KR100720755B1 - 파보바이러스 항원의 세포표면 발현벡터 및 상기 벡터에의해 형질전환된 미생물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 개 파보바이러스 감염증 (Canine parvovirus; CPU) 및 고양이 범백혈구 감소증 (Feline panleukopenia; FLP)을 유발하는 파보바이러스의 캡시드(capsid) 항원단백질을 코딩하는 유전자와 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체를 코딩하는 유전자 pgsB, pgsC 및 pgsA 중 어느 하나 이상을 함유하는 파보바이러스 항원의 표면 발현벡터, 상기 표면 발현벡터에 의해 형질전환된 미생물 및 상기 미생물을 함유하는 파보바이러스 백신에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 파보바이러스 항원을 표면발현하는 재조합 균주를 이용하여 개 파보바이리스 감염증 및 고양이범백혈구 감소증의 치료용 또는 예방용 백신을 경제적으로 생산하는 것이 가능하다.
Description
발명의 분야
본 발명은 개 파보바이러스 감염증 (Canine parvovirus; CPV) 및 고양이 범백혈구 감소증 (Feline panleukopenia; FLP)을 유발하는 파보바이러스의 캡시드(capsid) 항원단백질을 미생물 표변에 발현시키는 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 미생물 및 상기 형질전환된 미생물 또는 그 추출 정제물을 함유하는 개 파보바이러스 감염증 및 고양이 범백혈구 감소증의 치료용 또는 예방용 백신에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 개 파보바이러스 감염증 및 고양이 범백혈구 감소증 유발 파보바이러스의 캡시드 항원단백질을 암호화하는 유전자와 미생물 표면 발현 모체인 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체를 코딩하는 유전자 pgsB, pgsC 및 pgsA 중 어느 하나 또는 둘 이상을 함유하는 표면 발현벡터와, 상기 벡터로 형질전환된 미생물 및 상기 형질전환된 미생물을 유효성분으로 포함하는 파보바이러스 백신에 관한 것이다.
개 파보바이러스(canine parvovirus: CPV) 감염증은 1978년 여름이래 전세계 적으로 발생보고 된 이래 현재까지 개 설사증의 가장 대표적인 전염병으로 자견에서 출혈성 장염과 때로 심근염을 주증으로 하며 발생율이 42％, 폐사율이 20％에 달하는 전염병이다. 이러한 개 파보바이러스(canine parvovirus: CPV) 감염증의 원인체는 개 파보바이러스로 파보바이러스과(Parvoviridae), 파보바이러스속(Parvovirus)에 속하고 고양이 파보 바이러스(Feline parvovirus)의 일종에 속한다. 일반적으로 개 파보바이러스는 바이러스중에서 가장 작은 바이러스이 하나로 입자의 직경은 18-26nm로써 엔벨로프 (envelope)가 없고 단쇄의 DNA바이러스이다(Sieel et al., Intervirology, 23:61-73, 1985). 바이러스 단백질은 3종의 폴리펩타이드를 가지고 있다. CPV는 활발하게 자라는 세포에서만 증식이 되고 세포배양에서 세포변성은 뚜렷하지 않으며 핵내봉입체(Cowdry type A)를 형성하고, 형광항체법에 의한 특이항원 검출이 가능하다. CPV는 밍크 장염바이러스 (mink enteritis virus, MEV)와 고양이 범백혈구 감소증 바이러스 (feline panleukopenia virus, FPLV)와 항원적으로 또한 유전적으로 매우 비슷하다 (Parrish et al., Arch. Virol., 72:267-78, 1982).
1978년 미국, 캐나다, 오스트리아 등에서 심한 구토, 설사를 동반하는 백혈구 감소를 보이는 개에서 파보 바이러스를 최초로 보고한 이후 1980년대 세계각국에 이 질병이 만연하게 되었으며, 특히 집단사육을 하는 경우에는 양성율이 높은 경향이 있으며 또한 전염력도 높다. 비오염지대에서 개 파보바이러스가 침입할 경우 바이러스 전염력이 강해서 장염형은 개의 연령에 관계없이 발생하여 높은 폐사율을 나타내고 일단 만연된 후에는 모든 개는 항체양성율을 나타내며, 그 후 질병 발생은 이행항체가 소실되는 강아지(7-14주령)에 집중되는 경향이 있다. 임상 증상은 경구감염 5일 후 중증이 되며 감수성 개가 바이러스에 노출되면 개의 100％가 감염되고 약 75％가 불현성 감염, 25％는 치사율이 높은 임상증상을 가질 수 있다. 초기증상으로 기력이 없고, 식욕감퇴와 구토를 일으키고, 구토를 시작한 후 24-48 시간에 설사가 관찰되고 계속 진행이 되면 탈수, 체중감소, 수양성 및 혈액이 포함된 설사가 관찰된다. 혈청중의 항체는 경구감염 5일 후에 측정이 가능하며, 7-8일에 최고가 된다.
현재 개 파보바이러스(canine parvovirus: CPV) 감염증의 진단은 주요 임상증상을 지표로 하고, 바이러스의 검출, 혈청 중화항체의 상승에 의해 확인을 한다. 개 파보바이러스는 혈구응집능을 가지고 있으며 이를 이용하여 분변의 HA 활성이나 HI항체가 측정으로 비교적 용이하게 진단할 수 있다. 또한, 혈증에 특이항체의 검출 및 감염 초기에 나타나는 특징적인 IgM 항체의 증명이 중요한 진단이 된다.
CPV에 대한 근본적인 치료방법은 없으며, 보존적인 지지요법만이 있다. 개 파보바이러스 및 고양이 범백혈구 감소증 바이러스의 감염을 막기 위한 최선의 방법은 백신을 통한 예방이다. 현재까지 사용되고 있는 파보바이러스 예방용 백신은 파보바이러스를 조직에서 배양한 후 포르말린을 이용하여 강병원성의 바이러스를 불활화한 사독 백신이거나 병원성바이러스를 실험실에서 수십 대에 걸쳐 계대배양하여 약독화한 바이러스를 사용한다.
조직배양을 이용하여 개 파보바이러스를 배양하면 불완전한 바이러스(empty particle)가 많이 생성되어 높은 역가의 백신을 생산하기가 극히 어렵다.
미생물의 세포표면에 원하는 단백질을 부착하여 발현시키는 기술을 세포표면발현(cell surface display)기술이라 한다. 이 세포표면 발현기술은 박테리아나 효모 등 미생물의 표면 단백질을 표면발현 모체(surface anchoring motif)로 사용하여 외래 단백질을 표면에 발현시키는 기술로서 재조합 생백신의 생산, 펩타이드/항체 라이브러리(library) 제작 및 스크리닝(screening), 전세포 흡착제(whole cell absorbent), 전세포 생물전환 촉매 등 다양한 응용범위를 가지고 있는 기술이다. 이 기술은 어떤 단백질을 세포 표면에 발현시키는가에 따라 그 응용범위가 결정되어지며, 따라서 세포표면 발현기술을 이용한 산업적 응용 잠재력은 상당하다고 할 수 있다.
성공적인 세포표면 발현기술을 위해서는 표면발현모체가 가장 중요하다. 얼마나 효과적으로 외래단백질을 세포표면에 발현시킬 수 있는 모체를 선정하고 개발하느냐가 이 기술의 핵심이 된다. 따라서 다음의 성질을 가진 표면발현모체를 선정해야 한다. 먼저 외래단백질을 세포표면까지 보내기 위해 세포내막을 통과할 수 있도록 도와주는 분비신호가 있을 것, 둘째 세포외막 표면에 안정되게 외래단백질이 부착될 수 있도록 도와주는 표적신호가 있을 것, 셋째 세포 표면에 다량으로 발현되나 세포의 성장에 거의 영향을 미치지 않을 것, 넷째 단백질의 크기에 관계없고 외래 단백질의 3차원 구조에 변화가 없이 안정적으로 발현될 것 등이다. 하지만 위의 조건을 모두 만족시키는 표면발현 모체는 아직까지 개발되지 않은 상태이다.
지금까지 알려져 사용된 표면발현모체로는 세포 외막 단백질, 지질단백질(lipoprotein), 분비 단백질(secretory protein), 편모 단백질과 같은 표면기관 단 백질 등 크게 4가지이다. 그람음성균(Gram negative bacteria)의 경우 LamB, PhoE(Charbit ef al., J. Immunol., 139:1658,1987; Agterberg et al., Vaccine, 8:85, 1990), OmpA 등과 같은 세포 외막에 존재하는 단백질을 주로 이용하였고, 지질단백질인 TraT(Feliei et al., J. Mol. Biol., 222:301, 1991), PAL(peotidoglycan associated lipoprotein)(Fuchs et al., Bio/Technology, 9:1369, 1991) 그리고 Lpp(Francisco et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 489:2713, 1992) 등 역시 이용되었으며, FimA나 1 형(type 1) 핌브리아(fimbriae)의 FimH 어드헤신(adhesin)과 같은 핌브리아 단백질(Hedegaard et al., Gene, 85:115, 1989), PapA 필루(pilu) 서브유닛과 같은 필리(pili) 단백질 등을 세포 표면발현 모체로 이용하여 외래 단백질의 발현을 시도하기도 하였다. 이 외에도 빙핵활성 단백질(ice nucleation protein)(Jung et al, Nat. Biotechnol., 16:576, 1998; Jung et al., Enzyme Microb. Technol., 22:348, 1998; Lee et al., Nat. Biotechnol., 18:645, 2000), 클레브시엘라 옥시토카(Klebsiela oxytoca)의 풀루라나제(pullulanase) (Kornacker et al., Mol. Microl., 4:1101, 1990), 니세리아(Neiseria)의 IgA 프로테아제((Klauser et al., EMBO J., 9:1991, 1990), 대장균의 adhesin인 AIDA-1, shigella의 VirG 단백질, Lpp와 OmpA의 fusion 단백질 등이 표면발현 모체로 사용할 수 있다는 보고가 있다. 그람양성균(Gram Positive bacteria)을 이용하는 경우에는 스타필로코쿠스 오레우스(Staphylococcus aureus)유래의 protein A 및 FnBPB 단백질을 표면발현 모체로 사용하여 말라리아 항원을 효과적으로 발현시킨 보고가 있으며, 젖산 박테리아의 표면 코트(coat) 단백질을 이용하여 표면 발현에 이용했다는 보고와 Streptococcus pyogenes 유래의 M6 단백질 (Medaglini, D et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 92:6868, 1995), Bacillus anthracis의 S-layer protein EA1, Bacillus subtilis CotB 등 그람양성 박테리아의 표면 단백질을 모체로 이용했다는 보고가 있다.
본 발명자들은 바실러스 속 균주 유래의 폴리 감마 글루탐산의 합성복합체 유전자(pgsBCA)를 새로운 표면발현 모체로 활용하여, 외래단백질을 미생물의 표면에 효과적으로 발현시키는 새로운 벡터와 상기 벡터로 형질전환된 미생물의 표면에 외래단백질을 다량 발현시키는 방법을 개발한 바 있다(WO 03/14360). 상기에서 소개된 표면발현 모체들을 이용하여 병원체의 항원 또는 항원 결정기를 유전공학적 방법을 이용하여 대량생산이 가능한 세균에서 안정하게 발현시키고자 하는 연구가 많이 시도되었다. 특히 비병원성의 세균 표면에 외래 면역원을 발현시켜 살아있는 상태로 경구투여를 할 경우 종래의 약독화된 병원성 세균이나 바이러스를 이용한 백신들 보다 더 지속적이고 강한 면역반응을 유도할 수 있다고 보고되었다. 이러한 면역반응 유도는 세균의 표면 구조물들이 표면 발현된 외래단백질의 발항원성(antigenicity)을 증가시키는 보조제(adjuvant)작용을 하기 때문이며 살아있는 상태의 균에 대한 체내의 면역 반응에 의한 것으로 알려져 있다. 이러한 표면발현 시스템을 이용한 비병원성 세균의 재조합 생백신의 개발은 주목할 만하다.
이에, 본 발명자들은 바실러스 속 균주 유래의 폴리감마글루팀산의 합성 복합체 유전자(pgsBCA)를 표면발현 모체로 활용하여 유전자 및 단백질 분석에 의해 선정한 파보바이러스의 항원을 유산균과 같은 비병원성이면서, 식품 안전성이 보장된 미생물의 표면에 다량 발현하여 확인하고, 이 미생물을 마우스의 경구 복용 및 비강으로 투여하여 파보바이러스에 대한 체내 혈중 항체 생성능 및 점막 면역을 유도시키는 보다 경제적이고 안정적인 예방 백신을 개발하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 미생물의 표면발현 시스템을 활용하여 파보바이러스 항원을 발현할 수 있는 벡터 및 상기 벡터에 의해 형질전환된 미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 파보바이러스의 항원이 표면에 발현된 형질전환된 미생물, 상기 미생물로부터 추출된 파보바이러스 항원 또는 상기 미생물로부터 정제된 파보바이러스 항원을 유효성분으로 함유하는 파보바이러스 예방용 백신을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폴리감마글루탐산 합성효소복합체를 코딩하는 유전자 pgsB, pgsC 및 pgsA 로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상과, VP2-1 및 VP2-2 그리고 VP2로 구성된 군에서 선택되는 파보바이러스의 캡시드(capsid) 항원단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 표면 발현벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 표면 발현벡터는 pHCE2LB:pgsA:VP2-1, pHCE2LB:pgsA:VP2-2 또는 pHCE2LB:pgsA:VP2인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 적용될 수 있는 미생물은, 생체 적용시 독성이 없거나, 약독화된(attenuated) 미생물이라면 어느 것이라도 가능하다. 바람직하게는, 그람음성균으로 대장균, 살모넬라 타이피, 살모넬라 타이피뮤리움, 비브리오 콜레라, 마이코박테리움 보비스, 시겔라 등을, 그람양성균으로 바실러스, 락토바실러스, 락토코커스, 스테필로코커스, 리스테리아 모노싸이토제네스 및 스트랩토코커스 등을 적절히 선택할 수 있다. 유산균과 같이 식용이 가능한 미생물을 선택하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명은 또한, 상기 형질전환된 미생물을 배양하여 파보바이러스의 캡시드 항원단백질을 미생물 표면에 발현하는 것을 특징으로 하는 파보바이러스의 캡시드 항원단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 항원단백질을 유효성분으로 함유하는 파보바이러스 예방용 백신을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 항원단백질이 표면에 발현된 미생물 자체를 이용하거나, 상기 미생물을 파괴하고 세포막 성분을 조추출한 물질을 이용하거나, 상기 미생물로부터 정제한 항원단백질을 이용하는 것이 모두 가능하다.
본 발명은 또한, 상기 형질전환된 유산균을 배양하여 파보바이러스의 캡시드 항원단백질을 유산균 표면에 발현하는 것을 특징으로 하는 파보바이러스의 캡시드 항원단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조되고, 파보바이러스의 캡시드 항원단백질이 표면에 발현되어 있는 유산균을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 유산균, 상기 유산균으로부터 추출된 캡시드 항원단백질 또는 상기 유산균으로부터 정제된 캡시드 항원단백질을 유효성분으로 함유하는 파보바이러스 예방용 백신을 제공한다.
본 발명에 의한 백신은 파보바이러스에 의해 유발되는 파보바이러스 감염증의 예방용 의약품으로 이용될 수 있다. 본 발명에 의한 백신은, 경구용 또는 식용으로 섭취할 수 있고, 피하 또는 복강에 주사하거나, 비강에 투여할 수도 있다.
본 발명은 또한, 상기 미생물 또는 상기 미생물 배양에 의해 수득되는 파보바이러스의 캡시드 항원단백질을 유효성분을 함유하는 파보바이러스 예방용 사료첨가제 및 파보바이러스 예방용 제제를 제공한다.
개 파보바이러스 및 고양이 범백혈구 감소증 유발 파보바이러스의 감염은 현재까지 주로 경구감염을 통해 이루어지는 것으로 알려져 있어 소화기 점막 조직 표면 (mucosal surface)에서 일어나는 것으로 추정되므로 점막면역에 의한 감염의 방어는 매우 중요하다. 따라서 파보바이러스의 항원을 표면에 발현하는 미생물은 점막에서의 항체형성 (mucosal response)을 더 효과적으로 유도할 수 있는 장점을 가지고 있어 상기의 형질전환된 미생물 자체를 이용한 경구용 백신 혹은 비강 투여 백신이 비경구용(parenteral) 백신 보다 파보바이러스의 방어에 더 효과적일 것으로 기대된다.
FIG. 1은 파보바이러스의 항원성 부위와 파보바이러스의 캡시드 단백질. VP2와의 관계를 카이트-둘리틀(Kyte-Doolittle) 방법인 소수성 플롯 (hydrophilicity plot), 제임슨-울프(Jameson-wolf) 방법인 항원 인덱스(Antigenic index) 그리고 에미니(Emini) 방법인 표면 확률 플롯(surface probability plot)을 통해 분석한 것을 나타낸 것이다.
FIG. 2(A)는 본 발명에 의한 그람음성 및 양성 미생물을 숙주로 하는 표면발현용 전환벡터 pHCE2LB:pgsA:VP2-1의 유전자 지도이고, FIG.2(B)는 본 발명에 의한 pHCE2LB:pgsA:VP2-2의 유전자 지도이며, FIG. 2(C)는 본 발명에 의한 pHCE2LB:pgsA:VP2의 유전자 지도이다.
FIG. 3은 본 발명의 표면발현 전환벡터 pHCE2LB:pgsA:VP2-1 및 pHCE2LB:pgsA:VP2-2로 각각 형질전환시킨 유산균에서 pgsA와 융합된 캡시드 단백질 VP2-1 및 VP2-2의 단백질 발현 양상을 웨스턴 블러팅한 사진이다. 레일 1은 형질전환되지 않은 숙주세포인 락토바실러스 카제이의 전세포를 나타내고, 레인 2는 pHCE2LB:pgsA:VP2-1/락토바실러스 카제이를 그리고 레인 3은 pHCE2LB:pgsA:VP2-2/락토바실리스 카제이를 나타낸다.
FIG. 4는 본 발명에 따른 표면발현 전환벡터 pHCE2LB:pgsA:VP2-1 및 pHCE2LB:pgsA:VP2-2로 각각 형질전환되고, 항원기의 표면발현이 확인된 락토바실러스 카제이 균주를 경구와 비강으로 각각 투여한 마우스의 혈청내 CPV VP2-1 및 CPV VP2-2 항원에 대한 IgG 항체가를 엘리자 방법(ELISA, Enzyme-linked Immunosorbent assay)으로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. A는 경구투여군에서의 IgA 항체가를 나타내고, B는 비강투여군에서의 IgA 항체가를 나타낸다.
FIG. 5는 본 발명에 따른 표면발현 전환벡터 pHCE2LB:pgsA:VP2-1 및 pHCE2LB:pgsA:VP2-2로 각각 형질전환되고, 항원기의 표면발현이 확인된 락토바실러스 카제이 균주를 경구와 비강으로 각각 투여한 마우스의 장 및 기관지, 폐포 세척액내 CPV VP2-1 항원 및 CPV VP2-2에 대한 IgA 항체가를 엘리자 방법으로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. A는 경구투여군에서의 IgA 항체가를 나타내고, B는 비강투여군에서의 IgA 항체가를 나타낸다.
발명의 실시를 위한 최선의 형태
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히 하기 실시예에서는 파보바이러스의 캡시드 단백질 내 항원성 부위 유전자 및 전체 유전자를 적용하였으나, 어떠한 항원단백질 유전자를, 단독으로 또는 둘 이상을 복합적으로 이용할 수도 있을 것이다.
또한 하기 실시예에서는 바실러스 서브틸리스 청국장(Bacillus subtilis var. chungkookjang, KCTC 0697BP)로부터 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자 pgsBCA를 획득하여 이용하였으나, 유전자는 폴리감마글루탐산을 생산하는 모든 바실러스 속 균주로부터 pgsBCA를 획득하여 제조된 벡터 또는 이 벡터를 이용한 형질전환된 미생물 등도 본 발명의 범위에 포함된다 하겠다. 예컨대, 바실러스 서브틸리스 청국장에 존재하는 pgsBCA 유전자의 염기서열과 80％ 이상의 상동성을 갖는 타균주 유래의 pgsBCA 유전자를 사용하여 백신용 벡터를 제조하거나, 이를 이용하는 것도 본 발명의 범위에 포함될 것이다.
또한, 하기 실시예에서는 유전자 pgsBCA 중에서 pgsA만을 활용하여 표면 발현용 벡터를 제작하였으나, 유전자 pgsBCA의 전부 또는 일부만을 사용하여 백신용 벡터를 제작하는 것도 본 발명의 범위에 포함될 것이다
또한, 하기 실시예에서는, 상기 벡터에 대한 숙주로서 그람양성세균인 락토바실러스만을 사용하였으나, 이 세균 이외에 여하한 그람음성균 또는 그람양성균도 본 발명에 의한 방법으로 형질전환시키면 동일한 결과를 얻을 수 있다는 사실도 당업자에게는 자명할 것이다.
또한, 하기 실시예에서는, 백신용 벡터로 형질전환된 미생물 자체를 생백신으로 생체에 적용한 예만이 제시되어 있다. 그러나, 백신관련 기술분야의 지식으로 보아, 상기 미생물로부터 조추출된 발현단백질(파보바이러스의 항원단백질) 또는 정제된 발현단백질을 생체에 적용하더라도 동일하거나 유사한 결과를 얻을 수 있음은 당연할 것이다.
실시예 1: 개 파보바이러스의 캡시드 항원단백질 VP2내 항원성 부위 유전자 선정
개 파보바이러스의 캡시드 항원단백질 VP2는 586 아미노산으로 구성된 당단백질이다. 많은 연구가 이루어져 있는 개 파보바이러스 경우 캡시드 항원단백질 VP2는 바이러스 감염을 유도하고, 감염을 막기 위한 백신의 목적 항윈으로 그 연구가 많이 이루어져 있다.
따라서, 보다 효과적인 항원성 부위를 개 파보바이러스의 캡시드 항원단백질 VP2의 단백질 분석 및 구조적 분석을 통해 항원성 부위를 선정하였다.
구체적으로 개 파보바이러스의 캡시드 항원단백질 VP2 항원성 부위의 단백질을 카이트-둘리틀(Kyte-Doolittle) 방법인 소수성 플롯(hydrophilicity plot), 제 임슨-울프(Jameson-wolf) 방법인 항원 인덱스(Antigenic index) 그리고 에미니(Emini) 방법인 표면 확률 플롯(surface probability plot)을 통해 분석 후, 개 파보바이러스 전체 캡시드 항원단백질 VP2중 VP2-1 및 VP2-2를 선정하였다 (FIG. 1).
VP2-1은 두번째 아미노산부터 155번째 아미노산까지 153아미노산 길이 부위를 선택하여 CPV VP2-1라 명명하였고, 252번째 아미노산부터 522아미노산까지의 270아미노산 길이 부위를 선택하여 CPV VP2-2라 명명하였다.
실시예 2 : 표면발현용 전환 벡터 pHCE2LB:pgsA:VP2-1의 제작
바실러스 속 균주에서 유래한 폴리 감마 글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA) 중 pgsA를 이용하여 그람음성 미생물 및 그람 양성 미생물을 숙주로 하여 개 파보바이러스의 캡시드 항원 단백질 VP2 단백질내 항원성 부위단편인 VP2-1을 표면발현할 수 있는 벡터 pHCE2LB:pgsA:VP2-1를 제작하였다.
우선, 국내 동물병원에서 개 파보바이러스 감염증으로 의심이 되는 개의 설사분변을 체취하여 바이러스를 분리한 후 바이러스 DNA를 추출하였다. 인간 파필로마바이러스의 L1 항원을 그람음성 및 그람 양성 미생물을 숙주로 하는 표면 발현용 벡터[그람음성 및 그람 양성 범용 벡터인 pAT에 항시적 고발현 프로모터인 HCE 프로모터, 폴리 감마 글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA)] 중 pgsA 그리고 HPV L1을 포함하는 전환벡터, KCTC 10349BP)에 CPV의 VP2-1을 코딩하는 유전자를 도입하기 위하여 개에서 분리한 개 파보바이러스 유전자를 주형으로 사용하고, CPV VP2-1을 코딩하는 유전자 유래 서열번호 1 (5'-cgc gga tcc agt gat gga gca gtt caa-3') 및 서열번호 2 (5'-ccc aag ctt aag ctt aaa cat taa aaa ttt ctt-3')의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 이용한 PCR을 수행하였다. 그 결과 증폭된 유전자 부위의 크기는 459bp였다.
상기 프라이머 서열 1 및 서열 2에는 표면발현용 벡터 pHCE2LB:pgsA-HPVL1 (KCTC 10349BP)을 BamHI과 KpnI으로 절단하여 HPVL1 유전자를 제거한 표면 발현용 벡터 pHCE2LB:pgsA에 존재하는 제한효소 BamHI과 KpnI 인식부위가 존재하도록 구성되었다. 상기 증폭된 CPV VP 2-1 항원 유전자를 제한효소 BamHI 및 KpnI으로 절단하여 미리 준비된 표면발현용 벡터 pHCE2LB:pgsA의 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자 pgsA의 C-말단 부위에 번역코돈을 맞추어 연결하여 전환벡터 pHCE2LB:pgsA:VP2-1 (FIG. 2(A))을 제작하였다.
상기 제작된 표면발현용 벡터 pHCE2LB:pgsA:pgsA:VP2-1로 그람양성 세균인 락토바실러스를 형질전환시킨 후, 락토바실러스 내의 pHCE2LB:pgsA:VP2-1 플라스미드의 존재를 확인하였다.
실시예 3 : 표면발현용 전환 벡터 pHCE2LB:pgsA:VP2-2의 제작
바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA) 중 pgsA를 이용하여 그람음성 미생물 및 그람 양성 미생물을 숙주로 하여 개 파보바이러스의 캡시드 항원단백질 VP2 단백질내 항원성 부위단편인 VP2-2를 표면발현할 수 있는 벡터 pHCE2LB:pgsA:VP2-2를 제작하였다.
우선, 개 파보바이러스의 캡시드 항원단백질 VP2 단백질내 항원성 부위단편인 VP2-2를 도입하기 위하여 상기 실시예 1에서 제작된 표면발현용 벡터 pHCE2LB:pgsA:VP2-1을 BamH I과 KpnI으로 절단하여 VP2-1 유전자를 제거하고 pHCE2LB:pgsA 표면 발현용 벡터를 준비하였다.
CPV의 VP2-2를 코딩하는 유전자를 도입하기 위하여 개에서 분리한 개 파보바이러스 유전자를 주형으로 사용하고, CPV VP2-2를 코딩하는 유전자 유래 서열번호 3 (5'-cgc gga tcc cca gta cac tta cta aga -3') 및 서열번호 4 (5'-ccc aag ctt ggt acc tta aat tct tga cat att-3')의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 이용한 PCR을 수행하였다. 그 결과 증폭된 유전자 부위의 크기는 810bp였다.
상기 증폭된 CPV VP2-2 항원 유전자를 제한효소 BamHI과 KpnI으로 절단하여 미리 준비된 표면발현용 벡터 pHCE2LB:pgsA의 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자 pgsA의 C-말단 부위에 번역코돈을 맞추어 연결하여 전환벡터 pHCE2LB:pgsA:VP2-2 (FIG. 2(B))를 제작하였다.
상기 제작된 표면발현용 벡터 pHCE2LB:pgsA:VP2-2로 그람양성세균인 락토바실러스를 형질전환시킨 후 락토바실러스 내의 pHCE2LB:pgsA:VP2-2 플라스미드의 존재를 확인하였다.
실시예 4 : 표면발현용 전환 벡터 pHCE2LB:pgsA-VP2의 제작
바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA) 중 pgsA를 이용하여 그람음성 미생물 및 그람 양성 미생물을 숙주로 하여 개 파보바이러스의 캡시드 항원단백질 VP2 단백질 전체를 표면발현할 수 있는 벡터 pHCE2LB:pgsA-VP2를 제작하였다.
우선, 개 파보바이러스의 캡시드 항원단백질 VP2 단백질을 도입하기 위하여 상기 실시예 1에서 제작된 표면발현용 벡터 pHCE2LB:pgsA:VP2-1을 BamHI과 KpnI으로 절단하여 VP2-1 유전자를 제거하고 pHCE2LB:pgsA 표면 발현용 벡터를 준비하였다.
CPV의 VP2를 코딩하는 유전자를 도입하기 위하여 개에서 분리한 개 파보바이러스 유전자를 주형으로 사용하고, CPV VP2를 코딩하는 유전자 서열 1 (5'-cgc gga tcc agt gat gga gca gtt caa-3') 및 서열 4 (5'-ccc aag ctt ggt acc tta aat tct tga cat att-3')의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 이용한 PCR을 수행하였다. 그 결과 증폭된 유전자 부위의 크기는 1563bp였다.
상기 증폭된 CPV VP2 항원 유전자를 제한효소 BamHI과 KpnI으로 절단하여 미리 준비된 표면발현용 벡터 pHCE2LB:pgsA의 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자 pgsA의 C-말단 부위에 번역코돈을 맞추어 연결하여 전환벡터 pHCE2LB:pgsA-VP2 (FIG. 2(C))를 제작하였다.
상기 표면발현용 벡터로 대장균을 형질전환하고, pHCE2LB:pgsA-VP2를 함유하는 대장균을 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC, 대전광역시 유성구 어은동 52 소재)에 KCTC10590BP의 수탁번호(2004년 1월 일31자)로 기탁하였다.
상기 제작된 표면발현용 벡터 pHCE2LB:pgsA-VP2로 그람양성 세균인 락토바실러스를 형질전환시킨 후, 락토바실러스 내의 pHCE2LB:pgsA-VP2 플라스미드의 존재를 확인하였다.
실시예 5 : pgsA와 융합된 CPV VP2-1 및 CPV VP2-2의 표면발현
상기 표면발현용 벡터 pHCE2LB:pgsA:VP2-1 및 pHCE2LB:pgsA:VP2-2로 각각 형 질전환된 락토바실러스를 배양하여 pgsA와 융합된 CPV VP2-1 및 CPV VP2-2항원의 단백질의 발현을 각각 조사하였다 (FIG. 3 참조). 폴리감마글루탐산을 합성하는 유전자 pgsA의 C-말단과 융합된 CPV VP2-1항원의 세균 발현은 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 pgsA에 대한 특이 항체를 이용한 웨스턴 블럿팅 (western immunoblotting)을 수행하여 확인하였다.
구체적으로 pHCE2LB:pgsA:VP2-1 및 pHCE2LB:pgsA:VP2-2로 각각 형질전환된 락토바실러스 카제이를 MRS배지(Lactobacillus MRS, Becton Dickinson and Company Sparks, USA), 37℃에서 정체 배양, 증식시킴으로 표면발현을 유도하였다.
발현이 유도된 락토바실러스 카제이를 동일한 세포 농도에서 얻은 단백질로 디네이쳐(denature)시켜 시료를 준비하고, 이를 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 분석한 다음 분획된 단백질들을 PVDF(polyvinylidene-difluoride membranes, Bio-Rad) 멤브레인에 옮겼다. 단백질들이 옮겨진 PVDF 멤브레인을 블로킹 완충용액 (50 mM 트리스 염산, 5 ％ 스킴 밀크(skim milk), pH 8.0)에서 1시간 동안 흔들어 블로킹시킨 다음 pgsA에 대한 토끼 유래의 단클론 1차 항체를 블로킹 완충용액에 1000배 희석하여 12시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 멤브레인은 완충용액으로 세척하고 바이오틴이 접합된 토끼에 대한 2차 항체를 블로킹 완충용액에 1000배 희석하여 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 멤브레인은 완충용액으로 세척하고 아비딘-바이오틴(avidin-biotin)시약을 1시간 동안 반응시켜 다시 세척하였다. 세척된 멤브레인에 기질과 발색시약으로 H2O2 와 DAB 용액을 첨가하여 발색시키고 HPV L1에 대한 특이 항체와 상기 융합단백질간의 특이적인 결합을 확인하였다 (FIG, 3). FIG. 3에서 레인 1은 형질전환되지 않은 숙주세포인 락토바실러스 카제이의 전세포를 나타내고, 레인 2는 형질전환된 pHCE2LB:pgsA:VP2-1/락토바실러스 카제이를, 그리고 레인 3은 형질전환된 pHCE2LB:pgsA:VP2-2/락토바실러스 카제이를나타낸다.
FIG. 3에 나타난 바와 같이, pHCE2LB:pgsA:VP2-1 플라즈미드 및 pHCE2LB:pgsA:VP2-2 플라즈미드에 의해서 각각 약 58.6kDa 과 71.7kDa의 융합 단백질 밴드를 확인할 수 있었다. pgsA가 약 41.8kDa이고, CPV VP2-1 단백질이 약 16.8kDa이므로 상기 약 59kDa를 나타내는 밴드는 pgsA와 CPV VP2-1 단백질이 융합된 융합단백질임을 알 수 있었고, CPV VP2-2 단백질이 약 30kDa이므로 상기 약 71.7kDa를 나타내는 밴드는 pgsA와 CPV VP2-2 단백질이 융합된 융합단백질임을 알 수 있다.
실시예 6 : 개 파보바이러스의 캡시드 항원단백질이 표면발현된 유산균의 백신효과 분석
상기 실시예 3 및 실시예 4에서 제작된 표면발현용 전환벡터 pHCE2LB:pgsA:VP2-1 및 pHCE2LB:pgsA:VP2-2로 그람양성균인 락토바실러스 카제이를 각각 형질전환시키고, 실시예 5의 방법으로 상기 항원을 락토바실러스 카제이에서 표면발현시킨 후, 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질 pgsA와 융합된 개 파보바이러스의 캡시드 항원단백질의 항원성을 마우스 모델을 이용하여 조사하였다.
4-6 주령의 C57BL/6 마우스 10마리를 하나의 군으로 하여, CPV VP2-1을 발현하는 유산균, CPV VP2-2 발현하는 유산균, 및 상기 2 유산균의 혼합물 각각을 다시 경구투여군과 비강투여군으로 분리하여 대조군 2군을 포함하여 총 4군으로 실험을 수행하였다. 대조군은 항원을 발현하지 않는 유산균을 이용하였다.
구체적으로, 본 발명의 표면발현 전환벡터 pHCE2LB:pgsA:VP2-1 및 pHCE2LE:pgsA:VP2-2를 각각 락토바실러스 카제이에 형질전환시켜 각각의 동일한 세균농도가 되도록 수득하였다. 상기 수득된 세포를 완충용액(PBS buffer, pH7.4)으로 여러 번 세척한 다음, 항원이 표면발현된 락토바실러스(5 X 109)를 4-6주령의 C57BL/6 마우스의 구강으로 1일 간격으로 다섯번, 1주뒤 다시 1일 간격으로 다섯번, 그리고 2주 위에 역시 1일 간격으로 다섯번 투여하였다. 또한 항원이 표면발현된 락토바실러스(1 X 109)를 마우스의 비강으로 1일 간격으로 세번, 1주뒤 다시 1일 간격으로 세번, 그리고 2주 뒤에 다시 1일 간격으로 세번 투여하였다.
각각의 경구 및 비강 투여 후 2주 간격으로 각각의 ① 마우스군 혈청을 취하여 혈청내 캡시드 항원단백질에 대한 IgG 항체가 및 ② 마우스의 내장부위를 취하여 장의 내부를 씻은 부유액내 및 기관지와 폐포의 내부를 씻은 부유액내에서의 캡시드 항원단백질에 대한 IgA 항체가를 엘리자 방법으로 측정하였다.
그 결과, pHCE2LB:pgsA:VP2-1 및 pHCE2LB:pgsA:VP2-2로 각각 형질전환시킨 락토바실러스를 단독 혹은 혼합하여 투여한 C57BL/6 마우스군의 혈청, 내장세척액 및 기관지 폐 세척액에서 개 파보바이러스의 캡시드 항원단백질인 VP2-1 및 VP2-2 항원의 항원기에 대한 IgG 항체가 및 IgA 항체가가 대조군에 비해 상당히 높게 나타났다 (FIG. 4 및 FIG. 5).
따라서, 본 발명에 의한 개 파보바이러스의 캡시드 항원단백질인 VP2-1 및 VP2-2 항원단백질의 항원기가 표면발현된 미생물은 경구용 점막백신으로서 효과적으로 작용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명에 따른 파보바이러스의 항원단백질을 표면발현하는 형질전환 미생물 및 상기 미생물로부터 추출정제된 항원단백질은 파보바이러스의 예방용 백신으로 활용할 수 있다. 특히, 본 발명의 파보바이러스 항원을 발현하는 재조합 균주는 경구 및 비강용 점막백신을 경제적으로 생산할 수 있는 장점을 가진다.
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Claims (20)
- 오리진과 프로모터를 가지는 벡터에 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체를 코딩하는 유전자 pgsB, pgsC 및 pgsA 로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상과, VP2-1, VP2-2 및 VP2로 구성된 군에서 선택되는 파보바이러스의 캡시드(capsid) 항원단백질을 코딩하는 유전자가 삽입되어 있는 상기 파보바이러스의 캡시드(capsid) 항원단백질의 표면발현용 벡터.
- 제1항에 있어서, 도 2의 A로 표시되는 계열지도를 가지는 pHCE2LB:pgsA:VP2-1, 도 2의 B로 표시되는 계열지도를 가지는 pHCE2LB:pgsA:VP2-2 또는 도 2의 C로 표시되는 계열지도를 가지는 pHCE2LB:pgsA:VP2인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
- 제1항 또는 제2항의 표면발현용 벡터로 형질전환된 미생물.
- 제3항에 있어서, 상기 미생물은 대장균, 살모넬라 타이피, 살모넬라 타이피뮤리움, 비브리오 콜레라, 마이코박테리움 보비스, 시겔라, 바실러스, 유산균, 스테필로코커스, 리스테리아 모노싸이토제네스 및 스트랩토코커스로 이루어지는 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 형질전환된 미생물.
- 제4항에 있어서, 상기 미생물은 유산균인 것을 특징으로 하는 형질전환된 미생물
- 제3항의 미생물을 배양하여 파보바이러스의 캡시드 항원단백질을 미생물 표면에 발현하는 것을 특징으로 하는 파보바이러스의 캡시드 항원 단백질을 제조하는 방법.
- 제6항의 방법에 의해 제조된 캡시드 항원단백질을 유효성분으로 함유하는 파보바이러스 예방용 백신.
- 제7항에 있어서, 상기 항원단백질은 미생물표면에 발현된 형태이거나, 조추출된 형태 또는 정제된 형태인 것을 특징으로 하는 백신.
- 제7항에 있어서, 경구용 투여 또는 식용 섭취가 가능한 것을 특징으로 하는 백신.
- 제7항에 있어서, 피하 또는 복강 주사용인 것을 특징으로 백신.
- 제7항에 있어서, 비강 투여용인 것을 특징으로 백신.
- 제7항에 있어서, 개 파보바이러스(Canine Parvovirus:CPV) 또는 고양이 범백혈구 감소증(Feline Panleukopenia; FLP) 예방용인 것을 특징으로 하는 백신.
- 제5항의 유산균을 배양하여 파보바이러스의 캡시드 항원단백질을 유산균 표면에 발현하는 것을 특징으로 하는 파보바이러스의 캡시드 항원 단백질을 제조하는 방법.
- 제13항의 방법에 의해 제조되고, 파보바이러스의 캡시드 항원단백질이 표면에 발현되어 있는 유산균.
- 제14항의 유산균 및 상기 유산균으로부터 추출된 캡시드 항원단백질 또는 상기 유산균으로부터 정제된 캡시드 항원단백질을 유효성분으로 함유하는 파보바이러스 예방용 백신.
- 제15항에 있어서, 경구용 투여 또는 식용 섭취가 가능한 것을 특징으로 하는 백신.
- 제15항에 있어서, 개 파보바이러스(Canine Parvovirus: CPV) 또는 고양이 범백혈구 감소증(Feline Panleukopenia; FLP) 예방용인 것을 특징으로 하는 백신.
- 제3항의 미생물 또는 상기 미생물 배양에 의해 수득되는 파보바이러스의 캡시드 항원단백질을 유효성분을 함유하는 파보바이러스 예방용 사료첨가제.
- 제14항의 유산균 및 상기 유산균 배양에 의해 수득되는 파보바이러스의 캡시드 항원단백질을 유효성분으로 함유하는 파보바이러스 예방용 사료첨가제.
- 제3항의 미생물 또는 상기 미생물 배양에 의해 수득되는 파보바이러스의 캡시드 항원단백질을 유효성분을 함유하는 파보바이러스 예방용 제제.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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