CN114316009B

CN114316009B - 一种能够结合多种病毒的蛋白及其应用

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Publication number: CN114316009B
Application number: CN202011048565.9A
Authority: CN
Inventors: 王大鹏; 刘丹蕾; 张子蕾
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2020-09-29
Filing date: 2020-09-29
Publication date: 2023-04-25
Anticipated expiration: 2040-09-29
Also published as: CN114316009A; WO2022067879A1

Abstract

本发明提供了一种通过化学途径或基因工程合成的蛋白，其特征在于，所述蛋白具有能够与可引起腹泻的病毒的衣壳蛋白结合的功能性结构域，其中所述可引起腹泻的病毒包括杯状病毒和/或呼肠孤病毒；并且所述蛋白的氨基酸序列如以下(a)或(b)所述：(a)如序列表SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或(b)具有在(a)所述氨基酸序列中替换、缺失、和/或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列。本发明的蛋白具有易于生产、成本低、安全、环保、高效并且广谱的优点。

Description

一种能够结合多种病毒的蛋白及其应用

技术领域

本申请属于生物技术领域，具体涉及一种能够结合多种病毒的蛋白及其应用。

背景技术

病毒与宿主细胞结合是病毒入侵细胞或感染宿主的关键步骤。如何降低病毒与宿主细胞的结合率成为治疗病毒感染的一个重要途径。因此，大量制备可以与病毒结合的特异性分子成为阻断病毒(再)感染宿主的关键。另外，这种特异性分子还可用于目标病毒的捕获和浓缩。

以人源诺如病毒(Human noroviruses，HuNoVs)为例，近年，虽然有研究团队报道利用B细胞、HIE细胞以及斑马鱼陆续开展HuNoVs体外培养的研究工作，但是，所述细胞系和动物模型能够获得的病毒滴度较低且仅可培养几种特定基因型HuNoVs。迄今，已有报道称：HuNoVs至少有40种不同基因型，且因病毒体外增殖体系不成熟，以致无法真正开展病毒的生物学研究，以及病毒与宿主互作的相关研究工作，严重阻碍了治疗病毒感染药物和疫苗的研制等。那么，探寻可以与多种基因型HuNoVs结合的物质，阻断病毒与宿主细胞的结合成为降低病毒感染突破口。另外，食品或水体中HuNoVs的滴度较低，病毒检测依赖于分子检测方法且需进行病毒富集。但是，目前利用病毒抗体或非特异性的化学方法开展病毒富集，富集效率低且容易引入PCR抑制剂。探寻可广谱性结合HuNoVs的物质成为解决该技术瓶颈问题的关键。

现有技术中可以与病毒结合的特异性分子通常存在以下缺点：生产周期长、成本高；与病毒结合的能力差、应用范围窄；环境污染大；对实验动物依赖性强；安全性差。因此，仍然迫切需要一种易于生产、成本低、安全、环保、高效并且广谱的产品。

发明内容

为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了通过化学途径或基因工程合成的蛋白，用于检测可引起腹泻的病毒的复合材料、装置和方法，用于富集可引起腹泻的病毒的复合材料和方法，用于预防和/或治疗可引起腹泻的病毒感染的药物组合物，分离的、编码所述蛋白的DNA，表达载体，宿主细胞。

具体而言，本发明提供了：

(1)一种通过化学途径或基因工程合成的蛋白，其特征在于，所述蛋白具有能够与可引起腹泻的病毒的衣壳蛋白结合的功能性结构域，其中所述可引起腹泻的病毒包括杯状病毒和/或呼肠孤病毒；并且所述蛋白的氨基酸序列如以下(a)或(b)所述：

(a)如序列表SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或

(b)具有在(a)所述氨基酸序列中替换、缺失、和/或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列。

(2)根据(1)所述的蛋白，其中所述的(b)具有与(a)所述氨基酸序列至少80.0％、优选至少90.0％、至少95.0％、至少99.0％、至少99.5％、至少99.7％、更优选至少99.9％的一致性。

(3)根据(1)所述的蛋白，其中：

所述杯状病毒选自诺如病毒；所述诺如病毒包括GI-GX组；优选地，所述诺如病毒选自GI、GII、GIV、GVIII和/或GIX组；还优选地，所述诺如病毒选自GI和/或GII组；并且/或者

所述呼肠孤病毒选自轮状病毒；所述轮状病毒包括A-H组；优选地，所述轮状病毒选自A组轮状病毒；还优选地，所述轮状病毒选自A组G1P[8]和/或G9P[8]型。

(4)一种用于检测可引起腹泻的病毒的复合材料，其包含根据(1)-(3)中任一项所述的蛋白，其中所述蛋白结合至选自固相支持物和标记物中的至少一种。

(5)一种用于检测可引起腹泻的病毒的装置，其包含根据(4)所述的复合材料。

(6)一种检测可引起腹泻的病毒的方法，其中，该方法包括：

步骤A1，将待测样品与根据(4)所述的复合材料接触；以及

步骤A2，将经所述接触得到的复合材料针对所述可引起腹泻的病毒进行检测。

(7)一种用于富集可引起腹泻的病毒的复合材料，其包含根据(1)-(3)中任一项所述的蛋白，其中所述蛋白结合至固相支持物。

(8)一种富集可引起腹泻的病毒的方法，其中，该方法包括：

步骤B1，将含有所述可引起腹泻的病毒的待富集样品与根据(7)所述的复合材料接触；以及

步骤B2，将所述可引起腹泻的病毒从经所述接触得到的复合材料上洗脱，并进行收集。

(9)一种用于预防和/或治疗可引起腹泻的病毒感染的药物组合物，其包含：根据(1)-(3)中任一项所述的蛋白；以及可药用的辅料。

(10)根据(1)-(3)中任一项所述的蛋白在制备用于预防和/或治疗可引起腹泻的病毒感染的药物中的用途。

(11)一种分离的、编码根据(1)-(3)中任一项所述的蛋白的DNA。

(12)根据(11)所述的DNA，所述DNA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。

(13)一种表达载体，其含有与启动子有效连接的根据(11)或(12)所述的DNA。

(14)一种用于表达的宿主细胞，其含有(13)所述的表达载体；优选地，所述宿主细胞选自酵母细胞或大肠杆菌细胞。

本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

本发明通过人工合成核苷酸片段获得外源表达目标蛋白，并开展病毒结合介质的筛选，提高了安全性和靶向性。根据上述研究结果，本发明以从牡蛎组织中获得的可特异性结合可引起腹泻的病毒(例如诺如病毒)的主要衣壳蛋白的吸附配体为依据，人工合成核酸序列，利用分子克隆手段进行原核表达，能够缩短生产周期，降低生产成本，降低环境污染的风险。并且本发明采用微生物发酵法制备蛋白，不涉及动物伦理。

本发明的蛋白可以结合不同基因型病毒颗粒或多种病毒颗粒，形成复合物，增加复合物中病毒颗粒与宿主细胞受体结合的难度，从而降低病毒入侵宿主细胞的概率，进而能够用于预防或治疗病毒感染。另外，该蛋白可以识别并结合不同基因型病毒颗粒或多种病毒颗粒。基于此，以该蛋白为介质，能够建立不同病毒颗粒的富集体系，提高病毒颗粒的检出效率。

因此，本发明的蛋白具有易于生产、成本低、安全、环保、高效并且广谱的优点。

附图说明

图1示出制备例1中得到的重组蛋白的SDS-PAGE分析结果。

图2示出实施例1中重组蛋白与不同基因型诺如病毒颗粒的结合效率评价结果(蛋白质水平)。

图3示出实施例1中重组蛋白与不同基因型诺如病毒颗粒的结合效率评价结果(核酸水平)。

图4示出实施例2中重组蛋白与不同基因型轮状病毒颗粒的结合效率评价结果(核酸水平)。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

诺如病毒(Norovirus，简称NV)，曾称诺瓦克病毒(Norwalk Viruses)，是人类杯状病毒科(Human Calicivirus,HuCV)中诺如病毒属的一种病毒。诺如病毒为无包膜单股正链RNA病毒，病毒粒子直径约27-40nm，基因组全长约7.5-7.7kb。病毒衣壳由180个主要结构蛋白(VP1)和几个次要结构蛋白(VP2)分子构成。人源诺如病毒(human noroviruses，HuNoVs)目前体外培养体系不成熟，无法进行血清型分型鉴定。根据基因特征，诺如病毒被分为10个基因组(Genogroup，GI-GX)，GI和GII是引起人类急性胃肠炎的两个主要基因组，GIV、GIIIV和GIX也可感染人，但很少被检出。

轮状病毒(Rotavirus，简称RV)是一种双链RNA病毒，属于呼肠孤病毒科。它是婴幼儿腹泻的主因，几乎世界上五岁以下的婴幼儿都曾感染过轮状病毒。目前，轮状病毒共有8种基因组，分别以英文字母编号为A-H。A、B与C组轮状病毒主要感染人类，其中最常见的轮状病毒感染是A组毒株引起的。

在A组轮状病毒中有不同的病毒株，称之为血清变异株(serovar)。轮状病毒使用了双重的分类系统，这样分类法是依据这个病毒体表面的两个结构性蛋白质来作分类的。糖蛋白VP7定义了G型，而对于蛋白酶敏感的蛋白质VP4则定义了P型。P型跟一个数字来标示出P血清型，并用方括号内部的一个数字来标示所对应的P基因型。G血清型的表示方法很类似，但是G基因型的数字会与G血清型的数字相同。

轮状病毒颗粒直径大约70nm，且无包膜(Viral envelope)。由多个病毒结构蛋白(viral protein，VP)组成了整个病毒颗粒(病毒体)。其中VP4蛋白质位于病毒体的表面形成刺突(spike)，可与细胞表面的受体分子结合并协助病毒进入宿主细胞。VP7蛋白质是病毒外层表面的糖蛋白。VP7蛋白质跟VP4蛋白质一样，都可被用作阻断感染的靶标。

为了克服现有技术中存在的问题，本申请的发明人通过建立细菌细胞表面展示系统来构建约百倍放大的升级版假HuNoVs；以该假病毒为诱饵，从食品中成功分离到一种可以结合HuNoVs的蛋白质。令人惊奇的是，这种蛋白质可以结合不同病毒颗粒(包括不同基因型诺如病毒和不同基因型轮状病毒)，且其结合能力远大于目前公认的诺如病毒和轮状病毒的(辅助)受体(血组织抗原，histo-blood group antigens，HBGAs)。该蛋白为病毒感染(包括：单一基因型诺如病毒的感染，单一基因型轮状病毒的感染，不同基因型诺如病毒的混合感染，不同基因型轮状病毒的混合感染，诺如病毒和轮状病毒混合感染，等)的治疗，不同病毒颗粒的富集等提供了极具前景的候选材料。

具体而言，本发明提供了一种通过化学途径或基因工程合成的蛋白，其特征在于，所述蛋白具有能够与可引起腹泻的病毒的衣壳蛋白结合的功能性结构域，其中所述可引起腹泻的病毒包括杯状病毒和/或呼肠孤病毒；并且所述蛋白的氨基酸序列如以下(a)或(b)所述：

(a)如序列表SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或

在本发明的一个实施方案中，本发明的蛋白具有能够与所述可引起腹泻的病毒(例如杯状病毒或呼肠孤病毒)的衣壳蛋白结合的功能性结构域，是指本发明的蛋白能够与所述可引起腹泻的病毒(例如杯状病毒或呼肠孤病毒)的衣壳蛋白结合，并能够形成复合物，增加复合物中病毒颗粒与宿主细胞受体结合的难度，从而降低病毒入侵细胞的概率。所述细胞包括(例如)：哺乳动物细胞，例如人类细胞系。

在本发明的一个实施方案中，本发明的蛋白具有能够与所述可引起腹泻的病毒(例如杯状病毒(例如诺如病毒)或呼肠孤病毒(例如轮状病毒))的衣壳蛋白结合的功能性结构域，并且/或者具有抑制或阻断所述可引起腹泻的病毒感染的活性。其中，当杯状病毒为诺如病毒时，其主要衣壳蛋白包括VP1；当呼肠孤病毒为轮状病毒时，其主要衣壳蛋白包括VP4。

在本发明的一个实施方案中，所述蛋白的氨基酸序列可以是在如序列表SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列中替换、缺失、和/或添加一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个…)氨基酸而得到的氨基酸序列，只要不显著影响所述蛋白与杯状病毒或呼肠孤病毒的衣壳蛋白的结合能力，或不显著影响抑制或阻断所述杯状病毒或呼肠孤病毒感染的活性即可。

在本发明的一个实施方案中，所述蛋白的氨基酸序列具有与(a)所述氨基酸序列至少80.0％、优选至少90.0％、至少95.0％、至少99.0％、至少99.5％、至少99.7％、更优选至少99.9％的一致性。

优选的是，本发明所述的蛋白来源于牡蛎组织。优选的是，本发明的蛋白是通过基因工程获得的(如重组蛋白)或者是通过化学合成方法获得的。

在本发明的一个实施方案中，所述杯状病毒选自诺如病毒；所述诺如病毒包括GI-GX组(10种)；优选地，所述诺如病毒选自GI、GII、GIV、GVIII和/或GIX组；还优选地，所述诺如病毒选自GI和/或GII组；还优选地，所述GI组诺如病毒选自GI.1、GI.2、GI.3、GI.4和/或GI.5型；还优选地，所述GII组诺如病毒选自GII.2、GII.3、GII.4、GII.6、GII.12和/或GII.17型。在本发明的一个实施方案中，所述呼肠孤病毒选自轮状病毒；所述轮状病毒包括A-H组(8种)；优选地，所述轮状病毒选自A组流行毒株；还优选地，所述A组轮状病毒选自G1P[8]和/或G9P[8]型。

本发明还提供了一种用于检测可引起腹泻的病毒(例如杯状病毒或呼肠孤病毒)的复合材料，其包含本发明的蛋白，其中所述蛋白结合至选自固相支持物和标记物中的至少一种。

在本发明的一个实施方案中，用于检测的固相支持物可以是不溶于检测反应体系所用溶剂的支持物。固相支持物的形状包括但不限于：平板、珠、盘、管、滤器和膜。固相支持物的材料包括但不限于：聚合物，如聚对苯二甲酸乙二酯、醋酸纤维素、聚碳酸酯、聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸甲酯；金属，如金、银或铝；或玻璃。可以使用本领域已知的方法如物理吸附法、共价结合法、离子键合法或交联法作为使本发明的蛋白结合于固相支持物的方法。所述标记物包括但不限于：荧光物质、发光物质、染料、酶或放射性物质。可以使用本领域已知的方法如物理吸附法、共价结合法、离子键合法或交联法作为使本发明的蛋白结合于标记物的方法。

本发明还提供了一种用于检测可引起腹泻的病毒(例如杯状病毒或呼肠孤病毒)的装置，其包含本发明所述的用于检测的复合材料。

本发明还提供了一种检测可引起腹泻的病毒(例如杯状病毒或呼肠孤病毒)的方法，其中，该方法包括：

步骤A1，将待测样品与本发明所述的用于检测的复合材料接触；以及

步骤A2，将经所述接触得到的复合材料针对可引起腹泻的病毒进行检测。

在本发明的一个实施方案中，为检测可引起腹泻的病毒，可以使待测样品与本发明所述的用于检测的复合材料接触。随后，基于待测样品中含有的病毒与该复合材料中所含本发明的蛋白的反应，检测其物理量的变化。物理量的例子可以是发光强度、色度、透光性、浊度、吸光度和辐射剂量等。可以使用本领域已知的方法如酶免疫测定法、免疫色谱法、胶乳凝集反应法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法或表面等离子体共振光谱法等作为检测方法的具体例子。

本发明还提供了一种用于富集可引起腹泻的病毒(例如杯状病毒或呼肠孤病毒)的复合材料，其包含本发明的蛋白，其中所述蛋白结合至固相支持物。

在本发明的一个实施方案中，用于富集的固相支持物可以是不溶于富集体系所用溶剂的支持物。固相支持物的形状包括但不限于：平板、珠、盘、管、滤器和膜。固相支持物的材料包括但不限于：聚合物，如聚对苯二甲酸乙二酯、醋酸纤维素、聚碳酸酯、聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸甲酯；金属，如金、银或铝；或玻璃。可以使用本领域已知的方法如物理吸附法、共价结合法、离子键合法或交联法作为使本发明的蛋白结合于固相支持物的方法。

本发明还提供了一种富集可引起腹泻的病毒(例如杯状病毒或呼肠孤病毒)的方法，其中，该方法包括：

步骤B1，将含有所述可引起腹泻的病毒的待富集样品与本发明所述的用于富集的复合材料接触；以及

本发明还提供了一种用于预防和/或治疗可引起腹泻的病毒(例如杯状病毒或呼肠孤病毒)感染的药物组合物，其包含：本发明的蛋白；以及可药用的辅料。

优选地，所述药物组合物包含治疗有效量的本发明的蛋白。

可用于本发明中的可药用的辅料为本领域通常所用的那些。可以根据实际应用的需要或所采用的具体剂型来选择合适的辅料，例如可以为参考文献“厉保秋主编，《多肽药物研究与开发》，第四章‘多肽药物制剂研究’，第82-100页，人民卫生出版社，2011年7月”中披露的那些。可药用的辅料以其常规用量用于本发明的组合物中，本领域技术人员可以根据实际应用的需要来确定合适的用量。

本发明还提供了一种本发明的蛋白在制备用于预防和/或治疗杯状病毒或呼肠孤病毒感染的药物中的用途。

本发明还提供了一种分离的、编码本发明的蛋白的DNA。

在本发明的一个实施方案中，所述DNA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了一种表达载体，其含有与启动子有效连接的本发明的DNA。

本发明还提供了一种用于表达的宿主细胞，其含有本发明的表达载体；优选地，所述宿主细胞选自酵母细胞(例如毕赤酵母细胞)或大肠杆菌细胞(例如BL21(DE3)细胞)。

本发明的一个实施方案中包括：

1、人工合成一段核苷酸序列(其中包含如序列表SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列)，构建原核重组表达载体，并进行重组蛋白的表达。

2、利用Ni柱进行目标蛋白的纯化。

然后可以以所得到的重组蛋白包被酶标板，对不同种病毒的吸附能力进行评估。

也可以以所得到的重组蛋白捕获的相关病毒颗粒为对象，以热裂解的病毒核酸为模板，进行RT-qPCR检测，评估蛋白对不同种病毒的吸附能力。

也可以以所得到的重组蛋白为吸附配体捕获相关病毒颗粒，提高病毒滴度，便于病毒检测。

也可以以不同浓度的所得到的重组蛋白与病毒(例如GII.4型诺如病毒)临床样本进行孵育，将孵育后的混合物感染人源细胞(例如HIE细胞系)，以评估重组蛋白降低病毒(例如GII.4型诺如病毒颗粒)感染人源细胞(例如HIE细胞系)的效率。

以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明的内容，但这些例子不应被理解为对本发明的保护范围的限制。

例子

除非特别说明，否则以下例子中所用实验方法均使用生物工程领域的常规实验流程、操作、材料和条件进行。除非特别说明，同样的材料来源相同。以下除非特别说明，否则各试剂的百分浓度(％)均指该试剂的体积百分浓度(％(v/v))。

制备例1：重组蛋白的获得

A.重组菌的构建与验证：

参照从牡蛎组织筛选得到蛋白的核酸编码序列，根据原核表达系统进行核苷酸优化后，委托生工生物工程(上海)股份有限公司人工合成一段1845bp的核苷酸片段(即，如序列表SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列)；为了便于后续基因工程操作，在上述核酸片段两端分别添加了Nco I和Xho I限制性酶切位点，共计1853bp，得到如序列表SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。1853bp目标片段嵌入pUC57克隆载体(可得自生工生物工程(上海)股份有限公司)；利用Nco I限制性内切酶(可得自ThermoFisher，FD0596)和Xho I限制性内切酶(可得自ThermoFisher，FD0695)进行消化处理，重组表达载体pET-28a(可得自上海翊圣生物科技有限公司，11905ES03)做同样处理，构建原核重组表达质粒(其中通过pET-28a使重组蛋白携带His-tag)。经琼脂糖凝胶电泳后，利用DNA回收试剂盒(可得自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，DC301)回收目标片段；在DNA连接酶(可得自ThermoFisher，EL0014)的作用下，将两条目标片段进行连接，构建相应连接产物。将连接产物转化感受态细胞(克隆宿主，大肠杆菌DH5α(可得自Takara，9057))，涂布含Kan(100μg/mL)的固体平板(可得自生工生物工程(上海)股份有限公司，A507003)，37℃过夜培养。次日，从平板上挑取重组菌单克隆于5mL含有Kan(100μg/mL)的液体LB培养基(可得自青岛海博生物，HB0128)中，37℃震荡培养8-10小时。将重组菌送上海桑尼生物科技有限公司测序。

B.重组蛋白诱导表达：

提取测序正确重组菌的质粒，转化感受态细胞(表达宿主，大肠杆菌BL21(DE3)(可得自生工生物工程(上海)股份有限公司，B528414))，涂布含有Kan(100μg/mL)的固体LB平板，37℃过夜培养。次日，从平板上挑取重组菌单克隆于5mL含有Kan(100μg/mL)的液体LB培养基中，37℃震荡培养8-10小时。以1:100的比例转接至400mL含有Kan(100μg/mL)的液体LB培养基中，37℃培养至OD600为0.6左右，加入终浓度为0.5mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(可得自Takara，9030)于37℃诱导3小时。取样作为“诱导菌液”用于后续10％SDS-PAGE电泳针对重组蛋白进行的检测。

重新从平板上挑取可以表达目的蛋白的重组菌单克隆于5mL含有Kan(100μg/mL)的液体LB培养基中，37℃培养过夜。次日，以1:100的比例转接至400ml含有Kan(100μg/mL)的液体LB培养基中，37℃培养至OD600为0.6左右，加入终浓度为0.5mM的IPTG于25℃诱导20小时。

C.重组蛋白纯化：

1、5000×g离心培养液5min，收集诱导后菌体。

2、向收集的菌体中加入至少3倍体积的超声缓冲液(50mM NaH2PO4(可得自上海沪试)，300mM NaCl(可得自上海沪试)，10mM咪唑(可得自生工生物工程(上海)股份有限公司)，并加入终浓度为1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)(可得自上海碧云天生物技术有限公司，ST505)，1mg/mL溶菌酶(可得自上海碧云天生物技术有限公司，ST206)，混匀后置于冰上30min。

3、冰上用超声破碎仪(可得自宁波新芝，SCIENT2-IID)破碎，直到菌液澄清。

4、超声后的菌液10000×g离心5min，收集上清(取样作为“破碎上清”样品)，并以0.45μm膜(可得自天津市津腾实验设备有限公司)过滤；滤液置于4℃备用。

5、Ni柱(可得自常州天地人和生物科技有限公司)先使用超声缓冲液以1ml/min速度活化5个柱体积。

6、以0.5mL/min速率，将经过滤的菌液加入活化后的Ni柱(将此时直接流出的液体取样作为“流穿液”样品)。

7、以0.5mL/min速率，以3个柱体积超声缓冲液清洗Ni柱。

8、以1ml/min速率用，以5倍柱体积的洗涤液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM咪唑)洗除Ni柱上残留的杂蛋白(将洗到最后时流出的液体取样作为“洗涤液”样品)。

9、以1ml/min速率，以5倍柱体积的洗脱液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，100mM咪唑)将Ni柱上结合的目标蛋白洗脱，使用电脑核酸蛋白检测仪(可得自上海嘉鹏科技有限公司，HD300)检测洗脱过程，收集起峰段的流穿液，作为目标蛋白收集(取样作为“洗脱蛋白”样品)。

将目标蛋白进行10％(w/v)的SDS-PAGE分析。重组蛋白表达检测结果如图1所示，第一泳道为“Marker”(标准蛋白)(可得自生工生物工程(上海)股份有限公司，C610011)，第二泳道为“诱导菌液”，第三泳道为“破碎上清”，第四泳道为“流穿液”，第五泳道为“洗涤液”，第六泳道为“洗脱蛋白”。第六泳道与第三泳道相比，诱导菌液上清中的大部分杂蛋白已经被除去；与第一泳道的蛋白Marker相比，泳道中主蛋白条带大小约为70kDa(与预期的由615个氨基酸组成的蛋白质分子量相符)。由图1可知，已成功获得分子量约70KDa的目标重组蛋白。

实施例1：重组蛋白与不同基因型诺如病毒颗粒的结合能力评价

(1)酶联免疫吸附试验：

将按照制备例1的方法纯化的重组蛋白(20μg/mL)、类似蛋白(重组人热休克蛋白70(可得自北京义翘神州科技股份有限公司，11660-H07H))(20μg/mL)、猪胃粘膜提取物(pig stomach mucin,PGM,可得自Sigma，20μg/mL和1mg/mL，含人源诺如病毒公认受体)分别包被酶标板(可得自生工生物工程(上海)股份有限公司，F605031)，4℃过夜孵育。次日，包被孔以含0.05％吐温-20的Tris-HCl缓冲盐溶液(TBST，可得自生工生物工程(上海)股份有限公司，B548105)洗涤三次后，120μL/孔加入1％牛血清白蛋白(BSA，可得自上海翊圣生物科技有限公司，36101ES25)，37℃封闭1h。包被孔以TBST洗涤三次后，100μL/孔加入不同基因型诺如病毒样本(GI.1和GII.4型)(可得自北京市疾病预防控制中心)，37℃孵育1h。以TBST洗涤三次后，100μL/孔加入相应病毒衣壳蛋白的一抗(该一抗可按如下参考文献中披露的方法制备：“Mengya Niu,et al.Engineering bacterial surface displayed humannorovirus capsid proteins:A novel system to explore interaction betweennorovirus and ligands.Frontiers in Microbiology.2015,6:1448.”)，37℃孵育1h。以TBST洗涤三次后，100μL/孔加入HRP标记的羊抗鼠二抗(可得自生工生物工程(上海)股份有限公司，D110087)，37℃孵育1h。以TBST洗涤三次后，100μL/孔加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(可得自上海碧云天生物技术有限公司，P0209)，室温避光孵育10min，每孔加入50μL2.0mol/L H2SO4。酶标仪(可得自Tecan Sunrise)测定450nm吸光度。结果如图2所示，最上图例表示颜色越深包被物与病毒颗粒结合的能力越强；第一行是GI.1型诺如病毒(图中示出为“HuNoV(GI.1)”)与不同包被物结合能力的差异，第二行是GII.4型诺如病毒(图中示出为“HuNoV(GII.4)”)与不同包被物结合能力的差异；第一纵列为本发明的重组蛋白(20μg/mL)包被的酶标板与不同基因型诺如病毒结合能力的评价，第二纵列为与本发明的重组蛋白相似的人源类似蛋白(20μg/mL)包被酶标板与不同基因型诺如病毒结合能力的评价，第三列为PGM(20μg/mL，含诺如病毒受体)包被酶标板与不同基因型诺如病毒结合能力的评价，第四列为PGM(1mg/mL，含诺如病毒受体)包被酶标板与不同基因型诺如病毒结合能力的评价。由图2可知本发明的重组蛋白可以吸附不同基因型诺如病毒，且吸附能力显著优于类似蛋白和PGM。

(2)原位捕获RT-qPCR方法：

将按照制备例1的方法纯化的重组蛋白(20μg/mL)、PGM(1mg/mL，含人源诺如病毒公认受体)分别包被酶标板，4℃过夜孵育。次日，包被孔以TBST洗涤三次后，120μL/孔加入1％BSA，37℃封闭1h。包被孔以TBST洗涤三次后，100μL/孔加入不同基因型诺如病毒临床样本(GI.1、GI.2、GI.3、GI.4、GI.5、GII.2、GII.3、GII.4、GII.6、GII.12和GII.17型)(可得自北京市疾病预防控制中心)，37℃孵育1h。以TBS洗涤三次后，每孔分别加入10μL焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水，封口后，95℃孵育5min，4℃冷却备用。以原位捕获RT-qPCR方法(该方法可参见参考文献“Dapeng Wang and Peng Tian.Inactivation conditions for humannorovirus measured by an in situ capture-qRT-PCR method.International Journalof Food Microbiology.2014,172:76-82.”)检测上述热裂解病毒的核酸。结果如图3所示，其中横轴表示不同基因型诺如病毒临床样本，纵轴表示Ct值。黑色柱条表示以PGM捕获诺如病毒颗粒后，相应核酸的扩增信号强度(以Ct值显示)；白色柱条表示以本发明的重组蛋白捕获诺如病毒颗粒后，相应核酸的扩增信号强度(以Ct值显示)；注意：Ct值越大意味着所捕获病毒颗粒的量越少。由图3可知本发明的重组蛋白至少可以吸附11种常见基因型诺如病毒颗粒，且明显高于PGM的吸附能力。RT-qPCR结果显示：本发明的重组蛋白吸附病毒颗粒的Ct值较PGM吸附病毒低1-2个Ct值。

实施例2：重组蛋白与不同基因型轮状病毒颗粒的结合能力评价

将按照制备例1的方法纯化的重组蛋白(20μg/mL)和PGM(1mg/mL，也含可吸附轮状病毒的受体)分别包被酶标板，4℃过夜孵育。次日，包被孔以TBST洗涤三次后，120μL/孔加入1％BSA，37℃封闭1h。包被孔以TBST洗涤三次后，100μL/孔加入不同基因型轮状病毒样本(G1P[8]、G9P[8]型)(可得自北京市疾病预防控制中心)，37℃孵育1h。以TBS洗涤三次后，每孔分别加入10μL DEPC处理的水，封口后，95℃孵育5min，4℃冷却备用。以原位捕获RT-qPCR方法检测上述热裂解病毒的核酸。结果如图4所示，其中横轴表示不同基因型轮状病毒样本，纵轴表示Ct值。黑色柱条表示以PGM捕获轮状病毒颗粒后，相应核酸的扩增信号强度(以Ct值显示)；白色柱条表示以本发明的重组蛋白捕获轮状病毒颗粒后，相应核酸的扩增信号强度(以Ct值显示)；注意：Ct值越大意味着所捕获病毒颗粒的量越少。由图4可知本发明的重组蛋白至少可以吸附2种常见基因型轮状病毒颗粒，且明显高于PGM的吸附能力。RT-qPCR结果显示：重组蛋白吸附病毒颗粒的Ct值较PGM吸附病毒低3-5个Ct值。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一种能够结合多种病毒的蛋白及其应用

<130> 01335-20195PI

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 615

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

Met Ala Glu Lys Asn Pro Gln Ser Gln Thr Asp Asp Gln Lys Ser Gly

1 5 10 15

Lys Lys Thr Thr Glu Ile Pro Trp Cys Ser Pro Asn Leu Leu Val Ala

20 25 30

Ala Ile Asp Phe Gly Thr Thr Tyr Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Arg

35 40 45

Val Asp Phe Asp Asp Asp Pro Leu Arg Ile Thr Ala His Lys Trp Ser

50 55 60

Ser Gly Leu Ile Ser Glu Lys Asn Pro Thr Ser Ile Leu Phe Asp Asn

65 70 75 80

Asn Gln Lys Leu Val Ala Phe Gly Tyr Glu Ala Glu Lys Gln Phe Thr

85 90 95

Glu Leu Ser Asn Asp Asn Arg His Glu Asp Phe Tyr Tyr Phe Gln Arg

100 105 110

Phe Lys Met Gln Leu Tyr His His Asn Lys Asp Ala Lys Asn Lys Gln

115 120 125

Leu Pro Ile Asn Ser Lys Ser Met Leu Ser Asp Ile Ser Gly Lys Lys

130 135 140

Met Leu Ala Met Asp Val Phe Ser Ala Ala Ile Lys Tyr Met Lys Glu

145 150 155 160

His Leu Leu His Lys Leu Ser Glu Thr Gly Asp Thr Glu Thr Lys Lys

165 170 175

Glu Glu Ile Arg Trp Val Leu Thr Val Pro Ala Ile Trp Asn Asp Thr

180 185 190

Ala Lys Ser Phe Met Arg Glu Ser Ala Ile Lys Ala Gly Ile Arg Gly

195 200 205

Asp Cys Leu Thr Ile Ala Leu Glu Pro Glu Ala Ala Ser Met Tyr Cys

210 215 220

Lys Arg Leu Pro Ile Glu Met Leu Asn Asp Asn Leu Arg Val Gln Asn

225 230 235 240

Glu Gly Phe Gln Phe Phe Ser Gln Gly Asn Gln Tyr Leu Val Leu Asp

245 250 255

Ala Gly Gly Gly Thr Val Asp Ile Thr Val His Glu Val Leu Ser Gly

260 265 270

Asp Arg Ile Lys Glu Leu His Lys Ala Ser Gly Gly Ala Trp Gly Gly

275 280 285

Thr Tyr Val Asp Glu Asn Phe Phe Asp Ile Ile Lys Glu Ala Val Gly

290 295 300

Lys Glu Lys Phe Glu Ser Phe Lys Lys Glu Asp Leu Ala Gly Tyr Asn

305 310 315 320

Asp Leu Arg Lys Asp Leu Glu Val Lys Lys Arg Glu Ile Asn Thr Glu

325 330 335

Ser Thr Lys Ile Ser Phe Thr Ile Pro Asn Gln Leu Ala Gln Val Ile

340 345 350

Pro Lys Asp Tyr Asn Pro Glu Ile Leu Glu Cys Lys Lys Gly Lys Leu

355 360 365

Glu Leu Lys Val Pro Gly Ile Lys Lys Trp Phe Ser Glu Ile Cys Asp

370 375 380

Ser Ile Val Ser His Val Glu Glu Leu Leu Glu Glu Gln Lys Lys Lys

385 390 395 400

Gln Arg Asn Ile Glu Ser Ile Leu Met Val Gly Gly Phe Ser Glu Ser

405 410 415

Ser Tyr Leu Gln Glu Thr Val Lys Thr Ala Phe Pro Asn Lys His Ile

420 425 430

Ile Val Pro Asn Gln Ala Gly Leu Ala Val Leu Lys Gly Ala Val Leu

435 440 445

Phe Gly His Asn Pro Gln Ile Val Asp Ser Arg Val Ala Lys Val Thr

450 455 460

Tyr Gly Val Asn Thr Leu Ser Lys Ile Gln Asp Glu Arg Asp Val Pro

465 470 475 480

Asp Lys Ser Arg Ile Arg Thr Ile Asn Gly Val Lys Tyr Glu Lys Asn

485 490 495

Val Phe Ser Lys His Val Thr Lys Gly Asp Asp Leu Val Ile Gly Gln

500 505 510

Ala Gln Glu Glu Lys Thr Tyr Phe Pro Ile Tyr Pro Asp Gln Lys Ser

515 520 525

Val Gln Phe Ser Val Phe Ser Ser Gln Glu Glu Asn Pro Lys Tyr Val

530 535 540

Asp Gly Cys Lys Arg Leu Gly Ser Phe Asp Val Lys Ile Pro Tyr Thr

545 550 555 560

Thr Asp Gly Thr Asp Arg Lys Val Val Val Arg Phe Ile Phe Gly Gly

565 570 575

Thr Glu Ile Lys Phe Glu Cys Glu Asp Ala Asn Gly Glu Ile Thr Pro

580 585 590

Tyr Thr Phe Asp Trp Ser Glu Asn Ala Glu Glu Glu Cys Phe Gly Met

595 600 605

Ala Val Glu Arg Gly Glu Ser

610 615

<210> 2

<211> 1845

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

atggcggaga aaaacccgca gtcccagacc gatgatcaga aaagcggtaa gaaaaccact 60

gaaattccgt ggtgcagccc gaacctgctg gtagcggcca tcgacttcgg taccacctac 120

agcggctatg cgttttctag ccgcgttgac ttcgatgatg acccgctgcg catcaccgca 180

cataaatgga gcagcggtct gatctccgaa aagaacccga cctccatcct gttcgataac 240

aaccagaaac tggttgcgtt cggctacgaa gcggaaaaac agttcactga actgtctaac 300

gacaaccgcc atgaggactt ctattacttc cagcgcttca aaatgcagct gtaccaccat 360

aacaaagatg cgaaaaacaa acagctgccg attaacagca aaagcatgct gtccgatatt 420

agcggcaaaa agatgctggc gatggatgtt tttagcgcgg ctattaaata tatgaaagaa 480

cacctgctgc acaaactgtc cgaaaccggt gataccgaaa ccaaaaaaga agaaatccgt 540

tgggtgctga ctgtcccggc tatctggaac gacaccgcta aatccttcat gcgtgaatcc 600

gcgatcaaag cgggcatccg tggcgactgc ctgaccatcg cgctggaacc ggaagccgcc 660

agcatgtact gcaaacgtct gccgatcgaa atgctgaacg ataacctgcg tgttcagaat 720

gaaggtttcc agttcttctc tcagggcaac cagtacctgg tgctggacgc gggtggcggc 780

actgtcgata tcaccgtaca cgaggttctg agcggtgatc gcatcaaaga actgcacaaa 840

gccagcggcg gtgcctgggg tggcacctac gttgatgaga acttcttcga tatcattaaa 900

gaagccgtag gtaaggaaaa attcgaatct ttcaaaaaag aggatctggc tggttataac 960

gacctgcgta aagaccttga agttaaaaaa cgcgaaatca acaccgaatc taccaaaatc 1020

tcttttacca tcccgaacca gctggctcag gtgatcccaa aagactacaa cccggaaatc 1080

ctggaatgta aaaaaggcaa actcgaactg aaagtgccgg gcatcaaaaa atggttttcc 1140

gaaatctgcg atagcatcgt tagccatgtt gaagaactgc tcgaagaaca gaaaaagaaa 1200

cagcgcaaca tcgaaagcat cctgatggtt ggcggcttct ccgaatcttc ctacctgcag 1260

gaaaccgtga aaaccgcgtt cccgaacaaa cacatcatcg tgccgaacca ggcgggcctg 1320

gcggtgctga aaggcgccgt tctgtttggc cacaatccac agatcgttga cagccgtgtc 1380

gcaaaagtga cctatggcgt gaacaccctg tccaagattc aggacgaacg tgatgtgccg 1440

gataaatccc gtatccgtac catcaacggt gttaaatacg aaaagaacgt tttcagcaaa 1500

catgttacca aaggcgatga tctggtgatt ggccaggccc aggaagaaaa aacctacttc 1560

ccgatctacc cggatcagaa atccgttcag ttcagcgttt tcagcagcca ggaagaaaac 1620

ccgaaatacg tggacggttg taaacgcctg ggttccttcg acgttaaaat cccgtacacc 1680

actgacggca ccgatcgtaa agtggtcgtt cgcttcatct tcggcggcac cgaaatcaaa 1740

ttcgaatgtg aagatgctaa cggcgaaatc accccgtata ccttcgattg gtctgaaaac 1800

gcggaagaag aatgcttcgg catggcggtt gaacgcggcg aaagc 1845

<210> 3

<211> 1853

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ccatggcgga gaaaaacccg cagtcccaga ccgatgatca gaaaagcggt aagaaaacca 60

ctgaaattcc gtggtgcagc ccgaacctgc tggtagcggc catcgacttc ggtaccacct 120

acagcggcta tgcgttttct agccgcgttg acttcgatga tgacccgctg cgcatcaccg 180

cacataaatg gagcagcggt ctgatctccg aaaagaaccc gacctccatc ctgttcgata 240

acaaccagaa actggttgcg ttcggctacg aagcggaaaa acagttcact gaactgtcta 300

acgacaaccg ccatgaggac ttctattact tccagcgctt caaaatgcag ctgtaccacc 360

ataacaaaga tgcgaaaaac aaacagctgc cgattaacag caaaagcatg ctgtccgata 420

ttagcggcaa aaagatgctg gcgatggatg tttttagcgc ggctattaaa tatatgaaag 480

aacacctgct gcacaaactg tccgaaaccg gtgataccga aaccaaaaaa gaagaaatcc 540

gttgggtgct gactgtcccg gctatctgga acgacaccgc taaatccttc atgcgtgaat 600

ccgcgatcaa agcgggcatc cgtggcgact gcctgaccat cgcgctggaa ccggaagccg 660

ccagcatgta ctgcaaacgt ctgccgatcg aaatgctgaa cgataacctg cgtgttcaga 720

atgaaggttt ccagttcttc tctcagggca accagtacct ggtgctggac gcgggtggcg 780

gcactgtcga tatcaccgta cacgaggttc tgagcggtga tcgcatcaaa gaactgcaca 840

aagccagcgg cggtgcctgg ggtggcacct acgttgatga gaacttcttc gatatcatta 900

aagaagccgt aggtaaggaa aaattcgaat ctttcaaaaa agaggatctg gctggttata 960

acgacctgcg taaagacctt gaagttaaaa aacgcgaaat caacaccgaa tctaccaaaa 1020

tctcttttac catcccgaac cagctggctc aggtgatccc aaaagactac aacccggaaa 1080

tcctggaatg taaaaaaggc aaactcgaac tgaaagtgcc gggcatcaaa aaatggtttt 1140

ccgaaatctg cgatagcatc gttagccatg ttgaagaact gctcgaagaa cagaaaaaga 1200

aacagcgcaa catcgaaagc atcctgatgg ttggcggctt ctccgaatct tcctacctgc 1260

aggaaaccgt gaaaaccgcg ttcccgaaca aacacatcat cgtgccgaac caggcgggcc 1320

tggcggtgct gaaaggcgcc gttctgtttg gccacaatcc acagatcgtt gacagccgtg 1380

tcgcaaaagt gacctatggc gtgaacaccc tgtccaagat tcaggacgaa cgtgatgtgc 1440

cggataaatc ccgtatccgt accatcaacg gtgttaaata cgaaaagaac gttttcagca 1500

aacatgttac caaaggcgat gatctggtga ttggccaggc ccaggaagaa aaaacctact 1560

tcccgatcta cccggatcag aaatccgttc agttcagcgt tttcagcagc caggaagaaa 1620

acccgaaata cgtggacggt tgtaaacgcc tgggttcctt cgacgttaaa atcccgtaca 1680

ccactgacgg caccgatcgt aaagtggtcg ttcgcttcat cttcggcggc accgaaatca 1740

aattcgaatg tgaagatgct aacggcgaaa tcaccccgta taccttcgat tggtctgaaa 1800

acgcggaaga agaatgcttc ggcatggcgg ttgaacgcgg cgaaagcctc gag 1853

Claims

1.一种通过化学途径或基因工程合成的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO: 1所示。

2.一种用于检测可引起腹泻的病毒的复合材料，其包含根据权利要求1所述的蛋白，其中所述蛋白结合至固相支持物和标记物中的至少一种。

3.一种用于检测可引起腹泻的病毒的装置，其包含根据权利要求2所述的复合材料。

4.一种用于富集可引起腹泻的病毒的复合材料，其包含根据权利要求1所述的蛋白，其中所述蛋白结合至固相支持物。

5.一种富集可引起腹泻的病毒的方法，其中，该方法包括：

步骤B1，将含有所述可引起腹泻的病毒的待富集样品与根据权利要求4所述的复合材料接触；

6.一种用于预防和/或治疗可引起腹泻的病毒感染的药物组合物，其包含：根据权利要求1所述的蛋白；以及可药用的辅料。

7.根据权利要求1所述的蛋白在制备用于预防和/或治疗可引起腹泻的诺如病毒或轮状病毒感染的药物中的用途。

8.一种分离的、编码根据权利要求1中所述的蛋白的DNA。

9.根据权利要求8所述的DNA，所述DNA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 2所示。

10.一种表达载体，其含有与启动子有效连接的根据权利要求8或9所述的DNA。

11.一种用于表达的宿主细胞，其含有权利要求10所述的表达载体；所述宿主细胞选自酵母细胞或大肠杆菌细胞。