KR20230084201A - 융합전-안정화된 hmpv f 단백질 - Google Patents
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Abstract
조작된 hMPV F 단백질이 본원에서 제공된다. 일부 측면에서, 조작된 F 단백질은 향상된 입체형태 안정성 및/또는 항원성을 나타낸다. 스크리닝 플랫폼 및/또는 백신 조성물에서, 조작된 F 단백질을 진단제로서 사용하기 위한 방법이 또한 제공된다.
Description
관련 출원에 대한 참조
본 출원은 2020년 10월 9일에 출원된 미국 가출원 번호 63/089,978의 우선권을 주장하며, 이의 전체 내용은 참조로 여기에 포함된다.
서열 목록에 대한 참조
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본 개시내용은 일반적으로 의학, 바이러스학, 면역학 및 단백질 공학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 조작된 인간 메타뉴모바이러스(hMPV) F 단백질 및 약물 설계 및 백신 제형에서의 이의 용도에 관한 것이다.
인간 메타뉴모바이러스(hMPV)는 2001년에 발견되기 전 적어도 반세기 동안 인간에서 순환해 온 뉴모바이러스(Pneumoviridae)과의 호흡기 바이러스이다(van den Hoogen et al., 2001). 5세까지 거의 보편적인 감염이 있으며 재감염은 평생 동안 계속해서 부담이 된다(van den Hoogen et al., 2001). 그러나 영유아(6-12개월), 노인 및 면역력이 저하된 인구는 폐렴 및 세기관지염과 같은 더 심각한 질병으로 입원할 위험이 증가한다(Deffrasnes et al., 2007). hMPV가 나타내는 질병 부담에도 불구하고, 예방 또는 치료를 위해 승인된 백신 또는 치료제는 없다. 최근 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae) 내의 아과에서 상승된 뉴모바이러스 과의 구성원으로서 hMPV는 외피가 있는 네거티브-센스 RNA 바이러스이다. 이 과내의 바이러스는 세 가지 표면-발현 막 단백질을 코딩한다. hMPV의 경우, 이들은 작은 소수성(SH), 부착(G) 및 융합(F) 단백질이다(Shafagati & Williams, 2018).
클래스 I 바이러스 융합 당단백질로서, hMPV F는 먼저 단일 폴리펩티드 전구체(F0)로 번역된다. 단백질분해 절단은 F0을 디설파이드-결합된 F2 및 F1 서브유닛으로 전환시킨다(도 1a). 3개의 F2/F1 이종이량체는 단백질의 활성 형태를 구성하는 준안정성 융합전 삼량체로 회합된다. 세포 배양에서, 이 단백질분해 활성화는 일염기성 절단 부위에서 단백질을 절단하는 트립신의 첨가에 의해 달성될 수 있다(van den Hoogen et al., 2001; Skiadopoulos et al., 2006; Schickli et al., 2005). 자연 감염 동안, hMPV F0는 TMPRSS2와 같은 트립신-유사 세포외 세린 프로테아제에 의해 절단되지만, 생산 세포 대 표적 세포에서 발생하는 정도는 잘 정의되어 있지 않다(Shirogane et al., 2008). 성숙한 F1 서브유닛의 N-말단은 융합 펩티드라고 하는 소수성 서열을 포함하며, 이는 융합전 F 삼량체의 내부 공동 내에 위치한다(Battles et al., 2017). 사람 호흡기 세포융합 바이러스 F(RSV F) 및 인플루엔자 헤마글루티닌(HA)과 같은 다른 클래스 I 융합 단백질의 경우, 삼량체는 불안정하고 일시적으로 펴져서 개방될 수 있거나 "호흡"할 수 있는 것으로 나타났다(Bangaru et al., 2019; Watanabe et al., 2019; Gilman et al., 2019). 최근에 hMPV F의 삼량체 인터페이스를 표적으로 하는 인간 항체가 기술되었으며, 이는 융합전 hMPV F가 생체 내에서 이러한 일시적인 개방을 겪는다는 것을 시사한다(Huang et al., 2020). 막 융합을 촉진하기 위해, 준안정성 융합전 F 단백질은 상당한 입체형태적 변화를 겪어 융합 펩티드를 해방시키고 숙주-세포 막으로 확장한다. 이 불안정한 프리-헤어핀(pre-hairpin) 중간체는 융합후 입체형태라고 불리는 N-말단 및 C-말단 헵타드 반복(각각 HRA 및 HRB)의 삼량체로 구성된 매우 안정적인 6-나선 다발을 형성하기 위해 자체적으로 다시 붕괴된다(Mas et al., 2016). 바이러스 진입에서 이의 중요한 역할을 고려하면, hMPV용 백신 후보에는 일반적으로 F 단백질이 포함된다. 즉, hMPV에 대한 잠재적 백신화 전략은 바이러스 감염에 중요한 융합(F) 당단백질을 표적으로 삼는 것이다. 그러나, 약물 후보를 식별하고 F 단백질에 대한 효과적인 면역 반응을 자극하는 데 사용할 수 있는 안정화된 F 단백질에 대한 요구가 남아 있다.
이와 같이, 본원에서는 열안정성 hMPV F 융합전 입체형태 변이체를 제공한다. 디설파이드 결합을 도입하기 위한 쌍을 이루는 시스틴 돌연변이의 도입은 단백질의 발현 및 열안정성을 향상시켰다. 개별적인 소수성, 정전기적 상호작용 및 전하 감소 돌연변이도 또한 유익하다. 또한 여러 유익한 돌연변이를 조합하면 원하는 단백질 특성이 더욱 향상되었다.
일 구현양태에서, (i) 서열번호: 1, 2 및 4-7 중 임의의 것의 아미노산 19-489 또는 (ii) 서열번호: 3의 아미노산 19-484와 적어도 90% 동일성을 갖는 메타뉴모바이러스(MPV) F 단백질 엑토도메인을 포함하는 조작된 단백질이 본원에서 제공되며, 상기 조작된 단백질은 서열번호: 1-7 중 어느 하나의 서열에 비해 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 상기 적어도 하나의 돌연변이는 다음에 상응하는 위치에서 치환을 포함한다: K166, N342, A/D185, K188, T49, V262, H435, E26, G439, N46, L158, A161, L50, V162, E51, R163, V104, N457, L110, N322, A113, D336, A116, A338, A140, A147, S291, S443, S293, S444, S355, V442, T365, V463, S22, G53, V169, E305, L302, V47, A159, T127, N153, G121, I/F258, G106, A107, T160, I128, A190, V118, Q426, L165, V191, S149, I137, V/I122, S192, T317, L105, L134, A117, S347, G261, I268, S470, L473, S265, L460, F48, Q455, V231, A374, I217, S376, G366, S194, L219 A344, A86, T114, V148, D461, L66, L73, N145, Q195, E453, 및/또는 H368. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 (i) 서열번호: 1, 2 및 4-7 중 임의의 것의 아미노산 19-489, 또는 (ii) 서열번호: 3의 아미노산 19-484와 적어도 95% 동일성을 갖는다. 서열번호: 1은 BV-115 변이체 서열에 상응한다. 서열번호: 2는 JSM-1147 변이체 서열에 상응한다. 서열번호: 3은 DW-1 변이체 서열에 상응한다. 서열번호: 4는 hMPV A1 NL/1/00 균주 F 단백질(GenBank: AAK62968.2)에 상응한다. 서열번호: 5는 hMPV A2 NL/00/17 균주 F 단백질(GenBank: ACJ70115.1)에 상응한다. 서열번호: 6은 hMPV B1 NL/1/99 균주 F 단백질(GenBank: AY525843.1)에 상응한다. 서열번호: 7은 hMPV B2 TN/99/419 균주 F 단백질(GenBank: AAS92882.1)에 상응한다.
일부 측면에서, 조작된 단백질은 A/D185P에 상응하는 프롤린 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 RQSR(서열번호: 4-7 중 어느 하나의 잔기 99-102; 서열번호: 9)에 상응하는 RRRR(서열번호: 1-3 중 어느 하나의 잔기 99-102; 서열번호: 10)로의 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 A/D185P에 상응하는 프롤린 치환 및 RQSR(서열번호: 4-7 중 어느 하나의 잔기 99-102; 서열번호 9)에 상응하는 RRRR(서열번호: 1-3 중 어느 하나의 잔기 99-102; 서열번호: 10)로의 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 서열번호: 1-7 내지 중 어느 하나의 잔기 87-104에 상응하는 GGGGSGGGGSR(서열번호: 8)로의 치환을 포함한다.
일부 측면에서, 조작된 단백질은 다음에 상응하는 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 포함한다: E26C 및 G439C; N46C 및 L158C; T49C 및 A161C; L50C 및 V162C; E51C 및 R163C; E51C 및 K166C; V104C 및 N457C; L110C 및 N322C; A113C 및 D336C; A116C 및 A338C; A140C 및 A147C; S291C 및 S443C; S293C 및 S443C; S293C 및 S444C; S355C 및 V442C; T365C 및 V463C; S22C 및 H435C; G53C 및 K166C; G53C 및 V169C; E305C 및 N457C; S291C 및 L302C; V47C 및 A159C; T127C 및 N153C; G121C 및 I/F258C; F48C 및 T160C; 및/또는 T365C 및 Q455C. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 A116C 및 A338C; T365C 및 V463C; T127C 및 N153C; T365C 및 Q455C; V104C 및 N457C; L110C 및 N322C; 또는 A140C 및 A147C에 상응하는 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 A140C 및 A147C에 상응하는 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 V104C 및 N457C에 상응하는 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 L110C 및 N322C에 상응하는 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 T365C 및 V463C에 상응하는 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 포함한다.
일부 측면에서, 조작된 단백질은 L219 및/또는 V231에 상응하는 위치에서 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 L219K 및/또는 V231I에 상응하는 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 T127C 및 N153C에 상응하는 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 L110C 및 N322C에 상응하는 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 A140C 및 A147C에 상응하는 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 G366S에 상응하는 치환을 포함한다.
일부 측면에서, 조작된 단백질은 Q426, T49, L187, L473 및/또는 S347에 상응하는 위치에서 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 Q426W, T49E, L187F, L473F 및/또는 S347Q에 상응하는 치환을 포함한다.
일부 측면에서, 조작된 단백질은 A116C 및 A338C에 상응하는 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 T365C 및 V463C에 상응하는 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 T127C 및 N153C에 상응하는 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 T365C 및 Q455C에 상응하는 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 적어도 하나의 추가적인 조작된 디설파이드 결합을 포함한다.
일부 측면에서, 조작된 단백질은 다음에 상응하는 위치에서 공동 충전 치환을 포함한다: G106, A107, T160, L158, I128, A190, V118, Q426, L165, V191, T160, S149, I137, S149, V169, N46, T49, V/I122, S192, T317, V162, L105, L134, A117, S347, V47, G261, I268, S470, V231, A374, I217, 및/또는 S355. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 L105, V118, I137, S149, L158, L165 또는 Q426에 상응하는 위치에서 공동 충전 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 L105I 또는 L105W에 상응하는 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 L158W에 상응하는 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 V118F 또는 V118M에 상응하는 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 Q426W에 상응하는 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 L165F에 상응하는 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 S149V 또는 S149I에 상응하는 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 I137에 상응하는 위치에서 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 I137L에 상응하는 치환을 포함한다.
일부 측면에서, 조작된 단백질은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공동 충전 치환을 포함한다: G106W, A107F, T160M, L158W, I128F, A190M, V118F, V118M, Q426W, L165F, V191I, T160V, S149V, I137L, S149I, V169I, N46V, T49I, V/I122L, S192L, T317L, V162F, V162W, L105I, L105F, L105W, L134I, A117M, S347M, S347K, S347Q, V47M, G261M, I268M, S470Y, V231I, A374V, I217V, 및/또는 S355F.
일부 측면에서, 조작된 단백질은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 프롤린 치환을 포함한다: A86P, A107P, A113P, T114P, V148P, S443P, D461P, L130P, L141P, K142P, E146P, L151P, N153P, V162P, A/D185P, D186P, L187P, K188P, N342P 및 A344P.
일부 측면에서, 조작된 단백질은 S376, G366 및/또는 S194에 상응하는 위치에서 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 S376T, G366S 및/또는 S194Q에 상응하는 치환을 포함한다.
일부 측면에서, 조작된 단백질은 K166에 상응하는 위치에서 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 K166E에 상응하는 치환을 포함한다.
일부 측면에서, 조작된 단백질은 H435에 상응하는 위치에서 pH 감도를 조절하는 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 H435E, H435D 또는 H435N에 상응하는 치환을 포함한다.
일부 측면에서, 조작된 단백질은 L66, L73, N145, Q195, E453, L66, K188, H368, D461, T49 및/또는 V262에 상응하는 위치에 정전기적 상호작용 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 L66N, L73E, N145E, Q195K, E453Q, L66D, K188R, H368R, D461E, T49E 및/또는 V262D에 상응하는 치환을 포함한다.
일부 측면에서, 조작된 단백질은 L110C, T127C, A140C, A147C, N153C, L219K, V231I, N322C, T365C, E453Q, 및/또는 V463C에 상응하는 치환을 포함한다.
일부 측면에서, 조작된 단백질은 T127C, N153C, A185P, T365C, V463C, L219K 및 V231I에 상응하는 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 T127C, N153C, A185P, T365C, V463C, L219K, V231I 및 RQSR(서열번호: 1-7 중 어느 하나의 잔기 99-102)에 상응하는 RRRR(서열번호: 10)로의 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 T127C, N153C, T365C, V463C, L219K 및 V231I에 상응하는 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 서열번호: 14 또는 16과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 조작된 단백질은 L110C, T127C, A140C, A147C, N153C, A185P, L219K, V231I, N322C, T365C, N368H, E453Q 및 V463C에 상응하는 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 L110C, T127C, A140C, A147C, N153C, A185P, L219K, V231I, N322C, T365C, N368H, E453Q, V463C, 및 RQSR(서열번호: 1-7 중 어느 하나의 잔기 99-102)에 상응하는 RRRR(서열번호: 10)로의 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 L110C, T127C, A140C, A147C, N153C, L219K, V231I, N322C, T365C, N368H, E453Q 및 V463C에 상응하는 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 서열번호: 15 또는 17과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 조작된 단백질은 서열번호: 1-7 중 어느 하나의 잔기 87-104에 상응하는 GGGGSGGGGSR(서열번호: 8)로의 치환을 포함한다.
일부 측면에서, 조작된 단백질은 표 1에 개시된 임의의 치환 세트를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 A/D185P에 상응하는 프롤린 치환과 조합하여 표 1에 개시된 임의의 치환 세트를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 RQSR(서열번호: 4-7 중 어느 하나의 잔기 99-102; 서열번호: 9)에 상응하는 RRRR(서열번호: 1-3 중 어느 하나의 잔기 99-102; 서열번호: 10)로의 치환과 조합하여 표 1에 개시된 임의의 치환 세트를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 A/D185P에 상응하는 프롤린 치환 및 RQSR(서열번호: 4-7 중 어느 하나의 잔기 99-102; 서열번호: 9)에 상응하는 RRRR(서열번호: 1-3 중 어느 하나의 잔기 99-102; 서열번호: 10)로의 치환과 조합하여 표 1에 개시된 임의의 치환 세트를 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 조작된 단백질은 적어도 하나의 조작된 디설파이드 결합, 적어도 하나의 공동 충전 치환 및 적어도 하나의 프롤린 치환의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, 조작된 단백질은 서열번호: 1-3 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는다. 일부 측면에서, 조작된 hMPV F 단백질 엑토도메인은 서열번호: 3과 95% 동일성을 갖는다.
일부 측면에서, 조작된 단백질은 삼량체화 도메인에 융합되거나 접합된다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 삼량체화 도메인에 융합되거나 접합된다. 일부 측면에서, 삼량체화 도메인은 T4 피브리틴 삼량체화 도메인을 포함한다.
일부 측면에서, 조작된 단백질은 막횡단 도메인에 융합되거나 접합된다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 막횡단 도메인에 융합된다. 일부 측면에서, 막횡단 도메인은 메타뉴모바이러스(MPV) F 단백질 막횡단 도메인을 포함한다.
일부 측면에서, 조작된 단백질은 N-말단 신호 서열을 포함한다. 일부 측면에서, N-말단 신호 서열은 MSWKVMIIISLLITPQHG (서열번호: 6 또는 7의 잔기 1-18; 서열번호: 11)이다. 일부 측면에서, N-말단 신호 서열은 MSWKVVIIFSLLITPQHG(서열번호: 1-5 중 어느 하나의 잔기 1-18)이다.
일 구현양태에서, 본 발명의 조작된 단백질 구현양태 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 서브유닛을 포함하는 조작된 메타뉴모바이러스(MPV) F 단백질 삼량체가 본원에서 제공된다. 일부 측면에서, 삼량체는 야생형 메타뉴모바이러스(MPV) F 서브유닛의 삼량체에 비해 융합전 입체형태로 안정화된다. 일부 측면에서, 삼량체는 서브유닛 사이에 적어도 하나의 조작된 디설파이드 결합을 포함한다. 일부 측면에서, 서브유닛 사이의 적어도 하나의 조작된 디설파이드 결합은 S316C 및 D421C에 상응하는 치환에 의해 형성된다.
일 구현양태에서, 약제학적으로 허용되는 담체; 및 (i) 본 발명의 조작된 단백질 구현양태 중 임의의 하나의 조작된 단백질, 또는 (ii) 조작된 삼량체 구현양태 중 임의의 하나의 조작된 삼량체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 일부 측면에서, 약제학적 조성물은 보조제를 추가로 포함한다.
일 구현양태에서, 본 발명의 조작된 단백질 구현양태 중 임의의 하나의 조작된 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자가 본원에 제공된다. 일부 측면에서, 핵산은 DNA 발현 벡터를 포함한다. 일부 측면에서, 핵산은 mRNA를 포함한다.
일 구현양태에서, 대상체에게 유효량의 본 약제학적 조성물 구현양태 중 임의의 하나의 약제학적 조성물 또는 본 핵산 분자 구현양태 중 임의의 하나의 핵산 분자을 투여하는 것을 포함하여, 대상체에서 메타뉴모바이러스(MPV) 감염 또는 메타뉴모바이러스 감염과 관련된 질병을 예방하는 방법이 본원에 제공된다.
일 구현양태에서, 항체에 결합된 본 구현양태 중 임의의 하나의 조작된 단백질을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직일 구현양태를 나타내지만 단지 예시로서 주어진다는 것을 이해해야 하는데, 이는 본 발명의 사상 및 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이기 때문이다.
다음 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 발명의 특정 측면을 추가로 설명하기 위해 포함된다. 본 발명은 본 명세서에 제시된 특정 구현양태의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조함으로써 더 잘 이해될 수 있다.
도 1a-b. hMPV F 안정화를 위한 유익한 치환. (도 1a) hMPV F 단백질의 엑토도메인의 개략도. 디설파이드 연결 및 N-글리코실화 부위가 강조 표시된다. F1과 F2의 시작과 끝을 나타내는 잔기 번호는 막대 아래에 표시된다. (도 1b) 융합전 입체형태에서 삼량체 hMPV F 엑토도메인의 측면도(PDB ID: 5WB0). 하나의 프로토머는 리본 다이어그램으로 표시되고 다른 두 개는 흰색 분자 표면으로 표시된다. 각 삽도는 치환이 위치한 항원 부위에 상응한다.
도 2a-d. 단일-치환 hMPV F 변이체의 특성화. (도 2a) SEC의 피크 분율의 곡선 아래 면적(AUC)에 의해 계산된, 정제된 개별 변이체의 상대적 발현. 변이체은 설계별로 분류된다. 가로 점선은 비교를 위해 100%로 정규화된 기본 구성물의 계산된 AUC 농도를 나타낸다. (도 2b) 설계별로 분류된 정제된 F 변이체의 크기 배제 크로마토그래피(SEC)(프롤린, 극성, 공동 충전 및 디설파이드). 수직 점선은 hMPV F 기본 구성물에 대한 피크 보유 부피를 나타낸다. (도 2c) 디설파이드 변이체의 열안정성의 시차 주사 형광측정(DSF) 분석. 수직 점선은 기본 구성물의 용융 온도를 나타낸다. (도 2d) hMPV F 기본 구성물 및 단일-치환 F 변이체의 SDS-PAGE 분석. 분자량 표준은 왼쪽에 kDa로 표시된다.
도 3a-d. 다양한 F 단백질 치환 변이체의 발현을 나타내는 전기영동 겔 이미지: (도 3a) 공동 돌연변이, (도 3b) 디설파이드 돌연변이, (도 3c) 프롤린 돌연변이, 및 (도 3D) 정전기 돌연변이. 분자량 표준은 왼쪽에 kDa로 표시된다.
도 4a-f. 다중-치환 hMPV F 변이체의 특성화. (도 4a-c) 반복의 3회 주기로부터의 정제된 다중-치환 hMPV F 변이체의 SEC. 수직 점선은 hMPV F 기본 구성물에 대한 피크 보유 부피를 나타낸다. (도 4d) 다중 치환 F 변이체의 열안정성의 DSF 분석. 수직 점선은 기본 구성물의 용융 온도를 나타낸다. (도 4e) FreeStyle 293-F 세포의 1L 배양물로부터 정제된 DS-CavEs2의 SEC 추적. (도 4f) 생물층 간섭계에 의해 측정된 MPE8 Fab에 대한 DS-CavEs2의 열처리 또는 장기 보관의 결합. 수직 점선은 회합 이벤트의 종료를 나타낸다. 비처리 DS-CavEs2가 대조군으로 포함되었다.
도 5. F 단백질 치환 변이체 열안정성의 시차 주사 형광측정법(DSF) 분석. 수직 점선은 JSM-1147의 첫 번째 용융 온도를 나타낸다.
도 6. 정제된 F 단백질 치환 변이체의 크기 배제 크로마토그래피. 수직 점선은 기본 구성물의 특성 피크 보유 부피를 나타낸다.
도 7a-c. 융합전-선호 항체 MPE8에 결합된 조작된 hMPV F 변이체. (도 7a) 리본 다이어그램으로 나타낸 MPE8 Fab에 결합된 hMPV F 변이체(DSx2)의 원자 모델의 측면도. MPE8 Fab의 상수 영역은 명확성을 위해 생략되었다. DSx2에서 두 개의 디설파이드 치환의 측쇄는 막대기로 강조 표시된다. (도 7b) F 단백질의 MPE8 경쇄 CDR 및 항원 부위 II/V의 결합 인터페이스의 확대도. (도 7c) MPE8 중쇄 CDR 및 F의 결합 인터페이스의 확대도. 투명한 표면으로 강조된 항원 부위 III에 대해 패킹된 CDR3의 주요 사슬. 극성 상호 작용을 형성하는 주요 잔기는 막대기로 표시된다.
도 8a-b. hMPV F DS-CavEs2의 구조는 융합전 입체형태를 나타낸다. (도 8a) 융합전 입체형태에서 아포(apo) hMPV F 변이체(DS-CavEs2)의 원자 모델의 측면도. 모델(내화 벽돌 리본)은 융합전 F 구조(은색 리본, PDB ID: 5WB0)와 중첩된다. 도입된 치환의 측쇄는 막대기로 강조 표시된다. 각 삽도는 중첩이 수행되는 항원 부위에 상응한다. (도 8b) MPE8 Fab와 복합체화된 DS-CavEs2의 대표적인 2D 클래스 평균.
도 9. 관련 PDB 구조 5WB0에 대한 hMPV F DSx2의 구조 비교. PDBID: 5WB0(hMPV F)의 단일 프로토머 및 hMPV F DSx2의 중첩.
도 1a-b. hMPV F 안정화를 위한 유익한 치환. (도 1a) hMPV F 단백질의 엑토도메인의 개략도. 디설파이드 연결 및 N-글리코실화 부위가 강조 표시된다. F1과 F2의 시작과 끝을 나타내는 잔기 번호는 막대 아래에 표시된다. (도 1b) 융합전 입체형태에서 삼량체 hMPV F 엑토도메인의 측면도(PDB ID: 5WB0). 하나의 프로토머는 리본 다이어그램으로 표시되고 다른 두 개는 흰색 분자 표면으로 표시된다. 각 삽도는 치환이 위치한 항원 부위에 상응한다.
도 2a-d. 단일-치환 hMPV F 변이체의 특성화. (도 2a) SEC의 피크 분율의 곡선 아래 면적(AUC)에 의해 계산된, 정제된 개별 변이체의 상대적 발현. 변이체은 설계별로 분류된다. 가로 점선은 비교를 위해 100%로 정규화된 기본 구성물의 계산된 AUC 농도를 나타낸다. (도 2b) 설계별로 분류된 정제된 F 변이체의 크기 배제 크로마토그래피(SEC)(프롤린, 극성, 공동 충전 및 디설파이드). 수직 점선은 hMPV F 기본 구성물에 대한 피크 보유 부피를 나타낸다. (도 2c) 디설파이드 변이체의 열안정성의 시차 주사 형광측정(DSF) 분석. 수직 점선은 기본 구성물의 용융 온도를 나타낸다. (도 2d) hMPV F 기본 구성물 및 단일-치환 F 변이체의 SDS-PAGE 분석. 분자량 표준은 왼쪽에 kDa로 표시된다.
도 3a-d. 다양한 F 단백질 치환 변이체의 발현을 나타내는 전기영동 겔 이미지: (도 3a) 공동 돌연변이, (도 3b) 디설파이드 돌연변이, (도 3c) 프롤린 돌연변이, 및 (도 3D) 정전기 돌연변이. 분자량 표준은 왼쪽에 kDa로 표시된다.
도 4a-f. 다중-치환 hMPV F 변이체의 특성화. (도 4a-c) 반복의 3회 주기로부터의 정제된 다중-치환 hMPV F 변이체의 SEC. 수직 점선은 hMPV F 기본 구성물에 대한 피크 보유 부피를 나타낸다. (도 4d) 다중 치환 F 변이체의 열안정성의 DSF 분석. 수직 점선은 기본 구성물의 용융 온도를 나타낸다. (도 4e) FreeStyle 293-F 세포의 1L 배양물로부터 정제된 DS-CavEs2의 SEC 추적. (도 4f) 생물층 간섭계에 의해 측정된 MPE8 Fab에 대한 DS-CavEs2의 열처리 또는 장기 보관의 결합. 수직 점선은 회합 이벤트의 종료를 나타낸다. 비처리 DS-CavEs2가 대조군으로 포함되었다.
도 5. F 단백질 치환 변이체 열안정성의 시차 주사 형광측정법(DSF) 분석. 수직 점선은 JSM-1147의 첫 번째 용융 온도를 나타낸다.
도 6. 정제된 F 단백질 치환 변이체의 크기 배제 크로마토그래피. 수직 점선은 기본 구성물의 특성 피크 보유 부피를 나타낸다.
도 7a-c. 융합전-선호 항체 MPE8에 결합된 조작된 hMPV F 변이체. (도 7a) 리본 다이어그램으로 나타낸 MPE8 Fab에 결합된 hMPV F 변이체(DSx2)의 원자 모델의 측면도. MPE8 Fab의 상수 영역은 명확성을 위해 생략되었다. DSx2에서 두 개의 디설파이드 치환의 측쇄는 막대기로 강조 표시된다. (도 7b) F 단백질의 MPE8 경쇄 CDR 및 항원 부위 II/V의 결합 인터페이스의 확대도. (도 7c) MPE8 중쇄 CDR 및 F의 결합 인터페이스의 확대도. 투명한 표면으로 강조된 항원 부위 III에 대해 패킹된 CDR3의 주요 사슬. 극성 상호 작용을 형성하는 주요 잔기는 막대기로 표시된다.
도 8a-b. hMPV F DS-CavEs2의 구조는 융합전 입체형태를 나타낸다. (도 8a) 융합전 입체형태에서 아포(apo) hMPV F 변이체(DS-CavEs2)의 원자 모델의 측면도. 모델(내화 벽돌 리본)은 융합전 F 구조(은색 리본, PDB ID: 5WB0)와 중첩된다. 도입된 치환의 측쇄는 막대기로 강조 표시된다. 각 삽도는 중첩이 수행되는 항원 부위에 상응한다. (도 8b) MPE8 Fab와 복합체화된 DS-CavEs2의 대표적인 2D 클래스 평균.
도 9. 관련 PDB 구조 5WB0에 대한 hMPV F DSx2의 구조 비교. PDBID: 5WB0(hMPV F)의 단일 프로토머 및 hMPV F DSx2의 중첩.
인간 메타뉴모바이러스(hMPV) 융합(F) 단백질은 바이러스 진입에 필수적이며 중화 항체 및 백신 개발의 핵심 표적이다. 융합전 입체형태는 최적의 백신 항원으로 생각되지만, 이전에 기재된 융합전 F 단백질은 불량하게 발현되고 잘 안정화되지 않았다. 여기서, hMPV F의 구조는 설계를 안내하고 조작된 hMPV F 단백질을 특성화하는 데 사용되었다. 일부 측면에서, 구현양태의 조작된 hMPV F 단백질은 막 융합 전에 존재하는 입체형태로 안정화된다. 이러한 조작된 단백질은, 예를 들어 항-hMPV F 단백질 특이적 면역 반응을 자극하기 위해 사용될 수 있다. 추가 측면에서, 조작된 F 단백질은 샘플에서 F 단백질 결합 항체를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본원에서 제공되는 조작된 단백질은 hMPV에 대한 백신화를 위한 보다 효과적인 방법을 허용할 뿐만 아니라 예를 들어 생물학적 샘플에서 항-hMPV F 단백질 항체를 검출하기 위한 새로운 검정 방법을 가능하게 한다.
I. 본 개시내용의 측면
다른 클래스 I 융합 단백질과 유사하게 hMPV F 단백질은 숙주 인자에 의해 쉽게 촉발되고 준안정성 융합전 상태에서 고도로 안정한 융합후 상태로 전이된다. DS-Cav1과 같은 백시노겐으로 융합전 안정화 단백질을 사용하는 것은 융합후 단백질을 사용하는 것과 비교하여 동물 모델에서 더 높은 중화 역가를 유발하는 것으로 입증되었다. 특히 전-후 전환 동안 상당한 입체형태 변화를 경험하는 영역에 한번에 하나씩 전략적으로 돌연변이를 도입하기 위한 지침으로서 hMPV F(PDB ID: 5WB0)의 융합전 구조를 영감을 받아 사용했다. 조작된 SARS-CoV-2 스파이크에 대한 최근의 성공과 마찬가지로, 다중 프롤린 치환은 융합전 입체형태에서 F를 유지하면서 단백질 발현을 증가시켰다. 융합 펩티드에서 A107P의 역할은 헥사프로(Hsieh et al., 2020)의 F817P 치환 역할과 상당히 유사하며, 이는 융합 펩티드에 강성을 부여하고 또한 융합전 입체형태에서 나선을 캡핑하는 것으로 보인다. 흥미롭게도, Ala를 RSV F 상의 동등한 잔기인 Phe로 대체하면, 기본 구성물에 비해 단백질 발현이 약간 감소했다(표 1). HRB에서 D461P는 또한 융합 펩티드 내에서 가장 효과적인 프롤린 치환인 A107P 또는 A113P와 동일한 기능을 할 수 있다. 단백질 수율을 증가시키는 항원 부위 V에는 3개의 프롤린 치환이 있다. 이러한 잔기의 측쇄가 삼량체 표면에 부분적으로 노출된다는 점을 감안할 때, 이들은 백신 항원에 대해 차선책으로 간주된다.
인터-프로토머 또는 인터-서브유닛 염다리의 구현은 인트라-프로토머 염다리보다 더 효과적인 방식으로 삼량체 바이러스 단백질을 상대적으로 콤팩트한 입체형태로 효율적으로 유지하는 경향이 있다. 예를 들어, gp41의 K588E 돌연변이는 gp120의 K62 또는 K492와 정전기적으로 상호작용하여 HIV-1 Env가 융합전, 폐쇄 입체형태를 유지하도록 선호한다(Rutten et al., 2018). 현재 설계 중에서, F1 서브유닛의 L219K 치환은 F2 서브유닛의 E80 또는 F1 서브유닛의 D209와 염다리를 형성할 수 있고; F2 서브유닛로부터의 73E 치환은 또한 인접한 F1 서브유닛으로부터의 R198과 염다리를 형성할 수 있다. 두 변이체는 모두 발현을 촉진하고 SEC에서 더 긴 체류 시간을 가지므로 클래스 I 융합 단백질에 대한 염다리 설계의 역할이 놀랍도록 유사하다. 한편, 변이체 N145E와 같은 인트라-프로토머 염다리 설계는 hMPV F의 발현을 없앴다(표 1). 마찬가지로, 이러한 유형의 염다리는 SARS-CoV-2 스파이크를 안정화하는 데 잘 작동하지 않았다. 프로토머 인터페이스에서 전하 클러스터로 인한 반발 감소는 삼량체의 개방을 방지하는 또 다른 접근 방식이다. 전하 클러스터(E453/D454)는 삼량체의 염기에 근접한 HRB 영역에서 발견되었다. 따라서 Glu453을 등전자 Gln으로 대체하면 음으로 하전된 클러스터로 인한 전하 반발을 감소시킬 수 있다. RSV F의 E487Q 치환 또는 에볼라 GP의 K588F 치환(McLellan et al., 2013; Rutten et al., 2020)과 유사하게, 이 변이체는 hMPV F를 보다 컴팩트한 삼량체로 만들었고 SEC 용출 프로필에 의한 증거로 천연 4차 구조를 유지했다(도 2b).
공동 충전 접근법은 또한 융합전 입체형태에서 느슨하게 패킹된 바이러스 단백질을 안정화시키는데 매우 효과적이었다. 예를 들어, Cav1 변이체에서 S190F 치환은 부위 V와 부위 II 사이의 공동을 잘 채우고; CH2가 하나만 첨가된 V207L 치환은 부위 φ 사이의 포켓을 잘 채운다. 발현이 가장 높은 변이체 중 하나인 V231I는 놀랍게도 도메인 IIIb(부위 II)에 위치하며, 이 영역은 전-후 전이 동안 입체형태 변화를 겪지 않는다. 다른 2개의 치환(S149I, I137L)은 도메인 IIIa(부위 V)에 위치한 발현을 증폭시켰고 겉보기에는 매우 유연한 α2 및 β3을 안정화하기 위해 서로 밀집되어 있는 것으로 보인다.
hMPV F를 안정화시키기 위해 사용되는 전략 중에서, 아마도 디설파이드 결합의 도입이 가장 높은 성공률을 제공할 것이다. L110C/N322C 치환은 중앙 공동에 융합 펩티드를 포획하도록 설계되었고, T365C/V463C 치환은 막 근위 영역에서 HRB를 잠그도록 설계되었다. 융합 펩티드 또는 HRB를 전-후 전환 동안 일정하게 유지되는 영역에 부착함으로써, F 단백질은 융합전 입체형태로 유지되었고 열 안정성이 크게 향상되었다. 이 접근법은 여러 클래스 I 바이러스 융합 단백질에 성공적으로 사용되었다(McLellan et al., 2013; Stewart-Jones et al., 2018; Sanders et al., 2013). 이 설계는 RSV F의 DS 변종과 HIV-1 Env의 SOSIP를 연상시킨다. 대조적으로, T127C/N153C 또는 A140C/A147C 치환은 다른 유형의 디설파이드물 설계 전략을 나타낸다. 이러한 디설파이드 결합은 입체형태 변화를 겪는 영역(예를 들어, 도메인 IIIa(부위 V))에 배치되지만, 중앙 나선 근처에서 HRA의 재접힘을 방지하여 융합전 상태를 안정화하는 것으로 보인다. 이는 우엔자 바이러스 3 F 단백질에 사용된 Q162C/L168C 치환과 유사하며(Stewart-Jones et al., 2018), 이러한 유형의 디설파이드 설계가 클래스 I 바이러스 융합 단백질을 안정화하기 위한 일반적인 접근법일 수 있음을 시사한다. 그들은 HRA의 재접힘을 방지하고 잠재적으로 융합전 입체형태로 다시 접히도록 강제할 수 있다. 전-후 전환 동안 입체형태 변화를 겪고 있는 지역에서 2차 구조의 국소적 유연성을 제한하기 위한 유사한 디설파이드 설계도 SARS-CoV-2 스파이크에 성공적으로 적용되었다. 흥미롭게도 V104C/N457C 치환은 F가 푸린 프로테아제 소화를 방지하여 SDS-PAGE에서 F0의 단일 종을 생성한다. 융합 펩티드에 근접한 푸린 절단 부위는 디설파이드 설계로 인해 중앙 공동에 묻힐 수 있다. 이 변이체는 백신 항원의 프로테아제 없는 생산에 실용적일 수 있다.
단백질 발현 및 안정성을 증가시키는 다수의 유익한 변형을 조합하는 것은 최적화된 융합전 항원을 생성하기 위한 효과적인 전략인 것으로 입증되었다(Joyce et al., 2016; Krarup et al., 2015; McLellan et al., 2013; Rutten et al., 2020; Rutten et al., 2018; Jiachen et al., 2021; Hsieh et al., 2020). 여기에서 여러 유익한 변형을 조합하여 최고의 구성물 중 하나인 DS-CavEs2를 만들었고, 이는 디설파이드 결합, CAVity 충전 및 정전기 안정화 설계가 포함되어 있다. DS-CavEs2는 단백질 발현이 10배 더 높고 열 안정성이 향상되었으며 열 스트레스 및 4℃에서 장기 보관 후에도 융합전 에피토프를 유지한다. 부위 V에서의 2개의 디설파이드 치환, 부위 II에서의 공동-충전 치환 및 융합 펩티드에 근접한 또 다른 디설파이드 결합의 도입은 hMPV F의 막 원위 절반의 입체형태를 교란시키지 않았으며(도 8a), 이는 RSV에서 F는 가장 강력한 중화 에피토프를 보유하고 있다(Graham et al., 2017; Gilman et al., 2016). 반대로 T365C/V463C 치환은 α10 나선의 상대 위치를 변경했다. 그러나, 이 막 근위 영역은 면역원성일 가능성이 적고 RSV F에서 이 영역을 표적으로 하는 중화 항체는 발견되지 않았다.
푸린 부위가 유연한 글리신-세린(GS) 링커 또는 폴리글리신 링커로 대체된 또 다른 버전의 DS-CavEs2는 융합전 F 삼량체의 단일 사슬 형태를 생성한다. 일부 구현양태에서, 링커는 서열 GGSGGS(서열번호: 12) 또는 GGGGGG(서열번호: 13)를 갖는다. 푸린 프로테아제가 재조합적으로 이 구성물을 만드는 데 필요하지 않다는 점을 감안할 때, 이 설계는 백신 항원의 산업적 생산에 더 비용-효율적일 수 있다.
특히, 융합전-안정화 F 구성물 둘 모두는 인접한 프로토머에 걸쳐 있는 에피토프를 인식하는 MPE8과 복합체화될 때에도 단량체로서 결정화되었다. 다른 군은 또한 상이한 항원 부위를 인식하는 항체에 결합된 결정화된 단량체 hMPV F를 가지고 있다(Huang et al., 2020; Wen et al., 2012). 삼량체 F 입자가 nsEM에 의해 가시화될 수 있다는 점을 고려하면(도 8b), 이들 데이터는 hMPV F 삼량체가 삼량체화 모티프에 융합될 때에도 해리된 단량체와 평형 상태에 있음을 시사한다. 이는 여러 클래스 I 바이러스 융합 단백질이 삼량체 개방 또는 "호흡"을 겪고, 인플루엔자 HA 및 hMPV F의 삼량체 인터페이스에 결합하는 자연 발생 항체가 분리되었음을 보여주는 최근 결과와 일치한다(Bangaru et al., 2019; Watanabe et al., 2019; Gilman et al., 2019).
융합전 안정화 클래스 I 바이러스 융합 단백질은 동물 및 인간에서 종종 융합후 항원에 의해 유도된 것보다 훨씬 더 높은 차수로 높은 중화 항체 역가를 유도하는 것으로 알려져 있다(Crank et al., 2019; McLellan et al., 2013; Stewart-Jones et al., 2018). 이전 연구에서는 융합전 및 융합후 hMPV F 단백질의 면역원성에 거의 차이가 없는 것으로 나타났지만(Battles et al., 2017), 이러한 연구는 10 μg 항원 용량과 현재 융합후 입체형태를 아직 채택하지 않은 융합전-유사 단백질의 일부의 양으로 오염된 것으로 알려진 융합후 F 단백질로 수행되었다. 융합전- 안정화 hMPV F 항원은 융합후 F 단백질보다 마우스에서 더 높은 중화 항체 역가를 유도할 것으로 예상된다. 이러한 결과는 이전 hMPV F 연구보다 융합전-안정화된 바이러스 단백질의 다른 면역원성 연구와 더 일치할 것이다(Crank et al., 2019; van den Hoogen et al., 2002; Stewart-Jones et al., 2018). 본원에 개시된 안정화된 단백질은 hMPV F 백신 후보의 개발을 가속화하고 고위험 코호트의 수동적 예방에 사용할 수 있는 강력하고 광범위하게 반응하는 모노클로날 항체의 분리를 촉진해야 한다.
II. 정의
전술한 일반적인 설명 및 다음의 상세한 설명은 단지 예시적이고 설명을 위한 것이며 청구된 본 발명을 제한하지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본 출원에서 단수의 사용은 특별히 달리 언급하지 않는 한 복수를 포함한다. 본 출원에서 "또는"의 사용은 달리 명시되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 또한, "포함하는" 및 "포함하다"와 같은 다른 형태 뿐만 아니라 "포함하는"이라는 용어의 사용은 제한적이지 않다. 또한, "요소" 또는 "성분"과 같은 용어는 달리 구체적으로 언급되지 않는 한 하나의 단위를 포함하는 요소 및 성분과 하나 이상의 하위 단위를 포함하는 요소 및 성분을 모두 포함한다. 또한, "부분"이라는 용어의 사용은 모이어티의 일부 또는 전체 모이어티를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "하나"는 하나 이상을 의미할 수 있다. 청구항(들)에서 사용된 바와 같이, "포함하는"이라는 단어와 함께 사용되는 경우, 단어 "하나"는 하나 이상을 의미할 수 있다.
청구범위에서 "또는"이라는 용어의 사용은 본 개시내용은 대안 및 "및/또는"만을 언급하는 정의를 지원하지만, 명시적으로 대안만을 언급하거나 대안이 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 데 사용된다. 본원에서 사용된 "다른"은 적어도 제 2 이상을 의미할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "약"은 양, 지속 시간 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 특정 값으로부터 ±10%까지의 변동을 포함하는 것을 의미한다. 달리 나타내지 않는 한, 명세서 및 청구범위에 사용된 성분, 분자량, 반응 조건 등과 같은 특성의 양을 나타내는 모든 숫자는 모든 경우에 "약"이라는 용어로 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 나타내지 않는 한, 하기 명세서 및 첨부된 청구범위에 기재된 수치적 매개변수는 개시된 주제에 의해 얻고자 하는 원하는 특성에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 최소한, 청구 범위에 대한 등가 원칙의 적용을 제한하려는 시도가 아니라, 각각의 수치 매개변수는 적어도 보고된 유효 숫자의 수에 비추어 일반적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다. 본 발명의 넓은 범위를 설명하는 수치 범위 및 매개변수가 근사치임에도 불구하고, 특정 실시예에 설명된 수치 값은 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나 모든 수치에는 각각의 테스트 측정에서 발견된 표준 편차로 인해 필연적으로 발생하는 특정 오류가 본질적으로 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "본질적으로 없는"은 특정 성분과 관련하여 본원에서 특정 성분 중 어느 것도 조성물로 의도적으로 제형화되지 않았고/않거나 오염 물질로서 또는 미량으로만 존재함을 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. 따라서 조성물의 임의의 의도하지 않은 오염으로 인한 특정 성분의 총량은 0.05% 미만, 바람직하게는 0.01% 미만이다. 가장 바람직한 것은 특정 성분의 양이 표준 분석 방법으로 검출될 수 없는 조성물이다.
용어 "항체"는 표적 항원에 대한 특이적 결합을 위해 온전한 항체와 경쟁할 수 있는 임의의 이소타입의 온전한 면역글로불린 또는 이의 단편을 말하며, 예를 들어 키메라, 인간화, 완전 인간 및 이중특이성 항체를 포함한다. "항체"는 항원 결합 단백질의 종이다. 온전한 항체는 일반적으로 적어도 2개의 전장 중쇄 및 2개의 전장 경쇄를 포함할 것이지만, 일부 경우에는 중쇄만을 포함할 수 있는 낙타에서 자연적으로 발생하는 항체와 같이 더 적은 수의 사슬을 포함할 수 있다. 항체는 단일 공급원으로부터만 유래될 수 있거나 "키메라"일 수 있으며 즉, 항체의 다른 부분이 아래에서 추가로 설명되는 두 개의 다른 항체에서 유래될 수 있다. 항원 결합 단백질, 항체 또는 결합 단편은 하이브리도마에서 재조합 DNA 기술에 의해 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다. 달리 나타내지 않는 한, 용어 "항체"는 2개의 전장 중쇄 및 2개의 전장 경쇄를 포함하는 항체에 더하여 이의 유도체, 변이체, 단편 및 뮤테인을 포함하며, 그의 예는 하기에 기재되어 있다. 또한, 명시적으로 배제되지 않는 한, 항체는 모노클로날 항체, 이중특이성 항체, 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체(때때로 본원에서 "항체 모방체"로 지칭), 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체 융합체(때때로 본원에서 "항체 접합체"로 지칭) 및 이의 단편을 포함한다. 일부 구현양태에서, 상기 용어는 또한 펩티바디를 포함한다.
자연 발생 항체 구조 단위는 전형적으로 사량체를 포함한다. 이러한 각각의 사량체는 일반적으로 2개의 동일한 폴리펩티드 사슬 쌍으로 구성되며, 각 쌍은 하나의 전장 "경쇄"(특정 구현양태에서, 약 25 kDa) 및 하나의 전장 "중쇄"(특정 구현양태에서, 약 50 kDa-70 kDa)를 갖는다. 각 사슬의 아미노-말단 부분은 전형적으로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각 사슬의 카복시-말단 부분은 전형적으로 이펙터 기능을 담당할 수 있는 불변 영역을 정의한다. 인간 경쇄는 전형적으로 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 중쇄는 전형적으로 mu, 델타, 감마, 알파 또는 엡실론으로 분류되며 항체의 이소타입을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 정의한다. IgG에는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하되 이에 제한되지 않는 여러 하위클래스가 있다. IgM에는 IgM1 및 IgM2를 포함하되 이에 제한되지 않는 하위클래스가 있다. IgA는 유사하게 IgA1 및 IgA2를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하위클래스로 세분된다. 전장 경쇄 및 중쇄 내에서, 전형적으로 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 결합되며, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다(Fundamental Immunology, Ch. 7, Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989), 모든 목적을 위해 전체적으로 참조로 포함된다). 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 전형적으로 항원 결합 부위를 형성한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 일부를 지칭하며, 전형적으로 중쇄에서 약 120 내지 130개의 아미노산의 아미노-말단 및 경쇄에서 약 100 내지 100개의 아미노-말단 아미노산을 포함한다. 특정 구현양태에서, 상이한 항체의 가변 영역은 동일한 종의 항체 사이에서도 아미노산 서열이 광범위하게 상이하다. 항체의 가변 영역은 전형적으로 표적에 대한 특정 항체의 특이성을 결정한다.
가변 영역은 전형적으로 상보성 결정 영역 또는 CDR로도 불리는 3개의 초가변 영역에 의해 결합된 상대적으로 보존된 프레임워크 영역(FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. 각 쌍의 두 사슬로부터의 CDR은 일반적으로 특정 에피토프에 결합할 수 있는 프레임워크 영역에 의해 정렬된다. N-말단에서 C-말단까지, 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 전형적으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 도메인에 대한 아미노산의 지정은 전형적으로 면역학적 관심 단백질의 카밧(Kabat) 서열의 정의에 따른다(National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 및 1991)), Chothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987) 또는 Chothia et al., Nature, 342:878-883 (1989)).
특정 구현양태에서, 항체 중쇄는 항체 경쇄의 부재 하에 항원에 결합한다. 특정 구현양태에서, 항체 경쇄는 항체 중쇄의 부재 하에 항원에 결합한다. 특정 구현양태에서, 항체 결합 영역은 항체 경쇄의 부재 하에 항원에 결합한다. 특정 구현양태에서, 항체 결합 영역은 항체 중쇄의 부재하에 항원에 결합한다. 특정 구현양태에서, 개별 가변 영역은 다른 가변 영역의 부재하에 항원에 특이적으로 결합한다.
특정 구현양태에서, CDR의 명확한 묘사 및 항체의 결합 부위를 포함하는 잔기의 식별은 항체의 구조를 해결하고/하거나 항체-리간드 복합체의 구조를 해결함으로써 달성된다. 특정 구현양태에서, 이는 X-선 결정학과 같은 당업자에게 공지된 임의의 다양한 기술에 의해 달성될 수 있다. 특정 구현양태에서, 다양한 분석 방법을 사용하여 CDR 영역을 식별하거나 근사화할 수 있다. 이러한 방법의 예에는 카밧(Kabat) 정의, 초티아(Chothia) 정의, AbM 정의 및 접촉 정의가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
카밧 정의는 항체의 잔기 번호를 매기기 위한 표준이며 전형적으로 CDR 영역을 식별하는 데 사용된다(Johnson & Wu, Nucleic Acids Res., 28: 214-8 (2000)). 초티아 정의는 카밧 정의와 유사하지만 초티아 정의는 특정 구조 루프 영역의 위치를 고려한다(Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901-17 (1986); Chothia et al., Nature, 342: 877-83 (1989)). AbM 정의는 항체 구조를 모델링하는 옥스포드 분자 그룹(Oxford Molecular Group)에서 생산한 컴퓨터 프로그램의 통합 제품군을 사용한다(Martin et al., Proc Natl Acad Sci (USA), 86:9268-9272 (1989); "AbMTM, A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies," Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd). AbM 정의는 지식 데이터베이스와 처음부터(ab initio) 방법의 조합을 사용하여 일차 서열로부터 항체의 삼차 구조를 모델링한다(Samudrala et al., "Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach," in PROTEINS, Structure, Function and Genetics Suppl., 3:194-198 (1999)). 접촉 정의는 사용가능한 복잡한 결정 구조의 분석을 기반으로 한다(MacCallum et al., J. Mol. Biol., 5:732-45 (1996)).
통상적으로, 중쇄에서 CDR 영역은 전형적으로 H1, H2 및 H3으로 지칭되고 아미노 말단에서 카복시 말단 방향으로 순차적으로 번호가 매겨진다. 경쇄에서 CDR 영역은 전형적으로 L1, L2 및 L3으로 지칭되며 아미노 말단에서 카복시 말단 방향으로 순차적으로 번호가 매겨진다.
용어 "경쇄"는 결합 특이성을 부여하기에 충분한 가변 영역 서열을 갖는 전장 경쇄 및 이의 단편을 포함한다. 전장 경쇄는 가변 영역 도메인, VL 및 불변 영역 도메인, CL을 포함한다. 경쇄의 가변 영역 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 있다. 경쇄에는 카파 사슬과 람다 사슬이 포함된다.
용어 "중쇄"는 결합 특이성을 부여하기에 충분한 가변 영역 서열을 갖는 전장 중쇄 및 이의 단편을 포함한다. 전장 중쇄는 가변 영역 도메인, VH, 및 3개의 불변 영역 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. VH 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 있고, CH 도메인은 카복실-말단에 있으며, CH3는 폴리펩티드의 카복시-말단에 가장 가깝다. 중쇄는 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 하위유형 포함), IgA(IgA1 및 IgA2 하위유형 포함), IgM 및 IgE를 포함하는 모든 이소타입일 수 있다.
이중특이적 또는 이중작용성 항체는 전형적으로 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다. 이중특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다(Songsivilai et al., Clin. Exp. Immunol., 79: 315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-1553 (1992)).
용어 "항원"은 적응 면역반응을 유도할 수 있는 물질을 의미한다. 구체적으로, 항원은 적응 면역반응 수용체의 표적이 되는 물질이다. 전형적으로, 항원은 항원-특이적 수용체에 결합하지만 자체적으로 체내에서 면역 반응을 유도할 수 없는 분자이다. 항원은 일반적으로 단백질과 다당류이며 드물게 지질도 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 항원은 또한 면역원 및 합텐을 포함한다.
"Fc" 영역은 항체의 CH1 및 CH2 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 단편을 포함한다. 2개의 중쇄 단편은 2개 이상의 디설파이드 결합 및 CH3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 함께 유지된다.
"Fv 영역"은 중쇄 및 경쇄 모두로부터의 가변 영역을 포함하지만 불변 영역은 결여되어 있다.
특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 "특이적으로 결합"하거나 "특이적"인 항체는 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않고 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 항체이다. 예를 들어, 본 발명의 hMPV F 단백질 특이적 항체는 hMPV F 단백질에 특이적이다. 일부 구현양태에서, hMPV F 단백질에 결합하는 항체는 해리 상수(Kd)가 ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM 또는 ≤0.001 nM(예를 들어, 10-8M 이하, 예를 들어 10-8M 내지 10-13M, 예를 들어 10-9M 내지 10-13M)이다.
동일한 에피토프에 대해 경쟁하는 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)의 맥락에서 사용될 때 "경쟁하다"라는 용어는 테스트되는 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)이 공통 항원(예를 들어, hMPV F 또는 이의 단편)에 대한 참조 항원 결합 단백질(예를 들어, 리간드 또는 참조 항체)의 특이적 결합을 방지하거나 억제(예를 들어, 감소)시키는 검정에 의해 결정되는 바와 같이 항원 결합 단백질 간의 경쟁을 의미한다. 하나의 항원 결합 단백질이 다른 항원 결합 단백질과 경쟁하는지 여부를 결정하기 위해 다양한 유형의 경쟁적 결합 검정이 사용될 수 있다: 예를 들어, 고체 상 직접 또는 간접 방사면역검정(RIA), 고체 상 직접 또는 간접 효소 면역검정(EIA), 샌드위치 경쟁 검정(Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253); 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA(Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619); 고체 상 직접 표지 검정, 고체 상 직접 표지 샌드위치 검정(Harlow 및 Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); 1-125 표지를 사용하는 고체 상 직접 표지 RIA(Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15); 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA(Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552); 및 직접 표지된 RIA(Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82). 전형적으로, 이러한 검정은 표지되지 않은 테스트 항원 결합 단백질 및 표지된 참조 항원 결합 단백질 중 하나를 보유하는 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원의 사용을 포함한다. 경쟁적 억제는 테스트 항원 결합 단백질의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정된다. 일반적으로 테스트 항원 결합 단백질은 과량으로 존재한다. 경쟁 검정(항원 결합 단백질의 경쟁)에 의해 식별된 항원 결합 단백질은 참조 항원 결합 단백질과 동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질 및 발생할 입체 장애에 대해 참조 항원 결합 단백질에 의해 결합된 에피토프에 충분히 근접한 인접한 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질을 포함한다. 경쟁적 결합을 결정하는 방법에 관한 추가 세부 사항은 본원의 실시예에서 제공된다. 일반적으로 경쟁하는 항원 결합 단백질이 과량으로 존재할 때, 공통 항원에 대한 참조 항원 결합 단백질의 특이적 결합을 적어도 40-45%, 45-50%, 50-55% 억제, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% 또는 75% 이상 억제(예를 들어, 감소)할 것이다. 일부 경우에는 결합이 적어도 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97% 또는 97% 이상 억제된다.
본원에서 사용되는 용어 "에피토프"는 항체가 결합하는 항원 상의 원자 또는 아미노산의 특정 기를 의미한다. 에피토프는 선형 에피토프 또는 입체형태적 에피토프일 수 있다. 선형 에피토프는 항원의 연속적인 아미노산 서열에 의해 형성되며 1차 구조를 기반으로 항체와 상호 작용한다. 반면 입체형태적 에피토프는 항원의 아미노산 서열의 불연속적인 부분으로 구성되며 항원의 3차원 구조를 기반으로 항체와 상호 작용한다. 일반적으로 에피토프는 대략 5개 또는 6개의 아미노산 길이이다. 항원에 대해 경쟁적 결합을 나타내는 경우, 2개의 항체가 항원 내의 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
용어 "숙주 세포"는 핵산 서열로 형질전환되었거나 형질전환될 수 있고 이로써 관심 유전자를 발현하는 세포를 의미한다. 이 용어는 관심 유전자가 존재하는 한, 자손이 원래 모세포와 형태 또는 유전적 구성이 동일한지 여부에 관계없이 모세포의 자손을 포함한다.
용어 "동일성"은 서열을 정렬하고 비교함으로써 결정되는 바와 같이, 2개 이상의 폴리펩티드 분자 또는 2개 이상의 핵산 분자의 서열 사이의 관계를 의미한다. "퍼센트 동일성"은 비교되는 분자에서 아미노산 또는 뉴클레오티드 사이의 동일한 잔기의 백분율을 의미하며 비교되는 가장 작은 분자의 크기를 기준으로 계산된다. 이러한 계산을 위해 정렬의 갭(있는 경우)은 바람직하게는 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램(즉, "알고리즘")에 의해 처리된다. 정렬된 핵산 또는 폴리펩티드의 동일성을 계산하기 위해 사용될 수 있는 방법은 문헌에 기술된 것을 포함한다(Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., 및 Griffin, H. G., eds., 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. 및 Devereux, J., eds., 1991, New York: M. Stockton Press; 및 Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073).
퍼센트 동일성을 계산할 때, 비교되는 서열은 일반적으로 서열 간에 가장 큰 일치를 제공하는 방식으로 정렬된다. 퍼센트 동일성을 결정하는데 사용될 수 있는 컴퓨터 프로그램의 한 예는 GCG 프로그램 패키지이며, 이는 GAP를 포함한다(Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.). 컴퓨터 알고리즘 GAP는 퍼센트 서열 동일성이 결정될 2개의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 정렬하는데 사용된다. 서열은 각각의 아미노산 또는 뉴클레오티드의 최적 일치를 위해 정렬된다(알고리즘에 의해 결정되는 "일치 범위"). 갭 오프닝 페널티(평균 대각선의 3배로 계산되며, 여기서 "평균 대각선"은 사용되는 비교 매트릭스의 대각선의 평균이다; "대각선"은 특정 비교 매트릭스에 의해 각각의 완벽한 아미노산 일치에 할당된 점수 또는 숫자이다) 및 갭 확장 페널티(일반적으로 갭 오프닝 페널티의 1/10배) 뿐만 아니라 PAM 250 또는 BLOSUM 62와 같은 비교 매트릭스가 알고리즘과 함께 사용된다. 특정 구현양태에서, 표준 비교 매트릭스(Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 for the PAM 250 comparison matrix; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919 for the BLOSUM 62 comparison matrix)도 알고리즘에 의해 사용된다.
GAP 프로그램을 사용하여 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열에 대한 퍼센트 동일성을 결정하는데 사용될 수 있는 매개변수의 예는 문헌에 기재되어 있다(Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453).
2개의 아미노산 서열을 정렬하기 위한 특정 정렬 체계는 2개의 서열 중 짧은 영역의 일치만을 초래할 수 있으며, 이 작은 정렬 영역은 2개의 전장 서열 사이에 유의미한 관계가 없더라도 매우 높은 서열 동일성을 가질 수 있다. 따라서, 선택된 정렬 방법(GAP 프로그램)은 표적 폴리펩티드의 적어도 50개 또는 다른 수의 인접 아미노산에 걸친 정렬을 초래하기 위해 원한다면 조정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "연결"은 분자내 상호작용, 예를 들어 공유 결합, 금속 결합 및/또는 이온 결합, 또는 분자간 상호작용, 예를 들어 수소 결합 또는 비공유 결합을 통한 회합을 지칭한다.
"작동가능하게 연결된"이라는 용어는 설명된 성분이 일반적인 기능을 수행하도록 구성되는 요소의 배열을 의미한다. 따라서, 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 주어진 신호 펩티드는 세포로부터 폴리펩티드의 분비를 지시한다. 프로모터의 경우, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터는 코딩 서열의 발현을 지시할 것이다. 프로모터 또는 다른 제어 요소는 코딩 서열의 발현을 지시하는 기능을 하는 한, 코딩 서열과 인접할 필요가 없다. 예를 들어, 번역되지는 않았지만 전사된 서열이 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 존재할 수 있고, 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 단일 가닥 및 이중 가닥 뉴클레오티드 중합체를 모두 포함한다. 폴리뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 변형된 형태의 뉴클레오티드 유형일 수 있다. 상기 변형은 브로모우리딘 및 이노신 유도체와 같은 염기 변형, 2',3'-디데옥시리보스와 같은 리보스 변형, 및 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐라데이트 및 포스포로아미데이트와 같은 뉴클레오티드간 결합 변형을 포함한다.
본원에서 사용되는 "벡터"는 숙주 세포에 도입되어 형질전환된 숙주 세포를 생성하는 핵산 분자를 의미한다. 벡터는 복제 원점과 같이 숙주 세포에서 복제할 수 있도록 허용하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 하나 이상의 치료 유전자 및/또는 선별 마커 유전자 및 당업계에 공지된 다른 유전적 요소를 포함할 수 있다. 벡터는 세포를 형질도입, 형질전환 또는 감염시켜 세포가 고유의 핵산이외에 핵산 및/또는 단백질을 발현하도록 할 수 있다. 벡터는 임의로 바이러스 입자, 리포좀, 단백질 코팅 등과 같이 핵산이 세포로 들어가는 것을 돕는 물질을 포함한다.
용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 천연 단백질, 즉 자연 발생 및 비재조합 세포에 의해 생성된 단백질의 아미노산 서열을 갖는 거대분자를 의미하거나; 또는 유전자 조작 또는 재조합 세포에 의해 생산되고, 천연 단백질의 아미노산 서열을 갖는 분자, 또는 천연 서열의 하나 이상의 아미노산의 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 분자를 포함한다. 이 용어는 또한 하나 이상의 아미노산이 상응하는 자연 발생 아미노산 및 중합체의 화학적 유사체인 아미노산 중합체를 포함한다. 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 구체적으로 hMPV F 단백질 결합 단백질, 항체, 또는 항원-결합 단백질의 하나 이상의 아미노산의 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 서열을 포함한다. 용어 "폴리펩티드 단편"은 전장의 천연 단백질과 비교하여 아미노-말단 결실, 카복실-말단 결실 및/또는 내부 결실을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 단편은 천연 단백질과 비교하여 변형된 아미노산을 포함할 수도 있다. 특정 구현양태에서, 단편은 약 5개 내지 500개 아미노산 길이이다. 예를 들어, 단편은 적어도 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 또는 450개 아미노산 길이일 수 있다. 유용한 폴리펩티드 단편은 결합 도메인을 포함하는 항체의 면역학적 기능성 단편을 포함한다. hMPV F 단백질-결합 항체의 경우, 유용한 단편은 CDR 영역, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인, 항체 사슬의 일부 또는 2개의 CDR을 포함하는 단지 이의 가변 영역 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 유용한 약제학적으로 허용되는 담체는 통상적이다. 문헌은 본원에 개시된 융합 단백질의 약제학적 전달에 적합한 조성물 및 제형을 기술한다(Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)). 일반적으로 담체의 특성은 사용되는 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 비경구 제형은 일반적으로 비히클로서 물, 생리 식염수, 균형 염 용액, 수성 덱스트로스, 글리세롤 등과 같은 약제학적 및 생리학적으로 허용되는 유체를 포함하는 주사가능한 유체를 포함한다. 고체 조성물(예를 들어, 분말, 알약, 정제 또는 캡슐 형태)의 경우, 통상적인 무독성 고체 담체는, 예를 들어 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분 또는 마그네슘 스테아레이트를 포함할 수 있다. 생물학적으로 중성인 담체 이외에, 투여될 약제학적 조성물은 습윤제 또는 유화제, 방부제 및 pH 완충제 등과 같은 소량의 무독성 보조 물질, 예를 들어 나트륨 아세테이트 또는 소르비탄 모노라우레이트를 함유할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 인간 또는 임의의 비인간 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)을 지칭한다. 인간은 출생 전 형태와 출생 후 형태를 포함한다. 많은 구현양태에서, 대상체는 인간이다. 대상체는 질병의 진단 또는 치료를 위해 의료 제공자에게 제시하는 인간을 지칭하는 환자일 수 있다. 용어 "대상체"는 본원에서 "개체" 또는 "환자"와 상호교환적으로 사용된다. 대상체는 질병 또는 장애에 걸리거나 걸리기 쉬울 수 있지만 질병 또는 장애의 증상을 나타내거나 나타내지 않을 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "치료적 유효량" 또는 "유효 투여량"은 질병 또는 상태를 치료하는데 효과적인 약물의 투여량 또는 농도를 의미한다. 예를 들어, 바이러스 감염을 치료하기 위한 본원에 개시된 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 사용에 관하여.
본원에서 사용되는 상태의 "치료하는" 또는 "치료"는 상태를 예방 또는 완화하고, 상태의 개시 또는 발달 속도를 늦추고, 상태가 발생할 위험을 감소시키고, 상태와 관련된 증상의 발달을 예방하거나 지연시키고, 상태와 관련된 증상을 감소 또는 종료시키고, 상태의 완전한 또는 부분적 퇴행을 생성하고, 상태를 치료하고 또는 이들의 일부 조합을 포함한다.
III. hMPV F 단백질
인간 메타뉴모바이러스(hMPV)는 뉴모바이러스(Pneumoviridae)과의 네가티브-센스 외피 바이러스이고 2001년에 발견되었지만 발견되기 전 적어도 반세기 동안 순환되어 왔다. hMPV 융합(F) 단백질은 바이러스 게놈에 의해 코딩되는 세 가지 표면 당단백질 중 하나이다. 클래스 I 융합으로서, hMPV F는 먼저 단일 폴리펩티드 전구체(F0)로 번역된다. 처음에는 비기능적이며 디설파이드 결합에 의해 공유 결합된 F1 및 F2 서브유닛을 형성하기 위해 단백질분해 절단 이벤트가 필요하다. F2 폴리펩티드의 새로운 N-말단은 결국 바이러스와 숙주-세포 막을 융합시키는 과정에서 숙주-세포 막에 삽입되는 소수성 서열을 함유한다. 이동 중 또는 막 표면의 어느 시점에서, F 단백질은 자체와 회합하여 융합전 입체형태라고 불리는 준안정성 삼량체를 형성한다. hMPV 융합 단백질은 트립신-유사 프로테아제에 의해 세포외에서 절단된다. F 단백질이 극적인 입체형태적 변화를 겪도록 영향을 미치는 미지의 촉발 이벤트가 발생하여 융합 펩티드가 숙주-세포 막으로 확장된 후, 다시 붕괴되어 융합후 입체형태라고 하는 6-나선 다발을 형성한다. 길쭉한 중간체와 융합후 입체형태 사이의 에너지 차이는 막 융합에 필요한 에너지를 제공한다.
역사적으로 파라믹소바이러스 융합 단백질의 구조는 일반적으로 첫 번째 해결된 융합전 단백질을 머리, 목 및 줄기로 분할하는 도메인으로 분할되었다. 3개의 일반 도메인(DI, DII 및 DIII)을 추가 구조의 융합전 구조에 지정하는 명명법이 계속되었다. 뉴모바이러스 과는 이전에 파라믹소바이러스의 아과였기 때문에, 그들 역시 이 관례를 유지한다. hMPV의 도메인은 정의된 헵타드 반복의 추가 2개 영역과 함께 동일한 3개의 도메인으로 모호하게 나뉜다. 헵타드 반복 A(HRA)는 DIIIa 내에 위치한 F1의 N-말단에 있고 헵타드 반복 B는 정의된 도메인 영역 및 단백질의 막횡단 도메인 이전의 C-말단 외부에 있다. 그러나 뉴모바이러스과의 또 다른 구성원인 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)에 사용되는 항원 부위 명명법을 옮기면, 융합 단백질은 구조적 유사성으로 인해 단백질 부위를 보다 정확하게 설명하는 데 사용될 수 있다. DIIIa는 융합 펩티드가 삼량체의 내부 공동으로부터 방출되고 융합 펩티드가 표적 막에 삽입됨에 따라 HRA가 3-코일 다발을 형성할 때 가장 큰 입체형태적 재배열을 경험한다. HRB는 결국 융합후 입체형태에서 6HB를 형성하기 위해 HRA 다발 외부 주위에서 회합한다.
융합전 입체형태에서 클래스 I 융합 단백질의 안정화는 최근 RSV 및 SARS-코로나바이러스-2 백신 모두에서 이 접근 방식을 사용하여 임상 시험에서 백신 항원으로서 유망한 결과를 낳았다(Baden et al., 2020; Keech et al., 2020; Williams et al., 2020; Crank et al., 2019). RSV는 hMPV와 약 33%의 서열 동일성을 공유하며 두 개의 융합전 구조는 매우 유사하다(Battles et al., 2017; van den hoogen et al., 2002). 해결된 융합전 구조를 기반으로, 프롤린, 디설파이드 결합 및 공동-충전 치환의 도입을 포함하여 RSV F를 융합전 입체형태에서 안정화하기 위해 몇 가지 다른 전략이 사용되었다(Joyce et al., 2016; Krarup et al., 2015; McLellan et al., 2013). DS-Cav1의 경우, 소수성 잔기 치환에 의해 내부 공동이 보다 최적으로 채워졌으며 융합 펩티드 영역에 디설파이드 결합이 도입되었다. PR-DM의 경우, 루프 영역이 융합후 입체형태에서 보이는 확장된 알파 나선으로 재배열되는 것을 방지하기 위해 프롤린 잔기가 도입되었다. RSV F에서, 전하 반발 영역도 식별되고 감소되었다. 유사하게, 해결된 융합전 구조는 힌지 영역에 두 개의 프롤린 치환(S-2P)을 도입하여 코로나바이러스의 안정화를 허용했다. 또한 HIV(SOSIP) 및 인플루엔자 분야에서 조작된 안정화 돌연변이로 인해 잘 작동하는 융합전 시약이 생성된 예가 있다.
최근에, RSV F 연구로부터 얻은 지식을 사용하여 융합전 입체형태에서 hMPV F를 안정화시켰다. 먼저, F2/F1 절단 부위 서열 'RQSR'을 다염기성 'RRRR' 서열로 치환하여 생산 세포에서 푸린-유사 프로테아제에 의한 효율적인 절단을 가능하게 했다. 그런 다음 RSV F 안정화 전략(Krarup et al., 2015)을 모방하여, 막-원위 삼량체 정점에서 F1의 나선-루프-나선 영역에 프롤린을 도입했다. 이 조작된 전략은 hMPV F의 삼량체 융합전 결정 구조를 얻을 수 있게 해주었지만, 단백질은 제대로 발현되지 않아 추가 조작의 필요가 있음을 시사했다(Battles et al., 2017). 또한, 이전의 혈청-고갈 검정 및 뮤린 면역화 실험은 융합전 및 융합후 hMPV F 사이에 유의한 항원 차이가 없음을 나타냈다(Battles et al., 2017). 대조적으로, 융합전 RSV F는 융합후 RSV F보다 더 강력한 중화 항체 반응을 유도하고, 혈청-고갈 실험은 인간 혈청에서 RSV-중화 활성의 대부분이 융합전 입체형태에만 독점적으로 결합함을 입증했다(Sastre et al., 2005; Magro et al., 2012). 이러한 데이터는 이러한 부적합한 결과를 조사하기 위해 보다 안정적인 융합전 hMPV F 구조가 필요함을 시사했다.
이를 위해, F 단백질 안정화 전략은 F 단백질 코딩 서열의 돌연변이에 의해 본원에서 증명되었다. 공개된 융합전 hMPV F 구조는 추가적인 아미노산 치환의 조작을 안내하는 데 사용되었다. 여러 유익한 치환의 조합은 원하는 단백질 특성에 대해 부가적인 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 본원에서 분석 및 제공되는 돌연변이는 하기 표 1에 상세히 설명되어 있다. 돌연변이 단백질은 실시예에 상세히 기술된 바와 같이 발현되었고 생성된 단백질 및 삼량체 복합체의 양을 측정하였다.
표 1. F 단백질 치환 및 돌연변이
IV. 약제학적 제형
본 개시내용은 조작된 hMPV F 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 백신 제형의 일부와 같이 면역 반응을 자극하기 위해 사용될 수 있다.
조작된 hMPV F 단백질을 코딩하는 핵산 분자가 약제학적 조성물에 사용되는 경우, 핵산 분자는 함께 공유적으로 연결된 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 리보뉴클레오티드 또는 이의 유사체를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 핵산 분자는 일반적으로 포스포디에스테르 결합을 함유하지만, 일부 경우에 적어도 하나의 상이한 연결, 예를 들어 포스포르아미데이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 O-메틸포스포로아미다이트 연결 및 펩티드 핵산 백본 및 연결을 가질 수 있는 핵산 유사체가 포함된다. 천연 발생 폴리뉴클레오티드 및 유사체의 혼합물이 만들어질 수 있다; 대안적으로, 상이한 폴리뉴클레오티드 유사체의 혼합물, 및 천연 발생 폴리뉴클레오티드 및 유사체의 혼합물이 제조될 수 있다. 핵산 분자는 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체와 같은 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 표지화 성분과의 접합 등에 의해 중합 후에 추가로 변형될 수 있다. 이 용어는 또한 이중- 및 단일- 가닥 분자를 모두 포함한다. 달리 명시되거나 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오티드라는 용어는 이중-가닥 형태 및 이중-가닥 형태를 구성하는 것으로 알려지거나 예측되는 두 개의 상보적인 단일-가닥 형태 각각을 모두 포함한다. 핵산 분자는 폴리뉴클레오티드가 RNA일 때, 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T) 및 티민에 대한 우라실(U)의 4개 뉴클레오티드 염기의 특정 서열로 구성된다. 따라서 "핵산 서열"이라는 용어는 핵산 분자를 알파벳순으로 나타낸 것이다. 달리 나타내지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 그의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 축퇴 코돈 치환) 및 상보적 서열 뿐만 아니라 명시적으로 표시된 서열을 함축적으로 포함한다. 구체적으로, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 세 번째 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다.
일부 구현양태에서, 본 개시내용의 핵산은 변형된 당 모이어티를 포함하는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 하나 이상의 당-변형된 뉴클레오시드를 포함하는 이러한 화합물은 자연 발생 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오시드만을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 비해 향상된 뉴클레아제 안정성 또는 표적 핵산과의 증가된 결합 친화도와 같은 바람직한 특성을 가질 수 있다. 일부 구현양태에서, 변형된 당 모이어티는 치환된 당 모이어티이다. 일부 구현양태에서, 변형된 당 모이어티는 당 대체물이다. 이러한 당 대체물은 치환된 당 모이어티의 것에 상응하는 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다.
일부 구현양태에서, 변형된 당 모이어티는 2' 및/또는 5' 위치에서의 치환기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 비-가교 당 치환기를 포함하는 치환된 당 모이어티이다. 2'-위치에 적합한 당 치환기의 예는 2'-F, 2'-OCH3("OMe" 또는 "O-메틸") 및 2'-O(CH2)2OCH3("MOE")를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현양태에서, 2' 위치의 당 치환기는 알릴, 아미노, 아지도, 티오, O-알릴, O-C1-C10 알킬, O-C1-C10 치환된 알킬; OCF3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2--O--N(Rm)(Rn), 및 O--CH2--C(=O)-N(Rm)(Rn)으로부터 선택되고, 여기서 각각 Rm 및 Rn은 독립적으로 H 또는 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬이다. 5'-위치에서의 당 치환기의 예는 5'-메틸(R 또는 S); 5'-비닐, 5'-메톡시를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현양태에서, 치환된 당은 하나 초과의 비-가교 당 치환기, 예를 들어 T-F-5'-메틸 당 모이어티를 포함한다(예를 들어, 추가의 5',2'-비스 치환 당 모이어티 및 뉴클레오시드에 대해서는 PCT 국제 출원 WO 2008/101157 참조).
2'-치환된 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오시드는 2'-치환된 뉴클레오시드로 지칭된다. 일부 구현양태에서, 2'-치환된 뉴클레오시드는 할로, 알릴, 아미노, 아지도, SH, CN, OCN, CF3, OCF3, O, S 또는 N(Rm)-알킬; O, S 또는 N(Rm)-알케닐; O, S 또는 N(Rm)-알키닐; O-알킬레닐-O-알킬, 알키닐, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴, O-아르알킬, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2--O--N(Rm)(Rn) 또는 O--CH2--C(=O)--N(Rm)(Rn)로부터 선택되는 2'-치환 기를 포함하고, 여기서 각 Rm 및 Rn은 독립적으로 H, 아미노 보호기 또는 치환 또는 비치환 C1-C10 알킬이다. 이들 2'-치환 기는 하이드록실, 아미노, 알콕시, 카복시, 벤질, 페닐, 니트로(NO2), 티올, 티오알콕시(S-알킬), 할로겐, 알킬, 아릴, 알케닐 및 알키닐로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환 기로 추가로 치환될 수 있다.
일부 구현양태에서, 2'-치환된 뉴클레오시드는 F, NH2, N3, OCF3, O--CH3, O(CH2)3NH2, CH2―CH=CH2, O--CH2―CH=CH2, OCH2CH2OCH3, O(CH2)2SCH3, O--(CH2)2--O--N(Rm)(Rn), O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2, 및 N-치환 아세트아미드 (O--CH2--C(=O)--N(Rm)(Rn)로부터 선택된 2'-치환 기를 포함하며, 여기서 각 Rm 및 Rn은 독립적으로 H, 아미노 보호기 또는 치환 또는 비치환 C1-C10 알킬이다.
일부 구현양태에서, 2'-치환된 뉴클레오시드는 F, OCF3, O--CH3, OCH2CH2OCH3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2--O--N(CH3)2, --O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2, 및 O--CH2--C(=O)--N(H)CH3로부터 선택된 2'-치환 기를 포함하는 당 모이어티를 포함한다.
일부 구현양태에서, 2'-치환된 뉴클레오시드는 F, O-CH3, 및 OCH2CH2OCH3로부터 선택된 2'-치환 기를 포함하는 당 모이어티를 포함한다.
일부 구현양태에서, 본 개시내용의 뉴클레오시드는 하나 이상의 변형되지 않은 핵염기를 포함한다. 특정 구현양태에서, 본 개시내용의 뉴클레오시드는 하나 이상의 변형된 핵염기를 포함한다.
일부 구현양태에서, 변형된 핵염기는 보편적 염기, 소수성 염기, 무차별 염기, 크기-확장 염기 및 본원에 정의된 플루오르화 염기로부터 선택된다. 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실을 포함하는 5-치환 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환 퓨린; 5-프로피닐시토신; 5-하이드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 기타 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5 -할로라실 및 시토신, 5-프로피닐 CH3) 우라실 및 시토신 및 기타 피리미딘 염기의 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 기타 8-치환 아데닌 및 구아닌, 5-할로 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌, 보편 염기, 소수성 염기, 무차별 염기, 크기-확장 염기 및 본원에 정의된 플루오르화 염기로부터 선택된다. 추가로 변형된 핵염기는 트리사이클릭 피리미딘, 예를 들어 페녹사진 시티딘([5,4-b][1,4]벤즈옥사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘(1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프, 예를 들어 치환된 페녹사진 시티딘(예를 들어, 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-13][1,4]벤즈옥사진-2(3H)-온), 카바졸 시티딘(2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘(H-피리도[3',2':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온)을 포함한다. 변형된 핵염기는 또한 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로사이클, 예를 들어 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈으로 대체된 것들을 포함할 수 있다. 추가의 핵염기는 문헌에 개시된 것들을 포함한다(U.S. Patent 3,687,808, those disclosed in The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, Kroschwitz, J. I., Ed., John Wiley & Sons, 1990, 858-859).
상기 언급된 특정 변형된 핵염기 뿐만 아니라 다른 변형된 핵염기의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허에는 제한 없이 U.S. 특허 3,687,808; 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121; 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,681,941; 5,750,692; 5,763,588; 5,830,653 및 6,005,096이 포함되며, 이들 각각은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
올리고뉴클레오티드 상의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 상의 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 추가적인 변형이 또한 이루어질 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 리간드 접합된 올리고뉴클레오티드의 하나의 추가적인 변형은 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 향상시키는 하나 이상의 추가적인 비-리간드 모이어티 또는 접합체를 올리고뉴클레오티드에 화학적으로 연결하는 것을 포함한다. 그러한 모이어티는 지질 모이어티, 예컨대 콜레스테롤 모이어티, 콜산, 티오에테르, 예를 들어 헥실-5-트리틸티올, 티오콜레스테롤, 지방족 사슬, 예를 들어 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 인지질, 예를 들어 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 또는 아다만탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 모이어티를 포함하나 이로 제한되지 않는다. 일부 측면에서, 키메라 hMPV/RSV F 단백질을 코딩하는 핵산 분자는, 예를 들어 변형된 mRNA와 같은 변형된 RNA이다. 변형된 (m)RNA는 mRNA에 증가된 안정성과 낮은 면역원성을 부여하여 치료적으로 중요한 단백질의 발현을 촉진하는 특정 화학적 변형을 고려한다. 예를 들어, N1-메틸-슈도우리딘(N1mΨ)은 번역 능력 측면에서 여러 다른 뉴클레오시드 변형 및 이들의 조합보다 성능이 뛰어나다. 일부 구현양태에서, 본원에 사용된 (m)RNA 분자는 1-메틸-3'-슈도우리딜릴 염기와 같은 슈도우라실로 대체된 우라실을 가질 수 있다. 일부 구현양태에서는 일부 우라실이 대체되지만, 다른 구현양태에서는 모든 우라실이 대체된다. (m)RNA는 5' 캡, 5' UTR 요소, 임의로 코돈 최적화된 열린 해독틀, 3' UTR 요소 및 폴리(A) 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다.
천연이든 변형이든 핵산 분자는 네이키드 핵산 분자로서 또는 지질 나노입자와 같은 전달 비히클로 전달될 수 있다. 지질 나노입자는 약 5:1 내지 약 1:100의 지질 나노입자에 대한 중량비로 존재하는 하나 이상의 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구현양태에서, 핵산 대 지질 나노입자의 중량비는 약 5:1, 2.5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90 또는 1:100, 또는 그 안에서 유래되는 임의의 값이다.
일부 구현양태에서, 본원에 사용된 지질 나노입자는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 지질을 함유할 수 있다. 이들 지질은 트리글리세라이드, 인지질, 스테로이드 또는 스테롤, PEG화 지질, 또는 알킬 아민과 같은 이온화가능한 기를 갖는 기 및 C6 이상의 알킬 기와 같은 하나 이상의 소수성 기를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 지질 나노입자는 하나 이상의 스테로이드 또는 스테로이드 유도체와 혼합된다. 일부 구현양태에서, 스테로이드 또는 스테로이드 유도체는 임의의 스테로이드 또는 스테로이드 유도체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 일부 구현양태에서, 용어 "스테로이드"는 알킬 기, 알콕시 기, 하이드록시 기, 옥소 기, 아실 기, 또는 둘 이상의 탄소 원자 사이의 이중 결합을 포함하는 하나 이상의 치환체를 추가로 포함할 수 있는 4개의 고리 17 탄소 사이클릭 구조를 갖는 화합물 부류이다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 지질 나노입자는 하나 이상의 PEG화 지질(또는 PEG 지질)과 혼합된다. 일부 구현양태에서, 본 개시내용은 PEG 기가 부착된 임의의 지질을 사용하는 것을 포함한다. 일부 구현양태에서, PEG 지질은 글리세롤 기에 부착된 PEG 사슬을 또한 포함하는 디글리세라이드이다. 다른 구현양태에서, PEG 지질은 하나 이상의 C6-C24 장쇄 알킬 또는 알케닐 기 또는 PEG 사슬을 갖는 링커 기에 부착된 C6-C24 지방산 기를 함유하는 화합물이다. PEG 지질의 일부 비-제한적 예는 PEG 변형된 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티드산, PEG 세라마이드 접합되고, PEG 변형된 디알킬아민 및 PEG 변형된 1,2-디아실옥시프로판-3-아민, PEG 변형된 디아실글리세롤 및 디알킬글리세롤을 포함한다. 일부 구현양태에서, PEG 변형된 디아스테아로일포스파티딜에탄올아민 또는 PEG 변형된 디미리스토일-sn-글리세롤. 일부 구현양태에서, PEG 변형은 지질의 PEG 성분의 분자량에 의해 측정된다. 일부 구현양태에서, PEG 변형은 약 100 내지 약 15,000의 분자량을 갖는다. 일부 구현양태에서, 분자량은 약 200 내지 약 500, 약 400 내지 약 5,000, 약 500 내지 약 3,000, 또는 약 1,200 내지 약 3,000이다. PEG 변형의 분자량은 약 100, 200, 400, 500, 600, 800, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,250, 2,500, 2,750, 3,000, 3,500, 4,000, 4,500, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 12,500 내지 약 15,000이다. 본 개시내용에서 사용될 수 있는 지질의 일부 비-제한적 예는 본원에 참고로 포함된 미국 특허 5,820,873, WO 2010/141069 또는 미국 특허 8,450,298에 교시되어 있다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 지질 나노입자는 하나 이상의 인지질과 혼합된다. 일부 구현양태에서, 임의의 지질은 포스페이트 기를 또한 포함한다. 일부 구현양태에서, 인지질은 1개 또는 2개의 장쇄 C6-C24 알킬 또는 알케닐 기, 글리세롤 또는 스핑고신, 1개 또는 2개의 포스페이트 기, 및 임의로 작은 유기 분자를 함유하는 구조이다. 일부 구현양태에서, 작은 유기 분자는 아미노산, 당, 또는 콜린 또는 에탄올아민과 같은 아미노 치환된 알콕시 기이다. 일부 구현양태에서, 인지질은 포스파티딜콜린이다. 일부 구현양태에서, 인지질은 디스테아로일포스파티딜콜린 또는 디올레오일포스파티딜에탄올아민이다. 일부 구현양태에서, 다른 양쪽이온성 지질이 사용되며, 여기서 양쪽이온성 지질은 양전하 및 음전하를 모두 갖는 지질 및 지질-유사 분자를 정의한다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 친유성 및 양이온성 성분을 함유하는 화합물을 함유하는 지질 나노입자가 제공되며, 여기서 양이온성 성분은 이온화가능하다. 일부 구현양태에서, 양이온성 이온화가능한 지질은 생리학적 pH에서 양성자화되지만 pH 8, 9, 10, 11 또는 12 초과에서는 탈양성자화될 수 있고 전하를 갖지 않는 하나 이상의 기를 함유한다. 이온화가능한 양이온성 기는 생리적 pH에서 양이온 기를 형성할 수 있는 하나 이상의 양성자화가능한 아민을 함유할 수 있다. 양이온성 이온화가능한 지질 화합물은 또한 C6-C24 알킬 또는 알케닐 탄소 기를 갖는 2개 이상의 지방산과 같은 하나 이상의 지질 성분을 추가로 포함할 수 있다. 이들 지질 기는 에스테르 결합을 통해 부착될 수 있거나 황 원자에 마이클 첨가를 통해 추가로 첨가될 수 있다. 일부 구현양태에서, 이들 화합물은 덴드리머, 덴드론, 중합체, 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 친유성 및 양이온성 성분을 함유하는 화합물을 함유하는 조성물이 제공되며, 여기서 양이온성 성분은 이온화가능하다. 일부 구현양태에서, 이온화가능한 양이온성 지질은 전하(pKa)를 획득할 수 있는 질소 원자를 갖는 지질 및 지질-유사 분자를 지칭한다. 이들 지질은 문헌에서 양이온성 지질로 알려져 있을 수 있다. 아미노 기를 가진 이러한 분자는 일반적으로 2-6개의 소수성 사슬, 종종 C6-C24 알킬 또는 알케닐 기와 같은 알킬 또는 알케닐을 갖지만 적어도 1개 이상 6개의 꼬리를 가질 수 있다.
일부 구현양태에서, 약제학적 조성물에서 캡슐화된 핵산 분자를 갖는 지질 나노입자의 양은 약 0.1% w/w 내지 약 50% w/w, 약 0.25% w/w 내지 약 25% w/w, 약 0.5% w/w 내지 약 20% w/w, 약 1% w/w 내지 약 15% w/w, 약 2% w/w 내지 약 10% w/w, 약 2% w/w 내지 약 5% w/w, 또는 약 6% w/w 내지 약 10% w/w이다. 일부 구현양태에서, 약제학적 조성물에서 캡슐화된 핵산 분자를 갖는 지질 나노입자의 양은 약 0.1% w/w, 0.25% w/w, 0.5% w/w, 1% w/w, 2.5% w/w, 5% w/w, 7.5% w/w, 10% w/w, 15% w/w, 20% w/w, 25% w/w, 30% w/w, 35% w/w, 40% w/w, 45% w/w, 50% w/w, 55% w/w, 60% w/w, 65% w/w, 70% w/w, 75% w/w, 80 % w/w, 85% w/w, 90% w/w 내지 약 95% w/w, 또는 그 안에서 유래되는 임의의 범위이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 약제학적 조성물로 제형화된 하나 이상의 당을 포함한다. 일부 구현양태에서, 본원에서 사용되는 당은 당류이다. 이들 당류는 건조 과정 동안 약제학적 조성물을 불안정화로부터 보호하는 동결보호제로서 작용하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 수용성 부형제는 수크로스, 트레할로스 또는 락토스과 같은 이당류 또는 프락토스, 글루코스, 라피노오스를 포함하는 갈락토오스와 같은 삼당류, 전분 또는 셀룰로스와 같은 다당류와 같은 탄수화물 또는 당류, 또는 자일리톨, 소르비톨 또는 만니톨과 같은 당 알코올을 포함한다. 일부 구현양태에서, 이들 부형제는 실온에서 고체이다. 당 알코올의 일부 비-제한적인 예는 에리트리톨, 트레이톨, 아라비톨, 자일리톨, 리비톨, 만니톨, 소르비톨, 갈락티톨, 푸시톨, 이디톨, 이노시톨, 볼레미톨, 이소말트, 말티톨, 락티톨, 말토트리톨, 말토테트라이톨 또는 폴리글리시톨을 포함한다.
일부 구현양태에서, 약제학적 조성물에서 당의 양은 약 25% w/w 내지 약 98% w/w, 40% w/w 내지 약 95% w/w, 50% w/w 내지 약 90% w/w, 50% w/w 내지 약 70% w/w, 또는 약 80% w/w 내지 약 90% w/w이다. 일부 구현양태에서, 약제학적 조성물에서 당의 양은 약 10% w/w, 15% w/w, 20% w/w, 25% w/w, 30% w/w, 35% w/w, 40% w/w, 45% w/w, 50% w/w, 52.5% w/w, 55% w/w, 57.5% w/w, 60% w/w, 62.5% w/w, 65% w/w, 67.5% w/w, 70% w/w, 75% w/w, 80% w/w, 82.5% w/w, 85% w/w, 87.5% w/w, 90% w/w, 내지 약 95% w/w, 또는 그 안에서 유래되는 임의의 범위이다.
일부 구현양태에서, 약제학적으로 허용되는 중합체는 공중합체이다. 약제학적으로 허용되는 중합체는 중합체 서브유닛의 별개의 상이한 유형의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 서브유닛을 추가로 포함할 수 있다. 이들 중합체 서브유닛은 폴리옥시프로필렌, 폴리옥시에틸렌, 또는 유사한 서브유닛을 포함할 수 있다. 특히, 약제학적으로 허용되는 중합체는 적어도 하나의 소수성 서브유닛 및 적어도 하나의 친수성 서브유닛을 포함할 수 있다. 특히, 공중합체는 소수성 단위의 양쪽에 친수성 서브유닛을 가질 수 있다. 공중합체는 폴리옥시에틸렌인 친수성 서브유닛 및 폴리옥시프로필렌인 소수성 서브유닛을 가질 수 있다.
일부 구현양태에서, 후속 정제 및 세포/대상체로의 전달을 위해, 또는 바이러스-기반 전달 접근법에서 직접 사용하기 위해, 조작된 hMPV F 단백질을 발현하기 위해 발현 카세트가 사용된다. 조작된 hMPV F 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 함유하는 발현 벡터가 본원에서 제공된다.
발현은 적절한 신호가 벡터에 제공되고 세포에서 조작된 hMPV F 단백질의 발현을 구동하는 바이러스 및 포유동물 공급원 모두로부터의 인핸서/프로모터와 같은 다양한 조절 요소를 포함할 것을 요구한다. 본 출원 전반에 걸쳐, 용어 "발현 카세트"는 핵산 코딩 서열의 일부 또는 전부가 전사 및 번역될 수 있는, 즉 프로모터의 제어 하에 유전자 생성물을 코딩하는 핵산을 함유하는 임의의 유형의 유전적 구성물을 포함하는 것을 의미한다. "프로모터"는 유전자의 특정 전사를 개시하는 데 필요한 세포의 합성 기구 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식되는 DNA 서열을 의미한다. "전사 제어 하에 있는"이라는 어구는 RNA 중합효소 개시 및 유전자 발현을 제어하기 위해 프로모터가 핵산과 관련하여 정확한 위치 및 배향에 있음을 의미한다. "발현 벡터"는 복제할 수 있고, 따라서 하나 이상의 복제 기점, 전사 종결 신호, 폴리-A 영역, 선별 마커 및 다목적 클로닝 부위를 포함하는 유전자 구성물에 포함된 발현 카세트를 포함하는 것을 의미한다.
용어 프로모터는 여기서 RNA 중합효소 II에 대한 개시 부위 주변에 모여 있는 전사 제어 모듈의 군을 지칭하기 위해 사용될 것이다. 프로모터가 구성되는 방법에 대한 많은 생각은 HSV 티미딘 키나아제(tk) 및 SV40 초기 전사 단위에 대한 것을 포함하여 여러 바이러스 프로모터의 분석에서 파생된다. 보다 최근의 연구에 의해 강화된 이러한 연구는 프로모터가 각각 약 7-20 bp의 DNA로 구성되고 전사 활성화제 또는 억제 단백질에 대한 하나 이상의 인식 부위를 함유하는 개별 기능 모듈로 구성되어 있음을 보여주었다.
각각의 프로모터에서 적어도 하나의 모듈은 RNA 합성을 위한 시작 부위를 위치시키는 기능을 한다. 이에 대한 가장 잘 알려진 예는 TATA 상자이지만, 포유류 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 유전자에 대한 프로모터 및 SV40 후기 유전자에 대한 프로모터와 같이 TATA 상자가 없는 일부 프로모터에서는 시작 부위 자체 위에 있는 별개의 요소는 시작 위치를 고정하는 데 도움이 된다.
추가적인 프로모터 요소는 전사 개시 빈도를 조절한다. 일반적으로 이들은 시작 부위의 30-110 bp 업스트림 영역에 위치하지만, 최근에는 많은 프로모터가 시작 부위의 다운스트림에도 기능적 요소를 함유하는 것으로 나타났다. 프로모터 요소 사이의 간격은 종종 유연하므로 요소가 반전되거나 서로 상대적으로 이동할 때 프로모터 기능이 보존된다. tk 프로모터에서, 프로모터 요소 사이의 간격은 활성이 감소하기 시작하기 전에 50 bp 간격으로 증가될 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소가 협력적으로 또는 독립적으로 기능하여 전사를 활성화할 수 있는 것으로 보인다.
특정 구현양태에서, 인간 거대세포바이러스(CMV) 즉시 초기 유전자 프로모터, SV40 초기 프로모터, 루스(Rous) 육종 바이러스 긴 말단 반복, 래트 인슐린 프로모터 및 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소와 같은 바이러스 프로모터를 사용하여 관심 코딩 서열의 높은 수준의 발현을 수득할 수 있다. 관심 코딩 서열의 발현을 달성하기 위해 당업계에 널리 공지된 다른 바이러스 또는 포유동물 세포 또는 박테리아 파지 프로모터의 사용도 발현 수준이 주어진 목적에 충분하다면 또한 고려된다. 잘 알려진 특성을 가진 프로모터를 사용함으로써, 형질감염 또는 형질전환 후 관심 있는 단백질의 발현 수준과 패턴을 최적화할 수 있다. 또한, 특정 생리학적 신호에 반응하여 조절되는 프로모터의 선택은 유전자 생성물의 유도성 발현을 허용할 수 있다.
인핸서는 동일한 DNA 분자 상의 먼 위치에 위치한 프로모터로부터 전사를 증가시키는 유전적 요소이다. 인핸서는 프로모터와 매우 유사하게 구성된다. 즉, 이들은 각각 하나 이상의 전사 단백질에 결합하는 많은 개별 요소로 구성된다. 인핸서와 프로모터 사이의 기본적인 구별은 작동성이다. 전체적으로 인핸서 영역은 원거리에서 전사를 자극할 수 있어야 한다; 이는 프로모터 영역 또는 그 구성 요소에 대해 사실일 필요는 없다. 한편, 프로모터는 특정 부위 및 특정 배향에서 RNA 합성 개시를 지시하는 하나 이상의 요소를 가져야 하는 반면, 인핸서는 이러한 특이성이 결여되어 있다. 프로모터와 인핸서는 종종 중첩되고 연속적이며 종종 매우 유사한 모듈식 조직을 갖는 것처럼 보인다.
발현 구성물에서 관심 유전자를 코딩하는 핵산과 조합하여 사용될 수 있는 프로모터/인핸서 및 유도성 프로모터/인핸서의 목록이 하기에 있다. 또한, 임의의 프로모터/인핸서 조합(Eukaryotic Promoter Data Base EPDB에 따라)을 사용하여 유전자 발현을 유도할 수도 있다. 진핵 세포는 적절한 박테리아 중합효소가 전달 복합체의 일부로서 또는 추가적인 유전자 발현 구성물로서 제공되는 경우 특정 박테리아 프로모터로부터의 세포질 전사를 지원할 수 있다.
프로모터 및/또는 인핸서는, 예를 들어 면역글로불린 경쇄, 면역글로불린 중쇄, T-세포 수용체, HLA DQ a 및/또는 DQ β, β-인터페론, 인터루킨-2, 인터루킨-2 수용체, MHC 클래스 II 5, MHC 클래스 II HLA-Dra, β-액틴, 근육 크레아틴 키나아제(MCK), 프리알부민(트랜스티레틴), 엘라스타제 I, 메탈로티오네인(MTII), 콜라게나제, 알부민, α-태아단백질, t-글로빈, β-글로빈, c-fos, c-HA-ras, 인슐린, 신경 세포 부착 분자(NCAM), α1-안티트리페인, H2B(TH2B) 히스톤, 마우스 및/또는 I형 콜라겐, 글루코스-조절 단백질(GRP94 및 GRP78), 래트 성장 호르몬, 인간 혈청 아밀로이드 A(SAA), 트로포닌 I(TN I), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), SV40, 폴리오마, 레트로바이러스, 유두종 바이러스, B형 간염 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 거대세포바이러스(CMV) 및 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스일 수 있다.
cDNA 삽입물이 사용되는 경우, 일반적으로 유전자 전사물의 적절한 폴리아데닐화를 수행하기 위해 폴리아데닐화 신호를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 인간 성장 호르몬 및 SV40 폴리아데닐화 신호와 같은 임의의 폴리아데닐화 서열이 사용될 수 있다. 또한 발현 카세트의 요소로서 고려되는 것은 종결자이다. 이러한 요소는 메시지 수준을 향상시키고 카세트에서 다른 서열로의 리드 스루를 최소화하는 역할을 할 수 있다.
발현 벡터가 세포 내로 도입될 수 있는 다수의 방식이 있다. 특정 구현양태에서, 발현 구성물은 바이러스 또는 바이러스 게놈으로부터 유도된 조작된 구성물을 포함한다. 특정 바이러스가 수용체-매개 엔도사이토시스를 통해 세포에 들어가 숙주 세포 게놈에 통합되고 바이러스 유전자를 안정적이고 효율적으로 발현하는 능력은 외래 유전자를 포유류 세포로 전달하는 매력적인 후보가 되었다. 이들은 외부 DNA 서열에 대해 상대적으로 낮은 용량을 가지며 제한된 숙주 스펙트럼을 갖는다. 또한, 허용 세포에서의 발암 가능성 및 세포 변성 효과는 안전 문제를 제기한다. 그들은 최대 8 kB의 외래 유전 물질만 수용할 수 있지만 다양한 세포주와 실험실 동물에 쉽게 도입될 수 있다.
생체내 전달을 위한 한 방법은 아데노바이러스 발현 벡터의 사용을 포함한다. "아데노바이러스 발현 벡터"는 (a) 구성물의 패키징을 지지하고 (b) 내부에 클로닝된 조작된 hMPV F 단백질을 발현하기에 충분한 아데노바이러스 서열을 함유하는 구성물을 포함하는 것을 의미한다. 이러한 맥락에서 발현은 유전자 생성물이 합성될 것을 요구하지 않는다.
발현 벡터는 아데노바이러스의 유전적으로 조작된 형태를 포함한다. 36 kB, 선형, 이중-가닥 DNA 바이러스인 아데노바이러스의 유전적 조직에 대한 지식은 최대 7 kB의 외부 서열로 아데노바이러스 DNA의 큰 조각의 치환을 허용한다. 레트로바이러스와 달리, 아데노바이러스 DNA는 잠재적인 유전독성 없이 에피솜 방식으로 복제할 수 있기 때문에, 숙주 세포의 아데노바이러스 감염은 염색체 통합을 초래하지 않다. 또한, 아데노바이러스는 구조적으로 안정적이며 광범위한 증폭 후에도 게놈 재배열이 감지되지 않았다. 아데노바이러스는 세포 주기 단계에 관계없이 거의 모든 상피 세포를 감염시킬 수 있다. 지금까지 아데노바이러스 감염은 인간의 급성 호흡기 질병과 같은 가벼운 질병에만 연결되는 것으로 보인다.
아데노바이러스는 중간 크기의 게놈, 조작의 용이성, 높은 역가, 넓은 표적 세포 범위 및 높은 감염성으로 인해 유전자 전달 벡터로 사용하기에 특히 적합하다. 바이러스 게놈의 양 말단에는 바이러스 DNA 복제 및 패키징에 필요한 시스 요소인 100-200 염기쌍 역반복(ITR)이 포함되어 있다. 게놈의 초기(E) 및 후기(L) 영역은 바이러스 DNA 복제의 시작에 따라 구분되는 상이한 전사 단위를 포함한다. E1 영역(E1A 및 E1B)은 바이러스 게놈 및 몇 가지 세포 유전자의 전사 조절을 담당하는 단백질을 코딩한다. E2 영역(E2A 및 E2B)의 발현은 바이러스 DNA 복제를 위한 단백질 합성을 초래한다. 이 단백질은 DNA 복제, 늦은 유전자 발현 및 숙주 세포 차단에 관여한다. 대부분의 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 후기 유전자의 생성물은 주요 후기 프로모터(MLP)에 의해 배출되는 단일 1차 전사체의 상당한 처리 후에만 발현된다. MLP(16.8 m.u.에 위치)는 감염 후기 단계에서 특히 효율적이며, 이 프로모터에서 배출되는 모든 mRNA는 5'-트리파타이트(tripartite) 리더(TPL) 서열을 가지고 있어 번역에 선호되는 mRNA가 된다. 하나의 시스템에서, 재조합 아데노바이러스는 셔틀 벡터와 프로바이러스 벡터 간의 상동 재조합으로부터 생성된다. 두 개의 프로바이러스 벡터 간의 재조합 가능성으로 인해 이 과정에서 야생형 아데노바이러스가 생성될 수 있다. 따라서 개별 플라크에서 바이러스의 단일 클론을 분리하고 게놈 구조를 조사하는 것이 중요하다.
복제 결함인 현재의 아데노바이러스 벡터의 생성 및 증식은 Ad5 DNA 단편에 의해 인간 배아 신장 세포로부터 형질전환되고 구성적으로 E1 단백질을 발현하는 293으로 지정된 독특한 헬퍼 세포주에 의존한다. E3 영역은 아데노바이러스 게놈에서 필요하지 않기 때문에, 현재의 아데노바이러스 벡터는 293 세포의 도움으로 E1, D3 또는 두 영역 모두에서 외래 DNA를 운반한다. 자연에서 아데노바이러스는 야생형 게놈의 약 105%를 패키징할 수 있어 약 2 kb의 추가 DNA 용량을 제공한다. E1 및 E3 영역에서 대체가능한 약 5.5 kb의 DNA와 조합하여 현재 아데노바이러스 벡터의 최대 용량은 7.5 kb 미만 또는 벡터 전체 길이의 약 15%이다. 아데노바이러스 바이러스 게놈의 80% 이상이 벡터 백본에 남아 있으며 벡터-매개 세포독성의 원인이다. 또한, E1-결실 바이러스의 복제 결함은 불완전하다.
헬퍼 세포주는 인간 배아 신장 세포, 근육 세포, 조혈 세포 또는 다른 인간 배아 중간엽 또는 상피 세포와 같은 인간 세포로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 헬퍼 세포는 인간 아데노바이러스에 대해 허용되는 다른 포유동물 종의 세포로부터 유래될 수 있다. 이러한 세포는, 예를 들어 베로 세포 또는 다른 원숭이 배아 중간엽 또는 상피 세포를 포함한다. 위에서 언급한 바와 같이, 선호되는 헬퍼 세포주는 293이다.
본 개시내용의 아데노바이러스는 복제 결함, 또는 적어도 조건부 복제 결함이다. 아데노바이러스는 42개의 상이한 알려진 혈청형 또는 하위군 A-F 중 하나일 수 있다. 하위군 C의 아데노바이러스 유형 5는 본 개시내용에서 사용하기 위한 조건부 복제-결함 아데노바이러스 벡터를 수득하기 위해 사용될 수 있는 하나의 예시적인 출발 물질이다.
다른 바이러스 벡터가 본 개시내용에서 발현 구성물로서 사용될 수 있다. 백시니아 바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV) 및 헤르페스바이러스와 같은 바이러스로부터 유도된 벡터가 사용될 수 있다. 그들은 다양한 포유류 세포에 대해 몇 가지 매력적인 기능을 제공한다.
구현양태, 특정 구현양태에서, 벡터는 AAV 벡터이다. AAV는 인간과 일부 다른 영장류 종을 감염시키는 작은 바이러스이다. AAV는 현재 질병을 일으키는 것으로 알려져 있지 않다. 이 바이러스는 매우 가벼운 면역 반응을 일으켜 병원성이 없다는 명백한 증거를 추가로 제공한다. 많은 경우에 AAV 벡터는 숙주 세포 게놈에 통합되고, 이는 특정 응용에 중요할 수 있지만, 원하지 않는 결과를 초래할 수도 있다. 천연 바이러스에서는 바이러스에 의해 운반된 유전자가 숙주 게놈으로 통합되는 일이 발생하지만, AAV를 사용하는 유전자 치료 벡터는 분열 세포와 정지 세포 모두를 감염시킬 수 있으며 숙주 세포의 게놈에 통합되지 않고 염색체외 상태로 지속될 수 있다. 이러한 특징으로 인해 AAV는 유전자 치료용 바이러스 벡터 생성 및 동질유전자의 인간 질병 모델 생성을 위한 매우 매력적인 후보이다. 망막에서 유전자 치료를 위해 AAV를 사용한 최근의 인간 임상 시험은 가능성을 보여주었다. AAV는 디펜도파보바이러스(Dependoparvovirus) 속에 속하며, 이는 파보바이러스과(Parvoviridae)에 속한다. 이 바이러스는 작은(20 nm) 복제-결함이 있고 외피가 없는 바이러스이다.
야생형 AAV는 많은 특징으로 인해 유전자 요법 연구자들로부터 상당한 관심을 끌었다. 이들 중 가장 중요한 것은 바이러스의 명백한 병원성 결여이다. 또한 비-분할 세포를 감염시킬 수 있으며 인간 19번 염색체에서 특정 부위(AAVS1로 지정)에서 숙주 세포 게놈에 안정적으로 통합할 수 있는 능력이 있다. 이 특성은 무작위 삽입 및 돌연변이 유발의 위협을 나타내는 레트로바이러스보다 더욱 예측가능하며, 때때로 암 발생이 뒤따른다. AAV 게놈은 언급된 부위에 가장 자주 통합되는 반면, 게놈으로의 무작위 통합은 무시할만한 빈도로 발생한다. 그러나 유전자 치료 벡터로서 AAV의 개발은 벡터의 DNA에서 rep 및 cap을 제거함으로써 이러한 통합 능력을 제거했다. 단일-가닥 벡터 DNA가 숙주 세포 DNA 중합효소 복합체에 의해 이중-가닥 벡터 DNA로 전환된 후 핵에서 연쇄동일서열 형성을 돕는 역말단 반복(ITR) 사이에 유전자의 전사를 구동하는 프로모터와 함께 원하는 유전자가 삽입된다. AAV-기반 유전자 치료 벡터는 숙주 세포 핵에서 에피솜 연쇄동일서열을 형성한다. 비-분할 세포에서, 이러한 연쇄동일서열은 숙주 세포의 수명 동안 온전히 유지된다. 분열하는 세포에서, AAV DNA는 세포 분열을 통해 소실되는데, 이는 에피솜 DNA가 숙주 세포 DNA와 함께 복제되지 않기 때문이다. AAV DNA의 숙주 게놈으로의 무작위 통합은 검출가능하지만 매우 낮은 빈도로 발생한다. AAV는 또한 매우 낮은 면역원성을 나타내어 중화 항체의 생성으로 제한되는 것처럼 보이지만, 명확하게 정의된 세포독성 반응을 유도하지 않는다. 휴지기 세포를 감염시키는 능력과 함께 이 특징은 인간 유전자 치료를 위한 벡터로서 아데노바이러스보다 우세함을 나타낸다.
AAV 게놈은 길이가 약 4.7킬로베이스인 포지티브- 또는 네거티브-센스의 단일-가닥 데옥시리보핵산(ssDNA)으로 구성된다. 게놈은 DNA 가닥의 양쪽 단부에 있는 역말단 반복(ITR)과 두 개의 열린 해독틀(ORF)인 rep 및 cap으로 구성된다. 전자는 AAV 수명주기에 필요한 Rep 단백질을 코딩하는 4개의 중첩 유전자로 구성되고, 후자는 VP1, VP2 및 VP3의 캡시드 단백질의 중첩 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이들은 함께 상호작용하여 정이십면체 대칭의 캡시드를 형성한다.
역말단 반복(ITR) 서열은 각각 145개의 염기를 포함한다. 그들은 AAV 게놈의 효율적인 증식에 필요한 것으로 밝혀진 대칭성 때문에 그렇게 명명되었다. 이러한 특성을 부여하는 이러한 서열의 특징은 두 번째 DNA 가닥의 프리마제-독립적 합성을 가능하게 하는 소위 자가-프라이밍에 기여하는 헤어핀을 형성하는 능력이다. ITR은 또한 AAV DNA를 숙주 세포 게놈(인간의 19번째 염색체)으로 통합하고 그것으로부터 구조하는 것 뿐만 아니라 완전히 조립된 데옥시리보뉴클레아제-내성 AAV 입자의 생성과 조합된 AAV DNA의 효율적인 캡슐화에 필요한 것으로 나타났다.
유전자 요법과 관련하여, ITR은 치료 유전자 다음으로 시스에서 요구되는 유일한 서열인 것으로 보인다: 구조(cap) 및 패키징(rep) 단백질은 트랜스로 전달될 수 있다. 이러한 가정으로 리포터 또는 치료 유전자를 함유하는 재조합 AAV(rAAV) 벡터의 효율적인 생산을 위한 많은 방법이 확립되었다. 그러나 ITR이 효과적인 복제 및 캡슐화를 위해 시스에서 필요한 유일한 요소는 아니라는 것도 발표되었다. 몇몇 연구 그룹은 rep 유전자의 코딩 서열 내부에서 시스-작용 Rep-의존적 요소(cis-acting Rep-dependent element, CARE)로 지정된 서열을 확인했다. CARE는 시스로 존재할 때 복제 및 캡슐화를 증가시키는 것으로 나타났다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 하나 이상의 염을 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 염은 염화칼륨, 염화나트륨, 제2인산칼륨, 제1인산칼륨, 제2인산나트륨 또는 제1인산나트륨과 같은 무기 칼륨 또는 나트륨염일 수 있다. 약제학적 조성물은 인산염 완충액을 생성하기 위한 하나 이상의 인산염을 포함할 수 있다. 인산염 완충 용액은 약 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 또는 8.0, 또는 그안의 유래되는 임의의 범위의 pH로 용액을 완충하기 위한 각각의 인산염을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 약제학적 조성물로 제형화된 하나 이상의 부형제를 포함한다. "부형제"는 약제학적으로 허용되는 담체로서 대상체에게 API의 투여 또는 전달을 용이하게 하기 위해 사용되거나 API를 약제 제형으로 처리하여 대상체에서 작용 부위에 전달하기 위해 약제학적으로 사용될 수 있는 약제학적 제형을 용이하게 하는 데 사용되는 비교적 불활성인 물질을 의미한다. 또한, 이들 화합물은 환자에게 쉽게 측정되거나 투여될 수 있는 투여량을 얻기 위해 희석제로서 사용될 수 있다. 부형제의 비-제한적 예는 중합체, 안정화제, 계면활성제, 표면 개질제, 용해도 향상제, 완충제, 캡슐화제, 항산화제, 방부제, 비이온성 습윤제 또는 투명화제, 점도 증가제 및 흡수 향상제를 포함한다.
특정 구현양태에서, 용어 "약제학적으로 허용되는"은 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 동물, 특히 인간에 사용하기 위해 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인정되는 약전에 등재된 것을 의미한다. "담체"라는 용어는 치료제가 투여되는 희석제, 부형제 또는 비히클을 의미한다. 이러한 약제학적 담체는 물과 같은 멸균 액체일 수 있고 바람직하게는 보조제를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물이 근육내 주사와 같은 주사에 의해 투여될 때 물은 특별한 담체이다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 또한 특히 주사가능한 용액을 위한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 다른 적합한 약제학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다.
조성물은, 원한다면 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 또한 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 서방성 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 경구 제형은 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약제의 예는 문헌에 기술되어 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences). 이러한 조성물은 환자에게 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위해 적절한 양의 담체와 함께 바람직하게는 정제된 형태의 항체 또는 이의 단편의 예방적 또는 치료적 유효량을 함유할 것이다. 제형은 경구, 정맥내, 동맥내, 협측, 비강내, 분무, 기관지 흡입 또는 기계적 인공호흡에 의한 전달일 수 있는 투여 방식에 적합해야 한다.
본원에 기재된 바와 같은 본 개시내용의 조작된 단백질은 비경구 투여용으로 제형화될 수 있으며, 예를 들어 피내, 정맥내, 근육내, 피하, 종양내 또는 심지어 복강내 경로를 통한 주사용으로 제형화될 수 있다. 대안적으로 항체는 점비제, 흡입 또는 분무기에 의해 점막에 직접 국소 경로로 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 산 염 및 예를 들어, 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산으로 형성되는 염을 포함한다. 유리 카복실기로 형성된 염은 또한 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화철과 같은 무기 염기 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유래될 수 있다.
일반적으로, 본 개시내용의 조성물의 성분은 개별적으로 또는 단위 투여 형태로 함께 혼합되어, 예를 들어 건조 동결건조 분말 또는 밀봉된 용기, 예컨대 활성제의 양을 갖는 앰플 또는 향낭에 물이 없는 농축물로 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 멸균 약제 등급의 물 또는 식염수를 함유하는 주입 병이 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 투여 전에 성분들이 혼합될 수 있도록 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰플이 제공될 수 있다.
개시내용의 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염에는 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등에서 유래하는 것과 같은 음이온으로 형성되는 것 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등에서 유래하는 것과 같은 양이온으로 형성되는 것을 포함한다.
투여량은 단일 투여 일정 또는 다중 투여 일정에 의할 수 있다. 1차 면역화 일정 및/또는 부스터 면역화 일정에서 다중 용량이 사용될 수 있다. 다중 투여 일정에서 다양한 투여량은 동일하거나 다른 경로로 투여될 수 있다. 다중 용량은 전형적으로 적어도 1주 간격으로 투여될 것이다(예를 들어, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 6주, 약 8주, 약 10주, 약 12주, 약 16주 등).
본원에 개시된 조성물은 어린이 및 성인 모두를 치료하는데 사용될 수 있다. 따라서, 인간 대상체는 1세 미만, 1-5세, 5-16세, 16-55세, 55-65세 또는 적어도 65세일 수 있다.
바람직한 투여 경로는 근육내, 복강내, 피내, 피하, 정맥내, 동맥내 및 안구내 주사를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특히 바람직한 투여 경로는 근육내, 피내 및 피하 주사를 포함한다.
V. 면역검출 방법
또 다른 구현양태에서, 본 개시내용은 hMPV F 단백질-결합 항체를 결합, 정제, 제거, 정량화 및 달리 일반적으로 검출하기 위한 면역검출 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 전통적인 의미로 적용될 수 있지만, 항체가 항원의 양 또는 무결성(즉, 장기 안정성)을 평가하는 데 사용될 수 있는 백신 스톡의 품질 관리 및 모니터링에 또 다른 용도가 있을 것이다. 대안적으로, 방법은 적절한/원하는 반응성 프로파일에 대해 다양한 항체를 스크리닝하는 데 사용될 수 있다.
일부 면역검출 방법은 몇 가지를 언급하면 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사선면역검정(RIA), 면역방사측정 검정, 형광면역검정, 화학발광 검정, 생체발광 검정 및 웨스턴 블롯을 포함한다. 특히, hMPV F 단백질-결합 항체의 검출 및 정량화를 위한 경쟁 검정도 제공된다. 일반적으로, 면역결합 방법은 hMPV F 단백질-결합 항체를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 수득하고, 경우에 따라 면역복합체의 형성을 허용하기에 효과적인 조건 하에서 본 개시내용에 따라 샘플을 항원과 접촉시키는 것을 포함한다.
이들 방법은 샘플로부터 hMPV F 단백질-결합 항체 또는 hMPV F 단백질을 검출하거나 정제하는 방법을 포함한다. 항원은 바람직하게는 컬럼 매트릭스 형태와 같은 고체 지지체에 연결될 것이고, hMPV F 단백질-결합 항체를 함유하는 것으로 의심되는 샘플은 고정된 항원에 적용될 것이다. 원하지 않는 성분은 컬럼에서 세척되어 hMPV F 단백질-결합 항체가 고정된 항원에 면역복합체화된 상태로 남게 되며, 이는 컬럼에서 항원을 제거하여 수집된다.
면역결합 방법은 또한 샘플에서 hMPV F 단백질 또는 관련 성분의 양을 검출하고 정량화하는 방법 및 결합 과정 동안 형성된 임의의 면역 복합체를 검출하고 정량화하는 방법을 포함한다. 여기서, hMPV F 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 획득하고 샘플을 hMPV F 단백질 또는 이의 성분에 결합하는 항체와 접촉시킨 다음, 특정 조건에서 형성된 면역 복합체의 양을 검출하고 정량화할 것이다. 항원 검출 측면에서, 분석된 생물학적 샘플은 hMPV F 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 임의의 샘플, 예를 들어 조직 절편 또는 표본, 균질화된 조직 추출물, 생물학적 유체(예를 들아, 비강 면봉), 혈액 및 혈청 또는 대변이나 소변과 같은 분비물일 수 있다.
효과적인 조건 하에서 면역 복합체(1차 면역 복합체)의 형성을 가능하게 하기에 충분한 시간 동안 선택된 생물학적 샘플을 항원과 접촉시키는 것은 일반적으로 단순히 항원 조성물을 샘플에 첨가하고 항원이 면역 복합체를 형성하기에, 즉 hMPV F 단백질-결합 항체에 결합하기에 충분히 긴 시간 동안 혼합물을 인큐베이션하는 문제이다. 이 시간 후에, 조직 섹션, ELISA 플레이트, 도트 블롯 또는 웨스턴 블롯과 같은 샘플-항체 조성물은 일반적으로 세척되어 비-특이적으로 결합된 항체 종을 제거하여 1차 면역 복합체 내에서 특이적으로 결합된 항체만 검출되도록 허용한다.
일반적으로, 면역복합체 형성의 검출은 당업계에 잘 알려져 있으며 수많은 접근법의 적용을 통해 달성될 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 방사성, 형광, 생물학적 및 효소 태그와 같은 표지 또는 마커의 검출을 기반으로 한다. 이러한 표지의 사용에 관한 특허에는 미국 특허 3,817,837, 3,850,752, 3,939,350, 3,996,345, 4,277,437, 4,275,149 및 4,366,241이 포함된다. 물론, 당업계에 공지된 바와 같이 2차 항체 및/또는 비오틴/아비딘 리간드 결합 배열과 같은 2차 결합 리간드의 사용을 통해 추가적인 이점을 발견할 수 있다.
검출에 사용된 항체는 그 자체로 검출가능한 표지에 연결될 수 있으며, 여기서 간단하게 이 표지를 검출함으로써 조성물에서 1차 면역 복합체의 양이 결정될 수 있게 한다. 대안적으로, 1차 면역 복합체 내에서 결합되는 제 1 항체는 항체에 대해 결합 친화도을 갖는 제 2 결합 리간드에 의해 검출될 수 있다. 이러한 경우, 제 2 결합 리간드는 검출가능한 표지에 연결될 수 있다. 제 2 결합 리간드는 종종 그 자체가 항체이며, 따라서 "이차" 항체로 지칭될 수 있다. 1차 면역 복합체는 표지된 2차 결합 리간드 또는 항체와 효과적인 조건 하에서 2차 면역 복합체를 형성하기에 충분한 시간 동안 접촉된다. 그런 다음 2차 면역 복합체는 일반적으로 세척되어 비-특이적으로 결합된 표지된 2차 항체 또는 리간드를 제거하고 2차 면역 복합체에 남아 있는 표지를 검출한다.
추가 방법은 2단계 접근법에 의한 1차 면역 복합체의 검출을 포함한다. 항체에 대해 결합 친화도을 갖는 항체와 같은 제 2 결합 리간드는 전술한 바와 같이 2차 면역 복합체를 형성하는 데 사용된다. 세척 후, 2차 면역 복합체는 면역 복합체(3차 면역 복합체)를 형성하기에 충분한 시간 동안 효과적인 조건 하에서 제 2 항체에 대한 결합 친화도를 갖는 제 3 결합 리간드 또는 항체와 접촉된다. 제 3 리간드 또는 항체는 검출가능한 표지에 연결되어 이렇게 형성된 3차 면역 복합체를 검출할 수 있다. 이 시스템은 원하는 경우 신호 증폭을 제공할 수 있다.
면역검출의 한 방법은 2개의 상이한 항체를 사용한다. 첫 번째 비오틴화 항체는 표적 항원을 검출하는 데 사용되며 두 번째 항체는 복합체화된 비오틴에 부착된 비오틴을 검출하는 데 사용된다. 그 방법에서, 테스트할 샘플은 먼저 첫 번째 단계 항체를 포함하는 용액에서 인큐베이션된다. 표적 항원이 존재하는 경우, 항체의 일부가 항원에 결합하여 비오티닐화된 항체/항원 복합체를 형성한다. 그런 다음 항체/항원 복합체는 스트렙타비딘(또는 아비딘), 비오티닐화된 DNA 및/또는 상보적인 비오티닐화된 DNA의 연속적인 용액에서 인큐베이션하여 증폭되며, 각 단계는 항체/항원 복합체에 대해 추가 비오틴 부위를 첨가한다. 증폭 단계는 적절한 수준의 증폭이 달성될 때까지 반복되며, 이 시점에서 샘플은 비오틴에 대한 두 번째 단계 항체를 포함하는 용액에서 인큐베이션된다. 이 두 번째 단계 항체는, 예를 들어 크로모겐 기질을 사용하는 조직효소학에 의해 항체/항원 복합체의 존재를 검출하는 데 사용할 수 있는 효소로 표지된다. 적절한 증폭을 통해 육안으로 볼 수 있는 접합체가 생성될 수 있다.
또 다른 공지된 면역검출 방법은 면역-PCR(중합효소 연쇄 반응) 방법론을 이용한다. PCR 방법은 비오티닐화된 DNA와 함께 인큐베이션까지 칸토(Cantor) 방법과 유사하지만, 여러 라운드의 스트렙타비딘 및 비오티닐화된 DNA 인큐베이션을 사용하는 대신에, DNA/비오틴/스트렙타비딘/항체 복합체가 항체를 방출하는 낮은 pH 또는 높은 염 완충액으로 세척된다. 그런 다음 생성된 세척 용액을 사용하여 적절한 제어와 함께 적합한 프라이머로 PCR 반응을 수행한다. 적어도 이론상으로는 PCR의 엄청난 증폭 능력과 특이성을 이용하여 단일 항원 분자를 검출할 수 있다.
1. ELISA
가장 단순하고 직접적인 의미에서 면역검정은 결합 검정이다. 특정한 바람직한 면역검정은 당업계에 공지된 다양한 유형의 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA) 및 방사면역검정(RIA)이다. 조직 단편을 사용한 면역조직화학적 검출도 특히 유용하다. 그러나, 검출이 이러한 기술에 제한되지 않으며, 웨스턴 블롯팅, 도트 블롯팅, FACS 분석 등도 사용될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다.
하나의 예시적인 ELISA에서, 본 개시내용의 항체는 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트의 웰과 같은 단백질 친화도을 나타내는 선택된 표면 상에 고정된다. 그 다음, hMPV F 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 테스트 조성물을 웰에 첨가한다. 결합 및 비-특이적으로 결합된 면역 복합체를 제거하기 위해 세척한 후 결합된 항원을 검출할 수 있다. 검출가능한 표지에 연결된 또 다른 항-hMPV F 단백질 항체를 첨가하여 검출할 수 있다. 이 유형의 ELISA는 간단한 "샌드위치 ELISA"이다. 검출은 또한 제 2 항-hMPV F 단백질 항체의 첨가에 이어 제 2 항체에 대한 결합 친화도을 갖는 제 3 항체의 첨가에 의해 달성될 수 있으며, 제 3 항체는 검출가능한 표지에 연결된다.
또 다른 예시적인 ELISA에서, hMPV F 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 샘플(예를 들어, 잠재적으로 감염된 세포)은 웰 표면 상에 고정된 다음 개시내용의 항-hMPV F 단백질 항체와 접촉된다. 결합 및 비-특이적으로 결합된 면역 복합체를 제거하기 위한 세척 후, 결합된 항-hMPV F 단백질 항체가 검출된다. 초기 항-hMPV F 단백질 항체가 검출가능한 표지에 연결된 경우, 면역 복합체가 직접 검출될 수 있다. 다시, 면역 복합체는 제 1 항-hMPV F 단백질 항체에 대한 결합 친화도를 갖는 제 2 항체를 사용하여 검출될 수 있으며, 제 2 항체는 검출가능한 표지에 연결된다.
사용된 형식에 관계없이, ELISA는 코팅, 인큐베이션 및 결합, 비-특이적으로 결합된 종을 제거하기 위한 세척 및 결합된 면역 복합체 검출과 같은 공통적인 특정 특징을 가지고 있다. 아래에 설명되어 있다.
플레이트를 항원 또는 항체로 코팅할 때, 일반적으로 플레이트의 웰을 항원 또는 항체의 용액과 함께 밤새 또는 특정 시간 동안 인큐베이션할 것이다. 그런 다음 플레이트의 웰을 세척하여 불완전하게 흡착된 물질을 제거한다. 그런 다음 웰의 나머지 사용가능한 표면은 테스트 항혈청과 관련하여 항원적으로 중성인 비특이적 단백질로 "코팅"된다. 여기에는 소 혈청 알부민(BSA), 카제인 또는 분유 용액이 포함된다. 코팅은 고정 표면의 비특이적 흡착 부위를 차단할 수 있으므로 표면에 대한 항혈청의 비특이적 결합으로 인해 발생하는 배경을 감소시킨다.
ELISA에서, 직접적인 절차보다는 2차 또는 3차 검출 수단을 사용하는 것이 아마도 더 관례적일 것이다. 따라서, 단백질 또는 항체를 웰에 결합시키고, 배경을 감소시키기 위해 비반응성 물질로 코팅하고, 결합되지 않은 물질을 제거하기 위해 세척한 후, 고정화 표면을 면역 복합체(항원/항체) 형성을 허용하기에 효과적인 조건 하에서 테스트할 생물학적 샘플과 접촉시킨다. 면역 복합체의 검출은 표지된 2차 결합 리간드 또는 항체, 및 표지된 3차 항체 또는 제 3 결합 리간드와 함께 2차 결합 리간드 또는 항체를 필요로 한다.
"면역 복합체(항원/항체) 형성을 허용하기에 효과적인 조건 하에서"는 조건이 바람직하게는 항원 및/또는 항체를 BSA, 소 감마 글로불린(BGG) 또는 인산염 완충 식염수(PBS)/트윈과 같은 용액으로 희석하는 것을 포함함을 의미한다. 이러한 첨가된 제제는 또한 비특이적 배경의 감소를 돕는 경향이 있다.
"적절한" 조건은 또한 인큐베이션이 효과적인 결합을 가능하게 하기에 충분한 온도 또는 시간 동안이라는 것을 의미한다. 인큐베이션 단계는 전형적으로 바람직하게는 25℃ 내지 27℃ 정도의 온도에서 약 1 내지 2 내지 4시간 정도이거나, 또는 약 4℃ 정도에서 밤새일 수 있다.
ELISA에서 모든 인큐베이션 단계 후에, 비-복합체화 물질을 제거하기 위해 접촉된 표면을 세척한다. 바람직한 세척 절차는 PBS/트윈 또는 붕산염 완충액과 같은 용액으로 세척하는 것을 포함한다. 테스트 샘플과 원래 결합된 물질 사이에 특이적 면역 복합체가 형성되고 이후에 세척되면 아주 적은 양의 면역 복합체의 발생도 결정할 수 있다.
검출 수단을 제공하기 위해, 제 2 또는 제 3 항체는 검출을 가능하게 하는 관련 표지를 가질 것이다. 바람직하게는, 이는 적절한 발색 기질과 함께 인큐베이션시 발색을 생성할 효소일 것이다. 따라서, 예를 들어, 제 1 및 제 2 면역 복합체를 우레아제, 글루코스 옥시다제, 알카라인 포스파타제 또는 과산화수소-접합 항체와 추가 면역 복합체 형성을 촉진하는 조건 하에서 일정 기간 동안 접촉시키거나 인큐베이션(예를 들어, PBS-트윈과 같은 PBS-함유 용액에서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션)하는 것이 바람직할 것이다.
표지된 항체와 함께 인큐베이션한 후, 결합되지 않은 물질을 제거하기 위해 세척한 후, 표지의 양은, 예를 들어 우레아 또는 브로모크레졸 퍼플 또는 2,2'-아지노-디-(3-에틸-벤즈티아졸린-6-설폰산(ABTS), 또는 과산화효소가 효소 표지인 경우 H2O2와 같은 발색 기질과 함께 인큐베이션하여 정량화된다. 그런 다음 예를 들어 가시 스펙트럼 분광광도계를 사용하여 생성된 색의 정도를 측정하여 정량화한다.
2. 웨스턴 블롯
웨스턴 블롯(또는 단백질 면역블롯)은 주어진 조직 균질물 또는 추출물 샘플에서 특정 단백질을 검출하는 데 사용되는 분석 기술이다. 겔 전기영동을 사용하여 폴리펩티드의 길이(변성 조건) 또는 단백질의 3-D 구조(천연/비변성 조건)에 따라 천연 또는 변성 단백질을 분리한다. 그런 다음 단백질은 막(일반적으로 니트로셀룰로오스 또는 PVDF)으로 옮겨져 표적 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 프로브(검출)된다.
샘플은 전체 조직 또는 세포 배양에서 채취할 수 있다. 대부분의 경우, 고형 조직은 먼저 블렌더(대용량 샘플용)를 사용하거나 균질화기(더 적은 용량)를 사용하거나 초음파 처리를 통해 기계적으로 분해한다. 세포는 또한 위의 기계적 방법 중 하나에 의해 부러져 열릴 수 있다. 다양한 세제, 염 및 완충액을 사용하여 세포 용해를 촉진하고 단백질을 용해시킬 수 있다. 프로테아제 및 포스파타아제 억제제는 종종 자체 효소에 의한 샘플 소화를 방지하기 위해 첨가된다. 조직 제조는 종종 단백질 변성을 피하기 위해 차가운 온도에서 수행된다.
샘플의 단백질은 겔 전기영동을 사용하여 분리된다. 단백질의 분리는 등전점(pI), 분자량, 전하 또는 이러한 요인의 조합에 의해 이루어질 수 있다. 분리의 성질은 샘플의 처리와 겔의 성질에 따라 다르다. 이것은 단백질을 결정하는 매우 유용한 방법이다. 단일 샘플의 단백질을 2차원으로 퍼뜨리는 2차원(2-D) 젤을 사용하는 것도 가능하다. 단백질은 1차원에서 등전점(중성 순전하를 갖는 pH)에 따라, 2차원에서 분자량에 따라 분리된다.
단백질을 항체 검출에 이용가능하게 만들기 위해, 겔 내에서 니트로셀룰로스 또는 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF)로 만들어진 막으로 단백질을 이동시킨다. 겔 위에 막을 놓고 그 위에 여과지 더미를 놓는다. 모세관 현상에 의해 종이 위로 이동하여 단백질을 가져오는 완충 용액에 전체 더미가 배치된다. 단백질을 전달하는 또 다른 방법은 일렉트로블로팅(electroblotting)이라고 하며 전류를 사용하여 젤에서 PVDF 또는 니트로셀룰로스 막으로 단백질을 끌어당긴다. 단백질은 겔 내부에서 조직을 유지하면서 겔 내부에서 막으로 이동한다. 이 블로팅 과정의 결과로 단백질은 검출을 위해 얇은 표면층에 노출된다(아래 참조). 두 종류의 막 모두 비-특이적 단백질 결합 특성(즉, 모든 단백질에 동등하게 잘 결합) 때문에 선택된다. 단백질 결합은 소수성 상호작용 뿐만 아니라 막과 단백질 사이의 하전된 상호작용을 기반으로 한다. 니트로셀룰로스 막은 PVDF보다 저렴하지만 훨씬 더 약하고 반복적인 프로빙에 잘 견디지 못한다. 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 또는 퐁소(Ponceau) S 염료로 막을 염색하여 겔에서 막으로의 단백질 전달의 균일성과 전반적인 효율성을 확인할 수 있다. 일단 전달되면, 표지된 1차 항체 또는 표지되지 않은 1차 항체를 사용하여 단백질을 검출하고 표지된 단백질 A 또는 1차 항체의 Fc 영역에 결합하는 2차 표지 항체를 사용하여 간접적으로 검출한다.
3. 면역조직화학
본 개시내용의 항체는 또한 면역조직화학(IHC)에 의한 연구를 위해 제조된 신선-냉동 및/또는 포르말린-고정, 파라핀-임베딩 조직 블록 모두와 함께 사용될 수 있다. 이러한 미립자 표본으로부터 조직 블록을 제조하는 방법은 다양한 예후 인자에 대한 이전 IHC 연구에서 성공적으로 사용되었으며, 당업자에게 잘 알려져 있다(Brown et al., 1990; Abbondanzo et al., 1990; Allred et al., 1990).
간략하게, 냉동-절편은 50 ng의 냉동 "분쇄된" 조직을 실온에서 작은 플라스틱 캡슐에 있는 인산염 완충 식염수(PBS)에 재수화하여 제조할 수 있다; 원심분리에 의해 입자를 펠릿화; 점성 임베딩 매체(OCT)에 재현탁; 캡슐을 뒤집고/거나 원심분리에 의해 다시 펠릿화; -70℃ 이소펜탄에서 급속-동결; 플라스틱 캡슐 절단 및/또는 동결된 조직 실린더 제거; 저온 유지 장치 마이크로톰 척에 조직 실린더를 고정; 및/또는 캡슐에서 25-50개의 직렬 섹션을 절단한다. 또는 전체 냉동 조직 샘플을 연속 절편 절단에 사용할 수 있다.
영구-절편은 플라스틱 마이크로퓨즈 튜브에서 50 mg 샘플의 재수화를 포함하는 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다; 펠렛화; 4시간 고정 동안 10% 포르말린에 재현탁; 세척/펠렛화; 따뜻한 2.5% 한천에 재현탁; 펠렛화; 한천을 굳히기 위해 얼음물에서 냉각; 튜브에서 조직/한천 블록을 제거; 파라핀에 블록을 침윤 및/또는 임베딩; 및/또는 최대 50개의 연속 영구 절편을 절단한다. 다시 말하지만, 전체 조직 샘플이 대체될 수 있다.
4. 면역검출키트
또 다른 구현양태에서, 본 개시내용은 상기 기술된 면역검출 방법과 함께 사용하기 위한 면역검출 키트에 관한 것이다. hMPV F 단백질을 검출하기 위해 항체가 사용될 수 있으므로, 항체가 키트에 포함될 수 있다. 따라서 면역검출 키트는 적합한 용기 수단에 hMPV F 단백질에 결합하는 제 1 항체 및 임의로 면역검출 시약을 포함할 것이다. 대안적으로, hMPV F 단백질 항원은 hMPV F 단백질-결합 항체를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 이 경우, 면역검출 키트는 적절한 용기 수단에 hMPV F 단백질 항원을 포함할 것이다.
특정 구현양태에서, 항체 또는 항원은 컬럼 매트릭스 및/또는 마이크로타이터 플레이트의 웰과 같은 고체 지지체에 미리 결합될 수 있다. 키트의 면역검출 시약은 항체와 연관되거나 연결된 검출가능한 표지를 포함하여 다양한 형태 중 하나를 취할 수 있다. 2차 결합 리간드와 연관되거나 부착된 검출가능한 표지도 고려된다. 예시적인 2차 리간드는 1차 항체에 대한 결합 친화도을 갖는 2차 항체이다.
본 키트에 사용하기 위한 추가의 적합한 면역검출 시약은 제 1 항체에 결합 친화도를 갖는 제 2 항체와 함께 제 2 항체에 결합 친화도를 갖는 검출가능한 표지에 연결된 제 3 항체를 포함하는 2-성분 시약을 포함한다. 위에서 언급한 바와 같이, 다수의 예시적인 표지가 당업계에 공지되어 있고 이러한 모든 표지는 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
키트는 검출 검정을 위한 표준 곡선을 준비하는 데 사용될 수 있는 바와 같이, 표지되거나 표지되지 않은 hMPV F 단백질의 적합하게 분취된 조성물을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 완전히 접합된 형태, 중간체 형태 또는 키트 사용자에 의해 접합될 별도의 모이어티로 항체-표지 접합체를 포함할 수 있다. 키트의 구성 요소는 수성 매체 또는 동결 건조된 형태로 포장될 수 있다.
키트의 용기 수단은 일반적으로 적어도 하나의 바이알, 테스트 튜브, 플라스크, 병, 주사기 또는 항체가 놓이거나 바람직하게는 적절하게 분취될 수 있는 다른 용기 수단을 포함할 것이다. 본 개시내용의 키트는 또한 전형적으로 상업적 판매를 위해 밀폐된 밀폐 공간에서 항체, 항원 및 임의의 다른 시약 용기를 함유하기 위한 수단을 포함할 것이다. 이러한 용기에는 원하는 바이알이 보관되는 사출 또는 취입 성형 플라스틱 용기가 포함될 수 있다.
5. 유세포 분석 및 FACS
본 개시내용의 항체는 또한 유세포 분석 또는 FACS에 사용될 수 있다. 유세포 분석은 세포 계수, 세포 분류, 바이오마커 검출 및 단백질 공학을 포함한 많은 검출 검정에 사용되는 레이저- 또는 임피던스-기반 기술이다. 이 기술은 유체 흐름에 세포를 현탁시키고 전자 검출 장치를 통과시켜 초당 최대 수천 개의 입자의 물리적 및 화학적 특성에 대한 다중 매개변수 분석을 동시에 수행할 수 있도록 한다. 유세포 분석은 장애 진단에 일상적으로 사용되지만, 기초 연구, 임상 실습 및 임상 시험에서 다른 많은 응용 분야가 있다.
형광-활성 세포 분류(FACS, Fluorescence-activated cell sorting)는 특화된 유형의 세포분석법이다. 그것은 각 세포의 특정 광산란 및 형광 특성을 기반으로 한 번에 한 세포씩 두 개 이상의 용기로 생물학적 세포의 이종 혼합물을 분류하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 이 기술은 좁고 빠르게 흐르는 액체 흐름의 중앙에 혼입된 세포 현탁액을 포함한다. 흐름은 직경에 비해 세포 사이에 큰 간격이 있도록 배열된다. 진동 메커니즘으로 인해 세포 흐름이 개별 액적으로 부서진다. 스트림이 액적으로 부서지기 직전에, 흐름은 각 세포의 형광이 측정되는 형광 측정 스테이션을 통과한다. 흐름이 액적으로 부서지는 지점에 전기 충전 고리가 배치된다. 형광 강도가 측정되기 직전에 고리에 전하가 배치되고 반대 전하가 스트림에서 부서질 때 액적에 갇히게 된다. 그런 다음 하전된 액적은 전하에 따라 액적을 용기로 전환하는 정전기 편향 시스템을 통해 떨어진다.
특정 구현양태에서, 유세포 분석 또는 FACS에 사용하기 위해, 본 개시내용의 항체는 형광단으로 표지된 다음 관심 세포에 결합하도록 허용되며, 이는 유세포 분석에서 분석되거나 FACS 기계에 의해 분류된다.
VI. 실시예
하기 실시예는 본 발명의 바람직일 구현양태를 설명하기 위해 포함된다. 하기 실시예에 개시된 기술은 본 발명의 실시에서 잘 기능하는 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내며, 따라서 이의 실시를 위한 바람직한 모드를 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 당업자는 이해해야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시내용에 비추어 개시된 특정 구현양태에서 많은 변경이 이루어질 수 있고 여전히 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 유사하거나 유사한 결과를 얻을 수 있음을 인식해야 한다.
재료 및 방법
단백질 발현 및 정제. 모든 hMPV F 변이체는 깁슨(Gibson) 어셈블리에 의해 His 및 StrepTag II 태그를 함유하는 플라스미드로 구성되었고 DNA 시퀀싱에 의해 검증되었다. F 변이체와 푸린을 4:1 비율로 코딩하는 플라스미드를 폴리에틸렌이민(PEI)으로 FreeStyle 293F 세포(ThermoFisher)를 공동-형질감염시키는 데 사용했다. 형질감염 3시간 후, 키푸넨신을 최종 농도 5 μM로 첨가하고 대규모 형질감염을 위해 플루로닉 F-68을 최종 농도 0.1% v/v로 첨가했다. 형질감염 6일 후, 필터- 멸균된 상등액을 스트렙택틴(StrepTactin) 컬럼(IBA)에 적용하여 초기 정제한 다음, 수퍼로즈(Superose) 6 10/300 또는 수퍼덱스(Superdex) 200 10/300 크기 배제 컬럼(SEC)(GE Healthcare)에 적용하여 SEC 완충액(2 mM 트리스 pH 8.0, 200 mM NaCl 및 0.03% NaN3)에서 단분산 분획을 수득하였다. 초기 변이체 스크리닝 및 특성화를 위해, 단일 치환 및 조합 치환된 hMPV F 변이체를 40 mL 세포 배양물로부터 정제하였다. DS-CavEs2의 대규모 발현은 수퍼로즈(Superose) 6 16/600 컬럼을 사용하여 정제되었다.
MPE8의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 플라스미드를 PEI에 의해 FreeStyle 293F 세포에 1:1 비율로 동시 형질감염시켰다. MPE8의 항원-결합 단편(Fab)을 생성하기 위해 중쇄의 힌지 영역 전에 정지 코돈을 도입하였다. MPE8 Fab를 정제하기 위해 필터-멸균된 상청액을 먼저 CaptureSelect™ IgG-CH1 친화도 매트릭스(Affinity Matrix, ThermoFisher)에 적용한 다음 수퍼덱스(Superdex) 200 컬럼(GE Healthcare)에 적용하여 PBS 완충액에서 단분산 분획을 얻었다. 모든 단백질 샘플은 5에서 10 mg/ml 사이로 농축된 다음 액체 질소에서 급속 동결된 후 -80℃에서 보관되었다.
시차 주사 형광측정법. 1 μM의 최종 농도에서 정제된 hMPV 변이체를 흰색 불투명 96-웰 플레이트(VWR)에서 최종 농도 5X SYPRO 주황색 단백질 젤 착색제(Orange Protein Gel Stain, ThermoFisher)과 혼합했다. 혼합물은 로슈 라이트사이클러(Roche LightCycler) 480 II를 사용하여 연속 형광 스캐닝(λex=465 nm, λem=580 nm)에 의해 측정되었으며 온도 램프 속도는 4.4℃/분이고 온도 범위는 25℃ 내지 95℃였다. 데이터는 용융 곡선의 도함수로 플롯되었다.
생물층 간섭법에 의한 MPE8 결합 분석. 다양한 온도 스트레스 하에서 hMPV F의 에피토프 무결성을 검사하기 위해, DS-CavEs2 분취량을 열순환기에서 30분 동안 37℃, 50℃ 또는 70℃에서 인큐베이션하거나 옥테트 RED96e(ForteBio)를 사용하여 BLI에서 MPE8 결합을 테스트하기 전에 2.5개월 동안 4℃에서 방치했다. 간략하게, 항-인간 Fab-CH1 2세대(FAB2G) 바이오센서(ForteBio)를 사용하여 10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.005% v/v 트윈 20 및 1 mg/ml BSA로 구성된 완충액에서 30 nM의 농도로 동량의 MPE8 Fab를 포획했다. MPE8-포획 바이오센서를 열처리된 50 nM의 DS-CaEs2에 침지시켜 회합율을 측정하였다. 600초 회합 단계 후, 600초 해리 단계를 완충액 만을 포함하는 웰에서 수행하였다. 결합 곡선을 기준선에 정렬하고 완충액을 차감했다.
네가티브 염색 EM. 융합후 hMPV F를 70℃에서 10분 동안 열처리한 다음 4:1 O2/H2 비율에서 솔라루스(Solarus) 950 플라즈마 세정기(Gatan)에서 45초 동안 플라즈마 세정된 CF-400-Cu 그리드(Electron Microscopy Sciences)에 적용하였다. 그리드는 메틸아민 텅스테이트(Nanoprobes)을 사용하여 염색되었다. 융합전-안정화 hMPV F를 실온에서 30분 동안 1X PBS 중 2배 몰 과량의 MPE8 Fab와 함께 인큐베이션하였다. hMPV-F:Fab 복합체를 2 mM 트리스 pH 8.0, 200 mM NaCl 및 0.02% NaN3에서 0.03 mg/mL의 농도로 희석한 다음, CF-400-Cu 그리드에 증착했다. 그리드는 Ceta 16M 검출기(Thermo Fisher Scientific)가 장착된 Talos F200C TEM 현미경에서 92,000X(보정된 픽셀 크기 1.63Å/pix에 해당)의 배율로 이미지화되었다. CTF-추정 및 입자 선택은 cisTEM에서 수행되었다(Grant et al., 2018). 그런 다음 입자를 2D 분류를 위해 cryoSPARC v2.15.0으로 내보냈다(Punjani et al., 2017).
융합전 안정화 F 및 MPE8과 복합체화에 대한 X-선 결정학. DS-CavEs2 결정은 500 nl의 DS-CavEs2(10 mg/ml)를 0.1M MES pH 6.0 및 12%(v/v) PEK 20k를 함유하는 500 nl의 저장소 용액과 혼합하여 행잉-드롭(hanging-drop) 증기 확산에 의해 생성되었다. 결정을 20% 글리세롤이 보충된 저장소에 담그고 액체 질소에서 동결시켰다. 회절 데이터는 SBC 빔라인 19ID(Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory)에서 2.5Å까지 수집되었다. MPE8 Fab와 복합체에 있는 DSx2의 결정은 10%(v/v) 이소프로판올, 0.1 M HEPES pH 7.5, 및 20%(w/v) PEG4000를 함유하는 50 nl의 저장소 용액과 100 nl의 복합체(5.4 mg/ml)를 혼합하여 시팅-드롭(sitting-drop) 증기 확산에 의해 성장되었다. 동결 보호제를 첨가하지 않고 결정을 액체 질소에서 직접 동결했다. 2.2Å까지 회절된 단결정에 대한 회절 데이터는 SBC 빔라인 19ID(Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory)에서 수집되었다. 데이터는 에임리스(Aimless)(Evans & Murshudov, 2013)를 사용하여 병합 및 확장되기 전에 iMOSFLM(Battye et al., 2011)에서 인덱싱 및 통합되었다. 분자 교체는 페이저(Phaser)(McCoy et al., 2007)에서 수행되었으며, 모델은 쿠트(Coot)(Emsley & Cowtan, 2004) 및 피닉스(Phenix)(Adams et al., 2002)에서 각각 여러 차례의 모델 구축 및 개선을 거쳤다. 데이터 수집 및 정제 통계는 표 2에서 확인할 수 있다.
표 2. 결정학적 데이터 수집 및 정제 통계
괄호 안의 값은 최고 분해능 껍질에 대한 것이다.
효소-결합 면역흡착 검정. hMPV F 융합전-특이적인 모노클로날 항체(MFP10, Ac967, Ac1025 및 MPE8)(Corti et al., 2013) 또는 융합전-특이적이 아닌 항체(MF11, MF14)(Battles et al., 2017)의 패널을 개별적으로 4℃에서 하룻밤 동안 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 고정시켰다. PBS 중 1% BSA로 차단 단계 후, 4 ng부터 시작하여 열처리 또는 미처리 융합후 hMPV F의 연속 희석액을 실온에서 1시간 동안 항체 코팅된 웰에 적용했다. 결합되지 않은 F는 PBS 중 0.1% 트윈-20으로 3회 세척하여 제거했다. 그런 다음 양고추냉이 과산화효소(HRP)(Bio-Rad)와 접합된 항-His-태그 mAb를 첨가하고 PBS에서 0.1% 트윈-20으로 3회 세척하여 결합된 F를 검출했다. 그런 다음 발색을 위해 HRP 기질(Sigma)을 첨가하고 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 광학 밀도를 492 nm에서 판독했다.
실시예 1 - 융합전-안정화 hMPV F의 구조-기반 설계
다른 클래스 I 바이러스 융합 당단백질과 같이, 융합전 hMPV F 단백질은 준안정 상태로 존재하고 촉발 동안 안정한 융합후 입체형태로 쉽게 변형된다. 융합전 상태에서 F 단백질을 안정화하기 위해, 프롤린 치환, A185P가 삼량체 정점의 나선-루프-나선 영역에 도입되었다. 이러한 치환은 hMPV의 융합전 구조가 수득되도록 허용했지만, 이 구성물의 낮은 발현 수준은 백신 후보로서의 잠재적 적용을 후퇴시켰다. 따라서 이전에 기술된 융합전-안정화 F 단백질 BV-115(Battles et al., 2017)와 유사하게 이전에 단백질 발현을 증가(Schowalter et al., 2009)시키는 것으로 나타난 H368N 치환도 또한 사용되었다. 이 기본 구성물에서, hMPV F의 융합전(PDB ID: 5WB0) 및 융합후(PDB ID: 5L1X) 구조를 기반으로 97개의 변이체를 설계한 다음, 각 변이체는 발현되고 생산 수율, 단분산성, 열안정성, 및 항원성 측면에서 특성화되었다. 예시적인 변이체는 표 3에 나와 있다. 사용된 전략에는 전-후 전이 동안 실질적으로 움직이는 영역을 잠그기 위한 디설파이드 결합, 내부 공동을 채우기 위한 소수성 잔기, 내부 전하 불균형에 대응하기 위한 극성 잔기, 및 융합전 입체형태를 선호하고 F1의 재접힘을 선호하지 않는 프롤린 치환이 포함되었다. 전이 동안 5Å 이상 이동하는 영역은 도 1a에서 파란색으로 강조 표시되어 있고(Battles et al., 2017), 각 범주에서 최상의 치환은 도 1b에 표시되어 있다. 전반적으로, 단일 치환이 있는 36개의 변이체는 더 높은 내열성을 나타내는 많은 변이체와 함께 단백질 발현을 증가시켰다.
표 3. 예시적인 F 단백질 변이체.
실시예 2 - 단일-치환 F 변이체
42개의 개별 변이체의 발현 프로파일이 도 2a에 요약되어 있고 각각의 설계 카테고리로부터의 선택된 변이체의 크기-배제 크로마토그래피(SEC) 추적은 도 2b에 도시되어 있다. 이 실시예를 통해, 괄호 안에 제공된 단백질 수율의 배수 변화 값은 각 구성물을 설계할 때 결정된 원래 값과 관련된다는 점에 유의한다. 표 3에 주어진 값은 모든 구성물이 병렬로 재발현되고 정제된 실험에서 나온 것이며 각 실험에 대한 기본 구성물 대조군과 비교한 SEC 크로마토그램의 곡선 아래 영역이다. 재발현에서, 모든 구성물이 원래 발현보다 더 잘 발현되었다. 원래 발현에서 기본 구성물의 낮은 수율은 원래 값에서 더 높은 배수 수율 값의 주요 원인이었다.
프롤린 치환을 갖는 9개의 변이체를 설계하고, 발현시키고, 특성화하였다. 9개 변이체 중 6개가 단백질 발현을 향상시켰다(도 2a,b). A107P 및 A113P의 두 가지 변이체는 둘 다 융합 펩티드 내에 위치하며, 기본 구성물에 비해 단백질 수율이 각각 2.9배 및 1.9배 증가[5.1배 및 3.3배 증가]를 나타낸다(도 2b). 주목할 점은, A107P는 기본 구성물에 비해 SEC 피크의 오른쪽 방향 이동을 나타내었고, 이는 더 조밀한 삼량체 구조를 시사한다(도 2b). 나선을 캡핑하도록 설계된 도메인 I(부위 I)의 유일한 치환인 A344P는 단백질 수율이 2배 증가했지만 Tm은 약 0.6℃ 약간 감소했다. D461P의 설계는 또한 HRB에서 α10을 캡핑하려고 시도했는데, 이는 단백질 수율을 1.8배 증가[2.2배 증가]하고 기본 구성물에 비해 SEC 피크를 오른쪽으로 이동시켜 더 조밀한 삼량체 구조를 나타낸다. 마지막으로, T114P, E146P 및 V148P는 모두 단백질 발현을 증가시켰다.
내부 전하 불균형을 중화시키기 위해 염다리를 MPV F 단백질 내로 조작하였다. L73E 및 L219K는 단백질 발현을 각각 1.5배 및 1.4배[2.6배 및 1.4배] 증가시켰고(도 2a,b), 둘 다 SEC에서 더 긴 체류 시간을 나타냈다. L66D/K188R의 한 쌍의 치환이 도입되어 발현이 1.6배 증가했다. E453Q는 단백질 수율에서 1.9배 증가[2.8배 증가]를 나타냈지만 또한 SEC에서 삼량체 피크의 상당한 오른쪽 방향 이동을 나타내어 삼량체가 상대적으로 폐쇄된 입체형태일 수 있음을 시사한다(도 2c). 또한, 여러 공동 충전 변이체가 F 단백질 안정화에 유익한 효과를 나타냈다. 예를 들어, 도메인 IIIb(부위 II)에서 V231I는 단백질 발현을 2.7배[3.6배] 증가시켰다(도 2a,b). 또 다른 변이체인 S376T도 기본 구성물에 비해 단백질 수율이 2.4배 증가한 것으로 나타났다. 2개의 다른 변이체, S149I 및 G366S는 기본 구성물에 비해 단백질 발현에서 2.3배 및 1.7배 증가[2.3배 및 2.9배 증가]를 보였고 SEC에서 단분산 피크로 용출되었다.
단백질 발현 및 열안정성을 개선하기 위해 hMPV F에 대해 융합전 안정화 디설파이드 다리를 테스트하였다. 두 가지 예인 L110C/N322C 및 T365C/V463C는 기본 구성물에 비해 단백질 수율이 각각 2.5배 및 1.7배 증가[2.8배 및 2.4배 증가]하였고, Tm이 5.6℃ 및 6.2℃ 증가한 것으로 나타났다(도 2a,b,c). 변이체 A116C/A338C도 열안정성을 향상시켰지만 기본 구성물에 비해 발현을 증가시키지는 못했다. 한편, A140C/A147C 및 T127C/N153C는 모두 도메인 IIIa(부위 V)(즉, α2, α3, β3 및 β4 내(도 1b))에 위치하고, 단백질 발현을 각각 3.1 및 2.8배[6.0 및 4.8 배]로 유의하게 증가시켰다(도 2a,b). T127C/N153C는 열안정성을 적당히 개선했다(도 2c). V104C/N457C 변이체는 퓨린에 의한 감소된 절단을 나타냈고(도 2d), Tm을 4℃ 증가시켰고, 기본 구성물에 비해 감소된 단백질 발현 수준을 나타냈다(도 2b, c). 전반적으로, 42개 변이체 중 약 20개가 단백질 발현을 증가시켰고(도 2a), 6개 변이체는 증가된 열안정성을 나타냈다.
실시예 3 - 다중-치환 F 변이체
단일 치환의 조합을 2개의 디설파이드 결합, 하나의 공동 충전을 갖는 하나의 디설파이드 결합 또는 하나의 염 다리를 갖는 하나의 디설파이드 결합을 함유하는 3개의 상이한 변이체로 조작하였다. 치환 T365C/V463C는 열 안정성의 현저한 개선으로 인해 세 가지 조합 변형 모두에 포함되었다. 3가지 변이체(T127C/N153C/T365C/V463C, V231I/T365C/V463C, L219K/T365C/V463C) 모두 모체 구성물 T365C/V463C에 비해 단백질 수율이 1.2배, 1.9배, 1.2배 더 증가했으며, 2개의 디설파이드 결합을 함유하는 변이체의 Tm은 모체 T365C/V463C 구성물에 비해 1.7℃, 기본 구성물에 비해 6.4℃ 더 증가하였다(도 4a,d). T127C/N153C/T365C/V463C 변이체는 DSx2로 명명되었으며 L219K 또는 V231I가 추가로 조작되었다. DSx2/L219K 및 DSx2/V231I는 DSx2에 비해 추가적인 1.1배 및 1.6배 증가를 보였다(도 4b,6). 또한, 모든 유익한 돌연변이(T127C/N153C/T365C/V463C/L219K/V231I)를 함유하는 변이체는 1L의 FreeStyle 293-F 세포에서 16 mg의 단백질을 생산하여 DSx2와 비교하여 추가로 1.8배 증가하여 모든 구성물 중에서 가장 높은 발현 수준을 나타냈으며 60.7℃의 Tm을 가졌다(도 4d, 5). 이 변형은 DS-CavEs로 재명명되었고, 하나 이상의 디설파이드 결합 설계(L110C/N322C)가 DS-CavEs로 추가 조작되어 MM-1(T127C/N153C/T365C/V463C /L219K/V231I/L110C/N322C)이라는 펜타-치환 변이체를 생성했다. MM-1의 경우, 단백질 발현이 DS-CavEs에 비해 25% 감소했으며 Tm(67.6℃)에서 상당한 개선을 보였다. MM-1H(T127C/N153C/T365C/V463C/L219K/V231I//L110C/N322C/N386H)라는 또 다른 변이체는 H368N을 MM-1에 비해 야생형 His368로 되돌려 만들어졌다. MM-1H의 경우, 단백질 발현은 DS-CavEs에 비해 25% 감소했고 증가된 Tm(65.2℃)을 보였다(도 4c, d). L110C/N322C 도입으로 인한 이러한 열안정성 향상은 백신 항원에 매우 유리할 수 있다. 추가적인 디설파이드물 결합에 의해 나타나는 이점으로 인해, A140C/A147C의 도입은 단일 치환으로서 유리한 발현 프로파일에 기초하여 탐구되었다(도 2b). MM-4H로 지칭되는 이 구성물은 발현 수율의 최소 차이 및 1.0℃의 Tm 증가를 나타내었다(도 4c,d).
또한, A140C/A147C 및 E453Q 치환이 MM-1H에 도입되었으며, 이는 또한 E453Q를 MM-4H에 도입하고 DS-CavEs2로 명명하는 것에 상응한다. DS-CavEs-2의 대규모 발현은 1L의 FreeStyle 293-F 세포로부터 15.7 mg의 융합전 안정화된 F를 생성한다(도 4e). DS-CavEs2의 항원 표면은 잘 보존되어 있다. 융합전 특이적 항체 MPE8에 대한 DS-CavEs2의 친화도(Wen et al., 2017)는 50℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후 변경되지 않은 기본 구성물의 친화도와 비슷하다(도 4f). nsEM 분석에서, DS-CavEs2는 잘 접힌 융합전 삼량체로 나타나고 각 프로토머는 MPE8 Fab에 의해 결합되었다. 추가적인 치환을 갖는 DS-CavEs2는 발현을 10배 이상 향상시키고 정확한 융합전 입체형태로 가장 높은 열안정성(Tm 71.8℃)(도 4d)을 나타내어 백신 개발 가능성을 시사한다.
실시예 4 - MPE8-결합 DSx2 구성물의 결정 구조
조합 돌연변이 DSx2 구성물의 경우, hMPV F의 입체형태에 대한 다중 치환의 효과를 결정하기 위해 융합전-특이적 항체 MPE8과 복합체화된 단백질의 결정 구조를 수득하였다. 단백질 복합체는 공간 기 P2에서 결정화되고 2.2 Å의 분해능으로 X-선 회절되었다. 모델 구축 및 정제 후, 구조는 원래 각각 19.68% 및 23.5%의 Rwork 및 Rfree를 갖는 것으로 확인되었으며, 구조의 추가 개선 시 각각 21.3% 및 24.2%로 개선되었다(표 2). 이전에 결정된 hMPV F 구조(PDBID: 5WB0)와 비교하여, DSx2는 427개의 Cα 잔기에 대해 전체 RMSD가 1.8 Å인 융합전 입체형태를 유지했다(도 9).
실시예 5 - MPE8 결합 DS-CavEs2의 구조
DS-CavEs2의 결정 구조는 공간 기 P21에서 결정으로부터 2.5Å의 분해능으로 결정되었다(표 2). MPE8이 없는 경우, DS-CavEs2는 PDBID: 5WB0와 공유되는 428개 Cα 원자에 대해 RMSD가 2.3Å인 융합전 입체형태를 유지했다(도 8a). 모든 디설파이드 결합 치환(Cys127/Cys153, Cys140/Cys147, Cys110/Cys322, Cys365/Cys463) 및 공동-충전 치환(I231)에 대해 명확한 전자 밀도가 관찰되었다. 이전의 hMPV F 구조(PDBID: 5WB0)를 갖는 DS-CavEs2의 막-원위 절반(부위 II, V 및 Ø)의 중첩은 항원 부위 IV가 중심 3-배 축을 향하여 상당한 이동을 나타내었다(도 8a). 두 구조로부터의 부위 IV의 중첩은 F 단백질의 상부 및 하부 절반을 연결하는 2개의 긴 β 가닥(β1 및 β22)의 중심에 강체 굴곡이 있음을 입증하였다(도 8a). DSx2 구조와 유사하게, 부위 V에서 2개의 디설파이드-결합 치환은 국소 입체형태를 변경하지 않았다. 대조적으로, Cys365/Cys463 치환은 α10 나선을 중앙 3-배 축으로부터 끌어내어 HRB의 하향 궤적을 변경시켰다(도 8a). 네가티브 염색 전자 현미경(nsEM) 분석은 DS-CavEs2에 복합체화된 MPE8에서 수행되었다. 2D 클래스 평균화 후, 다중 클래스는 DS-CavEs2가 2개 또는 3개의 MPE8 Fab에 의해 결합된 잘-접힌 융합전 삼량체로서 DS-CavEs2를 보여주었고, 이는 DS-CavEs2가 삼량체 입체형태를 채택할 수 있음을 입증했다(도 8b).
실시예 6 - 면역원으로서 융합전-안정화된 hMPV F 변이체
융합전-안정화된 hMPV F 변이체가 면역원으로서 기능하는지 여부를 조사하기 위해, BALB/c 마우스는 융합전(예를 들어, 기본 구성물, DSx2 및 DS-CavEs2) 또는 3주 간격으로 CpG로 보강된 융합후 F 항원으로 면역화될 것이다. 혈청은 2차 면역화 후 10일 후에 수집될 것이다. 융합전-안정화 F 구성물은 융합후 F 항원에 비해 hMPV A1 및/또는 hMPV B1에 대해 더 높은 중화 항체 역가를 유도할 것으로 예상된다.
* * *
본원에 개시되고 청구된 모든 방법은 본 개시내용에 비추어 과도한 실험 없이 만들어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직일 구현양태의 관점에서 기술되었지만, 본 발명의 개념, 정신 및 범위를 벗어나지 않고 기술된 방법 및 단계 또는 단계의 순서에 변형이 적용될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 동일하거나 유사한 결과가 달성되는 동안 화학적 및 생리학적으로 관련된 특정 제제가 본원에 기재된 제제를 대체할 수 있음이 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 그러한 모든 유사한 치환 및 변형은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 본 발명의 사상, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
참고문헌
다음 참고문헌은 예시적인 절차 또는 본원에 제시된 내용을 보충하는 기타 세부 사항을 제공하는 범위 내에서 본원에 참조로 구체적으로 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Board of Regents, The University of Texas System
<120> PREFUSION-STABILIZED HMPV F PROTEINS
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<400> 15
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<210> 16
<211> 454
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial polypeptide sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (79)..(84)
<223> Xaa is Gly or Ser
<400> 16
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<210> 17
<211> 454
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial polypeptide sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (79)..(84)
<223> Xaa is Gly or Ser
<400> 17
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450
Claims (79)
- (i) 서열번호: 1, 2 및 4-7 중 임의의 것의 아미노산 19-489, 또는 (ii) 서열번호: 3의 아미노산 19-484와 적어도 90% 동일성을 갖는 메타뉴모바이러스(MPV) F 단백질 엑토도메인을 포함하는 조작된 단백질로서, 상기 조작된 단백질은 서열번호: 1-7 중 어느 하나의 서열에 비해 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 상기 적어도 하나의 돌연변이는 K166, N342, A/D185, K188, T49, V262, H435, E26, G439, N46, L158, A161, L50, V162, E51, R163, V104, N457, L110, N322, A113, D336, A116, A338, A140, A147, S291, S443, S293, S444, S355, V442, T365, V463, S22, G53, V169, E305, L302, V47, A159, T127, N153, G121, I/F258, G106, A107, T160, I128, A190, V118, Q426, L165, V191, S149, I137, V/I122, S192, T317, L105, L134, A117, S347, G261, I268, S470, L473, S265, L460, F48, Q455, V231, A374, I217, S376, G366, S194, L219 A344, A86, T114, V148, D461, L66, L73, N145, Q195, E453, 및/또는 H368에 상응하는 위치에서 치환을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 1항에 있어서, A/D185P에 상응하는 프롤린 치환을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 1항에 있어서, RQSR(서열번호: 1-7 중 어느 하나의 잔기 99-102)에 상응하는 RRRR(서열번호: 10)로의 치환을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 1항에 있어서, A/D185P에 상응하는 프롤린 치환 및 RQSR(서열번호: 1-7 중 어느 하나의 잔기 99-102)에 상응하는 RRRR(서열번호: 10)로의 치환을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 1항에 있어서, 서열번호: 1-7 중 어느 하나의 잔기 87-104의 GGGGSGGGGSR(서열번호: 8)로의 치환을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, E26C 및 G439C; N46C 및 L158C; T49C 및 A161C; L50C 및 V162C; E51C 및 R163C; E51C 및 K166C; V104C 및 N457C; L110C 및 N322C; A113C 및 D336C; A116C 및 A338C; A140C 및 A147C; S291C 및 S443C; S293C 및 S443C; S293C 및 S444C; S355C 및 V442C; T365C 및 V463C; S22C 및 H435C; G53C 및 K166C; G53C 및 V169C; E305C 및 N457C; S291C 및 L302C; V47C 및 A159C; T127C 및 N153C; G121C 및 I/F258C; F48C 및 T160C; 및/또는 T365C 및 Q455C에 상응하는 쌍을 이룬 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 6항에 있어서, A116C 및 A338C; T365C 및 V463C; T127C 및 N153C; T365C 및 Q455C; V104C 및 N457C; L110C 및 N322C; 또는 A140C 및 A147C에 상응하는 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 7항에 있어서, A140C 및 A147C에 상응하는 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 7항에 있어서, V104C 및 N457C에 상응하는 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 7항에 있어서, L110C 및 N322C에 상응하는 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 7항에 있어서, T365C 및 V463C에 상응하는 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 11항에 있어서, L219 및/또는 V231에 상응하는 위치에서의 치환을 추가로 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 11항에 있어서, L219K 및/또는 V231I에 상응하는 치환을 추가로 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 11항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, T127C 및 N153C에 상응하는 쌍을 이루는 시스테인 치환을 추가로 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 11항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, L110C 및 N322C에 상응하는 쌍을 이루는 시스테인 치환을 추가로 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 11항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, A140C 및 A147C에 상응하는 쌍을 이루는 시스테인 치환을 추가로 포함하는, 조작된 단백질
- 제 11항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, G366S에 상응하는 치환을 추가로 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 11항에 있어서, Q426, T49, L187, L473 및/또는 S347에 상응하는 위치에서의 치환을 추가로 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 11항에 있어서, Q426, T49, L187, L473 및/또는 S347에 상응하는 위치에서의 치환을 추가로 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 11항에 있어서, Q426W, T49E, L187F, L473F 및/또는 S347Q에 상응하는 치환을 추가로 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 7항에 있어서, A116C 및 A338C에 상응하는 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 7항에 있어서, T365C 및 V463C에 상응하는 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 7항에 있어서, T127C 및 N153C에 상응하는 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 7항에 있어서, T365C 및 Q455C에 상응하는 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 7항에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 조작된 디설파이드 결합을 추가로 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, G106, A107, T160, L158, I128, A190, V118, Q426, L165, V191, T160, S149, I137, S149, V169, N46, T49, V/I122, S192, T317, V162, L105, L134, A117, S347, V47, G261, I268, S470, V231, A374, I217, 및/또는 S355에 상응하는 위치에서 공동 충전 치환을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 26항에 있어서, L105, V118, I137, S149, L158, L165 또는 Q426에 상응하는 위치에서 공동 충전 치환을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 27항에 있어서, L105I 또는 L105W에 상응하는 치환을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 27항에 있어서, L158W에 상응하는 치환을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 27항에 있어서, V118F 또는 V118M에 상응하는 치환을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 27항에 있어서, Q426W에 상응하는 치환을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 27항에 있어서, L165F에 상응하는 치환을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 27항에 있어서, S149V 또는 S149I에 상응하는 치환을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 33항에 있어서, I137에 상응하는 위치에서의 치환을 추가로 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 34항에 있어서, I137L에 상응하는 치환을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 26항에 있어서, G106W, A107F, T160M, L158W, I128F, A190M, V118F, V118M, Q426W, L165F, V191I, T160V, S149V, I137L, S149I, V169I, N46V, T49I, V/I122L, S192L, T317L, V162F, V162W, L105I, L105F, L105W, L134I, A117M, S347M, S347K, S347Q, V47M, G261M, I268M, S470Y, V231I, A374V, I217V, 및/또는S355F로 이루어진 군으로부터 선택되는 공동 충전 치환을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, A86P, A107P, A113P, T114P, V148P, S443P, D461P, L130P, L141P, K142P, E146P, L151P, N153P, V162P, A/D185P, D186P, L187P, K188P, N342P, 및 A344P로 이루어진 군으로부터 선택된 프롤린 치환을 포함하는, 조작된 단백질
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, S376, G366 및/또는 S194에 상응하는 위치에서 치환을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 38항에 있어서, S376T, G366S 및/또는 S194Q에 상응하는 치환을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, K166에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 40항에 있어서, K166E에 상응하는 치환을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, H435에 상응하는 위치에서 pH 감도를 조절하는 치환을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 42항에 있어서, H435E, H435D 또는 H435N에 상응하는 치환을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, L66, L73, N145, Q195, E453, L66, K188, H368, D461, T49 및/또는 V262에 상응하는 위치에 정전기적 상호작용 치환을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 44항에 있어서, L66N, L73E, N145E, Q195K, E453Q, L66D, K188R, H368R, D461E, T49E 및/또는 V262D에 상응하는 치환을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, L110C, T127C, A140C, A147C, N153C, L219K, V231I, N322C, T365C, E453Q 및/또는 V463C에 상응하는 치환을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, T127C, N153C, A185P, T365C, V463C, L219K 및 V231I에 상응하는 치환을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, T127C, N153C, A185P, T365C, V463C, L219K, V231I 및 RQSR(서열번호: 1-7 중 어느 하나의 잔기 99-102)에 상응하는 RRRR(서열번호: 10)로의 치환을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, T127C, N153C, T365C, V463C, L219K 및 V231I에 상응하는 치환을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, L110C, T127C, A140C, A147C, N153C, A185P, L219K, V231I, N322C, T365C, N368H, E453Q 및 V463C에 상응하는 치환을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, L110C, T127C, A140C, A147C, N153C, A185P, L219K, V231I, N322C, T365C, N368H, E453Q, V463C 및 RQSR(서열번호: 1-7 중 어느 하나의 잔기 99-102)에 상응하는 RRRR(서열번호: 10)로의 치환을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, L110C, T127C, A140C, A147C, N153C, L219K, V231I, N322C, T365C, N368H, E453Q 및 V463C에 상응하는 치환을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 6항 내지 제 52항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 1-7 중 어느 하나의 잔기 87-104에 상응하는 GGGGSGGGGSR(서열번호: 8)로의 치환을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 1항 내지 제 53항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 조작된 디설파이드 결합, 적어도 하나의 공동 충전 치환 및 적어도 하나의 프롤린 치환의 조합을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 1항 내지 제 54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질이 서열번호: 14 또는 16과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 1항 내지 제 54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질이 서열번호: 15 또는 17과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 1항 내지 제 56항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 1-3의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는, 조작된 단백질.
- 제 1항 내지 제 56항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 3과 95% 동일성을 갖는 조작된 hMPV F 단백질 엑토도메인을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 1항 내지 제 58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 삼량체화 도메인에 융합되거나 접합된, 조작된 단백질.
- 제 59항에 있어서, 상기 단백질이 삼량체화 도메인에 융합된, 조작된 단백질.
- 제 60항에 있어서, 상기 삼량체화 도메인이 T4 피브리틴 삼량체화 도메인을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 1항 내지 제 58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 막횡단 도메인에 융합되거나 접합된, 조작된 단백질.
- 제 62항에 있어서, 상기 단백질이 막횡단 도메인에 융합된, 조작된 단백질.
- 제 62항에 있어서, 상기 막횡단 도메인이 메타뉴모바이러스(MPV) F 단백질 막횡단 도메인을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 1항 내지 제 62항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 신호 서열을 포함하는, 조작된 단백질.
- 제 65항에 있어서, N-말단 신호 서열이 MSWKVMIIISLLITPQHG(서열번호: 11)인, 조작된 단백질.
- 제 1항 내지 제 66항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 서브유닛을 포함하는 조작된 메타뉴모바이러스(MPV) F 단백질 삼량체.
- 제 67항에 있어서, 상기 삼량체가 야생형 메타뉴모바이러스(MPV) F 서브유닛의 삼량체에 비해 융합전 입체형태로 안정화된, 조작된 삼량체.
- 제 67항에 있어서, 상기 삼량체가 서브유닛 사이에 적어도 하나의 조작된 디설파이드 결합을 포함하는, 조작된 삼량체.
- 제 69항에 있어서, 서브유닛 사이의 적어도 하나의 조작된 디설파이드 결합이 S316C 및 D421C로부터 선택되는, 조작된 삼량체.
- 약제학적으로 허용되는 담체; 및 (i) 제 1항 내지 제 66항 중 어느 한 항의 조작된 단백질, 또는 (ii) 제 67항 내지 제 70항 중 어느 한 항의 조작된 삼량체를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제 71항에 있어서, 보조제를 추가로 포함하는, 조성물.
- 제 1항 내지 제 66항 중 어느 한 항의 조작된 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
- 제 73항에 있어서, 상기 핵산이 DNA 발현 벡터를 포함하는, 핵산.
- 제 73항에 있어서, 상기 핵산이 mRNA를 포함하는, 핵산.
- 유효량의 제 71항 또는 제 72항의 약제학적 조성물 또는 제 73항 내지 제 75항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 메타뉴모바이러스(MPV) 감염 또는 메타뉴모바이러스 감염과 관련된 질병을 예방하는 방법.
- 대상체에서 메타뉴모바이러스(MPV) 감염 또는 메타뉴모바이러스 감염과 관련된 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제 71항 또는 제 72항의 약제학적 조성물 또는 제 73항 내지 제 75항 중 어느 한 항의 핵산 분자.
- 메타뉴모바이러스(MPV) 감염 또는 메타뉴모바이러스 감염과 관련된 질병의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 있어서 제 71항 또는 제 72항의 약제학적 조성물 또는 제 73항 내지 제 75항 중 어느 한 항의 핵산 분자의 용도.
- 항체에 결합된 제 1항 내지 제 66항 중 어느 한 항의 조작된 단백질 또는 제67항 내지 제 70항 중 어느 한 항의 조작된 삼량체를 포함하는 조성물.
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