CN113430178B - 一种表达ii型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株及其制备方法与应用，所述表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株的保藏编号为CCTCC NO:V202148。本发明由II型单纯疱疹病毒蛋白优势表位整合入流感病毒基因组NS片段中组成的重组流感病毒，首次以流感病毒为载体表达II型单纯疱疹病毒蛋白；本发明的表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒可以在宿主细胞或鸡胚中稳定传代，可以用于II型单纯疱疹病毒疫苗的开发、相关药物的开发以及利用细胞或鸡胚作为生物反应器生产II型单纯疱疹病毒蛋白。

Description

一种表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株及其制备 方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株及其制备方法与应用。

背景技术

A型流感病毒(influenza A virus)属正粘病毒科，是一类负义，单链的RNA病毒。此类病毒由于血凝素HA和神经氨酸酶NA的重组与变异，可形成多种不同致病性且感染哺乳动物的流感病毒。其颗粒直径为80-120纳米，一般为丝状或球状，由八个编码片段编码而成，共由10种蛋白和8个vRNA基因组组成。8个vRNA分别为：PB2，PB1，PA，HA，NP，NA，M，NS，10种蛋白分别为：PB2，PB1，PA，HA，NP，NA，M1，M2，NS1，NEP。其中三种聚合酶蛋白(PB2，PB1，PA)可与核蛋白(NP)形成核糖核蛋白聚合物(RNPs)，在病进入细胞后释放并转移至细胞核启动基因组的复制与转录。血凝素HA是介导病毒与靶细胞受体结合，促进膜融合以及基因组进入靶细胞的蛋白。神经氨酸酶NA参与子代病毒的释放。M蛋白可通过来自同一RNA区段的不同阅读框来编码两个基质蛋白(M1和M2)，同样的，NS蛋白也通过可变性剪接产生NS1和NEP两个蛋白。病毒RNA的合成发生于细胞核中，而蛋白质的合成则发生于细胞质中，一旦病毒基因组和蛋白组装成子代病毒，病毒就会离开细胞核并向细胞膜迁移。而病毒跨膜蛋白(HA，NA和M2)以及M1蛋白部分可促进子代病毒以出芽方式释放。

反向遗传学技术主要是指某些病毒可通过质粒共转染的方式，产生病毒RNA及蛋白，从而包装出带有感染性和免疫原性的病毒。经过改进，这种方法同样适用于流感病毒此类负义RNA病毒。反向遗传学技术主要包括12质粒系统和8质粒系统，后者是在前者的基础上采用双向启动子手段加以改进的。将编码流感病毒的基因片段插入至PHW2000中，这是个双向表达系统，正向由polⅡ启动子(人巨细胞瘤病毒CMV启动子)开始，中间为插入的病毒基因，直至终止序列(牛生长激素poly(A)信号BGH)，此方向合成病毒mRNA，进一步翻译成病毒蛋白；反向由人polⅠ启动子开始，中间同样为病毒基因，直至鼠polⅠ终止序列，此方向合成病毒vRNA。

2A短肽是一类长18-22个氨基酸残基的肽片段，能诱导细胞内含有2A肽的重组蛋白进行自我剪切。目前比较常用的是四种2A肽：T2A，P2A，E2A，F2A。2A肽会在甘氨酸(G)和脯氨酸(P)连接处造成“剪切”的效果，核糖体无法将前后片段连接起来。2A肽诱导的剪切效率较高，部分情况下剪切效率接近100％。在表达蛋白中，如果要将两段蛋白分开表达，且构建在同一个载体上，就可使用2A短肽连接，翻译出来的蛋白可以有效分开，独立进行折叠，而且能恢复两个蛋白的功能。

II型单纯疱疹病毒(HSV-2)是一类DNA包膜病毒，主要引起生殖器或肛门等下体粘膜疱疹的病毒。大部分生殖器疱疹是由II型单纯疱疹病毒引起的，此外，HSV-2也可引起口腔等上半身部位粘膜溃疡。HSV-2主要的传播方式是性传播，此外母亲也可在怀孕或分娩期间传播给婴儿。由于部分人群初次感染HSV-2后呈无症状或亚临床状态，所以HSV-2在世界范围内得以流行。而另一个助长HSV-2肆虐的原因即是目前尚未针对HSV-2的疫苗，也没有能完全治愈由HSV-2感染所导致的生殖器溃疡的药物。目前世界范围内常用的抗HSV-2的药物是阿昔洛韦，但由于HSV-2能够潜伏至神经节内，阿昔洛韦也只是能抑制病毒复制而已，并不能完全杀死病毒，治愈患者。等到患者免疫力下降时，潜伏中的HSV-2会再次感染粘膜并造成溃疡。正因为如此，HSV-2感染引起的疱疹已经成为医药界的难题，研制对抗HSV-2的疫苗势在必行。

发明内容

为了解决所述技术问题，本发明提供了一种表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株及其制备方法与应用，本发明首次以流感病毒为载体表达II型单纯疱疹病毒蛋白，广谱性高且成本低。

在本发明的第一方面，提供了一种表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株，所述重组流感病毒株为表达II型单纯疱疹病毒蛋白的流感病毒载体通过反向遗传系统在细胞中拯救出的表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒；

所述编码II型单纯疱疹病毒蛋白的基因位于改造过的甲型流感病毒NS片段的开放阅读框内；编码所述II型单纯疱疹病毒蛋白的核心抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述改造过的甲型流感病毒NS片段的剪接位点进行了同义突变：将525-CCAGGA-530突变为525-CCCGGG-530；

所述II型单纯疱疹病毒蛋白的基因片段的5’端通过T2A连接子与甲型流感病毒NS1片段3端’连接；II型单纯疱疹病毒蛋白的基因片段的3’端通过P2A连接子与甲型流感病毒NEP片段5’端连接。

进一步地，所述流感病毒载体包括A型流感病毒A/WSN/33或A/PR/8/34中的一种。

进一步地，所述流感病毒载体为A型流感病毒A/WSN/33，所述表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株的保藏编号为CCTCC NO:V202148。

所述重组流感病毒可以在MDCK细胞、A549细胞、VERO细胞或鸡胚中进行传代和扩增；

在本发明的第二方面，所述的表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株在制备II型单纯疱疹病毒疫苗中的应用以及在利用鸡胚或细胞作为生物反应器生产II型单纯疱疹病毒蛋白中的应用。

在本发明的第三方面，提供了一种II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒疫苗，包括所述的表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株。

本发明中的重组流感病毒可用作病毒载体疫苗、亚单位疫苗、蛋白疫苗。

本发明用作疫苗时接种途径包括肌肉注射、皮下注射，鼻腔、口腔等粘膜感染。

在本发明的第四方面，提供了一种表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株的制备方法，所述方法包括：

将甲型流感病毒WSN中NS片段的剪接位点进行同义突变，将525-CCAGGA-530突变为525-CCCGGG-530；

获得氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示II型单纯疱疹病毒蛋白的串联基因；

将所述串联基因通过Linker连接于所述NS1片段和所述NEP片段之间，获得5’-3’方向分别为NS1、T2Alinker、II型单纯疱疹病毒基因、P2Alinker、NEP的重组NS质粒；

将所述重组NS质粒和WSN的其他七个质粒共转染宿主细胞，获得表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株。

上述技术方案中，将NS片段525-530位的6个碱基CCAGGA同义突变为CCCGGG从而破坏了NS片段上剪接受体位点，使NS无法自然发生可变剪接。

在本发明的第四方面，提供了一种II型单纯疱疹病毒蛋白，所述II型单纯疱疹病毒蛋白为串联D蛋白中高度保守区36aa-82aa和146aa-187aa之间用AAYlinker连接子连接而得，编码所述II型单纯疱疹病毒蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

所述的II型单纯疱疹病毒蛋白编码基因来自D蛋白的优势抗原表位，其蛋白序列为(36-82)以及(146-187)，具体序列为：MADPNRFRGKNLPVLDRLTDPPGVKRVYHIQPSLEDPFQPPSIPITV以及NKSLGVCPIRTQPRWSYYDSFSAVSEDNLGFLMHAPAFETAG，两段序列间用AAY连接。

所述表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒可以利用鸡胚作为生物反应器生产II型单纯疱疹病毒蛋白。上述重组病毒可以在9-11日龄鸡胚、MDCK、Vero、A549细胞中稳定传代。

在本发明的第五方面，提供了一种编码所述II型单纯疱疹病毒蛋白的核酸分子，所述核酸分子的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

在本发明的第六方面，提供了一种表达载体，包含有所述的核酸分子。

进一步地，所述表达载体包括原核表达载体和病毒载体中的一种。

在本发明的第七方面，提供了一种包含所述表达载体的细胞系或重组菌，所述细胞系包括MDCK、A549和VERO细胞系中的一种。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

1、本发明提供的一种表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株及其制备方法与应用，首次以流感病毒为载体表达II型单纯疱疹病毒蛋白，目前国内外还无相关文献报道。开创了II型单纯疱疹病毒疫苗的先河；

2、本发明在流感病毒中NS片段中插入外源片段造成流感病毒感染性和毒性减弱，可用作减毒流感病毒疫苗的研发；

3、本发明中表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒接种人体后可同时产生针对流感病毒和II型单纯疱疹病毒的抗体，具有双重疫苗的作用；

4、本发明中的表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒可用于II型单纯疱疹病毒蛋白的大规模生产纯化与功能研究，亦可用作HSV-2亚单位疫苗或蛋白疫苗的研发；本发明中表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒可以采用喷雾形式经鼻腔口腔途径免疫，与传统疫苗接种方式相比更为方便快捷；

5、本发明所述表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒可以用作(1)II型单纯疱疹病毒疫苗的制备；(2)II型单纯疱疹病毒蛋白的功能研究；(3)利用鸡胚作为生物反应器生产II型单纯疱疹病毒蛋白。

本发明的表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株的保藏日期为2021年5月25日，保藏编号为CCTCC NO:V202148。其分类命名为重组甲型流感病毒IAV-gD2，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为A型流感病毒基因组示意图；

图2所示为A型流感病毒基因组中NS发生可变剪接产生NS1和NEP；

图3所示将II型单纯疱疹病毒蛋白编码基因插入至NS1和NEP之间，且用2A短肽linker连接；SD为剪接供体位点，SA为剪接受体位点；

图4为表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒和野生型流感病毒感染MDCK后，提取细胞RNA逆转录PCR检测流感病毒NP的琼脂糖电泳图；

图5为表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒和野生型流感病毒感染MDCK后，提取细胞RNA逆转录PCR检测流感病毒NS的琼脂糖电泳图；

图6为表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒在MDCK细胞中连续传代十次，提取细胞RNA逆转录PCR检测流感病毒NP的琼脂糖电泳图；

图7为表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒在MDCK细胞中连续传代十次，提取细胞RNA逆转录PCR检测流感病毒NS的琼脂糖电泳图；

图8为表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒在MDCK细胞中连续传代十次，提取细胞RNA逆转录PCR检测II型单纯疱疹病毒蛋白编码基因的琼脂糖电泳图；

图9为不同滴度的表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒免疫小鼠后，取小鼠脾脏，分细胞，以灭活的HSV-2刺激，提取细胞RNA，RT-qPCR测定细胞因子图；

图10为II型单纯疱疹病毒感染小鼠后未死亡的小鼠出现的病变；

图11为不同滴度的表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒免疫小鼠后，再用HSV-2感染小鼠，小鼠体重变化图；

图12为不同滴度的表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒免疫小鼠后，再用HSV-2感染小鼠，小鼠死亡和病变情况图；

图13为不同滴度的表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒免疫小鼠后，再用HSV-2感染小鼠，取脑部组织，提取RNA，RT-qPCR检测HSV-2病毒载量。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

下面将结合实施例及实验数据对本申请的效果进行详细说明。如无特殊提及，以下方案中提到的分子克隆方法、蛋白表达纯化方法、细胞培养方法及各种检测方法等均为传统实验方法，可通过查询文献获得；用到的相关试剂可从对应试剂商处购买获得。

实施例1、重组NS片段的构建

1、利用常规分子生物学手段对NS片段中RNA剪接位点进行同义点突变，525-CCAGGA-530突变为525-CCCGGG-530。在构建重组质粒的时候，将NS片段525-530位的6个碱基CCAGGA同义突变为CCCGGG从而破坏了NS片段上剪接受体位点，使NS无法自然发生可变剪接。将NS构建在PHW2000载体上，然后需对NS片段中RNA剪接位点进行同义突变，525-CCAGGA-530突变为525-CCCGGG-530。以克隆手段或者直接合成突变后NS的策略进行突变，克隆设计两段引物通过同源重组酶同源重组即可。

2、II型单纯疱疹病毒蛋白基因由基因合成手段合成获得，氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。

3、将突变后的NS片段根据NS1和NEP的开放阅读框通过自剪接多肽与外源II型单纯疱疹病毒蛋白基因连接得到重组NS片段，如图4所示，获得5’-3’方向分别为NS1、T2Alinker、II型单纯疱疹病毒基因、P2Alinker、NEP的重组NS质粒；

具体步骤为：

(1)将NS连同PHW2000克隆下来，呈线性，引物为：

NEP-F：agaaccctggacctatggatccaaaca(如SEQ ID NO：2所示)；

NS1-R：gtgtttggatccataggtccagggttctcct(如SEQ ID NO：3所示)；

退火温度为58℃，延伸50s，跑胶，进行胶回收。

(2)将T2Alinker、II型单纯疱疹病毒基因、P2Alinker(整个片段均采用基因合成手段合成)克隆下来。引物为：

T2A-F：taggtcagaagttgagggcagaggaagtcttct(如SEQ ID NO：4所示)；

P2A-R：gtgtttggatccataggtccagggttctcct(如SEQ ID NO：5所示)；

退火温度为58℃，延伸10s，跑胶，进行胶回收。

(3)将两个回收片段用同源重组酶进行同源重组，转化，提质粒。

4、构建好的重组质粒经测序鉴定，片段大小与预期完全一致，并且无基因突变。

实施例2、重组流感病毒的拯救

将流感病毒的其余七个质粒联合NS重组质粒，共转染至293T细胞中，6h后换成无血清培养基，在37℃，5％CO₂环境下，培养48h，收集上清。除去细胞碎片，吸附感染MDCK1h，然后换成无血清培养基，加入TPCK胰酶至终浓度1ug/ml。24h后收样提取细胞RNA，RT-PCR，琼脂糖凝胶电泳检测NP和NS，结果如图4、5所示。最后获得表达II型单纯疱疹病毒蛋白的流感病毒疫苗株。

实施例3、噬斑纯化及鉴定

将状态良好的MDCK细胞消化收集下来，铺至6孔细胞板中，在37℃，5％CO₂环境中培养，等细胞密度达到100％后，去培养基，用PBS洗一遍，对收集的重组流感病毒上清用PBS或者无血清培养基进行适当稀释，设置梯度。每个孔加入400ul病毒稀释液，吸附感染1h，再用PBS清洗一遍。将事先保温在37℃的2×DMEM培养基与融化好并保温在55℃的1％低熔点琼脂1：1混合，加入TPCK胰酶至终浓度1ug/ml，摇匀，每孔加入2ml混合物，待其冷却凝固后转移至37℃培养箱中培养，第二天后开始观察空斑生长情况。待空斑长出来，用枪头挑斑，同样以吸附感染的方式感染新的MDCK细胞，24-48h后提取细胞RNA，RT-PCR检测NP，NS和外源片段。

实施例4、十代稳定遗传

将纯化后的重组流感病毒在MDCK细胞中连续传代十次，而后收集每代细胞的样，提取RNA，用通用引物和随机引物做引物进行逆转录，将cDNA进行特异性片段PCR，分别检测重组流感病毒的NP，NS以及外源片段，结果如图6、7、8所示。

由图6-图8可知，本发明实施例的重组病毒包装成功。

实施例5、重组流感病毒在小鼠体内引起的免疫应答

6周龄SPF级BALB/c小鼠分为四组：一个空白对照，三个实验组。空白组滴鼻PBS，实验组分别用三个滴度的重组流感病毒免疫小鼠，三周后加强免疫一次，两周后取小鼠脾脏，用尼龙布分出其中的淋巴细胞，除去其中的红细胞，转移至6孔细胞板中。将事先灭活的HSV-2加入至细胞板中刺激淋巴细胞，在37℃，5％CO₂环境下培养12h，去上清，加入适量的RNAiso Plus裂解细胞，提取细胞RNA，逆转录，以qPCR检测特定细胞因子。其结果如图9。

由图9可知，免疫组小鼠的细胞因子明显上调，尤其是IFN-γ，这是Th1细胞产生的，以及其他的Th2、Th17细胞等等产生的细胞因子，间接可推断出外源蛋白表达并刺激了小鼠产生抗体，并形成记忆细胞。

实施例6、小鼠免疫后针对HSV-2的保护实验

6周龄SPF级BALB/c小鼠分为四组，同样设一个空白组三个实验组，空白组滴鼻PBS，实验组分别用三个滴度的重组流感病毒免疫小鼠，三周后加强免疫一次，两周后对BALB/c小鼠采用3％戊巴比妥钠腹腔注射，待小鼠不挣扎后，用移液枪滴鼻致死剂量的HSV-2。

由图10可知，小鼠存在未出现死亡但有病变的现象。

连续十天观察小鼠体重变化及病变情况，如图11、12；由图11-图12可知，事先免疫过重组病毒的小鼠再次感染HSV-2时表现出更低的死亡率与病变率，相对体重变化最小。

实施例7、HSV-2攻毒后小鼠体内病毒载量测定

与实施例6相同，三个实验组与空白组免疫5周后，用致死剂量的HSV-2攻毒小鼠，两周后取出现病变的小鼠(若所有小鼠均未出现病变则随即取一只)的脑部组织，加入Trizol裂解，提取组织RNA，逆转录，再进行qPCR测定脑部组织中的HSV-2载量，如图13。其中，逆转录qPCR所用到的引物具体为：

HSV-2-F：GCTCGAGTGCGAAAAAACGTTC(如SEQ ID NO：6所示)

HSV-2-R；TGCGGTTGATAAACGCGCAGT(如SEQ ID NO：7所示)

由图13可知，事先接种过重组流感病毒的小鼠脑部的HSV-2病毒载量明显低于空白组，且接种重组流感病毒的滴度越高，抑制HSV-2在脑部复制的效果越好。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 一种表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株及其制备方法与应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 92

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asn Leu Pro Val Leu Asp

1 5 10 15

Arg Leu Thr Asp Pro Pro Gly Val Lys Arg Val Tyr His Ile Gln Pro

20 25 30

Ser Leu Glu Asp Pro Phe Gln Pro Pro Ser Ile Pro Ile Thr Val Ala

35 40 45

Ala Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Val Cys Pro Ile Arg Thr Gln Pro Arg

50 55 60

Trp Ser Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val Ser Glu Asp Asn Leu Gly

65 70 75 80

Phe Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr Ala Gly

85 90

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agaaccctgg acctatggat ccaaaca 27

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtgtttggat ccataggtcc agggttctcc t 31

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taggtcagaa gttgagggca gaggaagtct tct 33

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtgtttggat ccataggtcc agggttctcc t 31

Claims (9)

1.一种表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株，其特征在于，

所述重组流感病毒株为表达II型单纯疱疹病毒蛋白的流感病毒载体通过反向遗传系统在细胞中拯救出的表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒；

编码所述II型单纯疱疹病毒蛋白的基因位于改造过的甲型流感病毒NS片段的开放阅读框内；编码所述II型单纯疱疹病毒蛋白的核心抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述改造过的甲型流感病毒NS片段的剪接位点进行了同义突变：将525-CCAGGA-530 突变为525-CCCGGG-530；

所述II型单纯疱疹病毒蛋白的基因片段的5’端通过T2A连接子与甲型流感病毒NS1片段3端’连接；II型单纯疱疹病毒蛋白的基因片段的3’端通过P2A连接子与甲型流感病毒NEP片段5’端连接；

所述流感病毒载体为A型流感病毒A/WSN/33，所述表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株的保藏编号为CCTCC NO: V202148。

2.权利要求1所述的表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株在制备II型单纯疱疹病毒疫苗中的应用。

3.权利要求1所述的表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株在利用鸡胚或细胞作为生物反应器生产II型单纯疱疹病毒蛋白中的应用。

4.一种II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述的表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株。

5.一种表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

将甲型流感病毒WSN中NS片段的剪接位点进行同义突变，将525-CCAGGA-530 突变为525-CCCGGG-530；

获得氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示II型单纯疱疹病毒蛋白的串联基因；

将所述串联基因通过Linker连接于甲型流感病毒NS1片段和甲型流感病毒NEP片段之间，获得5’-3’方向分别为NS1、T2Alinker、II型单纯疱疹病毒基因、P2Alinker、NEP的重组NS质粒；

将所述重组NS质粒和WSN的其他七个质粒共转染宿主细胞，获得表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株。

6.一种II型单纯疱疹病毒蛋白，其特征在于，所述II型单纯疱疹病毒蛋白为串联D蛋白中的高度保守区36aa-82aa和146aa-187aa之间用AAYlinker连接而得，编码所述II型单纯疱疹病毒蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

7.一种编码权利要求6所述II型单纯疱疹病毒蛋白的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

8.一种表达载体，其特征在于，包含有权利要求7所述的核酸分子。

9.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料为包含权利要求8所述表达载体的细胞系或重组菌，所述细胞系包括MDCK、A549和VERO细胞系中的一种。

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