7Hg under anvendelse av standard prosesser Fig 5 Aminosyresekvens i humant veksthormon
(Somatotropm)
Den beregnete aminosyresekvens for den fulle lengde av leserammen som koder for humant veksthormon (SEQ ID nr 51) Den første ammosyrerest i det bearbeidete, modne protein (Phe^) er angitt
Fig 6 Konstruksjon av plasmidene pT7HgFX nr. 1, 2 og 3, som uttrykker ammosyrerester fra nr 20 {Ala) til 109 (Arg), ammosyrerest fra nr 20 (Ala) til 190 {Ala), samt ammosyrerest fra nr 20 {Ala) til 521 (Lys) i det humane a2-makroglubulinreseptorprotein (a2MR) (SEQ ID nr 52)
De mangfoldiggjorte DNA-fragmenter avledet fra leserammen av a2MR fra nr 1 ammosyrerest fra nr 20 (Ala) til 109 (Arg), nr 2 ammosyrerest fra nr 20 (Ala) til 190 {Ala) , samt nr 3 ammosyrerest fra nr 20 {Ala) til 521 (Lys), fusjonert i 5'-enden med nukleotidsekvensen som koder for FXa-spaltmgssetet IEGR (SEQ ID nr 38), ble kuttet med restnksjonsendonukleasene Barn HI og Hind III (levert av Boehringer, Tyskland) og ligert med T4 DNA ligase (levert av Boehringer, Tyskland) inn i Barn HI og Hind III kuttet pT7H6 under anvendelse av standard prosesser Fig 7 Konstruksjon av plasmidene pLcIIMLCHgFX nr 4, nr 5 og nr 6 som uttrykker ammosyrerester fra 803 (Gly) til 1265 (Asp) , ammosyrerester fra 849 {Val) til 1184 (Gin), samt ammosyrerester fra nr 1184 (Gin) til 1582 (Lys) av det humane a2-makroglobulinreseptorprotem {a2-MR) ( SEQ ID nr 52) De mangfoldiggjorte DNA-fragmenter avledet fra leserammen av a2-MR fra nr 4 ammosyrerester fra 803 (Gly) til 1265 (Asp), nr 5 ammosyrerest fra nr 849 (Val) til 1184 (Gin), og nr 6 ammosyrerest fra nr 1184 (Gin) til 1582 {Lys), fusjonert i 5'-enden med nukleotidsekvensen som koder for FXa-spaltmgssetet IEGR (SEQ ID nr 38), ble kuttet med restriksjonsendonukleasene Barn HI eller Bel og Hind III {levert av Boehringer, Tyskland) og ligert med T4 DNA ligase {levert av Boehringer, Tyskland) inn 1 Barn HI og Hind III kuttet pLcIIMLCHgFX under anvendelse av standard prosesser Fig 8 Konstruksjon av plasmidene pLcIIMLCHgFX nr 7 og 9 som uttrykker ammosyrerestene fra nr 803 (Gly) til 1582 (Lys), ammosyrerester fra 2519 (Ala) til 2941 (Ile) samt ammosyrerest nr 3331 (Val) til 3778 (Ile) av det humane a2-makroglobulinreseptorprotein (a2MR) (SEQ ID nr. 52)
De mangfoldiggjorte DNA-fragmenter avledet fra leserammen av a2MR fra nr 2 ammosyrerest fra nr 803 (Gly) til 1582 (Lys) , nr 8 ammosyrerest fra nr 2519 (Ala) til 2941 (Ile), og nr 9 ammosyrerest fra nr 3331 (Val) til 3778 (Ile), fusjonert i 5'-enden med nukleotidsekvensen som koder for FXa-spaltingssete IEGR (SEQ ID
nr 38) ble kuttet med restnksjonsendonukleasene Barn HI og Hind III {levert av Boehringer, Tyskland) og ligert med T^ DNA ligase (levert av Boehringer, Tyskland) mn 1 Barn HI og Hind III kuttet pLcIIMLCHgFX under anvendelse av standard prosesser
Fig 9a og 9b Aminosyresekvens av human a2-makro-globulinresptorprotem (ct2MR) <SEQ ID nr 52>
Den beregnete aminosyresekvens av den fulle lengde av leserammen som koder for a2MR Ammosyrerester som foreligger 1 de rekombinante proteiner som N- eller C-temmale rester er identifisert ved hjelp av deres numre over a2MR-sekvensen
Fig 10 Konstruksjon av ekspresjonsplasmidet pLcIIMLCH6 FX-FXAy
Det mangfoldiggjorte DNA-fragment som inneholdt leserammen til bovin blodkoaguleringsfaktor X fra ammosyrerest Ser82 til Tr<p>484 (FXAy) fusjonert 1 5'-enden med nukleotidsekvensen som koder for FXa-spaltmgssetet IEGR (SEQ ID nr 38) , ble kuttet med restnksjonsendonukleasene Barn HI og Hmd III (levert av Boehringer, Tyskland) og ligert med T4 DNA ligase (levert av Boehringer, Tyskland) inn 1 Barn HI og Hind III kuttet pLcIIMLCHgFX under anvendelse av standard prosesser
Fig 11 Aminosyresekvens for bovin blodkoaguler-mgsfaktor X (FX)
Den beregnete aminosyresekvens for hele lengden av leserammen som koder for bovin FX (SEQ ID nr 53) Den N-terminale ammosyrerest Serg2 og den C-termmale Trp^g^-rest 1 FXAy)-konstruksjonen er identifisert
Fig 12 Konstruksjon av ekspresjonsplasmidet pLcIIMLCH6FX-Kl
Det mangfoldiggjorte DNA-fragment som inneholdt leserammen til human plasmmogen kringle 1 (Kl) fra ammosyrerest Se<r>g2 til Glujg2 (nummerering som i "Glu"-plasmmogen), fusjonert i 5'-enden med nukleotidsekvensen som koder for FXa-spaltmgssetet IEGR {SEQ ID nr 38) ble kuttet med restriksjonsendonukleasene Barn HI og Hind III {levert av Boehringer, Tyskland) og ligert med T4 DNA ligase (levert av Boehringer, Tyskland) inn 1 Barn HI og Hind III kuttet pLcIIMLCHgFX under anvendelse av standard prosesser
Fig 13 Konstruksjon av ekspresjonsplasmidet pLcIIH 6FX-K4
Det mangfoldiggjorte DNA-fragment som inneholdt leserammen til human plasmmogen kringle 4 (K4) fra ammosyrerest Val354 til Ala^g (nummerering som 1 "Glu"-plasmmogen), fusjonert 1 5'-enden med nukleotidsekvensen som koder for FXa-spaltmgssetet IEGR (SEQ ID nr 38), ble kuttet med restriksjonsendonukleasene Barn HI og Hind III (levert av Boehringer, Tyskland) og ligert med T4 DNA ligase (levert av Boehringer, Tyskland) inn 1 Barn HI og Hind III kuttet pLcIIHgFX under anvendelse av standard prosesser Fig 14 Ammosyresekvensen til human "Glu"-plasmmogen (SEQ ID nr. 54) De N- og C-terminale ammosyrerester 1 konstruksjonene Kl og K4 er identifisert med deres numre 1 sekvensen Fig 15 SDS-PAGE-analyse av fremstilling og m vitro folding av rekombinant, humant fJ2-mikroglobulin
Felt 1 Rå protemekstrakt før anbringelse 1 Ni<2+ >NTR- agarosesøylen {redusert prøve)
Felt 2 Søylegjennomstrømning under anbringelsen av råproteinekstrakten på Ni^NTA-agarosesøylen (redusert prøve)
Felt 3 Humant (^-mikroglobulm eluert fra Ni<2+>NTA-agarosesøylen etter den sykliske foldingsprosess ved hjelp av den ikke-denaturerende eluermgsbuf f er (redusert prøve)
Felt 4 Protemmarkører (Pharmacia, Sverige) Fra gelens topp 94 kDa, 67 kDa, 43 kDa, 30 kDa, 20,1 kDa og 14,4 kDa (redusert prøve)
Felt 5 Samme som felt 3 (uredusert prøve)
Felt 6 Rekombinant, humant ^-mikroglobulin etter FXa-spaltmg og avsluttet rensing (uredusert prøve)
Fig 16 SDS-PAGE-analyse av in vitro folding av rekombinant, humant veksthormon, hGH (Somatotropin)
Felt 1 Protemmarkører (Pharmacia, Sverige) Fra toppen av gel 94 kDa, 67 kDa, 43 kDa, 30 kDa, 20,1 kDa og 14,4 kDa (redusert prøve)
Felt 2 Humant hGH eluert fra Ni<2+>NTA-agarosesøylen etter den sykliske foldmgsprosess ved hjelp av den ikke-denaturerende eluermgsbuf fer (uredusert prøve)
Felt 3 Humant hGH eluert fra Ni<2+>NTA-agarosesøylen etter den sykliske foldingsprosess ved hjelp av den denaturerende eluermgsbuf fer B fra f oldingsprosessen
(uredusert prøve)
Felter 4-18 Fraksjoner oppsamlet under separeringen av monomert hGH-fusjonsprotem fra dimere og multimere fusjonsproteiner etter den sykliske foldingsprosess ved hjelp av lonebytterkromatografi på "Q-Sepharose"
(Pharmacia, Sverige) Det monomere protein ble eluert i en topp som var godt adskilt fra toppen som inneholdt de dimere og multimere proteiner (ureduserte prøver)
Fig 17 SDS-PAGE-analyse av m vitro folding av rekombinant kringle 1 og 4 fra humant plasmmogen og rekombinant fusjonsprotein nr 4 avledet fra humant makroglobulinreseptorprotein (a2MR)
Felt 1 Protemmarkører (Pharmacia, Sverige) Fra toppen av gel 94 kDa, 67 kDa, 43 kDa, 30 kDa, 20,1 kDa og 14,4 kDa (redusert prøve)
Felt 2 Rå Kl-fusjonsprotemekstrakt før anbringelse på Ni<2+>NTA-agarosesøylen (redusert prøve)
Felt 3 Kl-fusjonsprotein eluert fra Ni<2+>NTA-agarosesøylen etter den sykliske foldingsprosess ved hjelp av den ikke-denaturerende eluermgsbuffer (redusert prøve)
Felt 4 Samme som felt 3 (uredusert prøve)
Felt 5 Gjennomstrømning fra lysin-agarosesøylen under anbringelsen av Kl-fusjonsprotemet (uredusert prøve)
Felt 6 Kl-fusjonsprotem eluert fra lysin-agarose-søylen (uredusert prøve)
Felt 7 K4-fusjonsprotem eluert fra Ni<2+>NTA-agarosesøylen etter den sykliske foldingsprosess ved hjelp av den ikke-denaturerende eluermgsbuf f er (redusert prøve)
Felt 8 Samme som felt 7 (uredusert prøve)
Felt 9 Fusjonsprotein c^MR nr 4 eluert fra Ni2 + NTA-agarosesøylen etter den sykliske foldingsprosess ved hjelp av den ikke-denaturerende eluermgsbuf f er (redusert prøve)
Felt 10 Samme som felt 9 (uredusert prøve)
Fig 18 Konstruksjon av ekspresjonsplasmidet pT7Hg FX-cé2MRBDv
Det mangfoldiggjorte DNA-fragment som inneholdt leserammen til humant o^-makroglobulm fra aminosyrerestene Va<l>i299 t:Ll A^-a1451' fusjonert i 5'-enden med nukleotidsekvensen som koder for FXa-spaltmgssetet IEGR (SEQ ID nr 38), ble kuttet med restriksjonsendonukleasene Barn HI og Hmd III (levert av Boehringer, Tyskland) og ligert med T4 DNA ligase (levert av Boehringer, Tyskland) mn i Barn HI og Hmd III kuttet pT7H6 under anvendelse av standard prosesser
Fig 19 Aminosyresekvens for reseptor-bindings-domenet i humant c<2-makroglobulin (fra rest Val^gg ^ il Ala1451) (SEQ ID nr 55) Fig 20 Konstruksjon av ekspresjonsplasmidet pT7Hg FX-TETN Det mangfoldiggjorte DNA-fragment som inneholdt leserammen til modent, monomert, humant Tetranectin fra ammosyrerester Glu^ til Val]_8if fusjonert i 5'-enden med nukleotidsekvensen som koder for FXa-spaltmgssetet IEGR (SEQ ID nr 38), ble kuttet med restriksjonsendonukleasene Barn HI og Hind III (levert av Boehringer, Tyskland) og ligert med T4 DNA ligase (levert av Boehringer, Tyskland) inn i Barn HI og Hmd III kuttet pT7Hg under anvendelse av standard prosesser Fig 21 Aminosyresekvens i humant, monomert Tetranectin Den beregnete aminosyresekvens til den fulle lengde av leserammen som koder for humant Tetranectin (SEQ ID nr 56) Den første ammosyrerest i det bearbeidede, modne protein (Glu^) er angitt Fig 22 Konstruksjon av ekspresjonsplasmidet pT7Hg FX-DB32 Det mangfoldiggjorte DNA-fragment som inneholdt leserammen til det kunstige diastoff DB32 fra ammosyrerest Gln]_ til Asn24g, fusjonert i 5'-enden med nukleotidsekvensen som koder for FXa-spaltingssetet IEGR (SEQ ID nr 38) ble kuttet med restriksjonsendonukleasene Barn HI og Hind III (levert av Boehringer, Tyskland) og ligert med T4 DNA ligase (levert av Boehringer, Tyskland) mn i. Barn HI og Hind III kuttet pT7Hg under anvendelse av standard prosesser Fig 23 Aminosyresekvensen til det kunstige diastoff DB32 (SEQ ID nr 57) Fig 24 Ekspresjonsplasmidet pT7HgFX-PS 4
Konstruksjonen av pT7H6FX-PS 4 som uttrykker humant psoriasin fra ammosyrerester Ser2 til Gln101 er tidligere beskrevet (Hoffmann, 1994)
Fig 25 Aminosyresekvensen til humant psoriasin
Den beregnete aminosyresekvens til den fulle lengde av leserammen som koder for humant psoriasin (SEQ ID nr 58)
Fig 26 SDS-PAGE-analyse av rensing og FXa-spalting av rekombinant Mab 32 diastoff
a Forskjellige stadier av rensingen Felter 1 og 2 Råprodukt fra folding
Felt 3 Ferdig renset Mab 32 diastoffusjonsprotein-produkt
Felt 4 Supernatant fra råte foldmgsprodukt etter 50 foldig konsentrering og sentrifugering
Felt 5 Pellet fra rått f oldmgsprodukt etter 50 foldig konsentrering og sentrifugering
b FXa-spalting av Mab 32 diastoffusjonsprotein
Felter 1 og 5 Ferdig renset Mab 32 diastoffusjons-protem
Felt 2 Molart forhold 1 5 mellom FXa og Mab 32 diastof fusjonsprotein ved 37°C i 20 timer
Felt 3 Molart forhold 1 2 mellom FXa og Mab 32 diastof fusjonsprotein ved 37°C i 20 timer
Felt 4 Molart forhold 1 1 mellom FXa og Mab 32 diastof fusjonsprotein ved 37°C i 20 timer
Fig 27 Glutations egnethet som reduksjonsmiddel i syklisk refolding av humant f^-mikroglobulinf us jons-protein
Felt 1 Redusert prøve av test nr 1
Felt 2 Uredusert prøve av test nr 1
Felt 3 Uredusert prøve av test nr 2
Felt 4 Uredusert prøve av test nr 3
Felt 5 Uredusert prøve av test nr 4
Felt 6 Uredusert prøve av test nr 5
Felt 7 Uredusert prøve av test nr 6
Felt 8 Uredusert prøve av test nr 7
Felt 9 Uredusert prøve av test nr 8
Felt 10 Uredusert prøve av test nr 9
Felt 11 Uredusert prøve av test nr 10
Felt 12 Uredusert prøve av test nr 11
Fig 28 L-cystelnetylesters egnethet som reduksjonsmiddel i syklisk refolding av humant l^-mikro-globulinfusjonsprotein
Felt 1 Redusert prøve av test nr 1.
Felt 2 Uredusert prøve av test nr 1
Felt 3 Uredusert prøve av test nr 2
Felt 4 Uredusert prøve av test nr 3
Felt 5 Uredusert prøve av test nr 4
Felt 6 Uredusert prøve av test nr 5
Felt 7 Uredusert prøve av test nr 6
Felt 8 Uredusert prøve av test nr 7
Felt 9 Uredusert prøve av test nr 8
Felt 10 Uredusert prøve av test nr 9
Fig 29 2-merkaptoetanols egnethet som reduksjonsmiddel i syklisk refolding av humant B2-nnkroglobulin-fusjonsprotein
Felt 1 Redusert prøve av test nr 1
Felt 2 Uredusert prøve av test nr 1
Felt 3 Uredusert prøve av test nr 2
Felt 4 Uredusert prøve av test nr 3
Felt 5 Uredusert prøve av test nr 4
Felt 6 Uredusert prøve av test nr 5
Felt 7 Uredusert prøve av test nr 6
Felt 8 Uredusert prøve av test nr 7
Felt 9 Uredusert prøve av test nr 8
Felt 10 Uredusert prøve av test nr 9
Fig 30 Merkaptoravsyres egnethet som reduksjonsmiddel i syklisk refolding av humant ^-mikroglobulin-fusjonsprotein
Felt 1 Uredusert prøve av test nr 1
Felt 2 Uredusert prøve av test nr 2
Felt 3 Uredusert prøve av test nr 3
Felt 4 Uredusert prøve av test nr 4
Felt 5 Uredusert prøve av test nr 5
Felt 6 Uredusert prøve av test nr 6
Felt 7 Uredusert prøve av test nr 7
Felt 8 Uredusert prøve av test nr 8
Felt 9 Uredusert prøve av test nr 9
Fig 31 N-acetyl-L-cysteins egnethet som reduksjonsmiddel i syklisk refolding av humant P2-nu-kro-globulins fusjonsprotein
Felt 1 Redusert prøve av test nr 1
Felt 2 Uredusert prøve av test nr 1
Felt 3 Uredusert prøve av test nr 2
Felt 4 Uredusert prøve av test nr 3
Felt 5 Uredusert prøve av test nr 4
Felt 6 Uredusert prøve av test nr 5
Felt 7 Uredusert prøve av test nr 6
Felt 8 Uredusert prøve av test nr 7
Felt 9 Uredusert prøve av test nr 8
Felt 10 Uredusert prøve av test nr 9
Fig 32 SDS-PAGE-analyse av syklisk refolding av humant ^-ntikroglobulinfusjonsprotein
Felt 1 Råprotemekstrakt før anbringelse på Ni<2+ >NTA-agarosesøylen (redusert prøve)
Felt 2 8 ul prøve av løselig fraksjon av refoldet hp2m slik som beskrevet i eksempel 1
Felt 3 4 ul prøve av løselig fraksjon av refoldet h$ 2m slik som beskrevet i eksempel 1
Felt 4 2 ul prøye av løselig fraksjon av refoldet h$ 2m slik som beskrevet i eksempel 1
Felt 5 8 ul prøve av uløselig fraksjon av refoldet h$ 2m slik som beskrevet i eksempel 1
Felter 6 og 7 hp2m sluttprodukt etter rensing ved lonebytterkromatografi
Felter 8 og 9 Refoldet h|32m etter optimalisert refoldingsprotokoll slik som beskrevet i eksempel 13
Fig 33 SDS-PAGE-analyse av refolding av humant (12-mikroglobulmfusjonsprotein ved hjelp av trinnvis og lineær buffergradient
Felt 1 Prøve av løselig fraksjon av refoldet hp2m, foldet ved hjelp av trinnvis bufferprotokoll slik som beskrevet i eksempel 13
Felter 2 og 3 Prøver av uløselig fraksjon av refoldet hp2m, foldet ved hjelp av trinnvis bufferprotokoll slik som beskrevet i eksempel 13
Felt 4 Proteinmolekylvektmarkører (Pharmacia, Sverige) fra topp av gel 94 kDa, 67 kDa, 43 kDa, 30 kDa, 20,1 kDa samt 14,4 kDa (redusert prøve)
Felt 5 Prøve av løselig fraksjon av refoldet h(J2m, foldet ved hjelp av lineær gradientprotokoll slik som beskrevet i eksempel 13
Felter 5 og 6 Prøve av uløselig fraksjon av refoldet h[i2m, foldet ved hjelp av lineær gradientprotokoll slik som beskrevet i eksempel 13
Fig 34 Det generelle skjema for utforming av fusjonsproteinene som er beskrevet i eksemplene
I fusjonsproteinets N-terminale ende er det eventuelt msertert et "boostersegment" som øker nivået av ekspresjon av fusjonsproteinet i cellen som uttrykker DNAen som koder for fusjonsproteinet C-termmalt i forhold til dette angir "6H" 6-nistidmylrestene som utgjør en lonechelatdannende sete som anvendes som et "affmitetshåndtak" under rensing og refolding av fusjonsproteinene "FX" i C-terminusen av 6-histidinylsetet er FXa-spaltingssetet Endelig representerer den del av fusjonsproteinet som er angitt "protein" proteinet som skal refoldes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen
EKSEMPLER
Eksemplene 1-11 i dette avsnitt, som benyttes for å eksemplifisere den "sykliske foldingsprosess" beskriver alle prosessen ved folding av et rekombinant, spaltbart hybridprotein (fusjonsprotein) fremstilt i E coli, renset fra en rå protemekstrakt og underkastet folding uten ytterligere rensing ved én generell fremgangsmåte
Nukleotidsekvensen som koder for det rekombinante protein som skal fremstilles fusjoneres med 5<1->enden med en nukleotidsekvens som koder for en aminosyresekvens som spesifiserer et FXa-spaltingssete (FX), som i sin tur er bundet N-terminalt til et segment som inneholder seks histidmylrester (SEQ ID nr 47) Bindingen av FXa-spaltmgssetet oppnås vanligvis ved hjelp av en polymerasekjedereaksjon hvor den 5'-terminale primer omfatter nukleotider som koder for denne sekvens Bindingen av de seks histidmylrester oppnås vanligvis ved anvendelse av en vektor som omfatter et nukleotidfragment som koder for SEQ ID nr 47 De seks histidmylrester utgjør et metall-lonchelatdannende sete som anvendes som effektivt håndtak under rensing av fusjonsproteinet og deretter som kontakt-punktet med den faste matriks under den sykliske foldmgsprosess Leilighetsvis inserteres "boostersegmenter"
(f eks et segment avledet fra N-terminusen av AcII-proteinet i noen tilfeller etterfulgt av et segment avledet fra myosin lett kjede) N-termmalt til affinitets-handtaket for å bedre fusjonsproteinets ekspresjonsnivå i E coli
Fusjonsproteinene er alle utformet etter samme generelle skjema (se fig 34) Nærværet av boostersegmenter, affmitetshåndtak og FXa-spaltmgssete vil kunne komplisere refolding av det interesserende, rekombinante protein Dessuten initieres den sykliske foldingsprosess umiddelbart etter afflnitetsrensing av fusjonsproteinet Dette betyr at fusjonsproteinmaterialet, som er blitt delvis nedbrutt av E coliverten holdes tilbake på afflnitetsmatriksen i tillegg til den fulle lengde av f us jonsprotemsøylen Dette nedbrutte fusjonsprotein kan meget gjerne innvirke alvorlig på refoldingen av den fulle lengde av fusjonsprotein og derved minske prosessens til-synelatende effektivitet De foldingseffektive resultater som er gjengitt i eksemplene 1-11 kan derfor ikke direkte sammenlignes med effektiviteten av fremgangsmåten til refolding av et renset fusjonsprotein
I eksemplene 1-11 beskrives refoldmgsprosessen for 21 forskjellige proteiner, proteindomener eller domeneklaser, fra en størrelse på 82 aminosyrer (Kl, eksempel 6) til 780 aminosyrer (a2MR nr 7, eksempel 4), og antallet disulf ldbroer i proteinene ligger på fra 0 (ct2MRAP, eksempel 3) til 33 (a2MR nr 4 eksempel 4) og 36 (ot2MR nr 7 > eksempel 4)
Effektiviteten ved refoldingen av proteinene ligger på fra 15 til 95%, og utbyttet av aktivt protein ligger i størrelsesorden på fra 10-100 mg for refolding på en 40 ml Ni+NTA-agarosesøyle (NTA angir en substituert nitrilotri-eddiksyre)
De etterfølgende tabeller 1-5 viser gradient-profilene som blir benyttet i eksemplene "Tid" er angitt i minutter og "strømning" i ml/min
EKSEMPEL 1
Fremstilling og folding av humant og munnt p2-inikro~ globulin
I dette eksempel beskrives fremstilling i E coli av både humant f^-mikroglobulm og murint ^-mikroglobulm som FXa-spaltbare fusjonsproteiner, samt rensing av det rekombinante humane og det munne B2~Itll'trc,9^ODUlin etter FXa-spaltmg
Plasmidkloner som inneholder den fulle lengde av cDNAer som koder for de humane og de munne j^-mikro-globulmproteiner (generøst stilt til rådighet av Dr David N Garboczi til Dr Søren Buus) ble anvendt som templater i en polymerasekjedereaksjon (PCR) (Saiki et al , 1988) utformet for å fremstille cDNA-fragmenter som tilsvarte det modne humane (tilsvarende ammosyrerest fra Ile^ til Metgg) og det modne munne (tilsvarende ammosyrerest fra Ile^ til Metgg) B2-mikroglobulinprotemer ved anvendelse av primerne SEQ ID nr 3 og SEQ ID nr 4 (for det humane B2-mikroglobulin) °9 SEQ ID nr 5 °9 SE(2 10 nr 6 (for det munne B2-mikroglobulin) De mangfoldiggjorte, kodende leserammer var i deres 5'-ender, via PCR-reaksjonen, bundet til nukleotidsekvenser, inkludert i SEQ ID nr 3 og 5, som koder for aminosyresekvensen SEQ ID nr 37, som utgjøre et spaltmgssete for den bovme re-stnksjonsprotease FXg (Nagai og Thøgersen, 1987) De mangfoldiggjorte DNA-fragmenter ble subklonet inn i E coli ekspresjonsvektoren pT^Hg (Christensen et al , 1991) Konstruksjonen av de resulterende plasmider pT-jHgFX-hf^m (som uttrykker humant ^-mikroglobulin) og pT7HgFX-mB2m (som uttrykker murint ^-mikroglobulin) er vist i fig 2, og fig 3 viser ammosyresekvensene til de uttrykte proteiner (i SEQ ID nr 49 (humant) og SEQ ID nr 50 (murint) vises ammosyresekvensene som kodes av den fulle lengde av leserammene)
Humant og murint B2-mikroglobulin ble fremstilt ved dyrking og uttrykkmg av plasmidene pT7HgFX-hB2m og -ml^m i E coli BL 21-celler i en middels skala (2x1 liter), slik som beskrevet av Studier og Moffat, J Mol Biol , Vol 189, 1986, p 113-130 Eksponentielt voksende kulturer ved 37°C ble ved O<D>60o °'8 infisert med bakteriofag ACE6 ved en multiplisitet på ca 5 Kulturer ble dyrket ved 37°C i ytterligere 3 timer før celler ble høstet ved sentrifugering Celler ble lysert ved osmotisk sjokk og ultralydbehandlmg og totalt cellulært protein ekstrahert inn i fenol (justert til pH 8 med Trisma-base) Protein ble utfelt fra fenolfasen ved tilsetning av 2,5 volumer etanol og sentrifugering Proteinpelleten ble løst i en buffer som inneholdt 6 M guanidmklorid, 50 mM Tris-HCl pH 8 samt 0,1 M ditioerytritol Etter gelfiltrering på "Sephadex" G-25 {Pharmacia, LKB, Sverige) mn i 8 M urea,
1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM 2-merkaptoetanol og 3 mM metionin ble det rå .proteinpreparat anbrakt på Ni<2+->aktiverte NTA-agarosesøyler for rensing (Hochuli et al , 1988) av fusjonsproteinene, MGSHHHHHHGSIEGR-humant og murint B2-mikroglobulin (hvor MGSHHHHHHGSIEGR er SEQ ID nr. 48) og deretter gjennomgå den sykliske foldingsprosess
Alle buffere som var fremstilt for væskekromatografi ble avgasset i vakuum før tilsetning av reduksjonsmiddel og/eller anvendelse
Ni<2+->aktivert NTA-agarosematriks (Ni<2+>NTA-agarose) er kommersielt tilgjengelig fra Diagen GmbH, Tyskland I arbeidet med den foreliggende oppfinnelse viste det seg imidlertid at dette kommersielle produkt ikke oppførte seg så godt som ventet Iakttakelsene var at den kommersielle Ni<2+>NTA-agarosematriks lett ble blokkert ved tilførsel av den denaturerte og reduserte totale proteinekstrakt, at kapasiteten for fusjonsprotein var lavere enn ventet, og at matriksen bare kunne regenereres med godt resultat noen få ganger
For å bedre egenskapene til Ni<2+>NTA-agarosen ble det bestemt å utføre en karbodiimidkopling av N-(5-amino-l-karboksypentyl)lminodieddiksyremetalliganden {synteserute slik som beskrevet av Dobeli og Hochuli (EPO 0253 303)) til en stivere agarosematriks (dvs "Sepharose" CL-6B, Pharmacia, Sverige)
8 g N-(5-amino-lykarboksypentyl)lminodieddiksyre fra syntesen i 50 ml justert til pH 10 ved tilsetning av 29 g Na2CC>3 10 H2O) og tilsatt til en omrørt suspensjon av aktivert "Sepharose" CL-6B 1 1 M Na2C03 Reaksjonen fikk pågå natten over
Nevnte "Sepharose" CL-6B (opprinnelig 100 ml suspensjon) ble aktivert etter fjerning av vann ved hjelp av aceton med 7 g 1,1'-karbonyldnmidazol under omrøring 1 fra 15 til 30 minutter For aktivering ble "Sepharose" CL-6B vasket med aceton etterfulgt av vann og IM Na2CC>3 NTA-agarosematriksen ble anbrakt 1 en søyle og "satset" med Ni <2+> ved at det langsomt ble ledet gjennom 5 søylevolumer av en 10 prosentig NiSC^-løsning Mengden Ni<2+> på NTA-agarosematriksen som ble fremstilt på denne måte ble bestemt til å være 14 umol per ml matriks Ni<2+>NTA-agarose-matriksen ble pakket 1 en standard glassøyle for væske-kromatograf 1 (innvendig diameter 2,6 cm) til et volum av 40 ml Etter satsing ble Ni^<+>NTA-agarosesøylen vasket med
2 søylevolumer vann, 1 søylevolum 1 M Tris-HCl pH 8 samt 2 søylevolumer buffer før tilførsel av den rå proteinekstrakt
Ved anbringelse av de rå proteinekstrakter på Ni<2>"<1>" NTA-agarosesøylen ble fusjonsproteinene, MGSHHHHHHGSIEGR-hB2m og MGSHHHHHHGSIEGR-mB2m (hvor MGSHHHHHHGSIEGR er SEQ ID nr 48) renset fra størstedelen av coli- og ct-fagproteinene ved vasking med 1 søylevolum av bufferen etterfulgt av 6 M guanidinklorid, 50 mM Tris-HCl, 10 mM 2-merkaptoetanol og 3 mM metionm inntil den optiske tetthet (OD) ved 280 nm for søyleeluatene var stabil
Fusjonsproteinene ble refoldet på Ni<2+>NTA-agarose-søylen under anvendelse av gradientprofil slik som beskrevet 1 tabell 1 og 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, og 1,2 mM/0,4 mM redusert/oksidert glutation som buffer A og 8 M urea, 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 3 mM metionm og 6 mM redusert glutation som buffer B Den reduserte/ oksiderte glutationløsnmg ble nyfremstilt som en 200 gangers forrådsløsning ved tilsetning av 9,9 M H202 til en omrørt løsning av 0,2 M redusert glutation før tilsetning til buffer A
Etter fullføring av den sykliske foldingsprosess ble h62m- og mf^m-fusjonsprotemene eluert fra Ni<2+>NTA-agarosesøylene med en buffer som inneholdt 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl og 20 mM EDTA pH 8
Fusjonsprotein som var aggregert og utfelt på Ni<2+ >NTA-agarosesøylene ble eluert 1 buffer B Ca- 75% av fusjonsproteinmaterialet ble eluert ved hjelp av ikke-denaturerende eluerm<g>sbuf fer (se fig 16 felter 2 og 3)
Bedømt ved ikke-reduserende SDS-PAGE-analyse viste
ca 70% av det løselige hf^m-fusjonsprotemmateriale (tilsvarende 4 0 mg h$ 2m~ £usjonsprotein) seg å være monomer (se fig 15, felter 5 og 3), mens 25% av mB2m-fusjonsproteinet viste seg å være monomer (tilsvarende 20 mg av mB2m-fusjonsproteinet) Den totale effektivitet ved foldmgsprosessen er derfor ca 50% for hB2m-fusjonsprotemet og mindre enn 20% for mB2m-fusjonsproteinet
Monomere hB2m- og mf^m-fusjonsprotemer ble renset ved dimere og høyere multimerer ved ionebytterkromatograf1 på "S-Sepharose" (Pharmacia, Sverige) Fusjonsproteinene som ble eluert med den ikke-denaturerende eluermgsbuffer (ca 70% av fusjonsprotemmaterialet) ble glefiltrert inn 1 en buffer som inneholdt 5 mM NaCl og 5 mM Tris-HCl pH 8 på "Sephadex" G-25 og tynnet 1 1 med vann før anbringelse på "S-Sepharose"-ionebyttersøylene Fusjonsproteiner ble eluert over 5 søylevolumer med en lineær gradient på fra 2,5 mM NaCl, 2,5 mM Tris-HCl pH 8 til 100 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 8 De monomere hB2m- og mB2m-fusjonsprotemer ble eluert helt 1 begynnelsen av gradienten, mens dimere og høyere multimerer ble eluert senere Fraksjoner som inneholdt de monomere fusjonsproteiner ble tynnet med vann og anbrakt på "S-Sepharose"-søylene igjen og eluert i ett trinn i 1 M NaCl og 50 mM Tris-HCl pH 8
De monomere fusjonsproteiner ble spaltet med restriksjonsproteasen FXa natten over ved romtemperatur i et vekt til vektforhold på ca 200 1
Etter spalting ble de rekombinante hp2m- o<? m$ 2m~ proteiner renset fra den N-terminale fusjonshale, frigjort fra det spaltede fusjonsprotein og FXa ved lonebytter-kromatografi på "Q-Sepharosesøyler" {Pharmacia, Sverige)
Ved gelfiltrering på "Sephadex" G-25 inn i 5 mM NaCl, 5 mM Tris-HCl pH 8 og 1 1 tynning med vann ble rekombinant hp2m og mp^m eluert i en lineær gradient (over 5 søylevolumer)
på fra 2,5 mM NaCl, 2,5 mM Tris-HCl pH 8 til 100 mM NaCl,
25 mM Tris-HCl pH 8 Fraksjoner som inneholdt de spaltede rekombinante proteiner ble tynnet med vann og igjen brakt på "Q-Sepharose"-søylene og eluert i ett trinn i 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 Rekombinante h&2m~°9 m^m-proteiner ble gelfiltrert inn i nylig fremstilt 20 mM NH4HCO3 og lyofilisert to ganger SDS-PAGE-analyse av fremstillingen av rekombinant, humant S2-mikroglobulin er vist 1 fig 15 Utbyttet av fullstendig bearbeidet, rekombinant, humant B2-mikroglobulin fremstilt ved denne prosess var 30 mg Utbyttet av fullstendig, bearbeidet, rekombinant, murint P2-mikroglobulin fremstilt ved denne prosess var 10 mg Sammenligning av rekombinant, humant med renset, naturlig, humant p2-mikroglobulin ^ le vennlig utført av Dr Søren Buus 1 to forskjellige prøver 1 Det viste seg at rekombinant, humant P2-mikroglobulm og naturlig, humant p2-mikroglobulin reagerte med både et monoklonalt og et monospesifikt antistoff med identisk affinitet 2 Rekombinant, humant B2-mikroglobulin °9 naturlig, humant ^-mikroglobulin viste seg i et bindmgsinhiber-mgsforsøk hvor det ble anvendt radiomerkede ligander å binde naturlige, af f initetsrensede tungkjedete klasse I K d
-molekyler med identisk affinitet
Rekombinant, murint 62-mikroglobulin viste seg å binde naturlige klasse I tungkjedemolekyler med en affinitet som var 5 ganger lavere enn den humane B2-mikroglobulin Dette resultat er 1 god overensstemmelse med tidligere resultater fra litteraturen hvor det ble anvendt naturlig materiale
EKSEMPEL 2
Fremstilling og folding av humant veksthormon (Somoto-tropin)
I dette eksempel beskrives fremstilling 1 E coli av humant veksthormon (hGH) som et FXa-spaltbart fusjonsprotein, samt rensing av det rekombinante hGH etter FXa-spaltmg
En plasmidklon som inneholdt cDNAen som koder for hGH (generøst stilt til rådighet av Dr Henrik Dalbøge (Dalbøge et al , 1987) ble anvendt som templat 1 en polymerasekjedereaksjon (PCR) (Saiki et al , 1988) under anvendelse av primerne SEQ ID nr 7 og SEQ ID nr 8, som var utformet for å fremstille et cDNA-fragment som tilsvarte det modne hGH-protem (som tilsvarte ammosyrerest fra Phe^ til Phe^g^) Den mangfoldiggjorte, kodende leseramme ble 1 5'-enden via PCR-reaksjonen bundet til en nukleotidsekvens, som befinner seg 1 SEQ ID nr 7, som koder for aminosyresekvensen SEQ ID nr 37, som utgjør et spaltingssete for den bovme restriksjonsprotease FXa (Nagai og Thøgersen, 1987) Det mangfoldiggjorte DNA-fragment ble subklonet inn 1 E coli-ekspresjonsvektoren pT7Hg (Christensen et al , 1991) Konstruksjonen av det resulterende plasmid pT-yHgFX-hGH (som uttrykker humant veksthormon) er angxtt i fig 4, og fig 5 viser ammosyresekvensen til det uttrykte protein (i SEQ ID nr . 51 vises ammosyresekvensen som kodes av den fulle lengde av leserammen)
Rekombinant, humant veksthormon ble fremstilt ved dyrking og uttrykkmg av plasmidet pT^HgFX-hGH i E coli BL21 celler i middels skala (2x1 liter), slik som beskrevet av Studier og Moffat, J Mol Biol , Vol 189, 1986, p 113-130 Eksponentielt voksende kulturer ved 37°C ble ved OD^qq på 0,8 infisert med bakteriofag ACE6 ved en multiplisitet på ca 5 Kulturer ble dyrket ved 37°C i ytterligere 3 timer før celler ble høstet ved sentrifugering Celler ble lysert ved osmotisk sjokk og ultralyd-behandling, og totalt celleprotein ble ekstrahert inn i fenol (justert til pH 8 med Trisma-base) Protein ble utfelt fra fenolfasen ved tilsetning av 2,5 volumer etanol og sentrifugering Proteinpelleten ble løst i en buffer som inneholdt 6 M guanidinklorid, 50 mM Tris-HCl pH 8 og 50 mM ditioerytriol Etter gelflltrering pa "Sephadex" G25 (Pharmacia, LKB, Sverige) mn i 8 M urea, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 5 mM 2-merkaptoetanol og 1 mM metionin ble det rå protempreparat anbrakt på en Ni^-aktivert NTA-agarosesøyle (Ni<2+>NTA-agarose) for rensing (Hochuli et al , 1988) av fusjonsproteinet, MGSHHHHHHGSIEGR-hGH (hvor MGSHHHHHHGSIEGR er SEQ ID nr 48) og deretter gjennomgå den sykliske foldingsprosess
Fremstilling og "satsing" av Ni^<T>NTA-agarosesøylen er beskrevet i eksempel 1
Alle buffere som var fremstilt for væskekromatografi ble avgasset i vakuum før tilsetning av reduksjonsmiddel og/eller anvendelse
Ved anbringelse av det rå proteinekstrakt på Ni<2+ >NTA-agarosesøylen ble fusjonsproteinet MGSHHHHHHGSIEGR-hGH (hvor MGSHHHHHHGSIEGR er SEQ ID nr 48} renset fra størstedelen av coli- og X- fagproteinene ved vasking med ett søylevolum av bufferen etterfulgt av 6
M guanidinklorid, 50 mM Tris HC1, 5 mM 2-merkaptoetanol og 1 mM metionin inntil eluatets optiske densitet (OD) ved 280 nm var stabil
Fusjonsproteinet ble refoldet på Ni<2+>NTA-agarose-søylen under anvendelse av en gradientprofil slik som beskrevet i tabell 2 og 0,5 M NaCl, 50 mM Tris HC1 pH 8 og 1,0 mM/0,1 mM redusert/oksidert glutation som buffer A og 8 M urea, 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM metionm og 5 mM redusert glutation som buffer B Den reduserte/ oksiderte glutationløsmng ble nyfremstilt som en 200 gangers forrådsløsning-ved tilsetning av 9,9 M ^ 2^ 2 t3-! en omrørt løsning av 0,2 M redusert glutationm før tilsetning til buffer A
Etter fullføring av den sykliske foldingsprosess ble hGH-fusjonsproteinet eluert fra Ni<2+>NTA-agarosesøylen med en buffer som inneholdt 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 20 mM EDTA pH 8 Fusjonsprotein som ble aggregert og utfelt på Ni<2+>NTA-agarosesøylen ble eluert til buffer B
Ca 80% av fusjonsprotemmaterialet ble eluert ved hjelp av den ikke-denaturerende eluerm<g>sbuf fer (se fig 16, felter 2 og 3) Som bedømt ved hjelp av lkke-reduserende SDS-PAGE-analyse viste 90% av det løselige fusjonsproteinmateriale (tilsvarende ca 70 mg fusjonsprotein) seg å være monomert (se fig 16, felt 2), noe som ga en total effektivitet ved foldingsprosessen på ca 70%
Monomert hGH-fusjonsprotein ble renset fra dimer og høyere multimerer ved lonerbytterkromatografi på "Q-Sepharose" (Pharmacia, Sverige) Etter gelflltrering mn i en buffer som inneholdt 25 mM NaCl og 25 mM Tris-HCl pH 8 på "Sephadex" G-25 ble fusjonsprotemmaterialet, eluert ved hjelp av den ikke-denaturerende buffer, anbrakt på en "Q-Sepharose"-ionebyttersøyle Fusjonsprotein ble eluert via 5 søylevolumer med en lineær gradient på fra 25 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 8 til 200 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 Det monomere hGH-fusjonsprotein ble eluert i begynnelsen av gradienten, mens dimerer og høyere multimerer ble eluert senere Fraksjoner som inneholdt det rene, monomere fusjonsprotein ble tilsatt N1SO4 og lminodieddik-syre (IDA, justert til pH 8 med NaOH) til 1 mM og spaltet med restriksjonsproteasen FXa1 5 timer ved 37°C 1 et vekt til vektforhold på ca 100 1 FXa ble inhibert etter spalting ved tilsetning av benzamidmhydroklorid til 1 mM
Etter spalting ble det rekombinante hGH-protein isolert fra uspaltet fusjonsprotein og den frigjorte fusjonshale etter gelflltrermg på "Sephadex" G-26 mn 1
8 M urea, 50 mM Tris-HCl pH 8, for fjerning av Ni<2+>IDA og benzamidin, ved passasje gjennom en liten Ni^NTA-agarose-søyle etterfulgt mime av en liten Nd^<+>NTA-agarosesøyle og deretter en ikke Ni<2+> aktivert NTA-agarosesøyle for å sikre fullstendig fjerning av FXa og av henholdsvis Ni<*T >og Nd<3+> Rekombinant hGH ble renset fra en mindre fraksjon av rekombinant nedbrytningsprodukt ved lonebytterkromato-grafi oppå "Q-Sepharose" hGH ble eluert 1 en lineær gradient (via 5 søylevolumer) fra 8 M urea, 50 mM Tris-HCl pH 8 til 8 M urea, 250 mM NaCl og 25 mM Tris-HCl pH 8 Fraksjoner som inneholdt det spaltede, rensede, rekombinante protein ble gelfiltrert mn 1 nylig fremstilt 20 mM NH4HCO3 og lyofilisert to ganger
SDS-PAGE-analyse av fremstillingen og foldingen av rekombinant, humant veksthormon er vist 1 fig 16
Utbyttet av det fullstendig bearbeidete, rekombinante, humane veksthormon som ble fremstilt ved denne prosess var 10 mg
Det rekombinante, humane veksthormon som ble fremstilt ved denne prosess ko-migrerte både 1 reduserende og ikke-reduserende SDS-PAGE- og 1 ikke-denaturerende PAGE-analyse med biologisk aktivt, rekombinant, humant veksthormon som generøst ble stilt til rådighet av Nova-Nordisk
A/S
EKSEMPEL 3
Fremstilling og folding av humant c^MRAP
Plasmidet som ble anvendt for ekspresjon i E coli BL21 celler av det humane a2-makroglobulin-reseptorassosi-erte protein (a2MRAP), pT-^H<g>FX-c^MRAP, og betingelsene som ble benyttet for fremstillingen av fusjonsproteinet er tidligere beskrevet av Nykjær et al , J Biol Chem , Vol 267, 1992, p 14543-14546 Primerne SEQ ID nr 9 og SEQ ID nr 10 ble anvendt i den PCR som ble benyttet for å opp-formere DNA som koder for a2MRAP
Rå protemekstrakt som ble utfelt fra fenolfasen av proteinekstraksjonen av celler av 2 liter kultur av MGSHHHHHHGSIEGR-a2MRAP (hvor MGSHHHHHHGSIEGR er SEQ ID
nr 48) uttrykkende E coli BL 21-celler ble løst i en buffer som inneholdt 6 M guanidmklorid, 50 mM Tris-HCl pH 8 og 50 mM ditioerytriol Etter gelflltrermg på "Sephadex" G-25 (Pharmacia, Sverige) inn i 8 M urea, 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 og 1 mM metionin ble det rå proteinpreparat tilført til en Ni<2+->aktivert NTA-agarosematriks (Ni<2+>NTA-agarose) for rensing (Hochuli et al , 1988) av fusjonsproteinet MGSHHHHHHGSIEGR-a2MRAP (hvor MGSHHHHHHGSIEGR er SEQ ID nr 48) og deretter gjennomgår den sykliske foldingsprosess
Alle buffere som ble fremstilt for væskekromatografi ble avgasset i vakuum før tilsetning av reduksjonsmiddel og/eller anvendelse
Fremstilling og "satsing" av Ni<2+>NTA-agarosesøylen er beskrevet i eksempel 1
Etter anbringelse av råproteinekstrakten på Ni<2+>NTA-agarosesøylen ble fusjonsproteinet MGSHHHHHHGSIEGR-cx2MRAP (hvor MGSHHHHHHGSIEGR er SEQ ID nr 48) renset fra størstedelen av coli- Å-fagprotemer ved vasking mecl ett søylevolum av bufferen etterfulgt av 6 M guanidmklorid, 50 mM Tris-HCl og 1 mM metionm inntil eluatets optiske densitet (OD) ved 280 nm var stabil
Fusjonsproteinet ble refoldet på Ni<2+>NTA-agarose-søylen under anvendelse av en gradientprofil slik som beskrevet i tabell 3 og 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,
2 mM CaCl2 og 1 mM 2-merkaptoetanol som buffer A og 6 M guanidmklorid, 50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM CaCl2 og 1 mM 2-merkaptoetanol som buffer B
Etter fullføring av den sykliske foldingsprosess ble a2MRAP-fusjonsproteinet eluert fra Ni^<+>NTA-agarosesøylen med en buffer som inneholdt 0,5 NaCl, 50 mM Tris-HCl og 20 mM EDTA pH 8
Stort sett intet fusjonsprotein viste seg å være aggregert eller utfelt på Ni<2+>NTA-agarosesøylen Det an-slåtte utbytte av a2MRAP-fusjonsprotem var 60 mg og foldingsprosessens effektivitet nær 95%
Fusjonsproteinet MGSHHHHHHGSIEGR-a2MRAP (hvor MGSHHHHHHGSIEGR er SEQ ID nr 48) ble spaltet med den bovme restriksjonsprotease FXa natten over ved romtemperatur i et vekt til vektforhold på 200 1 i eluermgs-bufferen Etter gelflltrering på "Sephadex" G-25 mn i 100 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 8 ble protemløsningen ledet gjennom en Ni<2+>NTA-agarosesøyle, hvorved uspaltet fusjonsprotein og den frigjorte N-terminale fusjonshale som stammet fra spaltede fusjonsproteiner Til slutt ble protemløsningen tynnet 1 4 med vann og a2MRAP-proteinet renset fra FXa ved lonebytterkromatografi på "Q-Sepharose"
(Pharmacia, Sverige) "Q-Sepharose"-søylen ble eluert med en lineær gradient via 6 søylevolumer fra 25 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 8 til 250 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 8 a2 MRAP-protemet ble eluert helt i begynnelsen av den lineære gradient mens FXa ble eluert senere
Utbyttet av a2MRAP-protein som ble fremstilt og refoldet ved denne prosess var 40 mg
Ligandbmdingsegenskapene (dvs binding til v- 2~ makroglobulmreseptoren og innvirkning på bindingen av human Urokinase Plasmmogen Aktivator - Plasmmogen Aktivator Inhibitor type-1 kompleks til a2"M-resePtoren) har ifølge Dr Nykjær vist seg å være identisk med ligand-bindingsegenskapene til renset, naturlig protein
EKSEMPEL 4
Fremstilling og folding av domener og domeneklaser fra c^-M-reseptoren
Det humane o^-makroglobulinreseptor/lavdensitets-lipoproteinreseptorbeslektede protein (a2MR) er en 600 kDa endocytotisk membranreseptor a2~MR syntetiseres som et enkeltkjedet forløperprotein med 4524 aminosyrer For-løperen bearbeides til en 85 kDa transmembran 6-kjede og en 500 kDa a-kjede, som er ikke-kovalent bundet til B-kjedens ekstracellulære domene Det er kjent at a2-MR bindes til Ca<2+> på en strukturavhengig måte (dvs at det reduserte protein ikke binder Ca<2+>) og antas å være multi-funksjonelt i den betydning at ot2MR binder ligander av forskjellige klasser
Hele aminosyresekvensen i a-kjeden kan representeres ved hjelp av klaser av tre typer repetisjoner som også er blitt funnet i andre membranbundne reseptorer og i forskjellige plasmaproteiner
A Denne type repetisjon spenner over ca 40 ammosyrerester og er kjennetegnet ved den sekvensielle forekomst av de 6 cysteinylrester som finnes i repetisjonen Noen forfattere har benevnt denne repetisjon domene av komplementtype
B Denne type repetisjon spenner også over ca. 40 ammosyrerester og er kjennetegnet ved den sekvensielle forekomst av de 6 cysteinylrester som finnes i repetisjonen I litteraturen er denne repetisjon blitt benevnt domener av EGF-type
C Denne type repetisjon spenner over ca 55 ammosyrerester og er kjennetegnet ved nærværet av konsensus-sekvensen SEQ ID nr 39
I dette eksempel beskrives fremstillingen i E coli av et antall domener og domeneklaser avledet fra a2-MR-proteinet som spaltbare fusjonsproteiner og rensingen, in vitro folding, og FXa-spaltmgen og bearbeidelsen av disse rekombinante proteiner
En plasmidklon som inneholdt den fulle lengde av cDNA som koder for det humane a2-MR-protem (generøst stilt til rådighet av Dr Joachim Herz, Herz et al , EMBO J , Vol 7, 1988, p 4119-4127) ble anvendt som templat i en serie polymerasekjedereaksjoner (PCR) som var utformet for å fremstille cDNA-fragmenter som tilsvarte et antall polypeptider som representerer domener og domeneklaser avledet fra c£2-MR-proteinet
Nr 1 Inneholder to domener av A-typen svarende til ammosyrerest fra 20 til 109 i ot2-NMR proteinet Primerne SEQ ID nr 11 og SEQ ID nr 12 ble anvendt i nevnte PCR
Nr 2 Inneholder to domener av A-typen etterfulgt av to domener av type B, tilsvarende ammosyrerest fra 20 til 190 i a2-MR-proteinet Primerne SEQ ID nr 11 og SEQ ID nr 13 ble anvendt i nevnte PCR
Nr 3 Identisk med nr 2, etterfulgt av en region inneholdende YWTD-repetisjoner, tilsvarende ammosyrerest fra 20 til 521 Primerne SEQ ID nr 11 og SEQ ID nr 14 ble anvendt i nevnte PCR
Nr 4 Inneholder en domene av type B, etterfulgt av 8 domener av type A og til slutt 2 domener av type B, tilsvarende ammosyrerest fra 803 til 1265 i a2-MR-protemet Primerne SEQ ID nr 15 og SEQ ID nr 16 ble anvendt i nevnte PCR
Nr 5 Inneholder bare de 8 domener av type A som også er tilstede i nr 4, tilsvarende ammosyrerest fra 849 til 1184 i ot2~MR~Pro1:e:Lnet Primerne SEQ ID nr . 17 og SEQ ID nr 18 ble anvendt i nevnte PCR
Nr 6 Inneholder de to C-terminale domener av type B fra nr 4, etterfulgt av 8 YWTD-repetisjoner og ett domene av type B, tilsvarende ammosyrerest fra 1184 til 1582 i a2-MR-proteinet Primerne SEQ ID nr 19 og SEQ ID nr 20 ble anvendt i nevnte PCR
Nr 7 Inneholder hele regionen som er inkludert i konstruksjonene fra nr 4 til nr 6, tilsvarende ammosyrerest fra 803 til 1582 i a2-MR-protemet Primerne SEQ ID nr 15 og SEQ ID nr 20 ble anvendt i nevnte PCR
Nr 8 Inneholder 10 domener av type A, tilsvarende ammosyrerest fra 2520 til 2941 i OÉ2~MR-Proteinet Primerne SEQ ID nr . 21 og SEQ ID nr 22 ble anvendt i nevnte PCR
Nr 9 Inneholder 11 domener av type A, tilsvarende ammosyrerest fra 3331 til 3778 i a2-MR-proteinet Primerne SEQ ID nr 23 og SEQ ID nr 24 ble anvendt i nevnte PCR
De mangfoldiggjorte nukleotidsekvenser som koder for domenene og domeneklasene ble i sin 5'-ende ved hjelp av PCR-reaksjonen bundet til nukleotidsekvenser {inkludert i SEQ ID nr 11, 15, 17, 19, 21 og 23), som koder for aminosyresekvens SEQ ID nr 37, som utgjør et spaltingssete for den bovine restriksjonsprotease FXa (Nagai og Thøgersen, Methods m Enzymology, Vol 152, 1987, p 4 61-481) De mangfoldiggjorte DN^-fragmenter ble enten subklonet mn i E coli ekspresjonsvektor pT7Hg (Christensen et al , FEBS Letters, Vol 295, 1991, p 181-184) eller ekspresjonsplasmidet pLcIIMLCHg, som er modifisert fra pLcIIMLC (Nagai et al , Nature, Vol 332, 1988, p 284-286) ved insersjon av et oligonukleotid som koder for seks histidmylrester C-termmalt i det lettkjedete myosm-fragment Konstruksjonen av de resulterende plasmider pT7H 6FX fra nr 1 til 3 og pLcIIMLCHgFX fra nr 4 til 9 er vist i fig 6-8, og fig 9 viser aminosyresekvensen til aet uttrykte protein (i SEQ ID nr 52 er det vist aminosyresekvensen som kodes av leserammen i full lengde)
Domenene og domeneklasene som ble subklonet i pT7Hg FX-serien ble dyrket og uttrykt i E coli BL21-celler m en middels skala {2 liter) slik som beskrevet av
Studier og Moffat, J Mol Biol , Vol 189, 1986, p 113-130 Eksponentielt voksende kulturer ved 37<*>C ble ved ODggo på 0,8 infisert med bakteriofag XCE6 ved en multiplisitet på ca 5 Kulturer ble dyrket ved 37°C i ytterligere 3 timer før celler ble høstet ved sentrifugering Celler ble lysert ved osmotisk sjokk og ultralydbehandlmg, og totalt cellulært protein ekstrahert inn i fenol (justert til pH 8 med Trisma-base)
Domeneklasene som var subklonet i pLcIIMLCHg-serien ble dyrket og uttrykt i E coli QYl3-celler slik som beskrevet i Nagai og Thøgersen, Methods in Enzymology, Vol 152, 1987, p 461-481 Eksponentielt voksende kulturer (4 liter) ved 30°C ble ved OD60n på 1,0 sKiftet til 42°C i 15 minutter Dette varmesjokk bevirker syntese av fusjonsproteinene Kulturene ble videre inkubert ved 37°C i fra 3 til 4 timer før celler ble dyrket ved sentrifugering Celler ble lysert ved osmotisk sjokk og ultralydbehandlmg og totalt cellulært protein ekstrahert inn i fenol
(justert til pH 8 med Trisma-base)
Råprotein ble utfelt fra fenolfasen ved tilsetning av 2,5 volumer etanol og sentrifugering Proteinpelleten ble løst i en buffer som inneholdt 6 M guanidmklorid, 50 mM Tris-HCl pH 8 og 0,1 M ditioerytriol Etter gelfiltrering på "Sephadex" G-25 (Pharmacia, Sverige) inn i 8 M urea, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM 2-merkaptoetanol og 2 mM metionm ble råproteinpreparatene anbrakt på en Ni<2+->aktivert NTA-agarosesøyle for rensing (Hochuli et al , 1988) av fusjonsproteinene og etterfølgende gjennomføring av den sykliske foldingsprosess
Alle buffere som ble fremstilt for væskekromatografi ble avgasset i vakuum før tilsetning av reduksjonsmiddel og/eller anvendelse
Fremstilling og "satsing" av Ni<2+>NTA-agarosesøylen er beskrevet i eksempel 1
Etter anbringelse av råproteinekstraktene på Wi<2+ >NTA-agarosesøylen ble fusjonsproteinene renset fra størstedelen av coli- og Å-fagproteinene ved vasking med ett søylevolum av bufferen etterfulgt av 6 M guanidmklorid, 50 mM Tris-HCl, 10 mM 2-merkaptoetanol og 2 mM metionm inntil eluatets optiske densitet (OD) ved 280 nm var stabil
Hvert av fusjonsproteinene ble refoldet på Ni<2+>NTA-agarosesøylen ved anvendelse av en gradientprofil slik som beskrevet i tabell 4 og 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM CaCl2, 0,33 mM metionm samt 2,0 mM/0,2 mM redusert/ oksidert glutation som buffer A og 4 M urea, 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM CaCl2, 2 mM metionm og 3 mM redusert glutation som buffer B Den reduserte/oksiderte glutationløsnmg var nylig fremstilt som en 100 gangers forrådsløsning ved tilsetning av 9,9 M H202 til en omrørt løsning av 0,2 M redusert glutation før tilsetning til buffer A
Etter fullføring av den sykliske foldingsprosess ble fusjonsproteinene som representerer domener og domeneklaser avledet fra ot2-MR-proteinet eluert fra Ni<2+>NTA-agarosesøylen med en buffer som inneholdt 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl og 5 mM EDTA pH 8 Fusjonsproteiner som var aggregert og utfelt på Ni<2+>NTA-agarosesøylen ble eluert i buffer B
Ca 75% av f usjonsprotemmaterialet som var uttrykt fra plasmidene pT^HgFX nr 1 og 2, representerende N-terminale to og fire cystemrike domener av a2~MR-proteinet, ble eluert fra Ni<2+>NTA-agarosesøylen ved hjelp av den ikke-denaturerende buffer Størstedelen av dette fusjonsprotemmateriale viste seg som monomert bedømt ved ikke-reduserende SDS-PAGE-analyse Utbyttet av monomert fusjonsprotein nr 1 og 2 ble estimert til ca 50 mg
Ca 50% av fusjonsprotemmaterialet som ble uttrykt fra alle øvrige ekspresjonsplasmider som representerer domeneklaser avledet fra a2-MR-proteinet ble eluert fra Ni <2+>NTA-agarosesøylen ved hjelp av den ikke-denaturerende buffer Mellom 30% (fusjonsproteiner nr 5 og 7) og 65%
(fusjonsprotein nr 4) av disse fusjonsproteiner viste seg å være monomere bedømt ved hjelp av ikke-reduserende SDS-PAGE-analyse (se fig 17, felter 9 og 10)
Hvert fusjonsprotein som ble eluert ved hjelp av den ikke-denaturerende eluermgsbuffer ble spaltet med restriksjonsproteasen FXa natten over ved romtemperatur i et estimert vekt til vektforhold på 100 1
Etter gelfiltrering på "Sephadex" G-25 mn i 100 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 8 ble protemløsningen ledet gjennom en Ni^<+>NTA-agarosesøyle, hvorved uspaltet fusjonsprotein og den frigjorte N-terminale fusjonshale med opprinnelse i de spaltede fusjonsproteiner ble derved fjernet FXa ble fjernet fra løsningen ved å lede de rekombinante protemløsnmger gjennom en liten søyle av SBTI-agarose (søyabønne-trypsininhibitor som var lmmobili-sert på "Sepharose" CL-6B (Pharmacia, Sverige))
SDS-PAGE-analyse av det refoldete, løselige fusjonsprotemprodukt nr 4 er vist i fig 17, felter 9 og 10, som viser henholdsvis reduserte og ureduserte prøver Mobilitetsøkningen som ble iakttatt for den ureduserte prøve reflekterer polypeptidets kompakthet som følge av nærværet av 33 disulfldbroer
Hvert av de rekombinante proteiner viste seg å binde Ca^<+> på en strukturavhengig måte
Det ble funnet av Dr Søren Moestrup at et monoklonalt antistoff, A2MRa-5 avledet fra det naturlige, humane 0C2_MRr bandt de rekombinante proteiner som uttrykkes av konstruksjonene nr 4, 6 og 7, mens et monospesifikt antistoff, A2MRa-3 som også var avledet fra naturlig o^-MR, viste seg å binde det rekombinante protein som uttrykket av konstruksjon nr 8 Begge antistoffers bmdmgsspesiflsitet er strukturavhengig (dvs at anti-stoffene hverken reagerer med det reduserte c<2-MR eller med redusert, rekombinant protein)
EKSEMPEL 5
Fremstilling og folding av bovin koaguleringsfaktor Xa (FX a»
I dette eksempel beskrives fremstilling i E coli av ett fragment avledet fra bovin FXa som et FXa-spaltbart fusjonsprotein samt rensingen, in vitro foldingen samt bearbeidelsen av det rekombinante protein
Det cDNA som koder for bovin FX ble klonet ved hjelp av spesifikk mangfoldiggjøring i en polymerasekjedereaksjon (PCR) av nukleotidsekvensene som koder for FX fra ammosyrerest Se<r>g2 til Tr<p>4<g>^ (SEQ ID nr 2, rester 82-484) (FXAy, ammosyrenummereringen vedrører den fulle kodende leseramme) under anvendelse av første tråd oligo-dT-primet cDNA syntetisert fra total bovinlever-RNA som templat Primere som ble anvendt i polymerasereaksjonen var SEQ ID nr 25 og SEQ ID nr 26 RNA-ekstraksjon og cDNA-syntese ble utført ved standard metoder
Den mangfoldiggjorte leseramme som kodet for FXAy ble i 5'-enden, via PCR-reaksjonen, bundet til nukleotidsekvenser som koder for aminosyresekvensen SEQ ID nr 37, som utgjør et spaltmgssete for den bovine restriksjonsprotease FXa (Nagai og Thøgersen, Methods m Enzymology, Vol 152, 1987, p 461-481) De mangfoldiggjorte DNA-fragmenter ble klonet inn i E coli-ekspresjonsvektoren pLcIIMLCHg, som er modifisert fra pLcIIMLCH (Nagai et al , Nature, Vol 332, 1988, p 284-286) ved insersjon av et oligonukleotid som koder for seks histidmylrester som er C-terminale i forhold til det lette myosmkj edefragment Konstruksjonen av det resulterende plasmid pLcIIMLCHgFX-FXAy er vist i fig 10, og fig 11 viser aminosyresekvensen til det uttrykte protein (SEQ ID nr 53 viser aminosyresekvensen som kodes av leserammen med full lengde)
pLcIIMLCHg-FXAv-plasmidet ble dyrket og uttrykt i E coli QY13 celler slik som beskrevet av Nagai og Thøgersen
(Methods in Enzymology, Vol 152, 1987, p 461-481)
Eksponentielt voksende kulturer ved 30°C ble ved OD^qq på 1,0 inkubert ved 42°C i 15 minutter Dette varmesjokk bevirker syntese av fusjonsproteiner Kulturene ble inkubert ytterligere ved 37°C i fra 3 til 4 timer før celler ble høstet ved sentrifugering Celler ble lysert ved osmotisk sjokk og ultralydbehandlmg, og totalt cellulært protein ble ekstrahert inn i fenol (justert til pH 8 med Trisma-base)
Råprotem ble utfelt fra fenolfasen ved tilsetning av 2,5 volumer etanol og sentrifugering Proteinpelleten ble løst i en buffer som inneholdt 6 M guanidmklorid, 50 mM Tris-HCl pH 8 og 0,1 M ditioerytriol Etter gelfiltrermg på "Sephadex" G-25 (Pharmacia, LKB, Sverige) mn i 8 M urea, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM 2-merkaptoetanol ble råprotempreparatet tilført til en Ni^ -aktivert NTA-agarosematriks for rensing (Hochuli et al , 1988) av FXåy- fusjonsproteinet og deretter gjennomgå den sykliske foldingsprosess
Alle buffere fremstilt for væskekromatografi ble avgasset i vakuum før tilsetning av reduksjonsmiddel og/ eller anvendelse
Fremstilling og "satsing" av Ni<2+>NTA-agarosesøylen er beskrevet i eksempel 1
Etter anbringelse av råproteinekstraktene på Ni<2+ >NTA-agarosesøylen ble fusjonsproteinene renset fra størstedelen av coli- og A-fagproteinene ved vasking med ett søylevolum av bufferen etterfulgt av 6 M guanidmklorid, 50 mM Tris-HCl og 10 mM 2-merkaptoetanol inntil eluatets optiske densitet (OD) ved 280 nm var stabil
Fusjonsproteinet ble refoldet på Ni<2+>NTA-agarose-søylen under anvendelse av en gradientprofil slik som beskrevet i tabell 5 og 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM CaCl2 og 2,0 mM/0,2 mM redusert/oksidert glutation som buffer A og 8 M urea, 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM CaCl2 og 3 mM redusert glutation som buffer B Den reduserte/oksiderte glutationløsnmg var nylig fremstilt som en 100 gangers forrådsløsning ved tilsetning av 9,9 M H2O2 til en omrørt løsning av 0,2 M redusert glutation før tilsetning til buffer A
Etter fullføring av den sykliske foldingsprosess ble FXAy-fusjonsproteinet eluert fra Ni<2+>NTA-agarosesøylen med en buffer som inneholdt 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA pH 8 Fusjonsprotein som var aggregert og utfelt på Ni<2+>NTA-agarosesøylen ble eluert 1 buffer B
Ca 33% av FXåy- fusjons<p>rotemmaterialet ble eluert fra Ni<2+>NTA-agarosesøylen ved hjelp av den ikke-denaturerende buffer Mengden FXAy-fusjonsprotein ble estimert til 15 mg Bare ca en tredjedel av dette fusjonsprotemmateriale viste seg som monomert bedømt ved hjelp av lkke-reduserende SDS-PAGE-analyse, noe som tilsvarte en total effektivitet av foldingsprosessen på ca 10%
FXAy-fusjonsprotein 1 ikke-denaturerende buffer ble aktivert ved å lede løsningen av rekombinant protein gjennom en liten søyle av trypsm-agarose (trypsinimmobi-lisert på "Sepharose" CL-6B (Pharmacia, Sverige))
Det aktiverte, rekombinante FXAy-fusjonsprotein ble prøvet på proteolytisk aktivitet og substratspesiflsitets-proil ved å benytte standard prosesser med kromogene sub-strater Aktiviteten og substratspesiflsitetsprofilen kunne ikke sjeldnes fra den som var oppnådd for naturlig, bovin FXa
EKSEMPEL 6
Fremstilling og folding av kringledomener 1 og 4 fra humant plasmmogen
I dette eksempel beskrives fremstillingen 1 E coli av de lysmbindende kringledomener 1 og 4 fra humant plasmmogen (henholdsvis Kl og K4) som FXa-spaltbare fusjonsproteiner og rensingen og m vitro foldingen av Kl-og K4-fusjonsprotemene
En plasmidklon som inneholdt den fulle lengde cDNA som koder for humant plasmmogen klonet mn 1 den generelle klonmgsvektor pUC18 (generøst stilt til rådighet av Dr Earl Davie, Seattle, USA) ble anvendt som templat i en polymerasekjedereaksjon (PCR) som var utformet for å fremstille cDNA-fragmenter som tilsvarte Kl (som tilsvarte aminosyrerestene fra Sergi til GlU]_g2 1 såkalt Glu-plasminogen) og K4 (som tilsvarte ammosyrerest fra Val354 til Ala43g 1 såkalt Glu-plasminogen) Primerne SEQ ID nr 27 og SEQ ID nr 28 ble anvendt i PCR-fremstillmgen av Kl, og primerne SEQ ID nr 29 og SEQ ID nr 30 ble anvendt i PCR-f remstillmgen av K4
De mangfoldiggjorte leserammer som koder for Kl og K4 ble i deres 5'-ender via PCR-reaksjonen bundet til nukleotidsekvenser, inkludert i SEQ ID nr 27 og SEQ ID nr 29, som koder for aminosyresekvens SEQ ID nr 37 som utgjør et spaltmgssete for den bonne restriksjonsprotease FXa (Nagai og Thøgersen, Methods m Enzymology, Vol 152, 1987, p 461-481) Det mangfoldiggjorte Kl DNA-fragment ble klonet inn i E coli ekspresjonsvektor pLcIIMLCHg, som er modifisert fra pLcIIMLC (Nagai et al , Nature, Vol 332, 1988, p 284-286) ved insersjon av et oligonukleotid som koder for seks hisitidinylrester C-termmalt i forhold til det lette myosinkjedefragment Konstruksjonen av det resulterende plasmid pLcIIMLCHgFX-Kl er vist i fig 12 Det mangfoldiggjorte K4 DNA-fragment ble klonet mn i E coli ekspresjonsvektor pLcIIHg, som er modifisert fra pLcII (Nagai og Thøgersen, Methods in Enzymology, Vol 152, 1987, p 461-481) ved insersjon av et oligonukleotid som koder for seks histidmylrester C-termmalt i cll-fragmentet Konstruksjonen av den resulterende plasmid pLcIIHgFX-K4 er vist i fig 13, og fig 14 viser aminosyresekvensen til humant "Glu"-plasminogen
(SEQ ID nr 54)
Både pLcIIMLCHg-Kl-plasmiden og pLcIIHgFX-K4-plasmiden ble dyrket og uttrykt i E coli QY13 celler slik som beskrevet av Nagai og Thøgersen, Methods in Enzymology, Vol 152, 1987, p'461-481 Eksponentielt voksende kulturer ved 30°C ble ved ODg0n På 1*0 skiftet til 42°C i 15 minutter Dette varmesjokk bevirket syntese av fusjonsproteinene Kulturene ble ytterligere inkubert ved 37°C i fra 3 til 4 timer før celler ble høstet ved sentrifu-germg Celler ble lysert ved osmotisk sjokk og ultralydbehandlmg og totalt cellulært protein ekstrahert mn i fenol (justert til pH 8 med Trisma-base)
Råprotem ble utfelt fra fenolfasen ved tilsetning av 2,5 volumer etanol og sentrifugering Proteinpelleten ble løst i en buffer som inneholdt 6 M guanidmklorid, 50 mM Tris-HCl pH 8 og 0,1 M ditioerytriol Etter gelfiltrering på "Sephadex" G-25 (Pharmacia, Sverige) mn i 8 M urea, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM 2-merkaptoetanol og 2 mM metionin ble råproteinpreparatet tilført til en Ni<2+->aktivert NTA-agarosematriks for rensing (Hochuli et al , 1988) av Kl- og K4-fusjonsproteinene og deretter gjennomgå den-sykliske foldingsprosess
Alle buffere som ble fremstilt for væskekromatografi ble avgasset i vakuum før tilsetning av reduksjonsmiddel og/eller anvendelse
Fremstilling og "satsing" av Ni<2+>NTA-agarosesøylen er beskrevet i eksempel 1
Etter anbringelse av råprotemekstraktene på Ni<2+ >NTA-agarosesøylen ble fusjonsproteinene renset fra størstedelen av coli- og A-fagproteinene ved vasking med ett søylevolum av bufferen etterfulgt av 6 M guanidmklorid, 50 mM Tris-HCl, 10 mM 2-merkaptoetanol og 2 mM metionin inntil søyleeluatets optiske densitet (OD) ved 280 nm var stabil
Fusjonsproteinet ble refoldet på Ni<2+>NTA-agarose-søylen ved anvendelse av en gradientprofil slik som beskrevet i tabell 4 med-0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM 6-aminoheksansyre (e-ammokarbonsyre, e-ACA), 0,33 mM metionin og 2,0 mM/0,2 mM redusert/oksidert glutation som buffer A og 4 M urea, 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM e-ammokapronsyre, 2 mM metionm og 3 mM redusert glutation som buffer B Den reduserte/oksiderte glutation-løsmng var nylig fremstilt som en 100 gangers forråds-løsning ved tilsetning av 9,9 M ^ 2®2 tl-L en ornrørt løsning av 0,2 M redusert glutation før tilsetning til buffer A
Etter fullføring av den sykliske foldingsprosess ble hver av Kl- og K4-fusjonsproteinene eluert fra Ni^<+>NTA-agarosesøylen med en buffer som inneholdt 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl og 5 mM EDTA pH 8 Fusjonsproteinene som var aggregert og utfelt på Ni<2+>NTA-agarosesøylen ble eluert i buffer B
Stort sett alt Kl- og K4-fusjonsproteinmateriale ble eluert fra Ni<2+>NTA-agarosesøylene ved hjelp av den ikke-denaturerende buffer Det estimerte utbytte av Kl-fusjons-protsm og K4-fusjonsprotein var ca 60 mg Stort sett alt Kl-fusjonsproteinet og K4-fusjonsprotemet viste seg å være monomert bedømt ved ikke-reduserende SDS-PAGE-analyse, noe som tilsvarte en effektivitet ved foldmgsprosessen på over 90%
SDS-PAGE-analyse-av fremstillingen av rekombinante plasminogenkrmgler 1 og 4 er vist i fig 17
Kl-fusjonsprotemet og K4-fusjonsproteinet ble renset ytterligere ved affinitetskromatografi på lysin-"Sepharose" CL-6B (Pharmacia, Sverige) Fusjonsproteinene ble eluert fra af f mitetsøylene ved hjelp av en buffer som inneholdt 0,5 NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 og 10 mM e-ammokapronsyre
Binding til lysin-"Sepharose" er vanlig akseptert som indikasjon på korrekt folding av lysinbmdende kringledomener
Den tredimensjonale struktur av rekombinante Kl- og K4-proteindomener, som er fremstilt ved denne sykliske foldingsprosess og som er blitt fullstendig bearbeidet ved frigjøring fra den N-terminale fusjonshale og deretter renset ved lonebytterkromatografi er blitt bekreftet ved røntgendiffraksjon (utført av Dr Robert Huber) og to-dimensjonal NMR-analyse (utført av stud scient Peter Reinholdt og Dr Flemming Poulsen)
Det generelle utbytte av fullt bearbeidede, rekombinante Kl- og K4-protemdomener ved denne prosess er 5 mg/ liter kultur
EKSEMPEL 7
Fremstilling i E coli og refolding av rekombinante fragmenter avledet fra humant 0C2-makroglobulin og kylling-ovostatm
I dette eksempel beskrives fremstillingen i E coli av det reseptorbindende domene av humant (^-makroglobulin {ot2-MRBDv) som et FXa-spaltbart fusjonsprotein, og rensingen av det rekombinante o^-MRBDv etter FXa-spaltmg
Det 4 62 basepar store DNA-fragment som koder for a2~ makroglobulinleserammen fra ammosyrerest Val-^gg t:Ll Ala 1451 («2~MRDv' kle mangfoldiggjort i en polymerasekjedereaksjon (PCR), ved stort sett å følge protokollen til Saiki et al , (1988) pA2M (generøst stilt til rådighet av Dr T Kristensen) som inneholdt den fulle lengde cDNA av humant a^-makroglobulm ble anvendt som templat og oligonukleotidene SEQ ID nr 31 og SEQ ID nr 32 som primere Den mangfoldiggjorte, kodende leseramme var 5'-enden, via PCR-reaksjonen, bundet til en nukleotidsekvens, inkludert i SEQ ID nr 7, som koder for aminosyresekvensen SEQ ID nr 37 som utgjør et spaltingssete for den bovme restriksjonsprotease FXa (Nagai og Thøgersen, 1987) Det mangfoldiggjorte DNA-fragment ble subklonet inn i E coli ekspresjonsvektoren pT-yHg (Christensen et al , 1991) Konstruksjonen av det resulterende plasmid pT7HgFX-a2MRDv (som uttrykker humant a2-MRDv) er vist i fig 18, og aminosyresekvensen til det uttrykte protein er vist i fig 19 (SEQ ID nr 55)
Rekombinant, humant a2MRDv ble fremstilt ved dyrking og uttrykking av plasmidet pT7HgFX-a2MRDv i E coli BL21 celler i middels skala (2x1 liter), slik som beskrevet av Studier og Moffat, J Mol Biol , Vol 189, 1986, p 113-130 Eksponentielt voksende kulturer ved 37°C ble ved ODgøo på 0,8 infisert med bakteriofag ACE6 med en multiplisitet på ca 5 Kulturen ble dyrket ved 37°C i ytterligere 3 timer før celler ble høstet ved sentrifugering Celler ble lysert ved osmotisk sjokk og ultralydbehandlmg og totalt cellulært protein ekstrahert mn i fenol {justert til pH med Trisma-base) Protein ble utfelt fra fenolfasen ved tilsetning av 2,5 volumer etanol og sentrifugering Protempelleten ble løst i en buffer som inneholdt 6 M guanidmklorid, 5 mM Tris-HCl pH 8 og 50 mM ditioerytriol Etter gelflltrering på "Sephadex" G-25 (Pharmacia, LKB, Sverige) inn i 8 M urea, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 og 10 mM 2-merkaptoetanol ble raprotempreparatet anbrakt på en Ni<2+->aktivert NTA-agarosesøyle (Ni<2+>NTA-agarose) for rensing (Hochuli et al , 1988) av fusjonsproteinet MGSHHHHHHGSIEGR-o<2MRDv (hvor MGSHHHHHHGSIEGR er SEQ ID
nr 48) og deretter gjennomgå den sykliske foldingsprosess
Fremstilling og "satsing" av Ni<2+>NTA-agarosesøylen er beskrevet i eksempel 1
Alle buffere som ble fremstilt for væskekromatografi ble avgasset i vakuum før tilsetning av reduksjonsmiddel og/eller anvendelse
Etter anbringelse av råproteinekstrakten på Ni^<+>NTA-agarosesøylen ble fusjonsproteinet, MGSHHHHHHGSIEGR-ajMRDv {hvor MGSHHHHHHGSIEGR er SEQ ID nr 48) renset fra størstedelen av coli- og A-fagprotemene ved vasking med ett søylevolum av bufferen etterfulgt av 6 M guanidmklorid, 50 mM Tris-HCl og 10 mM 2-merkaptoetanol inntil eluatets optiske densitet (OD) ved 280 nm var stabil
Fusjonsproteinet ble refoldet på Ni<2+>NTA-agarose-søylen under anvendelse av en gradientprofil slik som beskrevet i tabell 4 og 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 og
2,0 mM/0,2 mM redusert/oksidert glutation som buffer A og 8 M urea, 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 og 5 mM redusert glutation som buffer B Den reduserte/oksiderte glutation-løsning var nylig fremstilt som en 200 gangers forråds-løsnmg ved tilsetning av 9, 9 M H2O2 til en omrørt løsning av 0,2 M redusert glutation før tilsetning til buffer A
Etter fullføring av den sykliske foldingsprosess ble o^MRDv-fusjonsproteinet eluert fra Ni<2+>NTA-agarosesøylen med en buffer som inneholdt 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 20 mM EDTA pH 8 Fusjonsproteinet som var aggregert og utfelt på Ni<2+>NTA-agarosesøylen ble eluert i buffer B
Ca 50% av f usjons<p>rotemmaterialet ble eluert i den vandige eluermgsbuffer Halvparten av dette fusjonsproteinmateriale viste seg å være monomert og foldet slik det ble bedømt ved ikke-reduserende SDS-PAGE-analyse.
Rekombinant o^MRDv-protem ble frigjort fra den N-terminale fusjonshale ved spalting med restriksjonsproteasen FXa ved romtemperatur i et vekt til vektforhold på ca 50 1 i 4 timer Etter spalting ble c^MRDv-proteinet isolert fra uspaltet fusjonsprotein, den frigjorte fusjonshale samt FXa ved gelflltrering på "Sephadex" G-25 inn i 10 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 etterfulgt av ione-bytterkromatografi på "Q-Sepharose" a2MRDv ble eluert i en lineær gradient (via 10 søylevolumer) fra 10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8 til 500 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8 c^MRDv-proteinet fcle eluert ved 150 mM NaCl
Det rekombinante c^MRDv-domene bindes til c^M-reseptoren med en lignende affinitet til reseptoren som den som utøves av det fullstendige c^-makroglobulmmolekyl (referert til den estimerte KD i en ligand-en reseptor-binding (Moestrup og Glieman 1991) ) Bindmgsanalyse ble utført av Dr Søren K Moestrup og stud scient Kåre Lehmann)
EKSEMPEL 8
Fremstilling i E coli og refolding av rekombinante fragmenter avledet fra kappeglykoprotein G fra ørretvirus VHS
Ekspresjon og in vitro refolding av rekombinante fragmenter avledet fra kappeglykoproteinet G fra ørretvirus VHS i E coli som FXa-spaltbare fusjonsproteiner ble utført under anvendelse av generelle strategier som var analoge til de som er omtalt i den generelle beskrivelse av "den sykliske refoldingsprosess" og gitt i eksemplene 1-6
EKSEMPEL 9
Fremstilling i E coli og refolding av rekombinant, humant tetranectin og rekombinante fragmenter avledet fra humant tetranectin
Tetranectin er et tetramert protein bestående av fire identiske og ikke-kovalent bundne enkeltkjedete underenheter av 181 ammosyrerester (17 kDa) Hver underenhet inneholder 3 disulfldbroer og binder Ca^<+> Tetranectin finnes i plasma og er knyttet til ekstracellulær matriks Tetranectin bindes spesifikt til plasmmogen kringle 4 Denne binding kan titreres spesifikt ved hjelp av lysin eller Y-aminosyrer
Den cDNA som koder for leserammen som svarer til den modne, enkeltkjedete tetranectinunderenhet ble klonet ved spesifikk mangf oldiggjørmg i en polymerasekjedereaksjon (PCR) Saiki et al , 1988) av nukleotidsekvensene fra ammosyrerest Glu^ til Val^si un<^er anvendelse av første tråd oligo-dT-primet cDNA syntetisert fra total, human plasental RNA som templat Primere som ble anvendt i polymerasekjedereaksjonen var SEQ ID nr 33 og SEQ ID
nr 34 RNA-ekstraksjon og cDNA-syntese ble utført ved standard prosesser
Den mangfoldiggjorte leseramme som koder for tetranectins monomere underenhet ble i 5'-enden, via PCR-reaksjonen, bundet til nukleotidsekvenser som koder for aminosyresekvensen SEQ ID nr 37 som utgjør et spaltmgssete for den bovine restriksjonsprotease FXa (Nagai og Thøgersen, 1987) En glycmrest ble, som følge av den spesifikke utforming av 5'-PCR-primeren (SEQ ID nr 33) insertert mellom den C-terminale arginmrest av FXa-spaltmgssetet (SEQ ID nr 37) og tetranectins Glu^-rest Det mangfoldiggjorte DNA-fragment ble subklonet mn i E coli ekspresjonsvektoren pT^Hg (Christensen et al , 1991) Konstruksjonen av det resulterende plasmid pT- jH^ FX- TEW (som uttrykker tetranectinmonomeren) er vist i fig 20, og det uttrykte proteins aminosyresekvens er vist i fig 21
(i SEQ ID nr 56 er aminosyresekvensen som kodes av leserammen med full lengde vist)
For å fremstille tetranectinmonomeren ble plasmidet pT7H6FX-TETN dyrket i middels skala {4x1 liter, 2xTY-medium, 5 mM MgSO^ og 100 ug ampicillin) i E coli BL21 celler, slik som beskrevet av Studier og Moffat, J Mol Biol , Vol 189, 1986, p 113-130 Eksponentielt voksende kulturer ved 37°C ble ved ODgøo pa 0,8 infisert med bakteriofag ACE6 ved en multiplisitet på ca 5 Kulturer ble dyrket ved 37°C i ytterligere 3 timer og cellene høstet ved sentrifugering Celler ble resuspendert i 150 ml 0,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8 og 1 mM EDTA pH 8 Fenol (100 ml justert til pH 8) ble tilsatt, og blandingen ble ultralydbehandlet for å ekstrahere det totale protein Protein ble utfelt fra fenolfasen ved hjelp av 2,5 volumer etanol og sentrifugering
Protempelleten ble løst i en buffer som inneholdt 6 M guanidmklorid, 50 mM Tris-HCl pH 8 og 0,1 M ditioerytriol Etter gelflltrermg på "Sephadex" G-25 (Pharmacia, LKB, Sverige) inn i 8 M urea, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH
8 og 10 mM 2-merkaptoetanol ble råprotempreparatet anbrakt på en Ni<2+->aktivert NTA-agarosesøyle (Ni<2+>NTA-agarose, 75 ml som var vasket på forhånd med 8 M urea, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 og 10 mM 2-merkaptoetanol) for rensing (Hochuli et al-, 1988) av fusjonsproteinet, MGSHHHHHHGSIEGR-TETN (hvor MGSHHHHHHGSIEGR er SEQ ID nr 48)
Fremstilling og "satsing" av Ni<2+>NTA-agarosesøylen er beskrevet i eksempel 1
Alle buffere som ble fremstilt for væskekromatografi ble avgasset i vakuum før tilsetning av reduksjonsmiddel og/eller anvendelse
Søylen ble vasket med 200 ml 8 M urea, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 og 10 mM 2-merkaptoetanol (buffer I) og 100 ml 6 M guanidmklorid, 50 mM Tris-HCl pH 8 og 10 mM 2-merkaptoetanol (buffer II) Fusjonsproteinet MGSHHHHHHGSIEGR-TETN ble eluert med buffer II som inneholdt 10 mM EDTA pH 8, og eluatet ble gelfiltrert på "Sephaaex" G-25 under anvendelse av buffer I som elueringsmiddel
Det eluerte protein ble deretter refoldet Fusjonsproteinet MGSHHHHHHGSIEGR-TETN (hvor MGSHHHHHHGSIEGR er SEQ ID nr 48) ble blandet med 100 ml Ni<2+>NTA-agarose Harpiksen som inneholdt bundet protein ble pakket i en søyle med diameter 5 cm og vasket med buffer I supplert med CaCl2 til 2 mM Fusjonsproteinet ble refoldet på Ni<2+ >NTA-agarosesøylen ved 11-12°C under anvendelse av en gradientprofil slik som beskrevet i tabell 4 og 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM CaCl2 og 2,0 mM/0,2 mM redusert/oksidert glutation som buffer A og 8 M urea, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM CaCl2 og 3 mM redusert glutation som buffer B Den reduserte/oksiderte glutation-løsning var nylig fremstilt som en 200 gangers forråds-løsning ved tilsetning av 9,9 M H202 til en omrørt løsning av 0,2 M redusert glutation før tilsetning til buffer A
Etter fullføring av den sykliske foldingsprosess ble tetranectmfusjonsprotemet eluert fra Ni<2+>NTA-agarose-søylen med en buffer som inneholdt 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl og 25 mM EDTA pH 8 Tetranectmfusjonsprotemet ble spaltet med FXa ved 4°C natten over i et molart forhold på 1 300 Etter FXa-spalting ble proteinprøven konsentrert 10 ganger ved ultraflltrermg på en YMlO-membran (Amicon) Rekombinant tetranectin ble etter 10 gangers tynning av proteinprøven med 2 mM CaCl2 isolert ved lonebytter-kromatografi på "Q-Sepharose" (Pharmacia, Sverige) i en lineær gradient via 10 søylevolumer fra 10 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM CaCl2 til 10 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM CaCl2 og 0,5 M NaCl
Rekombinant tetrancetin fremstilt ved denne prosess ble analysert av Dr Inge Clemmensen, Rigshospitalet, København Dr Clemmensen fant at det rekombinante tetranectin når det gjaldt binding til plasmmogen kringle 4 og ekspresjon av antigene seter oppførte seg helt likt med naturlig, isolert, humant tetranectin
Primære forsøk av sammenligning av effektiviteten ved refolding under anvendelse av den "sykliske re-foldmgsprosess" av rekombinant tetranectmfusjonsprotein bundet til Ni<2+>NTA-agarosesøylen i forhold til rekombinant tetranectin inneholdt i en dialysepose indikerte et vesentlig bedre utbytte av løselig monomer fra løsnmgs-refoldingsstrategien Men dersom et produkt fra sykliser-mgsprosessene underkastes disulfldomdanning i løsning i nærvær av 5 mM CaCl2 omdannes stort sett alt polypeptidmaterialet til den korrekt foldete tetranectmtetramer
Denaturert og redusert, rekombinant, autentisk tetranectin som befant seg i en dialysepose ble refoldet via 15 sykliske eksponeringer for buffer B (6 M urea, 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM/0,2 mM redusert/ oksidert glutation, 2 mM CaCl2 og 0,5 mM metionin) og buffer A (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM/0,2 mM redusert/oksidert glutation, 2 mM CaCl2 og 0,5 mM metionin)
EKSEMPEL 10
Fremstilling og folding av et diastof f uttrykt intra.-cellulært i E coli Mab 32 diastoff rettet mot tumornekrosefaktor
Diastoffer (beskrevet i Holliger et al , 1993) er kunstige, bivalente og bispesifikke antistoffragmenter
I dette eksempel beskrives fremstillingen i E coli av et diastoff rettet mot tumornekrosefaktor alfa (TNF-a), avledet fra det monoklonale museantistoff Mab 32 (Rathjen et al , 1991, 1992, australsk patentsøknad 7 576, EP-A-486 526)
En fagraidklon, pCANTAB5-myc-Mab32-5, som inneholdt Mab32 kodet i diastofformatet (PCT/GB93/02492) ble generøst stilt til rådighet av Dr G Winter, Cambridge Antibody Technology (CAT) Ltd , Cambridge, Storbritannia. pCANTAB5-myc-Mab32-5 DNA ble anvendt som templat i en polymerasekjedereaksjon (PCR) (Saiki et al , 1988) under anvendelse av primerne SEQ ID nr 35 og SEQ ID nr 36, som var utformet for å fremstille et cDNA-fragment som tilsvarte det komplette, kunstige diastoff Den mangfoldiggjorte kodende leseramme ble i 5'-enden, via PCR-reaksjonen, bundet til en nukleotidsekvens som var inkludert i SEQ ID nr 35 og som kodet for aminosyresekvensen SEQ ID nr 37, som utgjør et spaltingssete for den bovine restriksjonsprotease FXa (Nagai og Thøgersen, 1987) Det mangfoldiggjorte DNA-fragment ble subklonet inn i E coli ekspresjonsvektoren pT7H6 (Christensen et al , 1991) Konstruksjonen av det resulterende plasmid pT7HgFX-DB32 (som uttrykker Mab32 diastoffet) er vist 1 fig 22, og ammosyresekvensene til det uttrykte protein er vist 1 fig 23 (1 SEQ ID nr • 57 er vist aminosyresekvensen som kodes- av leserammen med full lengde)
For å fremstille diastoffragmentet ble plasmidet pT7 H6FX-DB32 dyrket 1 middels skala (4x1 liter, 2xTY-medium, 5 mM MgSO^ og 100 ug ampicillin) 1 E coli BL21 celler, slik som beskrevet av Studier og Moffat, J Mol Biol , Vol 189, 1986, p 113-130 Eksponentielt voksende kulturer ved 37°C ble ved ODggo P å u>8 infisert med bakteriofag XCE6 ved en multiplisitet på ca 5 40 minutter etter infeksjon ble rifampicm tilsatt (0,2 g 1 2 ml metanol per liter medium) Kulturer ble dyrket ved 37°C 1 ytterligere 3 timer, og cellene høstet ved sentrifugering Celler ble resuspendert 1 150 ml 0,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8 og 1 mM EDTA pH 8 Fenol (100 ml justert til pH 8) ble tilsatt, og blandingen ble ultralydbehandlet for å ekstrahere det totale protein Protein ble utfelt fra
fenolfasen ved hjelp av 2,5 volumer etanol og sentrafu-gering
Proteinpelleten ble løst i en buffer som inneholdt 6 M guanidmklorid, 50 mM Tris-HCl pH 8 og 0,1 M ditioerytriol Etter gelfiltrermg på "Sephadex" G-25 (Pharmacia, LKB, Sverige) inn i 8 M urea, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 og 10 mM 2-merkaptoetanol ble råproteinpreparatet til-ført til en Ni<2+->aktivert NTA-agarosesøyle (Ni<2+>NTA-agarose, 75 ml, vasket på forhånd med 8 M urea, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 og 10 mM 2-merkaptoetanol) for rensing (Hochuli et al , 1988) av fusjonsproteinet, MGSHHHHHHGSIEGR-DB32 (hvor MGSHHHHHHGSIEGR er SEQ ID nr 48)
Fremstilling og "satsing" av Ni<2>~NTA-agarosesøylen er beskrevet i eksempel 1
Alle buffere fremstilt for væskekromatografi ble avgasset i vakuum før tilsetning av reduksjonsmiddel og/ eller anvendelse
Søylen ble vasket med 200 ml 8 M urea, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 og 10 mM 2-merkaptoetanol (buffer I) og 100 ml 6 M guanidmklorid, 50 mM Tris-HCl pH 8 og 10 mM 2-merkaptoetanol (buffer II) Fusjonsproteinet MGSHHHHHHGSIEGR-DB32 ble eluert med buffer II som inneholdt 10 mM EDTA pH 8, og eluatet ble gelfiltrert på "Sephadex" G-25 under anvendelse av buffer I som eluer-mgsmiddel
Det eluerte protein ble deretter refoldet Fusjonsproteinet MGSHHHHHHGSIEGR-DB32 (hvor MGSHHHHHHGSIEGR er SEQ ID nr 48) ble blandet med 100 ml Ni<2+>NTA-agarose Harpiksen som inneholdt bundet protein ble pakket i en søyle med diameter 5 cm og vasket med buffer I Fusjonsproteinet ble refoldet på Ni<2+>NTA-agarosesøylen ved ll-12e,C under anvendelse av en gradientprofil slik som beskrevet i tabell 4 og 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 og 2,0 mM/0,2 mM redusert/oksidert glutation som buffer A og 8 M urea, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 og 3 mM redusert glutation som buffer B Den reduserte/oksiderte glutation-løsnmg var nylig fremstilt som en 200 gangers forråds-løsning ved tilsetning av 9,9 M H202 tl1 en omrørt løsning av 0,2 M redusert glutation før tilsetning til buffer A
Etter fullføring av den sykliske foldingsprosess ble fusjonsproteinet DB32 eluert fra Ni<2+>NTA-agarosesøylen med en buffer som inneholdt 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 25 mM EDTA pH 8 og justert til 5 mM GSH, 0,5 mM GSSG og inkubert i fra 12 til 15 timer ved 20°C Fusjonsproteinet ble deretter konsentrert 50 ganger ved ultraflltrering under anvendelse av YM10-membraner og klarnet ved sentrifugering
DB32-fusjonsprotemdimeren ble renset ved gelfiltrermg under anvendelse av en "Superose" 12 søyle (Pharmacia, Sverige) med PBS som elueringsmiddel
Det totale utbytte av korrekt foldet DB32 fusjonsprotein fra denne prosess var 4 mg per liter
En analyse ved hjelp av ikke-reduserende SDS-PAGE fra forskjellige stadier av rensingen er vist i fig 26
Det MGSHHHHHHGSIEGR (SEQ ID nr 48) N-terminale fusjonspeptid ble spaltet av DB32-protemet ved spalting med restriksjonsproteasen FXa (molart forhold 1 5 FXa DB32 fusjonsprotein) ved 37°C i 20 timer Dette ble vist som tilsynekomsten av et bånd med lavere molekylvekt umiddelbart under det uspaltede fusjonsprotein i fig 26
Det refoldete DB32-protem ble analysert av
Cambridge Antibody Technology Ltd (CAT) Det viste seg at DB32 ble bundet spesifikt til TNF-ce og konkurrerte med det hele antistoff Mab32 når det gjaldt binding til TNF-a Nar det gjaldt binding til TNF-a konkurrerte dessuten både DB32 og Mab32 med anti-301 antiserum fra sau, hvorved dette serum ble dyrket ved å immunisere sau med et peptid som kodet for de første 18 aminosyrer i humant TNF-a og som omfatter minst en del av epitopen som gjenkjennes av det munne Mab32
EKSEMPEL 11
Fremstilling og refolding av humant psoriasin i E coli
Psoriasin er et Ca<2+> bindende protein som har ett eneste domene og som omfatter 100 ammosyrerester {11,5 kDa) Psoriasin inneholder én eneste disulfidbro Proteinet, som antas å være et medlem av S100 protein-familien, er sterkt oppregulert i psoriatisk hud og i primære, humane keratmocytter som gjennomgår unormal differensiering
Plasmidet pT7H6FX-PS 4 (vennlig levert av Dr. P Madsen, Institute for medisinsk biokjemi, Århus Universitet, Danmark) er tidligere beskrevet av Hoffman et al , (1994) Nukleotidsekvensen som koder for psoriasis-proteinet fra Ser2 til Gl<n>101 er i 5'-enden bundet til nukleotidsekvensen som koder for aminosyresekvensen MGSHHHHHHGSIEGR (SEQ ID nr 48) Et kart av pT7HgFX-PS 4 er gitt i fig 24, og aminosyresekvensen til humant psoriasin er angitt i fig 25 (i SEQ ID nr 58 er det aminosyresekvensen som kodes av leserammen med full lengde vist)
Rekombinant, humant psoriasin ble dyrket og uttrykt fra plasmidet pT7H6FA-PS 4 i E coli BL21 celler og totalt, cellulært protein ekstrahert slik som beskrevet {Hoffmann et al , 1994) Totalt protein utfelt med etanol ble løst i en buffer som inneholdt 6 M guanidmklorid, 50 mM Tris-HCl pH 8 og 50 mM ditioerytriol Etter gelfiltrering på "Sephadex" G-25 {Pharmacia, LKB, Sverige) mn i 8 M urea, 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 og 5 mM 2-merkaptoetanol ble råproteinpreparatet tilført til en Ni <2+->aktivert NTA-agarosesøyle (Ni<2+>NTA-agarose) for rensing {Hochuli et al , 1988) av fusjonsproteinet, MGSHHHHHHGSIEGR-psoriasin (hvor MGSHHHHHHGSIEGR er SEQ ID nr 48) og deretter gjennomgå den sykliske foldmgsprosess
Fremstilling og "satsing" av Ni^<+>NTA-agarosesøylen er beskrevet i eksempel 1
Alle buffere som ble fremstilt for væskekromatografi ble avgasset i vakuum før tilsetning av reduksjonsmiddel og/eller anvendelse
Etter anbringelse av råprotemekstrakten på Ni^<+>NTA-agarosesøylen ble fusjonsproteinet, MGSHHHHHHGSIEGR-psoriasin (hvor MGSHHHHHHGSIEGR er SEQ ID nr 48) renset fra størstedelen av coli- og A-fagproteinene ved vasking med ett søylevolum av bufferen etterfulgt av 6 M guanidmklorid, 50 mM Tris-HCl og 5 mM 2-merkaptoetanol inntil eluatets optiske densitet (OD) ved 280 nm var stabil
Fusjonsproteinet ble refoldet på Ni<2+>NTA-agarose-søylen under anvendelse av en gradientprofil slik som beskrevet i tabell 4 og 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM CaCl2 og 1,0 mM/0,1 mM redusert/oksidert glutation som buffer A og 8 M urea, 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM CaCl2 og 5 mM redusert glutation som buffer B Den reduserte/oksiderte glutationløsning var nylig fremstilt som en 200 gangers forrådsløsning ved tilsetning av 9,9 M H202 til en omrørt løsning av 0,2 M redusert glutation før tilsetning til buffer A
Etter fullføring av den sykliske foldingsprosess ble psoriasmfusjonsproteinet eluert fra Ni<2+>NTA-agarosesøylen med en buffer som inneholdt 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl og 10 mM EDTA pH 8 Fusjonsproteinet som var aggregert og utfelt på Ni<2+>NTA-agarosesøylen ble eluert i buffer B
Ca 95% av fusjonsproteinet ble eluert ved hjelp av den ikke-denaturerende eluermgsbuffer Slik som bedømt ved ikke-reduserende SDS-PAGE-analyse viste 75% av det løselige fusjonsprotemmateriale seg å være monomert, noe som ga en total effektivitet av foldingsprosessen på ca 70% Effektiviteten av den tidligere beskrevne refoldmgs-prosess for fremstilling av rekombinant, human psoriasin (Hoffmann et al , 1994) ble estimert til å være mindre enn 25%
Psoriasmfusjonsproteinet ble spaltet med FXa i et molart forhold på 100 1 i 48 timer ved romtemperatur Etter gelflltrering mn i en buffer som inneholdt 20 mM Na-acetat pH 5 og 20 mM NaCl på "Sephadex" G-25 ble proteinprøven anbrakt på en "S-Sepharose" lonebyttersøyle (Pharmacia) Monomer, rekombinant psoriasin ble eluert via 5 sølyevolumer med en lineær gradient på fra 20 mM Na-acetat pH 5, 20 mM NaCl til 0,5 M NaCl Monomer psoriasin ble eluert ved 150 mM NaCl Dimer og høyere multimerer av psoriasin sammen med uspaltet fusjonsprotein ble eluert senere i gradienten Fraksjoner som inneholdt det spaltede, rensede rekombinante protein ble gelfiltrert på "Sephadex" G-25 inn i en buffer som inneholdt 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,4 og lagret ved 4°C
EKSEMPEL 12
Evalueringsprosess for egnethetstesting av tiolforbind-elser for anvendelse som reduksjonsmidler i syklisk refolding, samt bestemmelse av optimale nivåer av denaturer-ingsmidler og disulfidomdanningsmidler for optimalisering av sykliske refoldingsprosesser
For å bedre utbyttet av korrekt foldet protein som er oppnåelig fra syklisk refolding bør antallet produktive sykluser maksimaliseres (Se oppsummering av oppfinnelsen) Produktive sykluser kjennetegnes ved denatureringstrinn hvor feilfoldet protein, på vei til død-endete aggregat-konformasjonstilstander, berges i ufoldete konformasjonstilstander mens det meste av allerede korrekt foldet protein blir værende i konformasjonstilstander som er i stand til å sprette tilbake til den refoldete tilstand i syklusens refoldingstrinn
Det er kjent at et antall disulfldbroholdige protiener, såsom ^-mikroglobulin, refoldes med høy effektivitet (over 95%) når de utsettes for høye nivåer av denaturerende midler så lengde deres disulfldbroer blir værende intakte
I dette eksempel beskrives hvordan man kan evaluere egnetheten til en tiolforbmdelse for anvendelse i syklisk refolding på basis av dens evne til å sjeldne korrekte fra ukorrekte disulfldbroer og hvordan man kan optimalisere nivåer av denaturerende middel og/eller reduksjonsmiddel for anvendelse i denatureringstrinnene for å maksimalisere antallet produktive sykluser Som modellsystem ble det valgt en blanding av mono-, di- og multimere former av renset, rekombinant, humant ^-mikroglobulin Det spesifikke mål var å analysere stabiliteten til forskjellige topologiske former av humant P2_rriikroglobulin mot reduksjon med 5 forskjellige reduksjonsmidler i forskjellige konsentrasjoner av denaturerende middel
Humant l^-niikroglobulin (fremstilt slik som beskrevet i eksempel 13) i 6 M guanidmklorid, 50 mM Tris-HCl og 10 mM 2-merkaptoetanol pH 8 ble gelfiltrert mn i ikke-denaturerende buffer (50 mM Tris-HCl, 0,5 NaCl pH 8) Bare en fraksjon av proteinet i prøven var løselig i den ikke-denaturerende buffer Etter 48 timers eksponering for luft var protemløsningen uklar Ikke-reduserende SDS-PAGE-analyse viste at det meste av proteinet var blitt oksidert til multimere former og at bare en liten fraksjon var oksidert og monomert (fig 27, felt 1)
Protemløsningen ble oppdelt i prøver i et antall rør, og varierende mengder urea ble tilsatt mens konsentrasjonen av protein og salt ble holdt på et konstant nivå
Reduksjonsmiddel, enten glutation, cystemetylester, N-acetyl-L-cystein, merkaptoravsyre eller 2-merkaptoetanol ble tilsatt til helet av proteinprøver med varierende ureakonsentrasjoner. Hvert reduksjonsmiddel ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 4 mM Proteinprøvene ble inkubert ved romtemperatur i 10 minutter, og deretter ble frie tiolgrupper blokkert ved tilsetning av jodeddiksyre til en sluttkonsentrasjon på 12 mM Til slutt ble protein-prøvene analysert ved hjelp av ikke-reduserende SDS-PAGE {fig 27-32) Sammensetningene til testprøvene som ble anvendt i den ikke-reduserende SDS-PAGE og resultatene er angitt nedenfor i de etterfølgende tabeller I rekkene som angir det valgte reduksjonsmiddels evne til å redusere di-sulfidbroer angir markeringen "+++" god evne, "++" angir middels evne, "+" angir dårlig evne, mens ingen markering angir at det ikke kunne iakttas noen målbar effekt
De forskjellige topologiske former av f^-m kan adskilles ved hjelp av'ikke-reduserende SDS-PAGE gel-elektroforese Det hurtigst migrerende bånd representerer den oksiderte, monomere form Dette bånd følges umiddelbart av det reduserte (^-m med en litt langsommere migrer-mgshastighet, mens de multimere former av proteinet migrerer mye langsommere i gelen
I denne analyse prøves evnen til hvert av de fem testede reduksjonsmidler til å redusere disulfldbroene i multimere former av l^-mikroglobulm uten vesentlig reduksjon av de korrekt formete disulfldbroer i den monomere, oksiderte form
Resultatene av analysene (fig 27-32) er sammenfatnmgsvis som følger N-acetyl-L-cystem og merkaptoravsyre er under de benyttede betingelser i det vesentlige ute av stand til å sjeldne mellom korrekte og ukorrekte disulfldbroer Glutation, cystemetylester og 2-merkaptoetanol er alle i stand til, i løpet av 10 minutter og i individuelle, karakteristiske ureakonsen-trasjonsområder, å vesentlig redusere disulfldbroer i multimere former mens det meste av det oksiderte monomere $ 2~ m ble værende i den oksiderte form Glutation har klart evnen til å redusere selektivt ukorrekte disulfldbroer i høyere konsentrasjoner av urea sammenlignet med cystemetylester og 2-merkaptoetanol, og derfor ville glutation blant valget av tioler som ble testet være det reduksjonsmiddel som vil bli valgt for syklisk refolding av humant 2-mikroglobulm Som en følge av disse forsøk ble konsentrasjonen av urea i den reduserte buffer B for refoldmgsprosessen som ble benyttet i eksempel 13 senket fra 8 M (eksempel 1) til 6 M, noe som førte til en bedring av totalt refoldingsutbytte av humant ^-mikroglobulin fra 53% til 87%
EKSEMPEL 13
Refolding av renset, humant {^-mikroglobulin Sammen-lignende analyse av tre refoldingsprosesser
Følgende sett forsøk ble foretatt for å oppnå sammenlignbare kvantitative data for å evaluere viktig-heten av syklisering på refoldingsutbytte i forhold til enkle refoldingsprosesser som omfatter en trinnvis eller gradvis entrinns overgang fra sterkt denaturerende og reduserende betingelser til ikke-denaturerende og ikke-reduserende betingelser
Renset, refoldet, rekombinant humant (32-mikro-globulinfusjonsprotem, oppnådd slik som beskrevet i eksempel 1, ble redusert og denaturert for å oppnå ut-gangsmaterialer uten forurensninger, såsom proteolytiske nedbrytningsprodukter eller mindre fraksjoner av fusjonsprotein som var skadet ved irreversibel oksidasjon eller annen kjemisk derivatisering
I et første trinn ble optimalisenngsprosessen som er beskrevet i eksempel 12 benyttet til å modifisere betingelsene for syklisk refolding som er beskrevet i eksempel 1 for å øke antallet produktive sykluser Den optimaliserte refoldingsprotokoll var identisk med den som er beskrevet i eksempel 1, og det var også bufferne og andre forøksparametre, med unntagelse av at bufferen B i de foreliggende forsøk var 6 M urea, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0,5 M NaCl og 4 mM glutation.
Tre satser av rent fusjonsprotein ble refoldet mens de var festet til Ni<++->belastet NTA-agarose slik som beskrevet i eksempel 1 under anvendelse av den foreliggende sammensetning av buffer B En sats ble utsatt for buffer-syklisering slik som beskrevet i eksempel 1 For sats to og tre ble syklisering erstattet av en monoton, lineær buffergradient (100% B til 10% B i løpet av 24 timer) og en trinnvis gradient (100% til 0% B i ett trinn etterfulgt av 0% buffer B i 24 timer) I hvert refoldingsforsøk ble alt polypeptidmaterialet utvunnet slik som beskrevet i eksempel 1 som en løselig fraksjon som var eluerbar under ikke-denaturerende betingelser, og en gjenværende, uløse-lig fraksjon som var eluerbar bare under denaturerende og reduserende betingelser Utbyttene av korrekt foldet fusjonsprotein ble målt ved kvantitativ densimetrisk analyse (optisk scanner HW og GS-370 Densiometric Analysis SW pakke fra Hoeffer Scientific, CA, USA) av Coomassie-flekkede SDS-PAGE-geler hvorpå passende tynnede, oppmålte prøver av løselige og uløselige fraksjoner var blitt adskilt under reduserende og ikke-reduserende betingelser, slik som det var nødvendig for å muliggjøre separering av monomer med korrekte disulfldbroer fra løselige polymerer i løselige fraksjoner Når det var nødvendig for å oppnå pålitelige densiometriske data både for intense og svake bånd i et gelfelt ble atskillige prøvefortynnmger skannet og analysert for å oppnå reskallerte datasett
Forsøksdetaljer og - resultater
Renset, denaturert og redusert fusjonsprotein
En sats av humant B2~mk2"oglobulinfusjonsprotein kle refoldet slik som beskrevet i eksempel 1 96% av fusjonsproteinet ble utvunnetii den løselige fraksjon (fig 32, felter 2-5) 56% av denne løselige fraksjon var i den monomere form med disulfldbroer Følgelig var den oppnådde, totale refoldingseffektivitet 53% Monomert fusjonsprotein ble renset fra multimerer ved lonebytter-kromatografi på "S-Sepharose" (Pharmacia, Sverige) Den løselige fraksjon som ble oppnådd etter refolding ble gelfiltrert på "Sephadex" G-25 (Pharmacia, Sverige) mn i en buffer som inneholdt 5 mM NaCl og 5 mM Tris-HCl pH 8, tynnet til det doble volum med vann og deretter tilført til "S-Sepharose"-søylen, som deretter ble eluert under anvendelse av en gradient (5 søylevolumer fra 2,5 mM Tris-HCl pH 8, 2,5 mM NaCl til 25 mM Tris-HCl pH 8, 100 mM NaCl) Det monomere, korrekt foldete fusjonsprotein som var renset til over 95% renhet (fig 32, felter 6 og 7) ble deretter gjort 6 M -i guanidinhydroklorid og 0,1 M i DTE, gelfiltrert mn i en buffer som inneholdt 8 M urea,
50 mM Tris-HCl pH 8, IM NaCl og 10 mM 2-merkaptoetanol og deretter delt i prøver for anvendelse som utgangsmateriale i de nedenfor beskrevne ref oldmgsf orsøk
Syklisk refolding av renset fusjonsprotein
En prøve av denaturert, redusert fusjonsprotein ble tilført til en Ni<++->belastet NTA-søyle som deretter ble vasket med ett søylevolum av en buffer som inneholdt 6 M guanidinhydroklorid, 50 mM Tris-HCl pH 8 og 10 mM 2-merkaptoetanol
Fusjonsproteinet ble deretter underkastet buffer-syklisering i overensstemmelse med det skjema som er vist i tabell 1 under anvendelse av buffer A 50 mM Tris-HCl pH 8, 0,5 M NaCl og 3,2 rtiM/0,4 mM redusert/oksidert glutation, og buffer B 50 mM Tris-HCl pH 8, 0,5 M NaCl, 6 M urea og 4 mM redusert glutation Etter fullføring av buffersykliseringen ble fusjonsproteinet utvunnet kvanti-tativt i en løselig form ved eluering av søylen med en buffer som inneholdt 50 mM Tris-HCl pH 8, 0,5 M NaCl og 20 mM EDTA 87% ble oppnådd i den korrekte, monomere form med disulfldbroer (fig 32, felter 8 og 9)
Refolding av renset fusjonsprotein ved hjelp av lineær gradient
En prøve av denaturert, redusert fusjonsprotein ble anbrakt på en Ni<++->belastet NTA-søyle som deretter ble vasket med ett søylevolum av en buffer som inneholdt 6 M guanidinhydroklorid, 50 mM Tris-HCl pH 8 og 10 mM 2-merkaptoetanol, etterfulgt av 1 søylevolum av en bufffer som inneholdt 50 mM Tris-HCl pH 8, 0,5 M NaCl, 6 M urea og 4 mM redusert glutation
En 24-timers lineær gradient fra 100% B til 100% A
ble deretter tilført med 2 ml per minutt under anvendelse av buffer A 50 mM Tris-HCl pH 8, 0,5 M NaCl og 3,2 mM/0,4 mM redusert/oksidert glutation og buffer B 50 mM Tris-HCl pH 8, 0,5 M NaCl, 6 M urea og 4 mM redusert glutation Etter fullføring av gradienten ble den løselige fraksjon
fusjonsprotein eluert i en buffer som inneholdt 50 mM Tris-HCl pH 8, 0,5 M NaCl og 20 mM EDTA Den gjenværende, uløselige fraksjon ble ekstrahert fra søylen i en buffer som inneholdt 50 mM Tris-HCl pH 8, IM NaCl, 8 M urea, 10 mM 2-merkaptoetanol og 20 mM EDTA
48% av fusjonsproteinet ble utvunnet i den løselige fraksjon, og 60% av den løselige fraksjon ble utvunnet i den korrekte monomere form med disulfldbroer Den totale effektivitet av den oppnådde folding var derfor 29% (fig 33, felter 5-7)
Refolding av renset fusjonsprotein ved buffertrinn
En prøve av denaturert, redusert fusjonsprotein ble anbrakt på en Ni<++->belastet NTA-søyle som deretter ble vasket med 1 søylevolum av buffer som inneholdt 6 M guanidinhydroklorid, 50 mM Tris-HCl pH 8 og 10 mM 2-merkaptoetanol
Buffer som inneholdt 50 mM Tris-HCl pH 8, 0,5 M NaCl og 3,2 mM/0,4 mM redusert/oksidert glutation ble deretter tilført til søylen ved 2 ml/min i 24 timer før utvinning av den løselige fraksjon av fusjonsprotein i en buffer som inneholdt 50 mM Tris-HCl pH 8, 0,5 M NaCl og 20 mM EDTA Den gjenværende, uløselige fraksjon ble ekstrahert fra søylen i en buffer som inneholdt 50 mM Tris-HCl pH 8, 1 M NaCl, 8 M urea, 10 mM 2-merkaptoetanol og 20 mM EDTA
34% av fusjonsproteinet ble utvunnet i den løselige fraksjon, og 28% av den løselige fraksjon ble utvunnet i den korrekte monomere form med disulfldbroer Den totale effektivitet av folding oppnådd var derfor 9,5% (fig 33, felter 1-3)
Konklusjoner>
Sammenfatningsvis kan det når humant j^-mikroglobulin anvendes som et modellprotein konkluderes at (a) direkte bufferoptimalisenng og bedret rensing av fusjonsprotein før syklisk refolding økte refoldmgsutbyttet vesentlig (fra 53% til 87%) og (b) progressiv denaturermgs-renaturermgssyklisermg er bedre enn entnnns refolding under ellers sammenlignbare forsøksbetingelser med en stor faktor (87% i forhold til 29% eller 9,5% utbytte)
REFERANSER
J H Christensen, P K Hansen, 0 Lillelund og H C Thøgersen, Sequence-specific binding of the N-termmal three-finger fragment of Xenopus transcription factor HIA to the mternal control region of a 5S RNA gene FEBS Letters, Vol 295, 1991, p 181-184
H Dalbøge, M H -H Dahl, J Pedersen, J W Hansen, og T Kristensen, A Novel Enzymatic Method for Production of Authentic hGH From an Eschericia coli Produced hGh-Precursor Bio/Technology, Vol 5, 1987, p 161-164
R V Datar, T Cartwright og C -G Rosen, Process Economics of Animal Cell and Bacterial Fermentations A Case Study Analysis of Tissue Plasmmogen Activator Bio/Technology, Vol 11, 1993, p 349-357
J Herz, U Hanmann, S Rogne, 0 Myklebost, H Gausepohl og K K Stanley, Surface location and high affmity for calcium of a 500 kd liver membrane protein closely related to the LDL-receptor suggest a physiological role as lipoprotem receptor EMBO J , Vol 7, 1988, p 4119-4127
H J Hoffmann, E Olsen, M Etzerodt, P Madsen, H C Thøgersen, T Kruse og J E Celis, Psoriasin Binds Calcium and Is Dif f erentially Regulated vJmh Respect to Other Members of the S100 Protein Family J Dermatol Invest, 1994 Under trykking
E Hochuli, W Bannwarth, H Dobeli, R Gentz og D Stuber, Genetic approach to facilitate purification of recombmant proteins with a novel metal chelate adsorbent Bio/Technology, Vol 6, 1988, p 1321-1325
P Holliger, T Prospero og G Wmter, "Diabodies" Small bivalent and bispecific antibody fragments Proe Nati Acad Sei USA, Vol 90, 1993, p 6444-6448
T Mamatis, E F Fritsch, og J Sambrook, Molecular clonmg Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N Y , 1982
K Nagai og H C Thøgersen, Synthesis and Sequence-Specific Proteolysis of Hybrid Proteins Produced in Escherichia coli, Methods in Enzymology, Vol 152, 1987,
p 461-481
K Nagai, Y Nakaseko, K Nasmyth og D Rhodes, Zinc-fmger motifs expressed in E coli and folded in vitro direct specific binding to DNA, Nature, Vol 332, 1988, p 284-286
A Nykjær, C M Petersen, B Møller, P H Jensen , S K Moestrup, T L Holtet, M Etzerodt, H C Thøgersen, M Munch, P A Andreasen og J Gliemann, Purified c<2-Macro-globulm Receptor/LDL Receptor-related Protein Binds Urokinase-Plasmmogen Activator Inhibitor Type-1 Coinplex J Biol Chem , Vol 267, 1992, p 14543-14546
D Rathjen et al , Mol Immunol , Vol 28, 1991, p 29
D Rathjen al , Brit J Cancer, Vol 65, 1992, p 852-856
R K Saiki, D H Gelfant, S Stoffel, S J Scharf, R Higuchi, G T Horn, K B Mullis og H A Erlich, Primer-directed enzymatic ampliflcation of DNA with a thermostable DNA polymerase Science, Vol 239, 1988, p 487-491
F W Studier og B A Moffat, Use of Bacteriophage T7 RNA Polymerase to Direct Selective High-level Expression of Cloned Genes, J Mol Biol , Vol 189, 1986, p 113-130
The Regents of the University of California Enterokinase-cleavable linker sequence, EP 035384

Claims (47)

1 Fremgangsmåte til generering av et bearbeidet hele av polypeptidmolekyler, hvor konformas}onstilstandene som er representert i det bearbeidede hele inneholder en vesentlig fraksjon polypeptidmolekyler i en spesiell foldet konformasjon, fra et opprinnelig hele av polypeptidmolekyler som har samme aminosyresekvens som det bearbeidede hele av polypeptidmolekyler, idet de konformasjonstilstander som er representert i det opprinnelige hele inneholder en vesentlig fraksjon polypeptidmolekyler i ufoldete eller feilfoldete konformasjoner, karakterisert ved at det opprinnelige hele av polypeptidmolekyler underkastes en serie på minst fem suksessive sykluser som hver omfatter en sekvens av 1) minst ett denatureringstrinn som omfatter betingelser som utøver en denaturerende og/eller utfoldende innvirkning på polypeptidmolekylene i helet slik at en fraksjon av polypeptidene i helet denatureres, etterfulgt av 2) minst ett renatureringstnnn som omfatter betingelser som har en renaturerende innvirkning på polypeptidmolekylene som har konformasjoner som er resultatet av det foregående trinn, slik at en fraksjon av de denaturerte og/eller ufoldete polypeptider i helet renatureres, idet serien av minst fem suksessive sykluser er tilpasset slik at det bearbeidede hele av polypeptidmolekyler har en høyere fraksjon av polypeptidmolekyler i den spesielle foldete konformasjon enn a) det opprinnelige hele, og b) et tilsvarende opprinnelig hele som har vært utsatt for bare en av syklusene
2 Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at den vesentlige fraksjon av polypeptidmolekyler i en spesiell foldet konformasjon i det bearbeidede hele utgjør minst 5 vekt% av det opprinnelige hele av polypeptidmolekyler
3 Fremgangsmåte i samsvar med krav 1 eller 2, karakterisert ved at polypeptidmolekylene i det bearbeidede hele omfatter cystemholdige molekyler, og at det bearbeidede hele omfatter en vesentlig fraksjon av polypeptidmolekyler i en spesiell foldet konformasjon som i tillegg har identisk disulfidbrotopologi
4 Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 1-3, karakterisert ved at polypeptidmolekylene er molekyler som har en aminosyresekvens som er identisk med et autentisk polypeptids aminosyresekvens, eller er molekyler som omfatter en aminosyresekvens som tilsvarer sekvensen til et autentisk polypeptid som er bundet til ett eller to ytterligere polypeptidsegmenter
5 Fremgangsmåte i samsvar med krav 4, karakterisert ved at aminosyresekvensen som tilsvarer et autentisk polypeptids sekvens er bundet til det eller de ytterligere polypeptidsegmenter via et spaltbart forbindelsespunkt eller lignende eller forskjellige, spaltbare forbmdelsespunkter
6 Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 1-5, karakterisert ved at serien omfatter minst 8 sykluser, såsom minst 10, og minst 25 sykluser, og høyst 2000 sykluser, såsom høyst 1000, høyst 500, høyst 200 sykluser, høyst 100 og høyst 50 sykluser
7 Fremgangsmåte i samsvar med et av de foregående krav, karakterisert ved at hvert denatureringstrinns varighet er minst 1 millisekund og høyst 1 time, og at varigheten av hvert renaturenngstrinn er minst 1 sekund og høyst 12 timer
8 Fremgangsmåte i samsvar med krav 7, karakterisert ved at denatureringsbetingelsene i hvert individuelt denatureringstrinn holdes konstant i et tidsrom, og at renatureringsbetingelsene i hvert individuelt renaturenngstrinn holdes konstant i et tidsrom, hvorved tidsrommene hvor betingelsene holdes konstant er adskilt av overgangsperioder hvor betingelsene forandres
9 Fremgangsmåte i samsvar med krav 8, karakterisert ved at overgangsperioden mellom trinnene hvor betingelsene holdes konstant har en varighet på mellom 0,1 sekund og 12 timer
10 Fremgangsmåte i samsvar med krav 9, karakterisert ved at tidsrommet hvor denaturer-ingstrinnets denaturenngsbetingelser holdes konstant har en varighet på mellom 1 og 10 minutter, og at tidsrommet hvor renaturermgstrmnets renatureringsbetingelser holdes konstant har en varighet på mellom 1 og 45 minutter.
11. Fremgangsmåte i samsvar med et av de foregående krav, karakterisert ved at polypeptidmolekylene er i kontakt med en væskefase under denaturerings- og renatureringstrmnene, hvorved væskefasen er en vandig fase eller en organisk fase
12 Fremgangsmåte i samsvar med krav 11, karakterisert ved at polypeptidene anordnes i et miljø som muliggjør forandring eller utskifting av væskefasen uten at polypeptidene trekkes med
13 Fremgangsmåte i samsvar med krav 12, karakterisert ved at polypeptidene er anordnet i et dialyseapparat eller et tofaset væskesystem
14 Fremgangsmåte i samsvar med krav 12, karakterisert ved at polypeptidmolekylene bindes til en fast eller halvfast bærer, såsom en fllteroverflate, en hulfiber eller et perleformet, kromatografisk medium, f eks en agarose- eller polyakrylamidgel, en fibrøs cellulose-matriks, en HPLC- eller FPLC-matriks, en substans som har molekyler av en slik størrelse at molekylene sammen med polypeptidmolekylene som er bundet til dem, når de er løst eller dispergert i en væskefase, kan holdes tilbake ved hjelp av et filter, en substans som er i stand til å danne miceller eller delta i dannelsen av miceller, noe som muliggjør forandring eller utskifting av væskefasen uten å trekke med micellene, eller en vannløselig polymer.
15 Fremgangsmåte i samsvar med krav 14, karakterisert ved at polypeptidmolekylene er lkke-kovalent adsorbert til bæreren gjennom en enhet som har affinitet til en bestanddel i bæreren, såsom en biotin-gruppe eller en analog derav bundet til en aminosyreenhet i polypeptidet, idet det til bæreren er bundet avidm, streptavidm eller analoger derav
16 Fremgangsmåte i samsvar med krav 15, karakterisert ved at enheten har en aminosyresekvens som er identisk med SEQ ID nr 47, og at bæreren omfatter et nitrilotrieddiksyrederivat (NTA) ladet med Ni<+ ><+->ioner
17 Fremgangsmåte i samsvar med et av de foregående krav, karakterisert ved at polypeptidmolekylene omfatter et polypeptidsegment som er i stand til å dirigere foretrukket spalting ved hjelp av et spaltingsmiddel i en spesifikk peptidbinding
18 Fremgangsmåte i samsvar med krav 17, karakterisert ved at det spaltingsdirigerende polypeptidsegment er et som er i stand til å dirigere foretrukket spalting i en spesifikk peptidbinding ved hjelp av et spaltingsmiddel valgt blant cyanogenbromid, hydroksylamm, jodosobenzosyre, N-bromsuccinimid, samt enzymer, såsom bovin koaguleringsfaktor Xa eller en analog og/eller homolog derav og bovin enterokinase eller en analog og/eller homolog derav
19 Fremgangsmåte i samsvar med krav 17 eller 18, karakterisert ved at polypeptidsegmentet som dirigerer foretrukket spalting er en sekvens som gjenkjennes selektivt av den bovine koaguleringsfaktor Xa eller en analog og/eller homolog derav, såsom et polypeptidsegment som har en aminosyresekvens valgt blant SEQ ID nr 38, SEQ ID nr 40, SEQ ID nr 41 og SEQ ID nr 42
20 Fremgangsmåte i samsvar med et av de foregående krav, karakterisert ved at polypeptidmolekylene omfatter et polypeptidsegment som er omdannbart m vitro til et derivatisert polypeptidsegment som er i stand til å dirigere foretrukket spalting i en spesifikk peptidbinding ved hjelp av et spaltingsmiddel
21 Fremgangsmåte i samsvar med krav 20, karakterisert ved at polypeptidsegmentet som er omdannbart in vitro er omdannbart til et derivatisert polypeptidsegment som gjenkjennes selektivt av den bovine koaguleringsfaktor Xa eller en analog og/eller homolog derav
22. Fremgangsmåte i samsvar med krav 21, karakterisert ved at polypeptidsegmentet som kan omdannes in vitro har en aminosyresekvens valgt blant SEQ ID nr 43, SEQ ID nr 44, SEQ ID nr 45 og SEQ ID nr 46
23 Fremgangsmåte i samsvar med krav 22, karakterisert ved at poylpeptidmolekylet omfatter et polypeptidsegment med enten aminosyresekvensen SEQ ID nr 43 eller SEQ ID nr 44, som omdannes til et derivatisert polypeptid som gjenkjennes selektivt av bovin koaguleringsfaktor Xa eller en analog og/eller homolog derav ved omsetning av cysteinresten med N-(2-merkaptoetyl)morfolyl-2-tiopyridyldisulfid eller merkaptotioacetat-2-tiopyridyldisulfid, eller aminosyresekvensen SEQ ID nr 45 eller SEQ ID nr 4 6 som omdannes til et derivatisert polypeptid som selektivt gjenkjennes av bovin koaguleringsfaktor Xa, ved oksidasjon av tioeterenheten i metionmsidegruppen til et sulfoksid- eller sulfonderivat
24 Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 19-22 eller 23, karakterisert ved at polypeptidsegmentet som er valgt blant SEQ ID nr 38, SEQ ID nr 40, SEQ ID nr • 41 og SEQ ID nr 42 eller valgt blant SEQ ID nr 43, SEQ ID nr 44, SEQ ID nr 45 og SEQ ID nr 4 6 er bundet N-terminalt til det autentiske polypeptid
25 Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 8-24, karakterisert ved at forandringen av betingelsene i løpet av overgangsperioden utføres ved forandring av den kjemiske sammensetning av væskefasen som polypeptidmolekylene er i kontakt med
26 Fremgangsmåte i samsvar med krav 25, karakterisert ved at denaturering av polypeptidmolekylene utføres ved å bringe polypeptidmolekylene i kontakt med en væskefase hvor mmst en denaturerende forbindelse er løst, og at renaturering av polypeptidmolekylene utføres ved å bringe polypeptidmolekylene i kontakt med en væskefase som enten inneholder minst en løst, denaturerende forbindelse i en slik konsentrasjon at kontakten med væskefasen vil være tilbøyelig til å renaturere eller denaturere helheten av polypeptidmolekyler i deres respektive konformasjonstilstander som er resultatet av det foregående trinn, eller ikke inneholder noen denaturerende forbindelse
27 Fremgangsmåte i samsvar med krav 26, karakterisert ved at denatureringen av polypeptidmolekylene oppnås eller økes ved senking eller øking av væskefasens pH
28 Fremgangsmåte i samsvar med krav 26 eller 27, karakterisert ved at den denaturerende forbindelse er valgt blant urea, guanidin-HCl og di-C]__g-alkylformamid, såsom dimetylformamid, samt di-C^.g-alkyl-sulfon
29 Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 11-28, karakterisert ved at væskefasen som anvendes i mmst ett av denaturerm<g>strinnene inneholder minst ett disulfidomdanningssystem
30 Fremgangsmåte i samsvar med krav 29, karakterisert ved at disulf ldomdannmgssystemet er et system som er i stand til å fortrinnsvis redusere og/ eller omdanne ukorrekt formede disulfldbroer til ufoldete og/eller feilfoldete polypeptidmolekyler under betingelser når det gjelder det denaturerende middels konsentrasjon hvor ufoldete og/eller feilfoldete proteiner denatureres
31 Fremgangsmåte i samsvar med krav 30, karakterisert ved at nærværet av disulfldomdan-ningssystemet i mmst ett trinn resulterer i et forhold mellom den relative mengde av redusert/omdannet, opprinnelig ukorrekt formede disulfldbroer og den relative mengde av reduserte/omdannede, opprinnelig korrekt formede disulf ldbroer på mmst 1,05
32 Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 29-31, karakterisert ved at disulfldomdan-ningssystemet inneholder glutation, 2-merkaptoetanol eller tiocholin, hvorav hver er i blanding med dets/dens tilsvarende symmetriske disulfid
33 Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 11-32, karakterisert ved at alle cystemrester i polypeptidmolekylene er omdannet til blandete disulfid-produkter av enten glutation, tiocholm, merkaptoetanol eller merkaptoeddiksyre i løpet av minst én av denaturermgs-/renatureringssyklusene
34 Fremgangsmåte i samsvar med krav 33, karakterisert ved at omdanningen av cysteinrestene til blandete disulfldprodukter utføres ved omsetning av det fullstendig denaturerte og fullstendig reduserte hele av polypeptidmolekyler med et overskudd av en reaktant som er en høyenergisk, blandet disulf idf orbmdelse
35 Fremgangsmåte i samsvar med krav 34, karak-ter' isert ved at den høyenergiske, blandete disulf idf orbmdelse er alaf atisk-aromatisk
36 Fremgangsmåte i samsvar med krav 34 eller 35, karakterisert ved at den høyenergiske, blandete disulfidforbindelsen har den generelle formel hvor R]_ er 2-pyridyl, R2, R3 og R4 er hydrogen eller en, eventuelt substituert, lavere aromatisk eller alifatisk hydrokarbongruppe
37 Fremgangsmåte 1 samsvar med et av kravene 34-36, karakterisert ved at den høyenergiske, blandete disulfidforbmdelse er valgt blant glutationyl-2-tiopyridyldisulfid, 2-tiocholyl-2-tiopyridyldisulfid, 2-merkaptoetanol-2-tiopyridyldisulfid og merkaptoacetat-2-tiopyridyldisulfid
38 Fremgangsmåte 1 samsvar med et av kravene 11-37, karakterisert ved at polariteten til væskefasen som ble anvendt ved renaturermgen av polypeptidmolekylene er blitt modifisert ved tilsetning av et salt, en polymer og/eller en hydrofluorforbmdelse, såsom trifluoretanol
39 Fremgangsmåte 1 samsvar med et av kravene 1-24 eller 29-38, karakterisert ved at denatureringen og renaturermgen av polypeptidmolekylene utføres ved direkte forandringer av fysikalske parametre som polypeptidmolekylene utsettes for, såsom temperatur eller trykk, eller ved forandringer av fysikalske parametre som øker eller modererer denaturerings- og renatureringsbetingelsene, såsom temperatur eller trykk
40 Fremgangsmåte 1 samsvar med krav 25, karakterisert ved at de kjemiske forandringer av væskefasen utføres ved skifting mellom en denaturerende løsning B og en renaturerende løsning A
41 Fremgangsmåte 1 samsvar med krav 40, karakterisert ved at konsentrasjonen av en eller flere denaturerende forbindelser B justeres etter hver syklus
42 Fremgangsmåte i samsvar med krav 41, karakterisert ved at konsentrasjonen av én eller flere denaturerende forbindelser i B senkes etter hver syklus
4 3 Fremgangsmåte i samsvar med krav 40, karakterisert ved at konsentrasjonen av en eller flere denaturerende forbindelser i medium B holdes konstant i hver syklus
44 Fremgangsmåte i samsvar med et av de foregående krav, karakterisert ved at polypeptidmolekylene i helet har en lengde på minst 25 ammosyrerester og høyst 5000 ammosyrerester
45 Fremgangsmåte i samsvar med et av de foregående krav, karakterisert ved at polypeptidene i det opprinnelige hele er kunstige polypeptider fremstilt i prokaryotiske celler ved hjelp av rekombinant DNA-teknikk
4 6 Fremgangsmåte i samsvar med krav 45, karakterisert ved at den opprinnelige prøve av polypeptidmolekylene er ufoldete eller feilfoldete diastof fmolekyler (kunstige bispesifikke eller bivalente antistoffragmenter) eller monomere fragmenter av diastoffmolekyler
47 Fremgangsmåte til fremstilling av korrekt foldete diastoffmolekyler, karakterisert ved at et opprinnelig hele av polypeptidmolekyler som omfatter ufoldete og/eller feilfoldete polypeptider som har ammosyresekvenser som er identisk med monomere fragmenter av diastof fmolekyler underkastes en serie på mmst to suksessive sykluser som hver omfatter en sekvens av 1) minst ett denatureringstrinn som omfatter betingelser som utøver en denaturerende og/eller utfoldende innvirkning på polypeptidmolekylene i helet slik at en fraksjon av polypeptidene i helet denatureres, etterfulgt av 2) minst ett renaturenngstrinn som omfatter betingelser som har en renaturerende innvirkning på polypeptidmolekylene som har konformasjoner som er resultatet av det foregående trinn, slik at en fraksjon av de denaturerte og/eller ufoldete polypeptider i helet renatureres, idet en serie sykluser er slik tilpasset at en vesentlig fraksjon av det opprinnelige hele av polypeptidmolekyler omdannes til fraksjon av korrekt foldete diastof fmolekyler
4 8 Fremgangsmåte i samsvar med krav 47, karakterisert ved at polypeptidmolekylene er i kontakt med en væskefase som inneholder minst ett disulf idomdanningssystem i minst en denaturerings-/renatu-reringssyklus
NO19952989A 1993-02-04 1995-07-28 Fremgangsmate til refolding av proteiner NO316274B1 (no)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK13093A DK13093D0 (da) 1993-02-04 1993-02-04 Processing of proteins
DK13993A DK13993D0 (da) 1993-02-05 1993-02-05 Processing of proteins
PCT/GB1993/002492 WO1994013804A1 (en) 1992-12-04 1993-12-03 Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
PCT/DK1994/000054 WO1994018227A2 (en) 1993-02-04 1994-02-04 Improved method for the refolding of proteins

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO952989D0 NO952989D0 (no) 1995-07-28
NO952989L NO952989L (no) 1995-10-03
NO316274B1 true NO316274B1 (no) 2004-01-05

Family

ID=26063372

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO19952989A NO316274B1 (no) 1993-02-04 1995-07-28 Fremgangsmate til refolding av proteiner

Country Status (14)

Country Link
US (2) US5739281A (no)
EP (1) EP0686162B1 (no)
JP (1) JP3695467B2 (no)
KR (1) KR100310739B1 (no)
AT (1) ATE241642T1 (no)
AU (1) AU674568B2 (no)
CA (1) CA2155335C (no)
DE (1) DE69432744T2 (no)
DK (1) DK0686162T3 (no)
ES (1) ES2199959T3 (no)
FI (1) FI113272B (no)
NO (1) NO316274B1 (no)
NZ (1) NZ261571A (no)
WO (1) WO1994018227A2 (no)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100310739B1 (ko) * 1993-02-04 2002-05-30 알란 스코브 단백질재생을위한개선된방법
JPH11508134A (ja) * 1995-06-22 1999-07-21 イーライ・リリー・アンド・カンパニー 肥満症蛋白質中間体およびその製法と使用
US7368111B2 (en) 1995-10-06 2008-05-06 Cambridge Antibody Technology Limited Human antibodies specific for TGFβ2
WO1997017438A1 (fr) * 1995-11-07 1997-05-15 Toshio Tanaka Procede de clonage par expression d'un gene codant une proteine liee a un ligand
CA2257118C (en) * 1996-06-11 2002-12-10 Boehringer Mannheim Gmbh Recombinant blood-coagulation proteases
CA2304254C (en) 1997-06-11 2012-05-22 Hans Christian Thogersen Trimerising module
US20030207402A1 (en) * 1997-08-22 2003-11-06 Erhard Kopetzki Autocatalytically activatable zymogenic precursors of proteases and their use
US6492497B1 (en) 1999-04-30 2002-12-10 Cambridge Antibody Technology Limited Specific binding members for TGFbeta1
AU5358901A (en) * 2000-04-17 2001-10-30 Dyax Corp Novel methods of constructing libraries of genetic packages that collectively display the members of a diverse family of peptides, polypeptides or proteins
US8288322B2 (en) 2000-04-17 2012-10-16 Dyax Corp. Methods of constructing libraries comprising displayed and/or expressed members of a diverse family of peptides, polypeptides or proteins and the novel libraries
EP1303532A2 (en) * 2000-07-12 2003-04-23 Eli Lilly And Company Process to increase protein stability
AU2001296303A1 (en) * 2000-09-22 2002-04-02 Ramot At Tel Aviv University Ltd. A soluble beta 2 microglobulin (beta2m)/hfe monochain for biotechnological and therapeutic applications
CN1268641C (zh) 2000-11-10 2006-08-09 普罗蒂奥制药公司 载脂蛋白类似物
US20040132094A1 (en) 2000-12-13 2004-07-08 Michael Etzerodt Combinatorial libraries of proteins having the scaffold structure of c-type lectinlike domains
NZ526312A (en) * 2000-12-13 2004-11-26 Borean Pharma As Combinatorial libraries of proteins having the scaffold structure of C-type lectin-like domains
ES2430857T3 (es) 2000-12-18 2013-11-22 Dyax Corp. Bibliotecas focalizadas de paquetes genéticos
US20060252917A1 (en) * 2001-02-08 2006-11-09 University Of Utah Methods for refolding conformationally constrained peptides
DE10105912A1 (de) * 2001-02-09 2002-08-14 Roche Diagnostics Gmbh Rekombinante Proteinase K
EP1572091A4 (en) * 2002-07-09 2008-03-05 Genentech Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR DIAGNOSING AND TREATING TUMORS
EP1382614A1 (en) * 2002-07-15 2004-01-21 Bayer HealthCare AG Process for the purification of interleukin-4 and its muteins
US20040067532A1 (en) * 2002-08-12 2004-04-08 Genetastix Corporation High throughput generation and affinity maturation of humanized antibody
US20040072262A1 (en) * 2002-10-11 2004-04-15 Montero-Julian Felix A. Methods and systems for detecting MHC class I binding peptides
AU2003277828B2 (en) 2002-10-29 2009-06-04 Anaphore, Inc. Trimeric binding proteins for trimeric cytokines
US20070009886A1 (en) * 2002-11-12 2007-01-11 Incyte Corporation Carbohydrate-associated proteins
EP1618135B1 (en) 2003-04-23 2013-06-26 F.Hoffmann-La Roche Ag Cleavage of fusion proteins using granzyme b protease
US20100028995A1 (en) * 2004-02-23 2010-02-04 Anaphore, Inc. Tetranectin Trimerizing Polypeptides
EP1745068A4 (en) * 2004-03-30 2009-11-04 Sudershan Biotech Ltd RECOMBINANT CALM CHYMOSIN AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME
EP1805205A1 (en) * 2004-10-22 2007-07-11 Amgen Inc. Methods for refolding polypeptides
CA2646329C (en) * 2006-03-20 2018-07-03 The Regents Of The University Of California Engineered anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting
EP1845103B1 (en) * 2006-04-10 2015-02-25 Boehringer Ingelheim RCV GmbH & Co KG Method for refolding a protein
EP2197491A4 (en) 2007-09-04 2011-01-12 Univ California HIGHAFFINE ANTI-PROSTATE STEM CELL ANTIGEN (PSCA) ANTIBODIES TO CANCER AND TO THE DETECTION OF CANCER
US8877688B2 (en) 2007-09-14 2014-11-04 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
BRPI0816785A2 (pt) 2007-09-14 2017-05-02 Adimab Inc bibliotecas de anticorpos sintéticos racionalmente desenhadas, e, usos para as mesmas
US8324151B2 (en) * 2007-11-20 2012-12-04 The Feinstein Institute For Medical Research Treatment of sepsis and septic shock using ghrelin and growth hormone
US9873957B2 (en) * 2008-03-13 2018-01-23 Dyax Corp. Libraries of genetic packages comprising novel HC CDR3 designs
WO2009132287A2 (en) 2008-04-24 2009-10-29 Dyax Corp. Libraries of genetic packages comprising novel hc cdr1, cdr2, and cdr3 and novel lc cdr1, cdr2, and cdr3 designs
US10865233B2 (en) * 2008-12-18 2020-12-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. NKG2D-fc for immunotherapy
AU2010291902A1 (en) * 2009-09-14 2012-04-05 Dyax Corp. Libraries of genetic packages comprising novel HC CDR3 designs
EP2499255A4 (en) * 2009-11-09 2013-06-19 Univ Colorado Regents EFFECTIVE PRODUCTION OF PEPTIDES
MX360336B (es) 2010-07-16 2018-10-30 Adimab Llc Star Colecciones de anticuerpos.
EP2420253A1 (en) 2010-08-20 2012-02-22 Leadartis, S.L. Engineering multifunctional and multivalent molecules with collagen XV trimerization domain
EP2441776A1 (en) 2010-10-15 2012-04-18 Leadartis, S.L. Generation of multifunctional and multivalent polypeptide complexes with collagen XVIII trimerization domain
ES2701445T3 (es) 2010-10-15 2019-02-22 Leadartis S L Generación de complejos polipeptídicos multifuncionales y multivalentes mediante el dominio de trimerización del colágeno XVIII
BR112016030740A2 (pt) 2014-07-01 2018-02-20 Pfizer Inc. diacorpos heterodiméricos biespecíficos e seus usos
AU2016353231B2 (en) 2015-11-13 2020-08-13 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. An NKG2D-Ig fusion protein for cancer immunotherapy
WO2019234187A1 (en) 2018-06-06 2019-12-12 Leadartis, S.L. Trimeric polypeptide complexes and uses thereof
CN117677634A (zh) 2021-03-05 2024-03-08 利达提斯有限公司 三聚体多肽及其在治疗癌症中的用途

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1200773A (en) * 1980-02-29 1986-02-18 William J. Rutter Expression linkers
US4444878A (en) * 1981-12-21 1984-04-24 Boston Biomedical Research Institute, Inc. Bispecific antibody determinants
JPH06102034B2 (ja) * 1983-03-25 1994-12-14 セルテク リミテツド タンパク質の生産方法
GB8412517D0 (en) * 1984-05-16 1984-06-20 Nagai K Recombinant fusion proteins
GB8508340D0 (en) * 1985-03-29 1985-05-09 Creighton T E Production of protein
US4656255A (en) * 1985-09-09 1987-04-07 International Minerals & Chemical Corp. Protein recovery
CA1340522C (en) * 1987-03-10 1999-05-04 Heinz Dobeli Fusion proteins containing neighbouring histidines for improved purification
US5074977A (en) * 1987-05-05 1991-12-24 The Washington Technology Center Digital biosensors and method of using same
US4999422A (en) * 1988-04-15 1991-03-12 Biogen, N.V. Continuous method of refolding proteins
US5231168A (en) * 1988-09-16 1993-07-27 Statens Seruminstitut Malaria antigen
DE3835350A1 (de) * 1988-10-17 1990-04-19 Boehringer Mannheim Gmbh Aktivierung von gentechnologisch hergestellten, in prokaryonten exprimierten antikoerpern
DK0432419T3 (da) * 1989-12-05 1994-11-14 American Cyanamid Co Fremgangsmåde til solubilisering og naturering af somatotropiner under anvendelse af lav urinstofkoncentration
US5324436A (en) * 1991-12-13 1994-06-28 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Use of hydrate formation to control membrane mimetic systems
KR100310739B1 (ko) * 1993-02-04 2002-05-30 알란 스코브 단백질재생을위한개선된방법

Also Published As

Publication number Publication date
DE69432744T2 (de) 2004-03-25
FI953705A (fi) 1995-08-03
FI953705A0 (fi) 1995-08-03
ATE241642T1 (de) 2003-06-15
CA2155335A1 (en) 1994-08-18
US5739281A (en) 1998-04-14
DE69432744D1 (de) 2003-07-03
EP0686162A1 (en) 1995-12-13
ES2199959T3 (es) 2004-03-01
NO952989L (no) 1995-10-03
AU6038094A (en) 1994-08-29
AU674568B2 (en) 1997-01-02
NO952989D0 (no) 1995-07-28
KR960701083A (ko) 1996-02-24
DK0686162T3 (da) 2003-09-22
CA2155335C (en) 2001-06-05
WO1994018227A2 (en) 1994-08-18
WO1994018227A3 (en) 1994-10-13
FI113272B (fi) 2004-03-31
JP3695467B2 (ja) 2005-09-14
JPH08506243A (ja) 1996-07-09
EP0686162B1 (en) 2003-05-28
NZ261571A (en) 1997-03-24
KR100310739B1 (ko) 2002-05-30
US5917018A (en) 1999-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO316274B1 (no) Fremgangsmate til refolding av proteiner
JP6591511B2 (ja) スプリットインテイン、複合体およびそれらの使用
AU605291B2 (en) Process for the purification of recombinant polypeptides
JPS61135591A (ja) 組み換え融合タン白質
CZ171492A3 (en) Polypeptide, process of its preparation, pharmaceutical composition containing thereof and its use as an intermediate for insulin preparation
JPH09501911A (ja) リラキシンの製造方法
US20190077828A1 (en) High ph protein refolding methods
US11053278B2 (en) Tangential flow filtration based protein refolding methods
WO2017177759A1 (zh) 镜像核酸复制体系
WO1999007735A2 (en) Recombinant expression of insulin c-peptide
EP0437544A1 (en) Recombinant pdgf and methods for production
JP2005506319A (ja) 融合タンパク質から目的タンパク質を分離する方法。
JP2021532730A (ja) 組換えタンパク質の発現レベルを高めるためのリーダー配列
US6518040B1 (en) In vitro production of proteins by translation of mRNA immobilized on a solid surface
Henry et al. Purification and Biochemical Characterization of the 19-kDa Signal Recognition Particle RNA-Binding Protein Expressed as a Hexahistidine-Tagged Polypeptide inEscherichia coli
ZA200404373B (en) Protein knobs
Rutter PRODUCTION OF “VALUABLE” PROTEINS IN ALTERNATE BIOLOGICAL HOSTS
MXPA00001204A (en) Recombinant expression of insulin c-peptide

Legal Events

Date Code Title Description
CREP Change of representative

Representative=s name: ZACCO NORWAY AS, POSTBOKS 2003 VIKA, 0125 OSLO, NO

MM1K Lapsed by not paying the annual fees