JPH07203986A - 固定化ジクチオステリウムのジペプチジルアミノペプチダーゼを用いるタンパク質の酵素的変換 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 偶数のアミノ酸のＮ末端鎖をもつタンパク質
の改良切断法を提供すること。 【構成】 ジクチオステリウム・ジスコイデウムのジペ
プチジルアミノペプチダーゼ（ｄＤＡＰ）を適当な固相
担体上に固定化し、ｄＤＡＰが機能するのに充分な条件
下で、前駆体ポリペプチドを固定化ｄＤＡＰと接触させ
て、前駆体ポリペプチドからアミノ末端ジペプチドを除
去し、次いで、切断されたポリペプチドを回収する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、バイオテクノロジーの
分野で行われたものであり、スライムカビと呼ばれるジ
クチオステリウム・ジスコイデウムから単離された固定
化ジペプチジルアミノペプチダーゼを用いる方法に関す
るものである。本発明は、偶数のアミノ酸Ｎ末端伸長鎖
をもつタンパク質のプロセシングに有用である。

【０００２】ジクチオステリウム・ジスコイデウムは、
通例、スライムカビ、特に細胞スライムカビと呼ばれる
原始的な真核微生物である。この名称は、巨視的に見た
該微生物の２つの先端の状態に由来している。活発に成
長するとき、ジクチオステリウム・ジスコイデウムは単
細胞アメーバとして成長する。この状態では、該有機体
は細胞壁をもたないが、薄膜(あるいはスライム)のよう
に見える。固体培地上で飢餓状態にすると、依存性のな
い細胞が集合してコロニーを形成する。コロニーは、ス
ラグ(ナメクジ状)と呼ばれる形態に移行して多細胞有機
体の特徴を呈示し、次いで分化してスラグの後部の細胞
群は偽足を形成し、前部の細胞群は付着柄を形成し、中
間部の細胞群は子実体を形成する。野生型アメーバは、
全細菌を偽足で取り込むこと(食菌作用)のみによって栄
養を得る；このため、野生型アメーバは食肉細胞と呼ば
れることもある。“食物”細菌の共培養なしで成長する
ことができ、それゆえに可溶性培地で成長しうるジクチ
オステリウム・ジスコイデウムの純粋型変異体が単離さ
れている。本発明は、ジクチオステリウム・ジスコイデ
ウムから単離された新規ジペプチジルアミノペプチダー
ゼ(ＤＡＰ)の固定化と用途に関する。

【０００３】ジペプチジルアミノペプチダーゼは、アミ
ノ末端から２番目のペプチド結合を加水分解して、閉鎖
されていないアミノ末端のペプチドおよびタンパク質か
ら、ジペプチドを遊離する酵素である。現在、ジペプチ
ジルアミノペプチダーゼには４つの種類があり(ＤＡＰ
−Ｉ、ＤＡＰＩＩ、ＤＡＰ−ＩＩＩおよびＤＡＰ−ＩＶ
と呼ばれる)、その差異は、それらの物理的特性および
基質との反応速度に基づいている。ＤＡＰ−Ｉは、相対
的に非特異的ＤＡＰであり、閉鎖されていないアミノ末
端ペプチドおよびタンパク質から、多くのジペプチドの
組み合わせを遊離する触媒である。ＤＡＰ−Ｉは、目的
のジペプチドがＸ−Ｐｒｏ、Ａｒｇ−ＸまたはＬｙｓ−
Ｘ(ここで、Ｘはいずれかのアミノ酸である)の場合、小
さい活性しか示さないかまたは全く活性を示さない。Ｄ
ＡＰ−ＩＩは、Ａｒｇ−ＸまたはＬｙｓ−Ｘで始まるア
ミノ末端ジペプチド配列に対して活性を示し、Ｘ−Ｐｒ
ｏで始まる配列にはそれよりもやや小さい活性を示す。
ほとんどの他のジペプチドの組み合わせに対するＤＡＰ
−ＩＩの反応速度は、これらに対する反応速度よりも非
常に遅い。ＤＡＰ−ＩＩＩは、Ａｒｇ−ＡｒｇおよびＬ
ｙｓ−Ｌｙｓというアミノ末端ジペプチド配列を求める
性質がある。ＤＡＰ−ＩＶは、Ｘ−Ｐｒｏというジペプ
チド配列に対して加水分解活性が最も高い。酵素ＤＡ
Ｐ、特にＤＡＰ−ＩおよびＤＡＰ−ＩＶは、タンパク質
のプロセシングにおいて有用な活性を示す。

【０００４】本発明は、ジクチオステリウム・ジスコイ
デウムから単離された新規ＤＡＰ(ｄＤＡＰ)に関するも
のであり、ｄＤＡＰは米国特許出願第０７／９５５５３
９号に開示されている物質である。さらに詳しくは、本
発明は、偶数のアミノ酸のＮ末端鎖をもつタンパク質の
改良切断法を提供する。従来の方法は、ｄＤＡＰを基質
に加え、特定の時間反応させるというシングルユース(s
ingle-use)バッチ反応である。これには、生成物からｄ
ＤＡＰを除去するために、続いて精製工程が必要であっ
た。本発明は、ｄＤＡＰを、比較的安価で市販されてい
るクロマトグラフィー用樹脂へ固定化し、活性型のｄＤ
ＡＰを選択的に固定化することにより、シングルユース
バッチ変換反応の改良を行うものである。

【０００５】最も驚くべき発見は、ｄＤＡＰが、ほとん
どのタンパク質が結合しないかまたは弱い結合しかしな
いような酸性条件下で、陰イオン交換樹脂に強く結合す
ることであった。通常陰イオン交換樹脂を使用しないよ
うな酸性条件下で、ｄＤＡＰは安定であり、目的の基質
に対する活性も高い。ｐＨが酸性であるため、収量に影
響を与えるに充分な程度あるいは非共有結合により結合
した酵素を置換するのに充分な程度に、この樹脂への基
質および生成物の結合は、効果的に阻害される。樹脂上
のｄＤＡＰの濃度は、動力学的に相対的に早い反応が得
られる程度まで高くすることができる。本発明は、反応
物および生成物が、ｐＨおよび温度の苛酷な条件下にさ
らされる時間を減少するが、逆に、反応物および生成物
の安定性、収量、純度および構造において良い影響が増
加する。さらに、本発明の工程は、後で行う変換反応に
おいてｄＤＡＰを再利用する簡便な手段を提供する。し
たがって、本発明改良法の利点は、一定量の前駆体タン
パク質を変換するのに必要な酵素の総量が減少されるこ
と、および反応物と生成物が苛酷なバッチ工程条件にさ
らされる時間が減少されることである。

【０００６】本発明は、切断ポリペプチドまたはタンパ
ク質を生成するために、前駆体ポリペプチドまたはタン
パク質からアミノ末端ジペプチドを除去する方法であ
る。本発明方法はジクチオステリウム・ジスコイデウム
のジペプチジルアミノペプチダーゼを適当な固相担体上
に固定化することから開始される。次いで、ｄＤＡＰが
機能するのに充分な条件下で、前駆体ポリペプチドを固
定化ｄＤＡＰと接触させて、前駆体ポリペプチドからア
ミノ末端ジペプチドを除去する。該方法には、切断され
たポリペプチドの回収も含まれる。別の具体化として、
本発明方法は、切断ポリペプチドを生成するために、前
駆体ポリペプチドから単一のアミノ末端ジペプチドを除
去するのに有用である。

【０００７】本明細書中で用いる語句の定義は以下のと
おりである。「ｄＤＡＰ」とは、ジクチオステリウム・
ジスコイデウムから単離されたジペプチジルアミノペプ
チダーゼであり、基質としてＧＦｐＮＡを用いる場合の
最適ｐＨは３.５、分析用超遠心分離を行って測定した
天然の分子量は約２２５０００ダルトンであり、ＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)を
行って測定したサブユニットの分子量は約６６０００で
ある。「前駆体ポリペプチド」とは、対象物である所望
のポリペプチドのアミノ末端から伸長された偶数のアミ
ノ酸を含むポリペプチドまたはタンパク質を意味する。
「切断ポリペプチド」とは、対象物である所望のポリペ
プチドを得るために、Ｎ末端ジペプチドまたはジペプチ
ド類が除去されたポリペプチドまたはタンパク質を意味
する。「担体」とは、そのままの状態でタンパク質と結
合しうるか、あるいは容易に誘導または活性化されてタ
ンパク質と結合しうるような、いずれの固体または半固
体あるいはマトリックスの表面でもよく、最小の非特異
的吸着を呈し、物理的、機構的および化学的に安定であ
り、リガンド接近可能性を提供するために極性が高く、
表面を劣化することなく再生産しうるような表面であ
る。

【０００８】「ｄＤＡＰ床」とは、固定化ｄＤＡＰの集
合体またはユニット体を形成する、単一または複数の担
体に固定化されたｄＤＡＰであり、量は規定しない。
「ＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩ」は、対応するインスリンＢ鎖
の２８位にＬｙｓをもち、２９位にＰｒｏをもつＭｅｔ
−Ａｒｇ−ヒトプロインスリンとして定義される。この
ヒトインスリン類縁体前駆体タンパク質を次の命名様式
で表現してもよい；Ｍｅｔ−Ａｒｇ−ヒトプロインスリ
ン類縁体(Ｂ２８ Ｌｙｓ,Ｂ２９ Ｐｒｏ)。「ＫＰＢ−
ｈＰＩ−」は、対応するインスリンＢ鎖の２８位にＬｙ
ｓをもち、２９位にＰｒｏをもつＭｅｔ−Ａｒｇ−ヒト
プロインスリンとして定義される。このヒトインスリン
類縁体前駆体タンパク質を次の命名様式で表現してもよ
い；ヒトプロインスリン類縁体(Ｂ２８ Ｌｙｓ,Ｂ２９
Ｐｒｏ)。「ＧＦｐＮＡ」は、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ ｐ−ニト
ロアニリドである。「ＲＲＢＮＡ」は、Ａｒｇ−Ａｒｇ
−β−ナフチルアミドである。「Ｚ−ＲＲＢＮＡ」は、
ベンジルオキシカルボニル−ＲＲＢＮＡである。本明細
書中で用いたすべてのアミノ酸の略語は、３７Ｃ.Ｆ.
Ｒ.§１.８２２(ｂ)(２)(１９９２年)において合衆国特
許庁の受諾を得ている。

【０００９】本発明は、米国特許出願第０７／９５５,
５３９号に開示の物質であるｄＤＡＰの物理的、化学的
および酵素的特性に基づくものであり、該出願は、本発
明の参考文献である。ｄＤＡＰの幾つかの顕著な特徴と
しては、閉鎖されていないアミノ末端ジペプチドを開裂
する性質、基質としてＧＦｐＮＡを用いる場合の最適ｐ
Ｈが３.５であること、ｐＨ６以上では重要な酵素活性
がないこと、天然の分子量が約２２５０００ダルトンで
あること、およびサブユニットの分子量が約６６０００
ダルトンであることが挙げられる。酵素ｄＤＡＰは、合
成基質であるＧＦｐＮＡおよびＲＲＢＮＡ、ならびに多
数の他のポリペプチド(天然、合成および組換え技術に
より製造されたもの)からジペプチドを除去する能力を
もつ。さらに、ｄＤＡＰは、Ｎ末端アミノ酸が酸化され
たメチオニン残基(すなわち、Ｍｅｔ(Ｏ)−Ａｒｇ−ヒ
トプロインスリン)であるアミノ末端のジペプチドを開
裂することができる。酵素ｄＤＡＰは、還元剤の添加を
必要とせず、ヨード酢酸塩または四チオン酸塩などのシ
ステイン修飾因子の存在下で充分活性である。

【００１０】本発明は、前駆体ポリペプチドまたはタン
パク質を、切断ポリポペプチドまたはタンパク質に効率
よく変換するのに特に有用である。たとえば、ヒト成長
ホルモンが所望のポリポペプチドならば、ヒト成長ホル
モン前駆体(一例として、Ｍｅｔ−Ａｓｐヒト成長ホル
モン)を発現させ、次いで、この前駆体をｄＤＡＰで処
理し、ジペプチドＭｅｔ−Ａｓｐおよび所望の切断ポリ
ポペプチド、すなわちヒト成長ホルモンを遊離させるだ
けである。しばしば類縁体または中間体を生成すること
が望ましいので、該切断ペプチドは“天然”野生型ポリ
ポペプチドである必要はない。本発明の酵素を用いて切
断される、その他の前駆体ポリポペプチドとしては、Ｍ
ｅｔ−Ａｒｇ−ヒト成長ホルモン、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−ヒ
トプロインスリン、Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−ヒトプロインスリ
ン、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−ヒトプロインスリン類縁体(Ｂ２
８ Ｌｙｓ,Ｂ２９ Ｐｒｏ)、Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−ヒトプロ
インスリン類縁体(Ｂ２８ Ｌｙｓ,Ｂ２９ Ｐｒｏ)、Ｍ
ｅｔ−Ａｒｇ−ヒトプロインスリン類縁体(Ｂ１０ Ａｓ
ｐ,ｄｅｓ Ｂ２８−３０)、Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−ヒトプロ
インスリン類縁体(Ｂ１０ Ａｓｐ,ｄｅｓ Ｂ２８−３
０)およびＭｅｔ−Ｔｙｒ−ヒトプロインスリン類縁体
(ｄｅｓ ６４)が挙げられる。欧州特許出願第９０３０
１２２４.３号にインスリン類縁体(Ｂ２８ Ｌｙｓ,Ｂ２
９ Ｐｒｏ)、欧州特許出願第９２３０５６７８.２号に
インスリン類縁体(Ｂ１０ Ａｓｐ,ｄｅｓＢ２８−３０)
が記載されている。

【００１１】ベッカー(Becker)らの米国特許第５１２６
２４９号(１９９２年６月３０日登録)には、ウシＤＡＰ
−ＩによるＭｅｔ−Ａｒｇ−ヒトプロインスリンおよび
Ｍｅｔ−Ａｒｇ−ヒトプロインスリン類縁体のプロセシ
ングが記載されており、この文献は本発明の参考文献で
ある。さらに、ｄＤＡＰは、前駆体ポリペプチドのＮ末
端からひと組以上のジペプチドを連続して除去するのに
使用しうる。ｄＤＡＰは最適ｐＨを約３.５にもち、そ
のため、多くの前駆体ポリペプチドが可溶性である酸性
ｐＨ領域において反応を進行させるので、前駆体タンパ
ク質からジペプチドを除去するのにｄＤＡＰを使用する
ということには、利点がある。さらに、中性またはアル
カリ性ｐＨにおいて前駆体ポリペプチドの変換を行う
と、内部鎖ジスルフィドダイマーまたはポリマーが高い
割合で発生し、生成物の収量に損失を招くことになる。
ジスルフィド・スクランブリングとして知られるＤＡＰ
−Ｉは反応混合物にβ−メルカプトエタノールまたはシ
ステインなどの還元剤を添加することを要求するので、
ウシＤＡＰ−Ｉを用いる場合、この現象は特に問題とな
る。また、酸性ｐＨ領域では低い割合でメチオニン残基
の酸化が生じる。ジクチオステリウム・ジスコイデウム
のアゼニック菌株ＡＸ−３(ＡＴＣＣ２８３６８)を発酵
させ、遠心分離し、陰イオン交換クロマトグラフィー、
疎水的相互作用クロマトグラフィーおよびサイズ排除ク
ロマトグラフィーを行い、酵素ｄＤＡＰの高精製溶液を
得るが、これを５５％ｖ／ｖグリセロール、０.０２５
Ｍ酢酸、０.２５Ｍ塩化ナトリウムの存在下、ｐＨ３.５
で−２０℃にて貯蔵するかまたはすぐに本発明の方法に
使用する。

【００１２】本発明を実施するには、まず精製したｄＤ
ＡＰを適当な固相担体または基質に固定化することが必
要である。当業者ならば、これについて理解し、多くの
市販の固相担体および基質を適用するであろう。固相担
体の具体例としては、多孔質シリカ、多孔質ガラスビー
ズおよびヒドロキシアパタイトなどの無機物質が挙げら
れるが、本発明はこれらに限定されるものではない。ポ
リアクリルアミド、ポリメタクリレートおよびポリスチ
レンなどの合成有機ポリマーも担体の具体例である。さ
らに、セルロース、デキストラン、セファデックス（Se
phadex）(登録商標)、セファロース(Sepharose)(登録商
標)およびアガロースなどの多糖類も本発明に使用しう
る担体の具体例である。膜および繊維などの他の担体も
本発明に使用しうる。市販されている膜の一例は、Acti
-Mod(登録商標)も第４アミン分子[エフエムシー・バイ
オプロダクツ（FMC BioProducts）製］である。

【００１３】一度表面に結合したｄＤＡＰに逆に影響を
及ぼさないような担体が好ましい。多孔質で、取り扱い
易く、生化学的精製の業界で公知であるという理由か
ら、様々な大きさのビーズに成形された市販の多糖類マ
トリックスが、より好ましい。市販の陰イオン交換樹脂
が、さらに好ましい。Ｑセファロース(登録商標)樹脂
[ファルマシア(Pharmacia）製］が最も好ましい[「Affin
ity C時omatography Principles & Methods」,ファルマ
シア・ファイン・ケンミカルズ（Pharmacia Fine Chemi
cals）(１９８３年)；「Biotechnology Products Catal
og １９９３」,ファルアマシア・バイオテック・インコ
ーポレイテッド（Pharmacia Biotech Inc）,アメリカ合
衆国０８８５４ニュージャージー州ピスカタウエイ、セ
ンテニアル・アベニュー８００番を参照]。

【００１４】過去２０〜３０年の間に、タンパク質を担
体に固定化またはカップリングするための各種の設計
が、広範囲に発達してきている。本発明は、担体へｄＤ
ＡＰを共有結合により固定化することおよび非共有結合
により固定化することの両方を包含し、これらが担体を
酵素ｄＤＡＰに結合させるブリッジとなる。通例、酵素
の固定化は、固相担体(一般にクロマトグラフィー用樹
脂)を用いて行われ、該固相担体は、樹脂を酵素に共有
結合によりカップリングさせる官能基を含むように修飾
または活性化されている。代表的には、脂肪族の結合ア
ームを利用する。市販の共有結合性固定化樹脂の一例
は、活性化ＣＨセファロース４Ｂ(ファルマシア製)であ
る。これは、ファルマシアがセファロース４Ｂ塩基マト
リックスに付加した数多い化学的性質の型のうちのひと
つである。一般に、活性化樹脂は、同じ塩基マトリック
スの陰イオン交換樹脂よりもかなり割高であり、イオン
交換クロマトグラフィー用媒体として種々の塩基マトリ
ックス型が適用しうるような広い範囲には利用できず、
したがって、カラム充填物が低清澄度である場合、また
は移動相が高速で流れる場合、その処理能力において非
常に制限がある。

【００１５】セファロースなどの多糖類ベースのビーズ
への、タンパク質のＣＮＢｒおよびカルボジイミドカッ
プリングも、本発明の直接カップリング工程に包含され
る。一般に、直接カップリングでは、どのような特別の
仕方においても、結合したタンパク質が担体に配向され
ることはない；しかし、幾つかの型の直接カップリング
では、結合したタンパク質を担体に何度も配向すること
ができる。酵素ｄＤＡＰは、たとえば、イオン的または
疎水性メカニズムを介して、固相担体へ非共有結合によ
り付加されてもよい。イオン交換および疎水性相互作用
クロマトグラフィー用樹脂は、多数市販されており、活
性化・共有結合性樹脂よりも低コストである。

【００１６】非共有結合による固定化における潜在的障
害は、酵素の結合が通常、可逆的であるということであ
る。中程度の塩、溶媒、ｐＨ変化または他のタンパク質
でさえも、樹脂から酵素を部分的または全体的に脱着さ
せることができる。ほとんどの場合、非共有結合性樹脂
への酵素の結合が堅固となり、酵素が高度の機能的活性
および安定性を維持し、酵素反応物がそれ自身を樹脂に
結合しないような条件を同定するのは難しい。全く予期
せぬことに、本発明における鍵となる要素は、ｄＤＡＰ
の活性が最大となる酸性ｐＨにおいて、陰イオン交換樹
脂に対するｄＤＡＰおよびＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩの親和
性が非常に阻害されるということであった。クロマトグ
ラフィーにおける挙動および等電点電気泳動に基づい
て、ｄＤＡＰは、酸性ｐＨにおいて豊富な負の電荷をも
つと信じられている。必然的に、陰イオン交換樹脂の陽
イオン官能基に対して、ｄＤＡＰは強く結合し、一方Ｍ
Ｒ−ＫＰＢ−ｈＰＩまたはプロインスリンは化学量論的
に大過剰で存在する場合でさえも結合しないということ
が信じられている。

【００１７】しかし、非共有結合による酵素の結合が可
逆性であるということは、共有結合による固定化を凌ぐ
利点であるとも言える。一般に、非共有結合性樹脂への
結合は容易であり、繰り返して逆行することができる。
性能の低下または背圧の増加により、カラムの樹脂の再
生が必要ならば、樹脂を再生用の苛酷な条件にさらす前
に、酵素を樹脂から静かに取り外す[もし樹脂に酵素が
残存していれば、おそらく破壊されるであろう]。樹脂
を再生すれば、新しいバッチまたは再精製したバッチの
酵素の固定化に用いることができる。他の固定化方法
は、ｄＤＡＰの触媒部位が影響を受けたままとなってい
るｄＤＡＰを用いるものである。このような方法のひと
つは、酵素上に認められる天然の炭水化物を利用するも
のである。まず始めに該炭水化物部位を酸化して対応す
るアルデヒドにし、次いで該アルデヒドを担体上の第１
アミノ基と反応させることにより、ｄＤＡＰを有利な配
向で結合することができる。

【００１８】ｄＤＡＰを担体に接続するブリッジには多
くの型式が可能であり、ｄＤＡＰを担体に共有結合によ
り結合する小さい有機リンカーが包含される。スペーサ
ーアーム(spacer arms)と呼ばれるこれらリンカーは、
受諾されるものであり、一度ブリッジが形成されれば、
タンパク質と相互作用を起こさないのが好ましい。別の
型式のブリッジは、数個のｄＤＡＰ分子を結合しうる、
担体に結合した、より大きい多価分子である。さらに別
の形式のブリッジは、担体に結合した、ｄＤＡＰを非共
有結合により結合する特異的免疫吸着剤である。担体上
にｄＤＡＰを配向しうる特異的免疫吸着剤の例として
は、エピトープ特異性、抗ｄＤＡＰ、モノクローナル抗
体がある。触媒部位から離れたｄＤＡＰのエピトープに
対して高親和性のモノクローナル抗体を製造し、次い
で、抗体を担体に化学的に結合し、ｄＤＡＰを抗体に結
合させることにより、ｄＤＡＰを担体上に有利な配置で
配向させることができる。

【００１９】上記の具体的な記載は、本発明の請求の範
囲を制限することを意図するものではない。当業者であ
れば、担体にタンパク質を結合するための多数の別の方
法が存在することを理解するであろう。さらに、担体お
よびｄＤＡＰ固定化法の選択が、主として便宜上の問題
となり、これは、実施者が種々の担体に精通しているか
どうか、および実施者による担体の選択、ならびに実施
者による種々の固定化方法の選択、および実施者の基質
に関する知識に依存するものである。最終的に、前駆体
タンパク質を変換して切断タンパク質にすることに関す
る、利用しうるｄＤＡＰの分量および全体的な目的およ
び設定が、担体および固定化法の選択を左右するであろ
う。

【００２０】一度ｄＤＡＰを担体に固定化すれば、前駆
体ポリペプチドの切断ポリペプチドへの変換は、種々の
適当な条件下で行うことができる。好ましい方法は、対
象となる基質(前駆体タンパク質)を固定化酵素の表面を
通過させて反応を進行させるために、クロマトグラフィ
ー用カラムに固定化ｄＤＡＰを充填することである。酵
素は、担体に付着したままであるから、物理的に反応物
の混合物の一部とならず、したがって、引き続いて再利
用しうるのである。切断タンパク質を得るための、前駆
体タンパク質の完全なプロセシングを確実にするため
に、接触工程を１回またはそれ以上繰り返すことも、本
発明を構成する部分である。したがって、反応物／生成
物の流れを同一ｄＤＡＰ床に１回またはそれ以上再循環
させてもよいし、あるいは別のｄＤＡＰ床に連続的に通
過させてもよい。好ましい方法は、前駆体タンパク質を
含む流れを、担体としてＱセファロース樹脂を用いて調
製した３つのｄＤＡＰ床に通過させることである。

【００２１】当業者であれば、対象となる基質の生成物
への変換を追うことによって、固定化ｄＤＡＰカラムの
作業をモニターするべきであることを理解するであろ
う。カラムの効率が少し低下することは、カラムの流速
を遅くし、それによって酵素反応を生じさせる時間を増
加させることによって改善される。生成物への基質の変
換が所望の収量に到達する限り、および背圧が作用上の
レベルを越えない限りは、カラムの流速をできるだけ速
くするのが理想的である。カラムの作業は、カラムの温
度および移動相のｐＨによっても影響を受ける。したが
って、これらのパラメーターをモニターするのが賢明で
ある。

【００２２】前駆体ポリペプチドの切断ポリペプチドへ
の変換は、一般に、緩衝液にてｐＨを約２.５〜約５.５
に安定に維持した水性培媒体中で行われる。好ましく
は、ｐＨの範囲を約３.０〜約４.５、最も好ましくは、
約３.０〜約３.５にする。最適ｐＨは、基質に応じて僅
かに変化する。非結合のｄＤＡＰを用いると、ＧＦｐＮ
ＡおよびＧｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡのプロセシングは、ｐ
Ｈが約３.５において最も急速になり、一方、Ｍｅｔ−
Ａｓｐ−ヒト成長ホルモン(Ｍｅｔ−Ａｓｐ−ｈＧＨ)の
プロセシングは、ｐＨが約３.０〜約３.５において起こ
り易くなる。ＲＲＢＮＡのプロセシングは、ｐＨが約
４.５において最も急速になる。当業者であれば、どん
な特異的反応でも、与えられた前駆体ポリペプチドおよ
び酵素の安定性および溶解度などの因子によって、その
最適ｐＨが決定されることを認めるであろう。幾つかの
場合に、尿素、ドデシル硫酸ナトリウム、グアニジンな
どの可溶化剤を用いてもよい。

【００２３】広範囲の種類の緩衝剤が使用できるが、そ
の第１の前提は、ｐＨを所望の範囲に維持する能力をも
ち、酵素を担体から脱着する能力がないことである。代
表的な緩衝剤は、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、
クエン酸ナトリウム、グリシンなどである。好ましい緩
衝剤は、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムおよびグリ
シンである。本発明で使用する前駆体ポリペプチドは、
一般に、組換えＤＮＡ技術によって製造されるものであ
る。それらを製造するには、このような合成における慣
例の技術を用いて、所望の前駆体ポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列を製造する。これらの方法には、
一般に、所望のコード配列のフラグメントおよびそれら
の相補的配列の両方をコードするオリゴヌクレオチドの
製造が包含される。該オリゴヌクレオチドは、該コード
配列の一つのフラグメントが、該相補的配列の２つのフ
ラグメントとオーバーラップするように設計されるが、
逆もまた同様である。オリゴヌクレオチドを対にし、結
合して、最終的に所望の遺伝子配列を生成する。該配列
を、配列がコードする生成物が発現するような位置にて
組換えベクターに挿入する。適当なベクターは、少なく
とも部分的に発現制御配列を含んでいる。次に挙げる実
施例は、本発明をさらに詳しく説明する手段として提供
されるものである。本発明はこれらの実施例に制限され
るものではないことを理解すべきである。

【００２４】

【実施例】実施例１ ジクチオステリウム・ジスコイデウムの発酵 ジクチオステリウム・ジスコイデウムのアゼニック菌株
ＡＸ−３の凍結乾燥した培養物をメリーランド州ロック
ビルにあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョンから、受託番号ＡＴＣＣ２８３６８で入手し、ディ
フコ酵母抽出物（Difco Yeast Extract）(７.１５)、デ
ィフコ・バクト・ペプトン（Difco Bacto Peptone）(１
４.３)、Ｎａ₂ＨＰＯ₄(０.５１)およびＫＨ₂ＰＯ₄(０.
４９)という組成(g/l)をもつ緩衝化酵母抽出物−ペプト
ン培地を含有する寒天平板[１.２％のディフコ・バクト
（Difco Bacto）(登録商標) Agar]に数種類の密度で植
込み、分離滅菌後、これにグルコース(最終濃度１０g/
l)を無菌的に加え、ＮａＯＨまたはＨ₂ＰＯ₄を用いて最
終ｐＨを６.５(＋/−０.１)に調節する。これと同じ培
地(寒天なし)を用い、約１リットル以下の体積で液体培
養を行う。寒天平板を２１〜２４℃で３〜５日間インキ
ュベートする。ＡＸ−３培養物とともに凍結乾燥してい
る“食物バクテリア”を拾い上げないよう注意しながら
平板から胞子嚢を収穫し、次いで、３mlの緩衝化酵母抽
出物−ペプトンブロス中に接種し、緩やかに振とうしな
がら２１〜２４℃でインキュベートする。その後、緩衝
化酵母抽出物−ペプトンブロス中、ジクチオステリウム
・ジスコイデウム細胞を連続継代培養によって増殖し
て、累進的に大容量にする。各連続継代培養ステップは
約１０倍〜２５倍希釈によるものであり、細胞密度が約
２×１０⁶／mlを越えるときに行う。ブロスを常に緩や
かに撹拌しながら２１〜２４℃でインキュベートする。

【００２５】撹拌発酵は、一般に、最初の酵母抽出物−
ペプトン培地中のBacto Peptoneの代わりに、濃度が２
〜２０g/lの大豆ペプトン[フィトン・ペプトン（Phyton
e Peptone）またはマーコー大豆ペプトン（Marcor Soy
Peptone）など］を含む同様の培地中で行われる。グル
コース濃度は、合計１５g/lに増加する。通例、収穫
は、４０〜１５０ＲＰＭで回転する１〜３個のラッシュ
トン（Rushton）(登録商標)タービン羽根車を取り付け
た１０〜５０００リットルの作業容量をもつ発酵装置で
行う。気流を液体ブロスの体積の０.１〜０.５倍に制御
しながら温度を２２±１℃に調節し、背圧を３〜５p.s.
i.に維持する。硫酸でｐＨを６.３〜６.５に調節し、撹
拌および／または気流を変化させることによって溶存酸
素を４０〜８０％に維持しながら発酵を行う。成長中の
細胞は細胞壁のないアメーバ状なので、細胞の処理およ
び発酵における剪断作用を最小化するように注意する。

【００２６】一般に、ジクチオステリウム・ジスコイデ
ウムＡＸ３の撹拌培養物は２４〜３６時間の間で２回成
長する。溶存酸素は、累進的に減少し(調節しない場
合)、次いで、細胞密度の増加が停止した後しばらくし
て上昇が始まる。最終細胞密度は３×１０⁶〜１×１０⁸
/mlの範囲である。サンプルを随時取り出し、細胞密度
およびｄＤＡＰ活性を分析する(後記実施例３を参照)。
ペトロフ−ハウザー(Petroff-Hauser)計数管を用いて、
上記の約５×１０⁵細胞/mlという細胞密度を評価する。
一般に、ＧＦｐＮＡの加水分解活性は発酵によって増加
する。最大ｄＤＡＰ活性は、最大細胞密度に到達した
後、１〜４日目に見られる。全ブロスを４℃で貯蔵する
かまたは−２０℃で凍結し、後日、解凍して活性を分析
する。発酵物は１０℃以下に冷却して収穫し、連続フロ
ー遠心分離に付して細胞を除去する。

【００２７】実施例２ ｄＤＡＰの単離 Ａ)細胞の除去および濃縮 ジクチオステリウム・ジスコイデウム発酵ブロスからｄ
ＤＡＰを精製する最初の処理は、細胞除去および濃縮で
ある。連続フロー遠心分離機によって細胞除去を行う。
アミコン（Amicon）再生セルロース分子量１０００００
０カットオフ膜を用いる接線フロー超濾過機によって、
無細胞培地を２０〜３０倍の濃度に濃縮する。残留液を
超濾過ユニットから排水し、ユニットを５０ｍＭのトリ
ス（Tris）（登録商標）緩衝液，ｐＨ７にて洗浄し、追
加のｄＤＡＰを回収する。残留液と洗浄液を合わせて最
終濃縮液を成し、これをさらにプロセシグを行うまで数
カ月間−２０℃で凍結して貯蔵する。

【００２８】Ｂ.清澄化 凍結した最終濃縮液を室温にて１２〜２４時間かけて解
凍する。解凍した後、最初のカラムクロマトグラフィー
処理の前に、最終濃縮液を清澄化する。遠心分離に続い
て１ミクロン膜濾過を組み合わせて行い、清澄化を達成
する。清澄化最終濃縮液をｐＨ７に調節し、４〜１０℃
に保つ。

【００２９】Ｃ.陰イオン交換クロマトグラフィー ｄＤＡＰ精製工程における最初のクロマトグラフィー処
理は、ファルマシアＱセファロース・ファーストフロー
（Fast Flow）樹脂を用いる陰イオン交換クロマトグラ
フィーである。カラムを５０ｍＭトリス緩衝液，ｐＨ７
で平衡にする。清澄化無細胞濃縮液を５０cm/時の線流
速で流す。Ｑセファロース・ファーストフロー樹脂１リ
ットルあたり、約６００〜１５００ユニットのｄＤＡＰ
活性が付加される。無細胞濃縮液の導電率は、１０mＭ
ＨＯＳ/cm以下である。サンプルの装填完了後、Ｑセフ
ァロース・ファーストフロー樹脂をカラム容積の２倍量
の平衡緩衝液で洗浄する。０〜１ＭのＮａＣｌの直線勾
配、５０ｍＭトリス，ｐＨ７を用い、流速５０cm/時で
カラム容積の１０倍量を流して、ｄＤＡＰ活性を樹脂か
ら溶離する。フラクションサイズは、カラム容積の０.
１〜０.２倍量である。導電率および２８０nmにおける
吸光度によって流出液をモニターし、ｐＨ３.５におけ
る、その比色分析用基質であるＧＦｐＮＡを切断する能
力によってフラクションのｄＤＡＰ活性を評価する。総
溶離ｄＤＡＰ活性の８０％以上を含むフラクションを合
わせて、主要流出液プールを用意する。ｄＤＡＰ画分は
単一ピークとして溶離する。１０％ｖ／ｖのＨＣｌを用
いて主要流出液プールを酸性化してｐＨ３.５にする。
Ｑセファロース・ファーストフロー酸性化主要流出液プ
ールを４℃に保つ。

【００３０】Ｄ）疎水的相互作用クロマトグラフィー 次に、Ｑセファロース・ファーストフロー酸性化主要流
出液プールを、ファルマシア製のフェニルセファロース
ファーストフロー樹脂で行う疎水的相互反応クロマトグ
ラフィー（ＨＩＣ）によって精製する。樹脂１リットル
あたり、約５００〜２０００ユニットの活性を付加す
る。Ｑセファロースファーストフロー主要流出液に、１
リットルあたり１４０ｇの硫酸アンモニウムを添加し
て、ＨＩＣカラムへの装填用に調製する。装填は、ｐＨ
３.５に調節して行い、最終導電率は約９０ｍＭＨＯＳ/
cmである。ＨＩＣカラムを、少なくとも１リットルあた
り１４０ｇの硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭクエン
酸，ｐＨ３.５で平衡にする。線流速４０cm/時で装填を
行い、樹脂を少なくともカラム容積の３倍量の平衡緩衝
液で洗浄する。１リットルあたり１４０ｇ〜０ｇの硫酸
アンモニウム、５０ｍＭクエン酸，ｐＨ３.５を用い、
流速４０cm/時でカラム容積の１０倍量を流して、ｄＤ
ＡＰ活性を樹脂から溶離する。フラクションサイズは、
カラム容積の０.１〜０.２倍量である。導電率および２
８０nmにおける吸光度によって、流出液をモニターし、
ｐＨ３.５における、ＧＦｐＮＡを切断する能力によっ
て、フラクションのｄＤＡＰ活性を評価する。総溶離ｄ
ＤＡＰ活性の８０％以上を含むフラクションを合わせ
て、主要流出液プールを用意する。１０％ｖ／ｖのＨＣ
ｌまたは１０％ｗ／ｗのＮａＯＨを用いて主要流出液プ
ールを酸性化してｐＨ３.５にする。ＨＩＣ主要流出液
プールを４℃に保つ。

【００３１】Ｄ）サイズ排除クロマトグラフィー セファクリル（Sephacryl）(登録商標)Ｓ−２００ＨＲ
で行うサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によっ
て、ＨＩＣ主要流出液をさらに切断する。アミコン再生
セルロース分子量１００００００カットオフ膜を用い、
超濾過ユニットでＨＩＣ主要流出液を濃縮することによ
って、ＳＥＣ用ＨＩＣ主要流出液を調製する。ＨＩＣ主
要流出液を濃縮し、残留液をユニットから排水する。超
濾過ユニットを５０ｍＭのクエン酸緩衝液，ｐＨ３.５
にて洗浄する。残留液と洗浄液を合わせて最終濃縮液を
成し、１０％ｖ／ｖのＨＣｌまたは１０％ｗ／ｖのＮａ
ＯＨを用いてｐＨを３.５に調節する。最終濃縮液の体
積は、ＳＥＣの体積の２.５％以下である。最終濃縮液
の導電率は約３０ｍＭＨＯ/cmである。ＳＥＣカラムを
５０ｍＭの酢酸、０.５Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ３.５
で平衡にする。この導電率は約２０〜３０ｍＭＨＯ／cm
である。最終濃縮液を、８cm/時の線流速で流し、カラ
ム容積の１倍量の平衡緩衝液を流して、ｄＤＡＰ活性を
樹脂から溶離する。フラクションサイズは、カラム容積
の０.０１倍量である。導電率および２８０nmにおける
吸光度によって流出液をモニターし、ｐＨ３.５におけ
る、ＧＦｐＮＡを切断する能力によってフラクションの
ｄＤＡＰ活性を評価する。総溶離ｄＤＡＰ活性の８０％
以上を含むフラクションを合わせて、主要流出液プール
を用意する。ｄＤＡＰ画分は単一ピークとして溶離す
る。ＳＥＣ主要流出液プールを数カ月間４℃に保つ。

【００３２】陰イオン交換樹脂、疎水的相互作用および
サイズ排除クロマトグラフィーを組み合わせて用いるｄ
ＤＡＰの精製によって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで大きなバン
ドとして移動する物質が得られる。バンドは、分子量標
準ウシ血清アルブミン（６６キロダルトン）に相当する
ゲル上の位置へ移動する。ＩＳＳプロ−ブルー着色剤で
タンパク質を着色する。サンプル調製中の０.１Ｍのジ
チオスレイトール（＋１００℃、５時間）の存在の有無
によって、移動パターンは影響を受けない。ウシ由来の
ＤＡＰ−Ｉのサブユニットの分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥ
によって約２２０００であると算出される。

【００３３】実施例３ ｄＤＡＰ活性の評価および特徴 Ａ）ＧＦ−ｐＮＡの切断 精製あるいは貯蔵後、通例、色素産生基質であるＧＦｐ
ＮＡの切断を用いて、ｄＤＡＰの酵素活性をモニターす
る。代表的に、このアッセイは、酵素を少なくとも１１
倍に希釈して、ｐＨ３.５に調節された、０.０５Ｍ酢酸
中の１.０mlの４ｍＭのＧＦｐＮＡに加えることによっ
て行われる。Ｇｌｙ−Ｐｈｅジペプチドの切断率を、４
０５ｎｍにおける吸光度の増加を測定することによっ
て、３７℃でモニターする。１単位の活性は、これらの
条件下で、１分間あたりのＯＤの変化として０.９０に
相当する。単位／mlの評価から、４０５ｎｍにおける遊
離のｐ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）の吸光係数を９.９
ｍＭ^-1ｃｍ^-1であると仮定できる。

【００３４】ウシ脾臓ＤＡＰ−Ｉの活性を阻害すること
がわかっているスルフヒドリル修飾剤であるヨードアセ
トアミドおよびテトラチオ酸カリウムを用いて、基質Ｇ
ＦｐＮＡに対するｄＤＡＰの阻害特性を、ウシ脾臓ＤＡ
Ｐ−Ｉのものと比較する。ｄＤＡＰまたはウシ脾臓ＤＡ
Ｐ−Ｉのサンプルを、それぞれ最終濃度０、０.５、５.
０または５０ｍＭの阻害剤を加え、ｐＨ７、１００ｍＭ
トリス緩衝液中、室温で１５分間インキュベートする。
次いで、インキュベートした溶液を４ｍＭのＧＦｐＮ
Ａ、ｐＨ３.５で２１倍に希釈する。３７℃における４
０５ｎｍの吸光度の増加を測定することによって、切断
率をモニターする。５ｍＭのヨードアセトアミドにさら
すことにより、ウシＤＡＰ−ＩのＧＦｐＮＡ切断率は９
０％以上減少し、５ｍＭのテトラチオ酸カリウムによっ
て９５％阻害される。試験したレベルのヨードアセトア
ミドまたはテトラチオ酸カリウムによる、ｄＤＡＰの大
きな阻害は認められない。

【００３５】ｐＨ３〜８の範囲の種々のｐＨに対して、
１０％ＨＣｌまたは１０％ＮａＯＨを含む０.５Ｍのト
リス、リン酸およびクエン酸からなる緩衝液を調節する
ことによって、ｄＤＡＰのＧＦｐＮＡ切断能力のための
最適ｐＨを決定する。１００ｍＭのシステアミンおよび
１０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で、酵素ｄＤＡＰを２
０倍に希釈する。同じ緩衝液で、ウシＤＡＰ−Ｉを２０
０倍に希釈する。ＧＦｐＮＡ基質溶液（４ｍＭ）を２％
ジメチルホルムアミド中で調製する。マイクロタイトレ
ーションプレートで、種々のｐＨのトリス／リン酸／ク
エン酸緩衝液０.０２５mlを、希釈酵素０.１mlおよび基
質溶液０.１mlと合わせる。４１０ｎｍにおける吸光度
の増加率を、３０分間にわたるプレートリーダーの読み
から決定する。ＧＦｐＮＡの切断のためのｄＤＡＰの最
適ｐＨは３.５〜４.０の間であることが結果として示さ
れる。

【００３６】Ｂ）Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（ＧＲｐＮ
Ａ）の切断 ５０ｍＭの酢酸、５０ｍＭのグリシン緩衝液、ｐＨ５に
おいて、４ｍＭのＧＲｐＮＡを調製する。ＨＣｌまたは
ＮａＯＨを用いて、５.１〜２.３の範囲の種々のｐＨを
達成する。上記ｐＨの緩衝化基質１８０μlに、５μlの
ｄＤＡＰ（最終的に４９ミリユニット／ｍｌ）を加え
る。４１０ｎｍにおける吸光度の増加率をモニターし
（プレートリーダーにて）、その増加率を反応溶液のｐ
Ｈ５と比較する。ＧＦｐＮＡと比較すると、ＧＲｐＮＡ
基質の最適ｐＨは３.５付近である。この酵素は、この
基質に対しては、ｐＨ２.５以下またはｐＨ５以上では
小さい活性しかもたない。

【００３７】Ｃ）ＲＲＢＮＡの切断 １００ｍＭの酢酸緩衝液、ｐＨ３.５または１００ｍＭ
のクエン酸緩衝液、ｐＨ５のいずれかの中で、約０.２
５ｍＭのＲＲＢＮＡまたは０.２５ｍＭのＺ−ＲＲＢＮ
Ａを調製する。２mlの基質に、ｄＤＡＰまたはウシＤＡ
Ｐ−Ｉ（約１５ミリユニット／ml溶液）を加える。切断
率（４１０ｎｍにおける蛍光の増加および３４０ｎｍに
おける励起をモニターする）をモニターする。ウシＤＡ
Ｐ−Ｉは、いずれの基質も切断することができない。驚
いたことに、ｄＤＡＰはＲＲＢＮＡ基質を効率よく切断
することができる。ｄＤＡＰは閉鎖されたアミノ基であ
るＺ−ＲＲＢＮＡ基質を切断することができず、このこ
とは、ｄＤＡＰがＤＡＰ酵素であるという所見をサポー
トするものである。ＲＲＢＮＡを切断するための最適ｐ
Ｈは、５０ｍＭの酢酸および５０ｍＭのクエン酸からな
る緩衝系を用いてＲＲＢＮＡ切断率をモニターすること
によって、得られる。ＨＣｌまたはＮａＯＨを用いて、
種々のｐＨを達成し、１.５mlの緩衝液に、１ｍＭのＲ
ＲＢＮＡストック溶液（最終濃度約０.２５ｍＭ）０.５
mlを加えて２.０mlとする。ｄＤＡＰを加え（約１５ｍ
Ｕ／mlになるまで）、切断率を決定する。ＲＲＢＮＡ切
断のための最適ｐＨは約４.５であることが観察され、
試験した全範囲（ｐＨ３.５〜５.７）において、大きな
活性が見られる。この驚くべき結果は、ｄＤＡＰがＤＡ
Ｐ−ＩＩＩの性質も、合わせもつことを示唆するもので
ある。当業者であれば、基質の切断のための最適ｐＨ
は、酵素に依存するものではなく、基質自身、すなわ
ち、除去されたジペプチドならびにそのインジケーター
基の構造に依存するものであることを認めるであろう。
たとえば、ｄＤＡＰを用いる場合、ＧＲｐＮＡの最適ｐ
Ｈは約３．５であり、一方、Ｇｌｙ−ａｒｇ−７−アミ
ド−４−メチルクマリンの切断の最適ｐＨは約５であ
り、このことは、環境指示基が切断特性に影響を与える
ことができることを示唆している。

【００３８】実施例４ ｄＤＡＰカラムの調製 Ｑセファロース・ファーストフロー樹脂の１．０mlカラ
ム（０．５×５．０cm）を、カラム容積の１０倍量の酢
酸（０．０５Ｍ酢酸，ｐＨ３．５）を通し、平衡にす
る。０．２７mlのｄＤＡＰを希酢酸で希釈して１．２２
mlにすることによって、ｄＤＡＰ（実施例１および２に
準じて製造、５．５Ｕ／ml）の１Ｕ／ml溶液を調製す
る。ｄＤＡＰ溶液を流速３０cm/時（０．１ml／分）で
流し、カラムを少なくとも１０mlの希酢酸で洗浄する。
ＧＦｐＮＡ活性アッセイを用いて、カラム流出液のｄＤ
ＡＰ活性を測定する。カラム流出液に、活性は検出され
ない。このことは、酵素ｄＤＡＰが、ほとんど定量的に
樹脂に結合することを示している。このカラムに付加さ
れたｄＤＡＰのレベルは、約１ユニット／cm³（または
５ユニット／cm²）に匹敵する。

【００３９】実施例５ 固定化ｄＤＡＰを用いるＧＦｐＮＡからｐＮＡへの変換 実施例４で調製したカラムに、０．０５Ｍ酢酸,ｐＨ
３．５中の１．０mlの０．４ｍＭのＧＦｐＮＡの溶液を
流速６０cm/時で加える。カラムからの流出液を、ＬＫ
Ｂモニター（モデル２１５１可変波長モニターを１．５
６ＡＵＦＳに設定し、１０mmフローセルを使用）を用い
てモニターする。カラムを下降するにつれて、溶液は黄
色になり、それたカラムに残るので、吸光度の増加が検
出される。着色と吸光度の両方の観察から、ｄＤＡＰカ
ラムが、ＧＦｐＮＡを着色生成物ｐＮＡに変換すること
が示される。１．０mlの固定化ｄＤＡＰカラム上にＧＦ
ｐＮＡを１．０ml注入するこのシステムは、樹脂上の酵
素ｄＤＡＰの有効性が持続しているかをモニターするた
めに定期的に使用する。

【００４０】実施例６ Ｍｅｔ−Ａｒｇ−ヒトプロインスリン類縁体（Ｂ２８
Ｌｙｓ，Ｂ２９ Ｐｒｏ）の変換 実施例４で調製したカラムをカラム容積の１０倍量の希
酢酸で平衡にする。組換え技術で生産したＭＲ−ＫＰＢ
−ｈＰＩの２０g/l溶液を用意し、１０％ｖ／ｖ塩酸溶
液にてｐＨ３．３に調節する。５．０mlのＭＲ−ＫＰＢ
−ｈＰＩ溶液を、ｄＤＡＰカラムに流速６０cm/時で室
温にて流す。流出液を１．０mlフラクションで集め、７
Ｍ尿素を含む０．０５Ｍ酢酸で希釈して４．０mlにす
る。ＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩからＫＰＢ−ｈＰＩへの変換
の程度を、ウルトラスフィアＯＤＳカラム[フェノメネ
ックス（Phenomenex）製]を、０．１Ｍのリン酸アンモ
ニウム（ｐＨ７）中の２５〜３０％のアセトニトリル勾
配で溶離することからなる逆相ＨＰＬＣ分析系でモニタ
ーする。

【００４１】２回目に、５．０mlのＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰ
Ｉを、ｄＤＡＰカラムに流速６０cm/時で流すと、ＨＰ
ＬＣで測定される変換パーセントは４０％である。３回
目に、５０mlのＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩを、ｄＤＡＰカラ
ムに流速６０cm/時で流す。この部分は連続的に再循環
させて合計２５０mlとなるように流すと、ＨＰＬＣで測
定される最終の変換パーセントは７５％である。４回目
に、５．０mlのＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩを、ｄＤＡＰカラ
ムに流速１２cm/時で流すと、ＨＰＬＣで測定される変
換パーセントは８３％である。５回目に、６０mlのＭＲ
−ＫＰＢ−ｈＰＩを、ｄＤＡＰカラムに流速１２cm/時
で流すと、ＨＰＬＣで測定される変換パーセントは８０
％である。６回目に、１４８mlのＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩ
を、ｄＤＡＰカラムに流速１２cm/時で流すと、ＨＰＬ
Ｃで測定される平均変換パーセントは８４％である。上
記の実験の進行により、合計１５日間が経過する。カラ
ムをＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩ溶液の実験に使用しない間
は、希酢酸で洗浄し、室温（２０℃）にて保存する。最
後に、２１３mlのＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩを、流速８cm/
時を維持しながら流すが、ＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩの変換
パーセントに大きな減少はなく、このことから、さらに
追加してＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩをこの樹脂に流しても、
持続して良い収率が得られることが示唆される。実験の
進行中、カラムの背圧の増加がときおり発生する；しか
し、一時的なカラムの逆流またはカラムフリット交換の
逆戻りによって、この問題は補正される。カラム上のｄ
ＤＡＰを、約５回の標準的バッチ方式のＭＲ−ＫＰＢ−
ｈＰＩ（２７３mlまたは約５．５ｇのＭＲ−ＫＰＢ−ｈ
ＰＩがこの実験で反応する）の等価物に対して変換反応
に付す。バッチ方式では、約５０〜６０mlまたは約１．
０ｇのＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩが１ユニットのｄＤＡＰと
反応する。この観察は、このように固定化されたｄＤＡ
Ｐが、ＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩ工程によるｄＤＡＰの使用
法に、大きな影響を与えるという主張を支持するもので
ある。

【００４２】実施例７ やや大きい固定化ｄＤＡＰカラムの調製 それぞれ１．０×６．０cm、２．２×６．０cmおよび３
０×１０cmのカラムに、Ｑセファロース・ビッグビーズ
樹脂（ファルマシア・ケミカル・カンパニー製）を充填
し、カラム容積の５倍量の希酢酸（０．０５Ｍ酢酸、ｐ
Ｈ３．５）で平衡にする。実施例１および２で製造およ
び単離した精製ｄＤＡＰ溶液（９．５Ｕ／ml）を、希酢
酸で希釈して４Ｕ／mlにする。ｄＤＡＰ溶液を上記の各
カラムに流速５０cm/時で流す。付加されるｄＤＡＰの
レベルは、それぞれ２．５Ｕ／cm²（１．０×６．０c
m）、５．０Ｕ／cm²（１．０×６．０cm）および１０．
０Ｕ／cm²（１．０×６．０cm、２．２×６．０cmおよ
び３０×１０cm）である。各カラムを少なくとも各カラ
ム容積の３倍量の希酢酸で洗浄する。ＧＦｐＮＡアッセ
イを用いて、各カラムの流出液のｄＤＡＰ活性を測定す
る。カラムから溶離される流出液フラクションには活性
は検出されない。このことは、酵素ｄＤＡＰがほとんど
定量的に樹脂に結合することを示している。

【００４３】実施例８ Ｍｅｔ−Ａｒｇ−ヒトプロインスリン類縁体（Ｂ２８
Ｌｙｓ，Ｂ２９ Ｐｒｏ）の変換 実施例７で調製した１．０×６．０cmのｄＤＡＰカラム
をカラム容積の３倍量の希酢酸で洗浄する。おおむね精
製した、組換え技術で生産したＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩの
１７g/l溶液を、１０％ｖ／ｖ塩酸溶液または１０％ｗ
／ｖ水酸化ナトリウムの溶液にてｐＨ３．５に調節す
る。２０００mlのＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩ溶液を、室温に
て種々の線流速（８〜１１５cm/時）で流す。少なくと
もカラム容積の２倍量の溶液を流した後、各流速の流出
液サンプルを集める。ＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩからＫＰＢ
−ｈＰＩへの変換の程度を、デュポン・ゾルバックス
（Zorbax）（登録商標)５ミクロン３００オングストロ
ームカラム（１５×４．６cm）を用いる逆相ＨＰＬＣ分
析系でモニターする。カラムを、ＡＣＮ勾配を用いるモ
ルホリン／リン酸／ＯＳＡ緩衝液系で溶離する。

【００４４】流速と収率の関係を、６つの異なる線流速
の平均に基づいて決定する。７６cm/時における収率を
定期的に評価することによって、カラムの作業をモニタ
ーすると、５４〜６１％であることがわかる。１９日間
保管した後、２回目の作業工程を行い、カラムに４００
mlのＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩを流す。７６cm/時における
収率は５５％である。最初の変換から４５日後、３回目
の作業工程を行い、カラムに６００mlのＭＲ−ＫＰＢ−
ｈＰＩを流す。２つの流出液サンプルに基づく、７６cm
/時における収率は４６〜５２％である。カラムをＭＲ
−ＫＰＢ−ｈＰＩ溶液の実験に使用しない間は、ｐＨ
３．５の希酢酸で洗浄し、室温（２０℃）にて保存す
る。上記のＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩ実験の間、ＭＲ−ＫＰ
Ｂ−ｈＰＩの変換パーセントは最小限度しか減少しな
い。

【００４５】上記実施例８における作業工程において、
カラム上の固定化ｄＤＡＰを、７．５回、標準的バッチ
方式のＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩ（２７３mlまたは約５．５
ｇのＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩがこの実験で反応する）の等
価物に対して変換反応に付す。この実験で変換されるＭ
Ｒ−ＫＰＢ−ｈＰＩは、合計３０００mlの（およそ５０
ｇ）のＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩに相当する。これに対し
て、バッチ方式工程における遊離酵素として用いた８ユ
ニットのｄＤＡＰは、与えられた時間枠内では、４００
ml（およそ６．８ｇ）のＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩに変換さ
れるだけである。この計算は、本発明方法が、バッチ方
式工程よりも有効な方法であるということを表してい
る。

【００４６】実施例９ 濃度を変化させるＭｅｔ−Ａｒｇ−ヒトプロインスリン
類縁体（Ｂ２８ Ｌｙｓ，Ｂ２９ Ｐｒｏ）の変換 実施例７で調製した１．０×６．０cmのｄＤＡＰカラム
をカラム容積の３倍量の希酢酸で洗浄する。おおむね精
製した、組換え技術で生産したＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩの
１７g/l溶液を、１０％ｖ／ｖ塩酸溶液または１０％ｗ
／ｖ水酸化ナトリウムの溶液にてｐＨ３．５に調節す
る。ＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩの１７g/l溶液を希酢酸で希
釈して、約３．４mg/mlおよび０．８５mg/mlの溶液にす
る。該１７mg/ml、３．４mg/mlおよび０．８５mg/mlの
ＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩ溶液を、室温（２０〜２２℃）に
て種々の線流速（１１５、７６および２３cm/時）で流
す。少なくともカラム容積の２倍量の溶液を流した後、
各流速の流出液サンプルを集める。ＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰ
ＩからＫＰＢ−ｈＰＩへの変換の程度を、デュポン・ゾ
ルバックス５ミクロン３００オングストロームカラム
（１５×４．６cm）を用いる逆相ＨＰＬＣ分析系でモニ
ターする。カラムを、ＡＣＮ勾配を用いるモルホリン／
リン酸／ＯＳＡ緩衝液系で溶離する。

【００４７】収率と流速の関係は、各基質濃度に対して
本質的に同一である（流速１１５cm/時において、１７m
g/ml、３．４mg/mlおよび０．８５mg/ml溶液の収率は、
それぞれ４８％、５０％および５０％である；流速７６
cm/時において、１７mg/ml、３．４mg/mlおよび０．８
５mg/ml溶液の収率は、それぞれ５５％、５８％および
５８％である；流速２３cm/時において、１７mg/ml、
３．４mg/mlおよび０．８５mg/ml溶液の収率は、それぞ
れ８３％、８９％および８５％である）。これはは、１
０Ｕ／cm²の固定化ｄＤＡＰカラムを用いる場合、変換
収率は基質濃度に関連して変化しないことを示してい
る。

【００４８】実施例１０ 再スラリー化したｄＤＡＰカラムを用いるＭｅｔ−Ａｒ
ｇ−ヒトプロインスリン類縁体（Ｂ２８ Ｌｙｓ，Ｂ２
９ Ｐｒｏ）の変換 実施例８で用いたカラムをカラム容積の１倍量の希酢酸
で再スラリー化する。カラムを少なくともカラム容積の
３倍量の希酢酸で充填・洗浄する。おおむね精製したＭ
Ｒ−ＫＰＢ−ｈＰＩの１７g/l溶液を、１０％ｖ／ｖ塩
酸溶液または１０％ｗ／ｖ水酸化ナトリウムの溶液にて
ｐＨ３．５に調節する。該ＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩ溶液
を、室温（２０〜２２℃）にて種々の線流速（１１５、
７６、３８、２３および４cm/時）で流す。少なくとも
カラム容積の２倍量の溶液を流した後、各流速の流出液
サンプルを集める。ＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩからＫＰＢ−
ｈＰＩへの変換の程度を、デュポン・ゾルバックス５ミ
クロン３００オングストロームカラム（１５×４．６c
m）を用いる逆相ＨＰＬＣ分析系でモニターする。カラ
ムを、ＡＣＮ勾配を用いるモルホリン／リン酸／ＯＳＡ
緩衝液系で溶離する。収率と流速の関係は、再スラリー
化の前の収率と本質的に同一である。流速１１５cm/時
において、収率は３９％であり、再スラリー化前の収率
は３８〜４１％である。

【００４９】実施例１１ Ｍｅｔ−Ａｒｇ−ヒトプロインスリン類縁体（Ｂ２８
Ｌｙｓ，Ｂ２９ Ｐｒｏ）の大きいスケールにおける変
換 実施例７で調製した１０Ｕ／cm²の固定化ｄＤＡＰの７
リットル容のカラム（３０×１０cm）を、カラム容積の
４倍量の希酢酸(ｐＨ３．５)で洗浄する。おおむね精製
したＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩの１６g/l溶液（２１８リッ
トル）（およそ３４８８ｇ）を、１０％ｖ／ｖ塩酸溶液
または１０％ｗ／ｖ水酸化ナトリウムの溶液にてｐＨ
３．５に調節する。ＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩ溶液を４℃か
ら２１℃に暖め、切断時間中（３０〜３５時間）、温度
を２１℃に維持する。溶液をカラムに１０cm/時で流
す。変換反応をモニターするために、流出液および充填
物のサンプルを２時間毎に処理する。ＭＲ−ＫＰＢ−ｈ
ＰＩ溶液がなくなった後、カラムを、カラム容積の３倍
量の希酢酸（ｐＨ３．５）で、流速１０cm/時にて洗浄
する。最初のカラム容積分を集め、ＫＰＢ−ｈＰＩ流出
物とともに保管し、カラムは希酢酸中、２１℃にて保管
する。ＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩからＫＰＢ−ｈＰＩへの変
換の程度を、３５℃にて、デュポン・ゾルバックス５ミ
クロン３００オングストロームカラム（１５×４．６c
m）を用いる逆相ＨＰＬＣ分析系でモニターする。カラ
ムを、イソクラティックなモルホリン／リン酸／ＯＳＡ
／ＡＣＮ緩衝液系で溶離する。緩衝液Ａ（２５％ＡＣ
Ｎ）および緩衝液Ｂ（５０％ＡＣＮ）の混合物をＡＣＮ
が３８〜４２％となるように維持する。変換収率の平均
値は約９８％である。

【００５０】１１日後、少なくともカラム容積の３倍量
の希酢酸でカラムを洗浄する。ＧＦｐＮＡ活性アッセイ
を用いてカラム流出液のｄＤＡＰ活性を測定する。カラ
ムから溶離したカラム流出液には、活性は検出されず、
このことは、カラム樹脂から活性ｄＤＡＰの溶け出しが
ないことを示している。おおむね精製したＭＲ−ＫＰＢ
−ｈＰＩの１７．５g/l溶液（２４２リットル）を、１
０％ｖ／ｖ塩酸溶液または１０％ｗ／ｖ水酸化ナトリウ
ムの溶液にてｐＨ３．５に調節する。ＭＲ−ＫＰＢ−ｈ
ＰＩ溶液を、切断時間中（３０〜３５時間）、温度を２
〜４℃に維持する。インラインの熱交換器を用いて、Ｍ
Ｒ−ＫＰＢ−ｈＰＩ充填物を２０〜２２℃に暖める。溶
液をカラムに１０cm/時で流す。

【００５１】変換反応をモニターするために、流出液お
よび充填物のサンプルを２時間毎に処理する。ＭＲ−Ｋ
ＰＢ−ｈＰＩ溶液がなくなった後、カラムを、カラム容
積の３倍量の希酢酸で、流速１０cm/時にて洗浄する。
最初のカラム容積分を集め、ＫＰＢ−ｈＰＩ流出物とと
もに保管し、他の２容積分は捨てる。カラムは希酢酸
中、２０℃にて保管する。ＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩからＫ
ＰＢ−ｈＰＩへの変換の程度を、３５℃にて、デュポン
・ゾルバックス５ミクロン３００オングストロームカラ
ム（１５×４．６cm）を用いる逆相ＨＰＬＣ分析系でモ
ニターする。カラムを、イソクラティックなモルホリン
／リン酸／ＯＳＡ／ＡＣＮ緩衝液系で溶離する。緩衝液
Ａ（２５％ＡＣＮ）および緩衝液Ｂ（５０％ＡＣＮ）の
混合物をＡＣＮが３８〜４２％となるように維持する。
変換収率の平均値は約９２％である。

【００５２】実施例１２ Ｍｅｔ−Ａｓｐ−ヒト成長ホルモンのプロセシングにお
けるｄＤＡＰの共有結合的固定化およびその用途 １ｇのＣＨセファロース４Ｂ（ファルマシア製）を１０
０ｍＭ酢酸（ｐＨ５）で膨潤させる。１mlの膨潤樹脂を
追加の１００ｍＭ酢酸（ｐＨ５）で徹底的に洗浄する。
樹脂と緩衝液のスラリー（１：１）を調製し、２３ｍＵ
の精製ｄＤＡＰ（実施例１および２に準じて調製）を加
える。反転によって、混合物を４℃で１８時間、緩やか
に混合する。次いで、樹脂を０．５×５cm(１．０ml)カ
ラム（ファルマシア（登録商標）ＨＲ５／５）に充填
し、０．５Ｍトリス（ｐＨ７）２．０mlを流速０．２ml
／分(１６．７cm/時)で流して洗浄する。樹脂にトリス
緩衝液を加えて、さらに３０分間インキュベートし、残
留活性化部位をなくす。さらに、２．０mlの０．０５Ｍ
酢酸（ｐＨ３．５）；２mlの０．５Ｍトリス、０．５Ｍ
ＮａＣｌ（ｐＨ７）；および４．０mlの０．０５Ｍ酢酸
（ｐＨ３．５）を流してカラムを洗浄し、前駆体タンパ
ク質との接触用のカラムを調製および平衡化する。

【００５３】Ｍｅｔ−Ａｓｐ−ｈＧＨは、大腸菌の細胞
質中で不溶性タンパク質として生成される。該不溶性タ
ンパク質を、可溶化し、おりたたんで固有のジスルフィ
ド結合をもつＭｅｔ−Ａｓｐ−ｈＧＨを生成し、イオン
交換クロマトグラフィーによって精製する。この調製物
の溶媒を交換し、ｐＨ３．５に調節して、固定化ｄＤＡ
Ｐカラム用の前駆体タンパク質溶液として使用する。２
８０ｎｍにおける溶液の吸光度を用いて決定されるＭｅ
ｔ−Ａｓｐ−ｈＧＨのおよその濃度は５mg/mlである。
Ｍｅｔ−Ａｓｐ−ｈＧＨ前駆体タンパク質溶液(５mg)
を、線流速１．２５cm/時でカラムに流す。カラム流出
液を１００ｍＭトリス、３０％アセトニトリル（ｐＨ
８）の溶液で１０倍に希釈し、逆相クロマトグラフィー
で評価し、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）変換収率３７％
を得る。さらに実験を行うと、このカラムを用いて、さ
らに６０mgのＭｅｔ−Ａｓｐ−ｈＧＨ溶液が、平均収率
３３％で切断可能であることが明らかになる。カラム流
出液の定期的なサンプリングから、ｈＧＨの収率が作業
工程を通して一定であることが示される。合計６５mgの
Ｍｅｔ−Ａｓｐ−ｈＧＨが切断される。バッチ方式で反
応を行う場合、６５mgのＭｅｔ−Ａｓｐ−ｈＧＨを切断
するには、約３９０ｍＵのｄＤＡＰが必要となる。ここ
で行った実験では、Ｍｅｔ−Ａｓｐ−ｈＧＨを切断して
ｈＧＨにするために、バッチ方式変換反応と比較して、
使用するｄＤＡＰが何倍も少なくてすむ、共有結合的に
固定化されたｄＤＡＰを使用することの可能性が表示さ
れる。

【００５４】実施例１３ Ｍｅｔ−Ａｓｐ−ヒトプロインスリン類縁体（Ｂ２８
Ｌｙｓ，Ｂ２９ Ｐｒｏ）のリサイクルおよび分離的通
過変換 １０Ｕ／cm²に相当するｄＤＡＰレベルをもつ、０．５
×５cmのカラムを実施例７の記載に準じて調製する。お
おむね精製した組換えＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩの溶液（約
１７g/l）を、１０％ｖ／ｖ塩酸溶液または１０％ｗ／
ｖ水酸化ナトリウムの溶液にてｐＨ３．５に調節する。
１００cm/時の流速で、室温（２０〜２２℃）にて、カ
ラムにＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩ溶液を流す。カラム容積の
約８倍量の溶液を流した後、流出液を連続的に装填コン
テナへリサイクルさせる。充填コンテナからサンプルを
定期的に取り出して処理する。ＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩか
らＫＰＢ−ｈＰＩへの変換の程度を、デュポン・ゾルバ
ックス５ミクロン３００オングストロームカラム（１５
×４．６cm）を用いる逆相ＨＰＬＣ分析系でモニターす
る。カラムを、ＡＣＮ勾配を用いるモルホリン／リン酸
／ＯＳＡ緩衝液系で溶離する。１、２および３回通過後
の等価物（カラムを通過した総体積は、装填コンテナお
よびライン中の溶液の総体積で割り切れる）の収率は、
それぞれ５８％、７１％および８０％である。

【００５５】前もって調製したカラムを、少なくともカ
ラム容積の３倍量の希酢酸で洗浄する。該カラムに、室
温（２０〜２２℃）にて、流速１５０cm/時および５０c
m/時で、前もって調製したＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩ溶液を
流す。流出液を集め、連続ではなく分離して追加的に２
〜３回通過させるやり方で、カラムに再度流す。流出液
のサンプルは各分離的通過後に取り出して処理する。Ｍ
Ｒ−ＫＰＢ−ｈＰＩからＫＰＢ−ｈＰＩへの変換の程度
を、前出の分析システムでモニターする。各分離的通過
後の累積収率は、１５０cm/時では５９％、８１％およ
び８５％であり、５０cm/時では７５％、８６％および
８９％である。これは、より高い線流速において、カラ
ム流出液をリサイクルさせること、または単一カラムを
分離的に通過させることによって、所望の変換収率が得
られることを表している。

【００５６】実施例１４ 連続した固定化カラムを用いるＭｅｔ−Ａｓｐ−ヒトプ
ロインスリン類縁体（Ｂ２８ Ｌｙｓ，Ｂ２９ Ｐｒｏ）
の変換 １０Ｕ／cm²に相当するｄＤＡＰレベルをもつ、０．５
×４．５cmの３本のカラムを実施例７の記載に準じて調
製する。カラムを連続して接続し、カラム容積の少なく
とも３倍量の希酢酸で洗浄する。おおむね精製した組換
えＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩの溶液（約１７g/l）を、１０
％ｖ／ｖ塩酸溶液または１０％ｗ／ｖ水酸化ナトリウム
の溶液にてｐＨ３．５に調節する。４０〜５０cm/時の
流速で、室温（２０〜２２℃）にて、カラムにＭＲ−Ｋ
ＰＢ−ｈＰＩ溶液を流す。ＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩからＫ
ＰＢ−ｈＰＩへの変換の程度を、デュポン・ゾルバック
ス５ミクロン３００オングストロームカラム（１５×
４．６cm）を用いる逆相ＨＰＬＣ分析系でモニターす
る。カラムを、ＡＣＮ勾配を用いるモルホリン／リン酸
／ＯＳＡ緩衝液系で溶離する。収率は、８４％〜９０％
の範囲である。これは、より高い線流速において、複数
の連続したカラムを用いることによって、所望の変換収
率が得られることを表している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リザ・ケイ・フォスター アメリカ合衆国46143インディアナ州グリ ーンウッド、フォックス・リッジ・アベニ ュー4263番

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 切断ポリペプチドを生成するための前駆
   体ポリペプチドからアミノ末端ジペプチドを除去する方
   法であって、 ａ)ジクチオステリウム・ジスコイデウムのジペプチジ
   ルアミノペプチダーゼ(ｄＤＡＰ)を適当な担体の表面上
   で固定化し； ｂ)ｄＤＡＰが機能するのに充分な条件下で、前駆体ポ
   リペプチドを固定化ｄＤＡＰと接触させて、前駆体ポリ
   ペプチドからアミノ末端ジペプチドを除去し；次いで、 ｃ)切断されたポリペプチドを回収する；ことを特徴と
   する方法。
2. 【請求項２】 前駆体ポリペプチドが、Ｍｅｔ−Ａｓｐ
   −ヒト成長ホルモン、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−ヒト成長ホルモ
   ン、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−ヒトプロインスリン、Ｍｅｔ(Ｏ)
   −Ａｒｇ−ヒトプロインスリン、Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−ヒト
   プロインスリン、ＭＲ−ＫＰＢ−ｈＰＩ[Ｍｅｔ−Ａｒ
   ｇ−ヒトプロインスリン類縁体(Ｂ２８Ｌｙｓ,Ｂ２９
   Ｐｒｏ)]、Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−ヒトプロインスリン類縁体
   (Ｂ２８Ｌｙｓ,Ｂ２９ Ｐｒｏ)、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−ヒト
   プロインスリン類縁体(Ｂ１０Ａｓｐ,ｄｅｓ Ｂ２８−
   ３０)、Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−ヒトプロインスリン類縁体(Ｂ
   １０ Ａｓｐ,ｄｅｓ Ｂ２８−３０)およびＭｅｔ−Ｔｙ
   ｒ−ヒトプロインスリン類縁体(ｄｅｓ ６４)から選ば
   れる請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前駆体ポリペプチドがＭＲ−ＫＰＢ−ｈ
   ＰＩ[Ｍｅｔ−Ａｒｇ−ヒトプロインスリン類縁体(Ｂ２
   ８ Ｌｙｓ,Ｂ２９ Ｐｒｏ)]であり、ｄＤＡＰが非共有
   結合によりＱセファロース・ファーストフロー樹脂に固
   定化される請求項２に記載の方法。