HU215457B - Eljárás albuminszármazékok és ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya albűmin alkalmazása stabil plazmatranszpőrterkéntegy őlyan terápiás fűnkcióval együtt, amely egy membránreceptőrbólszármazik. A jelen találmányban példaként egy új teráp ás ágenst írnakle, amelyet az AIDS kezelésében lehet alkalmazni: őlyan hibridmakrőmőlekűlák, amelyek albűminszármazékőkból és hőzzájűk kapcsőlt, aHIV–1 vírűshőz nőrmális vagy magas affinitással re delkező CD4-receptőrszármazékőkból állnak. ŕ

Description

A jelen találmány tárgya albuminszármazékok felhasználása olyan terápiás hatóanyagok készítésére, amelyeket bizonyos vírusos megbetegedések és a rák kezelésében lehet alkalmazni. Pontosabban, a jelen találmány olyan hibrid makromolekulák előállítására vonatkozik, amelyeket az jellemez, hogy egy vírusreceptor aktív doménjét tartalmazzák, vagy egy olyan molekula aktív doménjét, amely képes vírushoz kötődni, vagy egy olyan molekula aktív doménjét, amely képes felismerni egy vírushoz kötött immunglobulinok Fc-fragmensét, vagy egy olyan molekula aktív doménjét, amely képes a patológiás folyamatban szerepet játszó ligandumhoz kötődni, albuminhoz vagy egy albuminvariánshoz kötődve. Az alább következő szövegben az albuminszármazékok vagy albuminvariánsok szakkifejezések jelentése minden olyan fehérje, amely az albumin egy adott izomorfját kódoló gén génsebészeti technikák útján való módosításával (mutáció, deléció és/vagy addíció) kapott hosszú plazma-élettartamú molekula, valamint az ilyen gének által kódolt fehérjék in vitro módosításával kapott hosszú plazma-élettartamú összes makromolekula. Ezeket az albuminszármazékokat gyógyászati hatóanyagként lehet alkalmazni a vírusellenes kezelésben, mivel egy vírus vagy egy immunglobulinhoz kötött vírus nagy affinitással rendelkezik az albuminszármazékon lévő fixálóhelyhez. Alkalmazhatók gyógyászati hatóanyagként bizonyos rákmegbetegedések kezelésében egy ligandumnak, például egy növekedési faktornak az albuminszármazékon lévő fixálóhelyhez való affinitása miatt, különösen akkor, ha az ilyen ligandum egy bizonyos membránreceptorhoz kötődik, amelynek a sokszorozódása a transzformáló fenotípussal van korrelációban (protoonkogének). Nyilvánvaló, hogy az alábbi szövegben az összes funkcionálisan terápiás albumin származékot egymástól függetlenül a következő általános szakkifejezésekkel jelöljük: hibrid makromolekulák antivirális hatással, hibrid makromolekulák rákellenes hatással, vagy csak egyszerűen hibrid makromolekulák.

A jelen találmány előnyösen olyan új terápiás hatóanyagok előállítására vonatkozik, amelyek kémiai vagy génsebészeti módszerekkel legalább két eltérő funkciót kötnek össze:

(i) egy stabil plazmaszállító funkciót, amely bármely albuminvariánsra igaz, főleg a humán szérum albuminra (HSA). A HSA-t kódoló gének erősen polimorfok, több mint 30 különböző genetikai alléit írtak le [Weitkamp L. R. et al., Ann. Hűm. Génét. 37, 219-226 (1973)]. Az albuminmolekulát, amelynek térszerkezetét röntgenkrisztallográfiával határozták meg [Carter D. C. et al., Science, 244, 1195- 1198 (1989)], választottuk a stabil szállítófunkció betöltésére, mivel ez a legnagyobb mennyiségben előforduló plazmafehérje (40 g/liter emberben), hosszú a plazma-élettartama [14- 20 nap emberekben, Waldmann T. A., az „Albumin Structure, Function and Uses” című kiadvány, 255-275. oldal, szerk. Rosenoer et al„ Pergamon Press, Oxford (1977)], és mindenekelőtt azzal az előnnyel rendelkezik, hogy nincs enzimatikus funkciója, és ez lehetővé teszi, hogy nagy mennyiségben használjuk terápiás célokra;

(ii) egy vírusellenes vagy rákellenes terápiás funkciót. A vírusellenes funkció szolgál csapdaként egy vírus specifikus kötődéséhez, vagy csapdaként egy vírus-immunglobulin komplex megkötéséhez. A vírusellenes funkciót szolgáltathatja egy specifikus receptor vagy annak egy része, amelyet normális körülmények között egy vírus a saját elszaporítására alkalmaz a gazdasejtben, vagy bármely olyan molekula, amely elég nagy affinitással tudja megkötni az ilyen komplexeket ahhoz, hogy lehetséges legyen in vivő felhasználása vírusellenes szerként. A rákellenes funkció szolgál csapdaként egy ligandum, különösen az onkogén folyamatban szerepet játszó növekedési faktor megkötésében, ezt szolgáltathatja egy sejt-protoonkogén vagy annak egy része, vagy bármely olyan molekula, amely képes ezt a ligandumot elég nagy affinitással megkötni ahhoz, hogy lehetséges legyen in vivő felhasználása rákellenes szerként;

(iii) azokban az esetekben, amikor a terápiás funkció magas koncentrációjára van szükség, például mivel szinergizálja egy vírus in vivő fertózóképességének a gátlását, egy harmadik funkciót is hozzáadhatunk, amely lehetővé teszi a terápiásán aktív hibrid makromolekulák dimerizációját vagy polimerizációját, esetleg redundáns módon. Ilyen funkciót szolgáltathatunk például a „leucin zipper” motívummal [Landschulz W. H. et al„ Science, 240, 1759- 1764 (1988)], vagy olyan fehérjedoménekkel, amelyekről ismert, hogy bizonyos fehérjék homodimerizációjához szükségesek, úgymint a HÍV- 1 vírusgenomban kódolt tat gén termékének a doménje [Frankéi A. D. et al„ Science, 240, 70-73 (1988); Frankéi A. D. et al„ Proc. Natl. Acad. Sci„ USA, 85, 6297-6300 (1988)].

A jelen találmányban a plazmaszállító funkciót, a terápiás funkciót és egy potenciális polimerizációs funkciót ugyanabba a makromolekulába integráljuk génsebészeti technikák alkalmazásával.

A jelen találmány egyik célja HSA-ból származó hibrid makromolekulák előállítása, amelyek hasznosak lehetnek bizonyos vírusbetegségek, például a szerzett immunhiányos tünetegyüttes (AIDS) elleni küzdelemben. Egy másik cél olyan hibrid HSA makromolekula-származékok előállítása, amelyek használhatók bizonyos rákos megbetegedések elleni küzdelemben, például azok ellen, amelyek a humán protoonkogének genomiális sokszorozódásával és/vagy túlexpressziójával vannak kapcsolatban, úgymint a c-erbB-2 protoonkogénnel [Semba K. et al„ Proc. Natl. Acad. Sci„ USA, 82, 6497-6501 (1985); Slamon D. J. et al„ Science, 235, ΥΊΊ-182 (1987); Kraus, Μ. H. et al„ EMBO J„ 6,605-610 (1987)].

A HÍV- 1 vírus az egyike azoknak a retrovírusoknak, amelyek a szerzett immunhiányos tünetegyüttesért felelősek az emberben. Ezt a vírust alaposan tanulmányozták az elmúlt öt évben; egy alapvető felfedezés a CD4 (T4) molekulának, mint a HÍV- 1 vírus receptorának a szerepével foglalkozik [Dalgleish A. G. et al„ Natúré, 312, 763-767 (1984); Klatzmann D. et al„ Natúré, 312, 767- 768 (1984)]. A HÍV- 1 vírus és bizonyos T-limfociták közötti kölcsönhatás felfedezése volt az alapja annak a szabadalomnak, amely a T4-molekulát vagy az ellene készített antitesteket használja

HU 215 457 Β terápiás szerekként a HÍV-1 vírus ellen (FR 2570278 sorszámú francia szabadalmi leírás).

A humán CD4-molekulát kódoló gén klónozását és a nukleotidszekvencia első verzióját Maddon és munkatársai írták le [Cell, 42, 93- 104 (1985)], valamint a szekvencia egy javított verzióját Littmann és munkatársai írták le [Cell, 55, 541 (1988)]; a CD4-molekula az immunglobulinok szupercsaládjának a tagja, részletesebben, egy olyan VI N-terminális domént tartalmaz, amely lényegében homológ az immunglobulin nehéz lánca variábilis doménjével [Maddon, P. J., Cell, 42, 93- 104 (1985)]. In vitro DNS-rekombinációt alkalmazó kísérletekben a CD4-molekulát kódoló gén felhasználásával kapták azt a végső bizonyítékot, hogy a CD4gén terméke a HÍV- 1 vírus fő receptora [Maddon, P. J., Cell, 47, 333-348 (1986)]. Ennek a génnek a szekvenciáját, valamint anti-HIV- 1 terápiás szerként való alkalmazását a WO 88013 040 Al sorszámon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentésben közlik.

A CD4-gén manipulálása rekombináns DNS-módszerekkel adta az in vitro vírusellenes hatásra képes oldható variánsok első generációját [Smith, D. H. et al., Science, 238, 1704- 1707 (1987); Traunecker A. et al., Natúré, 331, 84- 86 (1988); Fischer R. A. et al., Natúré, 331, 84-86 (1988); Hussey, R. E. et al., Natúré, 331, 78-81 (1988); Deen, K. C. et al., Natúré, 331, 82-84 (1988)], valamint az in vivő hatásra képes variánsokat [WatanabeM. et al., Natúré, 337, 267-270 (1989)]. Mindegyik esetben azt figyelték meg, hogy különböző, állatokon végzett in vivő vizsgálatokban (nyúl, majom), valamint a klinikai vizsgálatok I. fázisában a CD4 oldható variánsok első generációja, amely olyan CD4-molekulákból állt, amelyekből hiányzott a C-terminális régió két doménje, nagyon rövid felezési idővel rendelkezett: körülbelül 15 perc nyulakban [Capon et al., Natúré, 337, 525-531 (1989)], míg az intramuszkulárisan Rhesus-majmoknak beadott CD4 első generációjának 50%-a biológiailag aktív maradt 6 órán át [Watanabe M. et al., Natúré, 337, 267-270 (1989)]. Emellett 60 AIDS-es vagy ARC-s (AIDS-hez kapcsolódó komplex tünetek) betegen végzett I. fázisú klinikai vizsgálatok azt mutatták, hogy a Genentech termék felezési ideje változott 60 perc (intravénás beadási mód) és 9 óra (intramuszkuláris beadási mód) között (AIDS/HIV Experimental Treatment Directory, AmFar, 1989. május). Egy gyógyhatású anyag, amely in vivő ilyen gyenge stabilitással rendelkezik, komoly hátrányoktól szenved. A termék ismételt injekciózása, ami költséges és a beteg számára kényelmetlen, vagy a termék beadása perfúzióval, ez válik szükségessé ahhoz, hogy a plazmában hatásos koncentrációt érjenek el. Ebből következően különösen fontos, hogy a CD4-molekulának olyan származékait találják meg, amelyek sokkal hosszabb felezési idővel rendelkeznek.

A CD4-molekulának azt a részét, amely a HÍV- 1 vírussal lép kölcsönhatásba, az N-terminális régióban lokalizálták, pontosabban a VI doménben [Berger E. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85, 2357-2361 (1987)]. Megfigyelték, hogy a HIV-vel fertőzött betegeknek egy jelentős része (körülbelül 10%) immunválaszt fejt ki a CD4-receptorral szemben, amely a receptor extracelluláris részének C-terminális régiója ellen irányul [Thiriart C. et al., AIDS, 2, 345-352 (1988); Chams V. et al., AIDS, 2, 353- 361 (1988)]. Tehát a jelen találmány egy előnyős megvalósítási módja szerint a CD4-molekulának csak a VI vagy VIV2 N-terminális doménjeit, amelyek a teljes antivirális hatásért felelősek, használjuk az albuminból származó transzportfunkcióval való fúzióban.

Az immunglobulinok variábilis doménjével megfigyelt homológia alapján számos laboratóriumban hoztak létre genetikai fúziót a CD4-molekula és különböző típusú immunglobulinok között, ezáltal in vitro antivirális hatással rendelkező hibrid immunglobulinokat állítva elő [Capon D. J. et al., Natúré, 337, 525-531 (1989); Traunecker A. et al., Natúré, 339, 68-70 (1989); lásd még a WO 89 02922 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentést]. Azonban az a tény, hogy az FcyRIII-receptor (3-as típusú receptor az IgG-k Fc régiójában), amely az emberekben a CD16antigén [Unkeless J. C. and Jacquillat C. J., Immunoi. Meth., 100, 235-241 (1987)] részt vesz a HÍV- 1 vírus internalizálásában [Homsy J. et al., Science, 244, 1357- 1360 (1989)], azt sugallja, hogy ezek a receptorok fontos szerepet játszanak in vivő a vírus szaporodásában. A receptor, amelyet nemrég klónoztak [Simmons D. and Seed B., Natúré, 333, 568-570 (1988)], főleg a makrofágok, polinukleáris sejtek és granulociták membránjaiban található, de a CD4-gyel szemben a CD16-receptor oldható formában is létezik a szérumban [Khayat D. et al., J. Immunok, 132, 2496- 2501 (1984); Khayat D. et al., J. Immunoi. Meth., 100, 235-241 (1987)]. Meg kell jegyeznünk, hogy a membránhoz kötött CD16-receptort használja a HÍV- 1 vírus másodlagos belépési útvonalnak a makrofágok megfertőzésére, a segítő antitestek jelenléte miatt [Homsy J. et al., Science, 244, 1357- 1360 (1989)]. Ezt a fertőzési folyamatot, amely egy „Fc-receptort” is tartalmaz a célsejtek felszínén (például a CD16-receptort), valamint a virion elleni antitestek Fc-régióját, ADE-nek (antitest-függő erősítés) nevezik; ezt flavivírusra is leírták [Peiris, J. S. M. et al., Natúré, 289, 189-191 (1981)], valamint a Visna-Maedi ovin lentivírusra [Jolly P. E. et al., J. Virol., 63, 1811- 1813 (1989)]. Más „Fc-receptorokat” is leírtak az IgG-re (FcyRI és FcyRII például), valamint az immunglobulinok más csoportjaira, és az ADE-jelenség más típusú „Fc-receptorokat” is magába foglal, például azt, amelyet a 3G8 monoklonális antitest ismer fel [Homsy J. et al., Science, 244, 1357-1360 (1989); Takeda A. et al., Science, 242, 580-583 (1988)]. Megkérdőjelezhető azoknak a hibrid vírusellenes makromolekuláknak a hatékonysága, ami egyedül az immunglobulinok, valamint a normális körülmények között a HÍV- 1 vírus által a gazdasejtben való szaporodásra használt receptor közötti fúzión alapul; valójában egy funkcionális Fc-fragmens jelenléte egy ilyen molekulán megkönnyítheti bizonyos sejttípusok vírusfertőzését. Az is lényeges, hogy olyan CD4-származékokat kapjunk, amelyeket nagy terápiás koncentrációban lehet használni.

HU 215 457 Β

Egy másik, a MalE baktériumfehérjét és a CD4-molekulát magába foglaló kimérakonstrukciót is tanulmányoztak [Clément J. M. et al., C. R. Acad. Sci. Paris, 308, III. sorozat, 401-406 (1989)]. Ez a fúzió lehetővé teszi, hogy kihasználjuk a MalE-fehérje előnyös tulajdonságait, ami a hibridfehérje termelésében és tisztításában nyilvánul meg. Emellett a CD4-molekula és egy bakteriális toxin közötti genetikai fúzió készítését is leírták [Chaudry V. K. et al., Natúré, 335, 369-373 (1989)]. Ezekben az esetekben azonban egy bakteriális fehérjét tartalmazó genetikai fúzió felhasználása humán terápiás célokra kérdójelezhetó meg.

Az ADE-jelenség szerepének felfedezése bizonyos vírusok szaporodásában, főleg a lenti vírusokéban, beleértve aHIV-l-et, igazolja azokat a kutatásokat, amelyek egy anti-AIDS-vakcina kifejlesztésére, illetve olyan terápiás ágensek kifejlesztésére irányulnak, amelyek immunglobulinok és a vírus megkötésére alkalmas molekulák közötti fúzión alapulnak. Ez az, amiért a jelen találmányban ismertetett anti-AIDS-terápiás ágensek a HÍV- 1 vírus által az in vivő szaporodás során közvetve vagy közvetlenül használt receptor vagy annak egy része és egy stabil plazmafehérje (amelynek nincs enzimatikus aktivitása és nincs rajta az Fc-fragmentum) közötti fúzión alapulnak.

A jelen találmány előnyösen humán albuminvariánsok és a HÍV- 1 vírus megkötési helye közötti kapcsolással foglalkozik, főleg génsebészeti módszerekkel. Ezeket a humán szérumalbuminból származó hibrid makromolekulákat az jellemzi, hogy a CD4-receptor egy vagy több olyan variánsát tartalmazzák, amelyek a CD4-receptor N-terminális doménjének főleg in vitro DNS-rekombinációs technikákkal (mutáció, deléció és/vagy addíció) való módosításából származnak, amely dómén a HÍV- 1 vírus és a célsejt közötti specifikus kölcsönhatásban játszik szerepet. Ezek a plazmában keringő hibrid makromolekulák stabil, vírusellenes hatással rendelkező csapdákat jelentenek, és a HSA- CD4 általános névvel jelöljük őket. A jelen találmány egy másik célkitűzése a humán albuminvariánsok és a CD16-molekula variánsai összekapcsolása, ami részt vesz a vírusok, többek között a HÍV- 1 internalizálásában (a továbbiakban a HSA- CD16 jelzést kapja), valamint általában az albuminvariánsok összekapcsolása olyan molekulákkal, amelyek képesek bizonyos vírusok, főleg a lentivírusok ADE-jelenségeiért felelős sejtreceptorok utánzására.

A jelen találmány elveit más, humán vagy állati vírus által direkt vagy indirekt módon a szervezetben való szaporodásra használt receptorokra is alkalmazni lehet. Például:

1) 1-es intercelluláris adhéziós molekula (ICÁM- 1), amelyről kimutatták, hogy a humán HRV14 rhinovírus receptora [Greve J. M. et al., Cell, 56, 839- 847 (1989); Staunton et al., Cell, 56, 849- 853 (1989)];

2) poliovírus-receptor, amelyet mostanában klónoztak [Mendelsohn et al., Cell, 56, 855- 865 (1989)];

3) a C3D komplement faktor receptora, amely az Epstein-Barr-vírus (EBV) receptora a humán sejtekben [Fingeroth J. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81,

4510-4514 (1984)]; ez a vírus felelős a fertőző mononukleózisért és bizonyos emberi limfómákért;

4) a HTLV-1 és HTLV- II humán T-sejt leukémiavírus receptora, amelyet mostanában azonosítottak a 17-es kromoszómán [Sommerfelt M. A. et al., Science, 242, 1557- 1559 (1988)]; ezek a vírusok felelősek a felnőttkori T-sejtes leukémiáért, valamint a trópusi görcsös bénulásért (HTLV- 1) és a tricholeukocita-leukémiáért (HTLV-II);

5) aMuLV-E ekotróp rágcsáló-leukémiavírus receptora, amelyet mostanában azonosítottak az egér 5-ös kromoszómáján [Oie et al., Natúré, 274, 60- 62 (1978)] és nemrég klónoztak [Albritton et al., Cell, 57, 659- 666(1989)].

A jelen találmány másik célkitűzése rákellenes tulajdonságokkal rendelkező stabil hibrid molekulák kifejlesztése, amelyeket úgy kapunk, hogy albuminvariánsokat olyan növekedési faktorokhoz kötünk, amelyek bizonyos kóresetekben a megfelelő membrán-protoonkogének sokszorozódásához kötődnek, képesek kölcsönhatásba lépni a célsejtekkel, és egy transzformáit fenotípust indukálni. Ezekre a receptorokra példa a tirozin-kináz aktivitással rendelkező receptorok osztálya [Yardén Y. and Ulrich A., Biochemistry, 27, 3113-3119 (1988)], a legjobban ismertek az epidermális növekedési faktor (EGF), és a kolóniastimuláló faktor I (CSF-1) receptorai, amelyeket a c-erbBA [Downward J. et al., Natúré, 307, 521-527 (1984), illetve a c-fms [Sherr, C. J. et al., Cell, 41, 665-676 (1985)] protoonkogének kódolnak. Egy másik példa az ilyen receptorokra a humán inzulinreceptor (HÍR), a vérlemezke eredetű növekedési faktor (PDGF) receptora, az inzulinszerű növekedési faktor I (IGF-1) receptora, és főleg a c-erbB-2 protoonkogén, amelynek a genomiális sokszorozódásáról és/vagy túlexpressziójáról igazolták, hogy szoros kapcsolatban áll bizonyos humán rákmegbetegedésekkel, főleg az emlőrákkal [Slamon D. J. et al., Science, 235, 177- 182 (1987); Kraus Μ. H. et al., EMBO J., 6, 605-610 (1987)]. A jelen találmányban lefektetett elveket ugyanúgy lehet alkalmazni más receptorokra is, például az interleukin-6 (IL-6) receptorra, amelyről in vitro kimutatták, hogy a vese-karcinómasejtekben egy autokrin faktor [Miki S. et al., FEBS Lett., 250, 607-610 (1989)].

Amint azt az előzőkben jeleztük, az érdekes hibrid makromolekulák előnyösen fehérjék, tehát génsebészeti módszerekkel állíthatók elő. Ezen makromolekulák előállításának előnyös módja a transzformált, transzfektált vagy a makromolekulát expresszáló vektorral fertőzött sejtek tenyésztése. Előnyösen az élesztőket, főleg a Kluyveromyces nemzetségbe tartozókat transzformálni képes expressziós vektorokat alkalmazzuk. Ez a rendszer lehetővé teszi, hogy az érett formájú hibrid makromolekulát nagy mennyiségben állítsuk elő, a tenyészfolyadékba szekretálva, ezzel megkönnyítve tisztítását.

Az előnyös módszer tehát a hibrid makromolekulák előállítására a Kluyveromyces nemzetségbe tartozó élesztő transzformálása a pKDl extrakromoszomális replikonból származó expressziós vektorral, amely replikont először a K. marxianus var. drosophilarum élesztőből

HU 215 457 Β izoláltak. Ezek az élesztők, és főleg a K. marxianus (beleértve a lactis, drosophilarum és fragilis variánsokat, amelyeket a továbbiakban K. lactis, K. drosophilarum és K. fragilis néven említünk) általában képesek ezeket a vektorokat szaporítani stabil módon, és azzal a további előnnyel rendelkeznek, hogy a G.R.A.S. (Generally Recognized As Safe, azaz általánosan biztonságosnak elismert) mikroorganizmusok listáján szerepelnek. A különösen érdekes élesztők közé tartoznak azok a Kluyveromyces ipari törzsek, amelyek képesek az említett pKDl-plazmidból származó plazmid stabil replikálására, amelybe egy szelektálható genetikai bélyeget, valamint egy olyan expressziós kazettát építettek be, amely lehetővé teszi az adott hibrid molekula magas szintű szekrécióját.

A Kluyveromyces fajra leírt klónozó vektorok három típusa:

i) Integrálódó vektorok, amelyek a Kluyveromyces genom régióival homológ szekvenciákat tartalmaznak, és amelyek a sejtbe való bejutásuk után in vivő rekombinációval beépülnek a Kluyveromyces kromoszómákba (WO 83/04050 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés). Az integráció, ami egy ritka esemény, és hatékony szelekciós markert igényel, akkor játszódik le, ha ezek a vektorok nem tartalmaznak a sejtben való önálló replikációt megengedő szekvenciákat. Ennek a rendszernek az előnye a transzformált törzsek stabilitása, ami azt jelenti, hogy képesek normál tápközegben növekedni anélkül, hogy az integrált szekvenciák megtartásához szelekciós nyomásra lenne szükség. A rendszer hátránya azonban, hogy az integrálódott gének csak nagyon kis számban vannak jelen a sejtben, ami gyakran a heterológ fehérje expressziójának alacsony szintjében nyilvánul meg.

ii) Autonóm Replikációs Szekvenciát (ARS) tartalmazó replikálódó vektorok, amelyekben az ARS a Kluyveromyces kromoszomális DNS-éból származik [Das S. and Hollenberg C. P., Current Genetics, 6, 123- 128 (1982); WO 83/04050 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés]. Ezek a vektorok azonban csak közepesen érdekesek, mivel szegregálódásuk a mitotikus sejtosztódás során nem homogén, ennek eredménye, hogy nagy gyakorisággal elvesznek a sejtekből még szelekciós nyomás alatt is.

iii) Természetes élesztöplazmidokból származó replikálódó vektorok, akár a K. lactisból izolált ki lineáris „killer”-plazmidból [de Louvencourt L. et al., J. Bacteriol., 154, 737-742 (1983); az 1983. december 7-én publikált EP O 095 986 Al számon közrebocsátott európai szabadalmi bejelentés] vagy a K. drosophilarumból izolált pKDl cirkuláris plazmidból [Chen X. J. et al., Nucl. Acids Rés., 14, 4471-4480 (1986); Falcone C. et al., Plasmid, 75, 248-252 (1986); az 1987. október 14-én publikált EP O 241 435 A2 számú európai szabadalmi bejelentés]. A lineáris „killer”-plazmidból származó replikont tartalmazó vektorokhoz speciális táptalaj szükséges, és már 15 generáció után 40-99%-ban kivesznek a sejtekből, még szelekciós nyomás alatt is (EP O 095 986 Al számon közrebocsátott európai szabadalmi bejelentés, 1983), ami korlátozza heterológ fehérjék nagy mennyiségben való előállításában való felhasználásukat. Az EP O 241 435 A2 számon közrebocsátott európai szabadalmi bejelentésben leírt pKDl-plazmidból származó vektorok szintén nagyon instabilak, hiszen a legjobb (P3) vektor is körülbelül 70%-ban kivész a sejtekből már hat generáció után is, nem szelektív növesztési körülmények között.

A jelen találmány tárgya a teljes pKDl-plazmidból származó bizonyos plazmidkonstrukciók alkalmazása; ezek a konstrukciók sokkal nagyobb stabilitási jellemzőkkel rendelkeznek, mint azok, amelyeket az EP O 241435 A2 számon közrebocsátott európai szabadalmi bejelentésben említenek. A jelen találmány során igazoljuk, hogy ezek a vektorok stabilan fennmaradnak a sejtek több mint 80%-ában 50 generáció után is, nem szelektív növekedési körülmények között.

A jelen találmány során alkalmazott vektorok nagy stabilitását a pKDl-plazmid jellemzőinek teljes kihasználása révén kapjuk. Egy replikációs origó mellett ez az extrakromoszomális replikonrendszer két fordított ismétlődő szekvenciát is tartalmaz, mindegyik 346 nukleotid hosszú, valamint három nyílt leolvasási keretet, amelyek az A, B és C géneket klónozzák, amelyek expressziója elengedhetetlen a plazmid stabilitásához és magas kópiaszámához. A S. cerevisiae 2 mikronos plazmidjával való analógia alapján, amely szerkezetileg rokona a pKDl-plazmidnak [Chen X. J. et al., Nucl. Acids Rés., 14, 4471-4480 (1986)], a B és C gének által kódolt fehérjék valószínűleg a mitotikus sejtosztódás során a plazmidmegoszlásban játszanak szerepet, valamint az A gén negatív szabályozásában, amely gén egy helyspecifikus rekombinázt (FLP) kódol. Igazolták, hogy a S. cerevisiae 2 mikronos plazmidján lévő fordított ismétlődő szekvenciák közötti FLP által közvetített rekombináció a plazmid sejtenkénti kópiaszámának autoregulációjában szerepet játszó mechanizmus alapja: ha a kópiaszám túl alacsony ahhoz, hogy a B és C gének termékei, amelyek az A gén represszoraként működnek, elegendő mennyiségben keletkezzenek, akkor az FLP rekombináz indukálódik, és a plazmid a „rolling circle” típusú modell szerint replikálódik, ami a kópiaszámot körülbelül 50 kópia/sejt értékre emeli [Fluteher A. B., Yeast, 4, 27-40 (1988)].

Az EP O 241 435 A2 számon közrebocsátott európai szabadalmi bejelentésben publikált vektorok nem rendelkeznek a K. drosophilarum pKDl-plazmidjának az előzőkben említett jellemzőivel: az A15-vektor nem tartalmazza a pKDl-plazmid teljes szekvenciáját, a Plés P3-vektorokban egy megszakított A gén van, ezáltal a pKDl-rezidens plazmid autoregulált replikációjának rendszere elromlik. Ezzel szemben a jelen találmány szerinti pKDl-eredetű konstrukciók megtartják a fordított ismétlődő szekvenciák és az A, B és C nyílt leolvasási keretek szerkezeti egységét, ennek eredménye egy sokkal magasabb plazmidstabilitás, valamint a terápiásán aktív hibrid makromolekulák megnövekedett szintű szekréciója.

Az expressziós kazetta egy transzkripciós iniciációs régiót tartalmaz (promotert), ami a hibrid makromolekulát kódoló gén expresszióját szabályozza. A promoter

HU 215 457 Β az alkalmazott gazdasejttöl függ. Ezek a promoterek a Saccharomyces vagy Kluyveromyces típusú élesztők génjeiből származnak, például a foszfoglicerát-kináz (PGK), gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GPD), a Kluyveromyces laktáz (LAC4), az enolázok (ENO), az alkohol-dehidrogenázok (ADH), a S. cerevisiae savas foszfatáz (PHO5) stb. fehérjéket kódoló génekből. Ezeket a kontrollszekvenciákat lehet módosítani, például in vitro helyspecifikus mutagenezissel, további kontrolielemek vagy szintetikus szekvenciák beépítésével vagy az eredeti kontrollelemek deléciójával vagy szubsztitúciójával. Például a magasabb eukarióták transzkripciót szabályozó elemei, az úgynevezett „erősítők” (enhancerek), az élesztőkben lévő „upstream activating sequences” (UAS), amelyek egyéb élesztő-promoterekböl, például a S. cerevisiae GÁLI vagy GAL10 promoterekböl, vagy a K. lactis LAC4 promoteréböl származnak, vagy éppen a vírus-transzaktivátorok (például a papillomavírus E2 transzaktivátora) által felismert gének erősítőszakaszai használhatók hibrid promoterek készítésére, ami lehetővé teszi, hogy az élesztötenyészet növekedési fázisát elválasszuk a hibrid makromolekulát kódoló gén expressziós fázisától. A jelen találmányban használt expressziós kazetta tartalmaz egy transzkripciós és transzlációs terminációs régiót, amely működik a megcélzott gazdaszervezetben, és amely a hibrid makromolekulát kódoló szekvencia 3 ’ végén helyezkedik el.

A hibrid makromolekulát kódoló szekvenciát egy szignálszekvencia előzi meg, ami azt a célt szolgálja, hogy a fehérjéket a szekréciós bioszintézis útra irányítsa. Ez a szignálszekvencia származhat az albumin természetes N-terminális régiójából (a prepro régióból), vagy olyan élesztögénekböl állítható elő, amelyek szekretált fehérjéket, például a szexuális feromonokat vagy a killer toxinokat kódolják, vagy bármely olyan szekvenciából, amelyről ismert, hogy megnöveli az úgynevezett gyógyászatilag értékes fehérjék szekrécióját, beleértve szintetikus szekvenciákat, valamint a „pre” és „pro” régiók bármely kombinációját.

A szignálszekvencia és az érett formában szekretálandó hibrid makromolekulát kódoló szekvencia közötti kapcsolódás helye megfelel az élesztő endoproteáz hasítási helyének, például egy bázikus aminosavpárnak (Lys-2-Arg-¹ vagy Arg ²-Arg ¹ típus), amely a S. cerevisiae KEX2 génje által kódolt proteáz vagy a K. lactis KEX1 génje által kódolt proteáz felismerési helyének felel meg [Chen X. J. et al„ J. Basic Microbiol., 28, 211-220 (1988); Wésolowski-Louvel M. et al„ Yeast, 4, 71-81 (1988)]. Tény, hogy a S. cerevisiae KEX2 génjének terméke in vitro elhasítja az albumin normál „pro” szekvenciáját, de nem hasítja el a pro-albumin „Christchurch”-nek megfelelő szekvenciát, amelyben mutáció következtében a bázikus aminosavpár helyett Arg ²- Gkr¹ szerepel [Bathurst I. C. et al„ Science, 235, 348- 350 (1987)].

Az expressziós kazetta mellett a vektor egy vagy több olyan genetikai bélyeget tartalmaz, ami lehetővé teszi a transzformált sejt szelektálását. Ilyen marker például az élesztő URA3 génje vagy azok a markerek, amelyek antibiotikumok, például geneticin (G418) elleni rezisztenciát biztosítanak a sejteknek, vagy bármely más, toxikus anyag, például fémionok elleni rezisztenciát. Ezeket a rezisztenciagéneket a megfelelő transzkripciós és transzlációs szekvenciák szabályozása alá helyezzük, ami lehetővé teszi expresszálódásukat egy adott gazdaszervezetben.

Az expressziós kazettát és a szelektálható markert tartalmazó konstrukciót használhatjuk akár az élesztő közvetlen transzformálására, akár egy replikatív vektorba való beépítésre. Az első esetben előnyösen a gazdasejt kromoszómáján lévő régiókkal homológ szakaszokat fuzionáltatunk a konstrukcióhoz. Ezeket a szekvenciákat az expressziós kazetta és a szelektálható genetikai bélyeg mindkét oldalára elhelyezzük, abból a célból, hogy megnöveljük a konstrukció in vivő rekombinációval való integrálódásának frekvenciáját a gazdasejt kromoszómájába. Abban az esetben, amikor az expressziós kazettát egy replikatív vektorba építjük be, akkor a Kluyveromyces számára előnyös replikációs rendszer az először Kluyveromyces drosophilarumból izolált pKDl-plazmidból származik, míg a Saccharomyces számára előnyös replikációs rendszer a 2 mikronos plazmidból származik. Az expressziós vektor tartalmazhatja az említett replikációs rendszereket,vagy kombinálhatja a pKDl-plazmidból, valamint a 2 mikronos plazmidból származó elemeket.

Ha Kluyveromyces élesztönemzetségben való expresszió a kívánatos, akkor az előnyös konstrukció a pKDl-plazmid teljes szekvenciáját tartalmazza. Pontosabban, azok az előnyös konstrukciók, ahol az idegen szekvenciáknak a pKDl-be való beépítése egy 197 bp méretű régióban van, amely a SacI (SstI) és az MstlI helyek között helyezkedik el, ami nagy stabilitást ad a replikációs rendszernek a gazdasejtekben.

Az expressziós plazmidok lehetnek ingázó vektorok egy bakteriális gazdasejt, például Escherichia coli és élesztők között; ebben az esetben egy replikációs origó és egy, a bakteriális gazdasejtben működő szelektálható genetikai bélyeg szükséges. Az is lehetséges, hogy az expressziós vektorban egyetlen hasítási hellyel rendelkező restrikciós helyeket helyezzünk el oly módon, hogy a bakteriális szekvenciát határolják. Ez lehetővé teszi, hogy a bakteriális szekvenciát restrikciós enzimes hasítással elimináljuk, és a vektort az élesztőbe való transzformálás előtt religáljuk, ennek eredménye lehet magasabb plazmidkópiaszám és megnövekedett plazmidstabilitás. Bizonyos restrikciós helyek, például az 5’-GGCCNNNNNGGCC-3’ (SflI) vagy az 5’-GCGGCCGC-3’ (NotI) különösen előnyösek, mivel nagyon ritkán fordulnak elő az élesztőkben, és általában hiányoznak az expressziós plazmidokból.

A fentiek szerint készített expressziós vektorokat az irodalomban ismertetett klasszikus módszerekkel juttatjuk be élesztőkbe. A transzformált sejtek szelektálása után azokat a sejteket, amelyek expresszálják a hibrid makromolekulát, megfelelő szelektív táptalajba inokuláljuk, majd megvizsgáljuk, hogy mennyire képesek az adott fehérjét az extracelluláris közegbe szekretálni. A fehérje izolálását végezhetjük növekedés közben fo1

HU 215 457 Β lyamatos tenyésztés esetén, vagy a növekedési fázis végén nem folyamatos tenyésztés esetén. A jelen találmány tárgyát képező hibridfehérjéket ezután kinyerjük a tenyészet felülúszójából olyan módszerekkel, amelyek figyelembe veszik a fehérjék molekuláris jellemzőit és farmakológiai aktivitását.

A jelen találmány foglalkozik továbbá az ismertetett hibrid makromolekulák terápiás alkalmazásával, főleg az AIDS kezelésében és megelőzésében, valamint az ilyen makromolekulákat expresszáló vektorokkal transzformált, transzfektált vagy infektált sejtekkel.

Az alábbiakban következő példák, valamint a csatolt ábrák a jelen találmány néhány jellemzőjét és előnyét mutatják be.

AZ ÁBRÁK LEÍRÁSA

Az ábrákon látható plazmidok rajza nem mérethelyes, és csak a konstrukciók számára fontos restrikciós helyeket j elöljük.

1. ábra: Az MstlI és HindlII-Smal restrikciós helyek bevitelére használt oligodezoxinukleotidok, amelyek a CD4-molekula VIV2 doménje előtt és után helyezkednek el.

2. ábra: Az MstI- Smal restrikciós fragmens nukleotidszekvenciája, amely tartalmazza a HÍV-1 vírus CD4-receptorának VI és V2 doménjeit. Az MstlI, HindlII és Smal restrikciós helyek alá vannak húzva.

3. ábra: A prepro-HSA-t kódoló pXL869-plazmid előállítása.

4. ábra: A pYG208- és pYG210-plazmidok előállítása.

5. ábra: A pYGll-plazmid előállítása.

6. ábra: A pYG18-plazmid előállítása.

7. ábra: A pYG303-plazmid restrikciós térképe.

8. ábra: A fúziós prepro-HSA- VIV2 fehérjét kódoló HindlII restrikciós fragmens nukleotidszekvenciája. A fekete nyilak mutatják a HSA „pre” és „pro” régióinak a végét. Az MstlI restrikciós hely alá van húzva.

9. ábra: A pYG306 plazmid restrikciós térképe.

11. ábra: A pYG18-plazmid előállítása.

12. ábra: A pkl-PS1535-6-plazmid előállítása.

13. ábra: A pUC-kanl- és pUC-kan202-plazmidok előállítása.

14. ábra: A pKan707-plazmid előállítása

15. ábra: A pKan707-plazmid stabilitási görbéje az

MW98- 8C törzsben nem szelektív növesztési körülmények között.

16. ábra: A pYG308B-plazmid előállítása.

17. ábra: A pYG221B-plazmid előállítása.

18. ábra: A pYG221B (prepro-HSA) és pYG308B (prepro-HSA-VIV2) plazmidokkal transzformáit MW98-8C törzs tenyészetébe 4 nap elteltével szekretált anyag jellemzése. A: Coomassie-festés 8,5%-os poliakrilamid gélen való elektroforézis után.

1. sáv: molekulatömeg-standardok;

2. sáv: a pYG308B-plazmiddal transzformáit sejtek tenyészete 300 μΐ-ének megfelelő felülúszó;

3. sáv: a pYG221B-plazmiddal transzformáit sejtek tenyészete 100 μΐ-ének megfelelő felülúszó;

4. sáv: 500 ng HSA.

B: A szekretált anyag immunológiai jellemzése 8,5%-os poliakrilamid gélen való elektroforézis, majd nitrocellulóz membránra való átvitel és humán albumin elleni primer antitestek alkalmazásával:

1. sáv: 250 ng HSA standard;

2. sáv: a pYG308B-plazmiddal transzformáit sejtek 100 μΐ tenyészetének megfelelő felülúszó;

3. sáv: a pYG221B-plazmiddal transzformáit sejtek 10 μΐ tenyészetének megfelelő felülúszó.

C: Pontosan ugyanaz, mint a B, azzal a különbséggel, hogy a HSA-ellenes antitestek helyett CD4-molekula elleni poliklonális antitesteket használunk.

19. ábra: A HSA-V1V2 fehérje (1 μg/ml) titrálása

Leu3A egér monoklonális antitesttel (Beckton Dickinson, Mountain View, Kalifornia, USA) (A panel); OKT4A egér monoklonális antitesttel (Ortho Diagnostic Systems; Raritan, New Jersey, USA) (B panel); vagy peroxidázhoz kötött poliklonális kecske anti-HSA antitesttel (Nordic; Tilburg, Hollandia) (C panel). A Leu3A és OKT4A antitestek alkalmazása után peroxidázhoz kötött nyúl anti-egér szekunder antitestet használunk. A három primer antitest titrálási görbéjét peroxidáz kromogén szubsztrát (ABTS, Fluka, Svájc) hozzáadása után 405 nm-en mért optikai sűrűség alapján határozzuk meg.

Ordináta: a 405 nm-en mért OD Abszcissza: a használt primer antitest hígítási faktora

20. ábra: A HSA-V1V2 fehérje vizsgálata ELISAszendvicsmódszerrel: nyúl poliklonális anti-HSA (Sigma)/HSA-VlV2/Leu3A egér monoklonális antitest (Beckton Dickinson) (A panel), vagy nyúl poliklonális anti-HSA (Sigma)/Hsa-V1V2/OKT4A egér monoklonális antitest (Ortho Diagnostic Systems) (B panel). Miután mindegyik fehérjét a HSA-V1V2 fehérjével inkubáltuk, peroxidázhoz kötött szekunder nyúl antiegér antitestet (Nordic) adunk hozzá. A titrálási görbéket peroxidáz kromogén szubsztrát (ABTS, Fluka, Svájc) hozzáadása után 405 nm-en mért optikai sűrűség alapján határozzuk meg.

Ordináta: a 405 nm-en mért OD Abszcissza: a HSA-V1V2 koncentrációja pg/ml értékben

21. ábra: A CD4-hez való kötődés folyadékfázisban való gátlása 125 femtomól rekombináns gpl60 fehérjével (Transgéne, Strasbourg,

HU 215 457 Β

Francé). A 492 nm-en mért optikai sűrűség van az ordinátán (a 2-es érték a telítési optikai sűrűsége a rendszernek), az abszcisszán a HSA (kontroll), a HSA-CD4 és az oldható CD4 mennyiségét (pikomól fehérjében) ábrázoljuk.

22. ábra: Az inaktivált HÍV- 1 vírus kötődése a

CEM13 sejtvonalhoz.

A: A fluoreszcenciájuk alapján osztályozott sejtpopulációk előzetes analízise.

Ordináta: sejtszám

Abszcissza: a fluoreszcencia intenzitása (logaritmikus skála).

B: A fluoreszcenciájuk alapján osztályozott sejtpopulációk hisztogramja.

1. oszlop: negatív kontroll;

2. oszlop: HÍV- 1 vírus;

3. oszlop: 116 pikomól rekombináns CD4 fehérjével előinkubált HÍV- 1 vírus;

4. oszlop: 116 pikomól HSA-V1V2 fehérjével előinkubált HÍV- 1 vírus;

5. oszlop: 116 pikomól HSA-val előinkubált HÍV- 1 vírus.

23. ábra: A fertőzés gátlása sejttenyészetben.

A reverz transzkriptáz aktivitást mérjük a CEM13 sejtek fertőzése után 19 nappal. A vizsgálatokat mikrotiter lemezeken végezzük a következő protokoll szerint: Mindegyik mélyedésbe 10-10 μΐ A puffért mérünk (összetétele: 0,5 mol/1 KC1, 50 mmol/1 DTT, 0,5% Triton X- 100), majd 40 μΐ B puffért (összetétele: 10 μΐ 5 mmol/l-es EDTA, 0,5 mol/1 TRIS-HC1ben, pH= 7,8, 1 μΐ 0,5 mol/1 MgCl₂, 3 μΐ ³H-dTTP, 10 μΐ poli rA-oligodT 5 OD/ml, 16 μΐ H₂O) adunk a fertőzés után különböző időpontokban vett tenyészet-felülúszók 5050 μΐ-éhez. A lemezeket 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk, majd 20 μΐ C puffért (összetétele: 120 mmol/1 Na₄P₂O₇ 60%-os TCA-ban) adunk hozzá, és az inkubálást további 15 percig folytatjuk 4 °C-on. A keletkező csapadékokat Skatron-szűrőkön bocsátjuk keresztül, Skatron cell harvestert alkalmazva, majd D pufferrel mossuk (összetétele: 12 mmol/1 Na₄P₂O₇ 5%-os TCA-ban). A szűrőket 15 percig 80 °C-on szárítjuk, majd a radioaktivitásukat szcintillációs számlálóban mérjük. Minden egyes pontra három független mintát vizsgálunk meg.

24. ábra: A CD4, HSA és HSA- CD4 in vivő koncentrációk változása az időben.

25. ábra: A pYG232-, pYG233- és pYG364-plazmidok előállítása.

26. ábra: A pYG234-plazmid előállítása.

27. ábra: A pYG332- és pYG347-plazmidok előállítása.

28. ábra: A pYG362-, pYG363- és pYG511-plazmidok előállítása.

29. ábra: A pYG371-, pYG374- és pYG375-plazmidok restrikciós térképe.

30. ábra: A pYG373B expressziós plazmid restrikciós térképe.

31. ábra: A pYG5 3 7-plazmid előállítása.

32. ábra: A pYG560 expressziós plazmid előállítása

33. ábra: A HSA-VI (pYG366B-plazmid, b sáv), a

VI-HSA (pYG373B, c sáv), Vl-HSAVIV2 (pYG380B, d sáv), Vl-HSAVI (pYG381B, e sáv) és a HSA-V1V2 (pYG308B, f sáv) hibridfehérjék intracelluláris expresszálása K. lactis MW98-8C törzsben. A kimutatást Western biot módszerrel végezzük, HSA elleni poliklonális nyúlszérumot használva primer antitestként. Az oldhatatlan frakcióból 10 μg fehérjét vittünk fel mindegyik esetben.

34. ábra: A c-jun (BglII- Ahall-fragmens) „Leucin

Zipper”-ének beépítése a HSA- CD4 hibrid fehérjébe.

35. ábra: A CD4-receptor VIV2 doménjeihez kapcsolt csonkított HSA-variánsok szekréciója az MW98- 8C törzsben.

1. panel: Coomassie blue festés. Mindegyik sávba a korai stacioner fázisban lévő tenyészet 400 μΐ-es felülúszójának megfelelő mennyiséget viszünk fel. Az a) sávban a molekulatömeg-markerek találhatók, a b) sávban apKan707 kontrollvektorral transzformáit törzs van, a c) sávban a HSA-standard van, a d) sávban a pYG308B (HSA₅₈₅-V1V2) expressziós plazmiddal transzformált törzs van, az e) sávban a pYG334B (HSA₃₁₂-V1V2) expressziós vektorral transzformált törzs van, az f) sávban a pYG335B (HSA₃₀₀-V1V2) expressziós vektorral transzformált törzs van.

2. panel: Western Blot-kimutatás nyúl poliklonális anti-HSA antitest felhasználásával. Mindegyik sávba a korai stacioner fázisban lévő tenyészet 100 μΙ-es felülúszójának megfelelő mennyiséget viszünk fel. Az a) sávban a biotinilezett molekulatömegmarkerek találhatók (Bio-Rad), a b) sávban a pKan707 kontrollvektorral transzformált törzs van, az f) sávban a HSA-standard van, a c) sávban a pYG308B (HSA₅₈₅-V1V2) expressziós plazmiddal transzformált törzs van, a d) sávban a pYG334B (HSA₃₁₂VIV2) expressziós vektorral transzformált törzs van, az e) sávban a pYG335B (HSA₃₀₀-VIV2) expressziós vektorral transzformált törzs van.

3. panel: Western Blot-kimutatás, nyúl poliklonális anti-CD4-szérum felhasználásával. Az ábramagyarázat ugyanaz, mint a 2. panelhez.

36. ábra: (a) panel: A HSA delécióknak megfelelő

HindIII(- 25)- MstI)II restrikciós fragmensek bemutatása. Az aminosavak sorszámát (a számozás megfelel az érett HSA-nak) zárójelben mutatjuk.

HU 215 457 Β (b) panel: Az MstlI restrikciós hely pozíciójának részletei az egyik deléciós mutánsban (YP63 klón, a linker a 495-ös aminosavnál van beépítve).

37. ábra: Példák a HSA és CD4 egységek közötti kapcsolórégiókra. Azokat az aminosavpárokat, amelyeket a szekréciós bioszintézis-útban szereplő endoproteázok céloznak meg, bekereteztük.

1. panel: A HSA₅₈₅- CD4 fehérje kapcsolórégiója.

2. panel: A HSA C-terminális részének Bal31-es deléciójával kapott HSA_Bal31CD4 fehérjék kapcsolórégiója (ebben az esetben a CD4 egység kezdeténél lévő LysLys párt helyspecifikus mutagenezissel módosítottuk az E.13.2. példában leírtak szerint).

3. panel: Egy polipeptid beépítésével kapott kapcsolórégió (az ábrán a troponin C fragmense látható), amelyet az Sql445 oligodezoxi-nukleotiddal végzett helyspecifikus mutagenezissel kaptunk.

4. panel: A HSA és CD4 egységek közötti kapcsolórégió általános szerkezete.

38. ábra: A HSA és a CD4 receptor leolvasási keretben való fúziójának szerkezete, amely a pYG373B, pYG380B, pYG381B és pYG560 expressziós plazmidokon található.

(la) panel: Azokat az aminosavpárokat, amelyeket szekréciós bioszintézis-útban szerepet játszó endoproteázok céloznak meg, bekereteztük.

(lb) panel: Ezeket az aminosavpárokat módosíthatjuk a minden egyes párban szereplő második lizin mutáltatásával, ezáltal a pár már nem célpontja ezeknek az endoproteázoknak.

(2) panel: Példák a HSA- és CD4-egységek közötti kapcsolórégiókra, amelyek főleg a VI-HSA (2a panel) vagy a V1V2-HSA (2b és 2c panelek) hibridfehérjéiben találhatók meg.

(3) panel: A CD4- és a HSA-egységek közötti kapcsolórégió általános szerkezete.

Példák

Általános klónozási technikák

A molekuláris biológia klasszikus módszereit, úgymint a plazmid-DNS preparatív kivonását, a plazmidDNS centrifugálását cézium-klorid gradiensen, az agaróz és poliakrilamid gélelektroforézist, a DNS-fragmensek tisztítását elektroelúcióval, a fehérjék eltávolítását fenol/kloroformos extrakcióval, a DNS kicsapását só jelenlétében etanollal vagy izopropanollal, az Escherichia coli transzformálását stb. részletesen, bőségesen tárgyalják a szakirodalomban [Maniatis T. et al., „Molecular Cloning, a Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1982; Ausubel F. M. et al. (eds), „Current Protocols in

Molecular Biology”, John Wiley & Sons, New York, 1987], ezeket nem idézzük a továbbiakban.

A restrikciós enzimeket a New England Biolabs (Biolabs), a Bethesda Research Laboratories (BRL) vagy az Amersham cégtől szereztük be, és az előállító előírásai szerint alkalmaztuk.

A pBR322-, pUC8-, pUC19-plazmidokat, valamint az M13mp8- és M13mpl8-fágokat is vásároltuk (Bethesda Research Laboratories).

Ligálásokhoz a DNS-fragmenseket méret alapján agaróz gélen (általában 0,8%) vagy poliakrilamid gélen (általában 10%) választjuk szét, elektroelúcióval tisztítjuk, fenol/kloroformos extrakcióval tisztítjuk, etanollal kicsapjuk, majd T4 DNS-ligáz (Biolabs) jelenlétében inkubáljuk az előállító előírásai szerint.

Az 5’ végek feltöltését az E. coli DNS-polimeráz I Klenow fragmensével (Biolabs) végezzük, a gyártó előírásai szerint. A 3’ kilógó végeket T4 DNS-polimerázzal (Biolabs) távolítjuk el az előállító előírásai szerint. Az 5’ kilógó végeket enyhe Sí nukleázos kezeléssel emésztjük le.

Az in vitro helyspecifikus mutagenezist a Taylor és munkatársai által kifejlesztett módszerrel végezzük [Nucleic Acids Rés., 13, 8749-8764 (1985)], az Amersham által előállított kitet használva.

A DNS-fragmensek enzimes sokszorozását PCRtechnikával [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R. K. et al., Science, 230,1350-1354 (1985); Mullis K. B. and Falona F. A., Meth. Enzym., 155, 335-350 (1987)] „DNA thermal cycler” berendezésben (Perkin Elmer Cetus) végezzük, az előállító előírásai szerint.

A nukleotidszekvencia meghatározását a Sanger és munkatársai által kifejlesztett módszerrel végezzük [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463- 5467 (1977)], Amersham-kit felhasználásával.

A K. lactis idegen DNS-sel való transzformálását, valamint a plazmid-DNS tisztítását K. lactisból az alábbiakban írjuk le.

Hacsak külön nem jelezzük, akkor a használt baktériumtörzsek a kővetkezők: E. coli MC1060 (ZacIPOZYA, X74, gall:. galK, strA¹) vagy E. coli TG1 (lac, proA.R, supE, thi, hsdD5, FfraD36, proA+B+, lacVi, lacZ, M15).

Az összes használt élesztőtörzs a sarjadzó élesztőkhöz tartozik, pontosabban a Kluyveromyces nemzetséghez. Ezekre az élesztőtörzsekre példát a szövegben adunk. A K. lactis MW98-8C törzset (a, uraA, arg, lys, K+, pKDl°) gyakran használjuk; ezt a törzset 1988. szeptember 16-án letétbe helyeztük a Centraalbureau voor Schimmelkulturen (CBS)-nél Baarnban (Hollandia), CBS 579.88 sorszám alatt.

1. példa

A HÍV-1 vírus receptora V1V2 doménjeit kódoló MstlI/HindlII- Smal restrikciós fragmens előállítása

A VIV2 doméneknek megfelelő MstlI- Smal restrikciós fragmenst állítunk elő (V1 és V2 jelentése a CD4molekulaelső két N-terminális doménjét jelöli) enzimatikus amplifikálással (PCR), a következő stratégia alapján: a CEM13 limfoblaszt sejtvonalat, amely nagy

HU 215 457 Β mennyiségben expresszálja a CD4-receptort, használjuk a receptort kódoló mRNS forrásaként. Az össz-RNS-t először 3x 10⁸, ebből a sejtvonalból származó sejtből állítjuk elő guanídium-tiocianátos extrakcióval, Cathala és munkatársai által először közölt módszerrel [DNA, 4, 329-335 (1983)]; az ily módon preparált 50 pg RNS szolgál azután a cDNS templátjaként, az Amershamkitet, valamint aXol27 oligodezoxinukleotidot használva indító molekulaként (1. ábra). A kapott cDNS-t ezután 30 ciklusos enzimes amplifikálásnak vetjük alá PCRtechnika alkalmazásával (a hibridizáció hőmérséklete 62 °C), 1-1 pgXo!26 ésXol27 oligodezoxinukleotidot használva indító molekulaként, amint az az 1. ábrán látható. Az amplifikált fragmenst közvetlenül klónozzuk az M13mp8 Smal helyére (a vektort előzőleg defoszforileztük), így állítjuk elő az M13/CD4-vektort. Ez a vektor egy közbenső konstrukció, amely tartalmazza az MstlISmal restrikciós fragmenst, amely az MstlI-HindlIIfragmens forrása, ez a fragmens tartalmazza a CD4-molekula VIV2 doménjét; ennek a fragmensnek a nukleotidszekvenciáját láthatjuk a 2. ábrán.

2. példa

A prepro-HSA expressziós kazetta előállítása

E.2.1. A prepro-HSA-t kódoló pXL869-plazmid előállítása

A pXL322-plazmid Ndel helyét [Latta M. et al., Bio/Technology, 5, 1309- 1314 (1987)], amely apreproHSA ATG transzlációs iniciációs kodonját tartalmazza, HindlII restrikciós helyre változtatjuk helyspecifikus mutagenezissel, a következő stratégia alkalmazásával: a pXL322-plazmid HindlII-BglII-fragmensét, amely a prepro-HSA gén 5’ végét tartalmazza, M13mpl8-vektorba klónozzuk, majd az 5’-ATCTAAGGAAATA CAAGCTT- ATGAAGTGGGT- 3’ oligodezoxinukleotiddal mutagenizáljuk (a HindlII helyet aláhúztuk, és a prepro-HSA ATG kodonját kiemeltük); az említett mutagenezis-lépés után kapott fág a pXL855-plazmid, amelynek restrikciós térképét a 3. ábrán mutatjuk be. A nukleotidszekvencia igazolása után a prepro-HSA teljes kódoló szekvenciáját helyreállítjuk a mutagenizált fág replikatív formájából származó HindlII- PvuII-fragmens hozzáligálásával (amely a prepro-HSA N-terminális régióját kódolja) a pXL322-plazmid PvuII- HindlII-fragmenséhez, amely a HSA C-terminálisát tartalmazza, ezzel egy olyan HindlII-fragmenst állítva elő, amely a teljes prepro-HSA gént kódolja. Ezt a HindlII-fragmenst, amely egy 61 bp méretű nem transzlálódó régiót is tartalmaz a 3’ végén, a pUC8-plazmid megfelelő hasítási helyére klónozzuk, így állítjuk elő a pXL869-plazmidot (3. ábra).

E.2.2. Prepro-HSA expressziós kazetták készítése, amelyek a S. cerevisiae PGK promoterének szabályozása alapján expresszálódnak

A pYG12-plazmid tartalmazza a S. cerevisiae PGK génje promoterét (1,5 kb) és terminátor régióját (0,4 kb) hordozó, 1,9 kb méretű Sall-BamHI restrikciós fragmenst (4. ábra). Ez a fragmens abból a genomiális HindlII-fragmensböl származik [Mellor J. et al., Gene, 24, 1- 14 (1983)], amelyből a struktúrgénnek megfelelő

1,2 kb méretű fragmenst kivágták, és amely az ATG transzlációs iniciációs kodon, valamint a TAA transzlációs terminációs kodontól 5’ irányban 30 bázispár távolságra lévő BglII restrikciós hasítási helyet hordozó régiót tartalmazza. Az 1,9 kb méretű fragmens két szélén lévő HindlII restrikciós helyeket szintetikus oligonukleotidok alkalmazásával elrontjuk, majd egy Sáli, illetve egy BamHI restrikciós hellyel helyettesítjük, a PGK gén promoter régiójától 5’ irányban, illetve a transzkripciós terminátortól 3’ irányban. Egyetlen HindlII restrikciós helyet helyspecifikus mutagenezissel építünk be a promoter régió és a terminátor régiók kapcsolódási pontjánál; az ezt az egyetlen HindlII helyet (kiemelt nukleotidok) határoló szekvencia a következő:

5’- TAAAAACAAAAGATCCCCAAGCTTGGG GATCTCCCATGTCTCTACT- 3’.

A pYG208-plazmid egy intermedier konstrukció, amely úgy készül, hogy egy BamHI/Sall/BamHI szintetikus adaptor molekulát (5’-GATCCGTCGACG-3’) építünk be a pYG12-plazmid egyetlen BamHI helyére; a pYG208-plazmid tehát lehetővé teszi, hogy eltávolítsuk a S. cerevisiae PGK génjét egy Sáli restrikciós fragmens formájában (4. ábra).

A prepro-HSA-t kódoló HindlII-fragmenst a pXL869-plazmidból tisztítjuk elektroelúcióval, majd a „helyes” orientációban klónozzuk (ez az az orientáció, amely az albumin prepro régiójának N-terminálisát közvetlenül a PGK-promoter mögé helyezi) a pYG208plazmid HindlII helyére, így kapjuk a pYG210plazmidot. Amint az a 4. ábrán látható, a pYG210plazmid a forrása annak a Sáli restrikciós fragmensnek, amely az expressziós kazettát hordozza (PGK-promoter/prepro-HSA/PGK-terminátor).

E.2.3. Az expressziós kazetta optimalizálása

A közvetlenül az erősen expresszálódó gének ATG transzlációs iniciációs kodonja előtt található nukleotidszekvencia olyan szerkezeti jellegzetességekkel rendelkezik, ami kompatíbilis a magas szintű expresszióval [Kozák M„ Microbiol. Rev„ 47, 1-45 (1983); Hamilton R. et al„ Nucl. Acid Res„ 75, 3581-3593 (1987)]. A BamHI restrikciós hely helyspecifikus mutagenezissel való beépítését a S. cerevisiae PGK-promoterje - 25-ös pozíciójába (az ATG iniciációs kodonhoz viszonyítva) az EP 89 10480 számú európai szabadalmi bejelentésben közlik.

Emellett az Sq451 és Sq452 oligodezoxinukleotidok alkalmazását, amelyek egy HindlII-BstE adaptort képeznek, és lehetővé teszik egy olyan HindlII restrikciós fragmens létrehozását, amely tartalmazza a PGK gén ATG iniciációs kodonját megelőző 21 nukleotidot, valamint utána a prepro-HSA-t kódoló gént, ugyanebben a dokumentumban írják le. Egy ilyen expressziós kazettában az ATG kodont megelőző nukleotidszekvencia a következő (a S. cerevisiae PGK-promoterjében lévő nukleotidszekvencia alá van húzva):

5’- AAGCTTTACAACAAATATAAAAACAATG- 3’.

3. példa

A prepro-HSA leolvasási keretben való jíizionáltatása a CD4-receptor VIV2 doménjeivel

HU 215 457 Β

A prepro-HSA-V1V2 hibrid molekula leolvasási keretben való előállításában használt klónozási stratégiát az 5-9. ábrákon mutatjuk be. A pYGll-plazmid egy intermedier konstrukció, amelyben a prepro-HSA-t kódoló HindlII-fragmenst a pXL869-plazmidból tisztítjuk, és a pYG12-plazmid HindlII restrikciós helyére klónozzuk (5. ábra). A pYG18-plazmid előállítását a 6. ábrán mutatjuk be; ez a plazmid megfelel az expressziós kazettát kódoló Sáli- BamHI-fragmensnek (PGK-promoter/prepro-HSA/PGK-terminátor), amelyet a pYG 11-plazmidból tisztítottunk, és a pIC20R-plazmid megfelelő helyére klónoztuk [Marsh F. et al., Gene, 32, 481-485 (1984)].

A CD4-receptor VIV2 doménjeit hordozó MstI- Smal restrikciós fragmenst, amelyet az 1. példában leírt módon állítunk elő, a pYG18-plazmidba klónozzuk (ugyanazokkal az enzimekkel hasítjuk előtte), így állítjuk elő pYG303 rekombináns plazmidot, amelynek a restrikciós térképét a 7. ábrán látjuk. Tehát a pYG303-plazmid egy olyan HindlII-fragmenst hordoz, amely megfelel a teljes prepro-HSA gén és ezt követően a CD4-receptor VIV2 doménjei leolvasási keretben való fúziójának; a 8. ábrán látható ennek a fragmensnek a nukleotidszekvenciája. Ezt a fragmenst klónozzuk azután a pYG208-plazmid HindlII restrikciós hasítási helyére: ennek, a prepro-HSA- VIV2 gént tartalmazó fragmensnek a beépítése a megfelelő orientációban a pYG208-plazmidba, hozza létre a pYG306plazmidot, amelynek a restrikciós térképét a 9. ábrán mutatjuk be. A pYG306-plazmid egy Sáli restrikciós fragmenst hordoz, amely tartalmazza az expressziós kazettát (PGK-promoter/prepro-HSA- VIV2/PGKterminátor).

4. példa

A pKDl-replikonból származó stabil klónozó vektorok előállítása

E.4.1. A pkDl-plazmid izolálása és tisztítása

A pKDl-plazmidot a K. drosophilarum UCD 51-130 törzsből izoláltuk (U.C.D. gyűjtemény, University of California, Davis, CA 95616), a következő protokoll szerint: 1 liter, YPD-táptalajban (1% élesztökivonat, 2% Bacto pepton, 2% glükóz) készült tenyészetet lecentrifugálunk, mosunk, majd 1,2 mol/1 szorbitoldatban szuszpendálunk, a sejteket zymolyase (300 pg/ml), 25 mmol/1 EDTA, 50 mmol/1 foszfát és 1 pg/ml β-merkapto-etanol jelenlétében szferoplaszttá alakítjuk. Miután 1,2 mol/l-es szorbitoldatban mostuk, az eredeti tenyészet 250 ml-ének megfelelő mennyiségű szferoplasztot 2,5 ml 1,2 mol/l-es szorbitoldatban szuszpendálunk, amelyhez azonos térfogatú puffért adtunk (25 mmol/1 TRIS-HC1 pH= 8,0; 50 mmol/1 glükóz; 10 mmol/1 EDTA). A következő lépések megfelelnek a már ismert, közölt lúgos lízis protokollnak [Bimbóim H. C. and Doly J. C., J. Nucleic Acids Rés., 7, 1513- 1523 (1979)]. A DNS-t sűrűségi egyensúlyi gradienssel tisztítjuk, cézium-klorid gradiensen.

E.4.2. A pCXJl-plazmid előállítása

A pUC- URA3 intermedier konstrukció (10. ábra) a

5. cerevisiae URA3 génjét hordozó 1,1 kb méretű fragmenst tartalmazza a pUC19 egyetlen Narl restrikciós helyére klónozva a következők szerint: az URA3 gént kódoló HindlII-fragmenst apG63-plazmid HindlII restrikciós enzimes emésztésével tisztítjuk [Gerbaud C. et al., Curr. Génét., 3, 173-180 (1981)]; a fragmenst ezután az E. coli DNS-polimeráz I Klenow fragmensével kezeljük, így állítunk elő tompa végeket, elektroelúcióval tisztítjuk, majd beépítjük a pUC19plazmidba, amelyet előzőleg Narl restrikciós enzimmel emésztettünk, és E. coli DNS-polimeráz I Klenow fragmensével kezeltünk.

A pCXJl-plazmid (11. ábra) tartalmazza a pKDlplazmid teljes nukleotidszekvenciáját a pUC-URA3plazmid egyetlen AatlI helyére beépítve, a következők szerint: a pKDl-plazmidot EcoRI-es emésztéssel linearizáljuk, majd tompa végűvé alakítjuk E. coli DNS-polimeráz I Klenow fragmensével kezelve. Ezt a fragmenst azután a pUC-URA3-plazmidba Egáljuk, amelyet előtte AatlI restrikciós enzimmel hasítottunk, és T4 DNS-polimerázzal tompa végűre alakítottunk: a tompa végű EcoRI-fragmenst tompa végű AatlI helyre klónozva helyreállítunk két EcoRI hasítási helyet. Meg kell jegyezni, hogy a pKDl-plazmidot az EcoRI helyen linearizálva nem inaktiválunk egyetlen olyan gént sem, amely a plazmid stabilitásához és a kópiaszám tartásához szükséges, mivel az EcoRI hasítási hely az A, B és C géneken kívül található, valamint a pKDl fordított ismétlődő szekvenciáin kívül is. Tény, hogy a pCXJl-plazmid a K. lactis uraA cir’ sejteket magas frekvenciával transzformálja, 70- 100 kópia található belőle sejtenként, és stabilan fenntartható szelekciós nyomás nélkül is. A pUC- URA3-plazmidon lévő replikációs origó következtében a pCXJl-plazmid képes E. coliban is szaporodni, ezáltal egy különösen előnyös ingázó vektor az E. coli és számos, a Kluyveromyces nemzetségbe tartozó élesztötörzs, például K. lactis, K. fragilis és K. drosophilarum között. A pCXJl felhasználása Kluyveromyces transzformálására alkalmas vektorként azonban csak azokra a törzsekre korlátozódik, amelyek kromoszomális uraA mutációt hordoznak.

E.4.3. A K. lactis killer plazmidjának ORF-ja és a Tn903 transzpozon bakteriális aph[3’]-I génje közötti leolvasási keretben maradó fúzió előállítása

A pKan707-plazmidot vad típusú élesztőkben használandó vektornak készítették. Ezt a plazmidot úgy állították elő, hogy a Tn903 baktérium transzpozon 3’-aminoglikozid-foszfotranszferázt (APH) kódoló aph[3’]-I génjét, amely egy élesztő promoter szabályozásával expresszálódik, a pCXJl-plazmid Sáli restrikciós helyére építették be.

Az első lépésben az aph[3’]-I gén bakteriális transzkripciós jeleit helyettesítjük a K. lactis ki killer plazmidjából izolált P_kl-promoterrel a következők szerint: a ki-plazmid 1,5 kb méretű Seal-Pstl-fragmensét a pBR322-plazmid megfelelő helyére klónozzuk, így állítjuk elő a pkl- PS1535-6-plazmidot (12. ábra); ez az 1,5 kb méretű fragmens tartalmazza a kl-plazmidon lévő első nyílt leolvasási keret (ORF1) 5’ régióját, valamint körülbelül 220 bázist 5’ irányban [Sor F. and

1

HU 215 457 Β

Fukuhara H., Curr. Génét., 9, 147- 155 (1985)]. A tisztított Seal-Pstl-fragmens valószínűleg tartalmazza az ORF1 teljes promoter-régióját, mivel a Seal hasítási hely csak 22 nukleotid távolságra van a ki-plazmid szélétől [Sor F. et al., Nucl. Acids Rés., 11, 5037-5044 (1983)]. A pKl- PS1535-6 emésztése Ddel restrikciós enzimmel egy olyan 266 bp méretű fragmenst eredményez, amely 17 bp-t tartalmaz a pBR322-plazmidból a Seal végen, és az ORF1 első 11 kodonját a másik végen.

A pUC-kanl egy intermedier konstrukció, amelyet úgy kapunk, hogy a Tn903 aph[3’]-I génjét hordozó 1,25 kb méretű EcoRI-fragmenst (Kanamycin Resistance Gene Block™, Pharmacia) a pUC19-plazmid EcoRI helyére klónozzuk (13. ábra). A pKl- PS1535-6plazmidból származó 226 bp méretű fragmenst az E. coli DNS-polimeráz I Klenow fragmensével kezeljük, majd elektroelúcióval tisztítjuk poliakrilamid gélen, utána a pUC-kanl SÍ nukleázzal kezelt Xhol helyére építjük be; így kapjuk a pUC- kan202-plazmidot (13. ábra). Ez a klónozási stratégia egy leolvasási keretben lévő fúziót hoz létre a ki-plazmid ORF1 génje és a Tn 903 aph[3’]-1 génje N-terminális része között: a fúzióban az aph[3’]-I gén termékének első 11 aminosavát az

ORF1 első 11 aminosavával helyettesítjük, és ennek a génnek az expressziója a K. lactis promoter szabályozása alatt áll. Az ORF1-APH fúziós fehérje iniciációs kodonját körülvevő nukleotidszekvencia a következő (az ORF 1-ból származó kodonok alá vannak húzva, az APH első kodonjai dőlt betűkkel vannak jelölve):

TTACATTATTAATTTAAAAATGGATTTCAAAAGATAAG

GCTTTAAATGATCTAAGGCCGCGAT7AAATTCCAAC...-3

E.4.4. A pKan707-plazmid készítése és stabilitása K. lactisban

A pCXJl-plazmidot HindlII restrikciós enzimmel hasítjuk, az E. coli DNS-polimeráz I Klenow fragmensével kezeljük, majd a pUC-kan202-plazmidból származó K. lactis P_kl-promoter szabályozása alatt álló ORF1-APH fúziós fehérjét kódoló 1,2 kb méretű Seal-HindlI-fragmenssel ligáljuk. A kapott plazmid (pKan707, 14. ábra) magas szintű G418-rezisztenciát biztosít (Geneticin, GIBCO, Grand Island, N. Y.) K. lactis törzsekben (>2,5 g/1), képes aK. lactis cir’ törzseket transzformálni a pKDl replikon funkcionális egysége miatt, kópiaszáma elérheti a 70- 100-at sejtenként, és szelekciós nyomás nélkül is stabilan fenntartható (15. ábra). Ez a nagy stabilitás, összekötve a Kluyveromyces ipari törzs transzformálását lehetővé tevő domináns genetikai bélyeg jelenlétével, a pK707-plazmidot a Kluyveromyces nemzetségbe tartozó élesztőkben való fehérjeexpresszióhoz használható nagy teljesítményű vektorrá teszi.

5. példa

A pYG221B (prepro-HSA) és a pYG308B (prepro-HSA- V1V2) expressziós plazmidok előállítása

A S. cerevisiae PGK-promoterjének szabályozása alatt expresszálódó prepro-HSA-VIV2 hibridfehérjét kódoló Sáli restrikciós fragmenst elektroelúcióval tisztítjuk a megfelelő enzimmel hasított pYG306plazmidból, majd a pKan707-plazmid Sáli helyére klónozzuk, így állítjuk elő a pYG308A- és pYG308Bplazmidokat, amelyek csak a Sall-fragmens és a pKan707-vektor egymáshoz viszonyított orientációjában különböznek. A pYG308B-plazmid restrikciós térképét a 16. ábrán mutatjuk be.

A pYG221B egy kontrollkonstrukció, amely csak a prepro-HSA-t kódolja; ezt a plazmidot a pYG308B (prepro-HSA-VIV2) plazmid mintájára állítjuk elő. A PGK-promoter szabályozása alatt expresszálódó prepro-HSA-t kódoló Sall-fragmenst a pYG210-plazmidból nyerjük ki, a pKan707-plazmid Sáli restrikciós helyére klónozzuk, így kapjuk a pYG221B-plazmidot (17. ábra). A pYG221B (prepro-HSA) és a pYG308B (preproHSA-VIV2) plazmidokban a Sáli expressziós kazettának azonos az orientációja, és teljesen izogének, egyetlen kivétellel, hogy az MstlI- HindlII-fragmens közvetlenül a PGK-terminátor előtt található. A pYG221-plazmidban (prepro-HSA) lévő MstlI-HindlII-fragmens nukleotidszekvenciája a következő (a prepro-HSA gén transzlációs stop kodonja kiemelten van nyomtatva):

5-CCTTAGGCTTATAACATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTA

CC ATG AG A ATA AG AG A A AG A A A ATG A AG ATC A A A AGCTT- 3 ’.

A pYg308B-plazmid MstlI-HindlII-fragmensének nukleotidszekvenciáját a 2. ábrán lévő MstlI-Smalfragmens szekvenciájában láthatjuk.

6. példa

Élesztők transzformálása

A Kluyveromyces nemzetségbe tartozó élesztők, főleg a K. lactis MW98-8C törzsek transzformálását az ép sejtek lítium-acetátos kezelésével végezzük [Ito H. et al., J. Bacteriol., 153, 163- 168 (1983)], a módszert a következők szerint adaptálva. A sejteket 50 ml YPD-táptalajban növesztjük 28 °C-on rázatva, amíg a

0,6-0,8 optikai sűrűséget el nem érik, ekkor a sejteket kis sebességű centrifugálással összegyűjtjük, steril TEpufferben mossuk (10 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,4; 1 mmol/1 EDTA), szuszpendáljuk 3-4 ml lítium-acetátban (0,1 mol/1 TE-pufferben) 2x 10⁸ sejt/ml sűrűségben, majd 1 órán át 30 °C-on inkubáljuk enyhe rá55 zatás közben. A kompetens sejtek kapott szuszpenziójából 0,1 ml-es alikvot részeket 30 °C-on inkubálunk DNS és polietilén-glikol (PEG 4000, Sigma, 35% végkoncentráció) jelenlétében. Egy ötperces, 42 °C-os hősokk után a sejteket kétszer mossuk, 0,2 ml steril vízben szuszpendáljuk, majd 16 órán át 28 °C-on o

HU 215 457 Β inkubáljuk 2 ml YPD-ben, hogy lehetővé tegyük a Pkr promoter szabályozása alatt álló ORF1-APH fúziós fehérje fenotipikus expresszióját; a kapott sejtszuszpenzióból 200 μΐ-t YPD szelekciós agarlemezre szélesztünk (G418, 200 μg/ml). A lemezeket 28 °C-on inkubáljuk, a transzformánsok 2-3 napos növekedés után tűnnek fel.

7. példa

A Kluyveromyces nemzetségbe tartozó élesztők albumin-, illetve albuminvariáns-expressziója

G418 antibiotikummal kiegészített gazdag táptalajon való szelekció után vizsgáljuk a rekombináns kiónoknak azt a képességét, hogy mennyire képesek az albumint vagy a HSA- VIV2 hibridfehérjét expresszálni. A pYG221B (prepro-HSA) vagy pYG308B (preproHSA- VI V2) plazmidokkal transzformált MW98-8C törzs bizonyos kiónjait szelektív gazdag folyékony táptalajban inkubáljuk 28 °C-on. A tenyészetek felülúszóit centrifugálással nyerjük ki, miután a sejtek elérték a stacioner fázist, majd 60%-os etanollal kezeljük 30 percig 20 °C-on, így csapva ki belőle a fehérjéket. A felül úszóból kicsapott fehérjéket 8,5%-os poliakrilamid gélen való elektroforézis után vizsgáljuk, akár a gél közvetlen Coomassie blue-val való festésével (18. ábra, A panel), akár immunblottal, primer antitestként nyúl poliklonális anti-HSA szérumot (18. ábra, B panel) vagy nyúl poliklonális anti-CD4 szérumot használva (18. ábra, C panel). Az immunblot-kísérleteknél a nitrocellulóz szűrölapokat először specifikus nyúl antitestek jelenlétében inkubáljuk, majd néhányszor mossuk, utána biotinilezett kecske anti-nyúl lg szérummal inkubáljuk, végül avidin-peroxidáz komplex jelenlétében inkubáljuk, a Vectastatin (Biosys S. A., Compiégne, Francé) által forgalmazott „ABC” kit felhasználásával. Az immunológiai reakciót ezután diamino-3,3’benzidin-tetrakloridáttal (Prolabo) hívjuk elő oxigénezett víz jelenlétében, a kithez mellékelt előírások szerint. A 18. ábrán látható eredmények azt mutatják, hogy a HSA-V1V2 hibridfehérjét mind az anti-HSA antitestek, mind az anti-CD4 antitestek felismerik, míg a HSA-t csak az anti-HSA antitestek ismerik fel.

8. példa

A szekretált termékek tisztítása és molekuláris szintű jellemzése

A pYG221B (prepro-HSA) és pYG308B (preproHSA-VIV2) plazmidokkal transzformált MW98-8C K. lactis törzseknek megfelelő tenyészet-felülúszók etanolos kicsapása után a csapadékokat 50 mmol/l-es TRIS-HC1 (pH= 8,0) pufferben oldjuk. A HSA- CD4 és HSA fehérjéket affinitás-kromatográfiával tisztítjuk Trisacryl-Blue-n (IBF). További tisztítást végezhetünk ioncserélő kromatográfiával, ha szükséges. Eluálás után a fehérjetartalmú frakciókat egyesítjük, vízzel szemben dializáljuk, és jellemzés előtt liofilezzük. A K. lactis MW98- 8C törzs által szekretált hibridfehérje szekvenálása (Applied Biosystem) kimutatta az albumin várt (Asp-Ala-His...) N-terminális szekvenciáját, igazolva ezzel a fehérje korrekt érési folyamaton való átesését.

Az izoelektromos pontot izoelektromos fókuszálással meghatározva 5,5-ös értéket kapunk a HSA-V1V2 fehérjére és 4,8-at a HSA-ra.

A HSA- VIV2 fehérjét felismerik a humán CD4 elleni egér OKT4A és Leu3 monoklonális antitestek, valamint a poliklonális anti-HSA szérum (19. ábra), és ELISA-módszerrel vizsgálható (ELISA: enzimhez kötött immun-szorbens vizsgálat, 20. ábra). Az ebben a két kísérletben használt peroxidáz szubsztrát a 2-2’-azinobisz-(3-etil-benzotiazolin-6-szulfonsav)-diammóniumsó (ABTS) (Fluka, Svájc).

9. példa

A HSA- CD4-variánsok antivirális tulajdonságainak jellemzése

Az albuminnak megfelelő fehérjét (negatív kontroll), valamint a HSA- VIV2 fúziós fehérjének megfelelő fehérjét, amelyet a 7„ illetve 8. példa szerint a pYG221B (prepro-HSA) és pYG308B (preproHSA-V1V2) plazmidokkal transzformált K. lactis MW98- 8C törzsek tenyészetének felülúszójából tisztítunk, in vitro vizsgáljuk vírusellenes hatás szempontjából, és a CHO (aranyhörcsög petefészek) sejtekből izolált teljes, oldható CD4-molekulához hasonlítjuk. A fehérjekoncentrációkat mol/l-ben fejezzük ki, és vagy olyan módszerrel határozzuk meg, hogy a fehérjét oldatban mérjük, vagy a fehérjékből készített sorozathígításokat hasonlítjuk össze poliakrilamid gélen végzett elektroforézis, majd ezüstnitrátos festés után.

A 21. ábrán látható, hogy a HSA-V1V2 fúziós fehérje képes in vitro gátolni a gpl60 virális glikoprotein (a gpl20 hasítatlan prekurzora) kötődését a CD4-receptorhoz folyadékfázisban. Ebben a kísérletben az ELISA-lemezeket tisztított rekombináns CD4-gyel borítjuk, majd rekombináns gpl60-nal (125 femtomól) inkubáljuk, miután különböző mennyiségű CD4-gyel, albuminnal vagy HSA-VlV2-vel előinkubáltunk. A gpl60 és a CD4 közötti maradék kötődést ezután egér monoklonális anti-gpl60 (110,4) hozzáadásával határozzuk meg, peroxidázhoz kapcsolt, egér-antitestek elleni kecskeszérum hozzáadásával. Kromogén szubsztrát (orto-fenilén-diamin) oxigénezett víz jelenlétében való hozzáadása után az optikai sűrűséget 492 nm-en mérjük. A 21. ábrán látható eredmények azt mutatják, hogy a HSA- VIV2 hibridfehérje képes meggátolni a gpl60 CD4-hez való kapcsolódását folyadékfázisban, olyan módon, hogy az megkülönböztethetetlen a teljes CD4-molekulának megfelelő pozitív kontrolitól. Ezzel szemben az albuminmolekula ebből a szempontból majdnem teljesen inaktív. Ez a kísérlet azt mutatja, hogy a hibridfehérje által okozott gátlás a VlV2-domének jelenlétének a következménye, amelyek a teljes CD4-receptorhoz hasonló konformációban, hozzáférhetőségben találhatók meg a molekulán.

A 22. ábrán az látható, hogy a HSA-VIV2 hibrid képes meggátolni a HÍV- 1 vírus kötődését olyan sejtekhez, amelyek a CD4-receptort a membránjukra expresszálják. Ebben a kísérletben azt a sejtvonalat, amely nagy mennyiségben expresszál CD4-receptort (CEM13 limfoblaszt sejtvonal), 2 μg olyan, hővel inak1

HU 215 457 Β ti vált vírusrészecskével inkubáljuk, amelyet 116 pikomól HSA- VlV2-vel (10,7 pg), HSA-val (7,5 pg) vagy CHO-sejtekböl tisztított rekombináns teljes CD4-gyel elöinkubáltunk. Az inaktivált vírusrészecskéknek a sejtmembránhoz való kötődését úgy mutatjuk ki, hogy ezt követően egér monoklonális anti-gpl20 antitesttel, majd fikoeritrinnel jelzett kecske anti-egér IgG-szérummal inkubáljuk a sejteket. A negatív kontroll olyan CEM13sejtvonal, amelyet egymás után inkubáltunk a két antitesttel. A fluoreszcenciát sejtosztályozóval mérjük (22. ábra, A panel), majd az eredményeket hisztogram formájában mutatjuk be (22. ábra, B panel). Ez a kísérlet azt mutatja, hogy HSA-V1V2 fehérje képes majdnem teljesen meggátolni a HÍV- 1 vírusnak a CEM13-sejtekhez való kapcsolódását. Továbbá, ez a gátlás egy kicsit magasabb, mint a CD4-molekuláé; ez azzal a ténnyel magyarázható, hogy az albumin, amely adhezív tulajdonságairól ismert, képes meggátolni a vírusnak a célsejthez való kötődését aspecifikus módon, alacsony hatékonysággal.

A HSA- CD4-fehérje képes megakadályozni a permisszív sejtek vírusfertőzését sejttenyészetben. Ezt a gátlást a vírus antigén (p24) termelésének vizsgálatával, az ELAVIA-AG1 kitet (Diagnostics Pasteur) vagy a p-24 kitet (DuPont) használva mérjük, vagy a reverz transzkriptáz enzim aktivitásának mérésével, Schwartz et al. módszerét alkalmazva [AIDS Research and Humán Retroviruses, 4, 441-448 (1988)]. A kísérleti protokoll a következő: a vizsgált terméket X végkoncentrációban elősző· olyan CEM13-sejtek felülúszójával elóinkubáljuk, amelyeket a HÍV- 1 vírus LAV- Brul izolátumával fertőztünk (hígítás: 1/250, 1/2500 és 1/25 000), 1 ml össztérfogatú tenyésztáptalajban (RPMI 1640, amely 10% borjúmagzatszérumot, 1% L-glutamint és 1-1% penicillint, streptomycint és neomycint tartalmaz). Az elegyet ezután 5x 10⁵ permisszív sejtüledékére visszük (például MT2, CEM13 vagy H9), majd csövekben 2 órán át 37 °C-on inkubáljuk a fertőzés előidézésére. A fertőzést végezhetjük mikrotiter lemezeken is, 10⁴ sejtet használva mélyedésenként 100 pl komplett táptalajban. A vizsgálandó termékkel elóinkubált 100 pl vírust adjuk ezután hozzá, majd 50 pl 5X koncentrációjú terméket adunk hozzá. A sejteket ezután kétszer mossuk 5 ml RPMI 1640 oldattal, majd 2,5x 10⁵ sejt/ml sűrűségben szuszpendáljuk tény észfolyadékban. Ebből a szuszpenzióból 100 pl-es alikvotokat mérünk olyan mikrotiter lemezek minden egyes mélyedésébe, amelyek már 100 pl 2X koncentrációjú terméket tartalmaznak, majd a lemezeket 37 °C-on inkubáljuk nedves, 5% szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában. Különböző napokon (N3-N4-N6-N8-N10-N12-N14-N16-N19-N21 és N25) 100-100 pl felülúszót eltávolítunk, és a p24 vírustermelést, valamint a reverz transzkriptáz-aktivitást vizsgáljuk. A sejteket ezután szuszpendáljuk, és mikrotiter lemezekre osztjuk szét a sejt-életképesség (MTT) meghatározása céljából az alábbiak szerint. Az eredeti lemezeken maradó 50 pl oldathoz 200 pl olyan tenyészfolyadékot adunk, amely X koncentrációban tartalmazza a vizsgálandó terméket, majd a fertőzést a következő mintavételezésig hagyjuk lejátszódni. A sejt életképességének vizsgálatához minden egyes mélyedésbe 0,2 pm-es szűrőn szűrt, 5 mg/ml koncentrációjú MTTból 10 pl-t adunk, majd a lemezeket 4 órán át 37 °C-on inkubáljuk 5% szén-dioxidot tartalmazó nedves atmoszférában. Ezután mindegyik mélyedésbe 150 pl izopropanol/0,04 normál HCl-elegyet adunk, és a Formazánkristályokat szuszpendáljuk. Az optikai sűrűséget 520- 570 nm között mérjük Titertek lemezleolvasón; ez a mérés ad információt a sejtek életképességéről [Schwartz et al., AIDS Research and Humán Retroviruses, 4,441-448 (1988)].

A 23. ábrán arra látunk példát, hogy a sejttenyészetek (CEM13 sejtvonal) fertőződését mérjük reverz transzkriptáz-aktivitás alapján. Ez azt mutatja, hogy a HSA-V1V2 hibrid képes csökkenteni a HÍV- 1 vírus fertözöképességét ugyanolyan mértékben, mint az oldható CD4-molekula.

10. példa

A hibridfehérjék in vivő stabilitása

Azt már korábban kimutatták, hogy az első generációs CD4 felezési ideje 20 perc nyulakban [Capon D. J. et al., Natúré, 337, 525-531 (1989)]. Ezért összehasonlítottuk a HSA- CD4 hibrid, az oldható CD4, valamint élesztőben előállított és a HSA- CD4-hez hasonló módon tisztított rekombináns HSA felezési idejét. Ezekben a kísérletekben legalább két, 2,5-2,8 kg testtömegű nőstény NZW(Hy)/Cr nyulat használtunk mindegyik termékre. A nyulakat 18,5-20,5 °C-on és 45-65%-os páratartalmú szobákban tartjuk, napi 13 órás megvilágítással. Mindegyik terméket egyetlen, 10 másodpercig tartó injekció formájában adjuk be a fül szélső erébe. Mindegyik termékből azonos moláris mennyiséget adunk be: 250 pg CD4/nyúl, 400 pg HSA/nyúl vagy 500 pg HSA- CD4/nyúl, 1 ml fiziológiás szérumban. Három-négy milliliter vérmintákat veszünk, lítiumheparináttal keverjük össze, majd 15 percig 3500/perc fordulatszámmal centrifugáljuk; a mintákat három alikvot részre bontjuk, gyorsan lefagyasztjuk -20 °Con, majd ELISA-módszerrel mérjük. A CD4-gyel injekciózott nyulakból vérmintákat az injekciózás előtt (T_o), majd 5, 10, 20, 30 perccel, 1, 2, 4 és 8 órával injekciózás után veszünk. A HSA- CD4-gyel vagy HSA-val injekciózott nyulakból vérmintát T_o időpontban, valamint az injekciózás után 30 perccel, 1, 2,4, 8, 24, 32,48, 56, 72, 80, 96,104 és 168 órával veszünk.

A CD4-molekulák mérését Dynatech M129B mikrotiter lemezeken végezzük, amelyeket előzőleg HSA- CD4 hibridfehérjével borítottunk. Ezután növekvő koncentrációban adjuk hozzá a CD4-et vagy a vizsgálandó mintákat egér monoklonális OKT4A monoklonális antitest jelenlétében (Ortho-Diagnostic, a hígítás 1/1000); a lemezek inkubálása és mosása után az OKT4A antitest megmaradt kötődését peroxidázhoz kötött, egér IgG elleni antitest segítségével (Nordic, a hígítás 1/1000) mutatjuk ki. A méréseket 405 nm-en mért OD-vel követjük ABTS peroxidáz szubsztrát jelenlétében (Fluka).

A rekombináns HSA vizsgálatát Dynatech M129B mikrotiter lemezeken végezzük, amelyeket előzőleg an1

HU 215 457 Β ti-HSA szérummal borítottunk (Sigma A0659, a hígítás 1/1000); ezután a HSA-t vagy a mérendő mintákat növekvő koncentrációban adjuk hozzá, majd peroxidázhoz kötött anti-HSA szérumot adunk hozzá (Nordic, a hígítás 1/1000). A méréseket a fentiek szerint 405 nmen mért OD meghatározásával végezzük.

Két különböző meghatározást végzünk a HSA- CD4 hibrid esetében: vagy csak a HSA-részt mérjük, a rekombináns HSA mérésére használt módszerrel, vagy a HSA-rész meghatározására használt módszert a CD4 meghatározására használt módszerhez kötve. Ez utóbbi esetben a mikrotiter lemezeket először anti-HSA szérummal borítjuk (Sigma A0659, a hígítás 1/1000), majd a vizsgálandó mintákkal inkubáljuk. Ezután a CD4 elleni egér Leu3A monoklonális antitestet adjuk hozzá, majd a peroxidázhoz kötött egér-antitest elleni antitesteket adjuk hozzá (Nordic, a hígítás 1/1000). A méréseket a fentiekben ismertetett módon 405 nm-en végezzük.

Ezeknek a vizsgálatoknak a görbéit látjuk a 24. ábrán. Az eredmények értelmezése lehetővé teszi az egyes termékek farmakokinetikai jellemzőinek meghatározását nyálban. Az egyes termékekre meghatározott felezési idők az alábbiak:

CD4 0,25+0,1 óra

HSA 47± 6 óra

HSA-CD4 34±4óra

Ezek az eredmények a következőket mutatják:

1) A CD4 albuminhoz való kötése jelentős növekedést eredményez a CD4-nek a vizsgált szervezetben való stabilitásában, mivel a kiürülés felezési ideje 140-szeresre nőtt.

2) A HSA- CD4 hibrid eliminálásának felezési ideje összevethető a HSA-éval.

3) A CD4 kiürülési sebessége körülbelül 3 ml/perc/kg, míg a HSA-é és a HSA-CD4-é körülbelül 0,02 ml/perc/kg.

4) A HSA-CD4 hibrid CD4 egysége láthatóan megtartja az aktív konformációját (azaz képes megkötni a gpl20-at), mivel a CD4 mérése a Leu3 A monoklonális antitest használatát foglalja magába, amely a gpl20 kötési helyéhez közeli epitópot ismer fel [Sattentau Q. J. et al., Science, 234, 1120-1123 (1986); Peterson A. and Seed B., Cell, 54, 65-72 (1988)]. Emellett a HSA-CD4 hibrid meghatározásában alkalmazott két független módszer lényegében ugyanazt az eredményt adta, ami azt mutatja, hogy a CD4rész nem bomlik le gyorsabban in vivő.

Megjegyzésre érdemes, hogy a HSA és a HSA- CD4 eloszlása közel van a vérrel elérhető részek eloszlásához, ezért a terméknek az extracelluláris részekre korlátozott eloszlását sugallja.

11. példa

A HSA- CD4 közismert módon való előállítása

E.ll.l Ahall és Bglll hasítási helyek bejuttatása a HSA prepro régiójába

Az Aha restrikciós helyet helyspecifikus mutagenezissel építjük be, a pYG232-plazmid és az Sql 187 oligodezoxinukleotid felhasználásával, így állítjuk elő a pYG364-plazmidot. A pYG232-plazmidot úgy állítjuk elő, hogy a prepro-HSA-t kódoló HindlII-fragmenst az M13mp9-vektorba klónozzuk. Az Sql 187 oligodezoxinukleotid szekvenciája a következő (az Aha restrikciós helyet kiemelten nyomtattuk):

5’-GTGTTTCGTCGAGACGCCCACAAGAGTGA

GG-3’.

Megjegyzendő, hogy az Ahal hely bevitelével nem módosítjuk az érett HSA N-terminális részének fehérjeszekvenciáját. A pYG364-plazmid készítését a 25. ábrán mutatjuk be.

A pYG233-plazmidot analóg módon állítjuk elő a pYG232-plazmid helyspecifikus mutagenezisével, az Sq648 oligodezoxinukleotidot használva (a HSA prepro régiójának végén található Arg-Arg aminosav párt meghatározó kodonok kiemelten vannak nyomtatva, a Bglll hely alá van húzva):

5’- GGTGTGTTTCGTAGATCTGCACACAAGAGT GAGG-3’.

Ennek a restrikciós helynek a bevitele nem változtatja meg a HSA prepro régiójának a fehérjeszekvenciáját. Viszont az érett fehérje első aminosavát aszparaginsavról szerinre változtatja; tehát apYG233-plazmid az N-terminálison módosított érett HSA-t kódol (HSA*, 25. ábra).

E.11.2. A HSA prepro régiójának beépítése a CD4receptor elé

A HSA prepro régiójának a CD4-receptor VIV2 doménjei elé való építését helyspecifikus mutagenezissel végezzük, így állítjuk elő a pYG347plazmidot, amint azt a 26-27. ábrán bemutatjuk. A pYG231-plazmid egy intermedier konstrukció (26. ábra), amennyiben egy olyan pUC-típusú replikonnak felel meg, amelybe a HSA expressziós kazettát hordozó Sall-fragmens van beépítve (élesztő promoter/preproHSA/S. cerevisiae PGK-terminátor). A pYG234plazmid izogén a pYG231-plazmiddal, azzal a különbséggel, hogy az Sq648 dezoxioligo-nukleotidot használjuk az in vitro mutagenezis kivitelezésére (E.ll.l.).

A pYG347-plazmidot a pYG332-plazmid helyspecifikus mutagenezisével állítjuk elő az Sql092 oligodezoxinukleotid felhasználásával (27. ábra), amelynek a szekvenciája a következő (a HSA-szekvencia dőlt betűkkel van nyomva, a CD4-szekvencia aláhúzva):

5’- CCAGGGGTGTGTTTCGTCGAAAGAAAGTGG TGCTGGGC-3’.

Tehát a pYG347-plazmid egy olyan HindlII-fragmenst hordoz, amely tartalmazza a S. cerevisiae PGK génje ATG kodonját megelőző 21 nukleotidot, az ATG transzlációs iniciációs kodont, valamint a HSA prepro régióját (LP_hsa), amelyet azonnal követ a CD4-receptor VIV2 doménje.

E.11.3. Ahall restrikciós hely beépítése a CD4-receptor VI doménje végére

Egy Ahall restrikciós hely beépítését a CD4-receptor V2 doménje végére helyspecifikus mutagenezissel végezzük, az Sql 186 oligodezoxi-nukleotid és a pYG368-plazmid felhasználásával, így állítjuk elő a pYG363-plazmidot (28. ábra). Az Sql 186 oligodezoxi1

HU 215 457 Β nukleotid szekvenciája az alábbi (az Ahall helyet kiemelten nyomtatjuk):

5’- GCTAGCTTTCGACGCCGGGGGAATTCG- 3’. Tehát a pYG363-plazmid egy olyan HindlII-Ahallfragmenst hordoz, amely tartalmazza a S. cerevisiae PGK génje ATG kodonját megelőző 21 nukleotidot, ezt követi a HSA prepro régióját kódoló szekvencia a CD4-receptor VIV2 doménjeihez fuzionálva. Ebben az adott fúzióban a VIV2 domének 179 aminosavat tartalmaznak.

A pYG363-plazmid egyéb variánsait hely specifikus mutagenezissel állítjuk elő abból a célból, hogy egy Ahall helyet vigyünk be a CD4-receptor V2 doménje különböző helyeire. Részletesebben, a pYG511-plazmid (28. ábra) nem tartalmazza a Lys-Lys aminosavpárt a V2 dómén 166- 167-es pozíciójában; ez a használt oligodezoxinukleotid következménye (Sql252; az Ahall hasítási helyet kiemelten nyomtatjuk):

5’- GCAGAACCAGAAGGACGCCAAGGTGGAG TTC-3’.

E.11.5. A VI-HSA típus közismert módon való előállítása

A megelőző példákban leírt plazmidok lehetővé teszik olyan, a hibridfehérjéket kódoló HindlII restrikciós fragmensek előállítását, amelyekben a HÍV- 1 vírus receptora (a HSA szignálszekvenciájához fuzionáltatva) megelőzi a HSA-t. Például a pYG362- és pYG364plazmidok a forrásai egy HindlII-Ahall-fragmensnek (a HSA prepro régiója a CD4-receptor V1 doménjéhez fuzionáltatva), valamint egy Ahall-Ncol-fragmensnek (az E. 11.1. példában előállított érett HSA N-terminális régiója). Ezeknek a fragmenseknek a ligálását az Ncol-KpnI-fragmenssel (a HSA C-terminális régiója, valamint a S. cerevisiae PGK génjének terminátora) egy analóg, HindlII és KpnI restrikciós enzimekkel hasított pYG18-plazmidban, állítja elő a pYG371-plazmidot, amelynek a szerkezetét a 29. ábrán láthatjuk. Ebben a plazmidban a HSA prepro régiójához fuzionált VI-HSA hibridfehérjét kódoló gént egy élesztőben működő expressziós kazettába klónozzuk. Ezt a kazettát lehet azután egy élesztőben szelektálható replikatív vektorba klónozni, például apKan707-be, így keletkezik apYG373B expressziós plazmid (30. ábra).

E.11.6. A V1V2- HSA típus ismert módon való előállítása

A VIV2- HSA típusú hibridfehérjéket a következő stratégia alapján állítjuk elő: az első lépésben a pYG511 (28. ábra) és apYG374 (29. ábra) plazmidok a BglII-Ahall (a HSA prepro régió és a CD4-receptor VIV2 doménjeinek fúziója), valamint a KpnI-Ahall (leolvasási keretben lévő fúzió az érett HSA- és a CD4receptor V1V2 doménjei között, lásd az E.12.2. példát) fragmensek forrásai. Ezeknek a plazmidoknak a klónozása Bluescript II SK(+ )-vektor kloramfenikol-rezisztenciát kódoló származékába [pSCBK(+ )-plazmid, Stratagene] hozza létre apYG537-plazmidot (31. ábra). Ez a plazmid egy olyan HindlII-fragmenst tartalmaz, amely a CD4-HSA-CD4 hibrid kétértékű molekulát kódolja, amely leolvasási keretben van a HSA szignálpeptidjével, lásd az E.11.2. példát. A pYG547-plazmidot, amely azt a HindlII-fragmenst hordozza, amely a V1V2-HSA hibridfehérjét a HSA prepro régiójával leolvasási keretben fuzionálva kódolja, úgy állítjuk elő, hogy a pYG537-plazmid PstI-KpnI-fragmenst a pYG3 71-plazmid PstI-KpnI-fragmensével helyettesítjük. A pYG547-plazmid által hordozott HindlII-fragmenst ezután egy olyan vektorba klónozott funkcionális élesztöpromoter szabályozása alatt expresszáljuk, amely például replikálódik a Kluyveromyces nemzetségbe tartozó élesztőkben. Egy ilyen példa a pYG560 expressziós plazmid, amelynek a szerkezetét és restrikciós térképét a 32. ábrán mutatjuk be. Az ebben a példában alkalmazott pYG 105-vektor megfelel egy olyan pKan707-plazmidnak, amelynek a HindlIIfelismerési helyét helyspecifikus mutagenezissel elrontották (Sql053 oligodezoxinukleotid, 5’-GAAATGC ATAAGCTCTTGCCATTCTCACCG-3’), és amelyben az URA3 gént kódoló Sáli- Sacl-fragmenst egy olyan Sáli- Sacl-fragmenssel helyettesítették, amely egy promoterből, terminátorból és egyetlen HindlII helyből álló expressziós kazettát kódol.

12. példa

Kétértékű hibridfehérje-komplexek

E.12.1 Stop kodon beépítése a CD4-receptor VI doménje után

A konvencionális technikák lehetővé teszik egy transzlációs stop kodon beépítését a CD4-receptor azon doménje után, amely a HÍV- 1 vírus gpl20 glikoproteinjéhez való kötődésért felelős. Például a TAA kodont építjük be helyspecifikus mutagenezissel közvetlenül egy HindlII restrikciós hely elé, a CD4-receptor VI doménje után. Részletesebben, a TAA kodont közvetlenül a CD4-receptor 106-os sorszámú aminosava után (Thr¹⁰⁶) építjük be az Sql034 oligodezoxinukleotidot és hordozóként az M13-CD4-plazmiddal analóg plazmidot alkalmazva. Az Sql034 oligodezoxinukleotid szekvenciáját az alábbiakban adjuk meg (a stop kodon és a HindlII restrikciós hely kiemelten van nyomtatva):

’- ACTGCC AACTCTGAC ACCTAAAAGCTTGG ATCCCACCTGCTTCAGGGGCA- 3’.

E.12.2. A CD4- HSA- CD4 típus előállítása

Az E.11.5. és E.11.6. példákban ismertetett plazmidok, amelyek a CD4- HSA típusú molekulák ismert módon való előállítását írják le, lehetővé teszik, hogy könnyű szerrel előállítsuk a CD4-HSA-CD4 típusú kétértékű konstrukciókat. A pYG374 (Vl-HSAVIV2) vagy a pY375 (VI- HSA- VI) plazmidok mutatnak két ilyen generikus konstrukciót: például a pYG371-plazmid kis MstlI- HindlII-fragmensét, amely a HSA utolsó aminosavait kódolja, helyettesíthetjük egy olyan MstlI-HindlII-fragmenssel, amely a HSA utolsó 3 aminosavát a CD4-receptor V1V2 doménjéhez (pYG374-plazmid, 29. ábra), vagy csak a VI doménjéhez (pYG375-plazmid, 29. ábra) fuzionáltan kódolja. Az ilyen kétértékű hibridfehérjéket kódoló géneket ezután egy olyan funkcionális élesztöpromoter szabályozása alatt lehet expresszálni, amelyet például a Kluyveromyces nemzetségbe tartozó élesztőkben replikálód1

HU 215 457 Β ni képes vektorba klónoztunk. Az ilyen expressziós vektorokra példa a pYG308B-plazmid (Vl-HSAVIV2) és a pYG381B-plazmid (VI-HSA-VI), amelyek szigorúan izogének a pYG373B-plazmiddal (VI-HSA), a HindlII-fragmens által kódolt struktúrgének kivételével. Az itt leírt kétértékű hibridfehérjéket az egyértékű ekvivalenseiknek megfelelő szinten expresszáljuk, ez azt mutatja, hogy nagyon alacsony szintű a rekombináció az ismétlődő szekvenciák között in vivő rekombinációval (33. ábra).

A V1V2- HSA-V1V2 típusú kétértékű hibridfehérjék készítését már ismertettük a 31. ábrán (pYG537plazmid). Az ilyen, CD4-HSA-CD4 típusú kétértékű hibridfehérjéket kódoló HindlII-fragmensek készítését már leírtuk a 31. ábrán (pYG537-plazmid). Az ilyen, CD4- HSA- CD4 típusú kétértékű hibridfehérjéket kódoló géneket egy funkcionális élesztópromoter szabályozása alatt expresszálhatjuk egy olyan vektorban, amely például a Kluyveromyces nemzetségbe tartozó élesztőkben szaporodik. Az ilyen expressziós plazmidokat a 32. ábrán ismertetett stratégiával állítjuk elő (egy HindlII-fragmens klónozása a pYG560-plazmiddal analóg plazmidokba).

E.12.3. Egy dimerizációs dómén beépítése

Egy adott, albuminból származó hibridfehérjénél, amely néhány HÍV- 1-víruskötó helyet tartalmaz, kívánatos lehet egy dimerizációs funkcióval rendelkező polipeptid beépítése, ami lehetővé teszi a csapdába esett vírusrészecskék összecsapódását. Az ilyen dime10 rizációs funkcióra jó példa a néhány transzkripciós szabályozó fehérjében (JUN, FOS,...) megtalálható „Leucin Zipper” (LZ) dómén. Részletesebben, lehetséges egy olyan BglII- Ahall-fragmenst készíteni, amely például a JUN LZ-t kódolja, PCR-technikával, a kö15 vetkező oligodezoxinukleotidok és hordozóként a pTS301-plazmid felhasználásával (amely a LexA bakteriális fehérjét és a JUN LZ-t tartalmazza leolvasási keretben lévő fúzióban, T. Schmidt and M. Schnar, nem publikált eredmény) (a BglII és Ahall helyek alá vannak húzva).

5’- GGTAGGTCGTGTGGACGCCAGATCTTTGGAAAGAATTGCCCGTCTGGAAG- 3 ’ 5’- CTGC AGGTTAGGCGTCGCC A ACC AGTTGCTTC AGCTGTGC- 3 ’.

Ezt a BglII-Ahall-fragmenst (34. ábra) ligálhatjuk azután a pYG233-plazmid Hindii-BglII-fragmensével (HSA prepro régió, 25. ábra), valamint az E.ll. példák egyikében ismertetett Ahall-HindlII-fragmenssel, így állítva elő a HSA szignálszekvenciájához fuzionált LZ-HSA-CD4 típusú hibridfehérjéket kódoló HindlII-fragmenst. Hogy megelőzzük ezeknek a molekuláknak a lehetséges dimerizálódását miközben átjutnak az élesztő szekréciós bioszintézis-útján, kívánatos lehet egy olyan LZ dómén alkalmazása, amely nem képes homodimereket képezni. Ebben az esetben a FOS „Leucin Zipper”-e az előnyös; dimerizáció akkor jöhet létre ezek után, ha ezeket a fehérjéket más, a JUN LZ-t hordozó hibridfehérjék jelenlétébe helyezzük.

A gondosan megválasztott restrikciós helyek beépítése is lehetséges, amelyek lehetővé teszik az LZ-CD4-HSA vagy LZ-CD4-HSA-CD4 típusú hibridfehérjék előállítását, konvencionális in vitro mutagenezis-technikák vagy PCR alkalmazásával.

13. példa

A CD4- és a HSA-részek közötti kapcsoló régió megváltoztatása in vitro DNS-manipulációval

E.13.1. A Bal31 exonukleázt használó stratégia

Azokkal a HSA-CD4 hibridfehérjét kódoló expressziós plazmidokkal (például a pYG308B-plazmiddal), amelyekben a CD4-egység a HSA természetes MstlI helyénél lévő MstlI- HindlII-fragmensen található, transzformált MW98- 8C törzs által szekretált fehérjéket vizsgáltunk. A 35. ábrán legalább két, az albuminstandarddal együtt vándorló hasítási terméket látunk (2. panel), amelyek az érett HSA N-terminális szekvenciájával rendelkeznek, és amelyek nem detektálhatok a humán CD4 elleni poliklonális antitestek felhasználásával (2. és 3. panel). Látszik, hogy ezek a hasítási termékek akkor keletkeznek, amikor az élesztő szekretáló bioszintézis-útján haladnak keresztül, valószínűleg a K. lactis KEX1 enzime hatására (vagy más proteáz hatására, amelynek a specifitása analóg a S. cerevisiae YAP3 proteázával, amelyet klónoztak és meghatározták a nukleotidszekvenciáját [Egel-Mitani

M. et al„ Yeast, 6, 127- 137 (1990)]. Tehát ezáltal a HSA- és a CD4-egységek közötti kapcsolódási régió peptidkörnyezete módosult, nevezetesen a CD4-molekula (vagy egyik, a HÍV- 1 gpl20 fehérjéjét megkötni képes variánsa) és a HSA változó hosszúságú N-termi35 nális régiója közötti fúzióval, a kővetkező stratégia szerint: a pYG400 egy olyan intermedier plazmid, amely az ATG kodon előtti, egy HindlII-fragmensen lévő nukleotidszekvencia alapján optimalizált prepro-HSA gént hordoz. Ezt a plazmidot linearizáljuk az egyetlen

MstlI helyén, majd részlegesen emésztjük Bal31 exonukleázzal. Az enzim inaktiválása után a reakcióelegyet az E. coli DNS-polimeráz Klenow fragmensével kezeljük, majd ligáljuk egy ekvimoláris mennyiségben jelen lévő oligodezoxinukleotid keverékkel, melynek össze45 tevői az Sql462 (5’-GATCCCCTAAGG-3’) és az Sql463 (5’-CCTTAGGG-3’) oligodezoxinukleotidok, amelyek együtt egy BamHI helyet megelőző MstlI helyet tartalmazó szintetikus adaptert képeznek. Ligálás után a reakcióelegyet HindlII és BamHI restrikciós en50 zimekkel emésztjük, majd a 0,7, illetve 2,0 kb méret közötti fragmenseket elektroelúcióval elválasztjuk, majd M13mpl9-vektorba klónozzuk, amelyet előzőleg az előző enzimekkel hasítottunk. így 10⁶ lítikus tarfoltot kapunk, amelyeknek körülbelül egyharmada adott kék színt IPTG és XGAL jelenlétében. A kék színt adó fág-klónokat szekvenáltuk, és a legtöbb esetben leolvasási keretben lévő fúziót tartalmaztak a HSA N-terminális része és a β-galaktozidáz között. Tehát ezek az összetett gének olyan HindlII- MstlI-fragmenseket tar60 talmaznak, amelyek a HSA N-terminálisának részét tar1 T

HU 215 457 Β talmazzák; a 36. ábrán néhány példát látunk a HSA C-terminális kétharmadai között. Ezeket a fragmenseket ligáljuk a CD4-egységnek megfelelő MstlIHindlII-fragmenssel (például a 2. ábrán szereplő VIV2 domének vagy a VI dómén egyedül), így olyan HindlII-fragmenseket kapunk, amelyek HSA-CD4 típusú hibridfehérjéket kódolnak, amelyekben a HSAegység változó hosszúságú. Ezeket a restrikciós fragmenseket klónozzuk azután megfelelő orientációban egy olyan expressziós kazettába, amely egy élesztőpromoterből és -terminátorból áll, majd ezt az együttest bejuttatjuk élesztőbe. A tenyészet növesztése után a HSA-CD4 hibridfehérjéket a tenyészfolyadékokban kapjuk meg; ezek közül a hibridek közül néhány megnövekedett rezisztenciával rendelkezik a csatoló régióban a proteolitikus hasítással szemben (35. ábra).

E.13.2. A dibázisos aminosavpárok mutációja Egy másik módszer a dibázisos aminosavpárokra specifikus endoproteázok hasításának megelőzésére az, hogy elnyomjuk ezeket a helyeket a HSA- és a CD4-egységek kapcsolódási régiójának területén (37. ábra), vagy a CD4 és a HSA kapcsolódási régiója közötti területen (38. ábra). Ennek egy példájaa 37. ábrán látható (1. panel), a pYG308B-plazmid által kódolt HSA- VIV2 hibridfehérjében található kapcsoló régió, amely mutatja egy Lys- Lys pár jelenlétét a HSA C-terminális részében, valamint két ilyen párt a CD4 VI doménjében. Helyspecifikus mutagenezis alkalmazásával ezek a potenciális endoproteáz-hasítási helyek elnyomhatok oly módon, hogy mindegyik párban a második lizint glutaminra változtatjuk [Risler J. L. et al., J. Mól. Bioi., 204, 1019- 1029 (1988)], például az M13-ompA-CD4plazmidot használva hordozóként, valamint az Sql090 és

Sql091 oligodezoxinukleotidokat (a glutamint meghatározó kodonok kiemelten vannak nyomtatva):

5’- GTGCTGGGCAAACAAGGGGATACAG- 3’ 5 ’- GGCTTAAAGCAAGTGGTGCTG- 3 ’.

Az M13-ompA-CD4-plazmid az M13 CD410 plazmádnak egy olyan származéka, amelyben az E. coli ompA génjének szignálszekvenciája leolvasási fázisban fuzionált a CD4-receptorhoz, a VI dómén előtt PCR-rel előállított MstlI helyet alkalmazva (1. példa).

E.13.3. Szintetikus kapcsoló szakasz beépítése

Abból a célból, hogy optimális kölcsönhatást biztosítsunk a HSA-hoz fuzionált CD4 és a HÍV- 1 vírus gpl20 fehérjéje között, kívánatos lehet a HSA- CD4 hibridfehérje két építőkövét képező két fehérjeegység korrekt egymás mellé helyezése. Például szintetikus kapcso20 ló régió állítható elő a HSA- és a CD4-egységek között helyspecifikus mutagenezissel, egy troponin C-fragmensnek az érett HSA 572. és 582. aminosava közé való juttatásával (37. ábra, 3. panel). Ebben az adott példában a kapcsoló peptidet helyspecifikus mutagenezissel épít25 jük be hordozóként a rekombináns Ml 3 fág (amely hordozza a HSA C-terminális része és a CD4 C-terminális része közötti leolvasási fázisban lévő fúziót kódoló PstI- Sacl-fragmenst), valamint az Sql445 oligodezoxinukleotid felhasználásával:

’- TGCTTTGCCGAGGAGGGTAAGGAAGACGCTA AGGGTA AGTCTGAAGAAGA AGCCTTAGGCTTAAAGAA A- 3 ’.

Hasonló technikák teszik lehetővé ilyen szintetikus kapcsoló szakasz beépítését a HSA- és CD4-egységek közé (kapcsoló peptid, 38. ábra, 3. panel).

14. példa

A hibridfehérjék expresszálása különböző promoterek szabályozásával

Egy adott, sejtek által magas szinten expresszált fehérje esetében létezik egy határ, amely felett az expresszió szintje már túl magas ahhoz, hogy a sejt túlélje. Ennélfogva léteznek a szekretált fehérje, az expressziót szabályozó promoter és a genetikai háttér olyan kombinációi, amelyek optimálisak a leghatékonyabb és legolcsóbb termelés szempontjából. Tehát fontos, hogy a jelen találmány szerinti hibridfehérjéket különböző promoterek szabályozása alatt expresszáljuk. Az ezeket a fehérjéket kódoló összetett gének általában olyan HindlII restrikciós fragmensen találhatók, amelyet megfelelő orientációban klónozni lehet élesztőben replikálódni képes vektorok funkcionális expressziós kazettájába. Az expressziós kazetta tartalmazhat olyan promotereket, amelyek lehetővé teszik a hibridfehérje konstitutív vagy szabályozott expresszióját, az expresszió kívánt szintjétől függően. Ilyen jellemzőkkel rendelkező plazmid például a pYG105 (a K. lactis LAC4 promotere, 32. ábra), a pYG106 (a S. cerevisiae PGK promotere) vagy a pYG536 (a S. cerevisiae

PH05 promotere) stb. Emellett olyan hibrid promo35 tereket használhatunk, amelyekben az erősen szabályozott promoterek UAS régióit alkalmazzuk, például a pYG44 (PGK/LAC hibrid, EP 89 10480 számú európai szabadalmi bejelentés), pYG373B (PGK/GAL hibrid), pYG258 (PHO5/LAC hibrid) stb. plazmidok hibrid pro40 moterei.

Claims (19)

1. 45 1. Eljárás hibrid molekulák előállítására, amelyek albumint vagy albuminvariánst és egy olyan receptor legalább egy aktív doménjét tartalmazzák kovalensen, előnyösen peptidkötéssel kapcsolva, amely immunglobulinokkal komplexet alkotó fertőző virionok internali50 zálásában vesz részt, vagy amely onkogén folyamatokban részt vevő faktorhoz tartozik, vagy amely a HÍV- 1 CD4-receptorának Vj doménje vagy V jV₂ doménje, azzal jellemezve, hogy az említett hibrid molekulákat kódoló DNS-fragmenst tartalmazó vektort hor55 dozó sejteket tenyésztünk, és az expresszált hibrid molekulákat izoláljuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás Fc'/RIII típusú receptor aktív doménjét tartalmazó hibrid molekulák előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő DNS-frag60 menst tartalmazó vektort hordozó sejteket tenyésztjük.

   1 Q

   HU 215 457 Β
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás CD_lg-receptor aktív doménjét tartalmazó hibrid molekulák előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő DNS-fragmenst tartalmazó vektort hordozó sejteket tenyésztjük.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás tirozin-kináz típusú receptor aktív doménjét tartalmazó hibrid molekulák előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő DNS-fragmenst tartalmazó vektort hordozó sejteket tenyésztjük.
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás proto-onkogén c-erbB-2 aktív doménjét tartalmazó hibrid molekulák előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő DNSfragmenst tartalmazó vektort hordozó sejteket tenyésztjük.
6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás humán albumint tartalmazó hibrid molekulák előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő DNS-fragmenst tartalmazó vektort hordozó sejteket tenyésztjük.
7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás egy receptor egynél több aktív helyét tartalmazó hibrid molekulák előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő DNS-fragmenst tartalmazó vektort hordozó sejteket tenyésztjük.
8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás olyan hibrid molekulák előállítására, amelyekben az albumin vagy albuminvariáns a molekula N-terminális végén helyezkedik el, azzal jellemezve, hogy a megfelelő DNS-fragmenst tartalmazó vektort hordozó sejteket tenyésztjük.
9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás olyan hibrid molekulák előállítására, amelyekben dimerizációs vagy polimerizációs funkció is található, azzal jellemezve, hogy a megfelelő DNS-fragmenst tartalmazó vektort hordozó sejteket tenyésztjük.
10. 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás olyan hibrid molekulák előállítására, amelyek a receptor aktív doménje és az albumin vagy albuminvariáns között proteolitikus hasítási helyektől mentesek, azzal jellemezve, hogy a megfelelő DNS-fragmenst tartalmazó vektort hordozó sejteket tenyésztjük.
11. 11. Az 1- 10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy élesztőt alkalmazunk.
12. 12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy Kluyveromyces nemzetségbe tartozó élesztőt alkalmazunk.
13. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pKDl-plazmid eredetű olyan vektort hordozó élesztőt alkalmazunk, amelyben az A, B és C gének, a replikációs origó és a fordított ismétlődő szekvenciák konzerváltak.
14. 14. Eljárás gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1. igénypont szerinti eljárás szerinti hibrid molekulát a gyógyszergyártásban szokásos segédanyagokkal összekeverve gyógyászati készítménnyé alakítunk.
15. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként egy humán albumint vagy albuminvariánst és a CD4-molekula Vj doménjét tartalmazó hibridmolekulát alkalmazunk.
16. 16. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként egy humán albumint vagy albuminvariánst és a CD4-molekula V ff doménjét tartalmazó hibridmolekulát alkalmazunk.
17. 17. Eljárás gazdasejtek előállítására, azzal jellemezve, hogy egy kiindulási sejtet egy, az 1. igénypont szerint meghatározott hibridmolekulát kódoló DNS-fragmenst tartalmazó vektorral transzformálunk, transzfektálunk vagy infektálunk.
18. 18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási sejtként élesztőt alkalmazunk.
19. 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Kluyveromyces nemzetségbe tartozó élesztőt alkalmazunk.