JP3695467B2 - タンパクを再生するための改良された方法 - Google Patents

タンパクを再生するための改良された方法 Download PDF

Info

Publication number
JP3695467B2
JP3695467B2 JP51754494A JP51754494A JP3695467B2 JP 3695467 B2 JP3695467 B2 JP 3695467B2 JP 51754494 A JP51754494 A JP 51754494A JP 51754494 A JP51754494 A JP 51754494A JP 3695467 B2 JP3695467 B2 JP 3695467B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
polypeptide
seq
protein
amino acid
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP51754494A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH08506243A (ja
Inventor
トーゲルセン，ハンス，クリスチャン
ホルテト，トール，ラス
エトゼロート，ミカエル
Original Assignee
ボレアン ファーマ エー／エス
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DK13093A external-priority patent/DK13093D0/da
Priority claimed from DK13993A external-priority patent/DK13993D0/da
Priority claimed from PCT/GB1993/002492 external-priority patent/WO1994013804A1/en
Application filed by ボレアン ファーマ エー／エス filed Critical ボレアン ファーマ エー／エス
Publication of JPH08506243A publication Critical patent/JPH08506243A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3695467B2 publication Critical patent/JP3695467B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6435—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6432—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21006—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21007—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/124—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes based on group I or II introns
    • C12N2310/1241—Tetrahymena
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/127—DNAzymes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

発明の分野
この発明は、組換えＤＮＡ技術に関し、特に、ジスルフィド結合を含有するタンパクを含む誤って折り畳まれた(misfolded)および／または不溶性タンパクを効率よく試験管内で(in vitro)再生するための新規な一般原理と方法論を記載することにより、組換えタンパク産物として異種または相同である宿主生物における遺伝子または遺伝子フラグメントの発現によって正しく折り畳まれたタンパクを産生するためのタンパク工学技術に関する。この発明は、さらに、その他のあらゆる起源に由来する折り畳まれていない(unfolded)または誤って折り畳まれたポリペプチドの再生に関する。この発明は、また、キメラタンパクの因子Xa切断のための暗号化された認識部位であり、試験管内での誘導(derivatization)後にはじめて認識されるようになる部位の新規な設計に関する。また、ウシ凝固因子Xaの２つの類似体も提供する。この類似体は、因子Xaによる切断のために設計された部位でのキメラタンパクの特異的な切断を伴う小規模、中規模または大規模な技術の応用に適している。最後に、この発明は、可逆的なジスルフィド遮断試薬の設計に関する。この試薬は、この特定の目的に対するジスルフィド交換試薬の適性を評価することができる一般的な分析手順を含む、システイン含有タンパクの再生のための補助化合物として有用である。
この発明の一般的な背景
特定のポリペプチドをコードする天然または合成ＤＮＡフラグメントを適切な宿主に組換えＤＮＡ法によって導入することによる、実質的にあらゆるポリペプチドを生成する技術は、過去１５年以上熱心に開発されており、現在では、生化学研究にとっておよび生物医学用途やその他の産業的用途に用いられる高品質(high grade)蛋白産物を産生するための多くの産業的工程にとって主要な手段となっている。
生物学的システムの４つの基本的物性により、タンパクを異種的に産生することが可能になる：
（i）タンパクの機能的特性は、その３次構造によって完全に特定され、かつこの構造における分子環境ゆえに、この構造の特定の部分によって示される化学的特性によって発現される。
（ii）次いで、タンパクの３次構造は、直線のペプチド鎖におけるアミノ酸残基の特定の連続した配列によって表わされる配列の情報によって特定される。ポリペプチドのアミノ酸配列に埋め込まれている構造の情報は、最終産物が完全でかつ正しく折り畳まれたタンパクである折り畳み工程を行うのに適切な条件下ではそれ自体十分なものである。
（iii）ポリペプチド鎖におけるアミノ酸残基の直線の配列は、細胞機構によるポリペプチド鎖の集合(assembly)を行う遺伝物質のコード領域におけるヌクレオチド配列により特定される。核酸配列情報のアミノ酸配列への翻訳を決定する翻訳表は公知であり、かつ公知生物ではほとんど一般的なものである。従って、その翻訳表により、あらゆるポリペプチドセグメントをコードする核酸セグメントは、実質的にあらゆる異種間障壁を越えてペプチド産物の集合を行うことができる。
（iv）生物の個々のタイプは、その遺伝子に存在する遺伝的要素の特徴的な配列に依存して、特定の細胞内および細胞外の因子に応答して、転写および翻訳に関して所定の遺伝子の発現を調整する細胞の分子機構と相互作用する。
従って、宿主細胞または生物のタンパク合成機構を活用することにより所望の組換え蛋白産物を実質的に産生するためには、所望の産物をコードするＤＮＡセグメントを、細胞の遺伝制御システムによって認識される配列を制御するように融合された細胞に提示する必要がある。
宿主において発現されるポリペプチドの直接の運命(immediate fate)は、ポリペプチドの性質、宿主の性質、および所定のポリペプチドの産生中に惹起され得る宿主生物のストレス状態に影響される。適度なレベルで発現されかつ宿主細胞に通常存在するタンパクに類似もしくは同一である遺伝子産物は、この内因性遺伝子産物の天然での運命に拘わらず、通常のプロセシングおよび適切な細胞区画における蓄積または分泌をしばしば経験する。対照的に、細胞にとって異質であるかまたは高レベルで産生される組換え遺伝子産物は、熱ショックまたは毒性アミノ酸類似体に暴露することにより活性化される細胞防御機構に類似した細胞防御機構（すなわち、制御された細胞内タンパク分解または望まれないポリペプチド材料の貯蔵粒子（「封入体」）中への分離（segregate）により、細胞が「誤った」ポリペプチド材料から逃れるように本来設計されている経路）をしばしば活性化する。これらの貯蔵粒子中の組換えタンパクは、しばしば誤って折り畳まれた状態または凝集した(aggregated)状態で沈殿し、そうした場合、有用なタンパク産物を得るには、変性および還元条件下で産物を溶解し、次いで試験管内方法によって組換えポリペプチドを折り畳むことが必要になる。
真核細胞における真核遺伝子の発現により、正しく折り畳まれかつ処理された遺伝子産物を細胞培養液または細胞材料から単離することが可能になる。このアプローチは、生化学研究用の比較的少量の蛋白を得るためにしばしば用いられ、現在では、生物医学上の多数の産物を産生するのにも産業的に活用されている。しかし、真核発現技術は、技術的複雑さ、人件費、材料費の点で高くつく。さらに、発現系を確立するのに必要となる開発面での時間に関しては、実験室レベルでの産生だけでも少なくとも数ヵ月かかる。組換え産物の、翻訳後修飾の性質および程度は、天然産物の性質および程度としばしば異なる。というのは、この修飾が、宿主細胞において間接的に遺伝子制御されているからである。合成後修飾を惹起する配列のシグナルは、真核生物間でしばしば相互に認識されるが、修飾酵素の適切な部位の有効性は、宿主細胞の性質と状態により決定される。
資金面、労力面および材料面での要求に関して真核宿主以上に有利である、原核宿主における遺伝子産物の発現に関する種々の戦略が開発されている。真生細菌である大腸菌の菌株は、しばしば宿主細胞として好ましい。というのは、大腸菌は、分子レベルにおいても他のあらゆる生物より遺伝的にはるかに多く特徴づけられているからである。
原核宿主細胞は、翻訳後修飾を行うのに必要とされる酵素機構を有しておらず、そのために真核遺伝子産物は、その修飾されていない形態で必ず産生されるであろう。さらに、産物は、高度に発現された宿主タンパクのＮ−末端セグメントに対応するＮ−末端セグメントをよりしばしば含む、Ｎ−末端延長（N-terminal extension)、すなわち必要とされる翻訳開始コドンから生じる少なくとも１つの追加のメチオニン残基を含んで合成されなくてはならない。また、Ｎ−末端延長と所望のポリペプチド産物との間の接合部に挿入されたリンカーセグメントで、配列特異的タンパク分解によりこのようなＮ−末端延長を除去する一般的な方法が、記載されている｛エンテロキナーゼにより切断可能なリンカー配列：EP 035384、The Regents of the University of California；因子Xaにより切断可能なリンカー配列：EP 161937、nagai &amp Thogersen、譲受人：Celltech Ltd.｝。
可溶形態の組換えタンパク産物、または活性な、おそらくＮ−末端が処理されている形態で細胞から分泌させる融合タンパク構築物（constructs）を発生させるための、原核生物における異種発現のための戦略の開発に向けてかなりの努力が何年もなされてきたが、この努力は、シャペロン（chaperone）分野における最近の開発にも拘わらず限られた成功しか収めていない。典型的には、少量の可溶性であって正しく折り畳まれた融合タンパク産物を単離する前に発現系を開発しかつ修正するために多くの時間と努力が必要である。よりしばしば、ポリペプチド産物の全ては、「封入体」において不適切に折り畳まれた状態で宿主細胞内に沈殿している。これは特に、ジスルフィド架橋を含有する真核タンパクの発現にあてはまる。
タンパクを試験管内で再生させる有効な方法には全て、溶液中に存在するか、または非特異的にイオン交換樹脂などに吸着されるタンパクを溶媒に暴露させ、その溶媒の組成を一回で（single pass）時間の経過とともに（over time）次第に強度の変性（および還元の場合もある）から非変性に変化させる工程が記載されている。これは、塩酸グアニジンまたは尿素を６〜８Ｍ含有するタンパクの濃縮溶液を実質量の非変性緩衝液に希釈するか、または非変性緩衝液に対して変性緩衝液中のタンパクの希釈溶液を透析することによってしばしばなされる。この基本的手順の多くの変形例が記載されているが、そのなかには、折り畳み構造を安定させると思われる、活性タンパクの特定のリガンドまたは補因子を加えるもの、ポリエチレンオキサイド（ポリエチレングリコール）のようなポリマー物質を加えるものが含まれる。
１つ以上のジスルフィド結合を含有するタンパクを含む多くの特異性タンパク産物に対して試験管内再生の標準的手順の有効な変形が見い出されているが、再生の収率はよりしばしば少なく、不完全に折り畳まれたほとんどのタンパクの溶解度が低く溶媒の使用量を過剰にしなくてはならないため、収率を高めることは実際的でなくかつ費用がかかる。
伝統的な試験管内再生プロトコールの全てに共通した特徴は、変性の急激なまたは徐々の減少に誘発される再生が、一回の操作として行われ、その収率が、問題になっているタンパクでは得られる限り最大のものであると見なされていることである。
タンパク折り畳みの一般分野は、トーマス Ｗ.クライトン（Thomas W．Creighton）編の最近の教則本(「タンパクの折り畳み」、Creighton T．E．編、Freeman 1992）に概要が記載されており、タンパク再生の実際的方法のより特別な検討は、レイナー ハエニケとレイナー ルドルフ（Rainer Jaenicke & Rainer Rudolph）により１９８９年に出版されている（「タンパクの構造、実際的アプローチ」T．E．Creighton編、IRL Press 1989）。より詳細に記載した多くの出版物のうち、シェイン（Schein）によるもの（Schein C．H.，1990，Bio／Technology 8，308-317）またはビュヒナーとルドルフ（Buchner and Rudolph）によるもの（Buchner J．およびRudolph R.，1991，Bio／Technology 9，157-162）のような技術状態を検討したものを参照してもよい。
従って、原核生物発現系またはペプチド合成のような種々の源由来の折り畳まれていないまたは誤って折り畳まれたタンパクを再生するための一般的に適用可能な収率の高い方法が必要であるのは明確である。
発明の概要
再生の収率は以下のことを考慮することにより非常に高められることが本発明者らにより見い出された。すなわち、タンパクの折り畳み工程が動力学的に制御された工程であるということ、およびタンパクの折り畳まれた配座異性体、折り畳まれていない配座異性体および誤って折り畳まれた配座異性体間の相互転換が、周期的な変性−復元工程（再生されたタンパク産物が、折り畳まれていない配座異性体および誤って折り畳まれた配座異性体を犠牲にして各周期で増加しながら蓄積する）を設計して基本的な伝統的アプローチよりもはるかに大きな可能性を有する新規な再生工程を発生させるために活用することができる、ヒステリシス現象と時間依存性の現象とに影響されやすいことである。
用語「折り畳まれたタンパク」は、生物学的に活性な形態のタンパクに生じる立体配座状態に対応する立体配座状態にあるポリペプチド、または特有の安定した中間体（続く工程では変換されて生物学的に活性の種を発生させることもあり得る）を意味する。ポリペプチドにおける対になったシステイン残基間の架橋の観点における折り畳まれたタンパクの共有結合構造は、生物学的に活性な形態のタンパクの共有結合構造と同一である。
従って、「折り畳まれていないタンパク」という用語は、生物学的に活性であって従って折り畳まれた形態のタンパクに対応するポリペプチドよりもコンパクトでなくかつ明確に定義されていない立体配座状態にあるポリペプチドを称している。ポリペプチドにおける対になったシステイン残基間の架橋という観点における折り畳まれていないタンパクの共有結合構造は、生物学的に活性な形態のタンパクの共有結合構造と同一もしくは同一でないかもしれない。折り畳まれていないタンパクに密接に関連しているのは、事実上は熱力学的に安定した立体配座状態であって、折り畳まれた形態のタンパクに対応する立体配座状態よりも時にはさらに安定している立体配座状態にあり、かつ生物活性を示すとしても折り畳まれたタンパクと同程度には生物活性を示さないポリペプチドである「誤って折り畳まれたタンパク」である。折り畳まれていないタンパクの場合のように、ポリペプチドにおける対になったシステイン残基間の架橋という観点における共有結合構造は、折り畳まれたタンパクの共有結合構造と同一もしくは同一でないかもしれない。
「再生されたタンパク」という用語は、折り畳まれていない状態から変換され、生物学的に活性な立体配座と、ポリペプチドにおける正しく対になったシステイン残基間の架橋という観点における共有結合構造とをとるポリペプチドを意味する。
この一般的に適用可能なタンパク再生の新規な戦略は、タンパク構造の以下の一般特性に基づいて設計されている。
（ａ） 非変性溶媒に暴露された折り畳まれていないタンパクの低い溶解性は、ポリペプチドを誘導してコンパクトな正しく再生された構造を形成するか、もしくは誤って折り畳まれて妥当な時間内で非変性条件下で再生して正しく再生された構造を生じることができないゆきどまり凝集体または沈澱物を生じる、主要な推進力を反映している。
（ｂ） 新しく形成されたゆきどまり凝集体は、正しく再生されたタンパクよりも容易に「変性」、すなわち折り畳まれていない形態に変換される。これは、ゆきどまり凝集体の構造がより無秩序なためである。おそらく、誤った折り畳みも、一般的には動力学的に制御された工程である。
（ｃ） 折り畳まれていないタンパクは、妥当な時間内でゆきどまり凝集体を変性させるのに必要な変性レベルでは正しく再生された形態に再生されることがしばしば不可能（もしくは非常にゆっくりした速度でのみ可能）である。
（ｄ） （ｂ）を支持するのに入手可能な一連の証拠には、数種のモデルタンパクに関する折り畳み経路と折り畳まれない経路および中間体の詳細な研究がある。また、還元および変性剤の制限濃度における還元に対するジスルフィド結合の安定性が所定のタンパクのジスルフィド架橋毎にしばしば有意に異なり、折り畳まれたタンパクのジスルフィド架橋が変性されたタンパクまたはタンパク凝集体における「非天然の（non-native）」ジスルフィド結合よりも還元またはジスルフィド交換を一般的にはるかに受けにくいという、ジスルフィド結合された多くのタンパクに関する観察も記載されている。
再生手順のための新規な戦略を、理論上の以下の例に基づいて最も容易に説明する：
緩衝液Ａまたは緩衝液Ｂに暴露され、次いで緩衝液Ａと緩衝液Ｂとの混合液において変性の中間レベルでインキュベーションに付した仮定のタンパク−非変性緩衝液「Ａ」において安定に折り畳まれ、強度の変性緩衝液「Ｂ」において安定に折り畳まれない（緩衝液Ｂは例えば塩酸グアニジンを６Ｍ含有）−を仮定する。
緩衝液Ｂが100〜75％の範囲にある場合には、折り畳まれたタンパクおよびゆきどまり凝集タンパクのいずれもが、折り畳まれていない形態に短時間のうちに変換される。
緩衝液Ｂが75〜50％の範囲にある場合には、新しく形成されたゆきどまり凝集体は折り畳まれていない形態に変換され、一方再生されたタンパクのほとんど全ては、少なくとも数時間のうちに安定した天然様構造にあり、変性剤を除去すると再生された形態に直ちに戻るであろう。
緩衝液Ｂが10％以上の場合には、折り畳まれていない形態から再生された形態への迅速な形成が阻害される。
溶媒の組成ステップを緩衝液Ｂ100％から０％に変えた場合には、折り畳まれていないタンパクは、ゆきどまり凝集体（収率75％）と再生されたタンパク（収率25％）に変換される。
最初に100％の緩衝液Ｂ中で折り畳まれていない形態にあるこのタンパクのサンプルを、図１に示されているような時系列のプログラムされた変性−復元周期（各周期は、再生相（Ｆn）（＜10％Ｂ）と変性相（Ｄn）からなる）に付す。周期（ｉ）の復元相の終盤では、変性内容物が、前周期の変性レベルよりもｋi％低いレベルに変化する。簡単なインキュベーションを行った後、変性剤を再び除去し、次の復元相Ｆi+1に入る。変性レベルが緩衝液100％から出発し、各周期のｋiが４％に固定されると仮定すると、この方法では、25周期後に終結する減衰した一連の変性工程が生じるであろう。
上記のように２５周期を通じて、再生されたタンパクの蓄積は以下のように進行する：
周期１〜周期５において、誤って折り畳まれたタンパクのみならず折り畳まれたタンパク全てが、各変性相Ｄnにおいて折り畳みが解けるであろう。
周期７〜周期１２：ゆきどまり凝集体は、各工程において折り畳まれていないタンパクに変換され、一方再生産物として復元可能なタンパクは、周期毎に以下の量：25％、44％、58％、68％、76％および82％で蓄積されるであろう。
周期１３〜２５では、変換はもう生じない。
従って、周期的な再生工程では、80％以上の全再生収率を生み、一方従来の最良の状態での１回の復元では、25％の収率を生むであろう。
この仮定のタンパクの種々の立体配座状態の各特徴の漸次変化が見られる場合および見られない場合において、簡略化のために近似値で記載されていることを理解されたい。それにも拘わらず、基本的な作業原則は、より複雑な一連の推定をこのモデルに加えたとしても大きな違いは生じない。
周期的な変性／復元タンパク再生工程を確立するための実際的構成は、様々な方法での準備が考えられる。
溶液中のタンパクは、例えば限外濾過膜装置または透折装置に保つことも可能であるし、適切な水性二相システムの相のうちいずれかに保持することも可能である。これらのいずれを用いる場合も、タンパク溶液中の低分子重量化学溶質の濃度を適切な装置によって制御することができるであろう。
また、タンパクは、要求されているように化学組成が制御され得る液相に接触した適切な面に吸収されることも可能である。適切な表面としては、例えば濾過装置、中空ファイバー装置またはビーズ状の（beaded）クロマトグラフィー媒体などが挙げられる。表面へのタンパクの吸収は、表面とタンパクとの間の折り畳み相溶性共有結合（folding-compatible covalent bonds）によるかまたは適切に誘導された表面に対する特定かつ変性耐性の親和性を示すタンパクの組換え誘導体における親和性ハンドルの特定の設計を介して、例えばWO 86/05809(Thomas Edwin Creighton)に記載されているような非特異な相互作用によって媒介され得る。
一般的方法の可能性を調査するために確立された周期的な変性／復元タンパク再生工程の特定の実施は、設計された因子Ｘa切断部位のＮ末端に挿入した金属親和性ハンドルモジュール｛EP 0282042（Heinz Dobeli，Bernhard Eggimann，Reiner Gentz，Erich Hochuli; Hoffmann-La Roche）｝を含有する切断可能なハイブリッドタンパクの設計（EP 161937、Nagai & Thogersen、譲受人: Celltech Ltd.)に基づくものであった。次いで、ニッケル−キレートアガロースビーズに吸収されたこの一般的な設計の組換えタンパクを、配列された較正済みポンプにより供給される、流速がコンピュータ制御でタイムプログラムされた適切な変性緩衝液と非変性緩衝液との混合液により灌流したクロマトグラフィーカラム「再生反応器」において、この発明の周期的な再生工程に付すことができる。
固体状態（solid-state）再生の概括的計画には、変性剤の濃度が、多くの一連の復元−変性周期を通じて高い初期値から次第にゼロに減少する漸進的な様式で、上記で概略説明されたように、または変性条件と非変性条件との間におけるその他のあらゆる手段と実施とによって固定化タンパクを循環させる工程が含まれる。このアプローチを用いる際には、手元にある特定のタンパクを循環させる間に折り畳み収率を高めるためにいずれの制限変性剤濃度が要求されるかを正確に決定する必要はない。というのは、この漸進的な一連の周期が、（多くて）３相、すなわち、周期（i）の終盤において存在する折り畳まれた産物が、周期（i+1）の変性工程において完全に変性される周期相、再生産物の蓄積量が増加する中間産生相、および変性剤の濃度が再生されたタンパクまたは残存するあらゆる誤って折り畳まれた構造を摂動させるには低すぎる最終相を通過するからである。
ジスルフィド含有タンパクでは、折り畳み反応器の流出液の緩衝液の組成をモニターするために、オンライン設備を備えた改良型クロマトグラフィー装置に類似した装置を用いて、漸進的変性−復元の周期を増やすことができる。還元剤の流出液組成とジスルフィド再編成（reshuffling）試薬濃度プロフィールに関する情報により産生周期が分かるため、この情報は、情報処理機能をもつ処理装置への入力に使用することが可能であり、次いで周期作用力のほとんどが一連の変性／復元周期の産生相内で消費されるのを確実にするために、フィードバックループの変性剤濃度の漸進を調節することができる。周期条件のこうした自動最適化が可能となるのは、分析システムを緩衝液流の酸化還元平衡における変化の程度と方向を測定するのに用いることができ、この測定値が、固定化タンパクサンプルにおけるチオール基／ジスルフィド当量の滴定を直接反映し、そのため周期の種々の相で破壊または形成されるジスルフィド結合の平均数に直ちに翻訳することができるからである。
周期の漸進を制御する情報処理機能をもつ処理装置への他の可能な入力としては、リガンド結合、基質変換、抗体結合能、および明確な方法で誤って折り畳まれたタンパクおよび折り畳まれたタンパク（折り畳み測定の評定段階において再生反応器を介してパーコレート（percolate）され、次いで適切な分析装置により流出液中でインライン（in-line）モニターすることもできる）と相互作用する他のあらゆる溶解可能な相互作用剤の測定が挙げられる。
情報処理機能をもつモニターおよび制御システムでは、さらに、入手可能な情報を用い、反応器流出液の利用可能な部分をサルベージ／リサイクルサブシステムに対し、それによって大規模操作にかかる出費を最小限にすることができる。
折り畳み工程を行った後、最終産物を濃縮形態でアフィニティーマトリックスから溶出させ、処理して、設計されたプロテアーゼ切断部位での切断により成熟した真正タンパクを放出させ、次いでタンパク化学の分野では公知の標準タンパク精製および処理技術により、最終的な後処理に付すことができる。
発明の詳細な開示
従って、この発明は、ポリペプチド分子の初期集合体（ensemble）を、一連の
１）集合体のポリペプチド分子に対して変性作用を及ぼす条件を伴う少なくとも１つの変性工程と、それに続く
２）上述の工程から得られる立体配座を有するポリペプチド分子に
対して変性作用を有する条件を伴う少なくとも１つの復元工程
からなる少なくとも２つの連続した周期の系列に付すことからなる、ポリペプチド分子の処理集合体と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド分子の初期集合体から、処理集合体において表される立体配座状態がある特定の一様な立体配座にあるポリペプチド分子の実質的フラクションを含有するポリペプチド分子の処理集合体を発生する方法に関する。
この明細書と請求の範囲において用語「集合体（ensemble）」は、この用語が当該分野で獲得した意味で用いられる。すなわち、この用語は、主要な共通した特徴を有する分子の集合を示している。初期には（「初期集合体」）、それらは、少なくともそのアミノ酸配列を共通に有している（および当然、この共通した特徴を保持している）。ポリペプチド分子の集合体がこの発明の方法で処理された場合（「処理集合体」を得るために）、この集合体において表された立体配座状態は、１つの特定の立体配座をもったポリペプチド分子の実質的フラクションを含有するであろう。以下の説明から理解されるように、処理集合体における１つの特定の立体配座をもったポリペプチド分子の実質的フラクションは、この発明の方法による処理のパラメーター、特定の立体配座にあるタンパクのサイズ、分子のアミノ酸配列の長さと同一性などに依存して変化するであろう。ここに報告されている処理パラメーターがまだ最適化されていない実施例では、１つの特定の立体配座をもったポリペプチド分子のフラクションは、集合体の15％〜100％（いずれの場合にも、この発明以前に得ることのできた数値よりも上回っている）の間で変化した。実施例１３には、この発明の方法に付す前のポリペプチド分子の精製により、１つの特定の立体配座をもったポリペプチド分子のフラクションが増加することがさらに示されている。
「変性工程」とは、時間間隔においてポリペプチド分子の集合体を、変性工程直前の条件を特徴づける変性力（denaturing power）よりも激しい変性力を特徴とする条件にポリペプチド分子の集合体を付す、物理的および／または化学的環境に暴露することを称する。
従って、用語「復元工程（renaturing step）」とは、時間間隔においてポリペプチド分子の集合体を、変性工程直前の条件を特徴づける変性力よりも激しくない変性力を特徴とする条件にポリペプチド分子の集合体を付す、物理的および／または化学的環境に暴露することを称する。
上記の「実質的フラクション」の大きさは、この発明の方法に付されるポリペプチド分子の集合体に依存するであろう。ポリペプチドの処理集合体が、長さが比較的短くかつ分子内ジスルフィド架橋をもたない単量体タンパクから構成されている場合、この発明の方法を用いれば一般的に非常に高い収率が得られるであろうが、（複雑なジスルフィド架橋トポロジーを持つ多量体タンパクのような）複雑な分子では、たとえこの発明の方法の条件を完全に最適化したとしても、収率は低くなるであろう。
この発明の興味深い観点は、処理集合体が、１つの立体配座状態にあるポリペプチド分子の実質的フラクションで、ポリペプチド分子の初期集合体の少なくとも１％(W/W)を構成する実質的フラクションからなる、上記の方法に関する。より高い収率、例えばポリペプチド分子の初期集合体の少なくとも５％、少なくとも10％、少なくとも20％および少なくとも25％が好ましい。より好ましい収率は、少なくとも30％、例えば少なくとも40％、50％、60％、70％および少なくとも80％である。特に好ましい収率は、少なくとも85％、例えば90％、95％、97％、および99％である。100％に近い収率が観察される場合がときどきある。
集合体のポリペプチド分子がシステインを含有している場合、処理集合体は、実質的に同一であるジスルフィド架橋トポロジー（disulphide bridging topology）をさらに有する、１つの特定の一様な立体配座にあるポリペプチド分子の実質的フラクションからなる。
ほとんどの場合、この発明の方法に付されるポリペプチド分子は、真正ポリペプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する分子であるか、または１つもしくは２つの追加のポリペプチドセグメントに結合された真正ポリペプチドのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列からなる分子であろう。
用語「真正のタンパクもしくはポリペプチド」は、対応する天然タンパクの一次構造と同一の、Ｎ−末端およびＣ−末端構造を含む一次構造を有するポリペプチドを意味する。この用語は、また、天然タンパクの一次構造と必ずしも同一でない公知の一次構造を有し、タンパク合成において意図した最終産物であるポリペプチドを表す。
用語「天然タンパク」は、タンパクが遺伝子操作の結果としてではなく存在している生物から生物学的活性形態で単離されたタンパクを意味する。
対照的に、この明細書および請求の範囲に用いられている用語「人工タンパクもしくはポリペプチド」は、いかなる天然の源からも入手不可能な、すなわちいかなる天然の源からも単離かつ精製することのできないタンパク／ポリペプチドに関するように意図されている。このように、人工タンパク／ポリペプチドは、人為的介入の結果であり、例えば組換えＤＮＡ操作の産物または試験管内ペプチド合成の一形態であることができる。上記定義によれば、こうした人工タンパクは、真正タンパクであって天然タンパクではないこともあり得る。
このように、この発明は、人工タンパクのみならず天然タンパクをここに記載の再生工程に付す方法にも関している。
以下により詳細に説明されるように、真正ポリペプチドが、例えば、ポリペプチドを担体に結合させるための「ハンドル」として、溶解度修飾因子として、メッセンジャーＲＮＡなどの翻訳中に有益な機能を発揮する発現ブースター（boosters）として、循環中やその前後のその他の処理中に補助的機能を有するポリペプチドセグメントに結合されるのが種々の理由で有利である。このような補助ポリペプチドセグメントは、切断可能な結合を介して真正ポリペプチドに結合されるのが好ましく、２つのこうした補助的ポリペプチドセグメントが真正ポリペプチドに結合される場合、この結合は、通常同時に切断される類似の切断可能な結合またはあらゆる時系列で切断することのできる非類似の切断可能な結合を介してなすことができる。
上記によれば、この発明の主要な新規な特徴事項は、上記のように少なくとも２つの連続した周期からなる循環により、復元工程後に変性工程（再生ポリペプチドの少なくとも実質的フラクションが再度変性される）が続く少なくとも１イベントが生じることであると信じられる。
ほとんどの場合、処理（processing）は、少なくとも３周期、しばしば少なくとも５周期およびよりしばしば少なくとも８周期、例えば少なくとも10周期からなり、場合によっては少なくとも25周期からなるであろう。一方、周期の系列（series）は、通常2000周期を超えず、しばしば最大で1000周期からなり、よりしばしば最大で500周期からなるであろう。用いられる周期の数は、循環が行われる装置によりもたらされる可能性に部分的に依存するであろう。
従って、循環処理が、以下により詳細に説明されるような、担体カラムに固定化されたポリペプチド分子を用いて行われる場合には、カラムに接触した液相を交換することができる速度が、現実に達成し得るものに対して１つの制限を設けるであろう。一方、高性能液体クロマトグラフィー（HPCL）装置により、液体環境が非常に速く交換され、従って数百または数千の範囲の周期数が現実的になるであろう。
望ましい周期数を決定する他の考えられる要素としては、例えば部分的に折り畳まれた状態への再分配を複雑にする傾向にあり、従ってタイミングを十分に考慮することが通常必要であるプロリン残基におけるシスおよびトランス異性体間の相互変換のような固有の動力学パラメーターが挙げられる。別の時間−臨界特徴は、ジスルフィド再編成（disulphide reshuffling）の動力学にある（ジスルフィド−再編成システムに関する以下のディスカッション参照）。
上記のことを十分に考慮することにより、循環系列は、しばしば最大200周期、よりしばしば最大100周期およびさらにしばしば最大50周期からなるであろう。
上述によれば、各変性工程の持続時間は、問題となる特定の条件下で少なくとも１ミリ秒〜最大１時間であろう。復元工程の持続時間は、問題となる特定の条件下で少なくとも１秒〜最大１２時間であろう。
この方法のほとんどの具体例では、各個々の変性工程における変性条件は一定の時間実質的に一定に保たれ、各個々の復元工程における復元条件は一定の時間実質的に一定に保たれ、条件が実質的に一定に保たれるそれらの時間は、条件が変化する遷移時間（transition period）によって分離される。条件が実質的に一定に保たれる工程間の遷移時間は、例えば0.1秒〜12時間のような広範囲にわたって変化する持続時間を有することができ、かつ通常変性および復元工程の持続時間に完全に密接に適合するであろう。
このことを考慮して、変性工程における変性条件が実質的に一定に保たれる時間は、例えば少なくとも１ミリ秒〜最大１時間、しばしば最大30分の持続時間を有することができ、復元工程における復元条件が実質的に一定に保たれる時間は、少なくとも１秒〜最大１２時間、およびしばしば最大２時間の持続時間を有する。
実際に、変性工程における変性条件が実質的に一定に保たれる時間は、しばしば1〜10分の持続時間を有し、復元工程における復元条件が実質的に一定に保たれる時間は、しばしば１〜45分の持続時間を有するであろう。
ポリペプチドが付される物理的条件における変化に起因する動力学の変化を考慮して、上記の間隔を調整する必要があることが上記より理解されるであろう。例えば、この発明の方法を行う際にHPLCシステムを用いる場合圧力は非常に高く（5000バールまで)、こうした情況下では、非常に迅速な工程が行われかつ／あるいは必要とされるであろう。さらに、実施例より理解されるように、生理的範囲から外れた温度で適宜再生するタンパクもあるため、温度パラメーターが重要である。温度、圧力ともに、この発明の再生工程の動力学に当然影響するため、復元工程および変性工程の上記時間間隔は、この発明の多くの可能な具体例に対する現実的な境界である。
この発明の方法の所定の利用に関して、当業者は、予備的実験などに基づいて適切な条件を決定することができるであろう。
上記のように、ポリペプチド分子は、変性工程および復元工程中、液相に通常接触しており、この液相は通常水性相である。すなわち、この発明の方法に用いられるあらゆる試薬または補助物質は、液相、通常水性相に通常溶解するであろう。しかし、好都合であれば、液相は、１以上の有機溶媒によって構成されてもよい。
タンパクの復元については、いわゆる「シャペロン（chaperone)」または「シャペロン複合体（chaperone complex）」を用いることは公知である。シャペロンは、折り畳まれていないまたは部分的に折り畳まれたタンパクの再生を増強する能力において共通した特徴を示す一群の最近記載されたタンパクである。しばしば、シャペロンは、多分子（multimolecular）複合体である。これらのシャペロンの多くは熱ショックタンパクであり、その熱ショックタンパクとは、外傷によって安定性を失ったタンパクに外傷後の「修復」を施す因子として生体内（in vivo）で作用するタンパクを意味している。この機能を果すため、シャペロンは、他の多くのタンパクおよびタンパク複合体よりも外傷イベントに対してより安定である傾向がある。この発明の方法は、分子シャペロンまたは分子シャペロン複合体の使用に依存しないが、少なくとも１つの復元工程中に存在する適切な分子シャペロンまたは分子シャペロン複合体を有することは当然可能であり、実質的に全周期中に存在する分子シャペロンまたは分子シャペロン複合体を有することが好ましい。
上記のように、ポリペプチド分子は、ポリペプチド分子を実質的に浮遊させて運ぶ（entrain）ことなく液相を変化させるかまたは交換させることのできる環境下に実質的に閉じ込めるのが好ましい。これは、多くの方法で達成可能である。例えば、ポリペプチド分子を透析装置に含有させることもできるし、適切な液体二相系の一方の相に閉じ込めることもできる。こうした適切な水性二相系は、例えばポリエチレンオキサイド（ポリエチレングリコール）、ポリビニルアセテート、デキストランおよび硫酸デキストランからなる群から選択されるポリマーを含有することができる。ある興味深い構成では、一方の相がポリエチレンオキサイド（ポリエチレングリコール）を含有し、他方の相がデキストランを含有し、それによってポリペプチド分子は、デキストラン含有相に閉じ込められるであろう。
ポリペプチドが浮遊して運ばれるのを避ける別の方法は、ポリペプチド分子を、例えばフィルター表面、中空ファイバーまたはビーズ状のクロマトグラフ媒体（アガロース、ポリアクリアミドゲルなど）、繊維状のセルロースマトリックス、またはHPLCもしくはFPLC｛高速液体クロマトグラフィー（Fast Performance Liquid Chromatography）｝マトリックスのような固体もしくは半固体の担体に結合させることである。別の方策では、担体は、液相に溶解もしくは分散させた場合にポリペプチド分子が結合した分子が濾過器により保持され得る大きさの分子を有する物質であるか、もしくは、担体は、ミセルを実質的に浮遊して運ぶことなく、液相を変化させるかまたは交換させながら、ミセルを形成するかもしくはミセルの形成に関与することのできる物質であってもよい。ミセル形成成分が単量体としてシステムから逃れようとする場合（例えばこのシステムを制限するのに用いられる限外濾過器をある程度通過することが可能な場合など）には、これは追加のミセル形成単量体を補給（replenishment）することにより補償することができる。
担体は、濾過器またはこのシステムを閉じ込めるのに用いられる他の手段の細孔を実質的に通過することができない大きさの分子を有する水溶性ポリマーであってもよい。
ポリペプチド分子は、担体の成分に対して親和性を有する成分（moiety）を介して担体に非共有結合的に吸収されるのが適切である。このような成分は、例えばポリペプチドのアミノ酸部分に結合したビオチン基もしくはその類似体であってもよく、こうして修飾されたポリペプチド分子とこうして修飾された担体との間の強力な親和性を有するシステムを確立するために、担体は、アビジン、ストレプトアビジンまたはそれらに結合したそれらの類似体を有する。修飾されたポリペプチドと修飾された担体との間の親和性は、吸着が変性条件によって実質的に影響を受けない程度に十分に安定であるべきであり、循環後の担体からのポリペプチド分子の除去は、以下に説明されるように特異的な切断により行われる必要があることが理解されるであろう。
ビオチニル（biotinyl）基が結合する適切なアミノ酸残基の例として、リジンが挙げられる。
担体に対して親和性を有する部分を担持するアミノ酸を導入する１つの興味深い方法は、CPY合成である。CPY（カルボキシペプチダーゼＹ）は、アミノ酸アミドの側鎖の性質に拘わらずアミノ酸アミドを付加することのできることが知られている。
ある興味深い具体例では、担体に対して親和性を有する部分はポリペプチドセグメント配列番号47であり、この場合、担体は、Ni++イオンによってチャージされたニトリロトリ酢酸誘導体（NTA）、例えばNi++からなる溶液に浴されたNTA−アガロースマトリックスからなるのが適切である。
この発明の重要な観点は、２つ以上のセグメント（１つのセグメントは上記定義の真正ポリペプチドである）に後に切断される分子を作成するポリペプチド分子における適切な手段の存在に関する。こうした組合わされたポリペプチド分子（融合ポリペプチド分子）は、この目的のために、特異的なペプチド結合で切断剤により優先切断を行うことができるポリペプチドセグメントからなってもよい。問題のポリペプチドセグメントは、切断剤のための認識部位となるセグメントの立体配座の結果として切断を行うポリペプチドセグメントであってもよい。
切断を行うポリペプチドセグメント（cleavage-directing polypeptide segment）は、例えばブロモシアン、ヒドロキシルアミン、ヨードソ安息香酸およびＮ−ブロモスクシンイミドからなる群から選択される切断剤によって特異的なペプチド結合で優先切断を行うことができるであろう。
切断を行うポリペプチドセグメントは、例えば酵素である切断剤によって特異的なペプチド結合で優先切断を行うことのできるセグメントであってもよく、こうした可能な酵素の１つとしてはウシエンテロキナーゼまたはその類似体および／または同族体が挙げられる。
この発明の重要な観点によれば、切断剤は、酵素ウシ凝固因子Ｘaまたはその類似体および／または同族体（類似体は、さらに以下でより詳細に説明される）であり、優先切断を行うポリペプチドセグメントは、酵素ウシ凝固因子Ｘaまたはその類似体および／または同族体によって実質的に選択的に認識される配列である。重要なこうしたセグメントは、配列番号38、配列番号40、配列番号41および配列番号42からなる郡から選択される配列を有するポリペプチドセグメントである。
この発明の興味深い特徴は、特異的なペプチド結合で切断を行い、それによってポリペプチドの異なるセグメントが、周期の異なる段階で切断を行うことが可能になる能力に関して、ポリペプチドセグメントをマスキングおよびアンマスキングする可能性である。
従って、ポリペプチド分子が、特異的なペプチド結合で切断剤によって優先切断を行うことのできる誘導されたポリペプチドセグメントに試験管内で変換可能なポリペプチドセグメントからなる場合、上記のマスキング／アンマスキング効果を得ることができる。この戦略の特に興味深い変更においては、試験管内で変換可能なポリペプチドセグメントは、ウシ凝固因子Ｘaまたはその類似体および／または同族体によって実質的に選択的に認識される誘導されたポリペプチドセグメントに変換可能である。
システイン残基とメチオニン残基の両方が、酵素ウシ凝固因子Ｘaまたはその類似体および／または同族体によって認識されるセグメントに試験管内で変換可能な配列番号43、配列番号44、配列番号45、および配列番号46からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するセグメントを作る修飾残基に変換されると考えられる。
この発明によれば、システイン残基を含む１つの可能な解決では、配列番号43または配列番号44のアミノ酸配列を有するポリペプチドセグメントは、システイン残基をＮ−(２−メルカプトエチル)モルホリル−２−チオピリジルジスルフィドまたはメルカプトチオアセテート-2-チオピリジル-ジスルフィドと反応させることによって、ウシ凝固因子Ｘaによって実質的に選択的に認識される誘導ポリペプチドに変換される。
メチオニンを伴うこの発明による可能な戦略では、配列番号:45および配列番号46のアミノ酸配列を有するポリペプチドセグメントは、メチオニン側基のチオエーテル部分が酸化されてスルホキシドもしくはスルホン誘導体になることにより、ウシ凝固因子Ｘaによって実質的に選択的に認識される誘導されたポリペプチドに変換される。
この発明の方法の好ましい具体例では、配列番号38、配列番号40、配列番号41および配列番号42のアミノ酸配列を有する切断を行うセグメント、または配列番号43、配列番号44、配列番号45および配列番号46のアミノ酸配列を有するマスキングされた切断を行うセグメントは、真正ポリペプチドに対してＮ−末端に結合される。というのは、溶液中に真正のポリペプチドを得るために、選択的切断以外のさらなる処理を行うことが不要なためである。一方、真正ポリペプチドのＣ−末端に切断を行う配列を結合する１つの可能性のある理由は、ポリペプチド分子の正しい折り畳みが、ポリペプチド分子の自由なＮ−末端に依存しているという場合である。こうした場合、切断後に残っている切断を行う配列（cleaving-directing sequense）の一部は、カルボキシペプチターゼＡとカルボキシペプチターゼＢの適切な使用により除去することができる。
これらの工程間の遷移時間中の条件の変化は、この発明によれば、ポリペプチド分子が接触している液相の化学組成を変化させることにより達成することができる。このように、ポリペプチド分子の変性は、ポリペプチド分子を、少なくとも１つの変性作用をもつ化合物（denaturing compound）が溶解している液相に接触させることにより達成することができ、ポリペプチド分子の復元は、液相との接触が前工程に起因するそれぞれの立体配座状態にあるポリペプチド分子の集合体を変性させるよりむしろ再生させる傾向のある濃度で溶解している少なくとも１つの変性作用をもつ化合物を含有するか、もしくは変性作用をもつ化合物を実質的に含有してない液相に、ポリペプチド分子を接触させることにより達成される。
表現「変性作用をもつ化合物」は、ポリペプチド分子からなる液相中に溶質の１つとして存在する場合にポリペプチド鎖の部分的なまたは不完全な折り畳みの解けに導くポリペプチド分子の折り畳まれた状態を不安定にする化合物を称する。変性作用をもつ化合物による変性効果は、溶液中の変性作用をもつ化合物の濃度が増すにつれて増加するが、さらに、溶液中の他の溶質の存在のためにまたは温度もしくは圧力のような物理的パラメーターの変化により、増強もしくは緩和されるかもしれない。
この発明の方法に用いられる適切な変性作用をもつ化合物の例としては、尿素、グアニジン塩酸塩、ジ−Ｃ1-6アルキルホルムアミド（ジメチルホルムアミド、ジ−Ｃ1-6アルキルスルホンなど）が挙げられる。
変性工程の少なくとも１つにおいておよび／または復元工程の少なくとも１つにおいて用いられる液相は、この発明によれば、少なくとも１つのジスルフィド−再編成システムを含有している。
「ジスルフィド−再編成システム」は、還元剤と酸化剤との混合物を含有するレドックスシステムであり、この還元剤と酸化剤との混合物の存在により、ポリペプチド中またはポリペプチド間のジスルフィド結合の破壊および形成が促進される。従って、「ジスルフィド再編成剤」または「ジスルフィド再編成化合物」は、ポリペプチド中またはポリペプチド間のジスルフィド結合の破壊および形成を促進する還元剤および酸化剤である。この発明の重要な観点では、タンパクに接触する水性相に含有されるジスルフィド再編成システムは、ジスルフィド再編成システムとして、メルカプタンとそれに対応するジスルフィド化合物との混合物を含有している。
１例として、ポリペプチド分子におけるシステイン残基は全て、少なくとも１つの変性／復元周期中に、グルタチオン、チオコリン、メルカプトエタノールもしくはメルカプト酢酸のいずれかの混合ジスルフィド産物に変換される。このような変換されたポリペプチドは、「ジスルフィド−完全遮断ポリペプチドもしくはタンパク」と名付けられ、従ってこの用語は、システイン残基が、各システイン残基がグルタチオンのようなメルカプタンにジスルフィド結合している混合ジスルフィドに変換されたポリペプチドもしくはタンパクを称する。システイン残基の混合ジスルフィド産物への変換は、ポリペプチド分子の完全変性および完全還元集合体を過剰な脂肪族−芳香族ジスルフィド化合物（２−チオピリジルグルタチオニルジスルフィドなど）のような高エネルギー混合ジスルフィド化合物である試薬と反応させることにより、または他の適切な方法により達成することができる。
高エネルギー混合ジスルフィド、すなわち比較的不安定なS-S結合)を有する混合ジスルフィドの例としては、一般式：
Figure 0003695467
［式中、Ｒ1は、2-ピリジルを表し、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4はそれぞれ、水素または任意に置換された低級芳香族もしくは脂肪族炭化水素基を表す］
を有する混合ジスルフィドが挙げられる。こうした混合ジスルフィドの例としては、グルタチオニル−２−チオピリジルジスルフィド、２−チオコリル−２−チオピリジルジスルフィド、２−メルカプトエタノール−２−チオピリジルジスルフィドおよびメルカプトアセテート−２−チオピリジルジスルフィドが挙げられる。
興味深い具体例では、ジスルフィド再編成システムとしては、グルタチオン、２−メルカプトエタノールまたはチオコリン（それぞれは、その対応する対称ジスルフィドとの混合で用いられる）が挙げられる。
特異的タンパク産物のための周期的な再生／再酸化工程における選択的還元および／またはジスルフィド再編成システムとして用いられるチオール類の所定の混合物の溶解度は、タンパクに弱度の、中度のまたは強度の影響を及ぼす変性剤の濃度を数段階に変えた一連のチオールの混合物とともに折り畳まれたタンパクと誤って折り畳まれたタンパクとの混合物のサンプルの集合体をインキュベートすることにより、直接的に分析することができる。インキュベートした後、各サンプルにおけるジスルフィドトポロジー（topology）を、過剰のチオール遮断試薬（ヨードアセトアミドなど）と反応させてロック（lock）し、サンプルの各セットを還元条件下でSDS-PAGEに付す。正確にジスルフィド架橋した材料および望ましくない共有結合トポロジー状態の材料は、分離したバンドで出現し、それによってチオール遮断時におけるタンパクの折り畳み状態の量的評価が可能になるであろう。というのは、正しく独自のジスルフィド結合した位相異性体のみが、チオール／ジスルフィドおよび変性剤とのインキューベーションの終りに存在する正しく折り畳まれたタンパクに対応するからである。誤ったジスルフィド結合の優先還元と再編成、および完全に折り畳まれたタンパクにおける結合を還元する傾向が低いことにより示されるように、この一連の（set）実験により、所定のチオール／ジスルフィド試薬をジスルフィド再編成剤として有利に用いることができる変性レベルの範囲を同定することが可能となる。この試薬試験工程は、有利な還元試薬および／またはチオール／ジスルフィド再編成試薬を選択するための一般的手順として用いることができる。実施例１２では、５つのチオール試薬に関するモデルタンパクにおける誤って折り畳まれた形態の選択的還元についての適性の評価へのこの分析手順の適用が示されており、それによって上記手順の実施可能性が示されている。
適切なジスルフィド再編成システムを選択するための上記の手順は、チオール類の混合物以外の成分を選択する際にも用いることができることが理解されるであろう。適切な還元／酸化剤を含有するあらゆる混合物は、上記手順により評価することができ、この発明の方法において選択された成分は、不正確に形成されたジスルフィド架橋を優先的に還元する能力を最も高く示すであろう。
このように、この発明の非常に重要な観点は、ここに記載のタンパク再生のための方法であり、この方法において、少なくとも１つの復元および／または変性工程において液相に含有された少なくとも１つのジスルフィド再編成システムは、折り畳まれていないタンパクおよび／または誤って折り畳まれたタンパクが変性されかつ正確に形成されたジスルフィド架橋の還元および／または再編成が実質的にない変性剤の濃度に関する条件下において、不正確に形成されたジスルフィド架橋を還元しかつ／または再編成することのできるシステムである。
この発明の興味深い具体例は、上記の方法であり、この方法において、ジスルフィド再編成システムは、少なくとも１つの変性／復元工程において用いられ、少なくとも1.05の、還元／再編成された初期に不正確に形成されたジスルフィド架橋の相対量と還元／再編成された初期に正確に形成されたジスルフィド架橋の相対量との比率を生じるであろう。この比率は、より高く例えば1.1、1.5、2.0、3.0、5.0、10、100および1000であるのが好ましいが、さらに高い比率でさえも現実的であり、この発明によれば特に好ましい。
ジスルフィド架橋の形態に関する用語「初期に不正確に／正確に」は、ジスルフィド再編成（reshuuffling）システムが効果を発揮する直前のジスルフィド架橋トポロジー（disulphide bridging topology）を意味する。
タンパクのサンプルにおいて正確に形成されたジスルフィド架橋を網状形成するために、比率は１よりも大きくなくてはならないことが理解されるであろう。通常、比率はできるだけ大きい必要があるが、かろうじて１より大きい比率でも、この発明の方法において正確に形成されたジスルフィド架橋を網状形成することは可能であり、高い収率を確実にする重要なパラメーターは、変性／復元周期の数である。比率がかろうじて１より大きい場合には、正確に形成されたジスルフィド架橋の実質的収率が得られる前に多くの周期が終了していることが必要であり、一方比率が高い場合には、限られた周期数しか必要としない。
ジスルフィド再編成システムが１つしか用いられない場合には、こうしたジスルフィド再編成システムは、この発明によれば、
１）選択された変性剤の濃度を数段階に変えた一連のジスルフィド再編成システムを用いて、この発明の方法で処理されるタンパクと同一のアミノ酸配列を有する折り畳まれたタンパクおよび誤って折り畳まれたタンパクのサンプルをインキュベートし、
２）還元／再編成された初期に不正確に形成されたジスルフィド架橋の相対量と、還元／再編成された初期に正確に形成されたジスルフィド架橋の相対量との比率を計算することにより評価されるように、それぞれのジスルフィド再編成システムにおける、初期に正確に形成されたジスルフィド架橋を実質的に還元／再編成することなく初期に不正確に形成されたジスルフィド架橋を還元／再編成する能力を、変性剤の異なる濃度のそれぞれで評価し、
３）選択された変性剤の最も広い濃度範囲において、初期に正確に形成されたジスルフィド架橋を実質的に還元および／または再編成せずに、初期に不正確に形成されたジスルフィド架橋を還元する能力を示すジスルフィド再編成システムを、ジスルフィド再編成システムＸとして選択する
ことにより、選択することができる。
また、1つ以上のジスルフィド再編成システムを、例えばこの発明の周期的な再生方法における異なる周期において、また同じ周期において同時に用いることができる。これは、例えば正しいジスルフィド架橋トポロジーを有する正しく折り畳まれたタンパクの全収率が、この発明の方法における異なるジスルフィド再編成システムを用いた場合よりも高いということが例えば上記で概略説明された方法により見込まれるかあるいは既に達成されている場合であろう。
上記の還元／再編成された初期に不正確に形成されたジスルフィド架橋の相対量と、還元／再編成された初期に正確に形成されたジスルフィド架橋の相対量との比率を計算するために、以下の方法を用いることができる。すなわち、工程１）の反応物の初期混合物に、放射標識された正しく折り畳まれたタンパクを公知量加える。正確に折り畳まれたタンパクおよび不正確に折り畳まれたタンパクの量を工程２）において（例えば非還元SDS-PAGEを用いて）評価する場合、正確に折り畳まれたタンパクのフラクションにおける放射活性の含量も決定する。それによって、現在不正確に折り畳まれた（だが初期には正確に折り畳まれていた）タンパクの評価を、正確に／不正確に折り畳まれたタンパクの全分布の決定に平行して決定することができる。このように、上記の比率は、
Figure 0003695467
［式中、Ｃ1は正確に折り畳まれたタンパクの初期量を、Ｃ2は正確に折り畳まれたタンパクの最終量を、Ｕ1は初期に不正確に折り畳まれたタンパクの量を、Ａ1は初期に正確に折り畳まれたタンパクのフラクションにおける放射活性を、Ａ2は後期に正確に折り畳まれたタンパクのフラクションにおける放射活性を表す］
として計算することができる。
上記の変性手段に加えて、変性は、液相のｐＨを減少させるかまたは増加させることによっても達成または増強することができる。
復元に用いられる液相の極性は、この発明によれば、塩、ポリマーおよび／またはヒドロフルオロ化合物（トリフルオロエタノールなど）の添加により修飾される。
この発明によれば、ポリペプチド分子の変性および復元は、ポリペプチド分子が暴露される物理的パラメーター（温度、圧力など）における直接の変化によっても達成することができ、またはこれらの方策は、上記の他の方策に起因する変性や復元を増強または緩和するのに用いることができる。
しかし、この方法の非常に重要な実際的具体例は、変性溶液（denaturing solution）Ｂと復元溶液（renaturing solution）Ａとの間の変化による液相における化学的変化を生じさせることにより行われることが理解されるであろう。この場合には、Ｂにおける１以上の変性作用をもつ化合物の濃度は、しばしば各周期後に調整され、１つの重要な例では、Ｂにおける１以上の変性作用をもつ化合物の濃度は各周期後に減衰し、別の重要な具体例では、媒体Ｂにおける１以上の変性作用をもつ化合物の濃度は、各周期において一様に保たれる。
媒体Ｂにおける変性作用をもつ化合物の濃度が一様に保たれるこの発明の具体例は、（正確に折り畳まれたタンパクに関する）循環工程の最も生産的な相が同定され、正確に折り畳まれたタンパクの大規模生産が望まれる場合に特に興味深い、この具体例の媒体Ｂにおける変性作用をもつ化合物の好ましい濃度は、この発明による循環工程において最大の生産性が確保されるために決定された濃度であることが理解されるであろう。
この発明の方法に付される集合体のポリペプチド分子は、アミノ酸残基少なくとも25個、例えば少なくとも30個または少なくとも50個の長さを通常有している。一方、集合体のポリペプチド分子は、アミノ酸残基最大5000個、例えば最大2000個または1000個または800個の長さを通常有している。
実施例１０から分かるように、この発明の方法は、正しく折り畳まれたジアボディー（diabody）分子（ジアボディーは、Holliger et al.，1993に記載されている）の産生を可能にした。
従って、この発明の重要な観点は、ジアボディー分子の単量体フラグメントのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する折り畳まれてないポリペプチドおよび／または誤って折り畳まれたポリペプチドからなるポリペプチド分子の初期集合体を、一連の
１）集合体のポリペプチド分子に変性作用を及ぼす条件を伴う少なくとも１つの変性工程と、それに続く
２）上述の工程から生じる立体配座を有するポリペプチド分子に対する変性作用を有する条件を伴う少なくとも１つの復元工程
からなる少なくとも２つの連続した周期の系列に付すことからなり、ポリペプチド分子の初期集合体の実質的なフラクションが正しく折り畳まれたジアボディー分子のフラクションに変換されるように周期の系列が適合されている、正しく折り畳まれたジアボディー分子を産生する方法に関する。
ジアボディーを正しく折り畳むこのような方法は、上記のシナリオおよびこの発明の再生方法の観点のいずれにおいても、すなわち、循環計画のみならず物理的／化学的条件の選択に関して認められる。しかし、ジアボディーを正しく折り畳む方法の重要な観点は、ポリペプチド分子が、少なくとも１つの変性工程または復元工程におけるジスルフィド再編成システムを含有する液相に接触している上記の方法である。こうした液相に用いられる好ましい変性剤は尿素であり、好ましいジスルフィド再編成システムは、主要な還元剤としてのグルタチオンからなる。
この発明の特別な観点は、セリンプロテアーゼのプロ酵素であるが天然に生じるあらゆるセリンプロテアーゼとは異なり、特にウシ凝固因子Ｘ｛タンパク同定源（resource）(Protein Identification Resource)（PIR）、National Biomedical Research Foundation，Georgetown University，Medical Center，U.S.A.，entry: P1; EXBO｝のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、かつポリペプチドを切断して新しいＮ−末端残基を遊離させる物質を含む非変性緩衝液中でポリペプチドの溶液をインキュベートすることによってタンパク分解作用により活性化されて活性セリンプロテアーゼを生成することができ、さらにそのセリンプロテアーゼの基質特異性が、50ｍＭのトリス、100ｍＭの塩化ナトリウムおよび１ｍＭの塩化カルシウムを含む緩衝液中で20℃、ｐＨ＝８における基質ＩおよびＩＩＩ：
Ｉ： ベンゾイル−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−パラニトロアニリド、
ＩＩＩ： トシル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−パラニトロアニリド、
の各々に対する切断速度ｋと、基質
Ｖ： ベンゾイル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−パラニトロアニリド
に対する切断速度との間の各々の割合ｋ（Ｉ）／ｋ（Ｖ）およびｋ（ＩＩＩ）／ｋ（Ｖ）が、実質的に混入しているプロテアーゼを含まないウシ凝固因子Ｘaについて定量される対応する割合と同一かまたはそれより引くことによって評価されるように、ウシの血液凝固因子Ｘaの基質特異性と同一かまたはそれより良好であるポリペプチドに関する。
セリンプロテアーゼとしての上記の新規なポリペプチドの特徴は、用語「セリンプロテアーゼ」の通常の名称の使用に基づいている。当該技術において公知のように、セリンプロテアーゼは、ヒスチジン残基と並ぶ活性部位セリンからなる触媒システムを有すると信じられている酵素である。酵素の対応するプロ酵素からの活性化は、アミノ基が、ペプチド構造内に再配置されて活性部位セリン残基に先立つアスパラギン酸残基に対する塩架橋を形成し、それによってセリンプロテアーゼの触媒部位特性を形成することができる新規なＮ−末端残基の遊離に基づいている。
上記定義の「人工」セリンプロテアーゼは、タンパク、折り畳まれた大きなタンパクでさえも選択的に切断する切断手段を有することが決定的に重要であるこの発明の方法およびその他の方法に用いられる著しく重要なペプチド切断手段である。ウシ凝固因子Ｘaと同様に、活性化された形態にある上記定義の人工セリンプロテアーゼは、配列番号38の切断を行うポリペプチドセグメントを選択的に認識することができるが、ウシ凝固因子Ｘaとは対照的に、それらは、組換えＤＮＡ技術を用いて容易に産生することができるアミノ酸配列で作ることができる。このように、この発明の好ましい人工セリンプロテアーゼは、特に原核細胞、例えば大腸菌において組換えＤＮＡ技術によって合成することができるアミノ酸配列を有するものである。以下のディスカッションと実施例から明らかになるように、この発明の人工セリンプロテアーゼは、原核生物中で産生される場合、この発明の方法による循環により、触媒的に活性なドメインが適切に露出している酵素的に活性な立体配座を与えることができる。
人工セリンプロテアーゼの選択性に関する定量試験には、20℃での時間に対する405nm（遊離のパラニトロアニリンの吸収極大）での光吸収の曲線の初期傾斜として決定される切断速度ｋの決定が含まれる。
定量的に発現した場合には、人工セリンプロテアーゼの選択性（selectivity）は、最大0.06のｋ（Ｉ）／ｋ（Ｖ）値、最大0.5のｋ（ＩＩＩ）／ｋ（Ｖ）値により特徴づけられるべきである。ｋ（Ｉ）／ｋ（Ｖ）値が最大0.05であり、ｋ（ＩＩＩ）／ｋ（Ｖ）値が最大0.4であるのが好ましく、ｋ（Ｉ）／ｋ（Ｖ）値が最大0.04であり、ｋ（ＩＩＩ）／ｋ（Ｖ）値が最大0.15であるのが最も好ましい。
より理解し易く特異性を特徴づけるのにさらなるモデル基質を用いる。従って、基質特異性は、50ｍＭのトリス、100ｍＭの塩化ナトリウムおよび１ｍＭの塩化カルシウムからなる緩衝液中で20℃、ｐＨ＝８における基質Ｉ−ＩＶ：
Ｉ： ベンゾイル−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−パラニトロアニリド、
ＩＩ： トシル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−パラニトロアニリド、
ＩＩＩ： トシル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−パラニトロアニリド、
ＩＶ： （ｄ，１）Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−パラニトロアニリド
の各々に対する切断速度ｋと、基質
Ｖ： ベンゾイル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−パラニトロアニリド
に対する切断速度との間の各々の割合ｋ（Ｉ）／ｋ（Ｖ）、ｋ（ＩＩ）／ｋ（Ｖ）、ｋ（ＩＩＩ）／ｋ（Ｖ）およびｋ（ＩＶ）／ｋ（Ｖ）(これらの割合は、実質的に混入しているプロテアーゼを含まないウシ凝固因子Ｘaについて測定される対応する割合と同一かまたはそれより低い）により、ウシ血液凝固因子Ｘaの基質特異性と同一かまたはそれより良好であると評価することができる。
こうして特徴づけた範囲内では、ｋ（Ｉ）／ｋ（Ｖ）は最大0.06、ｋ（ＩＩ）／ｋ（Ｖ）は最大0.03、ｋ（ＩＩＩ）／ｋ（Ｖ）は最大0.5およびｋ（ＩＶ）／ｋ(Ｖ)は最大0.01であるべきであり、ｋ（Ｉ）／ｋ（Ｖ）が最大0.05、ｋ（ＩＩ）／ｋ（Ｖ）が最大0.025、ｋ（ＩＩ）／ｋ（Ｖ）が最大0.4およびｋ（ＩＶ）／ｋ（Ｖ）が最大0.008であるのが好ましく、ｋ（Ｉ）／ｋ（Ｖ）が最大0.04、ｋ（ＩＩ）／ｋ（Ｖ）が最大0.015、ｋ（ＩＩＩ）／ｋ(Ｖ)が最大0.15およびｋ（ＩＶ）／ｋ（Ｖ）が最大0.005であるのがより好ましい。
上記定義のセリンプロテアーゼタイプのポリペプチドは、通常、最大70000、最小15000の分子量Ｍrを有するであろう。
この発明によるこうした新規な１つのポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸を有しており、その類似体かつ／または相同体である。この発明のポリペプチドの他の重要な具体例は、配列番号２のサブ配列またはそのようなサブ配列の類似体および／または同族体であるアミノ酸配列を有する。
用語「ＤＮＡ配列によりエンコードされたポリペプチドの類似体」または「アミノ酸配列を有するポリペプチドの類似体」は、上記試験におけるウシ凝固因子Ｘaとして作用することが可能ないずれかのポリペプチドを意味する。従って、実施例に記載の人工セリンプロテアーゼに比べ、アミノ酸組成または翻訳後修飾（例えばグリコシル化またはリン酸化）がある程度異なる、異なる哺乳動物もしくは脊椎動物のような異なる源からのポリペプチドも含まれる。
従って、用語「類似体」は、この明細書では、アミノ酸配列を変える重要でない変化、例えば余分のアミノ酸（extra amino acid）の欠失、部位特異的突然変異、挿入またはそれら組み合わせにより人工セリンプロテアーゼ類似体を生じる、実施例５に記載の人工セリンプロテアーゼ由来の配列番号２の特徴的なアミノ酸配列と類似したアミノ酸組成もしくは配列を有するタンパクまたはポリペプチドを示すのに用いられる。
従って、この明細書および請求の範囲では、（ポリペプチドの）類似体は、上記から評価することができるように、上記の特異性を有する酵素活性が保持されるという条件で、１個または数個のアミノ酸が欠失もしくは交換されかつ／またはアミノ酸が導入されているポリペプチドの変異を示している。
相同性に関しては、この発明によるポリペプチドの類似体は、最大50個のアミノ酸残基の欠失および／または挿入を生じ、配列番号２のフラグメントの配列に比べて、ポリペプチドレベルで少なくとも60％の同一性の配列相同性を有するであろう。
配列番号１のこの発明のＤＮＡ配列もしくはその類似体および／または同族体によりエンコードされる配列番号２で示されるポリペプチドに対して少なくとも60％の相同性を有するこうしたポリペプチド配列もしくはその類似体は、この発明の重要な具体例である。
用語「配列相同性」は、アミノ酸配列の２つ以上のアミノ酸のセグメントにおけるアミノ酸、もしくはヌクレオチド配列の２つ以上のヌクレオチドのセグメントにおけるヌクレオチドのいずれかの配列における同一性を意味する。従って、ポリペプチドに関しては、この用語は、ポリペプチドのアミノ酸の同一性および位置に関する釣り合わせにおいて、相同性が確立される問題のアミノ酸間の相同性を意味する。
従って、用語「相同な」は、所定のポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号２において示されるアミノ酸配列との間の同一性の程度を示すのにここでは用いられている。配列番号２において示されるアミノ酸配列に比較されるアミノ酸配列は、例えば以下に定義されたハイブリッド形成により得られるＤＮＡやＲＮＡ配列のようなヌクレオチド配列から導き出すか、もしくは従来のアミノ酸配列決定法により得ることができる。
別の具体例は、20個のアミノ酸の連続した糸（string）が、配列番号２において示されるアミノ酸配列から選択される同一の長さのアミノ酸の糸と少なくとも40％相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。
この発明による１つのセリンプロテアーゼポリペプチドは、配列番号２、残基82〜484のアミノ酸配列を有するか、もしくはその類似体および／または同族体である。この発明による別のセリンプロテアーゼポリペプチドは、配列番号２、残基166〜484のアミノ酸配列を有するか、もしくはその類似体および／または同族体である。
ここに示される多数の配列の修飾は、特に興味深い：配列番号２における好ましくはＧｌｙ、ＳｅｒまたはＡｒｇへのシステイン残基245の交換と組み合わされた、配列番号２における残基230〜233の代わりの配列番号38または配列番号40〜42の切断を行う配列の挿入。別の興味深い可能性は、配列番号２における残基179〜182の代わりの配列番号38、または配列番号40〜42の挿入である。非常に一般的には、上記定義の人工セリンプロテアーゼのいずれかにおいて、配列番号２における残基230〜233に対応する切断配列を、上記定義の切断を行う配列の１つに置き換えることにより、この発明の方法に用いられる非常に有用な切断酵素が生じるであろう。この切断酵素は、ウシ凝固因子Ｘaの特異的酵素活性を有する酵素、従って上記の人工セリンプロテアーゼ（同一の分子を含む）により選択的かつ非常に効率的に切断されることができる。これは、切断されかつ活性化される最初の分子が他の分子を切断しそれによって連鎖反応を開始することができるので、特異的な切断される配列のこうした挿入により修飾される人工セリンプロテアーゼが、非常に効率的に活性化されることを意味する。
上記のように、人工セリンプロテアーゼが組換えＤＮＡ技術により産生されうることは、非常に重要な特徴であり、従ってこの発明の別の重要な具体例は、上記のようにポリペプチドをエンコードすることができる核酸フラグメント、特に上記のように人工セリンプロテアーゼポリペプチドをエンコードすることができるＤＮＡフラグメントに関する。
その観点の１つにおいて、この発明は、上記定義のこの発明のポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列に関する。特に、この発明は、配列番号１において示されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列、もしくは配列番号１において示されるＤＮＡ配列のいずれかに対して少なくとも60％の相同性を有し、かつ／または配列番号２において示されるアミノ酸配列に対して少なくとも60％相同であるポリペプチドをエンコードする、それらの類似体に関する。
一般的には、内部の相同性を決定するためにヌクレオチド配列を比較する場合、コード領域だけが用いられる。
この発明のＤＮＡフラグメントに関する用語「類似体」は、この発明のＤＮＡフラグメントによりエンコードされるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一であるポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を示している。同一のアミノ酸が種々のコドンによりエンコードされ、コドンの用途がとりわけヌクレオチド配列を発現する問題の生物体の優先に関することは、公知である。従って、この発明のＤＮＡセグメントの１個以上のヌクレオチドまたはコドンは、発現する問題のＤＮＡフラグメントによりエンコードされるポリペプチドに同一もしくは実質的に同一であるポリペプチドを作る他のものに交換することができる。
さらに、用語「類似体」は１個以上のヌクレオチドの置換、挿入(イントロンを含む）、付加および再配置のような配列の変異（ＤＮＡフラグメントによりエンコードされるポリペプチドに実施的に影響を及ぼさない）が与えられていることを意図している。
従って、少なくとも１個のヌクレオチドが置換、付加、挿入、欠失および／または再配置された、配列番号１において示されるＤＮＡ配列と異なる修飾されたヌクレオチド配列は、この発明の範囲内に含まれる。
用語「置換」は、完全なヌクレオチド配列における１個以上のヌクレオチドを１個以上の異なるヌクレオチドで置き換えることを意味し、「付加」は、完全なヌクレオチド配列のいずれかの末端に１つ以上のヌクレオチドを付加することを意味し、「挿入」は、完全なヌクレオチド配列内に１個以上のヌクレオチドを導入することを意味し、「欠失」は、１個以上のヌクレオチドが、配列のいずれかの末端においてまたはその内部のいずれかの適切な位置において、完全なヌクレオチド配列から欠失されていることを意味し、「再配置」は、２個以上のヌクレオチド残基がＤＮＡまたはポリペプチド配列内で交換されていることを意味している。しかし、ＤＮＡフラグメントは、生物にそれを挿入する前もしくは後のいずれかに突然変異誘発により修飾されてもよい。この発明のＤＮＡまたはタンパク配列は、生物物理学的、生化学的または生物学的特性のいずれか、またはこのような特性（１つおよび／または全部）の一部分もしくはこのような特性（１つおよび／または全部）の全てを失わないような方法で修飾されてもよい。
この発明のＤＮＡ配列の特異的類似体の例としては、配列番号１において示されかつ特に大腸菌内での発現に適合されたＤＮＡ配列からなるＤＮＡ配列が挙げられる。このＤＮＡ配列は、適切な調節配列と共に大腸菌内に挿入されると、配列番号２において示されるアミノ酸配列を実質的に有するポリペプチドを発現するものである。従って、このＤＮＡ配列は、大腸菌により認識される特異的コドンからなる。
この発明によるフラグメント、配列、同族体および類似体に関する、この明細書および請求の範囲に用いれている用語「フラグメント」、「配列」、「同族体」および「類似体」は、その自然環境におけるこれらの現象からなるものとしてではなくむしろ例えば試験管内で単離された形態、精製された形態、または組換えの形態におけるこれらの現象からなるものとして当然理解されるべきである。
この発明による核酸フラグメントの１つの具体例は、少なくとも60％の解読三連符が、ウシ凝固因子Ｘをエンコードする核酸の核酸フラグメントと同一でアミノ酸をエンコードし、最大150個のヌクレオチドの挿入および／または欠失を与える上記定義の核酸フラグメントである。こうした核酸フラグメントの例としては、配列番号１、ヌクレオチド76〜1527、およびそれらの類似体および／または同族体が挙げられる。別の例は、配列番号１、ヌクレオチド319〜1527、およびそれらの類似体および／または同族体である。さらに別の例は、配列番号１、ヌクレオチド571〜1527、およびそれらの類似体および／または同族体である。
上記されかつこの発明の重要な観点を構成するＤＮＡフラグメントは、ゲノムＤＮＡから直接に得るか、またはｍＲＮＡを単離し逆転写酵素を用いて対応するＤＮＡ配列に変換し、それによってｃＤＮＡを産生することによって得ることができる。ＤＮＡフラグメントをゲノムＤＮＡから得る場合、ＤＮＡフラグメントは、当該分野における当業者に公知のゲノム配列のスクリーニングにより直接的に誘導される。それは、この発明の配列の知識、または精製されたセリンプロテアーゼのアミノ酸配列決定法により得られる配列情報に基づいて設計されるＤＮＡプローブに対するハイブリッド形成により達成することができる。ＤＮＡが相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）起源のものであれば、それは、人工セリンプロテアーゼを含有する細胞からのｍＲＮＡを用いるｃＤＮＡライブラリー（cDNA library）を作成することにより得ることができる。ハイブリッド形成は、ｃＤＮＡ配列の知識、または精製された人工セリンプロテアーゼのアミノ酸配列により得られる配列情報に基づいて設計されるＤＮＡプローブにより達成することができる。
この発明のＤＮＡフラグメントもしくはこの発明のその類似体および／または同族体は、それをベクターと融合させ、その複合体を適切な微生物または哺乳類の細胞系に挿入することにより複製することができる。もしくは、ＤＮＡフラグメントは、化学合成を用いて製造することができる。また、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）プライマーは、配列番号１において示されるヌクレオチド配列に基づいて合成することができる。次いで、これらのプライマーは、人工セリンプロテアーゼポリペプチドをエンコードする配列の全体または一部を増幅するのに用いることができる。
この発明の適切なポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術を用いて産生することができる。より特別には、ポリペプチドは、該ＤＮＡフラグメントの発現に導く条件下においてこの発明の配列番号１において示されるＤＮＡ配列またはその類似体および／または同族体を担持する生物を培養または増殖（breed）させ、ついでこの発現したポリペプチドを該生物から回収することからなる方法により産生することができる。
ポリペプチドの産生に用いられる生物は、動物のような高等生物、または微生物のような下等生物であってもよい。用いる生物のタイプとは無関係に、（上記の）この発明のＤＮＡフラグメントは、直接的にまたは適切なベクターの助けを借りるかのいずれかにより、生物に導入されるべきである。また、ポリペプチドは、直接的にまたは発現ベクターの助けを借りるかのいずれかにより、この発明のＤＮＡフラグメント、もしくはその類似体および／または同族体を導入することにより、哺乳動物の細胞系中で産生することができる。
この発明のＤＮＡフラグメントはまた、適切な安定な発現ベクター中にクローン化し、次いで適切な細胞系中に入れることもできる。次いで、所望のポリペプチドを発現する細胞を、用いるベクターと細胞系に対する適切な条件を用いて選択する。次いで、選択された細胞を、さらに増殖し、所望のポリペプチドの非常に重要かつ連続した源を形成する。
このように、この発明の別の観点は、上記定義の核酸フラグメントからなりかつ上記記定義の人工セリンプロテアーゼポリペプチドをエンコードする発現系に関し、その系は、該核酸フラグメントの発現を仲介することのできる５’−フランキング配列からなる。発現系は、核酸フランキングを担持する複製可能な発現ベクター（宿主生物または細胞系中で複製することができる）であることができる。ベクターは、例えばプラスミド、ファージ、コスミド、ミニ染色体またはウイルスであってもよく、ベクターは、宿主細胞中に導入されるとき宿主細胞ゲノムに組込まれるものであってもよい。
この発明の別の観点は、上記定義の核酸フラグメントを担持しかつそれを複製することができる生物に関する。生物は、微生物（例えばバクテリア、酵母、原生動物）、または多細胞生物由来の細胞（例えばカビ、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞）または細胞系であることができる。特に興味深い宿主生物は、エシエリヒア（Escherichia)、バシラス（Bachillus）またはサルモネラ（Salmonella）種の細菌ような微生物である。
この発明のさらに別の観点は、以下の工程
１ 上記定義の核酸フラグメントを発現ベクターに挿入し、
２ 上記の宿主生物を、工程ａで産生されたベクターを用いて形質転換し、
３ 工程ｂで産生した宿主生物を培養してポリペプチドを発現させ、
４ ポリペプチドを収集し、
５ 任意に、ポリペプチドを翻訳後修飾に付し、
６ 必要ならば、ポリペプチドをこの発明の変性／復元循環方法に付し、
７ 任意に、ポリペプチドを、上記定義の真正ポリペプチドを得るためにさらなる修飾に付すこと
からなる、上記のセリンプロテアーゼポリペプチドを産生する方法に関する。
ポリペプチドのさらなる修飾は、例えば、ポリペプチドをカルボキシペプチダーゼＡまたはＢに付すことによって達成することができ、それによって選択されたアミノ酸残基は、ポリペプチド分子のＣ−末端から除去することができる。これは、真正ポリペプチド分子の最適折り畳みが、Ｎ−末端がフリーであり従って切断されるポリペプチド（例えば配列番号37）が真正のポリペプチドのＣ−末端に配置される場合にのみ達成されるという情況下で望ましい。公知のように、カルボキシペプチダーゼＢは、Ｃ−末端から連続的に切断を行い、塩基性アミノ酸を切断するだけであり、一方カルボキシペプチダーゼＡは、非塩基性アミノ酸を切断する。どの残基を、真正のアミノ酸のＣ−末端に隣接させるかを注意深く設計することにより、真正ポリペプチドを除く全てがカルボキシペプチダーゼにより切断されることを保証することが可能である。真正ポリペプチドのＣ−末端が塩基性アミノ酸残基である場合には、除去するＣ−末端結合残基が非塩性であることを保証すべきであり、その逆もまた同じである。Ｃ−末端から真正のポリペプチドのＣ−末端までのアミノ酸残基の配列が知られている場合には、裸の真正ポリペプチドのみが残るまで２つのカルボキシペプチダーゼを用いた処理の間で交替することができる。実際上の具体例では、固定化されたカルボキシペプチダーゼが用いられる。
産生されたポリペプチドは、固定化されたポリペプチドまたは該ポリペプチドと反応する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーおよび／または他のクロマトグラフ手段および電気永動手段のような１つ以上の工程からなる方法により単離することができる。
また、この発明のポリペプチドは、ポリペプチド配列の個々のアミノ酸の連続的なカップリングを利用した公知の液相または固相のペプチド合成法により作成することもできることが理解されるであろう。また、ポリペプチドは、所望のポリペプチドが得られるように、後にカップリングされるポリペプチド配列のフラグメントを形成する個々のアミノ酸をカップリングすることにより合成することができる。従ってこれらの方法は、この発明の別の興味深い観点を構成する。
この発明は、配列番号38、配列番号40、配列番号41および配列番号42からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、ウシ凝固因子Ｘaの切断部位でポリペプチドを切断するための上記定義の人工セリンプロテアーゼポリペプチドの用途、および、配列番号43、配列番号44、配列番号45および配列番号46の群から選択されるアミノ酸配列の修飾されたもの（上記でさらに説明されているような切断可能な形態に変換されている）を有する、ウシ凝固因子Ｘaの切断部位でポリペプチドを切断するための上記定義の人工セリンプロテアーゼポリペプチドの用途に関する。
図面の説明
図１：周期的な変性／復元の時間計画を表す略図。
溶媒の組成は、非変性「緩衝液Ａ」と変性「緩衝液Ｂ」との２成分の混合液を緩衝液Ｂの相対的割合で表わされている。連続する３周期が表わされ、各周期は復元相「Ｆ」と変性相「Ｄ」からなっている。連続する周期の変性相における溶媒混合物の変性力のレベルの変化は「Ｋ」で表されている。
図２：発現プラスミドｐＴ7Ｈ6ＦＸ−ｈβ２ｍおよびｐＴ7Ｈ6ＦＸ−ｍβ２ｍの構成。
ＦＸa切断部位（配列番号37）をエンコードするヌクレオチド配列と５’末端で融合している、アミノ酸残基Ｉｌｅ1からＭｅｔ99までのヒトおよびマウスのβ2−ミクログロブリンの読み取り枠を含む増幅ＤＮＡフラグメントを、制限エンドンヌクレアーゼBam HIおよびHind III（Boehringer，Germanyより購入）を用いて切断し、標準手順を用いてＴ4ＤＮＡリガーゼ（Boehringer，Germanyより購入）によってBam HIおよびHind III切断ｐＴ7Ｈ6に結合した。
図３：ヒトおよびマウスのβ2−ミクログロブリンのアミノ酸配列。
Ａ：ヒトβ2−ミクログロブリン（配列番号４９）をエンコードする完全長の読み取り枠の予測アミノ酸配列。処理された成熟タンパク中のアミノ酸残基（Ｉｌｅ）が示されている。Ｂ：マウスβ2−ミクログロブリン（配列番号５０）をエンコードする完全長の読み取り枠の予測アミノ酸配列。処理された成熟タンパク中のアミノ酸残基（Ｉｌｅ）が示されている。
図４：発現プラスミドｐＴ7Ｈ6ＦＸ−ｈＧＨの構築。
ＦＸa切断部位ＩＥＧＲ（配列番号３８）をエンコードするヌクレオチド配列と５’末端で融合している、アミノ酸残基Ｐｈｅ1からＰｈｅ191までのヒト成長ホルモンの読み取り枠を含む増幅ＤＮＡフラグメントを、制限エンドンヌクレアーゼBam HIおよびHind III（Boehringer，Germanyより購入）を用いて切断し、標準手順を用いてＴ2ＤＮＡリガーゼ（Boehringer，Germanyより購入）によってBam HIおよびHind III切断ｐＴ7Ｈ6に結合した。
図５：ヒト成長ホルモン（ソマトトロピン）のアミノ酸配列。
ヒト成長ホルモン（配列番号５１）をエンコードする完全長の読み取り枠の予測アミノ酸配列。処理された成熟タンパクの最初のアミノ酸残基（Ｐｈｅ1）が示されている。
図６：ヒトα2−マクログロブリン受容体タンパク（α2ＭＲ）（配列番号５２）のアミノ酸残基番号２０（Ａｌａ）から１０９（Ａｒｇ）まで、アミノ酸残基番号２０（Ａｌａ）から１９０（Ａｌａ）まで、およびアミノ酸残基番号２０（Ａｌａ）から５２１（Ｌｙｓ）までを発現するプラスミドｐＴ7Ｈ6ＦＸ−＃１、＃２および＃３の構成。
＃１：アミノ酸残基番号２０（Ａｌａ）から１０９（Ａｒｇ）まで、＃２：アミノ酸残基番号２０（Ａｌａ）から１９０（Ａｌａ）まで、および＃３：アミノ酸残基番号２０（Ａｌａ）から５２０（Ｌｙｓ）までのα2ＭＲの読み取り枠に由来し、ＦＸa切断部位ＩＥＧＲ（配列番号３８）をエンコードするヌクレオチド配列と５’末端で融合している増幅ＤＮＡフラグメントを、制限エンドンヌクレアーゼBam HIおよびHind III（Boehringer，Germanyより購入）を用いて切断し、標準手順を用いてＴ4ＤＮＡリガーゼ（Boehringer，Germanyより購入）によってBam HIおよびHind III切断ｐＴ7Ｈ6に結合した。
図７：ヒトα2−マクログロブリン受容体タンパク（α2ＭＲ）（配列番号５２）のアミノ酸残基番号８０３（Ｇｌｙ）から１２６５（Ａｓｐ）まで、アミノ酸残基番号８４９（Ｖａｌ）から１１８４（Ｇｌｎ）まで、およびアミノ酸残基番号１１８４（Ｇｌｎ）から１５８２（Ｌｙｓ）までを発現するプラスミドｐＬｃＩＩＭＬＣＨ6ＦＸ−＃４、＃５および＃６の構成。
＃４：アミノ酸残基番号８０３（Ｇｌｙ）から１２６５（Ａｓｐ）まで、＃５：アミノ酸残基番号８４９（Ｖａｌ）から１１８４（Ｇｌｎ）まで、および＃６：アミノ酸残基番号１１８４（Ｇｌｎ）から１５８２（Ｌｙｓ）までのα2ＭＲの読み取り枠に由来し、ＦＸa切断部位ＩＥＧＲ（配列番号３８）をエンコードするヌクレオチド配列と５’末端で融合している増幅ＤＮＡフラグメントを、制限エンドンヌクレアーゼBam HIおよびHind III（Boehringer，Germanyより購入）を用いて切断し、標準手順を用いてＴ4ＤＮＡリガーゼ（Boehringer，Germanyより購入）によってBam HIおよびHind III切断ｐＬｃＩＩＭＬＣＨ6ＦＸに結合した。
図８：ヒトα2−マクログロブリン受容体タンパク（α2ＭＲ）（配列番号５２）のアミノ酸残基番号８０３（Ｇｌｙ）から１５８２（Ｌｙｓ）まで、アミノ酸残基番号２５１９（Ａｌａ）から２９４１（Ｉｌｅ）まで、およびアミノ酸残基番号３３３１（Ｖａｌ）から３７７８（Ｉｌｅ）までを発現するプラスミドｐＬｃＩＩＭＬＣＨ6ＦＸ−＃７、＃８および＃９の構成。
＃７：アミノ酸残基番号８０３（Ｇｌｙ）から１５８２（Ｌｙｓ）まで、＃８：アミノ酸残基番号２５１９（Ａｌａ）から２９４１（Ｉｌｅ）まで、および＃９：アミノ酸残基番号３３３１（Ｖａｌ）から３７７８（Ｉｌｅ）までのα2ＭＲの読み取り枠に由来し、ＦＸa切断部位ＩＥＧＲ（配列番号３８）をエンコードするヌクレオチド配列と５’末端で融合している増幅ＤＮＡフラグメントを、制限エンドンヌクレアーゼBam HIおよびHind III（Boehringer，Germanyより購入）を用いて切断し、標準手順を用いてＴ4ＤＮＡリガーゼ（Boehringer，Germanyより購入）によってBam HIおよびHind III切断ｐＬｃＩＩＭＬＣＨ6ＦＸに結合した。
図９ａおよび９ｂ：ヒトα2−マクログロブリン受容体タンパク（α2ＭＲ）（配列番号５２）のアミノ酸配列。
α2ＭＲをエンコードする完全長読み取り枠の予測アミノ酸配列。組換えタンパク中にＮ−またはＣ−末端として存在するアミノ酸残基は、α2ＭＲ配列上の番号によって同定されている。
図１０：発現プラスミドｐＬｃＩＩＭＬＣＨ6ＦＸ−ＦＸΔγの構成。
ＦＸa切断部位ＩＥＧＲ（配列番号３８）をエンコードするヌクレオチド配列と５’末端で融合している、アミノ酸残基Ｓｅｒ82からＴｒｐ484までのウシ血液凝固因子Ｘの読み取り枠を含む増幅ＤＮＡフラグメントを、制限エンドンヌクレアーゼBam HIおよびHind III（Boehringer，Germanyより購入）を用いて切断し、標準手順を用いてＴ4ＤＮＡリガーゼ（Boehringer，Germanyより購入）によってBam HIおよびHind III切断ｐＬｃＩＩＭＬＣＨ6ＦＸに結合した。
図１１：ウシ血液凝固因子Ｘ（ＦＸ）のアミノ酸配列。
ウシＦＸ（配列番号５３）をエンコードする完全長読み取り枠の予測アミノ酸配列。ＦＸΔγ構築物のＮ−末端のアミノ酸残基Ｓｅｒ82およびＣ−末端の残基Ｔｒｐ484が同定されている。
図１２：発現プラスミドｐＬｃＩＩＭＬＣＨ6ＦＸ−Ｋ１の構成。
ＦＸa切断部位ＩＥＧＲ（配列番号３８）をエンコードするヌクレオチド配列と５’末端で融合している、アミノ酸残基Ｓｅｒ82からＧｌｕ162（「Ｇｌｕ」−プラスミノーゲンにおけるような番号づけ）までのヒトプラスミノーゲンクリングル１（Ｋ１）の読み取り枠を含む増幅ＤＮＡフラグメントを、制限エンドンヌクレアーゼBam HIおよびHind III（Boehringer，Germanyより購入）を用いて切断し、標準手順を用いてＴ4ＤＮＡリガーゼ（Boehringer，Germanyより購入）によってBam HIおよびHind III切断ｐＬｃＩＩＭＬＣＨ6ＦＸに結合した。
図１３：発現プラスミドｐＬｃＩＩＨ6ＦＸ−Ｋ４の構成。
ＦＸa切断部位ＩＥＧＲ（配列番号３８）をエンコードするヌクレオチド配列と５’末端で融合している、アミノ酸残基Ｖａｌ354からＡｌａ439（「Ｇｌｕ」−プラスミノーゲンにおけるような番号づけ）までのヒトプラスミノーゲンクリングル４（Ｋ４）の読み取り枠を含む増幅ＤＮＡフラグメントを、制限エンドンヌクレアーゼBam HIおよびHind III（Boehringer，Germanyより購入）を用いて切断し、標準手順を用いてＴ4ＤＮＡリガーゼ（Boehringer，Germanyより購入）によってBam HIおよびHind III切断ｐＬｃＩＩＨ6ＦＸに結合した。
図１４：ヒト「Ｇｌｕ」−プラスミノーゲン（配列番号５４）のアミノ酸配列。Ｋ１およびＫ２構築物中のＮ−末端およびＣ−末端のアミノ酸残基が配列中の番号によって同定されている。
図１５：組換えヒトβ2−ミクログロブリンの産生および試験管内折り畳みのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
レーン１：Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムにアプライする前の粗タンパク抽出物（還元サンプル）。
レーン２：粗タンパク抽出物をＮｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムにアプライしている間のカラムのフロー／スルー（flow-through）（還元サンプル）。
レーン３：周期的な折り畳み工程の後に非変性溶離緩衝液を用いてＮｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムから溶離したヒトβ2−ミクログロブリン（還元サンプル）。
レーン４：タンパクマーカー(Pharmacia，Sweden)：ゲルの上から；９４ｋＤａ，６７ｋＤａ，４３ｋＤａ，３０ｋＤａ，２０．１ｋＤａおよび１４．４ｋＤａ（還元サンプル）。
レーン５：レーン３と同じ（非還元サンプル）。
レーン６：ＦＸa切断および最終精製後の組換えヒトβ2−ミクログロブリン（非還元サンプル）。
図１６：組換えヒト成長ホルモン；ｈＧＨ（ソマトトロピン）の試験管内折り畳みにおけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
レーン１：タンパクマーカー(Pharmacia，Sweden)：ゲルの上から；９４ｋＤａ，６７ｋＤａ，４３ｋＤａ，３０ｋＤａ，２０．１ｋＤａおよび１４．４ｋＤａ（還元サンプル）。
レーン２：周期的な折り畳み工程の後に非変性溶離緩衝液によってＮｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムから溶離されたヒトｈＧＨ（非還元サンプル）。
レーン３：周期的な折り畳み工程の後に折り畳み工程からの変性溶離緩衝液ＢによってＮｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムから溶離されたヒトｈＧＨ（非還元サンプル）。
レーン４−１８：周期的な折り畳み工程の後にＱ−セファロース（Pharamacia，Sweden）を用いたイオン交換クロマトグラフィーよって、単量体ｈＧＨ融合タンパクを二量体および多量体融合タンパクから分離する間に集められたフラクション。単量体タンパクは、二量体および多量体タンパクを含むピークとは完全に分離したピークとして溶離された（非還元サンプル）。
図１７：ヒトプラスミノーゲンからの組換えクリングル１と４、およびヒトα2−マクログロブリン受容体タンパク（α2ＭＲ）由来の組換え融合タンパク＃４の試験管内折り畳みのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
レーン１：タンパクマーカー(Pharmacia，Sweden)：ゲルの上から；９４ｋＤａ，６７ｋＤａ，４３ｋＤａ，３０ｋＤａ，２０．１ｋＤａおよび１４．４ｋＤａ（還元サンプル）。
レーン２：Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムにアプライする前の粗Ｋ１−融合タンパク抽出物（還元サンプル）。
レーン３：周期的な折り畳み工程の後に非変性溶離緩衝液によってＮｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムから溶離されたＫ１−融合タンパク（還元サンプル）。
レーン４：レーン３と同じ（非還元サンプル）。
レーン５：Ｋ１−融合タンパクをアプライしている間のリジン−アガロースカラムからのフロースルー（非還元サンプル）。
レーン６：リジンアガロースカラムから溶離されたＫ１−融合タンパク（非還元サンプル）。
レーン７：周期的な折り畳み工程の後に非変性溶離緩衝液によってＮｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムから溶離されたＫ４−融合タンパク（還元サンプル）。
レーン８：レーン７と同じ（非還元サンプル）。
レーン９：周期的な折り畳み工程の後に非変性溶離緩衝液によってＮｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムから溶離されたα2ＭＲ＃４融合タンパク（還元サンプル）。
レーン１０：レーン９と同じ（非還元サンプル）。
図１８：発現プラスミドｐＴ7Ｈ6ＦＸ−α2ＭＲＢＤｖの構成。
ＦＸa切断部位ＩＥＧＲ（配列番号３８）をエンコードするヌクレオチド配列と５’末端で融合している、アミノ酸残基Ｖａｌ1299からＡｌａ1451までのヒトα2−マクログロブリンの読み取り枠を含む増幅ＤＮＡフラグメントを、制限エンドンヌクレアーゼBam HIおよびHind III（Boehringer，Germanyより購入）を用いて切断し、標準手順を用いてＴ4ＤＮＡリガーゼ（Boehringer，Germanyより購入）によってBam HIおよびHind III切断ｐＴ7Ｈ6に結合した。
図１９：ヒトα2−マクログロブリンの受容体結合ドメインのアミノ酸配列（残基Ｖａｌ1299からＡｌａ1451まで）（配列番号５５）。
図２０：発現プラスミドｐＴ7Ｈ6ＦＸ−ＴＥＴＮの構成。
ＦＸa切断部位ＩＥＧＲ（配列番号３８）をエンコードするヌクレオチド配列と５’末端で融合している、アミノ酸残基Ｇｌｕ1からＶａｌ181までの成熟単量体ヒトテトラネクチン（Tetranectin）の読み取り枠を含む増幅ＤＮＡフラグメントを、制限エンドンヌクレアーゼBam HIおよびHind III（Boehringer，Germanyより購入）を用いて切断し、標準手順を用いてＴ4ＤＮＡリガーゼ（Boehringer，Germanyより購入）によってBam HIおよびHind III切断ｐＴ7Ｈ6に結合した。
図２１：ヒト単量体テトラネクチンのアミノ酸配列。
ヒトテトラネクチン（配列番号５６）をエンコードする完全長の読み取り枠の予測アミノ酸配列。処理された成熟タンパクの最初のアミノ酸残基（Ｇｌｕ1）が示されている。
図２２：発現プラスミドｐＴ7Ｈ6ＦＸ−ＤＢ３２の構成。
ＦＸa切断部位ＩＥＧＲ（配列番号３８）をエンコードするヌクレオチド配列と５’末端で融合している、アミノ酸残基Ｇｌｎ1からＡｓｎ246までの人工ジアボディＤＢ３２の読み取り枠を含む増幅ＤＮＡフラグメントを、制限エンドンヌクレアーゼBam HIおよびHind III（Boehringer，Germanyより購入）を用いて切断し、標準手順を用いてＴ4ＤＮＡリガーゼ（Boehringer，Germanyより購入）によってBam HIおよびHind III切断ｐＴ7Ｈ6に結合した。
図２３：人工ジアボディＤＢ３２のアミノ酸配列（配列番号５７）。
図２４：発現プラスミドｐＴ7Ｈ6ＦＸ−ＰＳ．４。
アミノ酸残基Ｓｅｒ2からＧｌｎ101までのヒトサライアシン（psoriasin）を発現するｐＴ7Ｈ6ＦＸ−ＰＳ．４の構成は既に記載されている（Hoffmann，1994）。
図２５：ヒトサライアシンのアミノ酸配列。
ヒトサライアシンをエンコードする完全長の読み取り枠の予測アミノ酸配列（配列番号５８）。
図２６：組換えＭａｂ３２ジアボディの精製およびＦＸa切断のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
ａ：精製の異なる段階。
レーン１およびレーン２：折り畳みからの粗タンパク。
レーン３：最終精製Ｍａｂ３２ジアボディ融合タンパク産物。
レーン４：５０倍濃縮および遠心分離後の粗折り畳み産物の上清。
レーン５：５０倍濃縮および遠心分離後の粗折り畳み産物からのペレット。
ｂ：Ｍａｂ３２ジアボディ融合タンパクのＦＸa切断。
レーン１およびレーン５：最終精製Ｍａｂ３２ジアボディ融合タンパク。
レーン２：３７℃２０時間モル率１：５ ＦＸa：Ｍａｂ３２ジアボディ融合タンパク。
レーン３：３７℃２０時間モル率１：２ ＦＸa：Ｍａｂ３２ジアボディ融合タンパク。
レーン４：３７℃２０時間モル率１：１ ＦＸa：Ｍａｂ３２ジアボディ融合タンパク。
図２７：ヒトβ2−ミクログロブリン融合タンパクの周期的な再生における還元剤としてのグルタチオンの適性。
レーン１：テスト番号１の還元サンプル。
レーン２：テスト番号１の非還元サンプル。
レーン３：テスト番号２の非還元サンプル。
レーン４：テスト番号３の非還元サンプル。
レーン５：テスト番号４の非還元サンプル。
レーン６：テスト番号５の非還元サンプル。
レーン７：テスト番号６の非還元サンプル。
レーン８：テスト番号７の非還元サンプル。
レーン９：テスト番号８の非還元サンプル。
レーン１０：テスト番号９の非還元サンプル。
レーン１１：テスト番号１０の非還元サンプル。
レーン１２：テスト番号１１の非還元サンプル。
図２８：ヒトβ2−ミクログロブリン融合タンパクの周期的な再生における還元剤としてのＬ−システインエチルエステルの適正。
レーン１：テスト番号１の還元サンプル。
レーン２：テスト番号１の非還元サンプル。
レーン３：テスト番号２の非還元サンプル。
レーン４：テスト番号３の非還元サンプル。
レーン５：テスト番号４の非還元サンプル。
レーン６：テスト番号５の非還元サンプル。
レーン７：テスト番号６の非還元サンプル。
レーン８：テスト番号７の非還元サンプル。
レーン９：テスト番号８の非還元サンプル。
レーン１０：テスト番号９の非還元サンプル。
図２９：ヒトβ2−ミクログロブリン融合タンパクの周期的な再生における還元剤としての２−メルカプトエタノールの適正。
レーン１：テスト番号１の還元サンプル。
レーン２：テスト番号１の非還元サンプル。
レーン３：テスト番号２の非還元サンプル。
レーン４：テスト番号３の非還元サンプル。
レーン５：テスト番号４の非還元サンプル。
レーン６：テスト番号５の非還元サンプル。
レーン７：テスト番号６の非還元サンプル。
レーン８：テスト番号７の非還元サンプル。
レーン９：テスト番号８の非還元サンプル。
レーン１０：テスト番号９の非還元サンプル。
図３０：ヒトβ2−ミクログロブリン融合タンパクの周期的な再生における還元剤としてのメルカプトコハク酸の適正。
レーン１：テスト番号１の非還元サンプル。
レーン２：テスト番号２の非還元サンプル。
レーン３：テスト番号３の非還元サンプル。
レーン４：テスト番号４の非還元サンプル。
レーン５：テスト番号５の非還元サンプル。
レーン６：テスト番号６の非還元サンプル。
レーン７：テスト番号７の非還元サンプル。
レーン８：テスト番号８の非還元サンプル。
レーン９：テスト番号９の非還元サンプル。
図３１：ヒトβ2−ミクログロブリン融合タンパクの周期的な再生における還元剤としてのＮ−アセチル−Ｌ−システインの適正。
レーン１：テスト番号１の還元サンプル。
レーン２：テスト番号１の非還元サンプル。
レーン３：テスト番号２の非還元サンプル。
レーン４：テスト番号３の非還元サンプル。
レーン５：テスト番号４の非還元サンプル。
レーン６：テスト番号５の非還元サンプル。
レーン７：テスト番号６の非還元サンプル。
レーン８：テスト番号７の非還元サンプル。
レーン９：テスト番号８の非還元サンプル。
レーン１０：テスト番号９の非還元サンプル。
図３２：ヒトβ2−ミクログロブリン融合タンパクの周期的な再生のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
レーン１：Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムにアプライする前の粗タンパク抽出物（還元サンプル）。
レーン２：実施例１に記載した再生ｈβ2ｍの可溶性フラクションの８μlサンプル。
レーン３：実施例１に記載した再生ｈβ2ｍの可溶性フラクションの４μlサンプル。
レーン４：実施例１に記載した再生ｈβ2ｍの可溶性フラクションの２μlサンプル。
レーン５：実施例１に記載した再生ｈβ2ｍの不溶性フラクションの８μlサンプル。
レーン６および７：イオン交換クロマトグラフィーによる精製後のｈβ2ｍ最終産物。
レーン８および９：実施例１３に記載した最適再生プロトコール後の再生ｈβ2ｍ。
図３３：緩衝液ステップと線形グラジエントによるヒトβ2−ミクログロブリン融合タンパクの再生のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
レーン１：実施例１３に記載した緩衝液ステッププロトコールによって折り畳まれた、再生ｈβ2ｍの可溶性フラクションからのサンプル。
レーン２：実施例１３に記載した緩衝液ステッププロトコールによって折り畳まれた、再生ｈβ2ｍの不溶性フラクションからのサンプル。
レーン４：タンパク分子量マーカー（Pharmacia，Sweden）：ゲルの上から；９４ｋＤａ，６７ｋｋＤａ，４３ｋＤａ，３０ｋＤａ，２０．１ｋＤａおよび１４．４ｋＤａ（還元サンプル）。
レーン５：実施例１３に記載した線形グラジエントプロトコールによって折り畳まれた、再生ｈβ2ｍの可溶性フラクションからのサンプル。
レーン６および７：実施例１３に記載した線形グラジエントプロトコールによって折り畳まれた、再生ｈβ2ｍの不溶性フラクションからのサンプル。
図３４：実施例に記載する融合タンパクの設計の一般的概略図。
融合タンパクのＮ−末端には、融合タンパクをエンコードするＤＮＡを発現する細胞内における融合タンパクの発現レベルを増強する「ブースターセグメント」が任意に挿入されている。これのＣ−末端において、「６Ｈ」は、融合タンパクの精製と再生の際に「アフィニティーハンドル（affinity handle）」として用いられるイオンキレート部位を構成する６個のヒスチジニル残基を示す。６個のヒスチジニル部位のＣ−末端の「ＦＸ」はＦＸa切断部位である。最後に、「タンパク」と表示される融合タンパクの部分は、本発明の方法に従って再生される予定のタンパクの表す。
実施例
「周期的な折り畳み工程」を例証するために用いる、このセクションの１から１１までの実施例は、すべて、大腸菌中で産生され、粗タンパク抽出物より精製され、さらに精製することなく一般的な手順によって折り畳みにかけられる切断可能な組換えハイブリッドタンパク（融合タンパク）の折り畳み工程を記載する。
産生すべき組換えタンパクをエンコードするヌクレオチド配列は、ＦＸa切断部位（ＦＸ）を特定するアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列に５’−末端で融合され、次いで、６個のヒスチジニル残基を含むセグメント（配列番号４７）のＮ−末端に結合される。ＦＸa切断部位の結合は、通常、５’−末端プライマーがこの配列をエンコードするヌクレオチドからなるポリメラーゼ連鎖反応中に達成される。６個のヒスチジニル残基の結合は、通常、配列番号４７をエンコードするヌクレオチドフラグメントからなるベクターを用いることによって得られる。６個のヒスチジニル残基は、融合タンパクの精製中にアフィニティーハンドルとして、続いて周期的な折り畳み工程中には固体マトリックスへの接触点として利用される金属イオンキレート部位を構成する。時には、「ブースターセグメント」（例えばλｃＩＩタンパクのＮ−末端由来のセグメント、場合によってミオシンＬ鎖由来のセグメントが続くこともある）が、大腸菌中の融合タンパクの発現レベルを向上させるために、アフィニティーハンドルのＮ−末端に挿入される。
融合タンパクはすべて、同じ一般的な概略図（図３４を参照）に従ってデザインされる。ブースターセグメント、アフィニティーハンドルおよびＦＸa切断部位の存在は、目的の組換えタンパクの再生を複雑にするかもしれない。さらに、周期的な折り畳み工程は、融合タンパクの親和性による精製の直後に始められる。これは、宿主の大腸菌によって部分的に分解された融合タンパク材料が、完全長の融合タンパクカラムに加えて、親和性マトリックス上に残留することを意味する。この分解融合タンパクは完全長の融合タンパクの再生を著しく妨害し、それによって工程の見かけの効率を下げるであろう。従って、実施例１から１１までで報告する折り畳み効率は、精製融合タンパクの再生工程の効率と直接比較することはできない。
実施例１から１１までは、大きさの範囲が８２個のアミノ酸（Ｋ１，実施例６）から７８０個のアミノ酸（α2ＭＲ＃７，実施例４）までの２１個の異なるタンパク、タンパクドメインまたはドメインクラスターの再生工程を記載し、そのタンパク中のジスルフィド架橋の数の範囲は、ゼロ（α2ＭＲＡＰ，実施例３）から３３（α2ＭＲ＃４，実施例４）および３６（α2ＭＲ＃７，実施例４）である。
タンパクを再生する効率は、１５％から９５％までの範囲であり、活性タンパクの収率は４０ｍｌのＮｉ＋ＮＴＡ−アガロースカラム（ＮＴＡは置換ニトリロトリ酢酸を表す）を用いての再生では、１０−１００ｍｇのオーダーにある。
次の１から５までの表は、実施例で用いられたグラジエントプロフィールを示している。「時間」は分で、「フロー」はｍｌ／分で示される。
Figure 0003695467
Figure 0003695467
Figure 0003695467
Figure 0003695467
Figure 0003695467
実施例１
ヒトおよびマウスβ2−ミクログロブリンの産生と折り畳み
この実施例は、ＦＸa切断可能融合タンパクとしてのヒトβ2−ミクログロブリンとマウスβ2−ミクログロブリン両方の大腸菌における産生、およびＦＸa切断後のヒトおよびマウスの組換えβ2−ミクログロブリンの精製を記載している。
ヒトおよびマウスβ2−ミクログロブリンタンパクをエンコードする完全長のｃＤＮＡを含有するプラスミドクローン（David N．Garboczi博士により好意でSφren Buus博士に提供された）を、配列番号３と配列番号４（ヒトβ2−ミクログロブリン用）および配列番号５と配列番号６（マウスβ2−ミクログロブリン用）のプライマーを用いて、成熟したヒトβ2−ミクログロブリンタンパク（アミノ酸残基Ｉｌｅ1からＭｅｔ99に相当）と成熟したマウスβ2−ミクログロブリンタンパク（アミノ酸残基Ｉｌｅ1からＭｅｔ99に相当）に対応するｃＤＮＡフラグメントを産生するため企画されたポリメラーゼチェーンリアクション法（ＰＣＲ）において鋳型として用いた（Saiki et al.，1988）。増幅されたコード読み取り枠を、５’末端においてＰＣＲ反応により、配列番号３および５に含まれ、かつウシ制限プロテアーゼＦＸaの切断部位を構成する配列番号３７のアミノ酸配列（NagaiとThφgersen，1987）をエンコードするヌクレオチド配列に連結した。増幅されたＤＮＡフラグメントを、大腸菌発現ベクターｐＴ7Ｈ6（Christensen et al.，1991）中にサブクローニングした。得られたプラスミドｐＴ7Ｈ6ＦＸ−ｈβ2ｍ（ヒトβ2−ミクログロブリンを発現）およびｐＴ7Ｈ6ＦＸ−ｍβ2ｍ（マウスβ2−ミクログロブリンを発現）の構成が図２に示され、図３には発現したタンパクのアミノ酸配列が示されている（配列番号４９（ヒト）および配列番号５０（マウス）に、完全長の読み取り枠によってエンコードされるアミノ酸配列を示す。）
ヒトおよびマウスβ2−ミクログロブリンを、StudierとMoffat，J．Mol．Biol.，189: 113-130，1986に記載されているように培地スケール（２×１リットル）で、大腸菌ＢＬ２１細胞中でプラスミドｐＴ7Ｈ6ＦＸ−ｈβ2ｍおよびｐＴ7Ｈ6ＦＸ−ｍβ2ｍを増殖させかつ発現させることにより産生させた。３７℃で指数関数的に増殖する培養物を、ＯＤ600 ０．８で、約５の感染多重度でバクテリオファージλＣＥ６に感染させた。培養物を３７℃で更に３時間増殖させた後、細胞を遠心分離により収集した。浸透圧ショックおよび超音波処理により細胞を溶解し、細胞タンパク全部をフェノール（トリズマ塩基でｐＨ８に調節）中に抽出させた。２．５容量のエタノールの添加および遠心分離によりフェノール相よりタンパクを沈澱させた。６Ｍの塩化グアニジニウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８と０．１Ｍのジチオエリトリオールを含有する緩衝液に、タンパクペレットを溶解させた。セファデックスＧ−２５（スエーデンのファルマシア，ＬＫＢ）を用いて、８Ｍの尿素、１Ｍの塩化ナトリウム、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８、１０ｍＭの２−メルカプトエタノールおよび３ｍＭメチオニン中にゲル濾過した後、融合タンパク、すなわち各々ＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲ−ヒトおよびマウスβ2−ミクログロブリン（ここでＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲは配列番号４８である）の精製（Hochuliら，1988）のため、粗タンパク調製物を、Ｎｉ2+により活性化されたＮＴＡ−アガロースカラムにアプライし、ひき続き周期的な折り畳み工程へと移行させた。
液体クロマトグラフィーのため調製した全ての緩衝液は、還元剤の添加および／または使用の前に真空下でガス抜きした。
Ｎｉ2+により活性化されたＮＴＡ−アガロースマトリックス（Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロース）は、ドイツのDiagen GmbHから市販されている。しかしながら、この研究の過程において、この市販品は期待したほど作用しないことが分かった。我々の観察によれば、市販のＮｉ2+ＮＴＡ−アガロースマトリックスは、変性し還元した全タンパク抽出物をアプライした時、簡単にブロックされ、融合タンパク収容力は期待されるより低く、マトリックスがうまく再生されるのはほんの数回だけであった。
Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースの性能を向上させるため、より剛性の高いアガロースマトリックス（すなわち、スエーデンのファルマシア製のセファロースＣＬ−６Ｂ）に対しＮ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノジ酢酸金属リガンド｛合成ルートはDobeliとHochuli（EPO 0253 303）に記載の通り｝をカルボジイミドカップリングさせることが決められた。合成工程から得られた８ｇのＮ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノジ酢酸を５０ｍｌ中に含む溶液を、２９ｇの炭酸ナトリウム（１０水和物）を加えてｐＨ１０に調製し、１Ｍの炭酸ナトリウム中に活性化したセファロースＣＬ−６Ｂを含む撹拌懸濁液に加えた。反応は一晩中行われた。
セファロースＣＬ−６Ｂ（最初は１００ｍｌ懸濁液）は脱水後、７ｇの１，１’−カルボニルジイミダゾールを含むアセトンを用いて１５から３０分撹拌して活性化した。活性化後、セファロースＣＬ−６Ｂをアセトンおよびひき続いて水と１Ｍの炭酸ナトリウムで洗浄した。このＮＴＡ−アガロースマトリックスをカラムに充填し、５カラム容量分の１０％硫酸ニッケル溶液をゆっくり通してＮｉ2+を「負荷（チャージ）」した。この工程で調製されたＮＴＡ−アガロースマトリックス上のＮｉ2+の量を定量したところ、１ｍｌのマトリックス当たり１４μモルであった。このＮｉ2+ＮＴＡ−アガロースマトリックスは、液体クロマトグラフィー用の標準クラスのカラム（内径２．６ｃｍ）に４０ｍｌの容量で充填した。負荷後、粗タンパク抽出物をアプライする前にこのＮｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムを、２カラム容量の水と１カラム容量の１Ｍのトリス塩酸塩ｐＨ８と２カラム容量のローディングバッファーで洗浄した。
Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムに粗タンパク抽出物をアプライした後、融合タンパク、すなわち各々ＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲ−ｈβ2ｍおよびＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲ−ｍβ2ｍ（ここでＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲは配列番号４８である）を、１カラム容量のローディングバッファー、およびそれにひき続き６Ｍの塩化グアニジニウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩と１０ｍＭの２−メルカプトエタノールと３ｍＭのメチオニンで、カラム溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）が安定になるまで洗浄することによって、大部分の大腸菌およびλファージタンパクから精製した。
融合タンパクを、表１に記載のようなグラジエント管理プロフィールを用いて、０．５Ｍの塩化ナトリウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８と１．２ｍＭ／０．４ｍＭの還元型／酸化型グルタチオンを緩衝液Ａとして、そして８Ｍの尿素と０．５Ｍの塩化ナトリウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８と３ｍＭのメチオニンと６ｍＭの還元型グルタチオンを緩衝液Ｂとして用いて、Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラム上で再生した。還元型／酸化型グルタチオン溶液は、緩衝液Ａに加える前に、９．９Ｍの過酸化水素を０．２Ｍの還元型グルタチオンの撹拌した溶液に加えることにより２００倍の保存溶液として新しく調製した。
周期的な折り畳み工程が完了した後、ｈβ2ｍおよびｍβ2ｍ融合タンパクを、０．５Ｍの塩化ナトリウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩と２０ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８を含有する緩衝液を用いて、Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムから溶離させた。
Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラム上に凝集し沈澱した融合タンパクを、緩衝液Ｂ中に溶離させた。約７５％の融合タンパク材料が、非変性溶出緩衝液により溶出した（図１６のレーン２およびレーン３参照）。
非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から判断すると、約７０％の可溶性ｈβ2ｍ融合タンパク材料（４０ｍｇのｈβ2ｍ融合タンパクに相当）が単量体であるように思われ（図１５のレーン５およびレーン３参照）、一方２５％のｍβ2ｍ融合タンパクが単量体であるように思われた（２０ｍｇのｍβ2ｍ融合タンパクに相当）。したがって折り畳み工程の全体的効率は、ｈβ2ｍ融合タンパクについては約５０％で、ｍβ2ｍ融合タンパクについては２０％未満である。
単量体のｈβ2ｍおよびｍβ2ｍ融合タンパクを、Ｓ−セファロース（スエーデンのファルマシア）を用いるイオン交換クロマトグラフィーにより二量体および高次の多量体から精製した。非変性溶出緩衝液により溶出した融合タンパク（約７０％の融合タンパク材料）を、５ｍＭの塩化ナトリウムと５ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８を含有する緩衝液中へセファデックスＧ−２５を用いてゲル濾過し、Ｓ−セファロースイオン交換カラムにアプライする前に水で１：１に希釈した。融合タンパクを、２．５ｍＭの塩化ナトリウムと２．５ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８から１００ｍＭの塩化ナトリウムと２５ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８への線形グラジエントにより５カラム容量かけて溶離させた。単量体のｈβ2ｍおよびｍβ2ｍ融合タンパクは、グラジエントの一番初めに溶出した。一方二量体および高次の多量体は後の方で溶出した。単量体の融合タンパクを含有するフラクションを水で希釈し、Ｓ−セファロースカラムに再負荷し、１Ｍの塩化ナトリウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８で一段階溶離させた。
単量体の融合タンパクを、制限プロテアーゼＦＸaを用いて約２００対１の重量比で一晩中室温で切断させた。
切断後、組換えｈβ2ｍおよびｍβ2ｍタンパクを、Ｑ−セファロースカラム（スエーデンのファルマシア）を用いるイオン交換クロマトグラフィーにより、切断した融合タンパクおよびＦＸaから遊離したＮ−末端融合尾部から精製した。セファデックスＧ−２５を用いての５ｍＭの塩化ナトリウムと５ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８中へのゲル濾過および水による１：１希釈の後、組換えｈβ2ｍおよびｍβ2ｍを、２．５ｍＭの塩化ナトリウムと２．５ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８から１００ｍＭの塩化ナトリウムと２５ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８への線形グラジエントにより（５カラム容量かけて）溶離させた。切断した組換えタンパクを含有するフラクションを水で希釈し、Ｑ−セファロースカラムに再負荷し、１Ｍの塩化ナトリウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８で一段階溶離させた。組換えｈβ2ｍおよびｍβ2ｍタンパクを、新しく調製された２０ｍＭの炭酸水素アンモニウム中へゲル濾過し、二度凍結乾燥した。
組換えヒトβ2−ミクログロブリン産生のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析が、図１５に示されている。
この工程により産生された完全に処理された組換えヒトβ2−ミクログロブリンの収量は、３０ｍｇであった。
この工程により産生された完全に処理された組換えマウスβ2−ミクログロブリンの収量は、１０ｍｇであった。
組換えヒトβ2−ミクログロブリンと精製した天然ヒトβ2−ミクログロブリンの比較が、親切にもSφren Buus博士により２つの異なった分析（assay）により行われた。
１． 組換えヒトβ2−ミクログロブリンと天然ヒトβ2−ミクログロブリンは、モノクローナル抗体および単一特異性抗体の両方に、同じ親和力で反応することが見いだされた。
２． 組換えヒトβ2−ミクログロブリンと天然ヒトβ2−ミクログロブリンは、放射標識されたリガンドを用いた結合阻害実験において、天然の親和性により精製された重鎖クラスＩのＫd分子を、同じ親和力で結合することが見いだされた。
組換えマウスβ2−ミクログロブリンは、天然のクラスＩの重鎖分子を、ヒトβ2−ミクログロブリンより５倍低い親和力で結合することが見いだされた。この結果は、天然の材料を用いた文献上の従来の結果と良く一致する。
実施例２
ヒト成長ホルモン（ソマトトロピン）の産生と折り畳み
この実施例はＦＸa切断可能融合タンパクとしてのヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の大腸菌における産生、およびＦＸa切断後の組換えｈＧＨの精製を記載している。
ｈＧＨをエンコードするｃＤＮＡを含有するプラスミドクローン｛Henrik Dalbφge博士により寛大にも提供された（Dalbφge et al.,1987）｝を、配列番号７と配列番号８のプライマーを用いて、成熟したｈＧＨタンパク（アミノ酸残基Ｐｈｅ1からＰｈｅ191に相当）に対応するｃＤＮＡフラグメントを産生するため企画されたポリメラーゼチェーンリアクション法（ＰＣＲ）において鋳型として用いた（Saiki et al.，1988）。増幅されたコード読み取り枠を、５’末端においてＰＣＲ反応により、配列番号７に含まれ、かつウシ制限プロテアーゼＦＸaの切断部位を構成する配列番号３７のアミノ酸配列（NagaiとThφgersen，1987）をエンコードするヌクレオチド配列に連結した。増幅されたＤＮＡフラグメントを、大腸菌発現ベクターｐＴ7Ｈ6（Christensen et al.，1991）中に、サブクローニングした。得られたプラスミドｐＴ7Ｈ6ＦＸ−ｈＧＨ（ヒト成長ホルモンを発現）の構成が図４に示され、図５には発現したタンパクのアミノ酸配列が示されている（配列番号５１に、完全長の読み取り枠によってエンコードされるアミノ酸配列を示す。）
組換えヒト成長ホルモンを、StudierとMoffat，J．Mol．Biol.，189: 113-130，1986に記載されているように培地スケール（２×１リットル）で、大腸菌ＢＬ２１細胞中でプラスミドｐＴ7Ｈ6ＦＸ−ｈＧＨを増殖させかつ発現させることにより産生させた。３７℃で指数関数的に増殖する培養物を、ＯＤ600 ０．８で、約５の感染多重度でバクテリオファージλＣＥ６に感染させた。培養物を３７℃で更に３時間増殖させた後、細胞を遠心分離により収集した。浸透圧ショックおよび超音波処理により細胞を溶解し、細胞タンパク全部をフェノール（トリズマ塩基でｐＨ８に調節）中に抽出させた。２．５容量のエタノールの添加および遠心分離によりフェノール相からタンパクを沈澱させた。６Ｍの塩化グアニジニウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８と５０ｍＭのジチオエリトリオールを含有する緩衝液に、タンパクペレットを溶解させた。セファデックスＧ−２５（スエーデンのファルマシア，ＬＫＢ）を用いて、８Ｍの尿素、１Ｍの塩化ナトリウム、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８、５ｍＭの２−メルカプトエタノールおよび１ｍＭメチオニン中にゲル濾過した後、融合タンパク、すなわちＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲ−ｈＧＨ（ここでＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲは配列番号４８である。）の精製（Hochuliら，1988）のため、粗タンパク調製物を、Ｎｉ2+により活性化されたＮＴＡ−アガロースカラム（Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロース）にアプライし、ひき続き周期的な折り畳み工程へと移行させた。
Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムの調製と「負荷」が、実施例１に記載されている。
液体クロマトグラフィーのために調製した全ての緩衝液は、還元剤の添加および／または使用の前に真空下でガス抜きした。
Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムに粗タンパク抽出物をアプライした後、融合タンパク、すなわちＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲ−ｈＧＨ（ここでＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲは配列番号４８である）を、１カラム容量のローディングバッファー、およびそれにひき続き６Ｍの塩化グアニジニウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩と５ｍＭの２−メルカプトエタノールと１ｍＭのメチオニンで、溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）が安定になるまで洗浄することによって、大部分の大腸菌およびλファージタンパクから精製した。
融合タンパクを、表２に記載のようなグラジエント管理プロフィールを用いて、０．５Ｍの塩化ナトリウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８と１．０ｍＭ／０．１ｍＭの還元型／酸化型グルタチオンを緩衝液Ａとして、そして８Ｍの尿素と０．５Ｍの塩化ナトリウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８と１ｍＭのメチオニンと５ｍＭの還元型グルタチオンを緩衝液Ｂとして用いて、Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラム上で再生した。還元型／酸化型グルタチオン溶液は、緩衝液Ａに加える前に、９．９Ｍの過酸化水素を０．２Ｍの還元型グルタチオンの撹拌した溶液に加えることにより２００倍の保存溶液として新しく調製した。
周期的な折り畳み工程が完了した後、ｈＧＨ融合タンパクを、０．５Ｍの塩化ナトリウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩と２０ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８を含有する緩衝液を用いて、Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムから溶離させた。Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラム上に凝集し沈澱した融合タンパクを、緩衝液Ｂ中に溶離させた。
約８０％の融合タンパク材料が、非変性溶出緩衝液により溶出した（図１６のレーン２およびレーン３参照）。非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から判断すると、約９０％の可溶性融合タンパク材料（約７０ｍｇの融合タンパクに相当）が単量体であるように思われ（図１６のレーン２参照）、折り畳み工程の全体的効率は、約７０％であった。
単量体のｈＧＨ融合タンパクを、Ｑ−セファロース（スエーデンのファルマシア）を用いるイオン交換クロマトグラフィーにより二量体および高次の多量体から精製した。２５ｍＭの塩化ナトリウムと２５ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８を含有する緩衝液中へセファデックスＧ−２５を用いてゲル濾過した後、非変性緩衝液により溶出した融合タンパク材料をＱ−セファロースイオン交換カラムにアプライした。融合タンパクを、２５ｍＭの塩化ナトリウムと２５ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８から２００ｍＭの塩化ナトリウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８への線形グラジエントにより５カラム容量かけて溶離させた。単量体のｈＧＨ融合タンパクは、グラジエントの一番初めに溶出した。一方、二量体および高次の多量体は、後の方で溶出した。純粋の単量体の融合タンパクを含有するフラクションに、硫酸ニッケルとイミノジ酢酸（ＩＤＡ，水酸化ナトリウムによりｐＨ８に調節）を１ｍＭまで加え、制限プロテアーゼＦＸaを用いて約１００対１の重量比で５時間３７℃で切断した。ＦＸaは、切断後ベンズアミジン塩酸塩を１ｍＭまで加えることにより阻害される。
切断後、Ｎｉ2+ＩＤＡとベンズアミジンを除去するために、セファデックスＧ−２５を用いて８Ｍの尿素と５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８中にゲル濾過した後、各々完全にＦＸaおよびＮｉ2+とＮｄ3+を除去するため、小さなＮｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムとそれに一列になって続く小さなＮｄ3+ＮＴＡ−アガロースカラムおよびそれに引き続いてＮｉ2+によって活性化されていないＮＴＡアガロースカラムの中を通すことにより、組換えｈＧＨタンパクを、切断されていない融合タンパクおよび遊離した融合尾部から単離した。組換えｈＧＨを、Ｑ−セファロースを用いるイオン交換クロマトグラフィーにより、組換え分解産物の微量フラクションから精製した。ｈＧＨを、８Ｍの尿素と５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８から８Ｍの尿素と２５０ｍＭの塩化ナトリウムと２５ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８への線形グラジエントにより（５カラム容量かけて）溶離させた。切断した精製組換えタンパクを含有するフラクションを、新しく調製された２０ｍＭの炭酸水素アンモニウム中へゲル濾過し、二度凍結乾燥した。
組換えヒト成長ホルモンの産生と折り畳みのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析が、図１６に示されている。
この工程により産生された完全に処理された組換えヒト成長ホルモンの収量は、１０ｍｇであった。
この工程により産生した組換えヒト成長ホルモンは、還元性および非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および非変性ＰＡＧＥ分析の両方において、Novo-Nordisk A/Sにより寛大にも提供された生物学的に活性な組換えヒト成長ホルモンと、同じ泳動を示した。
実施例３
ヒトα2ＭＲＡＰの産生と折り畳み
ヒトα2−マクログロブリン受容体（Receptor）関連タンパク（α2ＭＲＡＰ）の大腸菌ＢＬ２１細胞における発現のために使用されるプラスミドｐＴ7Ｈ6ＦＸ−α2ＭＲＡＰおよび融合タンパクの産生のために用いられる条件は、以前Nykjaer et al.，J．Biol．Chem．267: 14543-14546，1992において、我々が記述している。配列番号９および配列番号１０のプライマーが、α2ＭＲＡＰをエンコードするＤＮＡを増やすため利用されるＰＣＲに用いられた。
ＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲ−α2ＭＲＡＰ（ここでＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲは配列番号４８である）を発現する大腸菌ＢＬ２１細胞の培養物２リットルから細胞のタンパクを抽出したフェノール相から沈澱した粗タンパク抽出物を、６Ｍの塩化グアニジニウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８と５０ｍＭのジチオエリトリオールを含有する緩衝液に溶解させた。セファデックスＧ−２５（スエーデンのファルマシア）を用いて、８Ｍの尿素、０．５Ｍの塩化ナトリウム、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８および１ｍＭメチオニン中にゲル濾過した後、融合タンパクすなわちＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲ−α2ＭＲＡＰ（ここでＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲは配列番号４８である）の精製（Hochuliら，1988）のため、粗タンパク調製物を、Ｎｉ2+により活性化されたＮＴＡ−アガロースマトリックス（Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロース）にアプライし、ひき続き周期的な折り畳み工程へと移行させた。
液体クロマトグラフィーのために調製した全ての緩衝液は、還元剤の添加および／または使用の前に真空下でガス抜きした。
Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムの調製と「負荷」は、実施例１に記載されている。
Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムに粗タンパク抽出物をアプライした後、融合タンパクすなわちＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲ−α2ＭＲＡＰ（ここでＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲは配列番号４８である）を、１カラム容量のローディングバッファー、およびそれにひき続き６Ｍの塩化グアニジニウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩と１ｍＭのメチオニンで、溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）が安定になるまで洗浄することによって、大部分の大腸菌およびλファージタンパクから精製した。
融合タンパクを、表３に記載のようなグラジエント管理プロフィールを用いて、０．５Ｍの塩化ナトリウム、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８、２ｍＭの塩化カルシウムおよび１ｍＭの２−メルカプトエタノールを緩衝液Ａとして、そして６Ｍの塩化グアニジニウム、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８、２ｍＭの塩化カルシウムおよび１ｍＭの２−メルカプトエタノールを緩衝液Ｂとして用いて、Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラム上で再生した。
周期的な折り畳み工程が完了した後、α2ＭＲＡＰ融合タンパクを、０．５Ｍの塩化ナトリウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩と２０ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８を含有する緩衝液を用いて、Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムから溶離させた。
実質上、Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラム上に融合タンパクの凝集あるいは沈澱は全くみられなかった。α2ＭＲＡＰ融合タンパクの評価収量は６０ｍｇで、折り畳み工程の効率は９５％に近かった。
融合タンパクＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲ−α2ＭＲＡＰ（ここでＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲは配列番号４８である）を、溶出緩衝液中で２００対１の重量比で一晩中室温でウシ制限プロテアーゼＦＸaを用いることにより、切断させた。１００ｍＭの塩化ナトリウムと２５ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８の中へセファデックスＧ−２５を用いてゲル濾過した後、タンパク溶液をＮｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムに通し、それによって切断されていない融合タンパクと切断された融合タンパクに由来する遊離した融合Ｎ−末端尾部を除去した。最後に、タンパク溶液を水で１：４に希釈し、α2ＭＲＡＰタンパクを、Ｑ−セファロース（スエーデンのファルマシア）を用いるイオン交換クロマトグラフィーにより、ＦＸaから精製した。Ｑ−セファロースカラムを、２５ｍＭの塩化ナトリウムと２５ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８から２５０ｍＭの塩化ナトリウムと２５ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８への６カラム容量かけた線形グラジエントにより溶離させた。α2ＭＲＡＰタンパクは、線形グラジエントの一番初めに溶出した。一方、ＦＸaは、後の方で溶出した。
この工程により産生され再生されたα2ＭＲＡＰタンパクの収量は、４０ｍｇであった。
リガンド結合特性（すなわちα2−マクログロブリン受容体への結合、およびヒトウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子−プラスミノーゲン活性化因子阻害剤タイプ−Ｉ複合体のα2−Ｍ受容体への結合との干渉）は、Nykjaer博士によると、精製した天然タンパクのリガンド結合特性と同一であることが分かった。
実施例４
α2−Ｍ受容体（Receptor）からのドメインおよびドメイン−クラスターの産生と折り畳み
ヒトα2−マクログロブリン受容体／低密度リポタンパク受容体関連タンパク（α2ＭＲ）は、６００ｋＤａのエンドサイトーシス膜受容体である。α2−ＭＲは、４５２４アミノ酸単鎖前駆体タンパクとして合成される。その前駆体は、８５ｋＤａの貫膜β−鎖、およびβ−鎖の細胞外ドメインに非共有結合的に結合している５００ｋＤａのα−鎖に変換（process）される。α2−ＭＲは、Ｃａ2+を構造依存的に結合する（すなわち、還元されたタンパクはＣａ2+を結合しない）ことが知られており、α2−ＭＲが異なるクラスのリガンドを結合するという意味で多機能的であると信じられている。
α−鎖の全アミノ酸配列は、他の膜結合受容体および種々の血漿タンパクにおいても見られる、三つのタイプの繰り返し体のクラスターによって表すことができる。
Ａ：このタイプの繰り返し体は、約４０のアミノ酸残基にわたり（span）、繰り返し体に含まれる六つのシステイン残基の連続的出現（sequential appearance）に特徴を有する。何人かの著者は、この繰り返し体を補体（complement）型ドメインと命名した。
Ｂ：このタイプの繰り返し体も、約４０のアミノ酸残基にわたり、繰り返し体に含まれる六つのシステイン残基の連続的出現に特徴を有する。文献中で、この繰り返し体は、ＥＧＦ型ドメインと命名されている。
Ｃ：このタイプの繰り返し体は、約５５のアミノ酸残基にわたり、配列番号３９の共通配列の存在に特徴を有する。
この実施例は、α2−ＭＲタンパクに由来するいくつかのドメインおよびドメインクラスターを、ＦＸaによって切断可能な融合タンパクとして大腸菌中で産生し、これらの組換えタンパクを精製し、試験管内で（in vitro）折り畳み、ＦＸaによって切断し、処理することを記載している。
ヒトα2−ＭＲタンパクをエンコードする完全長のｃＤＮＡを含有するプラスミドクローン(Joachim Herz博士により好意で提供された；Herz et al.，EMBO J.，7: 4119-4127，1988）を、α2−ＭＲタンパクに由来するドメインおよびドメインクラスターを表すいくつかのポリペプチドに対応するｃＤＮＡフラグメントを産生するために企画された一連のポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）において鋳型として用いた。
＃１は、Ａタイプの２つのドメインを含有し、α2−ＭＲタンパク中のアミノ酸残基２０から１０９までに対応する。配列番号１１および配列番号１２のプライマーが、ＰＣＲにおいて用いられた。
＃２は、Ａタイプの２つのドメインおよびそれに続くタイプＢの２つのドメインを含有し、α2−ＭＲタンパク中のアミノ酸残基２０から１９０までに対応する。配列番号１１および配列番号１３のプライマーが、ＰＣＲにおいて用いられた。
＃３は、＃２と同じ領域およびそれに続くＹＷＴＤ繰り返し体を含む領域からなり、アミノ酸残基２０から５２１までに対応する。配列番号１１および配列番号１４のプライマーが、ＰＣＲにおいて用いられた。
＃４は、タイプＢの１つのドメイン、それに続くタイプＡの８つのドメイン、そして最後にタイプＢの２つのドメインを含有し、α2−ＭＲタンパク中のアミノ酸残基８０３から１２６５までに対応する。配列番号１５および配列番号１６のプライマーが、ＰＣＲにおいて用いられた。
＃５は、＃４にも存在するタイプＡの８つのドメインのみを含有し、α2−ＭＲタンパク中のアミノ酸残基８４９から１１８４までに対応する。配列番号１７および配列番号１８のプライマーが、ＰＣＲにおいて用いられた。
＃６は、＃４からのＣ末端タイプＢの２つのドメインおよびそれに続く８つのＹＷＴＤ繰り返し体とタイプＢの１つのドメインを含有し、α2−ＭＲタンパク中のアミノ酸残基１１８４から１５８２までに対応する。配列番号１９および配列番号２０のプライマーが、ＰＣＲにおいて用いられた。
＃７は、＃４から＃６までの構築物（constructs）に含まれる全ての領域を含有し、α2−ＭＲタンパク中のアミノ酸残基８０３から１５８２までに対応する。配列番号１５および配列番号２０のプライマーが、ＰＣＲにおいて用いられた。
＃８は、タイプＡの１０個のドメインを含有し、α2−ＭＲタンパク中のアミノ酸残基２５２０から２９４１までに対応する。配列番号２１および配列番号２２のプライマーが、ＰＣＲにおいて用いられた。
＃９は、タイプＡの１１個のドメインを含有し、α2−ＭＲタンパク中のアミノ酸残基３３３１から３７７８までに対応する。配列番号２３および配列番号２４のプライマーが、ＰＣＲにおいて用いられた。
これらのドメインとドメインクラスターをエンコードする増幅されたヌクレオチド配列を、その５’末端においてＰＣＲ反応により、ウシ制限プロテアーゼＦＸaの切断部位を構成する配列番号３７のアミノ酸配列（NagaiとThφgersen，Methods in Enzymology，152: 461-481，1987）をエンコードする（配列番号１１、１５、１７、１９、２１および２３に含まれる）ヌクレオチド配列に連結した。
大腸菌発現ベクターｐＴ7Ｈ6（Christensen et al.，FEBS Letters，295: 181-184，1991）、あるいはミオシン軽鎖フラグメントのＣ末端の６つのヒスチジン残基をエンコードするオリゴヌクレオチドを挿入することによりｐＬｃＩＩＭＬＣ（Nagaiら、Nature、332: 284-286，1988）から修飾した発現プラスミドｐＬｃＩＩＭＬＣＨ6のいずれかの中に、増幅されたＤＮＡフラグメントをサブクローニングした。得られたプラスミドｐＴ7Ｈ6ＦＸ−＃１から＃３、およびｐＬｃＩＩＭＬＣＨ6ＦＸ−＃４から＃９の構成が図６〜８に示され、図９には発現したタンパクのアミノ酸配列が示されている（配列番号５２に、完全長の読み取り枠によってエンコードされるアミノ酸配列を示す）。
ｐＴ7Ｈ6ＦＸ系列（series）にサブクローン化したドメインとドメインクラスターを、StudierとMoffat，J．Mol．Biol.，189: 113-130，1986に記載されているように、培地スケール（２リットル）で、大腸菌ＢＬ２１細胞中で増殖かつ発現させた。３７℃で指数関数的に増殖する培養物を、ＯＤ600 ０．８で、約５の感染多重度でバクテリオファージλＣＥ６に感染させた。培養物を３７℃で更に３時間増殖させた後、細胞を遠心分離により収集した。浸透圧ショックおよび超音波処理により細胞を溶解し、細胞タンパク全部をフェノール（トリズマ塩基でｐＨ８に調節）中に抽出させた。
ｐＬｃＩＩＭＬＣＨ6系列（series）にサブクローン化したドメインクラスターを、NagaiとThφgersen．Methods in Enzymology，152: 461-481，1987に記載されているように、大腸菌ＱＹ１３細胞中で増殖かつ発現させた。３０℃で指数関数的に増殖する培養物（４リットル）を、ＯＤ600 １．０で、１５分間４２℃へ移した。この熱ショックが融合タンパクの合成を誘発する。培養物を３７℃で更に３〜４時間インキュベートした後、細胞を遠心分離により収集する。浸透圧ショックおよび超音波処理により細胞を溶解し、細胞タンパク全部を、フェノール（トリズマ塩基でｐＨ８に調節）中に抽出させた。
２．５容量のエタノールの添加および遠心分離により、フェノール相から粗タンパクを沈澱させた。６Ｍの塩化グアニジニウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８と０．１Ｍのジチオエリトリオールを含有する緩衝液に、タンパクペレットを溶解させた。セファデックスＧ−２５（スエーデンのファルマシア）を用いて、８Ｍの尿素、１Ｍの塩化ナトリウム、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８、１０ｍＭの２−メルカプトエタノールおよび２ｍＭメチオニン中にゲル濾過した後、融合タンパクの精製（Hochuliら，1988）のため、粗タンパク調製物を、Ｎｉ2+により活性化されたＮＴＡ−アガロースカラムにアプライし、ひき続き周期的な折り畳み工程へと移行させた。
液体クロマトグラフィーのため調製した全ての緩衝液は、還元剤の添加および/または使用の前に真空下でガス抜きした。
Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムの調製と「負荷」は実施例１に記載されている。
Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムに粗タンパク抽出物をアプライした後、融合タンパクを、１カラム容量のローディングバッファー、およびそれにひき続き６Ｍの塩化グアニジニウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩と１０ｍＭの２−メルカプトエタノールと２ｍＭのメチオニンで、溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）が安定になるまで洗浄することによって、大部分の大腸菌およびλファージタンパクから精製した。
各々の融合タンパクを、表４に記載のようなグラジエント管理プロフィールを用いて、０．５Ｍの塩化ナトリウム、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８、２ｍＭの塩化カルシウム、０．３３ｍＭのメチオニンおよび２．０ｍＭ／０．２ｍＭの還元型／酸化型グルタチオンを緩衝液Ａとして、そして４Ｍの尿素、０．５Ｍの塩化ナトリウム、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８、２ｍＭの塩化カルシウム、２ｍＭのメチオニンおよび３ｍＭの還元型グルタチオンを緩衝液Ｂとして用いて、Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラム上で再生した、還元型／酸化型グルタチオン溶液は、緩衝液Ａに加える前に、９．９Ｍの過酸化水素を０．２Ｍの還元型グルタチオンの撹拌した溶液に加えることにより１００倍の保存溶液として新しく調製した。
周期的な折り畳み工程が完了した後、α2−ＭＲタンパクに由来するドメインおよびドメインクラスターを表す融合タンパクを、０．５Ｍの塩化ナトリウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩と５ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８を含有する緩衝液を用いて、Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムから溶離させた。Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラム上に凝集し沈澱した融合タンパクを、緩衝液Ｂ中に溶離させた。
α2−ＭＲタンパクのＮ末端の２および４の高システインドメインを表す、プラスミドｐＴ7Ｈ6ＦＸ−＃１および＃２から発現される約７５％の融合タンパク材料を、非変性緩衝液によりＮｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムから溶出させた。非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から判断すると、この融合タンパク材料の大部分が単量体であるように思われた。単量体融合タンパク＃１および＃２の収量は、約５０ｍｇと評価された。
α2−ＭＲタンパクに由来するドメインクラスターを表す、他の全ての発現プラスミドから発現される約５０％の融合タンパク材料を、非変性緩衝液によりＮｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムから溶出させた。非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から判断すると、これらの融合タンパクの３０％（融合タンパク＃５および＃７）〜６５％（融合タンパク＃４）が単量体であるように思われた（図１７の９および１０レーンを参照）。
非変性溶出緩衝液によって溶出された各々の融合タンパクを、制限プロテアーゼＦＸaを用いて、１００対１の評価重量比で一晩中室温で切断させた。
１００ｍＭの塩化ナトリウムと２５ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８の中へセファデックスＧ−２５を用いてゲル濾過した後、タンパク溶液をＮｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムに通し、それによって切断されていない融合タンパクと切断された融合タンパクに由来する遊離したＮ−末端融合尾部を除去した。組換えタンパク溶液をＳＢＴＩ−アガロース｛セファロースＣＬ−６Ｂ（スエーデンのファルマシア）に固定された大豆トリプシン阻害剤｝の小カラム中に通すことにより、ＦＸaを溶液から除去した。
再生した可溶性の融合タンパク産物＃４のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析が図１７の９および１０レーンに示され、それらは各々還元および非還元試料を示している。非還元試料に見られる移動度の増加は、３３個のジスルフィド架橋の存在によるポリペプチドの緻密性を反映している。
各々の組換えタンパクは、構造依存的にＣａ2+を結合することが分かった。
天然のヒトα2−ＭＲに由来するモノクローナル抗体Ａ２ＭＲα−５は、構築物＃４と＃６と＃７によって発現される組換えタンパクを結合することが、Sφren Moestrup博士により発見され、一方、やはり天然のα2−ＭＲに由来する単一特異性抗体Ａ２ＭＲα−３は、構築物＃８によって発現される組換えタンパクを結合することが発見された。両抗体の結合特異性は、構造依存的である（すなわち、それら抗体は還元α2−ＭＲとも還元組換えタンパクとも反応しない）。
実施例５
ウシ凝固因子Ｘa（ＦＸa）の産生と折り畳み
この実施例は、ウシＦＸaに由来する１つのフラグメントを、ＦＸaによって切断可能な融合タンパクとして大腸菌中で産生し、この組換えタンパクを精製し、試験管内で（in vitro）折り畳み、処理することを記載している。
アミノ酸残基Ｓｅｒ82からＴｒｐ484まで（配列番号２、残基８２−４８４）のウシＦＸ（ＦＸΔγ、アミノ酸番号は完全コード読み取り枠に関する）をエンコードするヌクレオチド配列を、ポリメラーゼチェーンリアクション法（ＰＣＲ）で、ウシの全肝臓ＲＮＡから合成した第一（１ｓｔ）鎖のオリゴ−ｄＴをプライマーとするｃＤＮＡを鋳型として用いて特異的に増幅することにより、ウシＦＸをエンコードするｃＤＮＡをクローニングした。ＰＣＲにおいて用いられたプライマーは、配列番号２５および配列番号２６であった。ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成は標準手順を用いて行った。
ＦＸΔγをエンコードする増幅された読み取り枠を、その５’末端においてＰＣＲ反応により、ウシ制限プロテアーゼＦＸaの切断部位を構成する配列番号３７のアミノ酸配列（NagaiとThφgersen，Methods in Enzymology，152: 461-481，1987）をエンコードするヌクレオチド配列に連結した。ミオシン軽鎖フラグメントのＣ末端の６つのヒスチジン残基をエンコードするオリゴヌクレオチドを挿入することによりｐＬｃＩＩＭＬＣ（Nagaiら、Nature、332: 284-286，1988）から修飾した大腸菌発現ベクターｐＬｃＩＩＭＬＣＨ6中に、増幅されたＤＮＡフラグメントをクローニングした。得られたプラスミドｐＬｃＩＩＭＬＣＨ6ＦＸ−ＦＸΔγの構成が図１０に示され、図１１には発現したタンパクのアミノ酸配列が示されている（配列番号５３に、完全長の読み取り枠によってエンコードされるアミノ酸配列を示す）。
ｐＬｃＩＩＭＬＣＨ6−ＦＸΔγプラスミドを、NagaiとThφgersen（Methods in Enzymology，152: 461-481，1987）に記載されているように、大腸菌ＱＹ１３細胞中で増殖かつ発現させた。３０℃で指数関数的に増殖する培養物を、ＯＤ600 １．０で、１５分間４２℃でインキュベートした。この熱ショックが融合タンパクの合成を誘発する。培養物を３７℃で更に３〜４時間インキュベートした後、細胞を遠心分離により収集する。浸透圧ショックおよび超音波処理により細胞を溶解し、細胞タンパク全部をフェノール（トリズマ塩基でｐＨ８に調節）中に抽出させた。
２．５容量のエタノールの添加および遠心分離により、フェノール相から粗タンパクを沈澱させた。６Ｍの塩化グアニジニウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８と０．１Ｍのジチオエリトリオールを含有する緩衝液に、タンパクペレットを溶解させた。セファデックスＧ−２５（スエーデンのファルマシア、ＬＫＢ）を用いて、８Ｍの尿素、１Ｍの塩化ナトリウム、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８および１０ｍＭの２−メルカプトエタノール中にゲル濾過した後、ＦＸΔγ融合タンパクの精製（Hochuliら，1988）のために、粗タンパク調製物を、Ｎｉ2+により活性化されたＮＴＡ−アガロースマトリックスにアプライし、ひき続き周期的な折り畳み工程へと移行させた。
液体クロマトグラフィーのために調製した全ての緩衝液は、還元剤の添加および／または使用の前に真空下でガス抜きした。
Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムの調製と「負荷」は、実施例１に記載されている。
Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムに粗タンパク抽出物をアプライした後、融合タンパクを、１カラム容量のローディングバッファー、およびそれにひき続き６Ｍの塩化グアニジニウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩と１０ｍＭの２−メルカプトエタノールで、溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）が安定になるまで洗浄することによって、大部分の大腸菌およびλファージタンパクから精製した。
この融合タンパクを、表５に記載のようなグラジエント管理プロフィールを用いて、０．５Ｍの塩化ナトリウム、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８、２ｍＭの塩化カルシウムおよび２．０ｍＭ／０．２ｍＭの還元型／酸化型グルタチオンを緩衝液Ａとして、そして８Ｍの尿素、０．５Ｍの塩化ナトリウム、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８、２ｍＭの塩化カルシウムおよび３ｍＭの還元型グルタチオンを緩衝液Ｂとして用いて、Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラム上で再生した。還元型／酸化型グルタチオン溶液は、緩衝液Ａに加える前に、９．９Ｍの過酸化水素を０．２Ｍの還元型グルタチオンの撹拌した溶液に加えることにより１００倍の保存溶液として新しく調製した。
周期的な折り畳み工程が完了した後、ＦＸΔγ融合タンパクを、０．５Ｍの塩化ナトリウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩と５ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８を含有する緩衝液を用いて、Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムから溶離させた。Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラム上に凝集し沈澱した融合タンパクを、緩衝液Ｂ中に溶離させた。
約３３％のＦＸΔγ融合タンパク材料が、非変性緩衝液によりＮｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムから溶出した。ＦＸΔγ融合タンパクの量は、約１５ｍｇと評価された。非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から判断すると、この融合タンパク材料の約３分の１だけが単量体であるように思われた。これは約１０％の折り畳み工程の全体的効率に対応する。
組換えタンパク溶液をトリプシン−アガロース｛セファロースＣＬ−６Ｂ（スエーデンのファルマシア）に固定したトリプシン｝の小カラム中に通すことにより、非変性緩衝液中のＦＸΔγ融合タンパクを活性化した。
色素原基質を利用する標準的手順を用いて、活性化した組換えＦＸΔγ融合タンパクのタンパク分解活性と基質特異性プロフィールを分析した。活性と基質特異性プロフィールは、天然ウシＦＸaから得られるものと、区別できなかった。
実施例６
ヒトプラスミノーゲンからのクリングルドメイン１および４の産生と折り畳み
この実施例は、ヒトプラスミノーゲンからのリジン結合性クリングルドメイン１および４（各々Ｋ１およびＫ４）を、ＦＸaによって切断可能な融合タンパクとして大腸菌中で産生し、このＫ１−およびＫ４−融合タンパクを精製し、試験管内で（in vitro）折り畳むことを記載している。
一般的なクローニングベクターｐＵＣ１８中にクローン化したヒトプラスミノーゲンをエンコードする完全長のｃＤＮＡを含有するプラスミドクローン（米国シアトルEarl Davie博士により好意で提供された）を、Ｋ１（いわゆるＧｌｕ−プラスミノーゲン中のアミノ酸残基Ｓｅｒ81からＧｌｕ162までに相当する）、およびＫ４（いわゆるＧｌｕ−プラスミノーゲン中のアミノ酸残基Ｖａｌ354からＡｌａ439までに相当する）に対応するｃＤＮＡフラグメントを産生するために企画されたポリメラーゼチェーンリアクション法（ＰＣＲ）において鋳型として用いた。配列番号２７および配列番号２８のプライマーが、Ｋ１を産生するＰＣＲにおいて用いられ、配列番号２９および配列番号３０のプライマーが、Ｋ４を産生するＰＣＲにおいて用いられた。
Ｋ１およびＫ４をエンコードする増幅された読み取り枠を、その５’末端においてＰＣＲ反応により、配列番号２７および配列番号２９に含まれ、かつウシ制限プロテアーゼＦＸaの切断部位を構成する配列番号３７のアミノ酸配列（NagaiとThφgersen，Methods in Enzymology，152: 461-481，1987）をエンコードするヌクレオチド配列に連結した。ミオシン軽鎖フラグメントのＣ末端の６つのヒスチジニル残基をエンコードするオリゴヌクレオチドを挿入することによりｐＬｃＩＩＭＬＣ（Nagaiら、Nature、332: 284-286，1988）から修飾した大腸菌発現ベクターｐＬｃＩＩＭＬＣＨ6中へ、増幅されたＫ１ＤＮＡフラグメントをクローニングした。得られたプラスミドｐＬｃＩＩＭＬＣＨ6ＦＸ−Ｋ１の構成を図１２に示す。ｃＩＩフラグメントのＣ末端の６つのヒスチジニル残基をエンコードするオリゴヌクレオチドを挿入することによりｐＬｃＩＩ（NagaiとThφgersen．Methods in Enzymology，152: 461-481，1987）から修飾した大腸菌発現ベクターｐＬｃＩＩＨ6中へ、増幅されたＫ４ＤＮＡフラグメントをクローニングした。得られたプラスミドｐＬｃＩＩＨ6ＦＸ−Ｋ４の構成が図１３に示され、図１４にはヒト”Ｇｌｕ”−プラスミノーゲンのアミノ酸配列（配列番号５４）が示されている。
ｐＬｃＩＩＭＬＣＨ6−Ｋ１プラスミドおよびｐＬｃＩＩＨ6ＦＸ−Ｋ４プラスミドの両方を、NagaiとThφgersen．Methods in Enzymology，152: 461-481，1987に記載されているように、大腸菌ＱＹ１３細胞中で増殖かつ発現させた。３０℃で指数関数的に増殖する培養物を、ＯＤ600 １．０で、１５分間４２℃へ移した。この熱ショックが融合タンパクの合成を誘発する。培養物を３７℃で更に３〜４時間インキュベートした後、細胞を遠心分離により収集する。浸透圧ショックおよび超音波処理により細胞を溶解し、細胞タンパク全部をフェノール（トリズマ塩基でｐＨ８に調節）中に抽出させた。
２．５容量のエタノールの添加および遠心分離によりフェノール相より粗タンパクを沈澱させた。６Ｍの塩化グアニジニウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８と０．１Ｍのジチオエリトリオールを含有する緩衝液に、タンパクペレットを溶解させた。セファデックスＧ−２５（スエーデンのファルマシア）を用いて８Ｍの尿素、１Ｍの塩化ナトリウム、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８、１０ｍＭの２−メルカプトエタノールおよび２ｍＭのメチオニン中にゲル濾過した後、Ｋ１−およびＫ４−融合タンパクの精製（Hochuliら，1988）のために、粗タンパク調製物を、Ｎｉ2+により活性化されたＮＴＡ−アガロースマトリックスにアプライし、ひき続き周期的な折り畳み工程へと移行させた。
液体クロマトグラフィーのため調製した全ての緩衝液は、還元剤の添加および／または使用の前に真空下でガス抜きした。
Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムの調製と「負荷」は、実施例１に記載されている。
Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムに粗タンパク抽出物をアプライした後、融合タンパクを、１カラム容量のローディングバッファー、およびそれにひき続き６Ｍの塩化グアニジニウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩と１０ｍＭの２−メルカプトエタノールと２ｍＭのメチオニンで、カラム溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）が安定になるまで洗浄することによって、大部分の大腸菌およびλファージタンパクから精製した。
この融合タンパクを、表４に記載のようなグラジエント管理プロフィールを用いて、０．５Ｍの塩化ナトリウム、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８、１０ｍＭの６アミノヘキサン酸（ε−アミノカプロン酸、ε−ＡＣＡ）、０．３３ｍＭのメチオニンおよび２．０ｍＭ／０．２ｍＭの還元型／酸化型グルタチオンを緩衝液Ａとして、そして４Ｍの尿素、０．５Ｍの塩化ナトリウム、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８、１０ｍＭのε−ＡＣＡ、２ｍＭのメチオニンおよび３ｍＭの還元型グルタチオンを緩衝液Ｂとして用いて、Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラム上で再生した。還元型／酸化型グルタチオン溶液は、緩衝液Ａに加える前に、９．９Ｍの過酸化水素を０．２Ｍの還元型グルタチオンの撹拌した溶液に加えることにより１００倍の保存溶液として新しく調製した。
周期的な折り畳み工程が完了した後、Ｋ１−およびＫ４−融合タンパクの各々を、０．５Ｍの塩化ナトリウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩と５ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８を含有する緩衝液を用いて、Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムから溶離させた。Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラム上に凝集し沈澱した融合タンパクを緩衝液Ｂ中に溶離させた。
実質的に全てのＫ１−およびＫ４−融合タンパク材料が、非変性緩衝液によりＮｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムから溶出した。Ｋ１−融合タンパクおよびＫ４−融合タンパクの評価収量は、約６０ｍｇであった。非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から判断すると、実質的に全てのＫ１−融合タンパクおよびＫ４−融合タンパクが、単量体であるように思われた。これは、９０％をこす折り畳み工程効率に相当する。
組換えプラスミノーゲンクリングル１および４の産生のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図１７に示す。
更に、Ｋ１−融合タンパクおよびＫ４−融合タンパクを、リジン−セファロースＣＬ−６Ｂ（スエーデンのファルマシア）を用いる親和性クロマトグラフィーによって精製した。融合タンパクは、０．５Ｍの塩化ナトリウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８と１０ｍＭのε−ＡＣＡを含有する緩衝液を用いて、親和性カラムから溶離させた。
リジン−セファロースへの結合は、通常、リジン結合性クリングルドメインの正しい折り畳みを指示するものとして受け取られている。
この周期的な折り畳み工程により産生し、Ｎ末端融合尾部から遊離させることによって完全に処理し、ひき続いてイオン交換クロマトグラフィーを用いて精製した組換えＫ１およびＫ４タンパクドメインの３次元構造が、Ｘ線回折（Robert Huber博士により行われた）および２次元ＮＭＲ解析｛科学研究生（stud．scient.）Peter ReinholdtおよびFlemming Poulsen博士により行われた｝を用いて確かめられた。
この工程により完全に処理された組換えＫ１およびＫ４タンパクドメインの概略収量は、培養物１リットル当り５ｍｇである。
実施例７
ヒトα2−マクログロブリンおよびニワトリオボスタチン(Ovostatin)に由来する組換えフラグメントの、大腸菌における産生と再生
この実施例はＦＸa切断可能融合タンパクとしての、ヒトα2−マクログロブリン（α2−ＭＲＢＤｖ）の受容体結合性ドメインの大腸菌における産生、およびＦＸa切断後の組換えα2−ＭＲＢＤｖの精製を記載している。
アミノ酸残基Ｖａｌ1299からＡｌａ1451までのα2−マクログロブリン読み取り枠（α2−ＭＲＤｖ）をエンコードする４６２個の塩基対（bp）のＤＮＡフラグメントを、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法で、実質的にSaikiら、（1988）のプロトコールに従って増幅した。ヒトα2−マクログロブリンの完全長のｃＤＮＡを含有するｐＡ２Ｍ（親切にもT．Kristensen博士により提供された）を鋳型として用い、配列番号３１および配列番号３２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。増幅されたコード読み取り枠を、５’末端においてＰＣＲ反応により、配列番号７に含まれ、かつウシ制限プロテアーゼＦＸaの切断部位を構成する配列番号３７のアミノ酸配列（NagaiとThφgersen，1987）をエンコードするヌクレオチド配列に連結した。増幅されたＤＮＡフラグメントを大腸菌発現ベクターｐＴ7Ｈ6（Christensen et al.，1991）中に、サブクローニングした。得られたプラスミドｐＴ7Ｈ6ＦＸ−α2−ＭＲＤｖ（ヒトα2−ＭＲＤｖを発現）の構成が図１８に示され、発現したタンパクのアミノ酸配列が図１９に示されている（配列番号５５）。
組換えヒトα2ＭＲＤｖを、StudierとMoffat，J．Mol．Biol.，189: 113-130，1986に記載されているように、培地スケール（２×１リットル）で、大腸菌ＢＬ２１細胞中でプラスミドｐＴ7Ｈ6ＦＸ−α2ＭＲＤｖを増殖させかつ発現させることにより産生させた。３７℃で指数関数的に増殖する培養物を、ＯＤ600 ０．８で、約５の感染多重度でバクテリオファージλＣＥ６に感染させた。培養物を３７℃で更に３時間増殖させた後、細胞を遠心分離により収集した。浸透圧ショックおよび超音波処理により細胞を溶解し、細胞タンパク全部を、フェノール（トリズマ塩基でｐＨ８に調節）中に抽出させた。２．５容量のエタノールの添加および遠心分離により、フェノール相からタンパクを沈澱させた。６Ｍの塩化グアニジニウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８と５０ｍＭのジチオエリトリオールを含有する緩衝液に、タンパクペレットを溶解させた。セファデックスＧ−２５（スエーデンのファルマシア，ＬＫＢ）を用いて８Ｍの尿素、１Ｍの塩化ナトリウム、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８および１０ｍＭの２−メルカプトエタノール中にゲル濾過した後、融合タンパク、すなわちＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲ−α2ＭＲＤｖ（ここでＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲは配列番号４８である）の精製（Hochuliら，1988）のために、粗タンパク調製物を、Ｎｉ2+により活性化されたＮＴＡ−アガロースカラム（Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロース）にアプライし、ひき続き周期的な折り畳み工程へと移行させた。
Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムの調製と「負荷」は、実施例１に記載されている。
液体クロマトグラフィーのため調製した全ての緩衝液は、還元剤の添加および／または使用の前に真空下でガス抜きした。
Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムに粗タンパク抽出物をアプライした後、融合タンパク、すなわちＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲ−α2ＭＲＤｖ（ここでＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲは配列番号４８である）を、１カラム容量のローディングバッファー、およびそれにひき続き６Ｍの塩化グアニジニウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩と１０ｍＭの２−メルカプトエタノールで、溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）が安定になるまで洗浄することによって、大部分の大腸菌およびλファージタンパクから精製した。
融合タンパクを、表４に記載のようなグラジエント管理プロフィールを用いて、０．５Ｍの塩化ナトリウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８と２．０ｍＭ／０．２ｍＭの還元型／酸化型グルタチオンを緩衝液Ａとして、そして８Ｍの尿素と０．５Ｍの塩化ナトリウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８と５ｍＭの還元型グルタチオンを緩衝液Ｂとして用いて、Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラム上で再生した。還元型／酸化型グルタチオン溶液は、緩衝液Ａに加える前に、９．９Ｍの過酸化水素を０．２Ｍの還元型グルタチオンの撹拌した溶液に加えることにより２００倍の保存溶液として新しく調製した。
周期的な折り畳み工程が完了した後、α2ＭＲＤｖ融合タンパクを、０．５Ｍの塩化ナトリウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩と２０ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８を含有する緩衝液を用いて、Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムから溶離させた。Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラム上に凝集し沈澱した融合タンパクを、緩衝液Ｂ中に溶離させた。
約５０％の融合タンパク材料が、水性溶出緩衝液により溶出した。非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から判断すると、この融合タンパク材料の半分が、単量体でかつ折り畳まれているように思われた。
組換えα2ＭＲＤｖタンパクを、制限プロテアーゼＦＸaを用いて約５０対１の重量比で４時間室温で切断させることにより、Ｎ末端融合尾部から遊離させた。切断後、α2ＭＲＤｖタンパクを、１０ｍＭの塩化ナトリウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８中へのセファデックスＧ−２５を用いるゲル濾過、およびひき続いてＱ−セファロースを用いるイオン交換クロマトグラフィーにより、切断されていない融合タンパクと遊離した融合尾部とＦＸaから単離した。α2ＭＲＤｖを、１０ｍＭの塩化ナトリウムと１０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８から５００ｍＭの塩化ナトリウムと１０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８への（１０カラム容量かけて）線形グラジエントにより溶離した。α2ＭＲＤｖタンパクは、１５０ｍＭの塩化ナトリウムで溶出した。
組換えα2ＭＲＤｖドメインは、α2Ｍ−受容体に、完全なα2−マクログロブリン分子がその受容体に対して示すのと同様の親和性で結合する{１リガンド−１受容体結合(MoestrupおよびGliemann 1991)におけるＫＤ評価に関して｝。結合分析は、Sφren K．Moestrup博士、および科学研究生（stud．scient.）Kare Lehmannにより行われた。
実施例８
ニジマスウィルスＶＨＳエンベロープグリコプロテインＧに由来する組換えフラグメントの大腸菌における産生および再生
ＦＸa切断可能融合タンパクとしての、ニジマスウィルスＶＨＳからのエンベロープグリコプロテインＧに由来する組換えフラグメントの大腸菌における発現と試験管内で（in vitro）の再生を、「周期的な再生工程」の一般的記述に示され、実施例１〜６に挙げられたものと類似の一般的戦略と方法を用いて行なった。
実施例９
ヒトテトラネクチン（Tetranectin）に由来する、組換えヒトテトラネクチンおよび組換えフラグメントの大腸菌における産生および再生
テトラネクチンは、１８１個のアミノ酸残基（１７ｋＤａ）の４つの同一かつ非共有結合的に連結した単鎖サブユニットからなる四量体タンパクである。各サブユニットは、３つのジスルフィド架橋を有し、Ｃａ2+を結合する。テトラネクチンは、血漿中に見いだされ、細胞外マトリックスと会合する。テトラネクチンは、プラスミノーゲンクリングル４に特異的に結合する。この結合は、リジンあるいはω−アミノ酸で特異的に滴定することができる。
アミノ酸残基Ｇｌｕ1からＶａｌ181までのヌクレオチド配列を、ポリメラーゼチェーンリアクション法（ＰＣＲ）（Saikiら、1988）で、ヒトの全胎盤ＲＮＡから合成した第一（１ｓｔ）鎖のオリゴ−ｄＴをプライマーとするｃＤＮＡを鋳型として用いて特異的に増幅することにより、成熟したテトラネクチン単鎖サブユニットに対応する読み取り枠をエンコードするｃＤＮＡをクローニングした。ＰＣＲにおいて用いられたプライマーは、配列番号３３および配列番号３４であった。ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成は標準手順を用いて行った。
テトラネクチンの単量体サブユニットをエンコードする増幅された読み取り枠を、５’末端においてＰＣＲ反応により、ウシ制限プロテアーゼＦＸaの切断部位を構成する配列番号３７のアミノ酸配列（Nagai，とThφgersen，1987）をエンコードするヌクレオチド配列に連結した。５’−ＰＣＲプライマー（配列番号３３）の特異的設計（design）のため、グリシン残基を、ＦＸa切断部位（配列番号３７）のＣ末端アルギニン残基とテトラネクチンＧｌｕ1−残基との間に挿入した。増幅されたＤＮＡフラグメントを大腸菌発現ベクターｐＴ7Ｈ6（Christensen et al.，1991）中に、サブクローニングした。得られたプラスミドｐＴ7Ｈ6ＦＸ−ＴＥＴＮ（テトラネクチン単量体を発現）の構成が図２０に示され、発現したタンパクのアミノ酸配列が図２１に示されている（配列番号５６に、完全長の読み取り枠によってエンコードされるアミノ酸配列を示す）。
テトラネクチン単量体を調製するため、プラスミドｐＴ7Ｈ6ＦＸ−ＴＥＴＮを、StudierとMoffat，J．Mol．Biol.，189: 113-130，1986に記載されているように、培地スケール（４×１リットル；２×ＴＹ培地、５ｍＭの硫酸マグネシウムおよび１００μｇのアンピシリン）で、大腸菌ＢＬ２１細胞中で増殖させた。３７℃で指数関数的に増殖する培養物を、ＯＤ600 ０．８で、約５の感染多重度でバクテリオファージλＣＥ６に感染させた。培養物を３７℃で更に３時間増殖させ、細胞を遠心分離により収集した。細胞を、０．５Ｍの塩化ナトリウム、１０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８および１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８の１５０ｍｌ中で再懸濁させた。フェノール（ｐＨ８に調節した１００ｍｌ）を加え、混合物を超音波処理してタンパク全部を抽出させた。２．５容量のエタノールおよび遠心分離によりフェノール相よりタンパクを沈澱させた。
６Ｍの塩化グアニジニウム、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８および０．１Ｍのジチオエリトリオールを含有する緩衝液に、タンパクペレットを溶解させた。セファデックスＧ−２５（スエーデンのファルマシア，ＬＫＢ）を用いて８Ｍの尿素、１Ｍの塩化ナトリウム、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８および１０ｍＭの２−メルカプトエタノール中にゲル濾過した後、融合タンパク、すなわちＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲ−ＴＥＴＮ（ここでＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲは配列番号４８である）の精製（Hochuliら，1988）のために、粗タンパク調製物を、Ｎｉ2+により活性化されたＮＴＡ−アガロースカラム（Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロース、８Ｍの尿素、１Ｍの塩化ナトリウム、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８および１０ｍＭの２−メルカプトエタノールで予め洗浄した７５ｍｌ）にアプライした。
Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムの調製と「負荷」は、実施例１に記載されている。
液体クロマトグラフィーのため調製した全ての緩衝液は、還元剤の添加および／または使用の前に真空下でガス抜きした。
カラムを、８Ｍの尿素、１Ｍの塩化ナトリウム、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８および１０ｍＭの２−メルカプトエタノールの２００ｍｌ（緩衝液Ｉ）、および６Ｍの塩化グアニジニウム、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８および１０ｍＭの２−メルカプトエタノールの１００ｍｌ（緩衝液ＩＩ）で洗浄した。ＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲ−ＴＥＴＮ融合タンパクを、１０ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８を含有する緩衝液ＩＩを用いて溶離させ、溶出物を、緩衝液Ｉを溶離液として用いてセファデックスＧ２５によりゲル濾過した。
次に、溶出したタンパクを再生させた。融合タンパクＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲ−ＴＥＴＮ（ここでＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲは配列番号４８である）に１００ｍｌのＮｉ2+ＮＴＡ−アガロースを混合した。結合したタンパクを含む樹脂を直径５ｃｍのカラムに詰め、塩化カルシウムを２ｍＭまで補足した緩衝液Ｉで洗浄した。融合タンパクを、表４に記載のようなグラジエント管理プロフィールを用いて、０．５Ｍの塩化ナトリウム、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８、２ｍＭの塩化カルシウムおよび２．０ｍＭ／０．２ｍＭの還元型／酸化型グルタチオンを緩衝液Ａとして、そして８Ｍの尿素、１Ｍの塩化ナトリウム、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８、２ｍＭの塩化カルシウムおよび３ｍＭの還元型グルタチオンを緩衝液Ｂとして用いて、Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラム上で１１〜１２℃で再生した。還元型／酸化型グルタチオン溶液は、緩衝液Ａに加える前に、９．９Ｍの過酸化水素を０．２Ｍの還元型グルタチオンの撹拌した溶液に加えることにより２００倍の保存溶液として新しく調製した。
周期的な折り畳み工程が完了した後、テトラネクチン融合タンパクを、０．５Ｍの塩化ナトリウムと５０ｍＭのトリス塩酸塩と２５ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８を含有する緩衝液を用いて、Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムから溶離させた。テトラネクチン融合タンパクを、ＦＸaを用いてモル比１：３００で一晩中４℃で切断した。ＦＸa切断後、タンパク試料を、ＹＭ１０膜（アミコン）を用いて限外濾過により、１０倍濃縮した。タンパク試料を２ｍＭの塩化カルシウムで１０倍希釈した後、Ｑ−セファロース（スエーデンのファルマシア）を用いるイオン交換クロマトグラフィーにより、１０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８と２ｍＭの塩化カルシウムから１０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８と２ｍＭの塩化カルシウムと０．５Ｍの塩化ナトリウムへの１０カラム容量かけた線形グラジエントで、組換えテトラネクチンを単離させた。
この工程により産生した組換えテトラネクチンは、CopenhagenのInge Clemmensen Rigshospitalet博士により分析された。プラスミノーゲンクリングル４への結合および抗原部位（antigenic sites）の発現に関して、組換えテトラネクチンが、天然に単離されたヒトテトラネクチンと同じ挙動を示すことを、Clemmensen博士は見いだした。
「周期的な再生工程」を用いた、Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムに結合している組換えテトラネクチン融合タンパクと透析袋に入っている組換えテトラネクチンとの再生効率を比較する予備実験は、溶液再生戦略からの可溶性単量体収量が有意に改善されたことを明示している。しかしながら、もし循環工程のいずれかの産物を、５ｍＭの塩化カルシウムの存在下溶液中でジスルフィド再編成（re-shuffling）させるならば、実質的に全てのポリペプチド材料が、正しく折り畳まれたテトラネクチン四量体に変換される。
透析袋に入っている変性し還元された組換え真正（authentic）テトラネクチンを、緩衝液Ｂ（６Ｍの尿素、１００ｍＭの塩化ナトリウム、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ＝８、２ｍＭ／０．２ｍＭの還元型／酸化型グルタチオン、２ｍＭの塩化カルシウムおよび０．５ｍＭのメチオニン）および緩衝液Ａ（１００ｍＭの塩化ナトリウム、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８、２ｍＭ／０．２ｍＭの還元型／酸化型グルタチオン、２ｍＭの塩化カルシウムおよび０，５ｍＭのメチオニン）に１５周期かけて暴露することにより、再生させた。
実施例１０
大腸菌の細胞内に発現させたジアボディ(ｄｉａｂｏｄｙ）の産生と折り畳み：腫瘍壊死因子に特異的なＭａｂ３２ジアボディ
ジアボディ（Hollinger et al.に記載、1993年）は、人工の二価二重特異性抗体フラグメントである。
この実施例では、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）に特異的な、マウスモノクローナル抗体Ｍａｂ３２(Rathjen et al.、1991年、1992年；オーストラリア特許出願7,576; EP-A-486,526）由来の、ジアボディの大腸菌内での産生を記載する。
ジアボディのフォーマット（ＰＣＴ／ＧＢ９３／０２４９２）中にエンコードされているＭａｂ３２を含むファージミドクローンｐＣＡＮＴＡＢ５−ｍｙｃ−Ｍａｂ３２−５は、Cambridge Antibody Technology (CAT) Ltd.，Cambridge，UKのG．Winter博士によって寛大にも提供された。ｐＣＡＮＴＡＢ５−ｍｙｃ−Ｍａｂ３２−５ＤＮＡは、配列番号３５および配列番号３６のプライマーを用いた、人工の完全ジアボディに対応するｃＤＮＡフラグメントを作るよう設計された、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）（Saiki et al.1988年）での鋳型として用いた。増幅コード読み取り枠を、５’末端で、ＰＣＲ反応を通して、ウシ制限プロテアーゼＦＸa（Nagai and Thogersen、1987年）の切断部位を構成する配列番号３７のアミノ酸配列をエンコードする配列番号３５に含まれる、ヌクレオチド配列に連結させた。増幅ＤＮＡフラグメントを、大腸菌発現ベクターｐＴ7Ｈ6にサブクローン化した（Christensen et al.、1991年）。得られたプラスミドｐＴ7Ｈ6ＦＸ−ＤＢ３２（Ｍａｂ３２ジアボディを発現）の構築は、図２２に略図が示されている。発現したタンパクのアミノ酸配列は、図２３に示されている（配列番号５７には、完全長の読み取り枠によってエンコードされたアミノ酸配列が示されている）。
ジアボディフラグメントを作成するために、プラスミドｐＴ7Ｈ6ＦＸ−ＤＢ３２を、Studier and Moffat，J．Mol．Biol.，189: 113-130、1986年に記載されているように、大腸菌ＢＬ２１細胞中に培地スケール（４×１リットル；２×ＴＹ培地、５ｍＭ ＭｇＳＯ4および１００μｇアンピシリン）で増殖させた。３７℃で指数関数的に増殖する培養物を、約５の多重度で、０Ｄ600 ０．８で、バクテリオファージλＣＥ６に感染させた。感染後４０分で、リファンピシンを加えた（培地１リットルにつき２ｍｌメタノール中に０．２ｇ）。培養物を、３７℃でさらに３時間増殖させ、細胞を遠心分離により収集した。細胞を、０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８、および１ｍＭのＥＤＴＡｐＨ８の１５０ｍｌ中に再懸濁させた。フェノール（１００ｍｌ、ｐＨ８に調整）を加え、全タンパクを抽出するために混合物を超音波処理した。タンパクを、２．５容量のエタノールと遠心分離によってフェノール相から沈殿させた。
タンパクペレットを、６Ｍの塩化グアニジニウム、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８および０．１Ｍのジチオエリトリオール（dithioerythriol）を含む緩衝液中に溶解した。セファデックスＧ−２５（ファルマシア、LKB、スウェーデン）を用いての８Ｍ尿素、１ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８および１０ｍＭの２−メルカプトエタノール中へのゲル濾過後、粗タンパク試料を、融合タンパクＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲ−ＤＢ３２（ここではＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲは配列番号４８である）の精製のために、Ｎｉ2+活性化ＮＴＡ−アガロースカラム（８Ｍ尿素、１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８および１０ｍＭの２−メルカプトエタノールで予め洗浄されたＮｉ2+ＮＴＡ−アガロース、７５ｍｌ）にアプライした。
Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムの調製と「負荷」については、実施例１に記載されている。
液体クロマトグラフィーのために調製した緩衝液はすべて、還元剤の添加および／もしくは使用に先立って、真空下でガス抜きをした。
カラムを、８Ｍ尿素、１ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８および１０ｍＭの２−メルカプトエタノール（緩衝液Ｉ）の２００ｍｌ、および６Ｍ塩化グアニジニウム、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８および１０ｍＭの２−メルカプトエタノール（緩衝液II）の１００ｍｌで洗浄した。ＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲ−ＤＢ３２融合タンパクを１０ｍＭのＥＤＴＡｐＨ８を含む緩衝液IIで溶離し、この溶離物を、緩衝液Ｉを溶離液として用いてセファデックスＧ２５でゲル濾過をした。
その後、溶離したタンパクを再生した。融合タンパクＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲ−ＤＢ３２（ここではＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲは配列番号４８である）を、１００ｍｌのＮｉ2+ＮＴＡ−アガロースと混合した。結合タンパクを含む樹脂を直径５ｃｍのカラムの中に詰め、緩衝液Ｉで洗浄した。融合タンパクを、表４に記載のグラジエント管理プロフィールと、緩衝液Ａとして０．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８および２．０ｍＭ／０．２ｍＭの還元型／酸化型グルタチオン、緩衝液Ｂとして８Ｍの尿素、１ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８および３ｍＭの還元型グルタチオンを用いて、１１〜１２℃でＮｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムで再生した。還元型／酸化型グルタチオン溶液は、緩衝液Ａに加える前に、０．２Ｍの還元型グルタチオンの撹拌溶液に９．９Ｍの過酸化水素を加えることにより２００倍保存溶液として新たに調製した。
周期的な折り畳み工程完了後、ＤＢ３２融合タンパクを、０．５ＭのＮａＣ、５０ｍＭのトリス塩酸塩および２５ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８を含みかつ５ｍＭのＧＳＨ、０．５ｍＭのＧＳＳＧに調整した緩衝液を用いて、Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムから溶離し、２０℃で１２ないし１５時間インキュベートした。その後、融合タンパクを、ＹＭ１０膜を用いて限外濾過により５０倍濃縮し、遠心分離によって浄化した。
ＤＢ３２融合タンパクダイマーを、ＰＢＳを溶離液として用いて、スーパーローズ１２カラム（ファルマシア、スェーデン）を用いたゲル濾過により精製した。
この工程によって得られた正しく折り畳まれたＤＢ３２融合タンパクの全収率は、１リットルにつき４ｍｇであった。
精製の異なる段階からの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は、図２６に示されている。
ＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲ（配列番号４８）Ｎ末端融合ペプチドは、制限プロテアーゼＦＸa（モル比率 １：５ ＦＸa：ＤＢ３２融合タンパク）を用いた切断により３７℃２０時間でＤＢ３２タンパクより切断された。このことは、図２６において、切断されていない融合タンパクのすぐ下のより低い分子量バンドの出現として示されている。
再生されたＤＢ３２タンパクは、Cambridge Antibody Techonology Ltd．(CAT)によって分析された。ＤＢ３２は、ＴＮＦ−αと特異的に結合し、ＴＮＦ−αとの結合については、Ｍａｂ３２抗体全体と競合することが分かった。さらに、ＤＢ３２とＭａｂ３２の両方は、ヒツジの抗−３０１抗血清によるＴＮＦ−αとの結合において競合する。ヒツジの抗−３０１抗血清は、ヒトのＴＮＦ−αの最初の１８個のアミノ酸をエンコードするペプチドでヒツジを免疫することによって生じ、マウスのＭａｂ３２によって認識されるエピトープの一部を少なくとも含むものである。
実施例１１
ヒトサライアシン（psoriasin）の大腸菌内での産生と再生
サライアシンは、１００個のアミノ酸残基からなるシングルドメインのＣａ2+−結合タンパクである。サライアシンは、単一のジスルフィド架橋を含んでいる。Ｓ１００タンパク群に属すると信じられるタンパクは、乾癬皮膚および通常でない分化をうけているヒトの一次ケラチン細胞中で高度に調節されている。
プラスミドｐＴ7Ｈ6ＦＸ−ＰＳ．４（Insitute of Medical Biochemistry，University of Aarhus，DemkarkのP．Madsen博士により親切にももたらされた）は、Hoffmannらによって先に記載された（1994年）。Ｓｅｒ2からＧｌｎ101までのサライアシンタンパクをエンコードするヌクレオチド配列は、アミノ酸配列ＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲ（配列番号４８）をエンコードするヌクレオチド配列に５’末端で連結されている。ｐＴ7Ｈ6ＦＸ−ＰＳ．４の地図は、図２４に示されており、ヒトサライアシンのアミノ酸配列は、図２５に示されている（配列番号５８には、完全長の読み取り枠によってエンコードされたアミノ酸配列が示されている）。
組換えヒトサライアシンを、大腸菌ＢＬ２１細胞中のプラスミドｐＴ7Ｈ6ＦＸ−ＰＳ．４から増殖発現させ、全細胞タンパクを、記載のごとく（Hoffmann et al.，1994年）抽出した。エタノール沈殿させた全タンパクを、６Ｍの塩化グアニジニウム、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８および５０ｍＭのジチオエリトリオールを含む緩衝液中に溶解した。セファデックスＧ−２５（Pharmacia，LKB、スウェーデン）を用いて８Ｍ尿素、０．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８および５ｍＭの２−メルカプトエタノール中へゲル濾過した後、粗タンパク試料を、融合タンパクＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲ−サライアシン（ここではＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲは配列番号４８である）の精製（Hochuli et al.，1988年）のために、Ｎｉ2+活性化ＮＴＡ−アガロースカラム（Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロース）にアプライし、続いて周期的な折り畳み工程を施した。
Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムの調製と「負荷」については、実施例１に記載されている。
液体クロマトグラフィーのために調製した緩衝液はすべて、還元剤の添加および／もしくは使用に先立って、真空下でガス抜きをした。
Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムに粗タンパク抽出物をアプライした後、融合タンパクＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲ−サライアシン（ここではＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＩＥＧＲは、配列番号４８である）を、溶出液の２８０ｎｍの吸光度（ＯＤ）が安定するまで１カラム量のローディングバファー、続いて６Ｍの塩化グアニジニウム、５０ｍＭのトリス塩酸塩および５ｍＭの２−メルカプトエタノールで洗浄することによって、大腸菌とλファージ・タンパクの大部分から精製した。
融合タンパクを、表４に記載のグラジエント管理プロフィールと、緩衝液Ａとして０．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８、２ｍＭのＣａＣｌ2および１．０ｍＭ／０．１ｍＭの還元型／酸化型グルタチオン、緩衝液Ｂとして８Ｍの尿素、０．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８、２ｍＭのＣａＣｌ2および５ｍＭの還元型グルタチオンを用いて、Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムで再生した。還元型／酸化型グルタチオン溶液は、緩衝液Ａに加える前に、０．２Ｍの還元型グルタチオンの撹拌溶液に９．９Ｍの過酸化水素を加えることにより２００倍保存溶液として新たに調製した。
周期的な折り畳み処置完了後、サライアシン融合タンパクを、０．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス塩酸塩、１０ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８を含む緩衝液で、Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムから溶離させた。Ｎｉ2+ＮＴＡ−アガロースカラムに凝集沈殿した融合タンパクを、緩衝液Ｂ中に溶離させた。
融合タンパク材料の約９５％が、非変性溶離緩衝液によって溶離した。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により判断すると、この可溶性融合タンパク材料の７５％が単量体と思われ、折り畳み工程の全体としての効率は、約７０％であった。組換えヒトサライアシンの産生（Hoffman et al.，1994年）に関する先に述べた再生工程の効率は、２５％に満たないと評価された。
サライアシン融合タンパクを、モル比率１００：１のＦＸaにより室温で４８時間で切断した。セファデックスＧ−２５を用いて２０ｍＭのナトリウムアセテートｐＨ５と２０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液中にゲル濾過した後、タンパク試料を、Ｓ−セファロースイオン交換カラム（Pharmacia）にアプライした。単量体の組換えサライアシンは、２０ｍＭのナトリウムアセテートｐＨ８と２０ｍＭのＮａＣｌから０．５ＭのＮａＣｌへの線形グラジエントによって５カラム容量かけて溶離した。単量体のサライアシンは、１５０ｍＭのＮａＣｌで溶離した。切断されない融合タンパクとともにサライアシンの二量体と高次の多量体は、グラジエントの後の方で溶離した。切断された精製組換えタンパクを含むフラクションを、セファデックスＧ２５を用いて、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ７．４を含む緩衝液中にゲル濾過し、４℃で保存した。
実施例１２
チオール化合物の周期的な再生における還元剤としての使用適性テストの評価手順、および周期的な再生工程を最大限活用するための変性剤およびジスルフィド再編成剤の最適レベル決定
周期的な再生から得られる正しく折り畳まれたタンパクの収率を上げるためには、産生周期数を最大にするべきである（発明の概要を参照）。産生周期は、その周期の再生工程において、誤って折り畳まれたタンパクが行き止まりの凝集配座状態へ向かう途中で折り畳まれない配座状態へと救出され、一方すでに正しく折り畳まれたタンパクのほとんどは再生した状態へとはね返ることのできる立体配座状態に留まる、変性の工程によって特徴づけられる。
いくらかのジスルフィド架橋を含むタンパクは、β2−ミクログロブリンのように、そのジスルフィド架橋が無傷で有る限り高レベルの変性剤にさらした場合、高い効率で（＞９５％）再生することが知られている。
この実施例では、周期的な再生に用いるチオール化合物の適性を正しいジスルフィド架橋と誤ったジスルフィド架橋を見分ける能力に基づいて評価する方法、および変性工程で用いる変性剤および／もしくは還元剤のレベルを産生周期数を最大にするために最適化する方法を記載する。モデル系として、精製した組換えヒトβ2−ミクログロブリンの単、二、および多量体形態の混合を選んだ。その具体的な目的は、変性剤の濃度を換えた場合の、５つの異なる還元剤による還元に対する、異なるトポロジー形態のヒトβ2−ミクログロブリンの安定性を分析することであった。
６Ｍの塩化グアニジニウム、５０ｍＭトリス塩酸塩および１０ｍＭの２−メルカプトエタノールｐＨ８中のヒトβ2−ミクログロブリン（実施例１３で記載するように産生された）を、非変性緩衝液（５０ｍＭのトリス塩酸塩、０．５ＭのＮａＣｌ ｐＨ８）中にゲル濾過した。サンプル中のタンパクフラクションのみが非変性緩衝液中に溶解した。４８時間空気中にさらした後、タンパク溶液は不透明になった。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によると、おおかたのタンパクが酸化されて多量体の形態になり、ちいさなフラクションのみが酸化され単量体であると分かった（図２７、レーン１）
タンパク溶液をいくつかのチューブにアリコート分割し、タンパクと塩の濃度を一定のレベルに保って、尿素の量を変えて加えた。
グルタチオン、シスチンエチルエステル、Ｎ−アセチル−Ｌ−シスチン、メルカプトコハク酸または２−メルカプトエタノールのいずれかの還元剤を、種々の尿素の濃度を有するタンパクサンプルの集合体に加えた。各還元剤を終濃度４ｍＭまで加えた。タンパクサンプルを室温で１０分間インキュベートし、その後、ヨード酢酸を終濃度１２ｍＭまで加えることによって遊離チオール基を遮断した。最後に、タンパクサンプルを、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した（図２７−３２）。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いたテストサンプルの組成は、結果と同様、以下の表に示されている。ジスルフィド架橋を還元するために選ばれた還元剤の能力を表す行において、「＋＋＋」の印は良い能力を表し、「＋＋」は中間の能力を表し、「＋」は弱い能力を表し、一方印のないものは測定できる効果が見られなかったことを表す。
Figure 0003695467
Figure 0003695467
Figure 0003695467
Figure 0003695467
Figure 0003695467
異なるトポロジー形態のβ2−ｍは、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動法によって分離させることができる。最も早く泳動するバンドは、酸化単量体型を表している。このバンドのすぐ後に、ほんの少し遅い泳動速度を有する還元型β2−ｍが続き、一方多量体形態のタンパクはゲル中をずっとゆっくりと泳動している。
この分析では、単量体の酸化型形態における正しく形成されたジスルフィド架橋を有意に還元することなくβ2−ミクログロブリンの多量体におけるジスルフィド架橋を還元するための、テストした５つの還元剤のそれぞれの能力を検証している。
要約すると、分析の結果（図２７−３２）は、次のようである：Ｎ−アセチル−Ｌ−システインとメルカプトコハク酸は、使用された条件下では、正しいジスルフィド架橋と誤ったジスルフィド架橋を区別することが本質的にできない。グルタチオン、システインエチルエステルおよび２−メルカプトエタノールはすべて、−１０分以内に尿素濃度の各特徴的な範囲内で−多量体形態のジスルフィド架橋を有意に還元することができ、この時酸化単量体β2−ｍは酸化型のままである。グルタチオンは、システインエチルエステルおよび２−メルカプトエタノールと比べてより高い尿素濃度で、誤ったジスルフィド架橋を選択的に還元する能力を明らかに有し、従って、選択しテストしたチオール類の中で、グルタチオンがヒトβ2−ミクログロブリンの周期的な再生のために選択すべき還元剤であろう。これらの実験の結果、実例１３で用いる再生手順用の還元緩衝液Ｂ中の尿素の濃度を、８Ｍ（実施例１）から６Ｍに下げ、そのためにヒトβ2−ミクログロブリンの全再生収率は、５３％から８７％に改善された。
実施例１３
精製したヒトβ2−ミクログロブリンの再生： ３つの再生工程の比較分析
強い変性および還元条件から非変性および非還元条件への段階的または漸進的な１回（ワンパス）のトランジション（遷移）を伴う単純な再生工程に対する再生収率に関する循環の重要性を評価する比較可能な量的データを得るために、次の一連の実験に着手した。
実施例１に記載のごとく得られた、精製した再生組換えβ2−ミクログロブリン融合タンパクを、タンパク分解産物または不可逆酸化またはその他の化学的誘導によって損傷を受けた微量の融合タンパクフラクションのような不順物を含まない原料を得るために、還元変性した。
まず始めに、産生周期数を増すために実施例１に記載の周期的な再生の条件を修正するため、実施例１２記載の最適化工程を用いた。最適化した再生プロトコールは、この実験の緩衝液Ｂが６Ｍの尿素、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８、０．５ＭのＮａＣｌおよび４ｍＭのグルタチオンであった点を除いて、緩衝液およびその他の実験パラメータ同様、実施例１に記載したものと同一であった。
この緩衝液Ｂの組成を用いて、実施例１に記載したようにＮｉ++−負荷ＮＴＡ−アガロースに付着させて、純粋な融合タンパクの３バッチを再生した。１つのバッチを実施例１に記載した緩衝液循環に付し、バッチ２と３の循環を単純線形緩衝液グラジエント（２４時間かけて１００％Ｂから０％Ｂに）および段階グラジエント（１段階で１００％Ｂから０％Ｂに、続いて０％Ｂ緩衝液で２４時間）にそれぞれ置き換えた。各再生実験において、すべてのポリペプチド材料を、実施例１に記載のように、非変性条件下で溶離できる可溶性フラクションと変性および還元条件下でのみ溶離できる残りの不溶性フラクションとして回収した。可溶性フラクション中の可溶性ポリマーから正しくジスルフィド架橋した単量体を分離させるのに必要とされるような、適切に希釈し測定した可溶性および不溶性フラクションのアリコートを還元または非還元条件下で分離するクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの定量濃度分析（Hoeffer Scientific，CA，USAの光学スキャナーＨＷおよびＧＳ−３７０濃度分析SWパッケージ)を用いて、正しく折り畳まれた融合タンパクの収率を測定した。ゲルレーンにおける強いバンドと弱いバンドの両方についての信頼できる濃度のデータを得る必要がある場合には、規模を縮小したデータ組を得るために、いくつかの希釈サンプルをスキャンし分析した。
実験の詳細と結果
精製した変性および還元融合タンパク：
ヒトβ2−ミクログロブリン融合タンパクの１バッチを実施例１記載のように再生した。この融合タンパクの９６％が、可溶性フラクション中に回収された（図３２、レーン２−５）。この可溶性フラクションの５６％が、単量体でジスルフィド架橋した形態であった。従って、得られた全再生効率は５３％であった。Ｓ−セファロース（Pharmacia，Sweden）を用いてイオン交換クロマトグラフィーによって、単量体の融合タンパクを多量体から精製した。再生後得られた可溶性フラクションを、セファデックスＧ−２５（Pharmacia，Sweden）を用いて５ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８を含む緩衝液中にゲル濾過し、水で２倍容量に希釈し、次いでＳ−セファロースカラムにアプライし、その後、グラジエントを用いて溶離した（２．５ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８と２．５ｍＭのＮａＣｌから２５ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８と１００ｍＭのＮａＣｌへ５カラム容量）。その後、純度＞９５％まで精製した正しく折り畳まれた単量体の融合タンパク（図３２、レーン６および７）を、塩酸グアニジニウム中で６ＭおよびＤＴＥ中で０．１Ｍにし、８Ｍの尿素、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８、１ＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む緩衝液中にゲル濾過し、その後下記に記載する再生実験の原料として使用するためにアリコートに分けた。
精製融合タンパクの周期的な再生：
変性還元融合タンパクの１アリコートをＮｉ++−負荷ＮＴＡカラムにアプライし、次いでカラムを１カラム容量の６Ｍの塩酸グアニジニウム、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８および１０ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む緩衝液で洗浄した。
その後、緩衝液Ａ：５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８、０．５ＭのＮａＣｌおよび３．２ｍＭ／０．４ｍＭの還元型／酸化型グルタチオンと緩衝液Ｂ：５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８、０．５ＭのＮａＣｌ、６Ｍの尿素および４ｍＭの還元型グルタチオンを用いて、表１に示した計画に従って、融合タンパクを緩衝液循環にかけた。緩衝液循環完了後、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８、０．５ＭのＮａＣｌおよび２０ｍＭのＥＤＴＡを含む緩衝液を用いたカラムの溶離によって、融合タンパクを定量的に可溶性の形態で回収した。８７％が単量体の正しくジスルフィド架橋した形態で得られた。
線形グラジエントによる精製融合タンパクの再生：
変性還元融合タンパクの１アリコートをＮｉ++−負荷ＮＴＡカラムにアプライし、次いでカラムを１カラム容量の６Ｍの塩酸グアニジニウム、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８および１０ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む緩衝液で、続いて１カラム容量の５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８、０．５ＭのＮａＣｌ、６Ｍの尿素および４ｍＭの還元型グルタチオンを含む緩衝液で洗浄した。
その後、緩衝液Ａ：５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８、０．５ＭのＮａＣｌおよび３．２ｍＭ／０．４ｍＭの還元型／酸化型グルタチオンと緩衝液Ｂ：５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８、０．５ＭのＮａＣｌ、６Ｍの尿素および４ｍＭの還元型グルタチオンを用いて、２４時間の１００％Ｂから１００％Ａへの線形グラジエントを２ｍｌ／分で適用した。グラジエンント完了後、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８、０．５ＭのＮａＣｌおよび２０ｍＭのＥＤＴＡを含む緩衝液中に、融合タンパクの可溶性フラクションを溶離した。残った不溶性フラクションを、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８、１ＭのＮａＣｌ、８Ｍの尿素、１０ｍＭの２−メルカプトエタノールおよび２０ｍＭのＥＤＴＡを含む緩衝液中にカラムから抽出した。
融合タンパクの４８％が可溶性フラクション中に回収され、この可溶性フラクションの６０％が単量体の正しくジスルフィド架橋した形態で回収された。従って、得られた全再生効率は、２９％であった(図３３、レーン５−７）。
緩衝液段階法による精製融合タンパクの再生：
変性還元融合タンパクの１アリコートをＮｉ++−負荷ＮＴＡカラムにアプライし、次いでカラムを１カラム容量の６Ｍの塩酸グアニジニウム、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８および１０ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む緩衝液で洗浄した。
次いで、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８、０．５ＭのＮａＣｌおよび２０ｍＭのＥＤＴＡを含む緩衝液中に融合タンパクの可溶性フラクションを回収する前に、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８、０．５ＭのＮａＣｌおよび３．２ｍＭ／０．４ｍＭの還元型／酸化型グルタチオンを含む緩衝液を２４時間２ｍｌ／分でカラムに適用した。残った不溶性フラクションを、５０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８、１ＭのＮａＣｌ、８Ｍの尿素、１０ｍＭの２−メルカプトエタノールおよび２０ｍＭのＥＤＴＡを含む緩衝液中にカラムから抽出した。
融合タンパクの３４％が可溶性フラクション中に回収され、この可溶性フラクションの２８％が単量体の正しくジスルフィド架橋した形態で回収された。従って、得られた全再生効率は、９．５％であった（図３３、レーン１−３）。
結論
要約すると、モデルタンパクとしてヒトβ2−ミクログロブリンを用いた時、（ａ）周期的な再生に先立つ直接的な緩衝液最適化および融合タンパクの改良された精製は、再生収率を有意に増加させ（５３％から８７％へ）、（ｂ）連続的な変性−復元循環は、他の面では同等な実験条件の下で１回の再生より非常に大きな率で優れている（８７％対２９％または９．５％収率）ことが、結論として得られるであろう。
参考文献
Figure 0003695467
Figure 0003695467
配列のリスト
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名称：デンザイム エーピーエス
（Ｂ）通り：ガスタブ ウェズ ベイ １０
（Ｃ）都市：アラス シー
（Ｅ）国 ：デンマーク
（Ｆ）郵便番号：８０００
（ｉｉ）発明の名称：タンパクを再生するための改良された方法
（ｉｉｉ）シークエンスナンバー：４７
（ｉｖ）コンピューター読み取り型：
（Ａ）媒体の型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ互換性
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：Ｐａｔｅｎｔ Ｉｎ Ｒｅｌｅａｓｅ ＃１．０，Ｖｅｒｓｉｏｎ ＃１．２５ （ＥＰＯ）
（２）配列番号：１についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５５４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）仮説：あり
（ｉｉｉ）アンチセンス：なし
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物：Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称／鍵：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：７６．．１５５１
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：１：
Figure 0003695467
Figure 0003695467
Figure 0003695467
（２）配列番号：２についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４９２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：タンパク
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：２：
Figure 0003695467
Figure 0003695467
（２）配列番号：３についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：３：
Figure 0003695467
（２）配列番号：４についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：４：
Figure 0003695467
（２）配列番号：５についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：５：
Figure 0003695467
（２）配列番号：６についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：６：
Figure 0003695467
（２）配列番号：７についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：７：
Figure 0003695467
（２）配列番号：８についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：８：
Figure 0003695467
（２）配列番号：９についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：９：
Figure 0003695467
（２）配列番号：１０についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：１０：
Figure 0003695467
（２）配列番号：１１についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：１１：
Figure 0003695467
（２）配列番号：１２についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：１２：
Figure 0003695467
（２）配列番号：１３についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：１３：
Figure 0003695467
（２）配列番号：１４についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：１４：
Figure 0003695467
（２）配列番号：１５についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：１５：
Figure 0003695467
（２）配列番号：１６についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：１６：
Figure 0003695467
（２）配列番号：１７についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：１７：
Figure 0003695467
（２）配列番号：１８についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：１８：
Figure 0003695467
（２）配列番号：１９についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：１９：
Figure 0003695467
（２）配列番号：２０についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：２０：
Figure 0003695467
（２）配列番号：２１についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：２１：
Figure 0003695467
（２）配列番号：２２についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：２２：
Figure 0003695467
（２）配列番号：２３についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：２３：
Figure 0003695467
（２）配列番号：２４についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：２４：
Figure 0003695467
（２）配列番号：２５についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：２５：
Figure 0003695467
（２）配列番号：２６についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：２６：
Figure 0003695467
（２）配列番号：２７についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：２７：
Figure 0003695467
（２）配列番号：２８についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：２８：
Figure 0003695467
（２）配列番号：２９についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：２９：
Figure 0003695467
（２）配列番号：３０についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：３０：
Figure 0003695467
（２）配列番号：３１についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：３１：
Figure 0003695467
（２）配列番号：３２についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：３２：
Figure 0003695467
（２）配列番号：３３についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：３３：
Figure 0003695467
（２）配列番号：３４についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：３４：
Figure 0003695467
（２）配列番号：３５についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：３５：
Figure 0003695467
（２）配列番号：３６についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成）
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：３６：
Figure 0003695467
（２）配列番号：３７についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：３７：
Figure 0003695467
（２）配列番号：３８についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：３８：
Figure 0003695467
（２）配列番号：３９についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：３９：
Figure 0003695467
（２）配列番号：４０についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：４０：
Figure 0003695467
（２）配列番号：４１についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：４１：
Figure 0003695467
（２）配列番号：４２についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：４２：
Figure 0003695467
（２）配列番号：４３についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：４３：
Figure 0003695467
（２）配列番号：４４についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：４４：
Figure 0003695467
（２）配列番号：４５についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：４５：
Figure 0003695467
（２）配列番号：４６についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：４６：
Figure 0003695467
（２）配列番号：４７についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：４７：
Figure 0003695467
（２）配列番号：４８についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：４８：
Figure 0003695467
（２）配列番号：４９についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：タンパク
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：４９：
Figure 0003695467
（２）配列番号：５０についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：タンパク
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：５０：
Figure 0003695467
（２）配列番号：５１についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２１７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：タンパク
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：５１：
Figure 0003695467
（２）配列番号：５２についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４５４４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：タンパク
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：５２：
Figure 0003695467
Figure 0003695467
Figure 0003695467
Figure 0003695467
Figure 0003695467
Figure 0003695467
Figure 0003695467
Figure 0003695467
Figure 0003695467
Figure 0003695467
Figure 0003695467
Figure 0003695467
Figure 0003695467
Figure 0003695467
Figure 0003695467
Figure 0003695467
（２）配列番号：５３についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４８７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：タンパク
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：５３：
Figure 0003695467
Figure 0003695467
Figure 0003695467
（２）配列番号：５４についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：７９０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：タンパク
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：５４：
Figure 0003695467
Figure 0003695467
Figure 0003695467
（２）配列番号：５５についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：タンパク
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：５５：
Figure 0003695467
（２）配列番号：５６についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：タンパク
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：５６：
Figure 0003695467
（２）配列番号：５７についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２４６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：タンパク
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：５７：
Figure 0003695467
（２）配列番号：５８についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１０１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：タンパク
（ｘｉ）配列の記載： 配列番号：５８：
Figure 0003695467

Claims (17)

  1. ポリペプチド分子の初期集合体を、一連の
    １）集合体におけるポリペプチドのフラクションを変性するように、集合体のポリペプチド分子に対して変性および／または折り畳みを解く作用を及ぼす条件からなる変性工程と、それに続く
    ２）集合体における変性されかつ／または折り畳まれていないポリペプチドのフラクションを復元するように、前工程から得られる立体配座を有するポリペプチド分子に対して復元作用を有する条件からなる復元工程
    からなり、かつポリペプチド分子の処理集合体が
    ａ）初期集合体および
    ｂ）１周期のみに付された対応する初期集合体
    よりも高い、正しく折り畳まれた立体配座にあるポリペプチド分子のフラクションを有するように適合されている、連続した５回以上の周期の系列に付すことからなる、表される立体配座状態が折り畳まれていないかまたは誤って折り畳まれた立体配座にあるポリペプチド分子の実質的なフラクションを含み、かつポリペプチド分子の処理集合体と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド分子の初期集合体から、処理集合体において表現された立体配座状態が正しく折り畳まれた立体配座にあるポリペプチド分子の実質的フラクションを含むポリペプチド分子の処理集合体を発生する方法。
  2. 処理集合体のポリペプチド分子がシステイン含有分子を含み、かつ処理集合体が、１つの正しく折り畳まれた立体配座にあり、更に各ペプチド分子が同一のジスルフィド架橋トポロジーを有するポリペプチド分子の実質的フラクションを含有する請求項１に記載の方法。
  3. 系列が、８〜２０００周期からなる請求項１又は２に記載の方法。
  4. 各々個別の変性工程における変性条件をある一定の時間一定に保ち、かつ各々個別の復元工程における復元条件をある一定の時間一定に保ち、条件を一定に保つ時間を、条件を変化させる遷移時間によって分離する請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
  5. 変性工程の変性条件を一定に保つ時間が１〜１０分の間の持続時間を有し、かつ再生工程の再生条件を一定に保つ時間が１〜４５分の間の持続時間を有する請求項４に記載の方法。
  6. ポリペプチド分子が、特定のペプチド結合で切断剤によって優先的切断を行うことができるポリペプチドセグメントからなる請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
  7. 切断を行うポリペプチドセグメントが、臭化シアン、ヒドロキシルアミン、ヨードソ安息香酸、Ｎ−ブロモスクシンイミド、およびウシ凝固因子Ｘaおよびウシエンテロキナーゼのような酵素からなる群から選択される切断剤によって、特定のペプチド結合での優先的切断を行うことができるものである請求項６に記載の方法。
  8. 優先的切断を行うポリペプチドセグメントが、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４１および配列番号４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドセグメントのような、ウシ凝固因子Ｘaによって選択的に認識される配列である請求項６または７に記載の方法。
  9. 初期集合体のポリペプチドが、組換えＤＮＡ技法によって原核細胞中で産生された人工ポリペプチドである請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法。
  10. ポリペプチド分子が、変性および復元工程中に水性相と接触する請求項１〜９のいずれか１つに記載の方法。
  11. ポリペプチド分子が、ポリペプチド分子を浮遊させて運ぶことなく液相を変化あるいは交換させる環境に閉じ込められる請求項１０に記載の方法。
  12. ポリペプチド分子が、フィルター表面、中空ファイバーまたはビーズ状クロマトグラフィー媒体、繊維状セルロースマトリックス、ＨＰＬＣまたはＦＰＬＣマトリックス、液相に溶解または分散させた時ポリペプチド分子が結合した分子を濾過によって残留させることのできるようなサイズの分子を有する物質、ミセルを浮遊させて運ぶことなく液相を変化または交換させながらミセルを形成できるかまたはミセルの形成に関与できる物質、または水溶性ポリマーのような固体または半固体の担体に結合される請求項１１に記載の方法。
  13. 遷移時間中における条件の変化が、ポリペプチド分子の接触している変性溶液Ｂ中の変性作用を有する化合物の濃度を変化させることにより達成される請求項１０〜１２のいずれか１つに記載の方法。
  14. 変性工程および／または復元工程に用いられる液相が、ジスルフィド再編成システムを含む請求項１０〜１３のいずれかに記載の方法。
  15. 液相の化学変化が、変性溶液Ｂおよび復元溶液Ａの間での取り替えにより達成される請求項１３に記載の方法。
  16. 変性溶液Ｂ中で変性作用を有する化合物の濃度が、各周期後に減少される請求項１５に記載の方法。
  17. ポリペプチド分子の初期サンプルが、折り畳まれていないかまたは誤って折り畳まれたジアボディ分子（人工の二重特異性および二価抗体フラグメント）またはジアボディ分子の単量体の成分である請求項１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
JP51754494A 1993-02-04 1994-02-04 タンパクを再生するための改良された方法 Expired - Fee Related JP3695467B2 (ja)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK13093A DK13093D0 (da) 1993-02-04 1993-02-04 Processing of proteins
DK13993A DK13993D0 (da) 1993-02-05 1993-02-05 Processing of proteins
PCT/GB1993/002492 WO1994013804A1 (en) 1992-12-04 1993-12-03 Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
WO139/93 1993-12-03
WO93/02492 1993-12-03
WO130/93 1993-12-03
PCT/DK1994/000054 WO1994018227A2 (en) 1993-02-04 1994-02-04 Improved method for the refolding of proteins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH08506243A JPH08506243A (ja) 1996-07-09
JP3695467B2 true JP3695467B2 (ja) 2005-09-14

Family

ID=26063372

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP51754494A Expired - Fee Related JP3695467B2 (ja) 1993-02-04 1994-02-04 タンパクを再生するための改良された方法

Country Status (14)

Country Link
US (2) US5739281A (ja)
EP (1) EP0686162B1 (ja)
JP (1) JP3695467B2 (ja)
KR (1) KR100310739B1 (ja)
AT (1) ATE241642T1 (ja)
AU (1) AU674568B2 (ja)
CA (1) CA2155335C (ja)
DE (1) DE69432744T2 (ja)
DK (1) DK0686162T3 (ja)
ES (1) ES2199959T3 (ja)
FI (1) FI113272B (ja)
NO (1) NO316274B1 (ja)
NZ (1) NZ261571A (ja)
WO (1) WO1994018227A2 (ja)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE241642T1 (de) * 1993-02-04 2003-06-15 Denzyme Aps Verbessertes verfahren zur rückfaltung der proteine
AU6284896A (en) * 1995-06-22 1997-01-22 Eli Lilly And Company Obesity protein intermediates and their preparation and use
US7368111B2 (en) 1995-10-06 2008-05-06 Cambridge Antibody Technology Limited Human antibodies specific for TGFβ2
WO1997017438A1 (fr) * 1995-11-07 1997-05-15 Toshio Tanaka Procede de clonage par expression d'un gene codant une proteine liee a un ligand
US6277618B1 (en) * 1996-06-06 2001-08-21 Roche Diagnostics Gmbh Recombinant blood-coagulation proteases
AU736707B2 (en) 1997-06-11 2001-08-02 Anaphore, Inc. Trimerising module
US20030207402A1 (en) * 1997-08-22 2003-11-06 Erhard Kopetzki Autocatalytically activatable zymogenic precursors of proteases and their use
US6492497B1 (en) 1999-04-30 2002-12-10 Cambridge Antibody Technology Limited Specific binding members for TGFbeta1
CA2406236C (en) * 2000-04-17 2013-02-19 Dyax Corp. Novel methods of constructing libraries of genetic packages that collectively display the members of a diverse family of peptides, polypeptides or proteins
US8288322B2 (en) 2000-04-17 2012-10-16 Dyax Corp. Methods of constructing libraries comprising displayed and/or expressed members of a diverse family of peptides, polypeptides or proteins and the novel libraries
AU2001280436A1 (en) * 2000-07-12 2002-01-21 Eli Lilly And Company Process to increase protein stability
AU2001296303A1 (en) * 2000-09-22 2002-04-02 Ramot At Tel Aviv University Ltd. A soluble beta 2 microglobulin (beta2m)/hfe monochain for biotechnological and therapeutic applications
EP2343317A1 (en) 2000-11-10 2011-07-13 F. Hoffmann-La Roche Ltd. Apolipoprotein analogues
EP2284270A3 (en) 2000-12-13 2012-07-25 Anaphore, Inc. Method for the identification and isolation of binding polypeptides from combinatorial libraries of proteins having the scaffold structure of C-type lectin-like domains
CA2430953A1 (en) 2000-12-13 2002-06-20 Borean Pharma A/S Combinatorial libraries of proteins having the scaffold structure of c-type lectin-like domains
PT2316940E (pt) 2000-12-18 2013-10-16 Dyax Corp Bibliotecas orientadas de pacotes genéticos
US20060252917A1 (en) * 2001-02-08 2006-11-09 University Of Utah Methods for refolding conformationally constrained peptides
DE10105912A1 (de) * 2001-02-09 2002-08-14 Roche Diagnostics Gmbh Rekombinante Proteinase K
CA2491488A1 (en) * 2002-07-09 2004-01-15 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
EP1382614A1 (en) * 2002-07-15 2004-01-21 Bayer HealthCare AG Process for the purification of interleukin-4 and its muteins
US20040067532A1 (en) 2002-08-12 2004-04-08 Genetastix Corporation High throughput generation and affinity maturation of humanized antibody
US20040072262A1 (en) * 2002-10-11 2004-04-15 Montero-Julian Felix A. Methods and systems for detecting MHC class I binding peptides
EP2311867A1 (en) 2002-10-29 2011-04-20 Anaphore, Inc. Trimeric binding proteins for trimeric cytokines
WO2004044166A2 (en) * 2002-11-12 2004-05-27 Incyte Corporation Carbohydrate-associated proteins
AU2004232405B2 (en) 2003-04-23 2008-06-19 F. Hoffman - La Roche Ltd. Cleavage of fusion proteins using granzyme B protease
US20100028995A1 (en) * 2004-02-23 2010-02-04 Anaphore, Inc. Tetranectin Trimerizing Polypeptides
US7482148B2 (en) * 2004-03-30 2009-01-27 Sudershan Biotech Ltd. Recombinant calf-chymosin and a process for producing the same
AU2005310305A1 (en) * 2004-10-22 2006-06-08 Amgen Inc. Methods for refolding polypeptides
US8940871B2 (en) * 2006-03-20 2015-01-27 The Regents Of The University Of California Engineered anti-prostate stem cell antigen (PSCA) antibodies for cancer targeting
EP1845103B1 (en) * 2006-04-10 2015-02-25 Boehringer Ingelheim RCV GmbH & Co KG Method for refolding a protein
JP6126773B2 (ja) 2007-09-04 2017-05-10 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 癌のターゲッティングおよび検出のための高親和性抗前立腺幹細胞抗原（ｐｓｃａ）抗体
US8877688B2 (en) * 2007-09-14 2014-11-04 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
US8691730B2 (en) 2007-09-14 2014-04-08 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
US8324151B2 (en) * 2007-11-20 2012-12-04 The Feinstein Institute For Medical Research Treatment of sepsis and septic shock using ghrelin and growth hormone
WO2009114815A1 (en) 2008-03-13 2009-09-17 Dyax Corp Libraries of genetic packages comprising novel hc cdr3 designs
ES2528963T3 (es) 2008-04-24 2015-02-13 Dyax Corp. Bibliotecas de paquetes genéticos que comprenden nuevos diseños de CDR1, CDR2, y CDR3 de HC y nuevos diseños de CDR1, CDR2, y CDR3 de LC
EP2376105B1 (en) * 2008-12-18 2015-07-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Nkg2d-fc for immunotherapy
WO2011032181A2 (en) * 2009-09-14 2011-03-17 Dyax Corp. Libraries of genetic packages comprising novel hc cdr3 designs
EP2499255A4 (en) * 2009-11-09 2013-06-19 Univ Colorado Regents EFFECTIVE PRODUCTION OF PEPTIDES
CN105734678B (zh) 2010-07-16 2019-11-05 阿迪马布有限责任公司 合成多核苷酸文库
EP2420253A1 (en) 2010-08-20 2012-02-22 Leadartis, S.L. Engineering multifunctional and multivalent molecules with collagen XV trimerization domain
US20150139991A1 (en) 2010-10-15 2015-05-21 Leadartis, S.L. Generation of multifunctional and multivalent polypeptide complexes with collagen xviii trimerization domain
EP2441776A1 (en) 2010-10-15 2012-04-18 Leadartis, S.L. Generation of multifunctional and multivalent polypeptide complexes with collagen XVIII trimerization domain
JP2017520575A (ja) 2014-07-01 2017-07-27 ファイザー・インク 二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディおよびその使用
JP7037480B2 (ja) 2015-11-13 2022-03-16 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド がんの免疫療法のためのｎｋｇ２ｄ－ｉｇ融合タンパク質
EP3802601A1 (en) 2018-06-06 2021-04-14 Leadartis, S.L. Trimeric polypeptide complexes and uses thereof
JP2024510947A (ja) 2021-03-05 2024-03-12 レアダルティス、ソシエダッド リミターダ 三量体ポリペプチドおよびがん治療におけるその使用

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1200773A (en) * 1980-02-29 1986-02-18 William J. Rutter Expression linkers
US4444878A (en) * 1981-12-21 1984-04-24 Boston Biomedical Research Institute, Inc. Bispecific antibody determinants
WO1984003711A1 (en) * 1983-03-25 1984-09-27 Celltech Ltd A process for the production of a protein
GB8412517D0 (en) * 1984-05-16 1984-06-20 Nagai K Recombinant fusion proteins
GB8508340D0 (en) * 1985-03-29 1985-05-09 Creighton T E Production of protein
US4656255A (en) * 1985-09-09 1987-04-07 International Minerals & Chemical Corp. Protein recovery
CA1340522C (en) * 1987-03-10 1999-05-04 Heinz Dobeli Fusion proteins containing neighbouring histidines for improved purification
US5074977A (en) * 1987-05-05 1991-12-24 The Washington Technology Center Digital biosensors and method of using same
US4999422A (en) * 1988-04-15 1991-03-12 Biogen, N.V. Continuous method of refolding proteins
US5231168A (en) * 1988-09-16 1993-07-27 Statens Seruminstitut Malaria antigen
DE3835350A1 (de) * 1988-10-17 1990-04-19 Boehringer Mannheim Gmbh Aktivierung von gentechnologisch hergestellten, in prokaryonten exprimierten antikoerpern
DK0432419T3 (da) * 1989-12-05 1994-11-14 American Cyanamid Co Fremgangsmåde til solubilisering og naturering af somatotropiner under anvendelse af lav urinstofkoncentration
US5324436A (en) * 1991-12-13 1994-06-28 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Use of hydrate formation to control membrane mimetic systems
ATE241642T1 (de) * 1993-02-04 2003-06-15 Denzyme Aps Verbessertes verfahren zur rückfaltung der proteine

Also Published As

Publication number Publication date
US5739281A (en) 1998-04-14
NO952989L (no) 1995-10-03
CA2155335A1 (en) 1994-08-18
NZ261571A (en) 1997-03-24
CA2155335C (en) 2001-06-05
EP0686162B1 (en) 2003-05-28
WO1994018227A3 (en) 1994-10-13
ES2199959T3 (es) 2004-03-01
DE69432744T2 (de) 2004-03-25
ATE241642T1 (de) 2003-06-15
FI953705A (fi) 1995-08-03
US5917018A (en) 1999-06-29
WO1994018227A2 (en) 1994-08-18
AU6038094A (en) 1994-08-29
AU674568B2 (en) 1997-01-02
NO952989D0 (no) 1995-07-28
JPH08506243A (ja) 1996-07-09
FI113272B (fi) 2004-03-31
KR100310739B1 (ko) 2002-05-30
FI953705A0 (fi) 1995-08-03
DE69432744D1 (de) 2003-07-03
EP0686162A1 (en) 1995-12-13
NO316274B1 (no) 2004-01-05
KR960701083A (ko) 1996-02-24
DK0686162T3 (da) 2003-09-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3695467B2 (ja) タンパクを再生するための改良された方法
AU605291B2 (en) Process for the purification of recombinant polypeptides
US7105638B1 (en) Product and process for the production, isolation, and purification of recombinant polypeptide
JPS61135591A (ja) 組み換え融合タン白質
US5449758A (en) Protein size marker ladder
JPS60501391A (ja) ポリペプチドおよび蛋白質生成物、ならびにその製造方法および使用
JPH02227090A (ja) 遺伝子工学で製造され、原核生物中に発現した生物学的活性蛋白質を活性化する方法
Holtet et al. Tetranectin, a trimeric plasminogen‐binding C‐type lectin
JPH10502243A (ja) 形質転換哺乳動物のミルクにおける融合タンパク質としてのペプチドの生産
EP0123928A2 (en) Recombinant DNA coding for a polypeptide displaying milk clotting activity
EP0511978B1 (en) Method of purifying recombinant polypeptides
Polyak et al. Introduction of spacer peptides N-terminal to a cleavage recognition motif in recombinant fusion proteins can improve site-specific cleavage.
US5416007A (en) Enhanced proteolytic cleavage of recombinant fusion proteins
JPH07203986A (ja) 固定化ジクチオステリウムのジペプチジルアミノペプチダーゼを用いるタンパク質の酵素的変換
Mackin et al. Expression, purification, and PC1-mediated processing of (H10D, P28K, and K29P)-human proinsulin
JP2877253B2 (ja) 融合タンパク質の選択的切断方法
Enfors et al. Impact of genetic engineering on downstream processing of proteins produced in E. coli
JP2845558B2 (ja) メチオニンアミノペプチダーゼのｄｎａ配列
WO2013149729A2 (en) Proinsulin with enhanced helper sequence
JPH1014578A (ja) 入れ換え変異体遺伝子ｄｎａの構築
JPS63245691A (ja) ヒト免疫グロブリンＧＦｃ領域蛋白質およびその製造方法
JPH0728746B2 (ja) 新規プラスミド、微生物細胞及びヒト免疫グロブリンＧ Ｆｃ領域蛋白質の製造法
Fischer et al. Immobilized hirudin and hirudin-based peptides used for the purification of recombinant human thrombin prepared from recombinant human prothrombin
JPS633790A (ja) プラスミド組換え体
JPH0670790A (ja) カルシトニンの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20040308

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20040426

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20040615

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20050531

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20050621

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313114

S533 Written request for registration of change of name

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533

R360 Written notification for declining of transfer of rights

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080708

Year of fee payment: 3

R360 Written notification for declining of transfer of rights

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360

R371 Transfer withdrawn

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R371

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080708

Year of fee payment: 3

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313114

S533 Written request for registration of change of name

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080708

Year of fee payment: 3

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080708

Year of fee payment: 3

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080708

Year of fee payment: 3

R360 Written notification for declining of transfer of rights

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080708

Year of fee payment: 3

R370 Written measure of declining of transfer procedure

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R370

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080708

Year of fee payment: 3

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090708

Year of fee payment: 4

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090708

Year of fee payment: 4

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100708

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110708

Year of fee payment: 6

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees