FR2650598A1 - Derives de l'albumine a fonction therapeutique - Google Patents

Abstract

Utilisation de l'albumine comme transporteur plasmatique stable d'une fonction thérapeutique dérivée d'un récepteur membranaire. La présente invention est exemplifiée par la description d'agents thérapeutiques nouveaux utilisables pour le traitement du syndrome d'immunodéficience acquise : macromolécules hybrides comprenant des dérivés de l'albumine humaine couplés à des dérivés du récepteur CD4 possédant une affinité normale ou une meilleure affinité pour le virus HIV-1.

Description

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La présente invention concerne l'utilisation de dérivés de l'albumine dans la fabrication d'agents thérapeutiques utilisables dans le traitement de certaines maladies virales ou cancéreuses. Plus précisément, la présente invention concerne des macromolécules hybrides caractérisées en ce qu'elles comportent le domaine actif d'un récepteur de virus ou le domaine actif d'une molécule capable de fixer ledit virus ou le domaine actif d'une molécule capable de reconnaitre le fragment Fc des immunoglobulines complexés à des virus ou le domaine actif d'une molécule capable de fixer un ligand intervenant dans un processus pathologique, couplé avec une albumine ou un 1 0 variant de l'albumine. Il est entendu dans ce qui suit que les termes dérivés ou variants de l'albumine désignent toute protéine à haute demie-vie plasmatique obtenue par modification (mutation, délétion et/ou addition) par les techniques du génie génétique d'un gène codant pour un isomorphe donné de l'albumine, mais également toute macromolécule à haute demie-vie plasmatique obtenue par modification in vitro de la protéine codée par de tels gènes. Ces dérivés de l'albumine à haute demie-vie plasmatique sont susceptibles d'une application thérapeutique dans les traitements anti-viraux du fait de l'affinité du virus ou d'une immunoglobuline complexée à un virus pour un site de fixation présent sur lesdits dérivés, ou d'une application thérapeutique dans les traitements de 2 O maladies cancéreuses du fait de l'affinité d'un ligand, par exemple un facteur de croissance, pour un site de fixation présent sur lesdits dérivés et provenant, en particulier, d'un récepteur membranaire dont l'amplification est corrélée à un phénotype transformant (proto-oncogènes). Il est entendu dans ce qui suit que de tels dérivés de l'albumine à fonction thérapeutique sont désignés indifféremment par le terme générique de mhacromolécules hybrides à fonction anti-virale, ou macromolécules hybrides à fonction anticancéreuse, ou tout

simplement macromolécules hybrides.

Plus particulièrement, la présente invention consiste en l'obtention * d'agents thérapeutiques nouveaux caractérisés par le couplage, chimique ou par 3 0 voie du génie génétique, d'au moins deux fonctions distinctes: (i) une fonction de transporteur plasmatique stable assurée par tout variant de l'albumine, et en particulier de l'albumine humaine plasmatique (SAH). En effet, les gènes codant pour la SAH sont très polymorphes et plus de 30 types génétiques différents ont été répertoriés (Weitkamp L.R. et al., Ann. Hum. Genet. 37 (1973) 219-226). La molécule

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d'albumine, dont la structure tridimensionnelle a été caractérisée par diffraction aux rayons X (Carter D.C. et al. Science 244 (1989) 1195-1198) , a été choisie comme vecteur de ladite fonction parce qu'elle représente la protéine plasmatique la plus abondante (40g par litre chez l'homme), posséde une demie vie plasmatique importante (entre 14 et 20 jours chez l'homme, Waldmann T.A., in "Albumin Structure, Function and Uses", Rosenoer.V.M. et al. (eds), Pergamon Press, Oxford, (1977) 255-275), et possède surtout l'avantage d'être dépourvue de fonction enzymatique permettant son utilisation thérapeutique à

des doses importantes.

1 0 (ii) une fonction thérapeutique anti-virale ou anti-cancéreuse. La fonction anti-virale est caractérisée, soit en ce qu'elle est un leurre pour la fixation spécifique du virus, soit en ce qu'elle est un leurre de fixation de l'ensemble constitué dudit virus complexé à des immunoglobulines. Par exemple, la fonction anti-virale est assurée par tout ou partie d'un récepteur 1 5 spécifique normalement utilisé par un virus pour sa propagation dans l'organisme, ou toute molécule capable de fixer ledit virus avec une affinité permettant son utilisation in vivo comme fonction thérapeutique dans les traitement anti-viraux. La fonction anti-virale peut également être assurée par tout-ou partie d'un récepteur capable de reconnaitre des immunoglobulines 2 0 complexés à des virus, ou toute molécule capable de fixer lesdits complexes avec une affinité permettant son utilisation in vivo comme fonction thérapeutique dans les traitement anti-viraux. La fonction anti-cancéreuse, qui est caractérisée en ce qu'elle est un leurre de fixation d'un ligand et plus particulièrement d'un facteur de croissance impliqué dans un processus d'oncogénèse, est assurée par 2 5 tout ou partie d'un proto-oncogène cellulaire ou par toute molécule capable de fixer ledit ligand avec une affinité autorisant son utilisation in vivo comme

fonction thérapeutique dans les traitement anti-cancéreux.

(iii) dans le cas ou une concentration locale importante de la fonction thérapeutique est souhaitable, par exemple parce qu'elle synergise une 3 0 inhibition de l'infectivité du virus in vivo une troisième fonction permettant la dimérisation ou la polymérisation de ladite macromolécule hybride à fonction thérapeutique pourra également être intégrée, éventuellement de façon redondante. Une telle fonction peut être assurée, par exemple, par un motif "leucine zipper" (Landschulz W.H. et al., Science 240 (1988) 1759-1764), ou 3 5 tout domaine protéique nécessaire à la formation d'homodimères comme celui

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de la protéine tat codée par le génÈme du virus HIV-1 (Frankel A.D. et al. , Science 240 (1988) 70-73; Frankel A.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988)

6297-6300).

Dans la présente invention, la fonction de transporteur plasmatique, la fonction thérapeutique, et éventuellement la fonction de polymérisation sont groupées au sein d'une même macromolécule, par exemple en utilisant les

techniques du génie génétique. -

Un des objets de la présente invention concerne en particulier l'obtention de macromolécules hybrides dérivées de la SAH et utilisables dans 1 0 la lutte contre certaines maladies virales, par exemple chez l'homme contre les virus responsables du syndrome de l'immunodéficience acquise (SIDA). Un autre objet de la présente invention concerne également l'obtention de macromolécules hybrides dérivées de la SAH et utilisables dans la lutte contre certaines maladies cancéreuses, et notamment contre certains cancers associés à 1 5 l'amplification génomique et/ou la surexpression de proto-oncogènes humains, par exemple le proto-oncogène c-erbB-2 (Semba K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 (1985) 6497-6501; Slamon D.J. et al., Science 235 (1987) 177-182;

Kraus M.H. et al., EMBO J. 6 (1987) 605-610).

Le virus HIV-1 est un des rétrovirus responsable chez l'homme du 2 O syndrome d'immunodéficience acquise. Ce virus a été particulièrement étudié au cours des cinq dernières années: une découverte fondamentale concerne la mise en évidence du rôle de la molécule CD4 (T4) comme récepteur du virus HIV-1 (Dalgleish A.G. et al., Nature 312 (1984) 763767; Klatzmann D. et al., Nature 312 (1984) 767-768), l'interaction virusrécepteur se faisant via une 2 5 interaction très spécifique entre une des protéines virales d'enveloppe (gpl20) et la molécule CD4 (McDougal et al, Science 231 (1986) 382-385). La découverte de cette interaction entre le virus HIV-1 et certains lymphocytes T a été à l'origine d'une demande de brevet Français revendiquant l'utilisation de la molécule T4 ou de ses anticorps comme agent th érapeutique contre le virus

3 0 HIV-1 (c.f. FR 2 570 278).

Le clonage et'une première version de la séquence du gène codant pour la molécule CD4 humaine a été décrite par Maddon et al. (Cell 42 (1985) 93104), puis corrigée par Littmann et al. (Cell 55 (1988) 541): la molécule CD4 fait partie de la super-famille des immunoglobulines -et comporte en particulier un 3 5 domaine N-terminal V1 très homologue au domaine variable de la chaine

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lourde des immunoglobulines (Maddon P.J. et al., CelI 42 (1985) 93-104).

L'utilisation du gène codant pour la molécule CD4 par les techniques in vitro d'ADN recombinant apporte la preuve définitive de l'utilisation du produit de ce gène comme récepteur principal du virus HIV-1 (Maddon P.J. et al., Cell 47 (1986) 333-348). La séquence de ce gène ainsi que son utilisation comme agent

thérapeutique anti-HIV-1 sont revendiqués dans le brevet WO 88 013 040 A1.

La manipulation de ce gène par les techniques de l'ADN recombinant a permis l'obtention de variants solubles de première génération capables d'exercer une action anti-virale in vitro (Smith D.H. et al., Science 238 (1987) 1 0 1704-1707; Traunecker A. et al., Nature 331 (1988) 84-86; Fischer R.A. et al., Nature 331 (1988) 76-78; Hussey R.E. et al., Nature 331 (1988) 78-81; Deen K.C. et al., Nature 331 (1988) 82-84), et in vivo (Watanabe M. et al., Nature 337 (1989) 267-270). Toutefois, il a pu être observé lors de divers essais in vivo soit chez l'animal (lapin, singe) soit lors d'essais cliniques de phase I, que le variant CD4 1 5 soluble de première génération constitué de la molécule CD4 dépourvue de ses deux domaines C-terminaux était caractérisé par une demie-vie courte: ainsi, Capon et al. (Nature 337 (1989) 525-531) ont évalué la demie-vie chez le lapin à environ 15 minutes, alors que Watanabe et al. (Nature 337 (1989) 267-270) ont estimé que 50% du C14 soluble de première génération administré par voie

2 0 intramusculaire restait biodisponible pendant 6 heures chez le singe Rhésus.

Enfin, les essais de phase I conduits sur 60 malades affectés du SIDA ou d'un ARC ("Aids Related Complex") traités par le produit de la société Genentech

ont indiqués des demi-vies du produit comprises entre 60 minutes (voie intra-

veineuse) et 9 heures après injection par voie intramusculaire (AIDS/HIV 2 5 Experimental Treatment Directory, AmPAR, May 1989). Il apparait qu'une stabilité aussi faible in vivo de l'agent thérapeutique constitue un handicap majeur. En effet, des injections répétées du produit, couteuses et handicapantes pour le malade, ou une administration par perfusion deviennent nécessaires pour espérer atteindre une concentration plasmatique efficace. Il devient donc 3 0 particulièrement important de trouver des dérivés de' la molécule CD4

caractérisés par une stabilité in vivo nettement supérieure.

La partie de la molécule CD4 capable d'interagir avec le virus HIV-1 a été localisée dans la moitié N-terminale, et plus précisément le domaine V1, de

cette molécule (Berger E.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1987) 2357-2361).

3 5 Il a de plus été observé qu'une proportion significative (environ 10%) des sujets infectés par le HIV développent une réponse immunitaire contre le récepteur CD4 et les anticorps ainsi développés sont dirigés contre la partie C-terminale de

la portion extra-cellulaire de ce récepteur (Thiriart C. et al., AIDS 2 (1988) 345-

352; Chams V. et al., AIDS 2 (1988) 353-361). Selon l'un des objets de la présente invention, on utilisera donc de préférence uniquement les domaines N- terminaux V1 ou V1V2 de la molécule CD4, qui supportent toute l'activité de fixation au virus, dans la fusion avec la fonction stabilisatrice dérivée de l'albumine. Sur la base de l'homologie observée avec le domaine variable des 1 0 immunoglobulines, plusieurs laboratoires ont construit des fusions génétiques entre la molécule CD4 et différents types d'immunoglobulines aboutissant à des immunoglobulines hybrides ayant une action anti-virale in vitro (Capon D.J. et al., Nature 337 (1989) 525-531; Traunecker A. et al., Nature 339 (1989) 68-70; voir également WO 89 02922). Néanmoins, l'implication du récepteur FcyRIII 1 5 (récepteur de type 3 pour la partie Fc des IgG), ou antigène CD16 chez l'homme (Unkeless J.C. et Jacquillat C., J. Immunol. Meth. 100 (1987) - 235-241), dans l'internalisation infectieuse du virus HIV-1 (Homsy J. et al., Science 244 (1989)

1357-1360) pourrait avoir un rôle important in vivo dans la propagation virale.

Ce récepteur, qui a été cloné récemment (Simmons D. et Seed B., Nature 333 2 0 (1988) 568-570), est essentiellement localisé dans la membrane des macrophages, des polynucléaires et des granulocytes, mais contrairement au CD4, le récepteur CD16 existe également à l'état soluble dans le sérum (Khayat D. et al., J. Immunol. 132 (1984) 2496-2501; Khayat D. et al., J. Immunol. Meth. 100 (1987) 235-241). Un point important est que le récepteur CD16 membranaire est utilisé 2 5 comme seconde voie d'entrée par le virus HIV-1 pour infecter les macrophages

grâce à la présence d'anticorps facilitants (Homsy J. et al., Science 244 (1989) 1357-

-1360). Ce processus d'infection qui fait intervenir.un "récepteur Fc" à la surface des cellules cibles (et par exemple le récepteur CD16) et la partie Fc des anticorps opsonisant un virion est appelé ADE ("Antibody Dependent Enhancement") et 3 0 a également été décrit pour les flavivirus (Peiris J.S.M. et al., Nature 289 (1981) 189-191) et le lentivirus du Visna-Maedi ovin (Jolly P.E. et al., J. Virol. 63 (1989) 1811-1813). D'autres "récepteurs Fc" ont été décrits pour les IgG (FcyRI et FcyRII par exemple) et d'autres classes d'immunoglobulines et le phénomène d'ADE semble faire intervenir d'autre types de "récepteur Fc" que celui reconnu par 3 5 l'anticorps monoclonal 3G8 (Homsy J. et al., Science 244 (1989) 1357-1360;

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- 6 - Takeda A. et al., Science 242 (1988) 580-583). On peut donc s'interroger sur l'efficacité anti-virale de macromolécules hybrides reposant uniquement sur des fusions entre immunoglobulines et tout ou partie d'un récepteur normalement utilisé par un virus, par exemple le virus HIV-I, pour sa propagation dans l'organisme; en effet, la présence sur de telles molécules d'un fragment Fc fonctionnel pourrait leur conférer un rôle facilitant lors de l'infection virale de certains types cellulaires. Il est également important d'obtenir des dérivés de la molécule CD4 qui soient utilisables à des

concentrations thérapeutiques très importantes.

1 0- Un type différent de constructions chimériques a été réalisé entre la protéine bactérienne MalE et la molécule CD4 (Clément J.M. et al., C.R. Acad. Sci. Paris 308, série III (1989) 401-406). Une telle fusion permet d'utiliser les propriétés de la protéine MalE, en particulier en vue de la production et/ou de la purification de la protéine hybride. Enfin, la construction d'une fusion 1 5 génétique entre la molécule CD4 et une toxine bactérienne a également été décrite (Chaudhary V.K. et al., Nature 335 (1988) 369-372). On peut toutefois s'interroger sur l'utilisation en thérapeutique humaine d'une fusion génétique

avec une protéine bactérienne.

La mise en évidence du phénomène d'ADE dans la propagation virale de 2 0 certains virus, en particulier les lentivirus, incluant le virus HIV-1, justifie la

recherche de méthodes alternatives, d'une part à l'obtention d'un vaccin anti-

SIDA et d'autre part à l'obtention d'agents thérapeutiques reposant uniquement sur des fusions entre immunoglobulines et toute molécule capable de fixer ledit virus. C'est pourquoi les agents thérapeutiques anti-SIDA qui sont 2 5 l'un des objets de la présente invention repose sur la fusion de tout ou partie d'un récepteur utilisé directement ou indirectement par le virus HIV-1 pour sa propagation in vivo avec une protéine plasmatique stable, sans activité

enzymatique, et dépourvue de fragment Fc.

En particulier, la présente invention concerne le couplage, notamment 3 0 par la voie du génie génétique, de variants de l'albumine humaine avec un site de fixation du virus HIV-1. Lesdites macromolécules hybrides dérivées de l'albumine humaine sont caractérisées par la présence d'un ou plusieurs variants du récepteur CD4 caractérisés en ce qu'ils proviennent de toute modification, notamment par les techniques in vitro de l'ADN recombinant 3 5 (mutation, délétion et/ou addition), du domaine N- terminal du récepteur CD4

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impliqué dans l'interaction spécifique du virus HIV-1 avec ses cellules cibles, aboutissant à la création de leurres plasmatiques stables à fonction globalement anti-virale (désigné par la suite par le terme générique SAH-CD4). Un autre objet de l'invention concerne le couplage de variants de l'albumine humaine à tout variants de la molécule CD16 impliquée dans l'internalisation infectueuse,

entre autres du virus HIV-1, (désigné par la suite par le terme générique SAH-

CD16), et plus généralement au couplage de variants de l'albumine à toute molécule capables de mimer les récepteurs cellulaires responsables du

phénomène d'ADE de certains virus, et en particulier les lentivirus.

1 0 Les principes de la présente invention peuvent également s'appliquer à d'autres récepteurs utilisés directement ou indirectement par un virus humain ou animal pour sa propagation dans l'organisme et par exemple: 1/ la molécule d'adhésion intercellulaire 1 (ICAM-1) dont il a été montré qu'elle joue le rôle de récepteur pour le rhinovirus humain 1 5 HRV14 (Greve J.M. et al., Cell 56 (1989) 839-847; Staunton D.E. et al., Cell 56

(1989) 849-853);

2/ le récepteur du poliovirus qui a été cloné récemment par Mendelsohn et al. (Cell 56 (1989) 855-865); 3/ le récepteur du complémer. t C3D qui constitue le

2 0 récepteur du virus d'Epstein-Barr EBV sur les cellules humaines (Fingeroth J.D.

et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 4510-4514), lequel est responsable chez l'homme de la mononucléose infectieuse et de certains lymphomes; 4/ le récepteur des rétrovirus des leucémies des cellules T humaines HTLV-I et HTLV-II récemment cartographiés sur le chromosome 17 2 5 (Sommerfelt M.A. et al., Science 242 (1988) 1557-1559), lesquels sont responsables de la leucémie T de l'adulte et de la paraparésie spastique tropicale (HTLV-I) et de la leucémie à tricholeucocytes (HTLV-II); / le récepteur du virus -écotropique de la leucémie murine MuLV-E, localisé sur le chromosome 5 de la souris par Oie et al. (Nature 274

3 0 (1978) 60-62) et récemment cloné par Albritton et al. (Cell 57 (1989) 659-666).

Un autre objet de la présente invention concerne l'obtention de molécules hybrides stables à fonction anticancéreuse obtenues par le couplage de variants de l'albumine avec toute molécule capable de fixer des facteurs de croissance qui, dans certains cas pathologiques associés à l'amplification des 3 5 proto-oncogènes membranaires correspondants, peuvent interagir avec leurs -8 -

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cellules cibles et induire un phénotype transformé. Un exemple de tels récepteurs est constitué par la classe des récepteurs associés à une activité tyrosine kinase (Yarden Y. et Ulrich A., Biochemistry 27 (1988) 3113-3119), dont les mieux connus sont les récepteurs du facteur de croissance épidermique (EGF) et du facteur I stimulant les colonies ("CSFI") qui sont respectivement codés par les proto-oncogènes c-erbB-1 (Downward J. et al., Nature 307 (1984) 521-527) et c-fms (Sherr C.J. et al., Cell 41 (1985) 665-676). Un autre exemple de

tels récepteurs est constitué par les récepteurs à l'insuline (HIR), au "platelet-

derived growth factor" (PDGF), au "Insuline-like Growth Factor-1" (IGF-1), et 1 0 surtout par le proto-oncogène c-erbB-2 dont il a été montré que son amplification génomique et/ou la surexpression est étroitement corrélée à certains cancers humains, notamment du sein (Slamon D.J. et al. , Science 235 (19ú7) 177-182; Kraus M.H. et al., EMBO J. 6 (1987) 605-610) . De plus, on peut également envisager d'appliquer les principes de la présente invention à I 5 d'autres récepteurs, par exemple le récepteur à l'interleukine-6 (IL-6) dont il a été montré in vitro que cette molécule est un facteur autocrine des cellules

rénales de certains carcinomes (Miki S. et aI., FEBS Lett., 250 (1989) 607-610).

Comme il a été indiqué précédemment, les macromolécules en cause sont, de préférence, essentiellement protéiques et peuvent do-Lc être obtenues 2 0 par des techniques mettant en jeu des ADN recombinants. De préférence, ces macromolécules seront obtenues par culture de cellules transformées, transfectées ou infectées par des vecteurs exprimant lesdites macromolécules dans lesdites cellules. Plus particulièrement, on utilisera la sécrétion des protéines hybrides dérivées de l'albumine précédemment citées par culture d'une levure, particulièrement du genre Kluvveromyces modifiée par l'utilisation des techniques in vitro de l'ADN recombinant. Le développement de ces techniques permet en effet d'obtenir des taux importants des protéines hybrides précédemment citées, correctement maturées et sécrétées dans le

milieu de culture, ce qui facilite considérablement leur purification.

3 0 Un système d'expression et de sécrétion préféré -consiste en l'utilisation des levures du genre Kluyveromyces comme cellule hôte, transformées par certains vecteurs dérivés du réplicon extrachromosomique pKD1 initialement isolé chez K. marxianus var. drosophilarum. Ces levures, et en particulier K. marxianus (incluant les variétés lactis, drosophilarum et marxianus qui dans ce 3 5 qui suit sont respectivement désignées K. lactis K. drosophilarum et K. fragilis) -9 -

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sont généralement capables de répliquer lesdits vecteurs de façon stable et possèdent en outre l'avantage d'être inclues dans- la liste des organismes G.R.A.S. ("Generally Recognized As Safe"). Des levures privilégiées seront préférentiellement des souches industrielles du genre Kluyveromyces capables de répliquer de façon stable lesdits plasmides dérivés du plasmide-pKD1 et dans lesquels a été inséré un marqueur de sélection ainsi qu'une cassette d'expression permettant la sécrétion desdites protéines hybrides à des niveaux importants. Trois types de vecteurs de clonage ont été décrits chez ces organismes: 1 0 i) des vecteurs intégratifs contenant des séquences génomiques de levures du genre Kluyveromyces et qui après introduction dans les cellules peuvent s'intégrer dans les chromosomes par recombinaison génétique in vivo (c.f. WO 83/04050). Une telle intégration est obtenue lorsque ces vecteurs ne contiennent pas de séquence permettant une réplication autonome dans la 1 5 cellule et résulte d'un événement rare qui nécessite l'utilisation d'un marqueur génétique permettant sa sélection. L'avantage de ce système:est la stabilité des souches transformées, c'est-à-dire le fait qu'elles puissent être cultivées dans un milieu nutritif normal ne nécessitant pas de pression de sélection pour le maintien des.séquences intégrées. L'inconvénient de ce 2 O système réside dans le fait que les gènes intégrés sont présents à un petit nombre de copies par cellule, ce qui résulte en un faible niveau d'expression

desdits gènes.

ii) des vecteurs réplicatifs contenant des séquences de réplication autonome (ARS) dérivées de l'ADN génomique de levures appartenant au

2 5 genre Kluyveromyces (Das S. et Hollenberg C.P., Current Genetics 6 (1982) 123-

128; voir également WO 83/04050). La ségrégation mitotique de tels vecteurs est cependant peu homogène même en conditions sélectives de croissance, ce qui résulte en leur perte à un taux élevé dans les cellules transformées. et limite

d'autant leur utilisation à l'échelle industrielle.

3 0 iii) des vecteurs réplicatifs contenant des réplicons dérivés de plasmides naturels de levure, soit du plasmide linéaire "killer" kl xisolé de K. lactis (de Louvencourt L. et al., J. Bacteriol. 154 (1983) 737-742; voir également EP 0 095 986 A1, publ. 07.12.1983), soit du plasmide circulaire pKD1 isolé de K. drosophilarum (Chen X.J. et al., Nucl. Acids Res. 14 (1986) 4471-4480; Falcone C. 3 5 et aI., Plasmid 15 (1986) 248-252; EP 0 241 435 A2, publ. 14.10.1987). Les vecteurs

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contenant des réplicons dérivés du plasmide "killer" nécessitent un milieu nutritif spécial, sont perdues à un taux de 40-99% après seulement 15 générations en conditions sélectives de croissance (c.f. EP 0 095 986 A1, 1983) et sont donc difficilement utilisables en fermentation à - grande échelle. Les vecteurs réplicatifs dérivés du plasmide pKD1 décrits dans la demande de brevet EP 0 241 435 A2 sont également très instables puisque le vecteur le plus performant de ce point de vue (P3) est perdu par environ 70% des cellules après

seulement six générations en conditions non-sélectives de croissance.

Un des objets de la présente invention concerne l'utilisation de certaines 1 0 constructions dérivées du plasmide pKD1 entier, constructions qui possèdent des caractéristiques de stabilité nettement supérieures à celles mentionnées dans la demande EP 0 241 435 A2: il sera montré dans la présente invention que ces nouveaux vecteurs sont maintenus dans plus de 80% des cellules après 50

générations cellulaires en conditions non-sélectives de croissance.

1 5 La stabilité élevée des vecteurs utilisés dans la présente invention à été obtenue en exploitant pleinement les caractéristiques du plasmide pKD1. Ce réplicon extrachromosomique possède, outre une origine de réplication, deux séquences répétées inversées de 346 nucléotides (SKI) et trois phases ouvertes de lecture codant pour les gènes A., Bet C dont le niveau d'expression est crucial 2 0 pour la stabilité et le nombre de copies plasmidiques par cellule. Par analogie avec le système du plasmide 2 g de S. cerevisiae qui est structurellement très proche du plasmide pKD1 (Chen X.J. et al., Nucl. Acids Res. 14 (1986) 4471-4480), les protéines codées par les gènes B et C sont vraisemblablement impliquées dans la partition mitotique du plasmide du fait de leurs rôles dans la régulation 2 5 négative du gène A codant pour une recombinase à site spécifique (FLP). Il a été démontré que la recombinaison FLP-dépendante entre les SRI du plasmide 2 g de S. cerevisiae est à la base d'un mécanisme d'autorégulation du nombre de copies plasmidique: quand le nombre de copies du plasmide devient trop bas pour permettre la production de quantités suffisantes des produits des gènes B 3 0 et C agissant comme des répresseurs du gène A., la recombinase FLP est induite et le plasmide recombiné peut se répliquer selon un mode du type "rolling circle" aboutissant à l'amplification du nombre de copies jusqu'à 50 copies par

cellule (Futcher A.B., Yeast 4 (1988) 27-40).

Les vecteurs publiés dans la demande EP 0 241 435 A2 ne respectent pas 3 5 les caractéristiques structurales du réplicon pKDI de K. drosophilarum: le - il - 265059 vecteur A15 ne contient pas la séquence complète du plasmide-pKD1 alors que les vecteurs P1 et P3 contiennent un gène A interrompu, détruisant ainsi le système de réplication autorégulé du plasmide résidant pKD1. Au contraire, les constructions plasmidiques dérivées de pKD1 utilisées dans la présente invention respectent l'intégralité structurale des SRI et des phases ouvertes A, B et C du plasmide pKD1, ce qui résulte en une stabilité remarquablement accrue et la sécrétion à des taux élevés desdites protéines hybrides à fonction thérapeutique. La cassette d'expression utilisée pour l'expression des macromolécules 1 0 hybrides comprendra en particulier une région d'initiation de la transcription (région promoteur) permettant l'expression dans les levures hôtes du gène placé sous son contrôle et codant pour lesdites protéines hybrides à fonction thérapeutique; ces régions peuvent provenir des régions promoteurs de gènes de levures appartenant au genre Saccharomyces ou Kluvveromvces tels que les

1 5 gènes codant pour la phosphoglycérate kinase (PGK), la glycéraldéhyde3- phosphate déshydrogénase (GPD), la lactase de Kluvveromvces (LAC4), les.

énolases (ENO), les alcool déhydrogénases (ADH), la phosphatase acide de S. cerevisiae (PH_5) etc... Ces régions de contrôle peuvent être modifiées, par exemple par mutagénèse in vitro par l'introduction d'éléments additionnels de 2 0 contrôle ou de séquences synthétiques ou par des délétions ou des substitutions des éléments originels de contrôle. Par exemple, des éléments de régulation de la transcription, appelées "enhancer" chez lés cellules eucaryotes supérieures et "upstream activating sequences" (UAS) chez les levures, provenant d'autres promoteurs, par exemple les UAS des gènes GALI et GAL1O de S. cerevisiae ou 2 5 d gène LAC4 de K. lactis ou encore des "enhancers" correspondant à des gènes reconnus par des transactivateurs viraux comme la séquence reconnue par la protéine E2 des papillomavirus, pourront être utilisés pour construire des promoteurs hybrides permettant, par exemple, de dissocier la phase de croissance des levures transformées de la phase d'expression des gènes codant 3 0 pour lesdites protéines hybrides. La cassette d'expression comprendra également une région de terminaison de la transcription fonctionnelie dans l'hôte envisagé et sera positionnée immédiatement en aval de la séquence

codante pour lesdites protéines hybrides à fonction thérapeutique.

La partie codant pour lesdites protéines hybrides à fonction thérapeutique 3 5 sera précédée par une séquence encodant un peptide signal capable de diriger

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lesdites protéines dans la voie de sécrétion de la cellule hôte. Cette séquence d'exportation peut correspondre à l'extension N-terminale naturelle de l'albumine (région "prépro") ou peut être obtenue à partir de gènes de levure codant pour des protéines sécrétées telles que les phéromones sexuelles ou les toxines "killer", ou peut correspondre à toute séquence améliorant la sécrétion desdites protéines d'intérêt pharmaceutique, y compris des séquences synthétiques ou toute combinaison entre une région "pré" et une région "pro"

permettant la sécrétion desdites protéines hybrides à fonction thérapeutique.

La jonction entre ladite séquence d'exportation et la séquence 1 0 correspondant à la protéine hybride que l'on souhaite faire sécréter sous forme mature correspondra au site de coupure reconnu par une endoprotéase de levure, par exemple une paire d'acides aminés basiques du type Lys2Arg'1 ou Arg'2-Arg'1 correspondant au site de reconnaissance de la protéase codée par le gène KEX2 de S. cerevisiae ou le gène KEX1 de K. lactis (Chen X.J. et al., J. Basic

1 5 Microbiol. 28 (1988) 211-220; Wésolowski-Louvel M. et aI., Yeast 4 (1988) 71-81).

De fait, le produit du gène KEX2 de S. cerevisiae coupe la pro-séquence normale

de l'albumine in vitro mais ne coupe pas la séquence correspondante de la pro-

albumine "Christchurch" dans laquelle la paire d'acides aminés basiques a été

muté en Arg'2-Glu'1 (Bathurst I.C. et al., Science 235 (1987) 348-350).

2 0 En plus de la cassette d'expression, un ou plusieurs marqueurs permettant de sélectionner l'hôte transformé seront additionnées, par exemple le gène URA3 de levure, ou des gènes conférant aux cellules hôtes la résistance à des antibiotiques comme la généticine (G418) ou à tout autre composé toxique comme certains ions métalliques. Ces gènes de résistance seront 2 5 éventuelement placés sous le contrôle de signaux appropriés permettant leur

expression dans les hôtes considérés.

L'ensemble constitué par la cassette d'expression et par le marqueur de sélection peut être utilisé soit pour transformer directement les levures considérées, soit pour être inséré dans un réplicon extrachromosomique 3 0 fonctionnel chez les levures hôtes. Dans le premier cas, des séquences homologues à des régions présentes dans le génôme des cellules hôtes seront préférentiellement additionnées à cet ensemble; lesdites séquences seront alors positionnées de chaque côté de la cassette d'expression et du gène de sélection de façon à augmenter la fréquence d'intégration de l'ensemble dans le génôme des 3 5 levures hôtes. Dans lé cas ou la cassette d'expression est insérée dans un

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système réplicatif, un système de réplication préféré pour les levures du genre Kluyveromyces sera dérivé du plasmide pKD1 initialement isolé de K. drosophilarum un système préféré de réplication pour les levures du genre Saccharomyces sera dérivé du plasmide 2 g de S. cerevisiae. Le plasmide d'expression pourra contenir tout ou partie desdits systèmes de réplication ou pourra combiner des éléments dérivés du plasmide pKD1 aussi bien que du

plasmide 2 g.

Lorsque l'expression dans les levures du genre Kluyveromyces est recherchée, les constructions préférées sont celles qui contiennent la séquence 1 0 entière du plasmide pKD1. Plus particulièrement, les constructions préférées sont celles o le site d'insertion des séquences étrangères dans pKD1 est localisé dans une région de 197 pb située entre le site SacI (SstI) et MstII du plasmide pKDI ou encore dans le site SphI de- ce plasmide, permettant une très bonne

stabilité desdits systèmes réplicatifs dans lesdites cellules hôtes.

I 5 Les plasmides d'expression peuvent être des vecteurs navettes entre un hôte bactérien tel que Escherichia coli et les levur.es; une origine de réplication et un marqueur de sélection fonctionnant dans l'hôte bactérien sont alors requises. Il est également possible de positionner des sites de restriction entourant les séquences bactériennes et uniques sur le vecteur d'expression: 2 0 ceci permet de supprimer ces séquences par coupure et religature in vitro du vecteur tronqué avant transformation des cellules de levure, ce qui peut résulter en une augmentation du nombre de copies et en une stabilité accrue des plasmides d'expression dans lesdites levures hôtes; par exemple, de tels sites

de restriction peuvent correspondre aux séquences telles que 5'-

GGCCNNNNNGGCC-3' (SfiI) ou 5'-GCGGCCGC-3' (NotI) dans la mesure o ces sites sont extrêmement rares et généralement absents d'un vecteur d'expression. Après construction de tels vecteurs d'expression, ceux-ci sont introduits dans les levures retenues selon les techniques classiques décrites dans la 3 0 littérature. Après sélection des cellules transformées, les.cellules exprimant lesdites protéines hybrides à fonction thérapeutique sont inoculées dans un milieu sélectif approprié puis testées pour leur capacité à sécréter les protéines attendues dans le milieu extracellulaire. La récupération desdites protéines hybrides peut être faite, soit au cours de la croissance cellulaire pour les 3 5 procédés "en continu", soit en fin de croissance pour les cultures "en lots" -14 - ("batch"). Les protéines hybrides qui sont l'objet de la présente invention sont ensuite purifiées à partir du surnageant de culture en vue de leur

caractérisation moléculaire et de leur activité pharmacologique.

La présente invention concerne également l'application à titre de médicament des macromolécules hybrides selon la présente invention, notamment dans le traitement et la prévention du SIDA, ainsi que les cellules transformées, transfectées ou infectées par des vecteurs exprimant lesdites

macromolécules hybrides.

Les exemples ci-après ainsi que les Figures annexées permettront de 1 0 mettre en évidence d'autres avantages et caractéristiques de la présente invention.

LISTE DES FIGURES

1 5 Les représentations des plasmides indiquées dans les Figures suivantes ne sont pas traçées à l'échelle et seuls les sites de restriction importants pour la

compréhension des clonages réalisés ont été indiqués.

Figure 1: Séquence nucléotidique des oligodéoxynucléotides utilisés pour générer les sites de restrictions MstII et HindIII-SmaI 2 0 respectivement en amont et en aval des domaines V1V2 de

la molécule CD4.

Figure 2 Séquence nucléotidique du fragment de restriction MstII-

SmaI incluant les domaines V1 et V2 du récepteur CD4 du virus HIV-I. Les séquences nucléotidiques des sites de

2 5 restriction MstII, HindIIH et SmaI sont soulignées.

Figure 3 Construction du plasmide pXL869 codant pour la prépro-

SAH.

Figure 4 Construction des plasmides pYG208 et pYG210.

Figure 5 Construction du plasmide pYG1.

3 0 Figure 6 Construction du plasmide pYG18.

Figure 7 Carte de restriction du plasmide pYG303.

Figure 8 Séquence nucléotidique du fragment de restriction HindIII codant pour la fusion protéique prépro-SAH-VIV2. Les flèches noires indiquent la fin des régions "pré" et "pro" de

3 5 la SAH. Le site de restriction MstII est souligné.

- 15 -

Figure 9: Carte de restriction du plasmide pYG306.

Figure 10: Construction du plasmide pUC-URA3.

Figure 11: Construction du plasmide pCXJ1.

Figure 12: Construction du plasmide pkl-PS1535-6.

Figure 13: Construction des plasmides pUC-kanl et pUC-kan202.

Figure 14: Construction du plasmide pKan707.

Figure 15: Courbe de stabilité du plasmide pKan707 dans la souche

MW98-8C en conditions non-sélectives de croissance.

Figure 16: Construction du plasmide pYG308B.

1 0 Figure 17: Construction du plasmide pYG221B.

Figure 18: Caractérisation du matériel sécrété après 4 jours de culture par la souche MW98-8C transformée par les

plasmides pYG221B (prépro-SAH) et pYG308B (prépro-

SAH-V1V2).

1 5 A, coloration au bleu de coomassie après migration électrophorétique en gel d'acrylamide à 8,5%; standard de poids moléculaire (piste 1); surnageant équivalent à 300 gl de la culture transformée par le plasmide pYG308B (piste 2); surnageant équivalent à 100 gl de la culture transformée 2 0 par le plasmide pYG221B (piste 3); 500 ng de SAH humaine

(piste 4).

B, caractérisation immunologique du matériel sécrété après migration électrophorétique en gel d'acrylamide à 8,5%, transfert sur membrane de nitrocellulose et utilisation 2 5 d'anticorps primaires dirigés contre l'albumine humaine: 250 ng d' un standard d'albumine humaine (piste 1); surnageant équivalent à 100 pl de culture transformée par le plasmide pYG308B (piste 2); surnageant équivalent à 10

gl de culture transformée par pYG221B (piste 3).

3 0 C, même légende que pour le panneau B à 'exception que des anticorps polyclonaux dirigés contre la molécule CD4 humaine ont été utilisés à la place des anticorps dirigés

contre l'albumine humaine.

Figure 19: Courbe de titration de la protéine SAH-V1V2 (1 gg/ml) par 3 5 l'anticorps de souris Leu3A (Becton Dickinson, Mountain

- 16 -

View, Californie, U.S.A.) (panneau A), l'anticorps de souris OKT4A (Ortho Diagnostic Systems, Raritan, New Jersey,

USA) (panneau B), ou un sérum polyclonal de chèvre anti-

SAH couplé à la péroxydase (Nordic, Tilburg, Pays-Bas) (panneau C). Quand les anticorps Leu3A et OKT4A sont utilisés, un anticorps secondaire de lapin couplé à la péroxydase (Nordic) et dirigé contre les anticorps de souris est ensuite utilisé. Les courbes de titration par les trois anticorps primaires utilisés dans les expériences des I O panneaux A, B, et C sont déterminées par mesure de la densité optique à 405 nm après utilisation d'un substrat chromatogène de la péroxydase (ABTS, Fluka, Suisse:. En ordonné: DO à 405 nm, en abcisse: facteur de dilution le

l'anticorps primaire utilisé.

i 5 Figure 20: Courbe de dosage de la protéine SAH-V1V2 par la métho'? sandwich ELISA: anti-SAH polyclonal de lapin (Sigma) / SAH-V1V2 / anticorps de souris Leu3A (Becton Dickinson) (panneau A), ou anti-SAH polyclonal de lapin (Sigma) /' SAH-V1V2 / anticorps de souris OKT4A (Ortho Diagnostic 2 O Systems) (panneau B). Après incubation de ces différents anticorps et de la protéine SAH-V1V2, un anticorps secondaire de lapin couplé à la péroxydase (Nordic) et dirigé contre les anticorps de souris est ensuite ajouté. Les courbes de titration sont déterminées par mesure de la densité optique à 405 nm après utilisation d'ABTS. En ordonné: DO à 405 nm, en abcisse: concentration de la

protéine SAH-V1V2 en gg/ml.

Figure 21: Inhibition en phase soluble de la fixation à CD4 de 125 femtomoles de gpl60 recombinante purifiée à partir de 3 0 cellules CHO. La densité optique à 492 nm est représentée en ordonnée (la valeur 2 est la densité optique de saturation du système) et les quantités de SAH (contrôl61e), de SAH-CD4 et de CD4 soluble sont reportées en abcisse et

exprimées en picomoles de protéine.

- 17 - 2650598'

- 17 - tu8 Figure 22: Inhibition de la fixation du virus HIV-1 inactivé sur la

lignée cellulaire CEM13.

A, résultats bruts de l'analyse des populations cellulaires triées en fonction de leur fluorescence; le nombre de cellules est représenté en ordonnée et l'intensité de la fluorescence est reportée en abcisse sur une échelle logarithmique. B, histogramme des populations cellulaires triées en fonction de leur intensité de fluorescence: colonne 1, 1 0 contrôle négatif; colonne 2, (virus HIV-1); colonne 3, virus HIV-1 préincubé avec 116 picomoles de CD4 complète recombinante; colonne 4, virus HIV-1 préincubé avec 116 picomoles de SAH-V1V2; colonne 5, virus HIV-1 préincubé

avec 116 picomoles de SAH.

EXEMPLES

TECHNIQUES GENERALES DE CLONAGE.

2 O Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragnients d'ADN. par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénolchloroforme, 2 5 la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli etc... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature (Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel FoM. et al. (eds), "Current Protocols in

3 0 Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987).

Les enzymes de restriction ont été fournies par New England- Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) ou Amersham et sont utilisées

selon les recommandations des fournisseurs.

Les plasmides pBR322, pUC8, pUCI9 et les phages M13mp8 et M13mpl8

3 5 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories).

- 18 -

Pour les ligatures, les fragments d'ADN sont séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose (généralement 0,8%) ou d'acrylamide (généralement 10%), extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur. Le remplissage des extrémités 5' proéminentes est effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon 1 0 les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5'

proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1.

La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques est effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. (Nucleic Acids Res.

13 (1985) 8749-8764) en utilisant le kit distribué par Amersham.

1 5 L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR (Polymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et. Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350) est effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon

les spécifications du fab, icant.

La vérification des séquences nucléotidiques est effectuée par la méthode développée par Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 54635467) en

utilisant le kit distribué par Amersham.

Les transformations de K. lactis avec de l'ADN étranger ainsi que les

purifications d'ADN plasmidiques de K. lactis sont décrites dans le texte.

2 5 Sauf indication contraire, les souches bactériennes utilisées sont E. coli MC1060 (lacIPOZYA, X74, galU, galK, strA7, ou E. coli TGI (lac proA, B, supE,

thi, hsdD5 / F'traD36, proA+B+, lacIq, lacZ, M15).

Les souches de levures utilisées appartiennent aux levures

bourgeonnantes et plus particulièrement aux levures du genre Kluyveromyces.

3 0 Des exemples -de ces levures sont donnés dans le texte. La souche K. lactis MW98-8C (, uraA, arg, lys K+, pKD1 ) a été particulièrement utilisée; un échantillon de cette souche a été déposé le 16 Septembre 1988 au Centraalbureau voor Schimmelkulturen (CBS) à Baarn (Pays Bas) o il a été enregistré sous le

numéro CBS 579.88.

-19- 2650598

EXEMPLE 1: CONSTRUCTION D'UN FRAGMENT DE RESTRICTION

MSTII/HINDIII-SMAI INCLUANT LES DOMAINES V1V2 DU RECEPTEUR

DU VIRUS HIV-1.

Un fragment de restriction MstII-SmaI correspondant aux domaines

V1V2 (ou V1 et V2 désignent les deux premiers domaines variables N-

terminaux de la molécule CD4) a été généré par la technique d'amplification enzymatique PCR selon la stratégie suivante: la lignée lymphoblastique CEM13, qui exprime des taux importants du récepteur CD4,; a été utilisée comme source 1 0 d'ARN messagers codant pour ce récepteur. Les ARN totaux ont d'abord été purifiés à partir de 3 x 108 cellules de cette lignée cellulaire en utilisant la technique d'extraction au thiocyanate de guanidium initialement décrite par Cathala et al. (DNA 4 (1983) 329-335); 50 gg des ARN ainsi préparés ont ensuite servi de matrice à la synthèse d'ADN complémentaires (ADNc) en utilisant le 1 5 kit distribué par Amersham et comme amorce l'oligodéoxynucléotide Xo127 (Figure 1). La solution résultante d'ADNc. a ensuite subi,. 30: cycles d'amplification enzymatique à une température d'hybridation de 62 C par la technique PCR, en utilisant comme amorce 1 Fg de chacun' des oligodéoxynucléotides Xol26 et Xol27 représentés à la Figure 1. Le fragment amplifié a été directement cloné dans le site SmaI du vecteur M13mp8 déphosphorylé pour générer le vecteur M13/CD4. Ce vecteur est une construction intermédiaire qui contient un fragment de restriction MstIISmaI qui est lui-même la source d'un fragment de restriction MstIIHindIII incluant les domaines V1V2 de la molécule CD4, fragment dont la séquence

2 5 nucléotidique est donnée à la Figure'2.

EXEMPLE 2: CONSTRUCTION DE LA CASSETTE D'EXPRESSION DE LA

PREPRO-SAH.

3 0 E.2.1. Construction du plasmide pXL869 codant pour la prépro-SAH.

Le site Ndel du plasmide pXL322 (Latta M. et aI., Bio/Technology 5 (1987) 1309-1314) incluant le codon ATG initiateur de la traduction de la préproSAH a été changé en un site HindIII par mutagénèse dirigée selon la stratégie suivante: le fragment HindIII-BgIII de pXL322 contenant l'extrémité 5' du- gène de la 3 5 prépro-SAH a été cloné dans le vecteur M13mpl8 et mutagénisé avec

- 20 -

l'oligodéoxynucléotide 5'-ATCTAAGGAAATACAAGCTTATGAAGTGGGT-3' (les séquences soulignées et en caractère gras représentent respectivement le site HindIII et le site de démarrage de la traduction de la prépro-SAH); le réplicon phagique obtenu après cette étape de mutagénèse est le plasmide pXL855 dont une carte de restriction est représentée à la Figure 3. Après vérification de la séquence nucléotidique, la séquence codant pour la prépro-SAH complète a été reconstituée en ligaturant le fragment HindIII-PvuII provenant de la forme réplicative du phage mutagénisé et codant pour la partie N-terminale de la prépro-SAH avec le fragment PvuIIHindIII du plasmide pXL322 contenant l'extrémité C-terminale de la SAH, générant ainsi un fragment HindIII codant pour l' intégralité de la prépro-SAH. Ce fragment HindIII, qui contient le gène structural de la prépro-SAH complet ainsi qu'une région de 61 pb non-traduite à son extrémité 3', a été cloné dans le site correspondant du plasmide pUC8 pour

générer le plasmide pXL869 (Figure 3).

E2.2. Construction de cassettes d'expression de la prépro-SAH exprimée

sous contrôle du promoteur 1GK de S. cerevisiae.

Le plasmide pYG12 contient un fragment de restriction SalI-BamI-H d'une taille de 1,9 kb constitué des régions promot ices (1,5 kb) et terminatrices (0,4 kb) du gène PGK de S. cerevisiae (Figure 4). Ce fragment provient d'un fragment génomique Hindl (Mellor J. et al., Gene 24 (1983) 1-14) délété d'un fragment de 1,2 kb comprenant une région comprise entre l'ATG d'initiation de la traduction du gène PGK et le site gIII localisé 30 codons en amont du codon TAA spécifiant la fin de traduction. Les sites HindI!I encadrant le fragment de 2 5 1,9 kb ainsi obtenu ont été détruits et remplacés à l'aide d'oligodéoxynucléotides synthétiques par un site SalI et un site BamHI localisés respectivement en amont de la région promotrice et en aval du terminateur de transcription du gène PGK. Un site HindIII unique a été ensuite introduit à la jonction entre régions promotrices et terminatrices par mutagénèse dirigée; la séquence 3 0 nucléotidique encadrant ce site de restriction HindIII (représenté en caractères gras) est la suivante:

'-TAAAAACAAAAGATCCCCAAGCTTGGGGATCTCCCATGTCTCTACT-3'

pYG208 est une construction intermédiaire générée par insertion de l'adaptateur synthétique BamHI/SalI/BamHI (5'-GATCCGTCGACG-3') dans le 3 5 site BamHI unique du plasmide pYG12; le plasmide pYG208 permet donc de

--21- 2650598

disposer du promoteur et du terminateur du gène PGK de S. cerevisiae sous la

forme d'un fragment de restriction SalI (Figure 4).

Le fragment HindIII codant pour la prépro-SAH a été purifié par électroélution à partir du plasmide pXL869 et cloné dans la "bonne orientation" (définie comme l'orientation qui place la région "prépro" de l'albumine de façon proximale par rapport au promoteur PGK de S. cerevisiae) dans le site HindIII du plasmide pYG208 pour générer le plasmide pYG210; comme il est indiqué à la Figure 4, le plasmide pYG210 est la source d'un fragment de restriction SalI correspondant à la cassette d'expression (promoteur PGK /

1 0 prépro-SAH / terminateur PGK).

EXEMPLE 3: FUSION EN PHASE TRADUCTIONNELLE DE LA PREPRO-SAH

AVEC LES DOMAINES V1V2 DU RECEPTEUR CD4.

1 5 La stratégie de clonage utilisée pour la construction en phase de la molécule hybride prépro-SAH-V1V2 est illustrée par les Figures 5 à 9..- Le plasmide pYGli est une construction intermédiaire dans lequel le fragment de restriction HindEM codant pour la prépro-SAH a été purifié à partir du plasmide pXL869 et cloné dans le site HindIII du plasmire pYG12 (Figure 5). La 2 0 construction du plasmide pYG18 est représentée à la Figure 6; ce plasmide correspond au fragment SalI-BamHI codant pour la cassette d'expression (promoteur PGK / prépro-SAH / terminateur PGK) purifié à partir du plasmide pYGlI et cloné dans les sites correspondants du plasmide pIC20R (Marsh F: et

al., Gene 32 (1984) 481-485).

Le fragment de restriction MstII-SmaI incluant les domaines V1V2 du récepteur CD4, obtenu selon l'exemple 1, a été cloné dans le vecteur pYG18 coupé par les mêmes sites de restriction pour doriner le plasmide recombinant pYG303 dont une carte de restriction est donnée à la Figure 7. Le. plasmide pYG303 permet donc de disposer d'un fragment de restriction HindIII 3 0 correspondant à la fusion en phase traductionnelle de la prépro-SAH entière suivie des domaines V1V2 dé la molécule CD4; la séquence nucléotidique de ce fragment de restriction est donnée à la Figure 8. Ce fragment de restriction est ensuite cloné dans le site HindIII du plasmide pYG208: l'insertion "dans la bonne orientation" du fragment HindHI codant pour le gène prépro-SAH-VlV2 3 5 dans le plasmide pYG208 génère le plasmide pYG306 dont une carte de

-22- 2650598

restriction est donnée à la Figure 9. Le plasmide pYG306 permet de disposer d'un fragment de restriction SalI contenant la cassette d'expression (promoteur

PGK / prépro-SAH-V1V2 / terminateur PGK).

EXEMPLE 4: CONSTRUCTION DE VECTEURS DE CLONAGE STABLES

DERIVES DU REPLICON pKD1.

E.4.1. Isolement et purification du plasmide pKD1.

Le plasmide pKD1 est purifié à partir de la souche de K. drosophilarum 1 0 UCD 51-130 (collection U.C.D., Université de Californie, Davies, CA 95616) selon le protocole suivant: une culture de 1 litre en milieu YPD (extrait de levure 1%, Bacto-peptone (Difco) 2%, glucose 2%) est centrifugée, lavée et resuspendue dans une solution 1,2 M de sorbitol, et les cellules sont converties en sphéroplastes en présence de zymolyase (300 gg/ml), d'EDTA 25 mM, de phosphate 50 mM et de t-mercaptoéthanol (1 gg/ml). Après lavage dans une solution 1,2 M de sorbitol, les sphéroplastes correspondant à 250 ml de la culture de départ sont - resuspendus dans 2,5 ml de sorbitol 1,2 M auxquels on ajoute le même volume de tampon (Tris-HCl 25 mM, pH 8,0; glucose 50.mM; EDTA 10 mM). Les étapes suivantes correspondent au protocol L de lyse alcaline 2 0 déjà décrit (Birnboim H.C. et Doly J.C., Nucleic Acids Res. 7 (1979) 1513-1523) et

l'ADN est purifié par centrifugation isopycnique en gradient de CsCl.

E.4.2. Construction du plasmide pCXJ1.

L'intermédiaire de construction pUC-UIRA3 (Figure 10) consiste en un 2 5 fragment de 1,1 kb contenant le gène URA3 de la levure S. cerevisiae inséré dans le site unique NarI du plasmide pUC19 comme suit: le fragment HindIII codant pour le gène URA3 a été purifié à partir du plasmide pG63 (Gerbaud C. et al., Curr. Genet. 3 (1981) 173-180) digéré par HindilI; ce fragment a été traité par le fragment Klenow de l'ADN polymérase I d'E. coli pour générer des 3 0 extrémités franches, purifié par électroélution et inséré dans'le plasmide pUC19 lui-même coupé par NarI et traité par le fragment de Klenow de l'ADN

polymérase I d'E. coli.

* Le plasmide pCXJ1 (Figure 11) contient la séquence complète du plasmide pKD1 inséré dans le site unique AatII de pUC-URA3 comme suit: le plasmide 3 5 pKD1 a été linéarisé par coupure au site EcoRI puis traité par le fragment

- 23 - 2650598'

Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli pour générer des extrémités franches; ce fragment d'ADN a été ensuite ligaturé avec le plasmide pUCURA3 coupé par AatII et traité par 1'ADN polymérase du phage T4 pour générer des extrémités franches: le clonage du fragment EcoRI à extrémités franches dans le site AatII ainsi traité permet la reconstitution de deux sites EcoRI. Un point important est que la linéarisation du plasmide pKD1 au site EcoRI n'inactive aucun des gènes nécessaires pour maintenir la stabilité et le nombre de copies de ce plasmide chez les levures dans lesquelles il est réplicatif, en particulier du fait que le site EcoRI est situé en dehors des gènes A_, et C, ainsi qu'en dehors 1 0 des séquences répétées inversées (SRI) du réplicon pKD1; de fait, le plasmide pCXJ1 transforme les cellules de K. lactis uraA cir à haute fréquence, est amplifié à environ 70-100 copies par cellule et est maintenu de façon remarquablement stable en l'absence de pression de sélection. Grâce à l'origine de réplication apportée par le plasmide pUC-URA3, le plasmidepCXJ1 peut 1 5 également se répliquer dans E. coli et constitue donc un plasmide navette particulièrement-utile entre E. coli et plusieurs espèces- de levures' du genre

Kluvveromyces, en particulier K. lactis K. fragilis et K. drosophilarum.

L'utilisation du plasmide pCXJ1 en tant que vecteur pour la transformation des levures du genre Kluvveromyces reste néanmoins limitée aux Fouches

2 0 auxotrophes portant la mutation uraA chromosomique.

E.4.3. Construction en phase traductionnelle entre l'ORF1 du plasmide "killer" de K. lactis et le produit du gène bactérien aph[3']-I du transposon Tn903. 2 5 Le plasmide pKan707 a été construit afin de disposer d'un vecteur de clonage utilisable dans des souches sauvages de levures; -ce plasmide a été généré par insertion du gène aph[3']-I du transposon bactérien Tn903 codant pour la 3'-aminoglycoside phosphotransférase (APH), exprimé sous contrôle

d'un promoteur de levure, dans le site SalI du plasmide pCXJ1.

3 0 Dans une première étape, les signaux de transcription bactériens du gène ph[3']-I ont été remplacés par le promoteur Pkl isolé à partir du plasmide "killer" (kl) de K. lactis selon les étapes suivantes: le fragment ScaI-PstI de 1,5 kb provenant du plasmide kl a été cloné dans les sites correspondants du vecteur pBR322, ce qui génère le plasmide pklPS1535-6 (Figure 12); ce fragment 3 5 de 1,5 kb contient la moitié 5' de la première phase ouverte de lecture (ORF1)

- - 24 - 650598

-24- 2650598

portée par le plasmide kl et environ 220 pb de séquences en amont (Sor F. et Fukuhara H., Curr. Genet. 9_ (1985) 147-155); le fragment ScaI-PstI purifié contient donc vraisemblablement la région promoteur entière de ORF1 car le site ScaI est localisé à seulement 22 nucléotides de l'extrémité du plasmide kl (Sor F. et al., Nucl. Acids. Res. 11 (1983) 5037-5044). La digestion de pkl-PS1535-6 par DdeI génère un fragment de 266 pb contenant 17 pb provenant de pBR322 à

l'extrémité proche de ScaI et les 11 premiers codons de ORF1 à l'autre extrémité.

Le plasmide pUC-kanl est une construction intermédiaire obtenue en insérant un fragment EcoRI de 1,25 kb contenant le gène aph[3']-I de Tn903 1 0 (Kanamycin Resistance Gene Block TM, Pharmacia) dans le site EcoRI du plasmide pUC19 (Figure 13). Le fragment DdeI de 266 pb provenant du plasmide pkl-PS1535-6 a été traité par le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I d'E. coli, purifié par électroélution en gel d'acrylamide puis inséré dans le site XhoI du plasmide pUC-kanl traité par la nucléase S1 pour générer

l 5 des extrémités franches, ce qui génère le plasmide pUC-kan202 (Figure 13).

Cette stratégie de clonage permet d'obtenir une fusion en phase traductionnelle du gène ORF1 du plasmide kl avec l'extrémité N-terminale du gène aph[3'1-I de Tn903: dans cette fusion, les onze premiers acides aminés du produit du gène aph[3']-I ont été remplacés par les onze premiers acides aminés de ORF1, et 2 0 l'expression de ce gène hybride est sous le contrôle du promoteur d'un gène K. lactis. La séquence nucléotidique qui encadre le codon initiateur de la traduction de la fusion protéique ORF1-APH est la suivante (les.codons provenant de ORF1 sont soulignés, alors que les premiers acides aminés provenant de!'APH sont en italique):

2 5 5'-TTACATTATTAATTTAAAA ATG GAT TTC AAA GAT AAG

GCT TTA AAT GAT CTA AGG CCG CGA TTA AAT TCC AAC...- 3'

E.4.4. Construction et stabilité du plasmide pKan707 chez K. lactis.

Le plasmide pCXJ1 a été coupé par HindlII, traité par le fragment de

3 0 Klenow de 1'ADN polymérase I d'E. coli, puis ligaturé avec le fragment ScaI-

HincII de 1.2 kb codant pour la fusion ORF1-APH exprimée sous contrôle du promoteur Pkl de K. lactis et provenant du plasmide pUC-Kan202. Le plasmide résultant pKan707 (Figure 14) confère la résistance à de très hauts niveaux de G418 (Geneticin, GIBCO, Grand Island, N.Y.) dans les souches de K. lactis (> 2,5 3 5 g/l), est transformable dans les souches de K. lactis cir du fait de l'intégralité

-25- 2650598

fonctionnelle du réplicon pKD1, peut être amplifié à 70-100 copies par cellule et peut être maintenu de façon stable en l'absence de pression de sélection (Figure ). Sa grande stabilité conjuguée avec la présence d'un marqueur dominant efficace permettant la transformation de souches industrielles de Kluyveromyces font de pKan707 un vecteur de dclonage très performant pour

l'expression des protéines dans les levures du genre Kluyveromyces..

EXEMPLE 5: CONSTRUCTION DES PLASMIDES D'EXPRESSION pYG221B

(PREPRO-SAH) ET pYG308B (PREPRO-SAH-V1V2).

Le fragment de restriction SalI codant pour la protéine hybride prépro-

SAH-V1V2 exprimée sous contrôle du promoteur PGK de S. cerevisiae est purifié par électroélution à partir du plasmide pYG306 coupé par l'enzyme correspondante; ce fragment de restriction est cloné dans le site de restriction I 5 SalI du plasmide pKan707, ce qui génère les plasmides pYG308A et pYG308B qui ne se distinguent entre eux que par l'orientation du fragment SalI. par rapport au vecteur pKan70O7. Une carte de restriction du plasmide pYG308B est donnée

à la Figure 16.

Le plasmide pYG221B est une construction témoin codant pour la seule 2 0 prépro-SAH; ce plasmide est construit de façon analogue au plasmide pYG308B (prépro-SAH-V1V2): le fragment de restriction SalI codant pour la prépro-SAH exprimée sous contrôle du promoteur PGK est purifié à partir du plasmide pYG210 et cloné dans le site SalI du plasmide pKan707 pour générer le plasmide pYG221B (Figure 17). Les plasmides pYG221B (préproSAH) et pYG308B 2 5 (prépro-SAH-V1V2) possèdent la même orientation relative des cassettes d'expression SalI par rapport au vecteur et sont strictement isogéniques à la différence du fragment de restriction MstIIHindIII localisé immédiatement en amont du terminateur de transcription du gène PGK de S. cerevisiae. La séquence nucléotidique de ce fragmenit de restriction MstII-HindIII contenu 3 0 dans le plasmide pYG221B (préproSAH) est la suivante (le codon spécifiant la fin de traduction du gène codant pour la prépro-SAH est représenté en caractères gras):

'-CCTTAGGCTTATAACATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTA

CCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAAAAGCTT-3'

- 26 - 2650598

La séquence nudéotidique du fragment MstTT-HindTI' contenu dans le plasmide pYG308B est incluse dans la séquence du fragment MstII-SmaI donnée à la

Figure 2.

EXEMPLE 6: TRANSFORMATION DE LA SOUCHE MW98-8C DE IK LACTIS.

La transformation des levures appartenant au genre Kluyveromvces, et en particulier la souche MW98-8C de K. lactis s'effectue par la technique de traitement des cellules entières par de l'acétate de lithium (Ito H. et al., J. 1 0 Bacteriol. 153 (1983) 163-168), adaptée comme suit. La croissance des cellules se fait à 28 C dans 50 ml de milieu YPD, avec agitation et jusqu'à une densité optique à 600 nm (DO600) comprise entre 0,6 et 0,8; les cellules sont récoltées par centrifugation à faible vitesse, lavées dans une solution stérile de TE (10 mM Tris HCl pH 7,4; I mM EDTA), resuspendues dans 3-4 ml d'acétate lithium (0,1 1 5 M dans du TE) pour obtenir une densité cellulaire d'environ 2 x 108 cellules/ml, puis incubées à 30 C pendant I heure sous agitation modérée. Des aliquotes de 0,1 ml de la suspension résultante de cellules compétentes sont incubés à 30 C pendant 1 heure en présence d'ADN et à une concentration finale de 35% de polyéthylène glycol (PEG4000, Sigma). Après un choc 2 0 thermique de 5 minutes à 42 C, les cellules sont lavées 2 fois, resuspendues dans 0,2 mi d'eau stérile et incubées 16 heures à 28 C dans 2 ml de milieu YPD pour permettre l'expression phénotypique de la fusion ORF1-APH exprimée sous contrôle du promoteur Pkl; 200 l de la suspension cellulaire sont ensuite étalés sur boites YPD sélectives (G418, 200 gg/ml). Les boites sont rmises à 2 5 incuber à 28 C et les transformants apparaissent après 2 à 3 jours de croissance cellulaire.

EXEMPLE 7: SECRETION DE L'ALBUMINE ET DE SES VARIANTS PAR LES

LEVURES DU GENRE KLUYVEROMYCES.

Après sélection sur milieu riche supplémenté en G418 les clones recombinants sont testés pour leur capacité à sécréter la forme mature de l'albumine ou la protéine hybride SAH-V1V2. Quelques clones correspondant à la souche MW98-8C transformée par les plasmides pYG221B (prépro-SAH) ou 3 5 pYG308B (prépro-SAH-VIV2) sont mis à incuber en milieu liquide complet

- 27 - 2650598

-2'7 -

sélectif à 28 C. Les surnageants cellulaires sont récupérés par centrifugation quand les cellules atteignent la phase stationnaire de croissance, concentrés 10 fois par précipitation pendant 30 minutes à 20 C dans une concentration finale de 60% d'éthanol, puis testés après électrophorèse en gel d'acrylamide à 8.5%, soit directement par coloration du gel d'acrylamide par du bleu de coomassie (Figure 18, panneau A), soit après immunoblot en utilisant comme anticorps primaires des anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre l'albumine humaine (Figure 18, panneau B) ou un sérum polyclonal de lapin dirigé contre la molécule CD4 humaine entière (Figure 18, panneau C). Lors des expériences 1 0 de détection immunologique, le filtre de nitrocellulose est d'abord incubé en présence de l'anticorps spécifique de lapin, lavé plusieurs fois, incubé en présence d'anticorps de chèvre anti-lapin biotinylés, puis incubé en présence d'un complexe avidine-péroxydase en utilisant le "kit ABC" distribué par Vectastain (Biosys S.A., Compiègne, France). La réaction immunologique est 1 5 ensuite révélée par addition de diamino-3, 3' benzidine tetrachlorydrate (Prolabo) en présence d'eau oxygénée, selon les recommandations du kit.. Les résultats de la Figure 18 démontrent que la protéine hybride SAH-V1V2 est reconnue à la fois par des anticorps dirigés contre l'albumine humaine et la molécule CD4, alors que la SAH n'est reconnue que par des anticorps dirigés

2 0 contre l'albumine.

EXEMPLE 8: PURIFICATION ET CARACTERISATION MOLECULAIRE DES

PRODUITS SECRETES.

Après précipitation éthanolique du surnageant de culture correspondant à la souche K. lactis transformée par les plasmides pYG221B (prépro-SAH) et pYG308B (prépro-SAH-V1V2), le culot est resolubilisé dans un tampon TrisHCl mM pH 8.0; les protéines SAH-CD4 et SAH sont purifiées par chromatographie d'affinité sur Bleu-Trisacryl (IBF). Une purification 3 0 supplémentaire par chromatographie d'échange d'ions peut être effectuée si nécessaire. Après élution, les fractions contenant les protéines sont réunies, dialysées contre de l'eau et lyophilisées avant caractérisation: le séquençage (Applied Biosystemn) de la protéine hybride sécrétée par la souche MW98-8C de

K. lactis indique la séquence N-terminale attendue de l'albumine (Asp-Ala-

3 5 His...), démontrant une maturation correcte de Iadite protéine.

- 28 -

Le point isoélectrique de la protéine SAH-VlV2 a été déterminé par la technique d'isoélectrofocalisation et donne une valeur égale à 5,5. Le point isoélectrique de la SAH a également été déterminé par cette technique et donne

une valeur égale à 4,8.

La protéine SAH-V1V2 est reconnue par les anticorps de souris monoclonaux OKT4A et Leu3A dirigés contre la molécule CD4 humaine, ainsi que par des anticorps polyclonaux anti-SAH (Figure 19), et peut être dosée par la méthode ELISA (Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay, Figure 20). Le

substrat de la péroxydase utilisé dans ces deux expériences est le 2-2'Azino-

1 0 bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) Diammonium salt (ABTS) (Fluka, Suisse).

EXEMPLE 9: CARACTERISATION ANTI-VIRALE DES VARIANTS SAH-CD4.

1 5 Les protéines correspondant à l'albumine (témoin négatif) et à la fusion SAH-V1V2 purifiées à partir des surnageants de culture de la souche MW98-8C

de K. lactis transformée respectivement par les plasmides pYG22IB (prépro-

SAH) et pYG308B (prépro-SAH-V1V2) selon les exemples 7 et 8 sont testées in vitro pour leur activité anti-virale et comparées à la molécule de CD4 soluble

2 O complète produite et purifiée à partir de cellules CHO (Chinese Hamster Ovary).

Les quantités protéiques utilisées sont exprimées en molarité et ont été déterminées à la fois par des méthodes de dosage des protéines en solution, ainsi que par comparaison des dilutions successives de chacun des produits après migration électrophorétique en gel d'acrylamide et coloration du gel au

2 5 nitrate d'argent.

La Figure 21 démontre que la fusion SAH-V1V2 est capable d'inhiber in vitro la fixation en phase soluble de la glycoprotéine virale gpl60 (le précurseur non-clivé de la gpl20) sur le récepteur CD4. Dans cette expérience, des plaques ELISA sont recouvertes par des molécules CD4 recombinantes purifiées et 3 0 incubées avec de la gpl60 recombinante purifiée à partir de cellules CHO (125 femtomoles) et ayant été préincubée avec différentes quantités de CD4, d'albumine, ou de protéine hybride SAH-V1V2. La fixation résiduelle de la gp160 à CD4 est ensuite révélée par l'adjonction successive d'un anti-corps monoclonal de souris anti-gpl60, suivie par la fixation d'un anticorps de chèvre anti-souris marqué à la péroxydase. Après adjonction d'un substrat

29- 2650598'

chromogénique (orthophényldialénine) en présence d'eau oxygénée, la densité optique à 492 nm est mesurée. Les résultats de la Figure 21 démontrent que la protéine hybride SAH-V1V2 est capable, en phase soluble, d'inhiber la fixation de la gpl60 sur le récepteur CD4 de façon indistinguable d'un témoin positif correspondant à la molécule CD4 complète; à l'inverse, la molécule d'albumine constitue une protéine pratiquement inactive de ce point de vue. Cette seule expérience indique que l'inhibition observée pour la protéine hybride est le fait de la présence des domaines V1V2 du récepteur dans une conformation et une

accessibilité satisfaisante par rapport à la molécule CD4 complète.

1 0 La Figure 22 démontre que la fusion SAH-V1V2 est capable d'inhiber in vitro la fixation du virus HIV-1 sur des cellules exprimant le récepteur CD4 membranaire. Dans cette expérience, une lignée cellulaire exprimant fortement le récepteur CD4 (lignée lymphoblastique CEM13) est incubée avec 2 gg de particules virales inactivées par la chaleur, éventuellement préincubées avec 1 5 116 picomoles de protéine hybride SAH-V1V2 (10,7 gg), de SAH (7,5 gg), ou de CD4 recombinante complète purifiée à partir de cellules CHIO (5 'gg). La fixation sur les membranes cellulaires des particules virales inactivées est révélée par incubation successive avec un anticorps monoclonal de souris dirigé contre la gpl20 virale puis par fixation d'un anticorps de chèvre anti-souris marqué à la 2 0 phycoérythrine. Le contrôle négatif correspond à la seule lignée CEM13 incubée successivement avec ses deux anticorps. La fluorescence des cellules est ensuite mesurée à l'aide d'un analyseur de cellules (Figure 22, panneau A) et les résultats sont ensuite traités et représentés sous la forme d'histogrammes (Figure 22, panneau B). Les résultats de cette expérience démontrent que la 2 5 protéine SAH-V1V2 est capable d'inhiber la fixation des virus sur les cellules de la lignée CEM13 de façon quasiment totale. De plus, cette inhibition de fixation est légèrement plus importante que celle provoquée par la molécule CD4 entière; ce résultat s'explique par le fait que la molécule d'albumine, qui est connue pour ces propriétés adhésives, est également capable, mais dans une 3 0 bien moindre mesure, d'inhiber la fixation des particules virales sur leurs

cellules cibles.

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Claims (22)

REVENDICATIONS

1/ Macromolécule hybride caractérisée en ce qu'elle comporte le domaine actif d'un récepteur de virus ou le domaine actif d'une molécule capable de fixer ledit virus ou le domaine actif d'un récepteur de ligand intervenant dans un processus pathologique couplé avec une albumine ou un

variant de l'albumine.

2/ Macromolécule selon la revendication 1, caractérisée en ce

que le récepteur est un récepteur membranaire.

3/ Macromolécule selon l'une des revendications 1 et 2,

caractérisée en ce que la macromolécule est essentiellement protéique.

4/ Macromolécule selon l'une des revendications 1 à 3,

caractérisée en ce que le couplage est un couplage covalent.

/ Macromolécule selon la revendication 4, caractérisée en ce

1 5 que le couplage covalent est effectué par une liaison peptidique.

6/ Macromolécule selon l'une des revendications 1 à 5,

caractérisée en ce que le domaine actif du récepteur est le domaine actif d'un récepteur normalement utilisé par. un virus pour sa propagation dans l'or;anisme.

7/ Macromolécule selon l'une des revendications 1 à 5,

caractérisée en ce que le domaine actif du récepteur est le domaine actif d'un récepteur intervenant dans l'internalisation infectueuse de virions complexés à

des immunoglobulines.

8/ Macromolécule selon la revendication 7, caractérisée en ce que le domaine actif du récepteur est le domaine actif d'un récepteur du type FcyRIII. 9/ Macromolécule selon la revendication 8, caractérisée en ce

que le domaine actif du récepteur est le domaine actif du récepteur CD16.

/ Macromolécule selon l'une des revendications 1 à 5

3 0 caractérisée eh ce que le domaine actif du récepteur est le domaine actif d'un

récepteur à un facteur intervenant dans un processus d'oncogénèse.

11/ Macromolécule selon la revendication 10, caractérisée en ce que le domaine actif du récepteur est le domaine actif d'un récepteur à activité

tyrosine kinase.

- 31 -

-31 - 2650598

12/ Macromolécule selon la revendication 11, caractérisée en ce

que le domaine actif du récepteur est le domaine actif du proto-oncogène c-

erbB-2.

13/ Macromolécule selon l'une des revendications 1 à 12,

caractérisée en ce que l'albumine utilisée est d'origine humaine.

14/ Macromolécule selon l'une des revendications 1 à 6,

caractérisée en ce que le récepteur est tout ou partie de la molécule CD4 utilisée par le virus HIV-1 pour sa propagation dans l'organisme, y compris des variants artificiels dans la-région d'interaction avec le virus et présentant une

1 0 affinité moléculaire supérieure à l'affinité naturelle.

/ Macromolécule selon la revendication 14 caractérisée en ce

que le récepteur est constitué par les domaines V1 et V2 de la molécule CD4.

16/ Macromolécule selon l'une des revendications 1 à 15,

caractérisée en ce qu'elle comporte plusieurs fois le domaine actif du récepteur

1 5 ou de la molécule capable de fixer lesdits ligands.

17/ Macromolécule selon l'une des revendications 1 à 16,

caractérisée en ce que l'albumine ou le variant de l'albumine sont localisés à

l'extrémité N-terminale.

8/ Macromolécule selon la revendication 17, caractérisée en ce 2 0 qu'une fonction de dimérisation et ou de polymérisation est incorporée pour permettre une augmentation de la concentration locale du domaine actif du récepteur du virus ou du récepteur du ligand associé à un processus d'oncogénèse.

19/ Macromolécule selon l'une des revendications 1 à 18,

2 5 caractérisée en ce qu'elle est obtenue par' culture de cellules transformées,

transfectées ou infectées par un vecteur exprimant ladite macromolécule.

/ Macromolécule selon la revendication 19, caractérisée en ce

que la cellule transformée est une levure.

21/ Macromolécule selon la revendication 20, caractérisée en ce

3 0 que la levure est une souche de Kluyveromvces. -

22/ Macromolécule selon la revendication 20, caractérisée en ce que le vecteur est un vecteur d'expression dérivé du plasmide pKD1 dans lequel les gènes A, B et C ont été conservés, ainsi que l'origine de réplication et

les séquences répétées inversées.

--32 - 22650598

23/ A titre de médicament, une macromolécule selon l'une des

revendications 1 à 22.

24/ A titre de médicament selon la revendication 23, une macromolécule comportant l'albumine humaine ou un variant et le domaine V1 de CD4. / A titre de médicament selon la revendication 24, une macromolécule comportant l'albumine humaine ou un variant et les

domaines V1V2 de CD4.

26/ Cellules.transformées, transfectées ou infectées par un vecteur

exprimant une macromolécule selon l'une des revendications 1 à 18.

27/ Cellule selon la revendication 26, caractérisée en ce qu'il

s'agit d'une levure.

28/ Cellule selon la revendication 27, caractérisée en ce qu'il

s'agit de Kluyveromyces.