KR101502619B1

KR101502619B1 - 인간로타바이러스의 ｖｐ７ 유전자 및 이에 특이적인프라이머 또는 프로브를 포함하는 인간로타바이러스 감염증진단용 조성물

Info

Publication number: KR101502619B1
Application number: KR1020070031079A
Authority: KR
Inventors: 백순영; 강진한
Original assignee: 한국엠에스디 유한회사
Priority date: 2007-03-29
Filing date: 2007-03-29
Publication date: 2015-03-16
Also published as: US20080293039A1; KR20080088279A

Abstract

본 발명은 인간로타바이러스의 VP7 유전자 및 이에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 인간로타바이러스 감염증 진단용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 VP7 유전자 및 이에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 인간로타바이러스 감염증 진단용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 인간로타바이러스 VP7 유전자는 신규 G11형 인간로타바이러스 감염증 진단에 유용하게 사용될 수 있으며, 나아가 로타바이러스 백신 개발에 이용될 수 있다.

인간로타바이러스, VP7 유전자, 진단

Description

인간로타바이러스의 ＶＰ７ 유전자 및 이에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 인간로타바이러스 감염증 진단용 조성물{VP7 gene of human rotavirus and composition for diagnosing human rotavirus infection containing primers or probes specific to thereof}

도 1은 본 발명에서 검출된 인간로타바이러스 CUK-1의 VP7 염기서열을 다른 15종류의 G형 로타바이러스들과 계통발생분석(phylogenetic analysis)한 결과이다.

도 2는 본 발명에서 검출된 인간로타바이러스 CUK-1과 15종류의 G형 로타바이러스들에 있어서, 4개의 유전자형내-보존된 항원 영역(intragenotype-conserved antigenic region)의 아미노산 서열을 비교정렬한 결과이다.

본 발명은 인간로타바이러스의 VP7 유전자 및 이에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 인간로타바이러스 감염증 진단용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 VP7 유전자 및 이에 특 이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 인간로타바이러스 감염증 진단용 조성물에 관한 것이다.

로타바이러스(Rotavirus)는 영유아에서 설사를 유발하는 주요 바이러스로서 전 세계적으로 매년 발생하는 약 1억2천5백명의 설사환자의 약 40%의 원인체이다 (World Health Organization: WHO WER 74:33-38, 1999). 미국 질병관리본부(CDC: Center for Disease Control and Prevention)의 보고에 따르면 세계적으로 매년 1억1천1백만 명이 감염되어 2천5백만 명이 병원에 내원하며 5세 이하 영유아의 44만 명이 사망한다고 하였으며, 미국에서 소요되는 의료비만도 1년에 1천만 달러에 이른다고 한다(Bresee J et al., Emerg Infect Dis 10:988-995, 2004). 따라서 세계보건기구(World Health Organization; WHO)는 개발도상국에서는 로타바이러스 발생을 감소시키고 선진국에서는 의료비의 절감을 목표로 로타바이러스에 대한 백신개발을 최우선 연구과제로 삼고 있다(Glass RI et al., Science 265:1389-1391, 1994).

국내에서도 로타바이러스는 영유아 설사증의 가장 흔한 원인체로 보고되고 있는데, 이러한 로타바이러스에 대한 백신 개발을 하기 위해서는 한국의 영유아에 있어서 로타바이러스 감염에 의한 임상적 특성과 최근 유행하는 바이러스 유전자형 분포에 대한 정보가 절실히 필요한 상태이다. 한국의 로타바이러스 유전자형의 분포를 결정하기 위하여, 2002년 7월부터 2003년 6월까지 로타바이러스에 감염된 시료를 채취하여 분석한 결과에 따르면, 전 세계적으로 드물게 발생하는 G4P6 형이 22%로 가장 많이 분포하였으며, 신규 계통인 G9P8이 11%에 달하는 것으로 조사되었다. 따라서, 국내에서 발병하는 로타바이러스에 의한 감염증이 신규 계통의 바이러스에 의하거나 전 세계에서 드문 로타바이러스에 의해 발생된다는 점을 고려할 때, 국내 실정에 맞는 바이러스 백신주의 개발이 필요한 상태이다.

레오비리데(Reoviridae)에 속하는 로타바이러스(Rotavirus)는 피막이 없으며, 정이십면체 형태로, 핵심, 내피 및 외피로 되어있다. 핵심은 RNA 세그먼트 1-3에 의해 암호화되는 VP1, VP2 및 VP3 단백질을 포함하며, 내피는 RNA 세그먼트 6에 의해 암호화되는 VP6 단백질로 이루어지고, 외피는 RNA 세그먼트 9(계통에 따라서는 7 또는 8)에 의해 암호화되는 VP7과 RNA 세그먼트 4에 의해 암호화되는 VP4 스파이크 단백질로 이루어져 있다.

로타바이러스는 VP6 단백질의 항원성에 따라 A군부터 G군까지 7개의 혈청형으로 분류되며, 전 세계적으로 가장 흔한 A군은 VP7에 의한 G형(Glycoprotein type)과 VP4에 의한 P형(Protease-sensitive type)으로 재분류된다. 바이러스 내피를 구성하는 VP6 단백질은 바이러스의 주요 단백질로서, 항원 진단 분석에 타겟으로 되고 있다. 현재까지 인간, 포유류 및 조류에서 15종의 G 혈청형과 24종의 P 유전자형이 규명되었으며, 사람에서는 G형으로 G1, G2, G3, G4 및 G9와 P형으로 P[8]과 P[4]의 조합형 인간로타바이러스가 가장 높은 빈도로 나타난다.

G11형 로타바이러스(YM계통)는 1983년 멕시코에서 돼지로부터 처음 분리된 이래, 방글라데쉬에서 P[25]의 조합형으로 인간에게서 검출된 바 있다. 우리나라에서 분리된 G11형 인간로타바이러스는 전무한 실정이며, G11 P[4]형 인간로타바이러스는 검출된 바 없다.

한편, 로타바이러스는 각 혈청형에 따라 서로 교차방어가 되지 않는 특징으로 인하여 현재까지 규명된 모든 혈청형에 대한 감염을 방어하기 위한 백신 개발은 매우 어려운 실정이다(Glass RI et al., J Infect Dis 192 Suppl 1:S160-166, 2005). 현재까지 개발된 경구용 약독화 생백신(소, UK, WC3; 원숭이, SA11, MMU18006; 사람, M37)과 동물-사람 재조합 백신은 아직까지 다른 혈청형의 감염에 대하여 충분한 방어능을 보여주지 못하고 있다(Anderson EL et al., J Infect Dis 153:823-831, 1986; Bernstein DI et al., JAMA 273:1191-1196, 1995; Clark HF et al., Am J Dis Child 140:350-356, 1986; Conner ME et al., Curr Top Microbiol Immunol 105:253, 1994; De Mol P. et al., Lancet II 108. 1986; Flores J, et al., J Clin Microbiol 27: 512-518, 1988; Kapikian AZ et al., Adv Exp Med Biol 257:67, 1990; Rennels MB et al., Pediatrics 97:7-13, 1996; Vesikari T, Vaccine 11:255-261, 1993). 최근에 미국 와이어스-아이어스트(Wyeth-Ayerst)사에서 개발한 Rotashield® 은 세계적으로 가장 높은 발생률을 보이고 있는 G 혈청형 (G1～G4)을 혼합한 4가 약독화 생백신으로 1998년 미국 FDA의 승인을 받아 2, 4, 6개월에 사용하는 기본 접종에 포함되었으나 15례의 장 중첩 환자가 발생하여 사용 이 중단된 상태이다(Murphy TV et al., N Engl J Med 344:564-572, 2001).

따라서, 상기와 같은 문제점으로 인하여 인간로타바이러스에 대한 효과적인 백신주의 개발이 필요하며, 이를 위하여 인간로타바이러스 유전자 분석 및 진단에 관한 선행연구가 요구되어지고 있다. 이에 본 발명자들은 인간로타바이러스의 진단 및 백신 개발에 이용할 목적으로 인간로타바이러스를 검출하고, 상기 인간로타바이러스의 외피유전자인 VP7과 VP4를 유전자 분석함으로써 상기 인간로타바이러스가 G11P[4]형 조합형을 가지는 인간로타바이러스임을 확인하였으며, VP 7 유전자를 계통발생분석하여 상기 바이러스가 종래 보고된 바 없는 신규 인간로타바이러스임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 되는 VP7 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 인간로타바이러스 감염증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 되는 VP7 유전자 를 제공한다.

본 발명의 또한, 상기 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 인간로타바이러스 감염증 진단용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 VP7 유전자를 제공한다.

로타바이러스의 외피를 구성하는 유전자는 VP7 유전자와 VP4 유전자로써, 상기 유전자들은 바이러스의 병원성, 면역원성 및 바이러스의 세포 부착와 침습에 관여한다. VP7 유전자에 의해 로타바이러스의 G 혈청형을 분류할 수 있고, VP4 유전자에 의해 P 유전자형을 분류할 수 있다.

본 발명의 일실시예들에서는 로타바이러스 감염증세를 나타내는 환아들의 분변을 시료로 사용하여 VP6 특이적 ELISA 키트로 로타바이러스를 검출하고, 상기 검출된 시료에서 바이러스 RNA 추출, RT-PCR 및 염기서열 분석 등의 일련의 과정을 거쳐 VP7 유전자 및 VP4 유전자를 분석하였다. 그 결과, 본 발명의 인간로타바이러스가 G11 P[4]형 신규 인간로타바이러스임을 알 수 있었으며, 이를 CUK-1이라 명명하였다. 한편, 상기에서 분석한 인간로타바이러스 CUK-1의 VP7 유전자 염기서열을 서열번호 1로, VP4 유전자 염기서열을 서열번호 3으로 나타내었으며, 상기 서열에 의해 암호화되는 VP7 아미노산 서열을 서열번호 2로, VP4 아미노산 서열을 서열번호 4로 나타내었다.

본 발명은 또한, 상기 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 인간로타바이러스 감염증 진단용 조성물을 제공한다.

프라이머를 이용한 특정 핵산의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 목적 유전자의 서열을 증폭한 다음 당 분야에 공지된 방법으로 유전자의 증폭여부를 확인함으로써 수행될 수 있다. 또한, 프로브를 이용한 특정 핵산의 검출은 적합한 조건하에서 시료 핵산을 프로브와 접촉시킨 후 하이브리드화되는 핵산의 존재여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.

상기 “프라이머”란 짧은 자유 수산화기를 가지는 핵산서열로서 상보적인 템플레이트와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산서열을 말한다. 본 발명의 프라이머는 예를 들면, 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다.

상기 “프로브”는 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기로 이루어진 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어 특정 mRNA의 존재유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 단쇄 DNA 프로브, 이중쇄 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고 비오틴, FITC, 로다민, DIG 등으로 표지되거나 방사선 동위 원소 등으로 표지될 수 있다.

또한, 상기 프로브는 검출 가능한 물질 예를 들면, 적합한 신호를 제공하고 충분한 반감기를 갖는 방사성 표지로 표지할 수 있다. 표지된 프로브는 문헌(Sambook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, 1989)에 공지된 바와 같은 고체 지지체 상의 핵산에 하이브리드화시킬 수 있다.

상기 프로브나 프라이머를 이용하여 특정 핵산을 검출할 수 있는 방법으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 중합효소 연쇄반응(PCR), DNA 시퀀싱, RT-PCR, 프라이머 연장법(Nikiforeov et al., Nucl Acids Res 22, 4167-4175, 1994), 올리고뉴클레오타이드 연장 분석(Nickerson et al., Pro Nat Acad Sci USA, 87, 8923-8927, 1990), 대립형질 특이적 PCR법(Rust et al., Nucl Acids Res, 6, 3623-3629, 1993), RNase 불일치 절단(RNase mismatch cleavage, Myers et al., Science, 230, 1242-1246, 1985), 단일가닥 입체 다형화(single strand conformation lymorphism, Orita et al., Pro Nat Acad Sci USA, 86, 2766-2770, 1989), SSCP 및 헤테로두플렉스 동시 분석법(Lee et al., Mol Cells, 5:668-672, 1995), 변성 구배 젤 전기영동(DGGE, Cariello et al., Am J Hum Genet, 42, 726-734, 1988), 변성 고압 액체 크로마토그래피(denaturing high performance liquid chromatography, Underhill et al., Genome Res, 7, 996-1005, 1997), 혼성화 반응, DNA 칩 등이 있다. 상기 혼성화 반응의 예로는 노던 하이브리다이제이션(Maniatis T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Habor Laboratory, NY, 1982), 인시츄 하이브리다이제이션(Jacquemier et al., Bull Cancer, 90:31-8, 2003) 및 마이크로어레이(Macgregor, Expert Rev Mol Diagn 3:185-200, 2003) 방법 등이 있다.

상기 본 발명의 인간로타바이러스 감염증 진단용 조성물은 상술한 핵산을 검출하는 방법에 일반적으로 사용되는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, PCR 반응에 요구되는 dNTP(deoxynulceotide triphosphate), 내열성 중합효소(polymerase), 염화마그네슘 등의 금속이온염이 포함할 수 있으며, 시퀀싱에 요구되는 dNTP, 시쿼나제(sequenase) 등을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 진단용 조성물은 진단용 키트, 마이크로어레이 및 DNA 칩의 형태로 제공될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

< 실시예 1>

인간로타바이러스의 검출

인천 성모자애병원에 설사증으로 내원한 5세 이하 환아들로부터 분변 시료를 수집하였고, VP6-특이적 ELISA(Enzyme-linked immunosorbant assay) 키트인 딥스틱 ‘에이켄(Eiken)’ 로타 키트(SA Scientific, Eiken, Tokyo, Japan)를 사용하여 로타바이러스 항원을 검출하였다. 상기 검출된 인간로타바이러스를 CUK-1이라 명명하였다.

< 실시예 2>

인간로타바이러스 VP4 유전자 및 VP7 유전자의 염기서열 분석

<2-1> RNA 추출

QIAamp® 바이러스 RNA 미니 키트(QIAGEN/Westburg, Leusden, The Netherlands)를 사용하여 상기 로타바이러스 항원이 검출된 분변 시료로부터 바이러스 RNA를 추출하였다. 먼저, 분변시료를 PBS(Phosphate-buffered saline)에 현탁하여 10%(w/v)현탁액을 만든 후 3000 x g로 20분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후 상등액을 수득하여 QIAamp® 바이러스 RNA 미니 키트로 바이러스 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 -70℃에서 보관하였다.

<2-2> RT - PCR

로타바이러스의 G 유전자형과 P 유전자형을 규명하기 위하여 원스텝 RT-PCR 키트를 사용하여 RT-PCR(Reverse transcriptase PCR)을 실시하였다.

VP7 유전자를 증폭하기 위하여, 정방향 프라이머 Beg9(5'-GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG-3': 서열번호 5)와 역방향 프라이머 End9(5'-GGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG-3' : 서열번호 6)를 사용였으며, 50℃에서 30분 동안 초기 역전사 단계를 수행한 후 95℃에서 15분 동안 처리하고, 94℃에서 45초, 54℃에서 50초, 72℃에서 45초간의 반응을 35회 반복한 다음, 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켜 1,062bp 단편의 VP7 유전자를 증폭하였으며, 상기 증폭된 PCR 산물은 아가로즈겔에서 전기영동된 후 EtBr(ethidium bromide)에서 염색, UV상에서 확 인하였다.

VP4 유전자를 증폭하기 위하여, 정방향 프라이머 Con3(5-TGGCTTCGCCATTTTATAGACA-3': 서열번호 7)와 역방향 프라이머 Con2(5'ATTTCGGACCATTTATAACC-3': 서열번호 8)를 사용하였으며, RT-PCR 반응은 50℃에서 30분 동안 초기 역전사 단계를 수행한 후 95℃에서 15분 동안 처리하고, 94℃에서 45초, 50℃에서 50초, 72℃에서 45초간의 반응을 35회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켜 876bp 단편의 VP4 유전자를 증폭하였으며, 이를 1.5% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 확인하였다.

<2-3> 염기서열 분석

VP7 유전자와 VP4 유전자의 염기서열 분석을 위하여, 상기 실시예<2-2>에서 증폭된 PCR 산물을 QIAEX Ⅱ 겔 추출 키트(QIAGEN, Hilden, Germany)로 정제하였다. 상기 정제된 PCR 산물 60ng, 5pmol의 정방향 또는 역방향 프라이머, 4ul의 Big Dye Terminator v2.0 100RR 믹스(Perkin-Elmer Applied Biosystems)를 혼합한 다음 상기 혼합물의 최종 부피를 10ul되도록 멸균수로 조절하였으며, 96℃에서 10초, 60℃에서 5초간의 반응을 30회 반복하고, 60℃에서 45초간의 반응시켰다. 양 가닥을 모두 염기서열 분석하여 크로스-체크하였다.

상기 분석된 바이러스의 VP7 유전자 염기서열을 서열번호 1로, VP4 유전자 염기서열을 서열번호 3으로 나타내었으며, 상기 서열에 의해 암호화되는 VP7 아미 노산 서열을 서열번호 2로, VP4 아미노산 서열을 서열번호 4로 나타내었다.

< 실시예 3>

인간로타바이러스 VP4 유전자의 P형 결정

인간로타바이러스 VP4 유전자의 P형을 결정하기 위하여, 상기 <실시예 2>에서 결정된 VP4 유전자의 염기서열을 GenBank상의 관련 계통들과 비교하였으며, 본 발명에 따른 인간로타바이러스 CUK-1이 P[4]형인 인간로타바이러스임을 알 수 있었다.

< 실시예 4>

인간로타바이러스 VP7 유전자의 G형 결정 및 유전적 상관관계조사

인간로타바이러스 VP7 유전자의 G형 결정 및 유전적 상관관계를 조사하기 위하여, 상기 <실시예 2>에서 결정된 VP7 유전자의 염기서열을 GenBank상의 관련 계통들과 비교하였다. DNA 서열과 단백질 서열은 MegAlign package(윈도우버젼 3.12e; DNA STAR, mADISON, Wis.)의 다중 얼라이먼트 알고리즘을 사용하여 정렬하였다. 또한, 염기서열 및 아미노산 서열의 상동성 및 서열간의 거리는 클러스터 W 방법에 의하여 산출하였으며, 계통발생분석(Phylogenetic analysis)은 메가 버전 3.1 소프트웨어 패키지(Mega version 3.1 software package)를 사용하여 수행하였다. DNA 서열은 클러스터 W 방법에 의해서 계산되었으며. 계통수(dendrogram)는 네이버-조이닝 방법(neighbor-joining method)에 의해 산출되었다.

15종류의 G 유전자형 로타바이러스의 VP7 유전자와 본 발명 CUK-1 계통의 VP7 유전자의 염기서열 및 아미노산의 상동성 비교

G 형	계통(strain)	기원(origin)	상동성 (%)
			염기서열	아미노산서열
G1	Wa	인간	73.8	77.6
G2	HU5	인간	74.3	74.2
G3	SA11	원숭이	76.8	86.2
G4	ST3	인간	73.8	76.1
G5	OSU	돼지	83.6	89.9
G6	NCDV	소	74.4	81.3
G7	Ch2	조류	62.1	57.7
G8	MW333	인간	73.4	80.1
G9	116E	인간	78.9	84.7
G10	B223	소	72.5	77.9
G11	A253	돼지	86.9	95.1
G11	Dhaka6	인간	98.7	98.5
G11	YM	돼지	91.9	95.4
G12	L26	인간	74.6	80.4
G13	L338	말	74.4	78.5
G14	F123	말	76.9	82.2
G15	Hg18	소	73.4	77.3

(VP7의 ORF(open reading frame)인 49번째부터 1026번째 염기서열이 시퀀싱되었다.)

본 발명의 VP7의 ORF(open reading frame) 염기서열과 G1~G15 계통의 VP7의 ORF(open reading frame) 염기서열을 비교한 결과, 상기 표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 CUK-1 계통의 VP7 염기서열은 G11형 로타바이러스 계통인 A253, Dhaka6 및 YM과 가장 밀접한 관계를 나타내었으며(염기서열에 있어서는 각각 86.9, 98.7 및 91.9%의 상동성을 나타내었으며, 아미노산 서열에 있어서는 각각 95.1, 98.5 및 95.4%의 상동성을 나타내었다.), 이중 Dhaka6 계통과 가장 높은 상동성을 나타내었고, G11형을 제외한 G1 ~ G15형과는 낮은 상동성을 나타내어 본 발명의 CUK-1 계통이 G11형 인간로타바이러스임을 알 수 있었다.

한편, CUK-1과 15종류의 G형의 VP7의 계통발생 분석결과는 도 1에 나타내었는데, 단위 분지(branch)안에 CUK-1와 G11형의 Dhaka6 형이 클러스터(cluster)되는 것을 알 수 있었다.

또한, CUK-1과 15종류의 G형 인간로타바이러스에 있어서, 4개의 유전자형내-보존된 항원 영역(intragenotype-conserved antigenic region)의 아미노산 서열을 정렬하였다. 그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, CUK-1 계통은 G11형 로타바이러스 계통인 A253, Dhaka6 및 YM과 밀접한 관계를 나타내었으며, Dhaka6와 비교하여 볼 때, “C ”부위에서 하나의 아미노산 서열이 차이를 나타냄을 알 수 있었다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 G11P[4]형의 조합형을 가지는 인간로타바이러스를 검출하였으며, 상기 바이러스의 VP7 유전자를 분석한 결과, 상기 바이러스가 종래 보고된 바 없는 신규 인간로타바이러스임을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 인간로타바이러스 VP7 유전자는 신규 G11형 인간로타바이러스 감염증 진단에 유용하게 사용될 수 있으며, 나아가 로타바이러스 백신 개발에 이용될 수 있다.

<110> MSD Korea Ltd. <120> VP7 gene of human rotavirus and composition for diagnosing human rotavirus infection containing primers or probes specific to thereof <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 978 <212> DNA <213> VP7 gene of human rotavirus <220> <221> CDS <222> (1)..(978) <400> 1 atg tat ggt att gaa tat acc aca att cta act ttt ttg ata tca ctt 48 Met Tyr Gly Ile Glu Tyr Thr Thr Ile Leu Thr Phe Leu Ile Ser Leu 1 5 10 15 gta ttt att aat tat ata gtg aaa tca ata act aga aca atg gac ttt 96 Val Phe Ile Asn Tyr Ile Val Lys Ser Ile Thr Arg Thr Met Asp Phe 20 25 30 gtt atc tat aga ttt ttg ttt gtt ata gtt gta cta gca cca ttc att 144 Val Ile Tyr Arg Phe Leu Phe Val Ile Val Val Leu Ala Pro Phe Ile 35 40 45 aaa acg caa aac tat gga ata aac ttg ccg ata act ggt tct atg gat 192 Lys Thr Gln Asn Tyr Gly Ile Asn Leu Pro Ile Thr Gly Ser Met Asp 50 55 60 aca cca tat atg aat tca aca atg agt gaa aca ttc tta act tct act 240 Thr Pro Tyr Met Asn Ser Thr Met Ser Glu Thr Phe Leu Thr Ser Thr 65 70 75 80 tta tgt tta tat tac ccg aac gaa gca gca act cag atc gca gac gac 288 Leu Cys Leu Tyr Tyr Pro Asn Glu Ala Ala Thr Gln Ile Ala Asp Asp 85 90 95 aag tgg aaa gat act ctc tca caa ctt ttt ctc act aaa ggg tgg cca 336 Lys Trp Lys Asp Thr Leu Ser Gln Leu Phe Leu Thr Lys Gly Trp Pro 100 105 110 aca gga tcg gtt tac ttt aaa gaa tat aca gat gtt gca tca ttt tcc 384 Thr Gly Ser Val Tyr Phe Lys Glu Tyr Thr Asp Val Ala Ser Phe Ser 115 120 125 gta gat cca caa cta tat tgt gat tat aat att gta atg atg aaa tat 432 Val Asp Pro Gln Leu Tyr Cys Asp Tyr Asn Ile Val Met Met Lys Tyr 130 135 140 gat gga aat tca caa cta gat atg tct gaa ttg gct gat tta ata tta 480 Asp Gly Asn Ser Gln Leu Asp Met Ser Glu Leu Ala Asp Leu Ile Leu 145 150 155 160 aat gaa tgg cta tgt aat cca atg gat ata gct ctt tac tat tat caa 528 Asn Glu Trp Leu Cys Asn Pro Met Asp Ile Ala Leu Tyr Tyr Tyr Gln 165 170 175 caa aca gat gaa gca aat aaa tgg ata tca atg ggc gat tca tgt acg 576 Gln Thr Asp Glu Ala Asn Lys Trp Ile Ser Met Gly Asp Ser Cys Thr 180 185 190 ata aaa gta tgc cca ctc aat aca cag acc ctt gga ata gga tgt tcg 624 Ile Lys Val Cys Pro Leu Asn Thr Gln Thr Leu Gly Ile Gly Cys Ser 195 200 205 act act gat cca aca aca ttt gag gaa gtg gct tct gca gag aaa ttg 672 Thr Thr Asp Pro Thr Thr Phe Glu Glu Val Ala Ser Ala Glu Lys Leu 210 215 220 gtg ata aca gat gtt gta gat gga gtt aac cac aaa cta gat gtg aca 720 Val Ile Thr Asp Val Val Asp Gly Val Asn His Lys Leu Asp Val Thr 225 230 235 240 acc gct acg tgt aca ata aga aac tgt aaa aag ctt gga cca aga gaa 768 Thr Ala Thr Cys Thr Ile Arg Asn Cys Lys Lys Leu Gly Pro Arg Glu 245 250 255 aat gtt gcg ata att caa gta gga ggt tca aat ata ctc gat att aca 816 Asn Val Ala Ile Ile Gln Val Gly Gly Ser Asn Ile Leu Asp Ile Thr 260 265 270 gca gat cca act aca gct cca caa act gaa aga atg atg cgt ata aat 864 Ala Asp Pro Thr Thr Ala Pro Gln Thr Glu Arg Met Met Arg Ile Asn 275 280 285 tgg aaa aaa tgg tgg caa gtg ttt tat act ata gtc gat tat gtt aat 912 Trp Lys Lys Trp Trp Gln Val Phe Tyr Thr Ile Val Asp Tyr Val Asn 290 295 300 caa att gta caa gtg atg tcc aaa cga tca cgt tct tta aat tcc gct 960 Gln Ile Val Gln Val Met Ser Lys Arg Ser Arg Ser Leu Asn Ser Ala 305 310 315 320 gct ttt tat tat cga gtc 978 Ala Phe Tyr Tyr Arg Val 325 <210> 2 <211> 326 <212> PRT <213> VP7 gene of human rotavirus <400> 2 Met Tyr Gly Ile Glu Tyr Thr Thr Ile Leu Thr Phe Leu Ile Ser Leu 1 5 10 15 Val Phe Ile Asn Tyr Ile Val Lys Ser Ile Thr Arg Thr Met Asp Phe 20 25 30 Val Ile Tyr Arg Phe Leu Phe Val Ile Val Val Leu Ala Pro Phe Ile 35 40 45 Lys Thr Gln Asn Tyr Gly Ile Asn Leu Pro Ile Thr Gly Ser Met Asp 50 55 60 Thr Pro Tyr Met Asn Ser Thr Met Ser Glu Thr Phe Leu Thr Ser Thr 65 70 75 80 Leu Cys Leu Tyr Tyr Pro Asn Glu Ala Ala Thr Gln Ile Ala Asp Asp 85 90 95 Lys Trp Lys Asp Thr Leu Ser Gln Leu Phe Leu Thr Lys Gly Trp Pro 100 105 110 Thr Gly Ser Val Tyr Phe Lys Glu Tyr Thr Asp Val Ala Ser Phe Ser 115 120 125 Val Asp Pro Gln Leu Tyr Cys Asp Tyr Asn Ile Val Met Met Lys Tyr 130 135 140 Asp Gly Asn Ser Gln Leu Asp Met Ser Glu Leu Ala Asp Leu Ile Leu 145 150 155 160 Asn Glu Trp Leu Cys Asn Pro Met Asp Ile Ala Leu Tyr Tyr Tyr Gln 165 170 175 Gln Thr Asp Glu Ala Asn Lys Trp Ile Ser Met Gly Asp Ser Cys Thr 180 185 190 Ile Lys Val Cys Pro Leu Asn Thr Gln Thr Leu Gly Ile Gly Cys Ser 195 200 205 Thr Thr Asp Pro Thr Thr Phe Glu Glu Val Ala Ser Ala Glu Lys Leu 210 215 220 Val Ile Thr Asp Val Val Asp Gly Val Asn His Lys Leu Asp Val Thr 225 230 235 240 Thr Ala Thr Cys Thr Ile Arg Asn Cys Lys Lys Leu Gly Pro Arg Glu 245 250 255 Asn Val Ala Ile Ile Gln Val Gly Gly Ser Asn Ile Leu Asp Ile Thr 260 265 270 Ala Asp Pro Thr Thr Ala Pro Gln Thr Glu Arg Met Met Arg Ile Asn 275 280 285 Trp Lys Lys Trp Trp Gln Val Phe Tyr Thr Ile Val Asp Tyr Val Asn 290 295 300 Gln Ile Val Gln Val Met Ser Lys Arg Ser Arg Ser Leu Asn Ser Ala 305 310 315 320 Ala Phe Tyr Tyr Arg Val 325 <210> 3 <211> 434 <212> DNA <213> VP4 gene of human rotavirus <220> <221> CDS <222> (1)..(429) <400> 3 tat gac gaa ata gaa cag att gga tcg gag aaa act caa aat gta acg 48 Tyr Asp Glu Ile Glu Gln Ile Gly Ser Glu Lys Thr Gln Asn Val Thr 1 5 10 15 ata aat cca ggt cca ttt gca cag act aga tat gct cca gtt gat tgg 96 Ile Asn Pro Gly Pro Phe Ala Gln Thr Arg Tyr Ala Pro Val Asp Trp 20 25 30 gga cac gga gag att aat gat tca act aca gtg gaa cca gtt tta gat 144 Gly His Gly Glu Ile Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Val Leu Asp 35 40 45 ggt cct tat caa ccc act gca ttc aaa cca ccc aat gat tat tgg ctg 192 Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Ala Phe Lys Pro Pro Asn Asp Tyr Trp Leu 50 55 60 ctt att agc tca aat acg gat gga gtg gtc tat gaa agt aca aat aat 240 Leu Ile Ser Ser Asn Thr Asp Gly Val Val Tyr Glu Ser Thr Asn Asn 65 70 75 80 agt gac ttt tgg aca gca gtt atc gct gtc gaa cca cat gtc agt caa 288 Ser Asp Phe Trp Thr Ala Val Ile Ala Val Glu Pro His Val Ser Gln 85 90 95 aca aat agg caa tat gtt tta ttt ggt gag aac aag cag ttt aat gta 336 Thr Asn Arg Gln Tyr Val Leu Phe Gly Glu Asn Lys Gln Phe Asn Val 100 105 110 gaa aat aat tca gat aaa tgg aaa ttt ttc gaa atg ttt aaa ggt agt 384 Glu Asn Asn Ser Asp Lys Trp Lys Phe Phe Glu Met Phe Lys Gly Ser 115 120 125 agt cag agt gat ttt tct aat aga cgg act cta acc tct aaa caa t 430 Ser Gln Ser Asp Phe Ser Asn Arg Arg Thr Leu Thr Ser Lys Gln 130 135 140 agaa 434 <210> 4 <211> 143 <212> PRT <213> VP4 gene of human rotavirus <400> 4 Tyr Asp Glu Ile Glu Gln Ile Gly Ser Glu Lys Thr Gln Asn Val Thr 1 5 10 15 Ile Asn Pro Gly Pro Phe Ala Gln Thr Arg Tyr Ala Pro Val Asp Trp 20 25 30 Gly His Gly Glu Ile Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Val Leu Asp 35 40 45 Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Ala Phe Lys Pro Pro Asn Asp Tyr Trp Leu 50 55 60 Leu Ile Ser Ser Asn Thr Asp Gly Val Val Tyr Glu Ser Thr Asn Asn 65 70 75 80 Ser Asp Phe Trp Thr Ala Val Ile Ala Val Glu Pro His Val Ser Gln 85 90 95 Thr Asn Arg Gln Tyr Val Leu Phe Gly Glu Asn Lys Gln Phe Asn Val 100 105 110 Glu Asn Asn Ser Asp Lys Trp Lys Phe Phe Glu Met Phe Lys Gly Ser 115 120 125 Ser Gln Ser Asp Phe Ser Asn Arg Arg Thr Leu Thr Ser Lys Gln 130 135 140 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer for VP7 <400> 5 ggctttaaaa gagagaattt ccgtctgg 28 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-sense primer for VP7 gene <400> 6 ggtcacatca tacaattcta atctaag 27 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense-primer for VP4 gene <400> 7 tggcttcgcc attttataga ca 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-sense primer for VP4 gene <400> 8 atttcggacc atttataacc 20

Claims

서열번호 5 및 서열번호 6으로 각각 표시되는 프라이머쌍을 포함하는, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 인간로타바이러스 VP7 유전자 검출용 프라이머.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 인간로타바이러스 VP7 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 프라이머.
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