ES2659875T3 - Vacuna de trímero de Env VIH-1 bioquímicamente estabilizado - Google Patents

Abstract

Uso de un trímero de gp140 de HIV estabilizado para la fabricación de un medicamento para inducir un antisuero neutralizante anti-VIH en un sujeto, caracterizado porque el trímero de gp140 de VIH comprende un polipéptido gp140 de VIH que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a la secuencia **(Ver secuencia)** y, que comprende el péptido de lazo V3 que consiste en la secuencia Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Met Arg Ile Gly Pro Gly Gln Thr Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile Gly Asp Ile Arg Gln Ala Tyr (sec. con núm. de ident.:8); y que comprende el dominio de trimerización plegado de fibritina T4, formando, de ese modo, un trímero estabilizado capaz de inducir la producción de antisueros neutralizantes contra el HIV cuando el trímero estabilizado se administra a un sujeto.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

15

25

35

45

55

65

reguladoras, seleccionadas sobre la base de las células huésped que se usan para la expresión, que está operativamente unida a la secuencia de ácido nucleico que se expresa. Dentro de un vector de expresión recombinante, "operativamente unido" pretende significar que la secuencia de nucleótidos que codifica uno o más trímeros estabilizados de una proteína de la envoltura se une a la secuencia reguladora de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped cuando el vector se introduce en la célula huésped). El término "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solo en ciertas células huésped (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido). Se apreciará por aquellos con experiencia en la técnica que el diseño del vector de expresión puede depender de tales factores comola elección dela célula huésped a transformar, el nivel de expresión deproteína deseado, y similares. Los vectores de expresión descritos en la presente descripción pueden introducirse en células huésped para producir proteínas o porciones de estas, que incluyen proteínas de fusión o porciones de estas, codificadas por ácidos nucleicos como se describe en la presente descripción (por ejemplo, uno o más trímeros estabilizados de una proteína de la envoltura).

En ciertos aspectos, las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente descripción pueden insertarse en vectores y usarse como vectores de terapia génica. Los vectores de terapia génica pueden suministrarse a un sujeto mediante, por ejemplo, inyección intravenosa, administración local (ver, por ejemplo, Patente de los EE.UU. núm. 5,328,470), o mediante inyección estereotáctica (ver, por ejemplo, Chen y otros (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:3054). La preparación farmacéutica del vector de terapia génica puede incluir el vector de terapia génica en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en la que se embebe el vehículo de suministro del gen. Alternativamente, cuando el vector de suministro génico completo puede producirse intacto a partir de células recombinantes, por ejemplo, vectores retrovirales, vectores de virus adenoasociados, y similares, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que producen el sistema de suministro de genes (Ver Gardlik y otros (2005)Med. Sci.Mon. 11:110;SalmonsyGunsberg(1993) Hu.GeneTher.4:129;yWangyotros(2005)J. Virol. 79:10999 para revisiones de vectores deterapia génica).

Los vectores de expresión recombinante pueden diseñarse para la expresión de uno o más que codifican uno o más trímeros estabilizados de una proteína de la envoltura en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, uno o más vectores que codifican uno o más trímeros estabilizados de una proteína de la envoltura pueden expresarse en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto (por ejemplo, usando vectores de expresión de baculovirus), células delevaduraocélulasdemamífero.Lascélulashuéspedadecuadassediscutenademásen Goeddel,GeneExpression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Alternativamente, el vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo usando secuencias reguladoras del promotor T7 y polimerasa T7.

La expresión de proteínas en procariotas se lleva a cabo con mayor frecuencia en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas de fusión o no de fusión. Los vectores de fusión añaden una cantidad de aminoácidos a una proteína codificada en ellos, generalmente al extremo amino de la proteína recombinante. Tales vectores de fusión típicamente tienen tres propósitos: 1) aumentar la expresión de la proteína recombinante; 2) aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) ayudar en la purificación de la proteína recombinante actuando como un ligando en la purificación por afinidad. Frecuentemente, en los vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión de la porción de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante de la porción de fusión posterior a la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento afines, incluyen el Factor Xa, trombina y enteroquinasa. Los vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. y Johnson, K. S. (1988) Gene 67:31-40); pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA); y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.) que fusionan glutatión S-transferasa (GST), proteína de unión E a maltosa, o proteína A, respectivamente, a la proteínarecombinante objetiva.

En otro aspecto, el vector de expresión que codifica uno omás trímeros estabilizados de una proteína de la envoltura es un vector de expresión de levadura. Ejemplos de vectores para la expresión en levadura S. cerevisiae incluye pYepSec1 (Baldari, y otros, (1987) EMBO J. 6:229-234); pMFa (Kurjan y Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943); pJRY88 (Schultz y otros, (1987) Gene 54:113-123); pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.); y picZ (Invitrogen Corporation).

Alternativamente, uno o más trímeros estabilizados de una proteína de la envoltura pueden expresarse en células de insecto usando vectores de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (por ejemplo, células Sf9) incluyen las series pAc (Smith y otros (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) ylas series pVL (Lucklow y Summers (1989) Virology 170:31-39).

En ciertos aspectos, un ácido nucleico descrito en la presente descripción se expresa en células de mamífero usando un vector de expresión de mamífero. Los ejemplos de vectores de expresión de mamíferos incluyen pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufman y otros (1987) EMBO J. 6:187-195). Cuando se usan en células de

imagen7

imagen8

15

25

35

45

55

65

de un conjunto particular de condiciones de hibridación se selecciona siguiendo métodos convencionales en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook y otros, más arriba).

Como se usa en la presente descripción, el término "hibrida bajo condiciones rigurosas" pretende describir las condiciones para la hibridación y el lavado en las que las secuencias de nucleótidos al menos 60% idénticas entre sí típicamente permanecen hibridadas entre sí. En un aspecto, las condiciones son de manera que las secuencias al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85% o 90% o más idénticas entre sí típicamente permanecen hibridadas entre sí. Tales condiciones rigurosas son conocidas por los expertos en la técnica y pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6. Un ejemplo no limitante de condiciones de hibridación rigurosas es la hibridación en cloruro de sodio 6X/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguido de uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS 0,1% a 50 °C, a 55 °C, o a 60 °C o 65 °C.

Un primer polinucleótido se "deriva de" un segundo polinucleótido si tiene la misma o esencialmente la misma secuencia de los pares de bases que una región del segundo polinucleótido, su ADNc, complementos de este, o si muestra identidad desecuencia como sedescribeanteriormente. Un primer polipéptido sederiva deun segundo polipéptido si se codifica por un primer polinucleótido derivado de un segundo polinucleótido, o muestra identidad de secuencia con los segundos polipéptidos como se describió anteriormente. En la presente descripción, cuando una proteína gp41 se "deriva del VIH", la proteína gp41 no necesita ser producida explícitamente por el virus en sí, simplemente se considera que el virus es la fuente original de la proteína gp41 y/o secuencias de ácido nucleico que la codifican. Las proteínas gp41 pueden, por ejemplo, producirse por vía recombinante o sintética, por métodos conocidos en la técnica, o alternativamente, las proteínas gp41 pueden purificarse a partir de cultivos celulares infectados con VIH.

En ciertos aspectos, uno o más anticuerpos, uno o más trímeros estabilizados de una proteína de la envoltura y/o secuencias de ácido nucleico que codifican uno o más trímeros estabilizados de una proteína de la envoltura descritos en la presente descripción pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración. Tales composiciones típicamente comprenden la molécula de ácido nucleico o proteína y un portador farmacéuticamente aceptable. Como se usa en la presente descripción, el término "portador farmacéuticamente aceptable" pretende incluir cualquiera y todos los solventes, medio de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antimicóticos, agentes isotónicos y de retardo de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones. Compuestos activos suplementarios pueden incorporarse también en las composiciones.

En ciertos aspectos, una composición farmacéutica se formula para que sea compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de vías de administración incluyen administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica), transmucosal y rectal. Las soluciones o suspensiones que se usan para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable pueden incluir dispersiones o soluciones acuosas estériles (solubles en agua) y polvos estériles para la preparación extemporánea de dispersiones o soluciones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, CREMOPHOR EL™ (BASF; Parsippany, NJ) o solución salina regulada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y fluida hasta el punto que sea fácilmente inyectable. Debería ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y debería preservarse contra la acción de contaminación de los microorganismos tales como bacteria y hongos. El portador puede ser un medio de dispersión o solvente que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y sus mezclas adecuadas. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, por medio del uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por medio del uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse por varios agentes antibacterianos y antimicóticos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir en la composición, agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede producirse incluyendo en la composición un agente que retarda la absorción, por ejemplo, monoestearato alumínico y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando uno o más anticuerpos, uno o más trímeros estabilizados de una proteína de la envoltura y/o secuencias de ácido nucleico que codifican uno o más trímeros estabilizados de una proteína de la envoltura descrita en la presente descripción en la cantidad requerida en un solvente

imagen9

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

en la presente descripción se preparan con portadores que los protegerán contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como etileno y acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales pueden obtenerse además comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposómicas (que incluyen liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales para antígenos virales) pueden usarse además como portadores farmacéuticamente aceptables. Estos pueden prepararse de conformidad con los métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la Patente de los EE. UU. núm. 4,522,811.

Es especialmente ventajoso formular las composiciones orales o parenterales en forma de dosis unitaria para facilitar la administración y uniformidad de la dosis. La forma de dosis unitaria como se usa en la presente descripción se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosis unitarias de la invención se dictan por, y dependen directamente de, las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se desea, y las limitaciones inherentes en la técnica de la composición tal como un compuesto activo para el tratamiento de los individuos.

La toxicidad y eficacia terapéutica de uno o más anticuerpos, uno o más trímeros estabilizados de una proteína de la envoltura y/o una o más secuencias de ácido nucleico que codifican uno o más trímeros estabilizados de una proteína de la envoltura descrita en la presente descripción pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población). La relación de la dosis entre los efectos tóxicos a terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación de LD50/ED50. Se prefieren los compuestos que exhiben elevados índices terapéuticos. Aunque pueden usarse compuestos que exhiben efectos secundarios tóxicos, debe tomarse la precaución de diseñar un sistema de suministro que dirija tales agentes al sitio del tejido afectado, para minimizar el daño potencial a las células no infectadas y, de ese modo, reducir los efectos secundarios.

Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo de células y/o estudios en animales pueden usarse en la formulación de un intervalo de dosificación para su uso en humanos. La dosificación típicamente estará dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivos celulares. Una dosis puede formularse en modelos animales para lograr un intervalo de concentración de circulación en el plasma que incluya la IC50 (es decir, la concentración de compuesto prueba que logra una inhibición semimáxima de los síntomas) como se determinó en cultivo celular. Esta información se puede usar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alto rendimiento.

En ciertos aspectos, un método para el tratamiento de una infección viral, por ejemplo, infección por VIH, incluye la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente (por ejemplo, uno o más anticuerpos, uno o más trímeros estabilizados de una proteína de la envoltura, una secuencia de ácido nucleico que codifica uno o más trímeros estabilizados de una proteína de la envoltura y similares) que modula (por ejemplo, inhibe) una o más actividades de proteína de la envoltura (por ejemplo, gp41) (por ejemplo, mediación de la fusión viral (por ejemplo entrada viral y/o formación de sincitios) a un sujeto. Como se define en la presente descripción, una cantidad terapéuticamente efectiva de agente (es decir, una dosificación efectiva) varía de aproximadamente 0,001 a 30 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,01 a 25 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,1 a 20 mg/kg de peso corporal, o deaproximadamente1 a 10 mg/kg, de2 a 9 mg/kg, de3 a 8 mg/kg, de4 a 7 mg/kg o de5 a 6 mg/kg depeso corporal. El experto en la técnica apreciará que ciertos factores pueden influir en la dosificación requerida para tratar efectivamente a un sujeto, que incluyen, pero no se limitan a, la gravedad de la enfermedad o trastorno, tratamientos previos, la salud general y/o la edad del sujeto y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor puede incluir un único tratamiento o, en ciertas modalidades ilustrativas, puede incluir una serie de tratamientos. Se apreciará además que la dosificación efectiva de las moléculas usadas para el tratamiento puede aumentarse o disminuirse durante el transcurso de un tratamiento en particular. Los cambios en la dosificación pueden resultar de los resultados de los ensayos de diagnóstico como se describe en la presente descripción. Las composiciones farmacéuticas se pueden incluir en un contenedor, paquete o dispensador junto con instrucciones para su administración.

Debe entenderse que las modalidades de la presente invención que se han descrito son meramente ilustrativas de algunas de las aplicaciones de los principios de la presente invención. Los expertos en la técnica pueden realizar numerosas modificaciones basadas en las enseñanzas presentadas en la presente descripción sin apartarse del alcance de la invención.

15

25

35

45

55

65

Se proporcionan los siguientes ejemplos. En lo que se refiere a la invención, tal debe ser visto como ilustrativo de esta. En cualquier otro punto, los ejemplos deben verse como proporcionados solo con propósitos ilustrativos.

Ejemplo I

Capacidad de neutralización de los trímeros de gpl40 de VIH-1 bioquímicamente estables en un modelo de conejillo de indias.

La evaluación preclínica de los inmunógenos candidatos de Env es fundamental para la prueba de conceptos y para la priorización de candidatos de vacunas. Ensayos de neutralización del virus basado en la luciferasa en células TZM.bl (Li y otros (2005) J. Virol. 79:10108; Montefiori (2005) Curr. Prot. Immunol. Capítulo 12:Unidad 1211) se han desarrollado como un ensayo de alto rendimiento que puede estandarizarse (Montefiori (2009) Methods Mol. Biol. 485:395; Polonis y otros (2008) Virology 375:315). Sin embargo, el uso óptimo de este ensayo requirió la generación de paneles de virus estandarizados derivados de múltiples clados y que reflejan virus tanto fáciles de neutralizar (nivel 1) como aislados primarios (nivel 2) (Li y otros, más arriba).

Mediante el tamizaje se identificó un panel de aislados primarios de VIH-1, dos virus, CZA97.012 (Clado C)) (Rodenburg y otros (2001) AIDS Res. Hum. Retroviruses 17:161) y 92UG037.8 (Clado A) (Chen y otros, más arriba)que produjeron trímeros bioquímicamente homogéneos y estables con propiedades antigénicas bien definidas y uniformes (Burke y otros (2009) Virology 387:147). La adición del dominio de trimerización "plegado" (Fd) de fibritina del bacteriófago T4 aumentó adicionalmente su rendimiento y pureza (Frey y otros (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:3739). Como se describe además en la presente descripción, la inmunogenicidad de estos trímeros de gp140 estabilizados de clado A y clado C se evaluó en conejillo de indias usando un panel deaislados de nivel 1 y nivel 2 delos clados A, B y C.

Producción de Trímeros de gp 140 de VIH-1 homogéneos, estables

Los trímeros de gp140 env derivados de los aislados primarios 92UG037.8 (clado A) y CZA97.012 (clado C) se estabilizaron con una etiqueta de trimerización C-terminal "plegada" de fibritina T4 (Figura 13) y se produjeron en células T.ni (High 5). La pureza y estabilidad bioquímica se determinó de la siguiente manera: El trímero de gp140 de CZA97.012 (clado C) purificado se resolvió por cromatografía de filtración en gel en columnas de Superose 6. La masa molecular aparente se calculó mediante el uso de estándares de tiroglobulina (670 kDa), ferritina (440 kDa) y catalasa (232 kDa). Las fracciones del pico se combinaron y se analizaron mediante SDS-PAGE. El trímero de clado C se trató con varias concentraciones (0, 0,05, 0,25, 0,5, 1, 2, 5 mM) de etilenglicol bis (succinimidilsuccinato). Los productos reticulados se analizaron mediante SDS-PAGE usando un gel al 4%. El estándar molecular fuela fosforilasa b reticulada (Sigma). Similares análisis se han reportado previamente para el trímero de gp140 92UG037.8 de clado A purificado (Frey y otros, más arriba). El trímero CZA97.012 (clado C) mostró una pureza y homogeneidad similares según lo determinado por la cromatografía de exclusión por tamaño y la reticulación química que confirmaron que era monodisperso y trimérico.

Se realizó un ensayo del gen reportero de luciferasa en células TZM-bl (una línea celular genéticamentemodificada que expresa CD4, CXCR4 y CCR5 y contiene los genes reporteros Luc y β-Gal inducibles por Tat) basado en una única ronda de infección con virus pseudotipados Env clonadosmolecularmente. Este ensayo resultó en una alta tasa de éxito en las infecciones de una única ronda, capacidad de ensayo aumentada (por ejemplo, un ensayo de dos días), precisión aumentada (por ejemplo, neutralización de 50% medida con precisión) y un nivel mejorado de estandarización (por ejemplo, unalínea celular estable). El ensayo del gen reportero deluciferasa se optimizó y validó.

Respuestas de unión del anticuerpo inducidas por los Trímeros de Clado A y Clado C

Se usó un enfoque de múltiples niveles para evaluar las respuestas de anticuerpos neutralizantes inducidas por la vacuna. En el Nivel 1, la(s) cepa(s) de la vacuna y cepas sensibles a la neutralización no se incluyeron en la vacuna. En el Nivel 2, se usó un panel de virus heterólogos que coincidían con el(los) subtipo(s) genético(s) de la vacuna (por ejemplo, 12 virus por panel). Este nivel podría incluir opcionalmente cepas adicionales de los sitios de prueba de la vacuna. En el Nivel 3, se usó un panel de múltiples clados compuesto por seis virus de Nivel 2 evaluados en el Nivel 2. El Nivel 3 podría incluir opcionalmente cepas adicionales de un sitio opcional de prueba de la vacuna.

En un estudio preliminar, se evaluó la inmunogenicidad de un inmunógeno de núcleo de monómero gp120 de 92UG037.8 (clado A) en conejillo de indias, que indujo solo respuestas de anticuerpos neutralizantes (NAb) mínimos contra los virus de nivel 1 sensibles a la neutralización. Se centró la inmunogenicidad de los trímeros 92UG037.8 (clado A) y CZA97.012 (clado C) que se seleccionaron y diseñaron para una estabilidad máxima y homogeneidad conformacional. Estos inmunógenos contuvieron la secuencia de gp140 fusionada al dominio de trimerización plegado de la fibritina T4.

Los experimentos preliminares de monómero de gp120 de 92UG037.8 se realizaron como sigue. Se generó un 'núcleo' monomérico de gp120 de 92UG037.8 que estaba desprovisto de las regiones V1-V3 y tuvo truncamientos amino y carboxi terminales. Se inmunizaron los conejillos de indias a intervalos de cuatro semanas con 100 µg de monómero de

imagen10

15

25

35

45

55

65

Respuestas del péptido de lazo variable

Se evaluaron las respuestas de anticuerpos contra los péptidos V1, V2 y V3 de gp140 de clado A, 92UG037.8, y clado C, CZA97.012. Se utilizó un péptido codificado V3, 92UG037.8, como control negativo. Sueros de conejillos de indias inmunizados con trímeros de clado A y de clado C exhibieron respuestas de ELISA contra péptidos líneales de lazo V3 pero no contra el péptido codificado (Figuras 4A-4B). Estas respuestas se compararon contra las secuencias V3 homólogas y heterólogas, y se observaron títulos de ELISA inferiores contra los péptidos V1 y V2. Se realizaron ensayos de neutralización por competencia de péptidos V3 a partir de animales representativos que recibieron los trímeros de clado A (conejillo de indias #5) y clado C (conejillo de indias #10). La actividad neutralizante contra los virus seleccionados de nivel 1 y nivel 2 se bloqueó parcialmente tanto por péptidos homólogos y heterólogos de lazo V3 pero no por el péptido codificado (Figura 4C), lo que indica que los trímeros de gp140 de clado A y clado C indujeron los NAb dirigidos en parte contra elementos conservados en el lazo V3. La alineación de secuencia de los lazos V3 de 92UG037.8 y CZA97.012mostró una homología de secuencia sustancial (Figura 4D).

Regímenes heterólogos de sensibilización/refuerzo

La sensibilización con ADN seguido del refuerzo con proteínas se ha informado anteriormente para inducir respuestas de anticuerpos de títulos superiores que cualquier enfoque único (Vaine y otros, (2008) J. Virol. 82:7369; Wang y otros, (2006) Virology 350:34). En consecuencia, se exploraron los regímenes de sensibilización de ADN, refuerzo de proteína así como sensibilización de ADN y refuerzo del adenovirus recombinante serotipo 26 (rAd26) que expresan los trímeros de clado A y clado C. Se sensibilizaron conejillos de indias (n=5/grupo) con 0,5 mg de vacunas de ADN por vía intramuscular (i.m.) en las semanas 0, 4 y 8 y después se reforzaron en la semana 36 con una única inmunización de vectores rAd26 o en las semanas 36, 40 y 44 con proteínas trímeras en adyuvante Ribi. Se observaron respuestas de ELISA de alto título después de la inmunización tanto con los regímenes de ADN/proteína (Figuras 5A-5B) como con ADN/rAd26 (Figuras 5C-5D). Los títulos máximos obtenidos después de las tres inmunizaciones de sensibilización con ADN tuvieron un título log promedio de 4,8. El refuerzo con inmunizaciones ya sean una única con rAd26 o tres con la proteína purificada aumentó las respuestas a títulos log promedios de 6,5, que fueron comparables a los inducidos por el régimen con la proteína sola (Figura 1).

Se observaron niveles bajos de respuestas NAb de nivel 1 después de la sensibilización de ADN (Figura 9). Sin embargo, después del refuerzo, los regímenes ADN/rAd26 y ADN/proteína no indujeron respuestas deNab de nivel 1 de título superior en comparación con el régimen de la proteína sola. Sin pretender estar limitado por la teoría científica, se piensa que las vacunas de ADN pueden haber inducido una variedad de confórmeros u oligómeros de la proteína gp140 que podrían haber sensibilizado respuestas de anticuerpos no neutralizantes. Estos datos sugieren que, en ciertos contextos, los regímenes de vacunación de sensibilización/refuerzo pueden no ser necesariamente superiores a los inmunógenos de la proteína purificada.

Discusión

Los datos presentados en la presente descripción evaluaron la inmunogenicidad de los inmunógenos de trímeros de Env gp140 altamente purificados CZA97.012 (clado C) y 92UG037.8 (clado A) que se seleccionaron y modificaron por ingeniería genética para una estabilidad bioquímica y homogeneidad conformacional óptimas. La mayoría de los inmunógenos del trímero Env reportados hasta la fecha provienen de aislados del clado B, aunque reportes recientes describieron además trímeros de otros clados (Burke y otros, más arriba; Kang y otros (2009) Vaccine 37:5120, Epub 28 de junio de 2009). Sin embargo, la homogeneidad conformacional de esas preparaciones no se evaluó totalmente ni frecuentemente. Se utilizó un panel de virus de nivel 1 y nivel 2 de los clados A, B y C con un amplio intervalo de sensibilidades de neutralización para evaluar la neutralización del virus. Los conejillos de indias inmunizados con los trímeros de clado A y C mostraron una actividad neutralizante robusta y cruzada para clado contra los virus de clado A, B y C de nivel 1 sensibles a la neutralización, así como niveles claros pero bajos de actividad neutralizante contra los virus selectivos de nivel 2 clados A, B y C. Se confirmaron las respuestas NAb contra aislados de nivel 2 con el uso de IgG purificada, pero fueron esencialmente inferiores en magnitud y menos consistentes que las respuestas contra los aislados de nivel 1. Las respuestas de anticuerpos inducidas por los trímeros se dirigieron en parte contra los lazos V1, V2 y V3. Se observó la reactividad del lazo V3 contra ambos virus heterólogos, aunque, sin pretender estar limitados por la teoría científica, es probable además, que estuviesen enfocados una variedad de otros epítopos.

Se evaluaron además los regímenes de vacunación heteróloga de sensibilización/refuerzo para su potencial en aumentar la inmunogenicidad de los inmunógenos del trímero de proteína. Los regímenes de ADN/proteína y ADN/rAd26 no condujeron a la magnitud o amplitud mejorada de las respuestas de anticuerpos en comparación con el régimen de la proteína sola. De hecho, los regímenes de sensibilización/refuerzo parecieron inducir respuestas de NAb inferiores a pesar de las respuestas de anticuerpos de unión a ELISA comparables. Estos hallazgos contrastan con los reportes anteriores que destacaban las respuestas humorales mejoradas obtenidas con los regímenes ADN/proteína o ADN/rAd en comparación con los regímenes con proteínas solas en otros sistemas (Seaman y otros (2005) J. Virol. 79:2956; Vainey otros, más arriba;Wang y otros (2005) J. Virol. 79:7933; Wang y otros, más arriba). Sehipotetiza quela actividad NAb inferior observada en los regímenes de sensibilización/refuerzo en el presente estudio puede haberse relacionado con una mezcla heterogénea de confórmeros u oligómeros de Env expresados por las vacunas de ADN, lo

imagen11

15

25

35

45

55

65

0,05% y se incubaron durante 1 hora con una dilución 1/2000 de un anticuerpo secundario de cabra anti-conejillo de indias conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Las placas se lavaron tres veces y se revelaron con peroxidasa demicropocillos SureBlue TMB (KPL Research Products), se detuvieron mediantela adición de solución de parada TMB (productos KPL Research) y se analizaron a longitudes de onda dobles 450nm/550nm en un lector de placas Spectramax Plus ELISA (Molecular Devices) con el uso del programa Softmax Pro 4.7.1. Se definieron los títulos de ELISA puntofinal como la dilución de suero recíproca que produjo la más alta absorbancia > 2 veces el fondo.

Ensayo de neutralización en TZM.bl

Se midieron las respuestas NAb contra pseudovirus de HIV-1 de nivel 1 y nivel 2 con el uso de un ensayo basado en luciferasa en células TZM.bl como anteriormente (Li y otros, más arriba; Montefiori y otros, más arriba). Este ensayo midió la reducción en la expresión génica del reportero de la luciferasa en células TZM-bl después de una única ronda de infección viral. La CI50 se calculó como la concentración que causó una reducción del 50% en unidades de luminiscencia relativa en comparación con los pocillos de control de virus después de la sustracción de las unidades de luminiscencia relativas del control celular. En resumen, se realizaron diluciones 3 veces en serie de las muestras de suero por triplicado (placa de fondo plano de 96 pocillos) en medio de crecimiento DMEM al 10% (100 µl/pocillo). Se añadió 200 TCID50 de virus a cada pocillo en un volumen de 50 μl y las placas se incubaron durante 1 hora a 37° C. Después, se añadieron las células TZM.bl (1×104/pocillo en 100 µl de volumen) en medio de crecimiento DMEM al 10% que contenía DEAE-Dextrano (Sigma) a una concentración final de 11 µg/ml. Se incluyeron controles negativos del virus de la leucemia murina (MuLV) en todos los ensayos para descartar una inhibición no específica. Se realizaron ensayos confirmatorios utilizando IgG purificada por columnas de proteína A inmovilizada (Pierce). Para probar la reactividad del péptido de lazo variable, se incubaron las muestras de IgG purificadas con los péptidos lineales V1, V2 o V3 durante 1 hora a 37°C antes de la adición del pseudovirus. Un péptido V3 de 92UG037 codificado de control negativo se incluyó también en estos ensayos. Los virus en el panel de nivel 1 fueron: MW965.26 (clado C), DJ123.8 (clado A), SF162.LS (clado B), BaL.26 (clado B), 92UG037.8 (clado A) y CZA97.012 (clado C). Los virus en el panel de nivel 2 clado A fueron: Q769.d22, Q168.a2, Q842.d12, 3718.v3, 0330.v4 y 0439.v5. Los virus en el panel de nivel 2 clado B fueron: WITO4160.33, AC10.0.29, REJO451, 6535.3, SC422661 y TRO.11. Los virus en el panel de nivel 2 clado C fueron: ZM109F.PB4, ZM249M, CAP45.2, Du123.6, Du422.1, y ZM197M.

Estructura génica y enzimas de clonación

Enzima de clonación única 5': SalI; secuencia Kozak: GCCACC; enzima de clonación única 3': BamHI; Estructura Génica: SalI-GCCACC-ATG..Parada-BamHI; Optimizar: Sí. La secuencia de aminoácidos del trímero 92UG037 gp1406xHis (líder de MCONS) se representa en la Figura 12A. La secuencia de aminoácidos del trímero CZA97.012 gp1406xHis (MCONS líder) se representa en la Figura 12B.

Referencias

Beddows y otros (2007) Virology 360:329 Li y otros (2006) J. Virol 80:1414 Bower y otros (2006) Vaccine 24:5442 Kim y otros (2005) AIDS Res. Hum. Retroviruses 21:58 Frey y otros (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:3739 Barouch (2008) Nature 455:613 Beddows y otros (2007) Virology 360:329 Berger y otros (1999) Annu. Rev. Immunol. 17:657 Berman y otros (2002) Aids 8:591 Binley y otros (2000) J. Virol. 74:627 Bower y otros (2006) Vaccine 24:5442 Burton y otros (2004) Nat. Immunol. 5:233 Carrow y otros, (1991) AIDS Res. Hum. Retroviruses 7:831 Crooks y otros (2007) Virology 366:245 Derby y otros (2007) Virology 366:433 Dey y otros (2007) J. Virol. 81:5579 Flynn y otros (2005) J. Infect. Dis. 191:654 Gallo y otros (2003) Biochim. Biophys. Acta 1614:36 Kim y otros (2005) AIDS Res. Hum. Retroviruses 21:58 Li y otros (2006) J. Virol. 80:1414 Montefiori y otros (2007) PLoSMed. 4:e348 Morner y otros (2009) J. Virol. 83:540 Nara y otros (1988) J. Virol. 62:2622 Page y otros (1991) Vaccine 9:47 Pantophle and Burton (2006) Annu. Rev. Immunol. 24:739 Pitisuttithum y otros (2006) J. Infect. Dis. 194:1661 Scheid y otros (2009) Nature 458:636 Vogel y otros (1994) J. Immunol. 153:1895

imagen12

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2

   imagen3

   imagen4

   imagen5

   imagen6