CN117866989A - 一种牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents
一种牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117866989A CN117866989A CN202310749076.3A CN202310749076A CN117866989A CN 117866989 A CN117866989 A CN 117866989A CN 202310749076 A CN202310749076 A CN 202310749076A CN 117866989 A CN117866989 A CN 117866989A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nanoparticle
- recombinant protein
- bovine viral
- viral diarrhea
- diarrhea virus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 title claims abstract description 57
- 241000710780 Bovine viral diarrhea virus 1 Species 0.000 title claims abstract description 44
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 47
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 claims abstract description 30
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 54
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 54
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 21
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 19
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 14
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 11
- 101150082674 E2 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 7
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 7
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 5
- 238000010008 shearing Methods 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract description 13
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract description 12
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 12
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 abstract description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 4
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 abstract description 3
- PPBOKXIGFIBOGK-BDTUAEFFSA-N bvdv Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CN=CN1 PPBOKXIGFIBOGK-BDTUAEFFSA-N 0.000 abstract 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 15
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 15
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 15
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 101710125507 Integrase/recombinase Proteins 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000017448 oviposition Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010051511 Viral diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000002062 molecular scaffold Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 2
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 240000000220 Panda oleosa Species 0.000 description 1
- 235000016496 Panda oleosa Nutrition 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000000474 nursing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明提供了一种牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原及其制备方法和应用，涉及基因工程技术领域。本发明采用以耐热纳米颗粒为支架的方法，耦连两个抗原构建二价抗原，将以E0和E2基因为基础的重组表达基因所编码的特征性抗原定向装载于纳米颗粒蛋白表面，制备含两个BVDV血清型特征性抗原的新型二价亚单位疫苗抗原，显著提升疫苗免疫原性。本发明利用二价纳米颗粒抗原免疫产蛋鸡，即可由其生产的蛋黄中提取相应的卵黄抗体，使得免疫制备的抗体滴度更高、亲和力更强。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体为一种牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
牛病毒性腹泻(Bovineviraldiarrhoea/Mucosaldisease)是由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起的以粘膜发炎、糜烂、坏死和腹泻为特征的一种传染性疾病，各种年龄的牛都易感染、以幼龄牛易感性最高。然而，该病至今尚无有效治疗和免疫方法，只有加强护理和对症疗法，增强机体抵抗力，促使病牛康复。
直至目前，应用疫苗防控BVD仍然是重要的方法。1960年BVDV疫苗开始生产，随着生物技术的发展，现如今已研制出多种类型的BVDV疫苗，其中，亚单位疫苗，尤其是多表位疫苗的研发取得了飞跃的进展。然而，仍然有部分表位肽存在体内容易降解、免疫原性较低的问题，这使得免疫细胞上的受体难以识别表位肽并刺激相应的免疫反应，从而导致产生的抗体滴度较低，难以产生较好的预防效果。而在BVDV基因组中E2、E0基因所编码的蛋白是BVDV的2个主要保护性抗原，均可用于基因工程疫苗的研究。E2基因保守性低，变异率高，所编码的蛋白具有较强的免疫原性；而E0基因高度保守并且抗原性也很强，已逐渐成为研制BVDV基因工程疫苗的候选者。
卵黄抗体是一种通过免疫接种产蛋母鸡，由其生产的蛋黄中提取相应的抗体，并可用于相应疾病的预防和治疗的抗体，具有制备简单、产量大、成本低、易保存与运输等优势。卵黄抗体的制备，需要对鸡进行高效免疫并持续产生高水平的抗体，因此，卵黄抗体制备所用的抗原是影响抗体制备的关键因素。现有制备卵黄抗体，一般仍采用传统的灭活苗、亚单位疫苗进行免疫，为维持抗体产生，需要持续多次免疫，给抗体生产带来更大的生产成本。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原，以耐热蛋白纳米颗粒作为支架，构建同时偶联BVDV的2个抗原的新型疫苗抗原，使疫苗具备多价、耐热、强免疫原的特征。
本发明目的还在于提供一种所述牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原的应用，所获得的卵黄抗体具有滴度高、亲合力强的特点，能够有效中和BVDV病毒。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原，所述牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原包括E0重组蛋白、E2重组蛋白和耐热纳米颗粒AaLS；编码E0重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码E0重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码耐热纳米颗粒AaLS的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述E0重组蛋白和/或E2重组蛋白的氨基端含有Spytag，所述E0重组蛋白和/或E2重组蛋白的羧基端含有组氨酸标签。
优选地，所述耐热纳米颗粒AaLS含有Spycatcher。
优选地，所述E0重组蛋白和/或E2重组蛋白的制备方法包括如下步骤：以BVDV-1GS5株的E0和/或E2基因序列作为重组表达基因，将上述E0和/或基因序列连接至pET21b表达载体获得重组载体pET21b-E0和/或pET21b-E2，并通过体外重组表达和纯化获得E0重组蛋白和/或E2重组蛋白。
优选地，所述体外重组表达包括如下步骤：将重组载体pET21b-E0和/或pET21b-E2转化到大肠杆菌BL21后在固体LB培养基上培养过夜，挑单菌落转入液体LB培养基中培养过夜后获得大肠杆菌单克隆种子菌；将获得的种子菌加入液体LB培养基中扩大培养后，加入IPTG诱导剂诱导目的蛋白表达。
本发明提供了一种所述牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原的制备方法，包括如下步骤：将E0重组蛋白和E2重组蛋白与耐热纳米颗粒蛋白AaLS以摩尔比1～1.5:1～1.5:1～3于PBS中性缓冲液中偶联即可获得牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原。
优选地，所述E0重组蛋白和/或E2重组蛋白的氨基端的Spytag与耐热纳米颗粒AaLS支架上的Spycatcher连接。
本发明还提供了一种免疫组合物，包括所述牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原和医学上可接受的佐剂。
优选地，将所述牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原与佐剂等体积比例混合后，使用磁力搅拌器在低剪切力200～300rpm下搅拌2～5h左右即可。
本发明还提供了一种所述的牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原或所述的免疫组合物在制备卵黄抗体中的应用。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明以耐热纳米颗粒为支架，同时耦连两个BVDV重要保护性抗原E0与E2，显著高了疫苗抗原的稳定性以及疫苗的免疫原性；本发明以构建的多价耐热纳米颗粒抗原作为免疫原，免疫制备卵黄抗体，以更小的成本从鸡蛋中提取更高产量、更高效价、更易保存、更高亲和力的卵黄抗体，制备的卵黄抗体能够有效中和BVDV病毒。
附图说明
图1为牛病毒性腹泻纳米颗粒抗原构建示意图；
图2为E0和E2重组蛋白纯化结果；
图3为耐热纳米支架与抗原蛋白的耦连结果；
图4为各个时间点不同组别卵黄抗体滴度结果；
图5为不同组别卵黄抗体中和试验结果。
具体实施方式
本发明提供了一种牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原，所述牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原包括E0重组蛋白、E2重组蛋白和耐热纳米颗粒AaLS；编码E0重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码E0重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码耐热纳米颗粒AaLS的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明中，所述E0重组蛋白和/或E2重组蛋白的氨基端含有Spytag，所述E0重组蛋白和/或E2重组蛋白的羧基端含有组氨酸标签。在本发明中，编码Spytag的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码组氨酸标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。在本发明中，Spytag通过柔性Linker1连接在E0蛋白和/或E2蛋白的氨基端；组氨酸标签通过柔性Linker2连接在E0蛋白和/或E2蛋白的羧基端。
在本发明中，所述耐热纳米颗粒AaLS含有Spycatcher。在本发明中，Spycatcher结构通过柔性Linker1连接连接在AaLS蛋白的氨基端；组氨酸标签通过Linker2连接在AaLS蛋白的羧基端，获得本发明所述耐热纳米颗粒AaLS。在本发明中，编码Spycatcher的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。在本发明中，所述耐热纳米颗粒AaLS制备方法为：将重组载体pET28a-AaLS转化到大肠杆菌BL21后在固体LB培养基上培养过夜，挑单菌落转入液体LB培养基中培养过夜后获得大肠杆菌单克隆种子菌；将获得的种子菌加入液体LB培养基中扩大培养后，加入IPTG诱导剂诱导目的蛋白表达。在本发明的具体实施例中，将重组载体pET28a-AaLS转化到大肠杆菌BL21后在固体LB培养基上37℃培养过夜，挑单菌落转入8ml液体LB培养基中37℃培养过夜后获得大肠杆菌单克隆种子菌。将获得的种子菌加入200ml液体LB培养基中37℃扩大培养2h后，16℃下加入1.0mMIPTG诱导剂12～16h以诱导目的蛋白表达，进一步通过镍柱和不同浓度梯度的咪唑液纯化目的蛋白，浓缩后采用SDS-PAGE的考马斯亮蓝染色进行纯度鉴定。上述LB培养基均加入50ug/ml卡那霉素(Kana)抗生素以排除杂菌污染。在本发明中，所述AaLS基因号：GenBank:WP_010880027.1。
在本发明中，所述E0重组蛋白和/或E2重组蛋白的制备方法包括如下步骤：以BVDV-1GS5株的E0和/或E2基因序列作为重组表达基因，将上述E0和/或E2基因序列连接至pET21b表达载体获得重组载体pET21b-E0和/或pET21b-E2，并通过体外重组表达和纯化获得E0重组蛋白和/或E2重组蛋白。在本发明中，所述E0基因序列如SEQ ID NO.7所示，E2基因序列如SEQ ID NO.8。
在本发明中，所述体外重组表达包括如下步骤：将重组载体pET21b-E0和/或pET21b-E2转化到大肠杆菌BL21后在固体LB培养基上培养过夜，挑单菌落转入液体LB培养基中培养过夜后获得大肠杆菌单克隆种子菌；将获得的种子菌加入液体LB培养基中扩大培养后，加入IPTG诱导剂诱导目的蛋白表达。在本发明的具体实施例中，将重组载体pET21b-E0和/或pET21b-E2转化到大肠杆菌BL21后在固体LB培养基上37℃培养过夜，挑单菌落转入8ml液体LB培养基中37℃培养过夜后获得大肠杆菌单克隆种子菌。将获得的种子菌加入200ml液体LB培养基中37℃扩大培养2h后，16℃下加入1.0mMIPTG诱导剂12-16h以诱导目的蛋白表达，进一步通过镍柱和不同浓度梯度的咪唑液纯化目的蛋白，浓缩后采用SDS-PAGE的考马斯亮蓝染色进行纯度鉴定。上述LB培养基均加入50ug/ml氨苄西林(Ampicillin)抗生素以排除杂菌污染。
本发明提供了一种所述牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原的制备方法，包括如下步骤：将E0重组蛋白和E2重组蛋白与耐热纳米颗粒蛋白AaLS以摩尔比1～1.5:1～1.5:1～3于PBS中性缓冲液中偶联即可获得牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原。在本发明的具体实施中，将纯化后E0重组蛋白和E2重组蛋白与纳米颗粒支架以摩尔比1.5:1.5:3于PBS中性缓冲液中在4℃偶联18h，偶联产物采用SDS-PAGE进行纯度鉴定，测定蛋白浓度后，保存于-20℃用于后续分析。
在本发明中，所述E0重组蛋白和/或E2重组蛋白的氨基端的Spytag与耐热纳米颗粒AaLS支架上的Spycatcher连接，可参见图1。
本发明还提供了一种免疫组合物，包括所述牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原和医学上可接受的佐剂。
在本发明中，将所述牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原与佐剂等体积比例混合后，使用磁力搅拌器在低剪切力200～300rpm下搅拌2～5h左右即可。
本发明还提供了一种所述的牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原或所述的免疫组合物在制备卵黄抗体中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1BVDVE0与E2蛋白基因库筛选、改造以及质粒构建
本发明通过基因库筛选选择了BVDV-1GS5株(GenBank:KJ541471)的E0及E2基因序列作为重组表达基因，并在E0及E2基因序列氨基端添加了Spytag，在其羧基端添加了组氨酸标签HHHHHH。
重组E0、E2及AaLS基因序列通过上海生工生物工程技术服务有限公司进行合成后，将重组E0与E2序列插入到质粒pET21a上的EcoRI和XhoI限制性酶切位点之间，得到重组大肠杆菌BL21表达质粒pET21a-E0与pET21a-E2；将重组AaLS序列插入到质粒pET28a上的NdeI和HindIII限制性酶切位点之间，得到重组大肠杆菌BL21表达质粒pET21a-E0与pET21a-E2。
实施例2E0与E2质粒转染、蛋白表达与纯化
将实施例1获得pET21b-E0和pET21b-E2表达质粒转化到大肠杆菌BL21后在固体LB培养基上37℃培养过夜，挑单菌落转入8ml液体LB培养基中37℃培养过夜后获得大肠杆菌单克隆种子菌。将获得的种子菌加入200ml液体LB培养基中37℃扩大培养2h后，加入1.0mMIPTG诱导剂诱导目的蛋白表达。进一步通过镍柱和不同浓度梯度的咪唑液纯化目的蛋白，浓缩后采用SDS-PAGE的考马斯亮蓝染色进行纯度鉴定。
根据图2结果显示，E0和E2重组蛋白均在500mM咪唑浓度被洗脱液洗脱，且大部分杂蛋白在之前的咪唑浓度便被洗脱下来，最后被洗脱的目的蛋白纯度较高。
实施例3耐热纳米支架与抗原蛋白的耦连与疫苗制备
将实施例2中纯化获得的E0、E2重组蛋白与纳米颗粒支架以摩尔比1:1:3于PBS中性缓冲液(Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl)中在4℃偶联18h，偶联产物采用体积排阻色谱法(SEC)与未耦连蛋白进行分离后，采用SDS-PAGE与BCA法分别进行纯度与浓度鉴定。耦连蛋白保存于-80℃用于后续分析。
根据图3结果显示，与用于对照的右侧泳道相比，用于检测蛋白耦连的泳道中支架位置的条带变细，证明耦连消耗了一定量的支架，即蛋白成功耦连了支架。
将上述保存的蛋白液稀释至1mg/ml后，与206佐剂按体积1:1比例混合，在4℃低温环境中使用磁力搅拌器以低剪切力300rpm搅拌3h左右，得到终浓度0.5mg/ml的均一蛋白乳液，以用于动物免疫注射。
实施例4牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原在制备卵黄抗体中的应用
(1)产蛋鸡免疫制备抗体
将20周龄产蛋母鸡分为4组：A组：阴性对照组；B组：E0-支架组；C组：E2-支架组和D组：E0+E2-支架组，每组5只。按照每组15ug/100ul/只的抗原量对各组注射相应的蛋白。阴性对照组注射等体积的生理盐水。首次免疫后每7天免疫一次，并在每次免疫前收集鸡蛋、测定鸡蛋卵黄液中特异性抗体效价，同时以阴性组鸡所产蛋为对照，结果如图4示。收集各实验组抗体效价为1:256以上的卵黄液，用于制备BVDV特异性的卵黄抗体。
(2)卵黄抗体的纯化
使用75％酒精对上述各组收集的鸡蛋进行消毒后，用卵黄分离器分离蛋白，收集卵黄并记录体积。加入2倍体积的PBS缓冲液后充分振荡。加入1/2体积氯仿充分振荡后，离心后收集上清液，使用50％硫酸铵沉淀卵黄抗体，最后溶于与原卵黄量等体积的PBS缓冲液中，使用PBS为透析液，4℃透析24小时，经0.22um滤膜过滤后即为纯化的卵黄抗体。经检测，抗体的滴度为105。
(3)卵黄抗体病毒抑制能力评价
采用固定病毒稀释法检测中和抗体。用2％FBS-DMEM培养基调整MDBK细胞密度为2×105个/孔并培养至贴壁状态。将感染了BVDV的细胞稀释至100TCID50。将待测的纯化后卵黄抗体用2％FBS-DMEM培养基按2倍倍比稀释后与100TCID50按照1:1混合后于37℃培养1-2h。加入病毒中和液后5％CO2、37℃培养箱培养3-7天后，观察细胞病变情况，若视野中MDBK细胞50％以上出现变大、变圆、破碎等病变则记为阳性，此孔的血清稀释倍数为血清中和效价。
根据图5的中和试验显示，免疫前各组中和效价均小于1:10。随着免疫时间的增加，三个实验组所产生的中和抗体滴度均上升，第35天时D组达到最高效价1:31623(104.5)。整体来看，D组所产生中和抗体滴度最高。
综上，以纳米颗粒为支架，设计并表达的的BVDVE0、E2重组蛋白通过与支架耦连，可以增强抗原的免疫原性，以此抗原免疫产蛋母鸡，能够有效诱导产蛋母鸡产生含有高水平、高效价、亲和力高的卵黄抗体的鸡蛋。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原，其特征在于，所述牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原包括E0重组蛋白、E2重组蛋白和耐热纳米颗粒AaLS；编码E0重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码E0重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码耐热纳米颗粒AaLS的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原，其特征在于，所述E0重组蛋白和/或E2重组蛋白的氨基端含有Spytag，所述E0重组蛋白和/或E2重组蛋白的羧基端含有组氨酸标签。
3.根据权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原，其特征在于，所述耐热纳米颗粒AaLS含有Spycatcher。
4.根据权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原，其特征在于，所述E0重组蛋白和/或E2重组蛋白的制备方法包括如下步骤：以BVDV-1GS5株的E0和/或E2基因序列作为重组表达基因，将上述E0和/或E2基因序列连接至pET21b表达载体获得重组载体pET21b-E0和/或pET21b-E2，并通过体外重组表达和纯化获得E0重组蛋白和/或E2重组蛋白。
5.根据权利要求4所述的牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原，其特征在于，所述体外重组表达包括如下步骤：将重组载体pET21b-E0和/或pET21b-E2转化到大肠杆菌BL21后在固体LB培养基上培养过夜，挑单菌落转入液体LB培养基中培养过夜后获得大肠杆菌单克隆种子菌；将获得的种子菌加入液体LB培养基中扩大培养后，加入IPTG诱导剂诱导目的蛋白表达。
6.权利要求1～5任意一项所述牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将E0重组蛋白和E2重组蛋白与耐热纳米颗粒蛋白AaLS以摩尔比1～1.5:1～1.5:1～3于PBS中性缓冲液中偶联即可获得牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述E0重组蛋白和/或E2重组蛋白的氨基端的Spytag与耐热纳米颗粒AaLS支架上的Spycatcher连接。
8.一种免疫组合物，其特征在于，包括权利要求1～5任意一项所述牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原和医学上可接受的佐剂。
9.权利要求8所述免疫组合物的制备方法，其特征在于，将所述牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原与佐剂等体积比例混合后，使用磁力搅拌器在低剪切力200～300rpm下搅拌2～5h左右即可。
10.权利要求1～5任意一项所述的牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原或权利要求8或9所述的免疫组合物在制备卵黄抗体中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310749076.3A CN117866989A (zh) | 2023-06-25 | 2023-06-25 | 一种牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310749076.3A CN117866989A (zh) | 2023-06-25 | 2023-06-25 | 一种牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117866989A true CN117866989A (zh) | 2024-04-12 |
Family
ID=90577930
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310749076.3A Pending CN117866989A (zh) | 2023-06-25 | 2023-06-25 | 一种牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117866989A (zh) |
-
2023
- 2023-06-25 CN CN202310749076.3A patent/CN117866989A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111607002B (zh) | 一种基于幽门螺旋杆菌铁蛋白的新型冠状病毒s蛋白双区域亚单位纳米疫苗 | |
| CN111217919A (zh) | 一种基于火球菌铁蛋白的新型冠状病毒s蛋白双区域亚单位纳米疫苗 | |
| CN113881704B (zh) | 一种包含新型冠状病毒双抗原靶标序列组合的重组新城疫病毒载体及相应疫苗株和疫苗 | |
| CN111560074A (zh) | 一种基于幽门螺旋杆菌铁蛋白的新型冠状病毒s蛋白单区域亚单位纳米疫苗 | |
| CN113186173B (zh) | 一种基于减毒流感病毒载体的新型冠状病毒肺炎疫苗 | |
| CN107033250B (zh) | 牛冠状病毒重组多表位抗原及其应用 | |
| RU2332457C2 (ru) | Вектор, обеспечивающий экспрессию антигена вируса sars на поверхности клеток, и микроорганизмы, трансформированные этим вектором | |
| CN113430178B (zh) | 一种表达ii型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株及其制备方法与应用 | |
| CN102816246A (zh) | 一种人巨细胞病毒免疫原融合蛋白及其制备方法和用途 | |
| CN111978411B (zh) | 一种猪蓝耳病亚单位疫苗及其制备方法与应用 | |
| CN111454989B (zh) | 一种嵌合型基因i型乙型脑炎病毒病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN111607605B (zh) | 一种多价表位和亚单位疫苗的构建方法 | |
| KR101919002B1 (ko) | 구제역 바이러스의 가용성 다가 항원단백질 및 이의 용도 | |
| KR100720755B1 (ko) | 파보바이러스 항원의 세포표면 발현벡터 및 상기 벡터에의해 형질전환된 미생물 | |
| CN110257428B (zh) | 一种表达猪圆环病毒3型orf2基因的重组腺病毒及制备方法与应用 | |
| CN110358741B (zh) | 一种表达猪塞内卡病毒vp2基因的重组杆状病毒及其制备方法与应用 | |
| CN116334139A (zh) | 基于猪圆环病毒2型病毒样颗粒的通用型模块化纳米抗原展示载体及其应用 | |
| CN117866989A (zh) | 一种牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒及其制备方法和应用 | |
| CN115779079A (zh) | 一种可增强与佐剂协同免疫效力的电荷调控型抗原蛋白 | |
| CN110028559B (zh) | 一种铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白及其编码基因和它们的应用 | |
| CN101116750A (zh) | 一种犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop | |
| CN113527516A (zh) | 一种a型塞内卡病毒基因工程复合表位蛋白、疫苗及其应用 | |
| TWI776048B (zh) | 預防豬瘟病毒感染之重組蛋白質及含其之組合物及細胞 | |
| CN115960265B (zh) | 一种长效多价猪口蹄疫和猪瘟疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN117106102B (zh) | 肠道病毒多抗原表位融合蛋白、基因、疫苗及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |