TR201802130T4 - Biyokimyasal olarak stabilize edilmiş HIV-1 env trimer aşısı. - Google Patents

Abstract

HIV-1'in bir klad A suşunun ve bir klad C suşunun stabilize trimerleri sağlanmaktadır. HIV-1'e karşı geniş çaplı nötrleştirici antiserumlar, HIV-1'e karşı geniş çaplı antierumların yapılması yöntemleri, HIV-1'e karşı geniş çaplı nötrleştirici aşılar ve ayrıca HIV ile enfekte süjelerin tedavi edilmesinin, HIV enfeksiyonun engellenmesinin ve HIV-aracılı aktivitelerin önlenmesinin yöntemleri sağlanmaktadır.

Description

TARIFNAME BIYOKIMYASAL OLARAK STABILIZE EDILMIS HIV-1 ENV TRIMER BULUSUN SAHASI Mevcut bulus, asilarin (örnegin, HIV-l asilarinin) olusturulmasi için yeni bilesimlerle ilgilidir.

BULUSUN ALT YAPISI Natif HIV-1 viryonu üzerinde Örtünün (Env) trimerik yapisini taklit eden immünojenler antikor-tabanli asilar olarak etkin sekilde izlenmektedir. Ancak, biyokimyasal olarak stabil, immünojen, trimerik Envimmünojenlerin üretilinesinin güç oldugu kanitlanmistir. Önceki teknik, (izole belirlenmis bir YU-ZSden), T4 fajinin fibritin proteininden sentetik bir trimerlesme motifine sahip yarilmamis bir HIVl enV proteininin içermektedir. 8 yayinindan bilinmektedir.

BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Bu spesifikasyonun ilgili oldugu bulus, spesifikasyona ekli istemlerde ortaya düzenlenmektedir.

Mevcut açiklama kismen, HIV-Pin klad bir C susunun stabilize bir trimerinin kesfine ve klad bir A susunun stabilize bir trimerinin ve klad bir C susunun 01201-P-0002 stabilize bir trimerinin her birinin in vi'vo genis çapli nötrlestirici bir antikor yanitina neden oldugunun sasirtici sekilde kesfedilmesine dayalidir.

Belirli yönlerde, HIV ile, örnegin, HIV-l ile enfekte bir süjenin, HIV ile enfekte bir süjenin bir HIV örtü glikoproteinin stabilize bir trimerini içeren izole bir polipeptitle temas ettirilmesi ve süjenin terapötik olarak tedavi edilmesi için süjede nötrlestirici (örnegin, genis çapli nötrlestiriei) antiserum üretilmesi dahil olmak üzere terapötik olarak tedavi edilmesinin bir yöntemi saglanmaktadir.

Belirli yönlerde, yöntem, klad A,nin, klad B,nin ve klad C°nin birinden veya daha fazlasindan seçilen HIV-Pin nötrlestirilmesini içerir. Diger yönlerde, yöntem bir gruptan seçilen bir veya daha fazla degisken döngü peptitlerini içerir. Diger Belirli yönlerde, HIV ile enfekte süjedeki HIV titresi, süjenin izole polipeptitle temas ettirilmesinden sonra azalir.

Belirli yönlerde, ihtiyaç duyan bir süjedeki bir HIV-aracili aktivitenin önlenmesinin bir yöntemi saglanmaktadir. Yöntem, HIV-enfekte bir süjenin, bir HIV örtü glikoproteininin stabilize bir trimerini içeren izole bir polipeptitle temas ettirilmesini ve HIV-aracili aktivitenin önlenmesi için süjede nötrlestirici (örnegin, genis çapli nötrlestirici) antiserum üretilmesini içerir. Belirli yönlerde, HIV-aracili aktivite viral olarak yayilir. Diger yönlerde, HIV-enfekte süjedeki HIV titresi, süjenin izole polipeptitle temas ettirilmesinden sonra azalir.

Belirli yönlerde, bir süjede HIV enfeksiyonunun önlenmesinin bir yöntemi saglanmaktadir. Yöntem bir süjenin, bir HIV örtü glikoproteininin stabilize bir trimerini içeren izole bir polipeptitle temas ettirilmesini ve süjede HlV°ye bagisikligin tetiklenmesini içerir.

Belirli yönlerde, bir asi saglanmaktadir. Asi, primer izolat CZA97.012 veya primer izolat 92UGO37.8”den türetilen bir izole gp140 polipeptidi içeren ve bir 01201-P-0002 oligomerlestirine alanina sahip stabilize bir trimer içerir. Asi, bir süjeye enjeksiyondan sonra HlVye karsi nötrlestirici (örnegin, genis çapli nötrlestirici) antiserumun üretimini saglar.

Diger yönlerde, gpl40'in bir izole, antijenik, stabilize trimeri saglanmaktadir. türetilen bir gpl40 polipeptidi ve bir oligomerlestirme alani içerir. Stabilize trimer, bir süjeye enjeksiyondan sonra HIV°ye karsi nötrlestirici (örnegin, genis çapli nötrlestirici) antiserumun üretimini saglar.

Yine diger yönlerde, gp140,1n bir antijenik, stabilize trimerini içeren bir polinükleotid kodlayan bir vektör saglanmaktadir. Vektör, primer izolat bir oligomerlestirme alani içerir. Belirli yönlerde, gpl40”in stabilize trimeri, V1, V2 ve V3°ten olusan gruptan seçilen bir veya daha fazla degisken döngü peptitlerini içerir. Diger yönlerde, gp140”in stabilize trimeri, SEQ ID NO:7 veya SEQ ID NO:8”e en az %85, %90, %95 veya daha fazla dizi özdesligine sahip bir amino asit dizisi içerir. Diger yönlerde, gp140'1n stabilize trimeri, SEQ ID NO:7 veya SEQ lD No:8 içeren bir amino asit dizisi içerir. Belirli yönlerde, gp140”1n stabilize trimeri, bir süjeye enjeksiyondan sonra HIVSye karsi genis çapli nötrlestirici antiserumun üretimini saglar.

SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekiller IA-IB, kobay serumunda gpl40,a karsi ELISA titrelerini grafik olarak göstermektedir. Her bir bagisiklamadan 4 hafta sonra elde edilen serum, (A) klad A ve (B) klad C ile asilanan kobaylardaki klad A ve klad C trimerlerine karsi uç noktasi ELISA`larda test edildi. Grafikler her bir zaman noktasi için +/- standart sapma geometrik ortalamasini göstermektedir. Yatay çizgi arka plan esigini isaret etmektedir. 01201-P-0002 Sekiller 2A-2B, katman 2 virüslerine karsi nötrlestirici antikor (NAb) titrelerinin özetlerini grafik olarak göstermektedir. Alti adet klad A (kirmizi), klad B (mavi) ve klad C (yesil) katman 2 primer izolatlarina karsi NAb titreleri, her bir kobay için özetlenmektedir. Bagisiklama (A)- öncesi ve (B)-sonrasi. Yatay çizgi, pozitiflik için >60 kesmeyi göstermektedir.

Sekiller 3A-3B, katman 2 klad C virüsü ZM109F.PB4,e karsi saIlastirilmis IgG ile numune ham nötrlestirilmesini grafik olarak göstermektedir. (A) klad A veya (B) klad C trimeriyle bagisiklanmis kobaylardan ve naif kontrol hayvanlarindan gelen satlastirilmis IgG”nin seri seyreltmeleri, katman 2 klad C virüsü ZM109F.PB4,e karsi NAb aktivitesi için test edildi.

Sekiller 4A-4D, degisken döngü peptitlere karsi antikor yanitlarini göstermektedir. (A) klad A ve (B) klad C trimeriyle bagisiklanmis hayvanlardan gelen bagisiklama-öncesi ve _sonrasi serum, homolog ve heterolog V1, V2 ve V3 döngü peptitlerine karsi ELISA ile degerlendirildi. Grafik, her bir grup için +/- standart sapma geometrik ortalama titrelerini göstermektedir. Yatay çizgi arka plan esigini göstermektedir. (C) Klad A (kobay #5) ve klad C (kobay #10) trimerleriyle bagisiklanan temsilci hayvanlarin serumundan elde edilen satlastirilrnis sonra SF162.LS (katman l-B), ZM109F.PB4 (katman 2-C) ve virüslerine karsi TZM.bl nötrlestirici tahlillerde test edildi.

(D) Dogrusal 92UG ve CZA97012 (SEQ lD NO,lar:4, 6 ve 8) V1-V3 peptit döngülerinin dizi hizalanmasi. Gri tonlamali olarak vurgulanan amino asit kalintilari, 0 konumdaki diziler arasindaki hoinolojiyi gösterinektedir.

Sekiller 5A-5D, heterolog hazirlik/güçlendirme asilama dozajlarinin ardindan gpl40”a karsi ELISA titrelerini grafik olarak göstermektedir.

DNA/protein güçlendirme gruplarinda (A, B) ve DNA/rAd26 gruplarinda (C, D) her bir asilamadan 4 hafta sonra elde edilen serumlar ELISA'larla 01201-P-0002 degerlendirildi. Grafikler her bir zaman noktasi +/- standart sapma için geometrik ortalama titrelerini göstermektedir. 3*, 3 bagisiklaina sonrasindaki ancak güçlendirme öncesindeki ELISA titrelerini isaret etmektedir. Yatay çizgi, arka plan esigini göstermektedir.

Sekil 6, TZM-bl tayinlerindeki kobay serumunun HIV-katman 1 ve 2 nötrlestirme katmanlarini göstermektedir. Bagisiklama-öncesi (Ön) ve sonrasi 3ncü trimer asilamasi (Post) serumlari TZM.bl nötrlestirme tayinlerinde katman 1 ve katman 2 klad A, B ve C psödovirüslerine karsi test edildi. Gösterilen degerler, her bir hayvan için ID50 titrelerini temsil eden serum seyreltileridir. Sariyla vurgulanan degerler su sekilde tanimlanan pozitif degerleri isaret etmektedir: (i) bagisiklama-öncesi arka planin >3-kat yukarisinda (ii) bir murin lösemi virüsü (MuLv) kontrolünün >2-kat yukarisinda ve (iii) mutlak ID50 titresi >60.

Sekil 7, katman 2 klad A, B ve C virüslerine karsi NAb titrelerinin bir özetini göstermektedir. Test edilen pozitif numunelerin adedi ve yüzdesi gösterilmektedir.

Sekil 8, seçili katman 1 ve 2 izolatlarinin saflastirilmis kobay IgGssi ile TZM.bl nötrlestirme tayinlerinde, katman 1 ve 2 virüslerinin seçili bir paneline karsi test edildi. Veriler IC50 titreleri olarak tig/ml birimiyle temsil edilmektedir (daha düsük sayilar daha iyi nötrlestirmeyi yansitmaktadir). Sariyla vurgulanan degerler, pozitif nötrlestirici aktiviteye sahip numuneleri isaret etmektedir.

Sekil 9, hazirlik/güçlendirme asilama dozajlarini takiben TZM.blade kobay serumlarinin HIV-1 katman l nötrlestirme katmanlarini göstermektedir.

Kobaylardan bagisiklama-öncesi, üçüncü DNA asilamasi-sonrasi ve rAd26/pr0tein güçlendirme sonrasi serumlar, TZM.bl nötrlestirme tayinlerinde katman l virüslerine karsi NAb yanitlari için test edildi.

Gösterilen degerler, her bir hayvan için ID50 titrelerini temsil eden serum seyreltileridir. Vurgulanan degerler pozitif yanitlari isaret etmektedir. 01201-P-0002 Sekil 10, CD4'e (sol panel, Kd = ve 2G12'ye (sag panel, Kd = baglanan 92UGO37.8-gpl4O-Fd7nin bir yüzey plazminojen rezonans tayinini göstermektedir.

Sekil 11, mAb l7b”ye (sol panel) ve Küme l mAb,lere (sag panel) baglanan 92UG037.8-gp140-Fd,nin bir yüzey plazminojen rezonans tayinini göstermektedir.

NO:1) ve CZA ainino asit dizilerini göstermektedir.

Sekil 13, foldon-stabilize HIV-1 gp140 trimerlerini (gp140-Fd) sematik olarak göstermektedir. Gp160 tam-boy öncüldür. gp120 ve gp41”in çesitli segmentleri su sekilde tayin edilmektedir: Cl-C5, korunmus gruplar 1-5; V1-V5, degisken bölgeler 1-5; F, ûizyon peptidi; HRl, yedi degerli yineleme 1; C-C döngüsü, korunmus bir disülfit bagiyla korunmus bir immüno-baskin döngü; HR2, yedi degerli yineleme 2; MPER, membran yakinsal harici bölge; TM, transmembran tutturmasi; CT, sitoplazmik kuyruk. Gp140-Fd, C-ucunda bir T4 fibritinfoldontrimerlesme etiketine ve His etiketine sahip gpl60sin yarilmamis ekto-alanini temsil etmektedir.

DETAYLI AÇIKLAMA HIV-l tarafindan tetiklenen birçok antikor, ya nötrlestirici-olmadiklarindan veya dar sekilde izolat-özgül oldugundan, enfeksiyonun baslamasini veya yayilmasini engellemede etkisizdir. HIV asisi gelistirrnedeki en büyük zorluklardan biri, küresel pandeiniyi karakterize eden ters HIV-l suslarina karsi koruyucu, nötrlestirici antikorlari tetikleyebilen bir HIV Örtü immünojen tasarlamaktir.

Gerçekten de, örtü glikoprotein üzerindeki nispeten korunmus bölgeleri taniyan kismen, sasirtici sekilde genis çapli i'n vivo bir nötrlestirici antikor yaniti saglayan stabilize trimerik HIV-l örtü proteinlerinin olusumuna dayalidir. 01201-P-0002 Burada tarif edilen bilesikler ve yöntemler, bir veya daha fazla multimerik yüzey proteinine sahip bir veya daha fazla patojenin (örnegin, virüsler, bakteriler, mantarlar, parazitler ve benzerleri) enfektivitesini önlemek veya azaltmakta kullanilabilir. Mevcut açiklama kismen, bir insan bagisiklik-yetmezligi virüsünün (örnegin, HIV-1) örtü proteininin (örnegin, gp4l) stabilize oligomer (örnegin, trimer) yapilarina ve bunlarin kullanimina yöneliktir. Belirli yönlerde, burada tarif edilen bilesikler ve yöntemler, bir süjedeki bir veya daha fazla HIV-aracili aktiviteleri (örnegin, enfeksiyon, füzyon (örnegin, hedef hücre girisi ve/veya sinsisya olusumu), viral yayilma ve benzerleri), dolayisiyla HIV titresini azaltabilen sekilde önlemek veya azaltmak için kullanilir.

Burada kullanildigi sekliyle, HIV”ye göre “önleme” veya “azaltma” terimleri, bir HIV-aracili aktivitenin (örnegin, enfeksiyon, füzyon (örnegin, hedef hücre girisi ve/veya sinsisya olusumu), viral yayilma ve benzerleri) bir önlenmesini veya azaltilmasini ve/veya viral titredeki bir azalmayi ifade etmektedir. Örnegin, bir HIV, Retroviri'dae familyasinin parçasi olan Lentivirinae sinifinin bir üyesidir.

HIV,nin iki türü insanlari enfekte etmektedir: HIV-1 ve HIV-2. Burada kullanildigi sekliyle, “insan bagisiklik yetmezligi virüsü” ve “HIV” terimleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, HIV-1 ve HIV-?yi ifade etmektedir. Belirli emsal uygulamalarda, burada tarif edilen örtü proteinler, taninan lentivirüslerin bes serogrubunun herhangi birini temsil edenleri ifade etmektedir: primat (örnegin HIV-1, HIV-2, simyan bagisiklik yetmezligi virüsü (SIV)); koyun ve keçi (örnegin visna virüsü, kaprin artirit ansefalit virüsü); at (ekuin enfeksiyöz anemi virüsü); kedi (örnegin felin bagisiklik yetmezligi virüsü (FIV)); ve sigir (Örnegin bovin bagisiklik yetmezligi virüsü (BlV)) (Bakiniz Virüslerin Taksonoinisi için Uluslararasi Komite tanimlamalari). 01201-P-0002 HIV, yüksek düzeyde genetik uyusinazligina sahip çoklu kladlar olarak kategorize edilir. Burada kullanildigi sekliyle, “klad” terimi, genetik benzerlik seviyelerine göre siniflandirilan ilgili insan bagisiklik yetmezligi virüslerini ifade etmektedir.

Halihazirda üç adet HlV-l izolat grubu bulunmaktadir: M, N ve 0. Grup M (ana suslar), A ile J arasinda en az on kladdan olusur. Grup 0 (dis suslar) benzer bir sayida kladlardan olusur. Grup N, ne M ne de O grubuna kategorize edilmemis yeni bir HIV-l izolatidir. Belirli emsal uygulamalarda, burada tarif edilen genis çapli nötrlestirici bir antikor iki, üç, dört, bes, alti, yedi, sekiz, dokuz, on veya daha fazla kladi ve/veya iki veya daha fazla HIV grubunu taniyacak ve bunlara karsi bir bagisiklik yaniti verecektir.

Burada kullanildigi sekliyle, “örtü glikoprotein” terimi, bununla sinirli kalmamak kaydiyla, HIV viryonlarinin yüzeyinde ve HIV enfekte hücrelerin plazma inembranlarinin yüzeyinde eksprese edilen glikoproteini ifade etmektedir. Env bir T-yardimci hücresi gibi bu tip bir reseptöre sahip hedef bir hücre üzerindeki CD4 reseptörüne baglanir. Gp41 esdegerli-olmayan sekilde gp120sye baglidir ve HIV°nin hücreye girdigi ikinci adimi saglar. Özgün olarak viral örtü içerisinde gömülüdür ancak gp120 bir CD4 reseptörüne baglandiginda, gpl20, gp417in konak hücreyle kaynasmaya yardimci olabildigi sekilde açiga çikmis hale gelmesine neden olarak yapisini degistirir.

Burada kullanildigi sekliyle, bir protein ve/veya polipeptidin baglaminda kullanildiginda “oligomer” teriminin, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, en az iki alt biriine sahip bir proteini veya polipeptidi içermesi amaçlanmaktadir.

Oligomerlere, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, dimerler, trimerler, tetramerler, pentamerler, heksamerler, heptamerler, oktamerler, nonamerler, dekamerler ve benzerleri dahildir.

Burada kullanildigi sekliyle, “stabilize oligomer” terimi, bununla sinirli kalmamak kaydiyla, oligomerik yapinin (örnegin, bir veya daha fazla oligomerlesme alaninin 01201-P-0002 varligi vasitasiyla) stabilitesini arttiran (örnegin, oligomerin monomerik birimler içine ayrisma yetisini indirgeyen) bir protein ve/veya polipeptit dizisi içeren bir oligomeri ifade etmektedir. Belirli emsal uygulamalarda, stabilize bir oligomer stabilize bir trimerdir.

Burada kullanildigi sekliyle, “oligomerlesme alani” terimi, bununla sinirli kalmamak kaydiyla, bir oligomerik-örtü proteininin stabilitesini arttirmak, örnegin, bir HIV gp41 trimerinin stabilitesini arttirmak için kullanilabilen bir polipeptit dizisini ifade etmektedir. Oligomerlesme alanlari, homo-oligomerik polipeptitlerin yani sira hetero-oligomerik polipeptitlerin stabilitesini arttirmak için kullanilabilir. Oligomerlesme alanlari teknikte iyi bilinmektedir.

Burada kullanildigi sekliyle, “trimerlesme alani” ve “trimerlesme etiketi” terimleri, trimerik polipeptitleri (örnegin, bir gp4l homo-trimerik polipeptidi) stabilize eden bir oligomerlesme alanini ifade etmektedir. Trimerlesme alanlarinin örneklerine, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, T4-fibritin “foldon” trimeri; trimer etiketi olarak E. 0011' aspartat transkarbamoilazin katalitik alt birimi (Chen bilinmektedir.

Burada kullanildigi sekliyle, “protein etiketi” terimi, bununla sinirli kalmamak kaydiyla, çesitli amaçlar için bir baska polipeptit dizisine eklenebilen bir polipeptit dizisini ifade etmektedir. Belirli emsal uygulamalarda, bir protein etiketi, artik gerekli olmadiginda daha büyük bir polipeptit dizisinden çikarilabilir.

Protein etiketlerine, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, afinite etiketleri (örnegin, poli-His etiketleri, kitin baglayici protein (CBP), maltoz baglayici protein (MBP), glutation-s-transferaz (GST) ve benzerleri), çözünürlestirme etiketleri (örnegin, tioredoksin (TRX), poli(NANP) MPB, GST ve benzerleri dahildir), kromatografi etiketleri (örnegin, F LAG epitopu gibi polianyonik ainino asitler), epitop etiketleri (örnegin, F LAG-etiketi, V5-etiketi, c-mik-etiketi, HA-etiketi ve benzerleri), isima 01201-P-0002 etiketleri (Örnegin, yesil isima proteini (CFP) ve benzerleri), biyoisima etiketleri (örnegin, lusiferaz (örnegin, bakteriyel, atesböcegi, takla böcegi, deniz meneksesi (Renilla) ve benzerleri), lusiferin, aekuroin ve benzerleri), enzim modifikasyon etiketleri (örnegin, biyotin ligazi ve benzerleri) ve benzerleri dahildir. Protein etiketleri teknikte iyi bilinmektedir ve belirteçleri siklikla piyasada bulunmaktadir.

Burada tarif edilen bir örtü glikoproteinin stabilize bir trimeri, bir bagisiklik yanitinin tesvik edilmesinin arzu edildigi bir süjeye verilebilir. Burada tarif edilen bir örtü proteinin bir veya daha fazla stabilize trimerini kodlayan bir nükleik asit dizisi, bir bagisiklik yanitinin tesvik edilmesinin arzu edildigi bir süjeye verilebilir.

Dolayisiyla, burada tarif edilen bir veya daha fazla stabilize oligomer (örnegin, stabilize trimerler), HIV ile enfeksiyonu önlemek veya engellemek için ve/veya enfekte bir bireyde HIVanin yayilmasini önlemek veya engellemek için, bir süjede anti-oligomer (örnegin, anti-trimer) antikorlarin üretilmesi amaciyla immünojenler olarak kullanilabilir. Burada tarif edilen bir örtü glikoproteinin bir veya daha fazla stabilize oligomeri (örnegin, stabilize trimerler), poliklonal ve monoklonal antikor hazirligi için standart teknikler kullanilarak dogal-tip örtü glikoproteinini (yani, gp4l ve/veya gp160) baglayan antikorlar olusturmak için bir immünojen olarak kullanilabilir.

Bir örtü glikoproteininin stabilize bir oligomeri (örnegin, stabilize trimeri), bir konakta genis çapli nötrlestirici bir antikor yanitini saglayabilir. Burada kullanildigi sekliyle, “nötrlestirici antikor yaniti” ve “genis çapli nötrlestirici antikor yaniti” terimleri teknikte iyi bilinmektedir ve bir veya daha fazla antikorun, enfeksiyöz ajanin virülansini yok etmek veya büyük ölçüde indirgeme için enfeksiyöz bir ajanla tepkiineye girme yetisini ifade etmektedir. Bu tip bir yanitin varligi, enfeksiyonun olusmasini engelleme ve/veya HIV ile enfekte olmus hücrelerin sayisini, potansiyel olarak viral yayilmayi geciktirerek ve enfekte konakta viral çogalmanin daha iyi bir kontrolüne olanak saglayarak kayda deger 01201-P-0002 sekilde indirgeme potansiyeline sahiptir. HIV7ye karsi genis çapli bir nötrlestirici antikor tipik olarak, HlV”nin çesitli farkli kladlarini, gruplarini veya mutantlarini baglayacaktir.

Burada kullanildigi sekliyle, “bagisiklik yaniti” teriminin amaci, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, T ve/veya B hücre yanitlarini, yani, hücresel ve/veya hümoral bagisiklik yanitlarini içermektir. Bir süjenin bagisiklik yaniti, örnegin, antikor üretiminin, bagisik hücre çogalmasinin, sitokinlerin saliminin, hücre yüzeyi markörlerinin ekspresyonunun, sitotoksisitenin ve benzerlerinin tayin edilmesiyle belirlenebilir. Burada kullanildigi sekliyle, “bagisik hücre” teriminin amaci, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, hematopoietik kökenli olan ve bir bagisiklik yanitinda bir rol oynayan hücreleri içermektir. Bagisik hücrelere, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, B hücreleri ve T hücreleri gibi lenfositler; inonositler, makrofajlar, eosinifiller, mast hücreleri, bazofiller ve granülositler gibi miyeloid hücreleri dahildir.

Bir örtü glikoproteinin stabilize bir oligomeri (örnegin, trimeri) tipik olarak, uygun bir süjenin (örnegin, tavsan, kobay, keçi, fare veya diger memeli) immünojenle bagisiklanmasiyla antikorlarin hazirlanmasi için kullanilir. Uygun bir immünojen preparat, örnegin, bir örtü glikoproteinin rekombinan olarak eksprese edilen bir stabilize trimerini veya bir örtü glikoproteinin kimyasal olarak sentezlenen bir stabilize trimerini ihtiva edebilir. Preparat ayrica, Freundaun tam veya tamamlanmamis adjuvani, Ribi adjuvani veya benzer bagisiklik-uyarici ajan gibi bir adjuvan içerebilir. Uygun bir süjenin, bir örtü glikoprotein preparatinin immünojen bir stabilize oligomeriyle (Örnegin, trimeriyle) bagisiklanmasi, bir poliklonal anti-örtü (örnegin, anti-gp4l ve/Veya anti-gp160) antikor yanitini, örnegin, bir anti-HIV antikor yanitini içerir.

Anti-stabilize gp4l trimer antikorlari saglanmaktadir. “Antikor” terimi burada kullanildigi sekliyle, immünoglobülin moleküllerini ve immünoglobülin moleküllerinin immünolojik olarak aktif kisimlarini, yani, örtü glikoproteini 01201-P-0002 (örnegin, gp4l ve/veya gp160) gibi bir antijeni spesifik olarak baglayan (bununla immün-tepkimeye giren) bir antijen baglama alani ihtiva eden molekülleri ifade etmektedir. Immünoglobülin moleküllerinin immünolojik olarak aktif kisimlarinin örneklerine, antikorun pepsin gibi bir enzimle muamele edilmesiyle olusturulabilen F(ab) ve F(ab')2 fragmanlari dahildir. Belirli yönlerde, örtü glikoproteini (örnegin, gp4l ve/veya gpl60) baglayan poliklonal ve/veya monoklonal antikorlar saglanmaktadir. “Monoklonal antikor” veya “monoklonal antikor bilesimi” terimi burada kullanildigi sekliyle, örtü glikoproteinin (örnegin, gp41 ve/veya gp160) belirli bir epitopuyla immün-tepkimeye girebilen bir antijen baglama alaninin sadece bir türünü ihtiva eden antikor moleküllerinin bir popülasyonunu ifade etmektedir. Bir monoklonal antikor bilesimi böylelikle tipik olarak, immün-tepkimeye girdigi belirli bir örtü glikoproteini (örnegin, gp41 ve/veya gp160) için tekli bir baglanma atinitesi sergiler.

Poliklonal anti-stabilize trimer örtü glikoproteini (örnegin, gp41 ve/veya gp160) antikorlari, yukarida tarif edildigi sekilde, uygun bir süjenin, burada tarif edildigi üzere bir örtü glikoproteini immünojeninin stabilize bir oligomeriyle (örnegin, trimeriyle) bagisiklanmasiyla hazirlanabilir. Bagisiklanan süjedeki bir örtü glikoprotein titresinin anti-stabilize trimeri zaman içerisinde, immobilize gp4l kullanan enzim bagli immünosorban tayini (ELISA) gibi standart tekniklerle izlenebilir. Arzu edilirse, gp4l'e karsi yönlendirilen antikor molekülleri memeliden (örnegin, kandan) izole edilebilir ve IgG kesitini elde etmek için protein A kromatografisi gibi iyi bilinen tekniklerle daha da saflastirilabilir.

Bagisiklamadan sonra uygun bir zamanda, örnegin, anti-gp4l antikoru titreleri en yüksek oldugunda, antikor-üreten hücreler süjeden elde edilebilir ve özgün olarak hybridoina technique (Kozbor et al. (1983) lminunol. Today 4:72), the EBV- hybridoma technique (Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies ve Cancer 01201-P-0002 Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) veya triom teknikleri gibi standart tekniklerle monoklonal antikorlar hazirlamak için kullanilabilir. Monoklonal antikor hibridomlarinin üretilmesi için teknoloji iyi bilinmektedir (bakiniz genel olarak, R. H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension [n Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, N.Y. (1980); E. A.

Genet. 3:231-36). Kisaca, ölümsüz bir hücre çizgisi (tipik olarak bir miyelom), yukarida tarif edilen sekildeki bir örtü glikoproteinin stabilize bir trimeriyle bagisiklanan bir memeliden gelen lenfositlere (tipik olarak splenositlere) kaynastirilir ve ortaya çikan hibridoma hücrelerinin kültür süzüntüleri, gp4l”i baglayan bir monoklonal antikor üreten bir hibridomu tanimlamak için elenir.

Lenfositlerin ve ölümsüzlestirilmis hücre çizgilerinin kaynastirilmasi için kullanilan birçok iyi bilinen protokolün herhangi biri, bir örtü glikoprotein monoklonal antikorun bir anti-stabilize trimerinin olusturulmasi ainaciyla yukarida anilan Gefter et al. Somatic Cell Genet.; Lerner, Yale J. Biol. Med. (yukarida); Kenneth, Monoclonal Antibodies, (yukarida)). Dahasi, teknikte normal uzmanliga sahip kisi, bu tip yöntemlerin yine yararli olabilecek birçok varyasyonunun oldugunu da anlayacaktir. Tipik olarak, ölümsüz hücre çizgisi (örnegin, bir miyelom hücre çizgisi), lenfositlerle oldugu gibi ayni memeli türünden türetilir. Örnegin, murin hibridomlari, mevcut bulusun bir immünojen preparatiyla bagisiklakan bir fareden gelen lenfositlerin, ölümsüzlestirilmis bir fare hücre çizgisiyle kaynastirilmasiyla yapilabilir. Özellikle uygun ölümsüz hücre çizgileri, hipoksantin, aminopterin ve tiinidin ihtiva eden kültür vasatina (“HAT vasati”) duyarli fare miyelom hücre çizgileridir. Standart tekniklere göre bir kaynasma ortagi olarak, miyelom hücre çizgilerinin, örnegin, P3-NSl/l-Ag4- 1, P3-x63-Ag8.653 veya SpZ/O-Agl4 miyelom çizgilerinin herhangi bir sayisi kullanilabilir. Bu miyelom çizgileri ATCCden temin edilebilir. Tipik olarak, HAT-duyarli fare miyelom hücreleri, polietilen glikol (“PEG”) kullanilarak fare splenositlerine kaynastirilir. Kaynastirmadan ortaya çikan hibridom hücreleri daha 01201-P-0002 sonra, kaynasmamis ve verimsiz sekilde kaynasmis miyelom hücrelerini öldüren (kaynasmamis splenositler birkaç gün sonra ölür çünkü dönüsmemislerdir) HAT vasati kullanilarak seçilir. Bir örtü glikoproteinin stabilize bir trimerinin bir monoklonal antikorunu üreten hibridom hücreleri, örnegin, bir standart ELISA tayini kullanilarak, gp417i baglayan antikorlar için hibridom kültür süzüntülerinin elenmesiyle saptanir.

Monoklonal antikor-salgilayan hibridomlarin hazirlanmasina alternatif olarak, bir örtü glikoprotein antikorunun bir monoklonal anti-stabilize trimeri, gp41'i baglayan immünoglobülin kitapligi üyelerinin izole edilmesi için, bir rekombinan kombinatoryal immünoglobülin kitapliginin (örnegin, bir antikor faj görüntüleme kitapliginin) bir gp4l proteiniyle taranmasiyla tanimlanabilir ve izole edilebilir.

Faj görüntüleme kitapliklarini olusturmak ve taramak için kitler piyasada bulunmaktadir (örnegin, Recombinant Phage Antibody System, Pfizer, New York, NY; ve SURFZAPTM Phage Display Kit, Stratagene, La Jolla, CA). Ek olarak, antikor görüntüleme kitapliginin olusturulmasinda ve taranmasinda kullanim için özellikle uygun yöntemlerin ve belirteçlerin örnekleri, örnegin su belgelerde bulunabilir; Ladner et al. U.S. Pat. No. 5.223.409; Kang et al. PCT Uluslararasi Basvuru No. WO 92/18619; Dower et al. PCT Uluslararasi Basvuru No. WC PCT Uluslararasi Basvuru No. WC 92/ 15679; Breitling et al. PCT Uluslararasi Basvuru WO93/01288; McCafferty et al. PCT Uluslararasi Basvuru No. WO 01201-P-0002 Ek olarak, bir örtü glikoprotein antikorunun, hem insan hem insan-olmayan kisimlar içeren, standart rekombinan DNA teknikleri kullanarak yapilabilen, kimerik ve insanlastirilmis monoklonal antikorlar gibi rekombinan anti-stabilize trimeri, bulusun kapsami dahilindedir. Bu tip kimerik ve insanlastirilmis monoklonal antikorlar teknikte bilinen rekombinan DNA teknikleriyle, örnegin asagidaki belgelerde tarif edilen yöntemler kullanilarak üretilebilir; Robinson et al. Uluslararasi Basvuru No. PCT/US86/02269; Akira. et al. Avrupa Patent et al. Avrupa Patent Basvurusu 173.494; Neuberger et al. PCT International Bir süjenin bir insan bagisiklik yetmezligi virüsüne bagisiklik yanitini güçlendirmek için bilesimler ve yöntemler saglanmaktadir. Burada kullanildigi sekliyle, “süje” ve “konak” terimlerinin amaci, memeliler gibi canli organizmalari içermektir. Süjelerin ve konaklarin örneklerine, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, atlar, inekler, koyunlar, domuzlar, keçiler, köpekler, kedler, tavsanlar, kobaylar, siçanlar, fareler, çöl fareleri, insan-olmayan primatlar (örnegin, makaklar), insanlar ve benzerleri, örnegin, kuslar (örnegin, tavuklar veya ördekler), baliklar veya kurbagalar (örnegin, Xenopus) gibi memeli-olmayan omurgalilar ve memeli-olmayan omurgasizlarin yani sira bunlarin transjenik türleri de dahildir. 01201-P-0002 Örnegin, ekspresyon vektörleri gibi, burada tarif edilen bir örtü proteininin bir veya daha fazla stabilize trimerini kodlayan bir nükleik asit ihtiva eden vektörler saglanmaktadir. Burada kullanildigi sekliyle, “vektör” terimi, baglanmis oldugu bir baska nükleik asidi tasiyabilen bir nükleik asit molekülünü ifade etmektedir.

Vektörün bir tipi, “içine ilave DNA seginentlerinin baglanabildigi bir dairesel çift sarmalli DNA döngüsünü ifade eden bir ““plazmiddir”. Vektörün bir baska tipi bir viral vektördür, burada ilave DNA segmentleri viral genomun içine baglanabilir.

Belirli vektörler, içine eklendikleri bir konak hücrede otonom çogalabilme yetenegine sahiptir (örnegin, bir bakteriyel çogalma kökenine sahip bakteriyel vektörler ve epizomal memeli vektörleri). Diger vektörler (örnegin, epizomal- olmayan memeli vektörleri) bir konak hücrenin genomunun içine konak hücrenin içine eklenmeleri üzerine bütünlestirilir ve böylelikle konak genomuyla birlikte çogalirlar. Dahasi, belirli vektörler, uygun sekilde bagli olduklari genlerin ekspresyonunu yönlendirebilir. Bu tip vektörler burada “ekspresyon vektörleri” olarak ifade edilmektedir. Genelde, rekoinbinan DNA tekniklerinde faydalanilan ekspresyon vektörleri siklikla plazmidler biçimindedir. Mevcut spesifikasyonda, amaci, ekspresyon vektörlerinin, Viral vektörler (örnegin, çogalma kusurlu retrovirüsler, adenovirüsler ve adeno-iliskili virüsler) gibi, esdeger islevler sunan bu tip diger biçimlerini de içermektir.

Belirli yönlerde, rekombinan ekspresyon vektörleri, bir konak hücrede nükleik asit dizisinin ekspresyonu için uygun bir biçimde bir nükleik asit dizisi (örnegin, burada tarif edilen bir örtü proteininin bir veya daha fazla stabilize trimerini kodlayan bir nükleik asit dizisi) içerir, yani rekombinan ekspresyon vektörleri, ekspresyon için kullanilacak konak hücrelere dayali olarak seçilen, eksprese edilecek olan nükleik asit dizisine uygun sekilde bagli bir veya daha fazla düzenleyici dizi içerir. Bir rekoinbinan ekspresyon vektörü içerisinde, “uygun sekilde bagli” ifadesi, bir örtü proteininin bir veya daha fazla stabilize trimerini kodlayan nükleotid dizisinin düzenleyici diziye (dizilere), (örnegin, bir in vitro transkripsiyon/trarislasyon sisteminde veya vektör konak hücrenin içine 01201-P-0002 eklendiginde bir konak hücrede) nükleotid dizisinin ekspresyonuna olanak saglayacak bir biçimde baglandigi anlamina gelme amaçlidir. “Düzenleyici dizi” terimi, promotörleri, güçlendiricileri ve diger ekspresyon kontrol ögelerini (örnegin, poliadenilasyon sinyalleri) içerme amaçlidir. Bu tip düzenleyici diziler, örnegin, Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)›da tarif edilmektedir. Düzenleyici dizilere, konak hücrelerin birçok tipinde bir nükleotid dizisinin yapisal ekspresyonunu yönetenler ve nükleotid dizisinin ekspresyonunu yalnizca belirli konak hücrelerde yönetenler (örnegin, dokuya-özgü düzenleyici diziler) dahildir.

Teknikte uzman kisiler tarafindan, ekspresyon vektörünün tasariminin, dönüstürülecek olan konak hücrenin seçimi, istenen proteinin ekspresyon seviyesi ve benzerleri gibi faktörlere bagli olabilecegi anlasilacaktir. Burada tarif edilen ekspresyon vektörleri, bu sayede, füzyon proteinleri veya bunlarin kisimlari dahil olmak üzere, burada tarif edilen sekilde nükleik asitler tarafindan kodlanan proteinlerin veya bunlarin kisimlarinin (örnegin bir örtü proteininin bir veya daha fazla stabilize trimeri) üretilmesi için konak hücrelerin içine eklenebilir.

Belirli yönlerde, burada tarif edilen nükleik asit molekülleri vektörlerin içine sokulabilir ve gen terapisi vektörleri olarak kullanilabilir. Gen terapisi vektörleri br süjeye, örnegin, intravenöz enjeksiyon, lokal uygulama (bakiniz, örnegin, U.S.

Patent No. 5.328.470) veya stereotaktik enjeksiyon (bakiniz, örnegin, Chen et al. vektörünün farmasötük preparati gen terapisi vektörünü kabul edilir bir seyreltici içinde içerebilir veya gen aktarimi aracinin içine yerlestirildigi bir yavas salimli anayapi içerebilir. Alternatif olarak, tam gen aktarim vektörünün rekombinan hücrelerden, örnegin, retroviral vektörlerden, adeno-iliskili Virüs vektörlerinden ve benzerlerinden bozulmamis üretilebildigi durumlarda, farmasötik preparat gen aktarim sistemini üreten bir veya daha fazla hücre içerebilir (gen terapisi vektörlerinin incelemeleri için bakiniz Gardlik et al. (2005) Med. Sci. Mon. 01201-P-0002 Rekombinan ekspresyon vektörleri, bir Örtü proteinin bir veya daha fazla stabilize trimerini kodlayan vektörün prokaryotik veya ökaryotik hücrelerde ekspresyonu için tasarlanabilir. Örnegin, bir örtü proteinin bir veya daha fazla stabilize trimerini kodlayan bir veya daha fazla vektör, E. 0011', böcek hücreleri (örnegin, bakulovirüs ekspresyon vektörleri kullanilarak), maya hücreleri veya memeli hücreleri gibi bakteriyel hücrelerde eksprese edilebilir. Uygun konak hücreler ayrintili olarak, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (l990)°da tartisilmaktadir. Alternatif olarak, rekombinan ekspresyon vektörü, örnegin T7 promotör düzenleyici dizileri ve T7 polimerazi kullanilarak in vitro transkribe edilebilir ve çevrilebilir.

Proteinlerin prokaryotlarlarda ekspresyonu en siklikla, ya füzyon veya füzyon- olmayan proteinlerin ekspresyonunu yöneten yapisal veya tetiklenebilir promotörler ihtiva eden vektörlere sahip E. coliide gerçeklestirilir. Füzyon vektörleri burada kodlanan bir proteine, çogunlukla rekombinan proteinin amino ucuna birkaç adet amino asit ekler. Bu tip füzyon vektörleri tipik olarak üç amaca hizmet eder: 1) rekombinan proteinin ekspresyonunu arttirmak; 2) rekombinan proteinin çözünürlügünü arttirmak ve 3) afinite saflastimiasinda bir ligand görevi görerek rekombinan proteinin saflastirilmasina yardim etmek. Siklikla, füzyon ekspresyon vektörlerinde, füzyon proteininin saflastirilmasini takiben rekombinan proteinin füzyon kesitinden ayrilmasini saglamak için füzyon kesitiyle rekombinan proteinin kesisiminde bir proteolitik yarilma alani eklenir. Bu tip enzimlere ve bunlarin soydas tanima dizilerine, Faktör Xa, trombin ve enterokinaz dahildir. Tipik füzyon ekspresyon vektörlerine, hedef rekombinan proteine, sirasiyla, glutation S-transferaz (GST), maltoz E baglayici protein veya A proteini kaynastiran pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. ve Johnson, K. S. (1988) Gene ; ve pRlTS (Pharmacia, Piscataway, N.J.) dahildir.

Bir baska yönde, bir örtü proteinin bir veya daha fazla stabilize trimerini kodlayan ekspresyon fektörü bir maya ekspresyon vektörüdür. S. cerevi'si'ae mayasinda 01201-P-0002 ekspresyon için vektörlerin örneklerine pYepSecl (Baldari, et. al., (1987) EMBO Diego, Calif.); ve picZ (lnvitrogen Corporation) dahildir.

Alternatif olarak, bir örtü proteinin bir veya daha fazla trimeri böcek hücrelerinde bakulovirüs ekspresyon vektörleri kullanilarak eksprese edilebilir. Kültürlenmis böcek hücrelerinde (Örnegin, Sf9 hücreleri) proteinlerin ekspresyonu için mevcut bakulovirüs vektörlerine pAc serisi (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156- Belirli yönlerde, burada tarif edilen bir nükleik asit memeli hücrelerinde, bir memeli ekspresyon vektörü kullanilarak eksprese edilir. Memeli ekspresyon (Kaufman et al. ( dahildir. Memeli hücrelerinde kullanildiginda, ekspresyon vektörünün kontrol islevleri siklikla Viral düzenleyici ögeler tarafindan saglanir. Örnegin, yaygin olarak kullanilan promotörler polyom adenovirüs 2, sitomegalovirüs ve simyan virüsü 40'tan türetilir. Hem prokaryotik hem ökaryotik hücreler için diger uygun ekspresyon sistemleri için bakiniz, Sambrook, J., Fritsh, E. F., ve Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 yayini bölümler 16 ve 17.

Belirli yönlerde, rekombinan memeli ekspresyon vektörü nükleik asidin ekspresyonunu tercihen belirli bir hücre tipinde yönetebilir (örnegin, dokuya-özgü düzenleyici ögeler nükleik asidi eksprese etmek için kullanilir). Dokuya-özgü düzenleyici ögeler teknikte bilinmektedir. Uygun dokuya-özgü promotörlerin sinirlayici-olmayan örneklerine, lenfoid-özgü promotörler (Calame ve Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235), özellikle T hücresi reseptörlerinin promotörleri (Winoto ve Baltimore ( ve immünoglobünler (Banerji et al. 01201-P-0002 promotörler (örnegin, nörofilament promotörü; Byrne ve Ruddle (1989) Proc.

Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:5473), pankreasa-özgü promotörler (Edlund et al. promotörü; U.S. Pat. No. 4,873,316 ve European Application Publication No. 264,166) dahildir. Gelisimsel olarak-düzenlenen promotörler, örnegin murin hoks promotörü (Campes ve Tilghman (1989) Genes Dev. 3:53 7) de kapsanmaktadir.

Belirli yönlerde, içine bulusun bir rekombinan ekspresyon vektörünün eklenmis oldugu konak hücreler saglanmaktadir. “Konak hücre” ve “rekombinan konak hücre” terimleri burada birbirlerinin yerine kullanilmaktadir. Bu tip terimlerin sadece belirli konu hücreyi degil bu tip bir hücrenin silsilesini veya potansiyel silsilesini de ifade ettigi anlasilmalidir. Izleyen nesillerde ya mutasyon veya çevresel etkiler nedeniyle belirli modifikasyonlar ortaya çikabilecegi için, bu tip silsile, aslinda, ana hücreye özdes olmayabilir ancak yine de burada kullanildigi sekliyle terimin kapsami dahilinde yer almaktadir.

Bir konak hücre herhangi bir prokaryotik veya ökaryotik hücre olabilir. Örnegin, bir örtü proteinin bir ya daha daha fazla stabilize trimeri, E. 0011' gibi bakteriyle hücrelerde, retroviral hücreler gibi viral hücrelerde, böcek hücrelerinde, maya veya (Çin hemstiri yumurtalik hücreleri (CHO) veya COS hücreleri gibi) memeli hücrelerinde eksprese edilebilir. Diger uygun konak hücreler, teknikte uzman kisilerce bilinmektedir.

Burada tarif edilen nükleik asitlerin (örnegin, vektör DNA) aktarilmasi, teknikteki herhangi bir uygun yöntemle olabilir. Örnegin, aktarim enjeksiyonla, gen tabancasiyla, nükleik asidin bir jel, yag veya krein içine uygulanmasiyla, lipit- tabanli transfeksiyon belirteçleri kullanilarak elektroporasyonla veya herhangi diger uygun transfeksiyon yöntemiyle yapilabilir. 01201-P-0002 Burada kullanildigi sekliyle, “dönüsüm” ve “transfeksiyon” terimleri, yabanci nükleik asidin (örnegin, DNA) bir konak hücrenin içine eklenmesi için, kalsiyum fosfat veya kalsiyum klorür es-çökelmesi, DEAE-dekstran-aracili transfeksiyon, (örnegin, örnegin, LIPOFECTIN® (lnvitrogen Corp., San Diego, CA), LIPOFECTAMINE® (Invitrogen), FUGENE® (Roche Applied Science, Basel, Isviçre), JETPEITM (Polyplus-transfection Inc., New York, NY), EFFECTENE® (Qiagen, Valencia, CA), DREAMFECTTM (OZ Biosciences, Fransa) ve benzerleri gibi piyasada bulunan belirteçler kullanilarak) lipofeksiyon veya elektroporasyon (örnegin, in vivo elektroporasyon) dahil olmak üzere, teknikçe-taninan çesitli teknikleri ifade etme amaçlidir. Konak hücrelerin dönüstürülmesi veya transfekte edilmesi için uygun yöntemler, Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y._, 1989)'da ve diger laboratuar el kitaplarinda bulunabilir.

Açiklamanin yönleri, sirasiyla bir ikinci nükleik asit veya polipeptit dizisine belirli bir dizi özesligine veya homoloji yüzdesine sahip bir birinci nükleik aside (örnegin, bir örtü glikoproteinin bir veya daha fazla stabilize trimerini kodlayan bir nükleik asit dizisi) veya polipeptit dizisine (örnegin, bir örtü glikoproteinin bir veya daha fazla stabilize trimeri) yöneliktir. Nükleik asit ve amino asit “dizi özdesligini” belirlemek için teknikler teknikte bilinmektedir. Tipik olarak, bu tip teknikler, bir gen için bir mRNA7dan yapilan genomik DNA, mRNA veya cDNA”nin nükleotid dizisinin belirlenmesini ve/veya kodladigi amino asit dizisinin belirlenmesini ve bu dizilerin birinin veya her ikisinin, uygun oldugu sekilde bir ikinci nükleotid veya amino asit dizisiyle karsilastirilmasini içerir.

Genelde, “Özdeslik”, sirasiyla iki polinükleotidin veya polipeptidin tam bir nükleotide-nükleotid veya amino aside-amino asit benzesmesini ifade etmektedir.

Iki veya daha fazla dizi (polinükleotid veya amino asit) bunlarin “özdeslik yüzdesinin” belirlenmesiyle karsilastirilabilir. Nükleik asit veya amino asit dizileri olacak sekilde iki dizinin özdeslik yüzdesi, iki hizali dizi arasinda daha kisa dizilerin uzunluguna bölünen ve 100 ile çarpilan tam eslesmelerin sayisidir. 01201-P-0002 Nükleik asit dizileri için yaklasik bir hizalama, Smith ve Waterman, Advances in Bu algoritma, Dayhoff, Atlas of Protein Sequences ve Structure, M. 0. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Bioinedical Research Foundation, Washington, tarafindan normallestirilen puanlama matrisi kullanilarak amino asit dizilerine uygulanabilir. Bir dizinin özdeslik yüzdesinin belirlenmesi için bu algoritmanin emsal bir uygulamasi Genetics Computer Group (Madison, Wis.) tarafindan, varsayilan parametreler, (Genetics Computer Group, Madison, WI firmasindan temin edilebilen) Wisoonsin Dizi Analizi Paket Programi Kilavuzu, Sürüm 8°de (1995) tarif edilmektedir.

Mevcut bulus baglaminda özdeslik yüzdesinin olusturulmasinin bir yöntemi, John F. Collins ve Shane S. Sturrok tarafindan gelistirilen ve IntelliGenetics, Inc.

(Mountain View, CA) tarafindan dagitimi yapilan, telif hakki Edinburgh Üniversitesine ait MPSRCH program paketinin kullanimidir. Bu program eslerinden, puanlama tablosu için (örnegin, bosluk açikligi cezasi 12, bosluk uzamasi cezasi bir ve altilik bir bosluk) varsayilan parametrelerin kullanildigi Smith-Waterinan algoritmasi kullanilabilir. “Eslesme” degerini olusturan veriler benzerligi hesaplamak için diger uygun programlar genellikle teknikte bilinmektedir; örnegin, bir diger hizalama programi, varsayilan parametrelerle kullanilan BLAST programidir. Örnegin, BLASTN ve BLASTP, asagidaki varsayilan parametreler kullanilarak kullanilabilir: genetik kod = standart; filtre = yok; sarmal = her ikisi; kesme = 60; beklenen = 10; Matris = BLOSUM62; Tanimlar : 50 dizi; siralama : YÜKSEK PUAN; Veritabanlari : artiksiz, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translasyonlari + Isveç proteini + Spupdate + PIR. Bu programlarin ayrintilari NCBI/NLM web sitesinde bulunabilir. 01201-P-0002 Alternatif olarak, homoloji, homolog bölgeler arasinda istikrarli dubleksler olusturan kosullar altinda polinükleotidlerin melezlenmesiyle ve ardindan tek- sarmalli-özgül nükleaz(lar)la sindirmeyle ve sindirilen fragmanlarin boyut belirlenmesiyle belirlenebilir. Iki DNA dizisi veya iki polipeptit dizisi, diziler moleküllerin tanimli bir uzunlugu üzerinde, yukaridaki yöntemler kullanilarak belirlendigi üzere en az yaklasik %80-%85, en az yaklasik %85-%90, en az yaklasik %90-%95 veya en az yaklasik %95-%98 dizi özdesligi sergilediginde birbirlerine “büyük ölçüde homologtur”. Burada kullanildigi sekliyle, büyük ölçüde homolog ifadesi ayrica, belirtilen DNA veya polipeptit dizisine tam özdeslik gösteren dizileri de ifade etmektedir. Büyük ölçüde homolog DNA dizileri, örnegin, 0 belirli sistem için tanimlandigi üzere sert kosullar altinda bir Southern melezleme deneyinde tanimlanabilir. Uygun melezleme kosullarinin tanimlanmasi teknikte uzmanlik dahilindedir. Bakiniz, örnegin, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, NY; Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B. D.

Hames ve S. J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, D.C.; IRL Press.

Iki nükleik asit fragmani burada tarif edildigi sekilde “seçilerek melezleme” için degerlendirilir. Iki nükleik asit molekülü arasindaki dizi özdesliginin seviyesi, bu tip moleküller arasindaki melezleme olaylarinin etkililigini ve gücünü etkiler.

Kismen özdes bir nükleik asit dizisi, tamamen özdes bir dizinin bie hedef moleküle melezlenmesini en azindan kismen önleyecektir. Tamamen özdesi dizinin melezlenmesinin önlenmesi, teknikte iyi bilinen melezleme tayinleri kullanilarak tayin edilebilir (örnegin, Southern boyama, Northern boyama, solüsyon melezleme veya benzerleri, bakiniz Sambrook, et al., yukarida). Bu tayinler degisen seçimlilik seviyeleri kullanilarak, örnegin, düsükten yüksek sertlige degisen kosullar kullanilarak yürütülebilir. Düsük sertlik kosullari kullaniliyorsa, özgül-olmayan baglanmanin yoklugu, özgül-olmayan baglanma olaylarinin yoklugunda ikincil proboun hedefe melezlenmeyecegi sekilde, kismi bir özdeslik yüzdesinden bile yoksun olan bir ikincil prob (örnegin, hedef 01201-P-0002 molekülle yaklasik %30idan az bir özdeslik yüzdesi seviyesine sahip bir prob) Bir melezleme-tabanli saptaina sistemi kullanilirken, bir hedef nükleik asit dizine tamamlayici bir nükleik asit probu seçilir ve daha sonra uygun kosullarin seçilmesiyle, prob ve hedef dizi, bir melez molekül olusturmak için birbirine diziye seçimli olarak melezlenebilen bir nükleik asit inolekülü tipik olarak, seçilen nükleik asit probunun dizisiyle en az yaklasik %70 dizi özdesligine sahip, en az yaklasik 10-14 nükleotid uzunlugunda bir hedef nükleik asit dizisinin saptanmasina olanak saglayan kosullari altinda melezlenir. Siki melezleme kosullari tipik olarak, seçilen nükleik asit probunun dizisiyle yaklasik %90-95°ten büyük dizi özdesligine sahip, en az yaklasik 10-14 nükleotid uzunlugundaki hedef` nükleik asit dizisinin saptanmasina olanak saglar. Probun ve hedefin belirli bir dizi özdesligi derecesine sahip oldugu prob/hedef melezlemesi için uygun melezleme kosullari, teknikte bilindigi sekilde belirlenebilir (bakiniz, örnegin, Nüklei'k Asit Melezleme, yukarida).

Melezleme için sert kosullara istinaden, örnegin, asagidaki faktörlerin degistirilmesiyle belirli bir sertligin olusturulmasi için sayisiz esdeger kosulun kullanilabilecegi teknikte iyi bilinmektedir: prob ve hedef dizilerin uzunlugu ve yapisi, çesitli dizilerin baz bilesimleri, tuzlarin ve diger melezleme solüsyonu bilesenlerinin konsantrasyonlari, melezleme solüsyonlarinda bloke edici ajanlarin varligi veya yoklugu (örnegin, forinainid, dekstran sülfat ve polietilen glikol), melezleme tepkime sicakligi ve zaman parametrelerinin yani sira degisen yikama kosullari. Belirli bir melezleme kosulu grubunun seçimi, teknikteki standart yöntemler izlenerek seçilir (bakiniz, Örnegin, Sambrook et al., yukarida).

Burada kullanildigi sekliyle, “sert kosullar altinda melezler” terimi, birbirlerine en az %60 özdes nükleotid dizilerinin tipik olarak birbirlerine melezlenmis olarak kaldigi, melezleme ve yikama kosullarini tarif etmeyi amaçlamaktadir. Bir yönde, 01201-P-0002 kosullar, birbirlierine en az yaklasik %70, en az yaklasik %80, en az yaklasik %85 veya %90 veya daha özdes dizilerin tipik olarak birbirlerine melezlenmis olarak kaldigi sekildedir. Bu tip sert kosullar teknikte uzman kisilerce bilinmektedir ve Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1- 6.3.6”da bulunabilir. Sert melezleme kosullarinin sinirlayici-olmayan bir örnegi, yaklasik 45°C°de 6X sodyum klorür/sodyum sitrat (SSC) içinde melezleme, içinde bir veya daha fazla yikamadir.

Bir birinci polinükleotid bir ikinci polinükleotidden, ikinci polinükleotidin, cDNA,sinin, bunun komplemanlarinin bir bölgesi olarak ayni veya büyük ölçüde ayni baz-çift dizisine sahipse veya yukarida tarif edildigi üzere dizi özdesligi sergiliyorsa ““türetilir”. Bir birinci polipeptit bir ikinci polipeptitten, bir ikinci polinükleotidden türetilen bir birinci polinükleotid tarafindan kodlanirsa veya yukarida tarif edildigi üzere ikinci polipeptitlere dizi özdesligi sergiliyorsa türetilir. Mevcut açiklamada, bir gp41 proteini ““HIV'den türetilir”, gp4l proteininin bariz bir biçimde virüsün kendisi tarafindan üretilmesi gerekmez, Virüs basitçe gp41 proteininin ve/veya kendisini kodlayan nükleik asit dizisinin özgün kaynagi olarak ele alinir. Gp41 proteinleri, örnegin, rekombinan veya sentetik olarak, teknikte bilinen yöntemlerle üretilebilir veya alternatif olarak, gp41 proteinleri HIV-enfekte hücre kültürlerinden saflastirilabilir.

Belirli yönlerde, bir veya daha fazla antikor, bir örtü proteinin bir veya daha fazla stabilize trimeri ve/veya burada tarif edilen bir örtü proteinin bir veya daha fazla stabilize triinerini kodlayan nükleik asit dizileri, uygulama için uygun farinasötik bilesimlerin içine katilabilir. Bu tip bilesimler tipik olarak nükleik asit molekülü veya protein ve farmakolojik olarak kabul edilen bir tasiyici içerir. Burada kullanildigi sekliyle “farmakolojik olarak kabul edilen tasiyici” ifadesi, farmsötik uygulamayla uygun herhangi ve tüm çözücüleri, dispersiyon vasatini, kaplamalari, antibakteriyel ve antifungal ajanlari, izotonik ve abzorpsiyon geciktirici ajanlari ve benzerlerini içerme amaçlidir. Bu tip vasat ve aj anlarin farmasötik olarak etken 01201-P-0002 maddeler için kullaniini teknikte iyi bilinmektedir. Herhangi bir geleneksel vasat veya ajanin aktif bilesikle uyumsuz olmasi haricinde, bunlarin bilesimlerde kullanilmasi ele alinmistir. Tamamlayici aktif bilesikler de bilesimlerin içine katilabilir.

Belirli yönlerde, farmasötik bir bilesim, amaçlanan verilis yoluyla uygun olmasi için formüle edilir. Verilis yolu örneklerine parenteral, örnegin, intravenöz, intradermal, subkütan, oral (Örnegin, soluma), transdermal (topikal), transmukozal ve rektal uygulama dahildir. Parenteral, intradermal veya subkütan uygulama için solüsyonlar veya süspansiyonlar, asagidaki bilesenleri içerebilir: enjeksiyon için su, salin solüsyonu, sabit yaglar, polietilen glikoller, gliserin, propilen glikol veya diger sentetik çözücüler gibi bir steril seyreltici; benzil alkol veya metil parabenler gibi antibakteriyel ajanlar; askorbik asit veya sodyum bisülfit gibi antioksidanlar; etilendiamintetraasetik asit gibi selatlama ajanlari; asetatlar, sitratlar veya fosfatlar gibi tamponlar ve tonisitenin ayarlanmasi için sodyum klorür veya dekstroz gibi ajanlar. pH, hidroklorik asit veya sodyum hidroksit gibi asitlerle veya bazlarla ayarlanabilir. Parenteral preparat ampullere, tek kullanimlik siringalara veya cam veya plastikten mamul çok dozlu flakonlara konulabilir.

Enjekte edilebilir kullanim için uygun farmasötik bilesimlere (suda çözünen) steril sulu solüsyonlar veya steril enjekte edilebilir solüsyonlarin veya dispersiyonlarin ekstamporane preparasyonu için dispersiyonlar veya steril tozlar dahildir. intravenöz uygulama için uygun tasiyicilara fizyolojik salin, bakteriostatik su, CREMOPHOR ELTM (BASF, Parsippany, NJ) veya fosfat tamponlu salin (PBS) dahildir. Tüm durumlarda, bilesim steril olmalidir ve kolay siringalamanin var olacagi seviyede sivi olmalidir. Üretim ve saklama kosullari altinda stabil olmali ve bakteriler ve mantarlar gibi mikroorganizmalarin kontamine edici eylemlerine karsi korunmalidir. Tasiyici, örnegin, su, etanol, poliol (örnegin, gliserol, propilen glikol ve sivi polietilen glikol ve benzerleri) ve bunlarin uygun karisiinlarini ihtiva eden bir çözücü veya dispersiyon vasati olabilir. Uygun sivilik, örnegin, lesitin gibi bir kaplamanin kullanimiyla, dispersiyon durumunda gereken partikül 01201-P-0002 boyutununun muhafaza edilmesiyle ve sürfaktanlarin kullanimiyla muhafaza edilebilir. Mikroorganizmalarin eyleminin engellenmesi, çesitli antibakteriyel ve antifungal ajanlar, örnegin, parabenler, klorobütanol, fenol, askorbik asit, timerosal ve benzerleri tarafindan elde edilebilir. Birçok durumda, bilesime izotonik ajanlarin, örnegin, sekerlerin, manitol, sorbitol, sodyum klorür gibi polialkollerin eklenmesi de tercih edilir olacaktir. Enjekte edilebilir bilesimlerin uzatilmis emilimi, bilesime emilimi geciktiren bir ajanin, örnegin aluminyum monostearat ve jelatinin eklenmesiyle saglanabilir.

Steril enjekte edilebilir solüsyonlar, bir veya daha fazla antikorun, bir örtü proteinin bir veya daha fazla stabilize trimerinin ve/veya burada tarif edilen bir örtü proteinin bir veya daha fazla stabilize trimerini kodlayan nükleik asit dizilerinin gereken miktarda, gerektigi sekilde yukarida siralanan içeriklerin birine veya daha fazlasina sahip ibr uygun bir solüsyona eklenmesiyle ve ardindan filtreli sterilizasyonla hazirlanabilir. Genellikle, dispersiyonlar aktif bilesigin, temel bir dispersiyon vasati ve yukarida siralananlardan gereken diger içerikleri ihtiva eden steril bir aracin içine katilmasiyla hazirlanir. Steril enjekte edilebilir solüsyonlarin hazirlanmasi için steril tozlar durumunda, tercih edilen hazirlama yöntemleri, vakumla kurutma ve etken maddenin bir tozu arti bunun önceden steril-filtrelenmis bir solüsyonundan istenen herhangi ilave içerigi saglayan dondurarak-kurutmadir.

Oral bilesimler genellikle etkisiz bir seyreltici veya yenilebilir bir tasiyici içerir.

Jelatin kapsüllere konulabilirler veya tabletlere sikistirilabilirler. Oral terapötik uygulama amaciyla, aktif bilesik eksipiyanlarla katilabilir ve tabletler, yassi haplar veya kapsüller formunda kullanilabilir. Oral bilesimler ayrica, bir gargara olarak kullanim için bir sivi tasiyici kullanilarak da hazirlanabilmektedir, burada sivi tasiyicidaki bilesik oral yolla uygulanir ve çalkalanir ve tükürülür veya yutulur.

Farmasötik olarak uygun baglayici ajanlar ve/veya adjuvan materyaller bilesimin parçasi olarak eklenebilir. Tabletler, haplar, kapsüller, yassi haplar ve benzerleri asagidaki içeriklerin herhangi birini veya benzer yapidaki bilesikleri ihtiva 01201-P-0002 edebilir: mikrokristalin selüloz, sakiz tragasant veya jelatin gibi bir baglayici; nisasta veya laktoz gibi bir eksipiyan, aljinik asit, Primojel veya misir nisastasi gibi bir dagitici bir ajan; magnezyum stearat veya Sterotes gibi bir kaydirici; koloidal silikon dioksit gibi bir yapisinayi önleyici; sükroz veya sakarin gibi bir tatlandirici ajan veya nane, metil salisilat veya portakal aromasi gibi bir lezzetlendirici ajan.

Bir yönde, bir ya daha daha fazla antikor, bir örtü proteinin bir veya daha fazla stabilize trimeri ve/veya burada tarif edilen bir örtü proteinin bir veya daha fazla stabilize trimerini kodlayan nükleik asit dizileri, bilesigi vücuttan hizli yok etmeye karsi koruyacak olan, implantlar ve mikrokapsüllenmis aktarim sistemleri dahil olmak üzere kontrollü bir salim formülasyonu gibi tasiyicilarla hazirlanir. Etilen vinil asetat, polianhidritler, poliglikolik asit, kolajen, poliortoesterler ve polilaktik asit gibi biyoçözünür, biyouyumlu polimerler kullanilabilir. Bu tip formülasyonlarin hazirlama yöntemleri teknikte uzman kisilerce anlasilacaktir.

Materyaller ayrica, Alza Corporation ve Nova Pharmaceuticals, Inc firmasindan da satin alinabilir. (Enfekte hücrelere hedeflenmis, viral antijenlere monoklonal antikorlara sahip lipozomlar dahil olmak üzere) lipozomal süspansiyonlar da farmakoloj ik olarak kabul edilen tasiyicilar olarak kullanilabilir. Bunlar, teknikte uzman kisilerce bilinen, örnegin, U.S. Patent No. 4.522.8113de tarif edilen yöntemlere göre hazirlanabilir.

Nazal bilesimler genellikle nazal Spreyleri ve inhalanlari içerir. Nazal Spreyler ve inhalanlar bir veya daha fazla aktif bilesen ve koruyucular, viskozite düzenleyiciler, emülgatörler, tamponlama ajanlari ve benzerleri gibi eksipiyanlar ihtiva edebilir. Nazal Spreyler lokal ve/Veya sistemik kullanim için burun bosluguna uygulanabilir. Nazal Spreyler, aktif bilesigin ölçülen bir dozunun aktarilmasi için uygun bir basinçsiz dagiticiyla dagitilabilir. Nazal inhalanlar, lokal ve/veya sistemik kullanim için oral solumayla cigerlere aktarim amaçlidir.

Nazal inhalanlar, bir veya daha fazla aktif bilesigin ölçülen bir dozunun aktarilmasi için kapali bir konteynir sistemiyle dagitilabilir. 01201-P-0002 Bir yönde, nazal inhalanlar bir aerosol ile kullanilir. Bu, bilesigi ihtiva eden bir sulu aerosolün, lipozomal preparatin veya kati partiküllerin hazirlanmasiyla elde edilir. Susuz (örnegin, florokarbon itici gaz) bir süspansiyon kullanilabilir. Ajanin, bilesigin bozulmasiyla sonuçlanabilecek sekilde kaymaya maruz kalmasini asgariye indirgemek için sonik nebülizörler kullanilabilir.

Normal olarak, sulu bir aerosol, ajanin sulu bir solüsyonunun veya süspansiyonunun, konvansiyonel farmakolojik olarak kabul edilen tasiyicilar veya stabilizörlerle birlikte formüle edilmesiyle yapilir. Tasiyioilar ve stabilizörler, belirli bilesigin gereksinimleriyle degisir, ancak tipik olarak iyonik olmayan sürfaktanlar (Tweens, Pluronics veya polietilen glikol), serum albümini gibi zararsiz proteinler, sorbitan esterleri, oleik asit, lesitin, glisin gibi amino asitler, tamponlar, tuzlar, sekerler ve seker alkolleri içerir. Aerosoller genellikle izotonik solüsyonlardan hazirlanir.

Sistemik uygulama ayrica transmukozal veya transdermal araçlarla da olabilir.

Transmukozal veya transdermal uygulama için, formülasyonda nüfuz edilecek olan engele uygun penetranlar kullanilir. Bu tip penetranlar genellikle teknkte bilinmektedir ve, örnegin, transmukozal uygulama için deterjanlari, öd tuzlarini ve fusidik asit türevlerini içerir. Transmukozal uygulama, nazal spreylerin veya süpozituarlarin kullanimi yoluyla basarilabilir. Transdermal uygulama için, teknikte genel olarak bilindigi üzere aktif bilesikler onguanlar, merhemler, jeller veya kremler seklinde formüle edilir.

Bir veya daha fazla antikor, bir örtü proteinin bir veya daha fazla stabilize trimeri ve/veya burada tarif edilen bir örtü proteinin bir veya daha fazla stabilize trimerini kodlayan nükleik asit dizileri ayrica, rektal aktarim için (örnegin, kakao yagi ve diger gliseritler gibi konvansiyonel süpozituar bazlarina sahip) süpozituarlar veya tutulumlu lavmanlar formunda da hazirlanabilir. 01201-P-0002 Bir yönde, bir veya daha fazla antikor, bir örtü proteinin bir veya daha fazla stabilize trimeri ve/veya burada tarif edilen bir örtü proteinin bir veya daha fazla stabilize trimerini kodlayan nükleik asit dizileri, implantlar ve mikrokapsüllenmis aktarim sistemleri dahil olinak üzere, kendilerinin vücuttan hizli yok edilmesini karsi koruyacak, kontrollü bir salim formülasyonu gibi tasiyicilarla hazirlanir.

Etilen vinil asetat, polianhidritler, poliglikolik asit, kolajen, poliortoesterler ve polilaktik asit gibi biyoçözünür, biyouyumlu poliinerler kullanilabilir. Bu tip formülasyonlarin hazirlama yöntemleri teknikte uzman kisilerce anlasilacaktir.

Materyaller ayrica, Alza Corporation ve Nova Pharmaceuticals, Inc firmasindan da satin alinabilir. (Enfekte hücrelere hedeflenmis, viral antijenlere monoklonal antikorlara sahip lipozomlar dahil olmak üzere) lipozomal süspansiyonlar da farrnakolojik olarak kabul edilen tasiyicilar olarak kullanilabilir. Bunlar, teknikte uzman kisilerce bilinen, örnegin, U.S. Patent No, 4.522.811”de tarif edilen yöntemlere göre hazirlanabilir.

Oral veya parenteral bilesimleri uygulama ve dozaj uyumu kolayligi için dozaj birim formunda formüle etmek özellikle avantajlidir. Dozaj birim formu, burada kullanildigi sekliyle, tedavi edilecek süje için üniter dozajlar olarak uyumlu hale getirilen fizikzsel olarak ayri birimleri ifade etmektedir; her bir birim aktif bilesigin, gereken farmasötik tasiyiciyla iliskili istenen terapötik etkinin saglanmasi için hesaplanan önceden belirlenmis bir miktarini ihtiva eder. Bulusun dozaj birim formlari için spesifikasyon, aktif bilesigin ve elde edilecek olan belirli terapötik etkinin benzersiz karakteristikleri ve bireylerin tedavisi için bu tip bir aktif bilesigin birlestirilmesi tekniginde yer alan sinirlamalar tarafindan belirlenmektedir ve dogmdan bunlara baglidir.

Bir veya daha fazla antikorun, bir örtü proteinin bir veya daha fazla stabilize trimerinin ve/veya burada tarif edilen bir örtü proteinin bir veya daha fazla stabilize trimerini kodlayan nükleik asit dizilerinin toksisitesi ve terapötik etkisi, örnegin, LD50”nin (popülasyonun %50*si için ölümcül doz) ve EDSOinin (popülasyonun %50,si için terapötik olarak etkili doz) belirlenmesi için, hücre 01201-P-0002 kültürlerine veya deney hayvanlarinda standart farmasötik prosedürlerle belirlenebilir. Toksik ve terapötik etkiler arasindaki doz orani terapötik indekstir ve LDSO/EDSO orani olarak ifade edilebilir. Büyük terapötik indeksler sergileyen bilesikler tercih edilmektedir. Toksik yan etkiler sergileyen bilesikler kullanilabilirken, enfekte olmamis hücrelere potansiyel hasari asgariye indirgeinek ve böylelikle yan etkileri azaltmak amaciyla, bu tip bilesikleri etkilenmis dokuya hedefleyen bir aktarim sistemi tasarlamaya özen gösterilmelidir.

Hücre kültürü tayinlerinden ve/veya hayvanlarla yapilan çalismalardan elde edilen veriler, insanlarda kullanim için bir doz araliginin formüle edilmesinde kullanilabilir. Dozaj tipik olarak, çok az veya hiç toksisiteye sahip ED50 içeren dolasimdaki konsantrasyonlarin araligina denk gelecektir. Dozaj, kullanilan dozaj formuna ve kullanilan verilis yoluna bagi olarak bu aralik içerisinde degisebilir.

Bulusun yönteminde kullanilan herhangi bir bilesik için, terapötik olarak etkili doz, baslangiçta hücre kültürü tayinlerinden hesaplanabilir. Bir doz, hücre kültüründe belirlendigi üzere, ICSO içeren dolasimdaki bir plazma konsantrasyonu araligi (yani, test bilesiginin semptomlarin yari-maksimal önlenmesini elde eden konsantrasyonu) elde etmek için hayvan modellerinde formüle edilebilir. Bu bilgiler, insanlarda faydali dozlari daha dogru olarak belirlemek için kullanilabilir.

Plazmadaki seviyeler, örnegin, yüksek performansli sivi kromatografiyle ölçülebilir.

Belirli yönlerde, bir Viral enfeksiyonun, örnegin, HIV enfeksiyonunun tedavisinin bir yöntemi, bir veya daha fazla örtü proteini (örnegin, gp41) aktivitesini (örnegin, araci Viral füzyon (örnegin, viral giris ve/veya sinsisya olusumu)) modüle eden bir ajanin (örnegin, bir veya daha fazla antikorun, bir örtü proteinin bir veya daha fazla stabilize trimerinin ve/veya burada tarif edilen bir örtü proteinin bir veya daha fazla stabilize trimerini kodlayan nükleik asit dizilerinin) terapötik olarak etkili bir miktarinin bir süjeye verilmesi adimini içerir. Burada tanimlandigi üzere, bir ajanin terapötik olarak etkili bir miktari (yani, etkili bir dozaj) yaklasik 0,001 01201-P-0002 ila 30 mg/kg vücut agirli arasinda, yaklasik 0,] ila 25 mg/kg vücut agirligi arasinda, yaklasik 0,1 ila 20 mg/kg Vücut agirligi arasinda veya yaklasik 1 ila 10 mg/kg, 2 ila 9 mg/kg, 3 ila 8 mg/kg, 4 ila 7 g/kg veya 5 ila 6 mg/kg vücut agirligi arasinda degisir. Teknikte uzman kisi, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla hastalik veya rahatsizligin siddeti, önceki tedaviler, süjenin genel sagligi ve/veya yasi ve mevcut olan diger hastaliklar gibi belirli faktörlerin, bir süjenin etkili tedavi edilmesi için gereken dozaji etkileyebilecegini anlayacaktir. Dahasi, bir süjenin bir inhibitöiiin terapötik olarak etkili bir miktariyla tedavisi, bir tek tedavi içerebilir veya belirli emsal uygulamalrda, bir dizi tedavi içerebilir. Ayrica, tedavi için kullanilan inhibitörün etkili dozajinin, belirli bir tedavi süresince artabilecegi veya azalabilecegi de anlasilacaktir. Dozajdaki degisiklikler, burada tarif edildigi üzere tanisal tayinlerin sonuçlarindan kaynaklanabilir. Farmasötik bilesimler, uygulama talimatlariyla birlikte bir konteynir, paket veya dagitici içine konulabilir.

Mevcut bulusun burada tarif edilmis olan uygulamalarinin yalnizca, mevcut bulusun ilkelerinin uygulamalarinin bazilarini örnekleme amacinda oldugu anlasilmalidir. Teknikte uzman kisiler tarafindan, bulusun kapsamindan uzaklasmadan burada sunulan ögretilere dayali olarak sayisiz modifikasyon yapilabilir.

Asagidaki örnekler sunulmaktadir. Bulusla ilgili oldugu seviyede, bunlar ömekleine olarak görülmelidir. Diger durumlarda, örnekler sadece örnekleme amaciyla saglanmis olarak kabul edilmelidir. ÖRNEK I Biyokimyasal Olarak Stabil HIV-1 gp140 Trimerlerinin Bir Kobay Modelinde Nötrlestirme Kapasitesi Aday Env immünojenlerin klinik öncesi degerlendirilmesi, kavram deneyi ve asi adaylarinin önceliklendirilmesi için önemlidir. TZM.b1 hücrelerde lusiferaz- 01201-P-0002 verimli tayin olarak gelistirilmistir (Montefiori (2009) Methods Mol. Biol. kullanimi, birden fazla kladdan türetilen ve hem nötrlestirmesi-kolay (katman l) hem primer izolatlarin (katman 2) virüslerini yansitan standardize edilmis virüs panellerinin olusturulmasini gerektirmistir (Li et al., Yukarida).

Primer HIV-1 izolatlarinin bir panelinin elenmesiyle, iyi-tanmli ve tekdüze antijenik özelliklere sahip biyokimyasal olarak homojen ve stabil trimerle saglamis (Burke et al. ( (Rodenburg et al. ( ve 92UG tanimlanmistir. T4 bakteriyofaj fibritin “fold-on” (Fd) trimerlesme alaninin eklenmesi randimani ve safligi daha da arttirmistir (Frey et al. (. Burada ayrintili olarak tarif edildigi üzere, bu stabilize klad A ve klad C gp140 trimerlerinin immünoj enesitesi kobaylarda, A, B ve C kladlarindan katman 1 ve katman 2 izolatlarinin bir paneli kullanilarak degerlendirilmistir.

Stabil, Homoien HIV-1 gp 140 Trimerlerinin Üretimi Primer izolatlar 92UG türetilen Env gpl40 trimerleri, bir T4-fibritin “foldon” C-uç trimerlesme etiketiyle stabilize edilmis (Sekil 13) ve T.m` (Yüksek 5) hücrelerde üretilmistir. Biyokimyasal satlik ve stabilite su sekilde belirlenmistir: Saflastirilmis CZA97.012 (klad C) gp140 trimeri, Superpose 6 kolonlarinda jel-filtrasyon kromatogratiyle çözündü.

Görünen moleküler kütle standart trioglobulin (ve katalaz ( kullanilarak hesaplandi. Pik kesitleri havuzlandi ve SDS-PAGE ile analiz edildi. Klad C trimeri etilen glikol bis(süksinimidilsüksinat)`in çesitli ürünler, bir %4 jel kullanilarak SS-PAGE ile analiz edildi. Moleküler standart, 01201-P-0002 çapraz-bagli fosforilaz b (Sigma) oldu. Benzer analizler önceden saflastirilmis klad A 92UG037.8 gpl40 trimeri için bildirilmistir (Frey et al., Yukarida).

CZA97.012 (klad C) trimeri, boyut dislama kromatografisi ile belirlendigi üzere, benzer saflik ve homojenlik ve monodisperse ve trimerik oldugunu onaylayan kimyasal çapraz baglanma gösterdi.

Bir lusiferaz bildirici gen tayini, moleküler olarak klonlanan Env-psödotipli virüslerle tek tur enfeksiyona dayali olarak, TZM.bl hücrelerinde (CD4, CXCR4 ve CCRS eksprese eden ve Tat-tetikli Luc ve ß-Gal bildirici genler ihtiva eden genetik olarak islenmis bir hücre çizgisi) gerçeklestirildi. Bu tayin, tek tur enfeksiyonlarda yüksek bir basari oraniyla, artan tayin kapasitesiyle (örnegin, iki günlük bir tayin), artan kesinlikle (örnegin, net olarak ölçülen %50 nötrlestirme) ve gelisen bir standardizasyon (örnegin, stabil bir hücre çizgisi) sonuçlandir.

Lusiferaz bildirici gen tayini optimize edildi ve degerlendirildi.

Klad A ve Klad C Trimerleri tarafindan saglanan Baglavici Antikor Yanitlari Asinin-sagladigi nötrlestirici antikor yanitlarinin degerlendirilmesi için bir çok- katinanli yaklasim kullanildi. Katman 1,de, asi susu (suslari) ve nötrlestirmeye- duyarli suslar asiya eklenmedi. Katman 2sde, asinin genetik alt türüne (türlerine) eslesen heterolog virüslerin (örnegin, panel basina 12 virüs) bir paneli kullanildi.

Bu katman opsiyonel olarak, asi deneme alanlarindan ilave suslari içerebildi.

Katman 3°te, Katman 2,de degerlendirilen alti Katman 2 virüsünden olusan çok kladli bir panel kullanildi. Katman 3, opsiyonel olarak, opsiyonel bir asi deneme alanindan ilave suslari içerebildi.

Bir ön çalismada, bir 92UGO37.8 (klad A) gpl20 monomeri çekirdek immünojeninin immünojenesitesi kobaylarda degerlendirildi ve katman l nötrlestirmeye duyarli virüslere karsi sadece minimal nötrlestirici antikor (NAb) yanitlari sagladi. Maksimumstabilite ve uyumlu homojenlik için seçilen 01201-P-0002 92UG trimerlerinin immünojenesitesine odaklanildi. Bu immünojenler, T4 fibritin fold-on trimerlesme alanina kaynastirilmis gp140 dizisi ihtiva etti. bölgelerinden yoksun ve amino- ve karboksi-uç budamalarina sahip bir monomerik 92UG037.8-gp120 “çekirdegi” olusturuldu. Kobaylar dört haftalik bagisiklandi. Her bir bagisiklamadan dört hafta sonra serumlar elde edildi ve bir uç-nokta ELISA tayininde 92UG037.8 gp120 antij enine karsi test edildi.

Primer izolatlar 92UG türetilen Env gp140 trimerleri T4-fibritin “foldon” C-uç trimerlesme etiketiyle stabilize edildi ve T.m` hücrelerinde HIGH FIVETM, Invitrogen, Carlsbad, CA) üretildi. Boyut- dislama kromatografisi ve kimyasal çapraz-baglanmayla ilk biyokimyasal analizler gerçeklestirildi. 92UG gp140-Fd trimerleri homojenlige saflastirildi ve boyut-dislama kromatogratisiyle belirlendigi üzere tek pikler sergiledi. Beklenen moleküler agirliklar ve oligomerlesme durumlari, sirasiyla, Koomassie lekeleme ve kimyasal çapraz- 92UG037.8-gp140-Fd,nin çökelme dengesi ve insan plazmini tarafindan in vitro yarilmasi belirlendi. Moleküler kütle (yaklasik 405 kDa”lik beklenen degeri onaylayarak) 409 +/-l 0 kDa olarak belirlendi. 92UGO37.8-gpl40-Fd, hem çözünebilir CD4°e hem monoklonal antikor (mAb) 2G12ye (dis gp120 yüzeyinde karbonhidratlari taniyan genis çapli nötrlestirici bir baglanma alaniyla kismen üst üste gelen bir baglayici epitopa sahip bir monoklonal CD4-tetikli (CD4i) nötrlestirici antikor olan) CD4 i mAb 17b”yi ve küme l mAb”leri (nötrlestirici-olmayan ve gp4l*in immüno-baskin bölgesiyle (amino asitler 579-613) tepkimeye giren mAb°ler) baglayabildi; Küme II mAb'ler 01201-P-0002 MPER gp4l amino asitleri 644-667 ile tepkimeye girer ve ya nötrlestirici-degildir veya nötrlestiricidir (örnegin, mAb 2F 5, 4E10, Zl3)).

Kobaylar (n:5/grup) Onci, 5nci ve lOncu haftalarda Ribi adjuvani s.q./i.p.°de 100 iig klad A veya klad C gpl40 trimeriyle bagisiklandi. Her bir bagisiklamadan 4 hafta sonra serum elde edildi. Env-özgül baglayici antikorlar, hem klad A hem klad C gpl40,a uç-nokta ELISA'larla degerlendirildi. Yüksek titreli baglayici antikor yanitlari, hem klad A hem klad C trimeriyle bagisiklaninis kobaylarda gözlemlendi. Yanitlar bir tek bagisiklamadan sonra saptandi ve ikinci ve üçüncü bagisiklamalarin ardindan bir ortalama 6,5 log titresine arttirildi (Sekiller lA-lB).

ELISA yanitlari homolog ve heterolog gp140 suslarina benzer sekilde gerçeklesti (Sekiller 1A-1B).

Klad A ve Kld C Trimerleri Tarafindan Saglanan Nötrlestirici Antilg Yanitlari Stabil klad A ve klad C trimerleri tarafindan saglanan nötrlestirrnenin degerlendirilmesi için, TZM.bl tayinleri (Li et al., Yukarida; Montefiori et al., Yukarida), A, B ve C kladlarindan genis bir nötrlestirmeye duyarlilik araligina sahip katman 1 ve katman 2 virüslerinin bir paneli kullanilarak gerçeklestirildi.

Kriter su sekilde tanimlandi: (i) bagisiklik-öncesi arka planin >3-kat yukarisinda, (ii) eszamanli bir murin lösemi virüsü (MuLv) kontrolünün >2-kat yukarisinda ve (iii) bir mutlak ID50 titresi >60. Ya klad A veya klad C trimerleriyle bagisiklanan kobaylar, nötrlestirmeye duyarli katman 1 klad A, B ve C virüslerine (srasiyla, arasinda degisen lD50 titreleriyle birlikte saglam, çapraz-klad nötrlestirici aktivite gelistirdi (Sekil 6). Otolog asi suslarina karsi hiç nötrlestirme gözlemlenmedi.

Bilimsel teoriyle sinirli kalmaksizin, bu sonuç muhtemelen yapilarinda olan nötrlestirmeye dirençli fenotiplerini yansitmaktadir. 01201-P-0002 NAb yanitlari, daha sert katman 2 primer izolat virüslerine karsi degerlendirildi.

Seçilen katman 2 klad A, B ve C virüslerine karsi daha düsük titreli ancak çopaltilabilir nötrlestirme aktivitesi, bagisiklamanin ardindan hayvanlardan gelen serumlarda saptandi (Sekil 6). Katman 2 virüslerine karsi yanitlarin büyüklügü ve tutarliligi, katman 1 virüslerine karsi olanlardan büyük ölçüde daha düsük oldu.

Yine de, katman 2 nötrlestirme aktivitesinin bir derecesi istikrarli sekilde gözlemlendi. Ayrica, klad C trimeri, klad A trimeriye kiyasla artan büyüklük ve genislikte yanitlar saglar. Bagisiklik-öncesi ve sonrasi serumlarda katman 2 virüslerine karsi NAb titreleri, Sekil 2'de gösterilmektedir. Genel olarak, klad C trimeri, sirasiyla A, B ve C kladlarindan test edilen katman 2 virüslerinin %27, sirasiyla A, B ve C kladlarindan test edilen katman 2 virüslerinin %13, %7 ve klad A ve klad C trimerlerinin immünojenesitesini ortaya koymakta ve HIV-l Envimmünojenleri tarafindan saglanan NAb yanitlarinin degerlendirilmesi için sistematik bir katmanli yaklasik saglamak için virüslerin bu panelinin faydasini göstermektedir.

Saflastirilmis IgG”nin Nötrlestirici Antikor Yanitlari Serum kullanilarak NAb tayinlerinin sonuçlarini onaylamak için, bagisiklanmis hayvanlarin serumundan saflastirilan IgG kullanilarak ilave nötrlestirme testleri gerçeklestirildi. Saflastirilmis lgG, düsük konsantrasyonlarda (MW965.26 için 0,1-O,4 ug/ml) katman l virüslerinin paneline karsi kuvvetli nötrlestirici olmak üzere sinirli sayida katman 2 virüslerine karsi saptanabilir nötrlestirme aktivitesi ortaya koydu (Sekil 8). Klad C katman 2 virüsü ZM109F.PB4,e karsi saflastirilmis lgG kulanilarak örnek ham virüs nötrlestirme verisi, Sekil 3°te gösterilmektedir. Naif serumlardan kontrol IgGîsi hiç nötrlestirme aktivitesi sergilemedi. 01201-P-0002 Degisken Döngü Peptit Yanitlari karsi antikor yanitlari degerlendirildi. Bir negatif kontrol olarak karisik bir 92UG037.8 V3 peptidinden faydalanildi. Hem klad A hem klad C trimerleriyle bagisiklanmis kobaylardan alinan serumlar, dogrusal V3 döngü peptitlerine karsi ELISA yanitlari sergiledi ancak karisik peptide karsi sergilemedi (Sekiller 4A- 4B). Bu yanitlar, homolog ve heterolog V3 dizilerine karsi benzer gerçeklesti ve V1 ve V2 peptitlerine karsi daha düsük ELISA titreleri gözlemlendi. V3 peptit karsilastirma nötrlestirme tayinleri, kald A (kobay #5) ve klad C (kobay #10) trimerlerini alan temsilci hayvanlardan gerçeklestirildi. Seçili katman 1 ve katman 2 virüslerine karsi nötrlestirme aktivitesi hem homoloh hem heterolog V3 döngü peptitleri tarafindan kismen bloke edildi ancak karisik peptit tarafindan bloke edilmedi (Sekil 4C) ve bu da klad A ve klad C gp140 trimerlerinin, kismen V3 döngüsündeki korunmus ögelere yönlendirilen NAb”leri sagladigini gösterdi. homolojisi gösterdi (Sekil 4D).

Heterolog Hazirlik/Güçlendirme Reiimleri DNA hazirlama ve ardindan protein güçlendirmenin, her iki yaklasim tek basina uygulanmasindan daha yüksek titreli antikor yanitlari sagladigi daha önceden 350234). Dolayisiyla, DNA hazirlik, protein güçlendirmesinin yani sira, klad A ve klad C trimerlerini eksprese eden DNA hazirlama, rekombinan adenoviiüs serotip 26 (rAd26) güçlendirme rejimleri kesfedildi. Kobaylar (n=5/grup) Onci, 4ncü ve 8nci haftalarda intramusküler (i.m.) olarak 0,5 mg DNA asilariyla hazirlandi ve daha sonra 36nci haftada rAd26 vektörlerinin tek bir bagisiklamasiyla veya 36nci, 40nci ve 44ncü haftalarda Ribi adjuvaninda trimer proteinleriyle güçlendirildi.

Hem DNA/protein (Sekiller 5A-SB) hem DNA/rAd26 (Sekiler 5C-5D) rejimleriyle bagisiklamanin ardindan, yüksek titreli ELISA yanitlari gözlemlendi. 01201-P-0002 Üç DNA hazirlaina bagisiklamasindan sonra elde edilen pik titreleri, 4,8*lik bir ortalama log titresi oldu. Ya bir tek rAd26 ile veya üç saflastirilmis protein bagisiklamalariyla güçlendirme, sadece protein rejiminin sagladiklarina benzer olan 6,5”1uk ortalain log titreleri yanitlari sagladi (Sekil 1).

Katman l NAb yanitlarinin düsük seviyeleri DNA hazirlamadan sonra gözlemlendi (Sekil 9). Ancak, güçlendirmenin ardindan, DNA/rAd26 ve DNA/protein rejimleri, sadece-protein rejimiyle kiyaslandigi üzere daha yüksek titreli katman 1 NAb yanitlarini tetiklemedi. Bilimsel teoriye bagli kalmaksizin, DNA asilarinin nötrlestirici-olmayan antikor yanitlarina sahip olabilen çesitli gp149 protein konformerleri veya oligomerleri saglamis oldugu düsünülmektedir.

Bu veriler, belirli ayarlarda, hazirlama/güçlendirme asi rejimlerinin, saflastirilmis protein immünoj enlerinden üstün olmalari gerekmedigini ortaya koymaktadir.

Tartisma Burada sunulan veriler, optimal biyokimyasal stabilite ve yapisal homojenlik için (klad A) Env gp140 trimer immünojenlerinin immünojenesitesini degerlendirmektedir. Bugüne kadar bildirilmis olan birçok Env trimeri immünoj eni, her ne kadar son dönemlerdeki raporlar diger kladlardan trimerleri de Epub 2009 Jun 28) klad B izolatlarindan türetilir. Ancak, bu preparatlarin yapisal homojenligi siklikla tam olarak degerlendirilmemistir. A, B ve C kladlarindan gelen, genis nötrlestirmeye duyarlilik araligina sahip katman 1 ve katman 2 virüslerinin bir paneli, virüs nötrlestirmenin degerlendirilmesi için kullanilmistir.

Klad A ve klad C trimerleriyle bagisiklanmis kobaylar, nötrlestirmeye duyarli katman 1 klad A, B ve C virüslerine karsi saglam, çapraz-klad nötrlestirme aktivitesinin yani sira, seçili katman 2 klad A, B ve C virüslerine karsi net ancak düsük seviyelerde nötrlestirme aktivitesi ortaya koymustur. Katman 2 izolatlarina karsi NAb yanitlari saIlastirilmis IgG kullanilarak onaylanmistir ancak katman l 01201-P-0002 izolarlarina karsi yanitlardan büyüklük olarak büyük ölçüde daha düsük ve daha az istikrarlidir. Trimerler tarafindansaglanan antikor yanitlari kismen V1, V2 ve V3 döngülerine yönelik olmustur. Her ne kadar, bilimsel teoriye bagli kalmaksizin, çesitli diger epitoplarinda hedeflenmis oldugu mümkün olsa da, her iki heterolog virüse karsi V3 döngü tepkenligi gözlemlenmistir.

Heterolog hazirlama/güçlendirme asilama rejimleri de, trimer protein immünojenlerin iininünojenesitesini çogaltma potansiyelleri açisindan degerlendirilmistir. DNA/protein ve DNA/rAd26 rejimleri, sadece-protein rejimine kiyasla, antikor yanitlarinin gelismis büyüklügüne veya genisligine yol açmamistir. Aslinda, hazirlama/güçlendirme rejimleri, benzer ELISA baglayici antikor yanitlarina ragmen daha düsük NAb yanitlari sagliyor gibi görünmektedir.

Bu bulgular, diger sistemlerde sadece-protein rejimine kiyasla DNA/protein veya DNA/rAd rejimleriyle elde edilen gelismis hümoral yanitlari vurgulayan önceki çalisinada hazirlama/güçlendirme rejimlerinde gözlemlenen daha düsük NAb aktivitesinin, DNA asilarai tarafindan eksprese edilen, antikor yanitlarini nötrlestirici-olmayan epitoplara çarpitmis olabilen EnV konformerlerinin veya oligomerleirnin heterojen bir karisimiyla ilgili olabildigi varsayiminda bulunulmaktadir. Birlikte ele alindiginda, bu bulgular, optimal rejimin kullanilan belirli antijen veya sisteme bagimli olabilecegini göstermektedir. Özet olarak, burada tarif edilen sonuçlar, optimal saflik ve stabilite için seçilmis ve islenmis olan klad A ve klad C trimerlerinin immünojenesitesini ortaya koymaktadir. Önemli sekilde, A, B ve C kladlarindan katman 1 ve katman 2 virüslerinin paneli, çesitli virüslere karsi NAb profillerinin hizli bir degerlendirmesine olanak saglamaktadir ve yeni aday HIV-l Envimmünojenlerin karsilastirmali immünojenesite çalismalari için fayda saglamaktadir. 01201-P-0002 ÖRNEK Ii Materyaller ve Yöntemler HIV-l 20140 Trimerleri Bir C-ucu T4 bakteriyofaj fibritintrimerlesme alanina (foldon) ve poli-histidin motifine sahip 92UG gp140 trimerleri böcek hücrelerinde, önceden tarif edildigi sekilde (Chen et al. (2000) J. Biol.

Chem. 27534946; Frey et al., Yukarida) Bac-to-Bac (Invitrogen) sistemi kullanilarak eksprese edildi. Kisaca, rekombinan bakulovirüs üreticinin protokolüne göre olusturuldu ve Sf9 böcek hücrelerinde güçlendirildi. Büyük ölçekli üretim için, 12 litre Trichoplusz'ani (Hi-5) hücresi (2x106 hücre/ml) optimal enfeksiyon çoklugunda enfekte edildi. Süzüntü enfeksiyondan 68 saat sonra santritîijlemeyle hasat edildi ve 2 litreye konsantre edildi, ardindan bir teget akis filtrasyon sisteminde, ProFlux M 12 (Millipore), fosfat tamponlu saline (PBS) degistirildi. Berraklastirici bir döndürmeden ve 15 mM,lik nihai konsantrasyona imidazol eklendikten sonra, süzüntü l ml/dk,lik bir akis hizinda bir nikel kolon üzerine yüklendi, daha sonra 15 mM PBS içinde imidazol ile yikandi, ardindan 40 mM ve 60 mM PBS içinde imidazol ile yeniden yikandi.

Protein PBS içinde 300 mM imidazol ile ayristirildi. Saflastirilmis proteini ihtiva eden kesitler havuzlandi, konsantre edildi ve Superpose 6 (GE Healthcare) üzerinde jel filtrasyon kromatogratîyle saHastirildi. Protein konsantre edildi, sivi nitrojende donduruldu ve -80°C,de saklandi.

DNA Asilari Bir C-ucu T4 bakteriyofaj fibritintrimerlesme alanina (Bower et al. (2004) J. sahip 92UG gpl40 trimerleri için insan kodonu optimize edilmis gen dizileri ticari olarak (Geneart) sentezlendi ve bir 01201-P-0002 pCMV ökaryotik ekspresyon vektörünün SalI-BamHl kisitlama alanlarinin içine klonlandi. Gen sokmalari, 293 hücrede tanisal sinirlama beslemesi, DNA dizileme ve ekspresyon testleriyle dogrulandi. pCMV-CZA97012-gp140 ve pCMV- 92UG037-gpl4091n (Qiagen) endo-toksin içermeyen preparatlari, bagisiklama protokolleri için kullanildi.

Rekombinan Adenovirüs Serotip 26 Vektörleri Bir C-ucu T4 bakteriyofaj fibritintrimerlesme alanina (Bower et al. (2004) J. sahip 92UG gp140 trimerleri eksprese eden çogalma-kusurlu, E1/E3 silinmis rekoinbinan adenovirüs serotip 26 (rAd26) vektöeleri, önceden tarif edildigi sekilde hazirlandi (Abbink et al. (2007) J. Virol. 8124654).

Hayvanlar ve Bagisiklamalar Farkli soydan disi Hartley kobaylar (Elm Hill), onaylanmis Kurumsal Hayvan Bakimi ve Kullanimi Komitesi (IACUC) protokolleri kapsaminda, Beth Israel Deaconess Tip Merkezinn Hayvan Arastirma Tesisinde yuvalandirildi. Protein trimeri (100 ug/hayvan) 4 veya 5 hafta araliklarla Ribi adjuvaninda (Sigma) 500 ul PBS içinde üç alanda uygulandi: 2 subkütan (sq) (200 ul/alan) ve 1 intraperitoneal (ip.) (100 ul/alan). Endo-toksin içermeyen DNA asilari (500 yil/hayvan) intramusküler olarak, 4-haftalik araliklarla sag ve sol kuadrisepsler arasinda bölünen 500 ul PBS içinde verildi. Rekombinan Ad26 vektörleri (5 x lûva/hayvan) intramusküler olarak, sag ve sol kuadrisepsler arasinda bölünen 500 ul salin içinde verildi. Uyutulan hayvanlardan serum numuneleri, ana toplardamardan elde edildi. 01201-P-0002 Gp140 trimerlerine ve dogrusal peptitlere (New Engladn Peptide) karsi serum baglayici antikor titreleri, bir uç nokta ELISA ile belirlendi. Gece boyunca 100 ul/göz olarak, PBS içinde 1 tig/ml klad A gp140, Klad C gpl40 veya Vl-V3 dogrusal peptit döngüleri ile kaplanan doksan-alti gözlü maxisorp ELISA plakalari (Thermo Fisher Scientific) 3 saat süreyle %2 BSA (Sigma) ve %0,05 Tween 20 (Sigma) ihtiva eden PBS ile bloke edildi. Daha sonra, sirali seyreltiler halinde kobay serumlari eklendi ve oda sicakliginda 1 saat süreyle inkübe edildi.

Plakalar üç kez %0,05 Tween 20 ihtiva eden PBS ile yikandir ve bir HRP- konjugatli keçi anti-kobay sekonder antikorun (Jackson ImmunoResearch Laboratories) bir 1/2000 seyreltisiyle 1 saat süreyle inkübe edildi. Plakalar üç kez yikandi ve SureBlue TMB mikro-göz peroksidaz (KPL Research Products) ile gelistirildi, TMB durdurma solüsyonunun (KPL Research products) eklenmesiyle durduruldu ve Softmax Pro 4.7.1 yazilimi kullanilarak bir Spectramax Plus ELISA plaka okuyucu (Molecular Devices) üzerinde 450nm/550nm ikili dalga boylarinda analiz edildi. ELISA uç nokta titreleri, emilim > 2-kat arka plan veren en yüksek karsilikli serum seyreltisi olarak tanimlandi.

TZM.bl Nötrlestîrme Tayini Katman 1 ve katman 2 HIV-1 psödovirüslerine karsi NAb yanitlari, önceki sekilde (Li et al., Yukarida; Montefiori et al., yukarida) TZMbl hücrelerinde bir lusiferaz-bazli tayin kullanilarak ölçüldü. Bu tayin, bir tek virüs enfeksiyonu turunun ardindan TZMzbl hücrelerinde lusiferaz bildirici gen ekspresyonundaki azalmayi ölçtü. IC50, hücre kontrol bagi] isima birimlerinin çikarilmasindan sonra virüs kontrol gözlerine kiyasla bagil isima birimlerinde %50”lik bir indirgemeye neden olan konsantrasyon olarak hesaplandi. Kisaca, serum numunelerinin 3-katli seri seyreltileri, %10 DMEM büyüme vasatinda (100 ul/göz) üçlü olarak (96- gözlü düz dipli plaka) gerçeklestirildi. Her bir göze 50 ul hacminde virisün 200 TCID50”si eklendi ve plakalar 37°C,de 1 saat süreyle inkübe edildi. TZM.b1 01201-P-0002 hücreleri daha sonra, 11 ng/mFlik bir nihai konsantrasyonda DEAE-Dextran (Sigma) ihtiva eden %10 DMEM büyüme vasatinda (100 nl hacimde lX104/göz) eklendi. Spesifik-olmayan önlemenin ekarte edilmesi için tüm tayinlerde murin lösemi virüsü (MuLv) negatif kontrolleri dahil edildi. Devinimsizlestirilmis protein A kolonlariyla (Pierce) saflastirilan IgG kullanilarak dogrulayici tayinler gerçeklestirildi. Degisken döngü peptit tepkenliginin test edilmesi için, saflastirilmis IgG numuneleri, psödovirüsün eklenmesi öncesinde 1 saat süreyle 37°C7de V1, V2 ve V3 dogrusal peptitlerle inkübe edildi. Bu tayinlerde bir negatif kontrol karisik 92UG037 V3 peptiti de dahil edildi. Katman 1 panelindeki virüsler (klad B), 92UG. Katman 2 klad A Du422.1, ve ZM197M.

Gen Yapisi ve Klonlama Enzimleri ' benzersiz klonlama enzimi: Sall; Kozak dizisi: GCCACC; 3' benersiz klonlama enzimi: BamHl; Gen yapisi: Sall-GCCACC-ATG..Stop-BamHI; Optimize: EVET. 92UG amino asit dizisi, Sekil 12A”da gösterilmektedir. CZA amino asit dizisi, Sekil 12B”de gösterilmektedir.

Referanslar Kim et al. (2005) AIDS Res. Hum. Retroviruses 21:58 01201-P-0002 Berger et al. (1999) Annu. Rev. lmmunol. 17:657 Berman et al. (2002) Aids 8:591 Binley et al. (2000) J. Virol. 74:627 Burton et al. (2004) Nat. lmmunol. 5:233 Carrow et al., (1991) AIDS Res. Hum. Retroviruses 72831 Kim et al. (2005) AIDS Res. Hum. Retroviruses 21:58 Montefiori et al. (2007) PLoSMed. 4:e348 Momer et al. (2009) J. Virol. 83:540 Page et al. (1991) Vaccine 9:47 01201-P-0002 A KladATrimer 2“ 4' 1' Bagisiklama B KladCTrimer 6- 5 'I Bagisiklama ü Klad C 01201-P-0002 Log Titre Bagisiklama öncesi serum r_ Klad C Trimer _ Log Titre Asilama sonrasi serum 4_ Klad A Trimer i4_ Klad C Trimer _> 01201-P-0002 Klad A Trimer g 80' -I- GP2 -E 60- 1- GP3 g 4- GP4 lg Konsantrasyon (uglml) KladCTrimer g 80' "' GP? g 4- GP9 2 40“ -o- GP10 g 20- -e- Naif lg Konsantrasyon (ug/ml) 01201-P-0002 Klad A Trimer 9:: »3 U 32-”, 2.932 4 @Emrmimk 4 asma› 4 ESMA., Klad C Trimer 2.: m5 U car/nin› U ©5579/ 2.9.8& 4 nazim., 4 :21”, 4 UEMA? 01201-P-0002 Klad A Ti'imei' Klad C Trimer 80" 80" 60- 60- 40. 40- -' 20_ 133 _ 103 da zmosnm (katman b 60- 50- 80-1 30- 49.. 40. -' 2D- g . 4 U .: ..:5 4' U 8. g- 3 g 3 E E E a -2 3 a 2. ... a 3 92UG037 . 8 V1 92UG037 . 8 V2 92UGO37 . 8 V3 SYNITRNITNSÃTNSSVMIREEIK (SFQ in No:3› TNATFKNVQSDMNKEiRisr-.Q m No:4) 2 10 Il s_ j_:sngpimmmspmmWQIN-HGKNSSNL-mm . 7. .r 7 . .ISEQIDNÜr-*I WTWI@mmwmppmmmmsmw 1 10 20 d] Sekil 4 (Devam) 01201-P-0002 002%' 422.”. w m 9 ..m n N rwu=© 5205229 :::E o 32 . 4 25:”. 1 m... .4 I.. 01201-P-0002 tman1 Serum NAb Klad A gp140 Kntman 2 Klad A Serum NAb Iitreleri DSO Klad A gp14l] Klad c gp140 01201-P-0002 Klad A gp140 Klad A gp140 Klad C gp140 Katman 2 Klad B Serum NAIJ Tilreleri ([DSO) 131 109 115 67 54 <20 24 Katman 2 Klad C Serum .\'.-\b Titrelerî (IDSO) Sekil 6 (Devam) 01201-P-0002 Tn'mer Immünoien Kanunu 2 Virüs Paneli Klad C gp 20% 01201-P-0002 2.0.2.0( 4." :anani 4” .::Buz Un 5:55_ umiâsmFSN 2.836 :ama _:55_ S 5.55_ 3.3252 2 5.5.9_ 01201-P-0002 DNA-sonrasi r. sonrasi DNA-sonrasi D.\`A›s arizasi Klad C gp140 DNA-sonrasi r. sonrasi DNA-sonrasi DNA-sarimsi sonrasi 1 DNA& omasi 500 1 BG sonrasi 10 75 1 118 DNA-sonrasi Klad A gp140 DNA-sonrasi sonrasi DNA-sonrasi r. sonrasi 01201-P-0002 Klad C gp140 Klad A gp140 . `Aýsonrasi .VA-sonrasi .Ik-sonrasi ani-sonrasi .YA-sonrasi sonrasi V `A60nrasi .YA-sonrasi .'A-somasi Sekil 9 (Devami) Kontrol 01201-P-0002 Cam. o m cc& Cum 2 _Row 01201-P-0002 D . ani. ama ch

Claims (8)

1. ISTEMLER Bir süjede nötrlestirici bir anti-HIV antiserumunun tetiklenmesi için bir ilacin üretilmesi için stabilize bir HIV gp140 trimerinin kullanimidir, burada HIV gpl40 trimeri, asagidaki diziye en az %95 özdes bir amino asit dizisi içeren T4-f1britin foldon trimerlesme alanini içeren, böylece, stabilize trimer bir süjeye verildiginde HIV”ye karsi bir nötrlestirici antiserumun üretimini saglayabilen bir stabilize trimer olusturan bir HIV gpl40 polipeptidini içerir.
2. 2. Istem 1,e göre kullanimdir, burada nötrlestirici anti-HIV antiserumu, klad A, klad B ve klad C°nin birinden veya daha fazlasindan seçilen HIV-1”i nötrlestirir.
3. 3. Istem 1,6 göre kullanimdir, burada HIV ile enfekte süjedeki HIV titresi, süjenin izole polipeptitle temas ettirilmesinden sonra azalir. 01201-P-0002. Önceki istemlerin herhangi birine göre kullanimdir, burada stabilize HIV gp140 trimeri, degisken döngü peptitleri Vl ve V2,yi içeren bir HIV glpl40 polipeptidi içerir, söz konusu Vl döngü peptidi, Thr Asn Ala Thr Phe Lys Asn Asn Val Thr
4. Asn Asp Met Asn Lys Glu Ile Arg Asn Cys Ser Phe Asn Thr Thr Thr Glu söz konusu V2 döngü peptidi, Ser Phe Asn Thr Thr Thr Glu Ile Arg Asp
5. Lys Lys Gln Gln Gly Tyr Ala Leu Phe Tyr Arg Pro Asp Ile Val Leu Leu
6. Lys Glu Asn Arg Asn Asn Ser Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Leu Ile Asn (SEQ . Önceki istemlerin herhangi birine göre kullanimdir, burada HIV, HIV-dir. . Önceki istemlerin herhangi birine göre kullanimdir, burada HIV gp140 trimeri, asagidaki amino asit dizisini içeren bir HIV gp140 polipeptidi
7. 7. Istemler 1 ila 6,dan herhangi birinde anildigi üzere bir stabilize HIV gp140 trimeri içeren bir asidir, burada asi, bir süjeye enj eksiyondan sonra HIViye karsi nötrlestirici serumlarin üretilmesini saglar.
8. 8. Istemler 1 ila 6adan herhangi birinde anildigi üzere bir izole, antijenik, stabilize HIV gpl40 trimeridir, burada antijenik, stabilize HIV gpl40 trimeri, bir süjeye enjeksiyondan sonra HIV°ye karsi nötrlestirici serumlarin üretilmesini saglar.