UA76661C2 - A method for producing recombinant humanæs insulin - Google Patents
A method for producing recombinant humanæs insulin Download PDFInfo
- Publication number
- UA76661C2 UA76661C2 UAA200503206A UAA200503206A UA76661C2 UA 76661 C2 UA76661 C2 UA 76661C2 UA A200503206 A UAA200503206 A UA A200503206A UA A200503206 A UAA200503206 A UA A200503206A UA 76661 C2 UA76661 C2 UA 76661C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- insulin
- hybrid protein
- strain
- proinsulin
- recombinant
- Prior art date
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract description 45
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 title abstract description 25
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 title abstract description 25
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 title abstract description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 10
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 40
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 36
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 abstract description 23
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 abstract description 18
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 abstract description 5
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 abstract description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- AYKYXWQEBUNJCN-UHFFFAOYSA-N 3-methylfuran-2,5-dione Chemical compound CC1=CC(=O)OC1=O AYKYXWQEBUNJCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 3
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 abstract 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 abstract 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 abstract 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 14
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 4
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 3
- CWGJBBRZFIPXNZ-UHFFFAOYSA-N [C-]#N.Br Chemical compound [C-]#N.Br CWGJBBRZFIPXNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 102000003670 Carboxypeptidase B Human genes 0.000 description 2
- 108090000087 Carboxypeptidase B Proteins 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150110300 Kap gene Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 2
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LXWQKLVAJOMMSN-REOHCLBHSA-N (2s)-2-amino-3-sulfanylpropanoyl chloride Chemical compound SC[C@H](N)C(Cl)=O LXWQKLVAJOMMSN-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101001091385 Homo sapiens Kallikrein-6 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102100034866 Kallikrein-6 Human genes 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000023852 carbohydrate metabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000021256 carbohydrate metabolism Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 102000034238 globular proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005896 globular proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 1
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Опис винаходуDescription of the invention
Винахід відноситься до галузі біотехнології та медицини і може бути використаним у виробництві лікарських 2 препаратів різної тривалості дії при лікуванні цукрового діабету.The invention relates to the field of biotechnology and medicine and can be used in the production of 2 medicinal preparations of different duration of action in the treatment of diabetes.
Інсулін - гормон підшлункової залози, який регулює процеси вуглеводного обміну та підтримує нормальний рівень глюкози у крові. Молекула інсуліну являє собою глобулярний білок, який складається з ланцюгів А (21 амінокислотний залишок) та В (30 амінокислотних залишків). Ланцюги А і В з'єднані двома дисульфідними зв'язками та мають ще один внутрішній дисульфідний зв'язок у ланцюгу А |Д.Мецлер, Биохимия, т. 1, стр. 70. 291-295, М., 1980 г). В організмі людини інсулін синтезується як попередник - препроінсулін, який складається з 110 амінокислотних залишків. В процесі біосинтезу внаслідок відщеплення сигнального пептиду з 23 амінокислот утворюється проінсулін, а при подальшому відщепленні С-пептиду - біологічно активна молекула інсуліну (В.В. Корпачев "Инсулин и инсулинотерапия", стр. 25-28, Киев, 2001 гі.Insulin is a hormone of the pancreas that regulates the processes of carbohydrate metabolism and maintains a normal level of glucose in the blood. The insulin molecule is a globular protein consisting of chains A (21 amino acid residues) and B (30 amino acid residues). Chains A and B are connected by two disulfide bonds and have one more internal disulfide bond in chain A. In the human body, insulin is synthesized as a precursor - preproinsulin, which consists of 110 amino acid residues. In the process of biosynthesis, as a result of the cleavage of the signal peptide from 23 amino acids, proinsulin is formed, and with subsequent cleavage of the C-peptide, a biologically active insulin molecule is formed (V.V. Korpachev, "Insulin and insulin therapy", pp. 25-28, Kyiv, 2001
У теперішній час інтенсивно розробляються нові технології одержання інсуліну і вдосконалюються існуючі. 12 Для виготовлення лікарських препаратів використовують інсуліни тваринного походження (свинячий і бичачий) та інсуліни людини. Частина інсулінів тваринного походження поступово зменшується внаслідок виникнення у хворих алергічних реакцій, викликаних видовою специфічністю тваринних білків. Технологія одержання інсуліну людини представлена двома напрямками: 1) технологіями одержання інсуліну людини напівсинтетичного та 2) технологіями одержання інсуліну людини біосинтетичного. Інсулін людини напівсинтетичний одержують із свинячого інсуліну за допомогою реакції транспептидації, використовуючи трипсин |Деклараційний патентCurrently, new technologies for insulin production are intensively being developed and existing ones are being improved. 12 Insulins of animal origin (porcine and bovine) and human insulins are used for the manufacture of medicinal products. Part of insulins of animal origin gradually decreases due to the occurrence of allergic reactions in patients caused by the species specificity of animal proteins. Human insulin production technology is presented in two directions: 1) semi-synthetic human insulin production technologies and 2) biosynthetic human insulin production technologies. Semi-synthetic human insulin is obtained from porcine insulin by means of a transpeptidation reaction using trypsin | Declaration patent
України Мо 46667А, 2001 рік; заявка Мо 2002135039, рішення про видачу патенту Росії від 29.11.2004 року).Mo 46667A of Ukraine, 2001; application No. 2002135039, decision on the issuance of a Russian patent dated November 29, 2004).
Технологія одержання біосинтетичного інсуліну є найбільш перспективною. Вона базується на технології рекомбінантних ДНК. Спочатку вдалося розробити технологію одержання біосинтетичного інсуліну людини шляхом дисульфідного зшивання ланцюгів А і В, які клонувалися і синтетизувалися окремо |Соедаеї! О.М. еї аї., с 1979, Ргос. Май. Асад. Зсі, ОБА 76 : 106 -110). В подальшому було встановлено, що інсулін з більш високим (3 виходом утворюється із свого біосинтетичного попередника - проінсуліну (Соизеийз І. еї а). 1987, Сепе, 61: 265 - 2671. Ген, який кодує біосинтез проінсуліну людини, був одержаний біля 20 років тому як синтезом кКДНК на матриці мРНК, яку виділили з підшлункової залози людини (ІВеїЇ 0.9. еї аї., 1979, Маїшиге, 282, 525 - 527), так і хіміко-ферментативним синтезом |(МУШіатвг О.С. еї аі!., 1982, Зсіепсе, 215,687-689). -The technology for obtaining biosynthetic insulin is the most promising. It is based on recombinant DNA technology. First, it was possible to develop a technology for obtaining biosynthetic human insulin by disulfide cross-linking of A and B chains, which were cloned and synthesized separately | Soedaei! OHM. ei ai., p. 1979, Rhos. May Asad Zsi, OBA 76: 106 -110). Later, it was established that insulin with a higher yield (3) is formed from its biosynthetic precursor - proinsulin (Soizeyz I. eyi a). 1987, Sepe, 61: 265 - 2671. The gene that codes for the biosynthesis of human proinsulin was obtained around 20 years ago both by the synthesis of cDNA on the mRNA matrix that was isolated from the human pancreas (IVeiYi 0.9. ei ai., 1979, Maishige, 282, 525 - 527), and by chemical-enzymatic synthesis |(MUshiatvg O.S. ei ai! ., 1982, Zsiepse, 215, 687-689).
На сьогодні вже розроблена методологія експресії гена проінсуліну людини у клітинах Е. соїї. Вона полягає Ге) у біосинтезі клітинами бактерій проінсуліну у складі гібридних білків у вигляді нерозчинних ,тілець включення". Гібридний білок забезпечує резистентність щодо дії протеолітичних ферментів клітин і ефективне ее, відщеплення лідерної послідовності від проінсуліну людини. В якості лідерної послідовності використовують Ге) глутатіон-З-трансферазу, бичачий протимозін, імуноглобулін -зв'язуючі домени білка А із 5.ацгеив та інші 3о (патент Мо 2144957, Росія, 1998 рік). Лідерні фрагменти відщеплюють хімічним або ферментативним шляхом. -To date, a methodology for the expression of the human proinsulin gene in E. soy cells has already been developed. It consists Ge) in the biosynthesis of proinsulin by bacterial cells in the composition of hybrid proteins in the form of insoluble inclusion bodies". The hybrid protein provides resistance to the action of proteolytic enzymes of cells and effective ee, cleavage of the leader sequence from human proinsulin. As a leader sequence, Ge) glutathione- Z-transferase, bovine antimosin, immunoglobulin-binding domains of protein A from 5.atsgeiv and other 3o (patent Mo 2144957, Russia, 1998). Leader fragments are cleaved by chemical or enzymatic methods. -
Хімічний спосіб передбачає обробку бромціаном по залишку метіоніну, а ферментативний - розщеплення по залишку аргініну - використання трипсину. Як відомо, бромціан є високотоксичною сполукою, тому його використання є головним недоліком цієї технології. «The chemical method involves treatment with cyanide bromide on the methionine residue, and the enzymatic method - cleavage on the arginine residue - using trypsin. As you know, cyanide bromide is a highly toxic compound, so its use is the main drawback of this technology. "
Найбільш близьким до винаходу за технічною суттю та результатом, якого досягають, є спосіб одержання З 50 рекомбінантного інсуліну людини за патентом України Мо 24452, 1998 року. Згідно з цим патентом в якості с штаму-продуцента гібридного білка використовують штам ЕзспПегіспіа соїї Хі І-Віе, який характеризуєтьсяThe closest to the invention in terms of technical essence and the result achieved is the method of obtaining C 50 recombinant human insulin according to Ukrainian patent No. 24452, 1998. According to this patent, the EzspPegispia soybean Hi I-Vie strain is used as a hybrid protein producer strain, which is characterized by
Із» наявністю плазміди ріп5К, котра кодує гібридний білок, в якому проінсулін людини - попередник інсуліну - зв'язується з природним лідерним пептидом через залишок аргініну і одержується на основі векторної плазміди рКК223-3. Клітини цього штаму культивують, вирощують в необхідній кількості біомасу, відібрані клітини дезінтегрують, проводять окисний сульфітоліз, очищують одержаний рекомбінантний білок-8-сульфонат і аніонообмінною хроматографією, потім знесолюють його на колонці з сефадексом (03-25 і ренатурують заWith" the presence of the rip5K plasmid, which encodes a hybrid protein in which human proinsulin - the precursor of insulin - is linked to the natural leader peptide through an arginine residue and is obtained on the basis of the pKK223-3 vector plasmid. The cells of this strain are cultivated, grown in the required amount of biomass, the selected cells are disintegrated, oxidative sulfitololysis is carried out, the obtained recombinant protein-8-sulfonate is purified by anion exchange chromatography, then it is desalted on a Sephadex column (03-25 and renatured according to
Ге»! допомогою 2-меркаптоетанолу. Очищений ренатурований білок розщеплюють трипсином, а подальше перетворення отриманих продуктів в інсулін проводять з використанням карбоксипептидази В. Потім його б очищують катіонообмінною хроматографією, фракції з високим вмістом інсуліну об'єднують і проводять заключнеGee! using 2-mercaptoethanol. The purified renatured protein is cleaved with trypsin, and further conversion of the obtained products into insulin is carried out using carboxypeptidase B. Then it is purified by cation exchange chromatography, the fractions with a high insulin content are combined and the final
Ге»! 20 очищення гельфільтрацією.Gee! 20 purification by gel filtration.
Це рішення дозволяє відмовитися від стадії бромціанового гідролізу при одержанні інсуліну, тобто від та використання токсичної сполуки, в певній мірі скоротити технологічний процес та підвищити вихід гібридного білка за рахунок відмовлення від додаткового імуноглобулін С - зв'язуючого домена між аргініном і проінсуліном. Але його недоліками є недостатній вихід гібридного білка та утворення домішок, які важко 59 усуваються (дез. Тпг0-Іпв), що призводить до зменшення виходу кінцевого продукту - рекомбінантного інсулінуThis decision makes it possible to abandon the stage of cyanide bromide hydrolysis in the production of insulin, i.e. from the use of a toxic compound, to a certain extent shorten the technological process and increase the yield of hybrid protein due to the rejection of the additional immunoglobulin C - binding domain between arginine and proinsulin. But its disadvantages are the insufficient output of the hybrid protein and the formation of impurities that are difficult to eliminate (des. Tpg0-Ipv), which leads to a decrease in the output of the final product - recombinant insulin
ГФ) людини. т Завданням винаходу є створення ефективного способу одержання рекомбінантного інсуліну людини, який гарантує збільшення виходу гібридного білка та одержання кінцевого продукту високої якості.GF) of a person. The task of the invention is to create an effective method of obtaining recombinant human insulin, which guarantees an increase in the output of the hybrid protein and obtaining a high-quality final product.
Поставлене завдання вирішується тим, що у способі одержання рекомбінантного інсуліну людини шляхом бо конструювання рекомбінантної плазмідної ДНК, в якій проінсулін зв'язаний з лідерною послідовністю Через аргінін, одержання і культивування штаму-продуцента гібридного білка ЕЗСНЕКІСНІА СОЇ, виділення і дезінтеграції клітин, виділення гібридного білка, його ферментативного розщеплення з наступним очищенням і одержанням цільового продукту, згідно з винаходом ділянка рекомбінантної плазмідної ДНК, яка кодує гібридний дБ білок з амінокислотною послідовністю проінсуліну людини, має наступну структуру:The task is solved by the fact that in the method of obtaining recombinant human insulin by the construction of recombinant plasmid DNA in which proinsulin is linked to the leader sequence Through arginine, obtaining and cultivating the hybrid protein-producing strain EZSNEKISNIA SOY, isolation and disintegration of cells, isolation of the hybrid protein , its enzymatic cleavage, followed by purification and obtaining the target product, according to the invention, the region of recombinant plasmid DNA, which encodes the hybrid dB protein with the amino acid sequence of human proinsulin, has the following structure:
1 МЕТО1у5екбестНівНнізНівНівНізНівбегбекс1уГгечуа1іРегоАгосСіубексНів 1 АТОБОСАССАБССАТСАТСАТСАТСАТСАСАССАоСооССтТооТОСсСОСОСОБСАССАТ 21 МеєАгоРпеуа1їАзпо1пНізГгецСувзбсіубекНізрецпУа1сіпАТатечТтукГгецМаї 61 АТОСОСТІТОТОААССААДСАССТОТОСООСТСАСАССТОСТОСААССТОСТСТАССТАСТОо 41 Сузб1ус1цАгос1уРбреРпетугТВгРгоГцузТПгАгЯАгоб1іЧА1асіцАзрієцсіп 121 ТОСОООСААССАСОСТТІСТТСТАСАСАСССААСАСССОССОССАСОСАСАССАССТОСАЄ 61 уа1с1усі1іпуа1с1і1птейбіусі1уб1УуРгобіуАзїасіубзеггедб1іпРгогепАТтТагей 181 стосоОСсАооТобАоСстовоСсоооооссстТоотТоСсАСоСАвСсстТоСсАосссттоосссто 81 б1ш0бі1убегтецсіптузАкодсіут1іеуа1б1іпсіпСсузвСузТпг5егІ1їеСувбегтгеий 241 СБАСОБОСТСССТОСАСААОСОТОССАТТСТОСААСААТОСТОТАССАССАТСТОСТОССТО см (8) 101 ТуксіпгепбіцАзпТукСувАвп'яхх «- зо 301 ТАССАССТОбАСААСТАСТОСААСТАС і в якості штаму-продуцента використовують штам ЕЗСНЕКІСНІА СОЇ ВІ21/рікв-ргоїп5, який ісе) характеризується наявністю сконструйованої плазміди, а перед ферментативним розщепленням гібридного «о білка проводять його обробку цитраконовим ангідридом.1 МЕТО1у5екбестНівНнізНівНівНізНівбегбекс1уГгечуа1іРегоАгосСіубексНів 1 АТОБОСАССАБССАТСАТСАТСАТСАТСАСАССАоСооССтТооТОСсСОСОСОБСАССАТ 21 МеєАгоРпеуа1їАзпо1пНізГгецСувзбсіубекНізрецпУа1сіпАТатечТтукГгецМаї 61 АТОСОСТІТОТОААССААДСАССТОТОСООСТСАСАССТОСТОСААССТОСТСТАССТАСТОо 41 Сузб1ус1цАгос1уРбреРпетугТВгРгоГцузТПгАгЯАгоб1іЧА1асіцАзрієцсіп 121 ТОСОООСААССАСОСТТІСТТСТАСАСАСССААСАСССОССОССАСОСАСАССАССТОСАЄ 61 уа1с1усі1іпуа1с1і1птейбіусі1уб1УуРгобіуАзїасіубзеггедб1іпРгогепАТтТагей 181 стосоОСсАооТобАоСстовоСсоооооссстТоотТоСсАСоСАвСсстТоСсАосссттоосссто 81 б1ш0бі1убегтецсіптузАкодсіут1іеуа1б1іпсіпСсузвСузТпг5егІ1їеСувбегтгеий 241 СБАСОБОСТСССТОСАСААОСОТОССАТТСТОСААСААТОСТОТАССАССАТСТОСТОССТО см (8) 101 ТуксіпгепбіцАзпТукСувАвп'яхх «- зо 301 ТАССАССТОбАСААСТАСТОСААСТАС і в якості штаму-продуцента використовують штам ЕЗСНЕКІСНІА СОЇ ВІ21/рікв-ргоїп5, який ise) is characterized by the presence of a constructed plasmid, and before enzymatic cleavage of the hybrid "o protein, it is processed by cyt raconic anhydride.
Приклад 1 ре)Example 1 d)
Конструювання рекомбінантної плазмідної ДНК. Рекомбінантна плазмідна ДНК створюється на основі одного ї- з представників серії ЗЕТ векторів, в нашому випадку, рЕТ 28а (ж). Даний вектор розміром 5369 п.н. (пар іуклеотидів) містить сайт ініціації реплікації (огі), ген стійкості до канаміцину (Кап), юлілінкерну ділянку та репресорний ген (І ад). Полілінкерна ділянка міститься за такими регуляторними ділянками, як 77 промотор, сайт зв'язування з рибосомою та сайт ініціації гранскрипції. Експресія полілінкерної ділянки даного вектора « знаходиться під контролем Г7 промотора. Ділянка рекомбінантної плазмідної ДНК згідно з винаходом, яка кодує з с їбридний білок, складається з лідерного фрагменту, який містить шість гістидинових іалишків і кодується . ділянкою транскрипції, і амінокислотної послідовності проінсуліну іюдини, зв'язаних через залишок аргініну. и?» Кодон вищевказаного залишку аргініну іводиться задля протеолітичного відщеплення лідерного фрагменту від проінсуліну пляхом трипсинолізу. Ця ділянка означена авторами як ,ргоіпз" на фізичній карті Текомбінантної плазмідної ДНК. кДНК проінсуліну отримують шляхом полімеразної іанцюгової реакції з використанням кКДдНК -І Бібліотеки клітин островків Лангерганса ідшлункової залози людини.Construction of recombinant plasmid DNA. Recombinant plasmid DNA is created on the basis of one of the representatives of the ZET series of vectors, in our case, pET 28a (g). This vector is 5369 bp in size. (a pair of nucleotides) contains a replication initiation site (ogi), a kanamycin resistance gene (Kap), a linker site, and a repressor gene (I ad). The polylinker region is located after such regulatory regions as the 77 promoter, the ribosome binding site, and the transcription initiation site. The expression of the polylinker section of this vector is under the control of the G7 promoter. The region of the recombinant plasmid DNA according to the invention, which encodes a hybrid protein, consists of a leader fragment that contains six histidine residues and is encoded by . site of transcription, and the amino acid sequence of proinsulin iudine, connected through an arginine residue. and?" The codon of the above-mentioned arginine residue is used for proteolytic cleavage of the leader fragment from proinsulin by trypsinolysis. This region is designated by the authors as "rgoipz" on the physical map of Tecombinant plasmid DNA. cDNA of proinsulin is obtained by polymerase chain reaction using kKDdNK -I Library of cells of the islets of Langerhans of the human pancreas.
Ф В якості олігонуклеотидних затравок використовують праймери наступного їТуклеотидного дизайну.Ф Primers of the following nucleotide design are used as oligonucleotide primers.
Ф 1771 | люF 1771 | lol
ГРогмага |5 - СС - САТАТО - СОА -Grogmaga |5 - SS - SATATO - SOA -
Ге»! 250 - ТТТСТСААССААСАССТСТО - З і 0 нн | в " Кемегв | 5- ТО - СААТТС - СТА - - СТТОСАСТАСТТСТССАСС ЗGee! 250 - TTTSTSAASSAAAASSSTSTO - With and 0 nn | in " Kemegv | 5- TO - SAATTS - STA - - STTOSASTASTTSTSSSASS Z
Рекомбінантну плазмідну ДНК, яку автори назвали ріКО-ргоїп5, конструюють шляхом клонування о нуклеотидної послідовності, яка кодує проінсулін, в полілінкерну ділянку вихідного вектора по липких кінцях сайтів Мае!/Есокі за допомогою лігазної реакції. їмо) Рекомбінантна плазміда ріК5-ргоїпз характеризується молекулярною масою 5575 п.н. і складається з наступних ділянок: огі - сайт ініціації реплікації; Кап - ген стійкості до канаміцину; ргоїпе - ділянка, що бо кодує гібридний білок з амінокислотною послідовністю проінсуліну людини; Гай - репресорний ген. Експресія рекомбінантного білка перебуває під контролем Т7-промотора. Повна генетична ідентичність послідовності проінсуліну людини була підтверджена ДНК-секвенуванням. Фізична карта рекомбінантної плазмідної ДНК представлена на фіг. 1.Recombinant plasmid DNA, which the authors named riKO-rgoip5, is constructed by cloning the nucleotide sequence that encodes proinsulin into the polylinker region of the original vector at the sticky ends of the Mah!/Esoki sites using a ligase reaction. imo) Recombinant plasmid riK5-rgoipz is characterized by a molecular weight of 5575 bp. and consists of the following sites: ogi - replication initiation site; Kap - gene for resistance to kanamycin; rgoipe - a section that encodes a hybrid protein with the amino acid sequence of human proinsulin; Guy is a repressor gene. The expression of the recombinant protein is under the control of the T7 promoter. The complete genetic identity of the human proinsulin sequence was confirmed by DNA sequencing. The physical map of recombinant plasmid DNA is presented in fig. 1.
Приклад 2 65 Для одержання штаму-продуцента, який містить проінсулін людини, компетентні клітини Е.соїї вихідного штаму ВІ21 трансформують рекомбінантною плазмідною ДНК ріКбргоїп5. Штам-продуцент Е.соїїExample 2 65 To obtain a producer strain that contains human proinsulin, competent E. soy cells of the original VI21 strain are transformed with recombinant plasmid DNA riKbrgoip5. The strain-producer of E. soybean
ВІ21/ріКаргоїпз характеризується наступним генотипом: Е-отр Нзазе (Ггв - пів-) да! аДзт Кт та має такі ознаки: 1) культурально-морфологічні: рухливі, непатогенні, грамнегативні палички розміром менше 1 мкм; на агаризованому середовищі ІВ, яке міститьбО мкг/мл канаміцина, утворюють округлі колонії білого кольору діаметром 2-3 мм за 12 годин інкубації при 372С; 2) фізіолого-біохімічні: клітини зростають в температурному діапазоні від 5 до 402С, оптимум рН від 6,0 до 7,5. Як джерела вуглецю, азоту і інших необхідних компонентів використовують амінокислоти, солі, вітаміни та глюкозу;VI21/riKargoipz is characterized by the following genotype: E-otr Nzaze (Hgv - semi-) yes! aDzt Kt has the following characteristics: 1) cultural and morphological: mobile, non-pathogenic, gram-negative rods less than 1 μm in size; on the agar medium IV, which contains 0 μg/ml of kanamycin, round white colonies with a diameter of 2-3 mm are formed in 12 hours of incubation at 372C; 2) physiological and biochemical: cells grow in the temperature range from 5 to 402C, optimum pH from 6.0 to 7.5. Amino acids, salts, vitamins and glucose are used as sources of carbon, nitrogen and other necessary components;
З) стійкість до антибіотиків: клітини виявляють стійкість до канаміцину. Концентрація канаміцину в 70 середовищі вища за 100 мкг/мл є критичною.C) resistance to antibiotics: cells show resistance to kanamycin. Kanamycin concentration in 70 medium higher than 100 μg/ml is critical.
Ідентифікація гібридного білка, який продукується штамом-продуцентом Е.соїї ВІ 21/ріКвргоіїп5, проводиться методом УУевіегп-Біої з використанням моноклональних антитіл проти інсуліну людини та антитіл, які розпізнають бхХНіз ділянку лідерного фрагменту.The identification of the hybrid protein, which is produced by the producer strain E. soii VI 21/riKvrgoiip5, is carried out by the UUevigp-Bioi method using monoclonal antibodies against human insulin and antibodies that recognize the region of the leader fragment.
Приклад З 15 В 5 мл рідкого живильного середовища ІВ, яке містить 10 г/л бактотриптону, 5 г/л дріжджового екстракту, г/л натрію хлориду, 0,05 г/л канаміцину сульфату, при рН 7,2 інокулюють індивідуальну колонію клітин штамуExample C 15 In 5 ml of liquid IV nutrient medium, which contains 10 g/l of bactotryptone, 5 g/l of yeast extract, g/l of sodium chloride, 0.05 g/l of kanamycin sulfate, at a pH of 7.2, an individual colony of cells is inoculated strain
Е.соїї ВІ 21/ ріК8 ргоіпз, продуцента гібридного білка, який містить проінсулін людини. Проводять інкубацію на качалочному апараті протягом ночі при температурі 372С. Нічну культуру вносять в колбу, яка містить 100 мл живильного середовища, і продовжують культивацію протягом б годин до оптичної густини культури (ОО вго), яка дорівнює одиниці, після чого її використовують для інокуляції ферментера. 100 мл культури вносять в 10 л живильного середовища, культивування в ферментері ведуть при температурі 372С з інтенсивною аерацією.E. soybean VI 21/riK8 rgoipz, producer of a hybrid protein that contains human proinsulin. Incubation is carried out on a rocking apparatus overnight at a temperature of 372C. The overnight culture is introduced into a flask containing 100 ml of nutrient medium, and the cultivation is continued for b hours until the optical density of the culture (OO vgo) is equal to one, after which it is used to inoculate the fermenter. 100 ml of culture are added to 10 liters of nutrient medium, cultivation in a fermenter is carried out at a temperature of 372C with intensive aeration.
Кожні 30 хвилин контролюють оптичну густину культури і при ОЮОв2о » З вносять індуктор експресії - ізопропіл- Р -О-тіогалактопіранозід до кінцевої концентрації 5 мМ і продовжують культивування протягом 4 годин. Одержану біомасу концентрують центрифугуванням (30 хвилин, 4 000 4). Клітини з 1 л культуральної с 29 рідини суспендують в 40 мл 0,05 М трис-НСІ буфері, 0,2 М натрію хлориду рН 7,8 і руйнують ультразвуковою ге) дезінтеграцією (З рази по 1 хвилині за частоти 44 кГц). Аналіз лізату бактеріальних клітин проводять методом електрофорезу в 15 956 ПААГУу (39 : 1) в присутності додецилсульфату натрію з наступним скануванням на денситометрі. Аналіз показав, що вміст гібридного білка складав 63 95 від сумарного білка клітин. Одержаний лізат бактеріальної культури центрифугують протягом 45 хвилин при 10 000 д з охолодженням (422). Отриманий (77 осад (тільця включення) розчиняють в 0,1 М трис-НСІ буфері рН 8,5, який містить 8М сечовини, до повного (Те) розчинення.Every 30 minutes, the optical density of the culture is monitored, and at ОХОв2о » C, the expression inducer - isopropyl-P-O-thiogalactopyranoside is introduced to a final concentration of 5 mM and cultivation is continued for 4 hours. The obtained biomass is concentrated by centrifugation (30 minutes, 4,000 4). Cells from 1 liter of culture liquid with 29 are suspended in 40 ml of 0.05 M Tris-HCl buffer, 0.2 M sodium chloride, pH 7.8 and destroyed by ultrasonic disintegration (3 times for 1 minute at a frequency of 44 kHz). Bacterial cell lysate analysis is carried out by electrophoresis in 15,956 PAAGUu (39:1) in the presence of sodium dodecyl sulfate followed by densitometer scanning. The analysis showed that the content of the hybrid protein was 63 95 of the total protein of the cells. The resulting bacterial culture lysate is centrifuged for 45 minutes at 10,000 d with cooling (422). The resulting (77) precipitate (inclusion bodies) is dissolved in 0.1 M Tris-HCI buffer pH 8.5, which contains 8 M urea, until complete (Te) dissolution.
Розчин тілець включення освітлюють центрифугуванням при 10 000 д при кімнатній температурі. Аналіз о показав, що розчин містив 155 мг білка, з яких 100 мг приходилися на гібридний білок (з 1 л культуральної Ге) рідини). Одержаний розчин розводять в 2 рази і проводять очищення від білків клітин ,хазяїна" за допомогоюThe solution of inclusion bodies is clarified by centrifugation at 10,000 d at room temperature. The analysis showed that the solution contained 155 mg of protein, of which 100 mg was the hybrid protein (from 1 L of culture fluid). The resulting solution is diluted 2 times and purification from the proteins of the "host" cells is carried out with the help of
Зо ДЕАЕ-сефарози, використовуючи ступеневий градієнт по натрію хлориду від 0,1 до 1 М.Фракція 0,3 - 0,6 М по - натрію хлориду містила гібридний білок - чистота 98 96. Після того проводять окисний сульфітоліз, використовуючи 6М гуанідин хлорид в 0,1 М трис-НСІ буфері рН 8,5 за концентрації гібридного білка 2 мг/мл та за кінцевої концентрації сульфіту натрію та хлориду цистеїну 0,05 М і 0,2 мМ, відповідно. «From DEAE-sepharose, using a graded gradient in sodium chloride from 0.1 to 1 M. The fraction of 0.3 - 0.6 M in sodium chloride contained a hybrid protein - purity 98 96. After that, oxidative sulfitolysis is carried out using 6M guanidine chloride in 0.1 M Tris-HCl buffer pH 8.5 at a hybrid protein concentration of 2 mg/ml and at final concentrations of sodium sulfite and cysteine chloride of 0.05 M and 0.2 mM, respectively. "
Відновлення дисульфідних зв'язків проводять в 0,1 М трис-НСІ буфері рН 7,5, який містить 4 М сечовини, - 70 2-меркаптоетанолом за концентрації 0,7 молей/л. с Після цього гібридний білок обробляють цитраконовим ангідридом за його 30 кратного молярного надлишку в з» перерахунку на 2 залишки лізину та при рН 8,2 - 8,5. Час реакції становить 2 години за кімнатної температури.Restoration of disulfide bonds is carried out in 0.1 M Tris-HCI buffer pH 7.5, which contains 4 M urea, - 70 2-mercaptoethanol at a concentration of 0.7 mol/l. c After that, the hybrid protein is treated with citraconic anhydride in its 30-fold molar excess in c" calculation for 2 lysine residues and at pH 8.2 - 8.5. The reaction time is 2 hours at room temperature.
Оброблений цитраконовим ангідридом гібридний білок розщеплюють трипсином (співвідношення фермент : субстрат складає 1:1000) і карбоксипептидазою В (0,05 од. на мг білка) протягом 2 годин при температурі 37 2б. 75 Реакцію зупиняють оцтовою кислотою, реакційну суміш інкубують за кімнатної температури для зняття їв. цитраконового захисту. (є) Реакційну суміш фільтрують через фільтр з розміром пор 0,2 мкм для нанесення на колонку системи ВЕРХ (високоефективної рідинної хроматографії). В якості нерухомої фази використовують сорбент ме) 1 1 1 2 обернено-фазового типу, наприклад, ЮОаізоде! О0О5-АР з розміром часток 15 мкм та розміром пор 100 - 150 АThe hybrid protein treated with citraconic anhydride is cleaved with trypsin (the enzyme: substrate ratio is 1:1000) and carboxypeptidase B (0.05 units per mg of protein) for 2 hours at a temperature of 37°C. 75 The reaction is stopped with acetic acid, the reaction mixture is incubated at room temperature to remove yeast. citracone protection. (e) The reaction mixture is filtered through a filter with a pore size of 0.2 μm for application to a HPLC (high performance liquid chromatography) column. As a stationary phase, a sorbent (me) 1 1 1 2 of the reversed-phase type is used, for example, YuOaizode! ООО5-АР with a particle size of 15 μm and a pore size of 100 - 150 A
Ф В якості рухомої фази використовують 0,06 М гліцин-НСІ буфер, 0,015 М амонію сульфату та пропанолу-2 з -з концентрацією від 20 до 35 9о за рН 2,5. Фракцію інсуліну людини кристалізують за рН 5,8.F As a mobile phase, 0.06 M glycine-HCI buffer, 0.015 M ammonium sulfate and propanol-2 with a concentration from 20 to 35 9o at pH 2.5 are used. The human insulin fraction is crystallized at pH 5.8.
Кристалічну суспензію фільтрують, кристали промивають водою, розчиняють в 0,25 95 оцтовій кислоті та наносять на колонку системи ВЕРХ. При такій же нерухомій фазі, як вказана вище, в якості рухомої фази в даному випадку використовують 0,05 М ацетатний буфер, котрий містить пропанолу-2 від 10 до 25 95 за рН 2,5. о Фракцію інсуліну людини кристалізують за рН 5,8, суспензію кристалів промивають водою та ліофільне висушують. іме) Ідентичність одержаного продукту - інсуліну людини - підтверджується наступними параметрами: - молекулярною масою (мас-спектрометрія), бо - амінокислотним складом, - збігом амінокислотної послідовності з С- та М-кінців (по 15 амінокислотах), - відповідністю часу утримування піку інсуліну міжнародному референт-стандарту О5Р при аналізі ВЕРХ, - відповідністю часу утримування фрагментів інсуліну референт - стандарту О5Р при аналізі ВЕРХ (пептидне картування протеазою М в), 65 - біологічною активністю.The crystalline suspension is filtered, the crystals are washed with water, dissolved in 0.25 95 acetic acid and applied to the column of the HPLC system. With the same stationary phase, as indicated above, as a mobile phase in this case, 0.05 M acetate buffer is used, which contains propanol-2 from 10 to 25 95 at pH 2.5. o The fraction of human insulin is crystallized at pH 5.8, the crystal suspension is washed with water and lyophilized. i.e.) The identity of the obtained product - human insulin - is confirmed by the following parameters: - molecular mass (mass spectrometry), because - amino acid composition, - coincidence of the amino acid sequence from the C- and M-ends (15 amino acids each), - correspondence of the retention time of the insulin peak to the international reference standard O5R in HPLC analysis, - compliance of the retention time of insulin fragments with the reference standard O5R in HPLC analysis (peptide mapping by protease M), 65 - biological activity.
Щодо амінокислотного складу одержаного рекомбінантного інсуліну людини в порівнянні з стандарт інсуліном, то він приводиться у таблиці нижче.Regarding the amino acid composition of the obtained recombinant human insulin in comparison with the standard insulin, it is given in the table below.
Проведені дослідження дозволили зробити висновок, що якість одержаного продукту відповідає вимогамThe conducted research made it possible to conclude that the quality of the obtained product meets the requirements
Європейської і ЗР фармакопеи і характеризується наступними показниками: вміст основної речовини » 98 9б, вміст високомолекулярних білків - не більше 0,5 905, вміст інсулінспоріднених сполук - не більше 1 95, вміст проінсуліну - не більше 10 ррт, вміст імунореактивних поліпептидів (пептидів клітин) - не більше 10 ррт, біологічна активність - не менше 27,5 МО/мг.of the European and Russian pharmacopoeias and is characterized by the following indicators: the content of the main substance » 98 9b, the content of high molecular weight proteins - no more than 0.5 905, the content of insulin-related compounds - no more than 1 95, the content of proinsulin - no more than 10 ppt, the content of immunoreactive polypeptides (peptides of cells ) - not more than 10 ppt, biological activity - not less than 27.5 IU/mg.
Таким чином, використання винаходу, що пропонується, дозволяє збільшити вихід гібридного білка більш ніж на 30 9о та одержати рекомбінантний інсулін високої якості. Окрім того, відмовлення від використання сефадекса 7/0 3-25 для знесолення рекомбінантного білка-5-сульфоната, катіонообмінної хроматографії для виділення і очищення інсуліну та гель-фільтрації на останньому етапі очищення, як у винаході -прототипі, дозволяє масштабувати виробничий процес і збільшити вихід кінцевого продукту. о60181 вве сч 67777191 зв яв о шо 186 в вв - зо с (Се)Thus, the use of the proposed invention allows to increase the output of the hybrid protein by more than 30 9o and to obtain high-quality recombinant insulin. In addition, the rejection of the use of Sephadex 7/0 3-25 for desalination of recombinant protein-5-sulfonate, cation exchange chromatography for isolation and purification of insulin, and gel filtration at the last stage of purification, as in the prototype invention, allows scaling the production process and increasing output of the final product. о60181 вве сч 67777191 звав о шо 186 ввв - зо с (Se)
Ф (Се) ормула винаходу і -F (Ce) formula of the invention and -
Спосіб одержання рекомбінантного інсуліну людини шляхом конструювання рекомбінантної плазмідної ДНК, яка кодує проінсулін, зв'язаний з лідерною послідовністю Через аргінін, одержання і культивування штаму-продуцента гібридного білка ЕЗСНЕКІСНІА СО, виділення і дезінтеграції клітин, виділення гібридного « білка, його ферментативного розщеплення з наступним очищенням і одержанням цільового продукту, в с який відрізняється тим, що ділянка рекомбінантної плазмідної ДНК, яка кодує гібридний білок з амінокислотною послідовністю проінсуліну людини, має наступну структуру: . и? -і (о) (о) (о) - іме) 60 б5The method of obtaining recombinant human insulin by constructing recombinant plasmid DNA that encodes proinsulin linked to the leader sequence Through arginine, obtaining and cultivating the hybrid protein producer strain EZSNEKISNIA CO, isolation and disintegration of cells, isolation of the hybrid protein, its enzymatic cleavage with the following purification and obtaining the target product, which differs in that the region of the recombinant plasmid DNA, which encodes a hybrid protein with the amino acid sequence of human proinsulin, has the following structure: and? -i (o) (o) (o) - name) 60 b5
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
UAA200503206A UA76661C2 (en) | 2005-04-06 | 2005-04-06 | A method for producing recombinant humanæs insulin |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
UAA200503206A UA76661C2 (en) | 2005-04-06 | 2005-04-06 | A method for producing recombinant humanæs insulin |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
UA76661C2 true UA76661C2 (en) | 2006-08-15 |
Family
ID=37504027
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
UAA200503206A UA76661C2 (en) | 2005-04-06 | 2005-04-06 | A method for producing recombinant humanæs insulin |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
UA (1) | UA76661C2 (en) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010062279A1 (en) | 2008-11-26 | 2010-06-03 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Mako" | Method for producing human recombinant insulin |
WO2012115638A1 (en) * | 2011-02-23 | 2012-08-30 | Elona Biotechnologies | Glargine proinsulin compositions and methods of producing glargine insulin analogs therefrom |
-
2005
- 2005-04-06 UA UAA200503206A patent/UA76661C2/en unknown
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010062279A1 (en) | 2008-11-26 | 2010-06-03 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Mako" | Method for producing human recombinant insulin |
WO2012115638A1 (en) * | 2011-02-23 | 2012-08-30 | Elona Biotechnologies | Glargine proinsulin compositions and methods of producing glargine insulin analogs therefrom |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3362847B2 (en) | Serine protease variants with peptide ligase activity | |
ES2437068T3 (en) | Cell lines to express enzyme useful in the preparation of amidated products | |
Wong et al. | New developments in enzymatic peptide synthesis | |
JPH11504217A (en) | Method for producing anti-obesity protein | |
JPH05501360A (en) | Enzymatic cleavage method for recombinant proteins using IgA protease | |
CN113105536B (en) | New proinsulin glargine and method for preparing insulin glargine by using same | |
JPH0659218B2 (en) | DNA transfer vector | |
Kadonookuda et al. | Baculovirus-mediated production of the human growth hormone in larvae of the silkworm, Bombyx mori | |
JPH0797995B2 (en) | Method for producing peptides | |
CN114790474B (en) | Preparation method of Somalutide | |
WO2010062279A1 (en) | Method for producing human recombinant insulin | |
RU2354702C2 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pHINS11 CODING HYBRID PROTEIN-HUMAN INSULIN PRECURSOR, Escherichia coli CELL, TRANSFORMED WITH RECOMBINANT PLASMID DNA pHINS11, Escherichia coli BACTERIA STRAIN JM109/pHINS11 - PRODUCER OF HYBRID PROTEIN-HUMAN INSULIN PRECURSOR, AND METHOD OF OBTAINING HUMAN INSULIN | |
WO2020187270A1 (en) | Fusion protein containing fluorescent protein fragments and uses thereof | |
UA76661C2 (en) | A method for producing recombinant humanæs insulin | |
RU2447149C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pMSIN4, CODING HYBRIDE POLYPEPTIDE - HUMAN INSULIN PRECURSOR, BL21(DE3)VpMSIN4-PRODUCER STRAIN OF RECOMBINANT HUMAN INSULIN, METHOD FOR PRODUCING RECOMBINANT HUMAN INSULIN | |
JP5743370B2 (en) | Method of extracting insulin by air gas treatment with improved folding | |
WO2013015697A1 (en) | A recombinant protein, a polynucleotide encoding it as well as a method of obtaining insulin or its an analogue | |
CN113201074B (en) | PKEK fusion protein and preparation method and application thereof | |
EA022946B1 (en) | Process for obtaining aspart insulin using a pichia pastoris yeast strain | |
JPH02190193A (en) | Production of c-terminal amidated peptide | |
KR101634078B1 (en) | Process for producing protein capable of forming inclusion body | |
CA2369973C (en) | Preparation of pancreatic procarboxypeptidase b, isoforms and muteins thereof and their use | |
CN113025599A (en) | Recombinant Clostridium histolyticum type I collagenase and preparation method and application thereof | |
RU2453604C1 (en) | Hybrid protein (versions), bacterial strain escherichia coli - hybrid protein producer (versions) and method for producing methionine-free human interferon alpha-2 | |
RU2451750C2 (en) | Method of producing recombinant human proinsulin c-peptide |