JPH04501954A - ドロソフィラ細胞におけるｈｉｖ蛋白の発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ７、請求項６記載の昆虫細胞の培養にて産生されるＨＩＶ　ｇｐ１２０またはｇ ｐ　ｌ　６０蛋白。

８、ＨＩＶ感染に対する保護を刺激するワクチンであって、免疫保護量および非 毒性量の請求項７記載の蛋白からなるワクチン。

９、請求項７記載の蛋白からなるヒト患者におけるＨＩＶ感染検出用診断薬。

１０、ＨＩＶ蛋白遺伝子発現ユニットでトランスフェクションした、該蛋白の発 現能を有するドロソフィラ細胞を適当な培地にて培養することを特徴とするドロ ソフィラ細胞におけるＨＩＶ蛋白の産生方法。

１１、細胞を、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼについてのコーディ ング配列を有する第１のベクター、およびＨＩＶ蛋白遺伝子発現ユニットについ てのコーディング配列を有する第２のベクターでトランスフェクションする請求 項１Ｏ記載の方法。

１２、第１のベクターがｐＣＯＨＹＧＲＣ）Ｃ’ある請求項１１記載の方法。

１３、第２のベクターが、ｐｇｐ１６０△３２、ｐｇｐ　１２０ＦΔ３２、ｐｇ ｐ　Ｉ　２０Δ３２またはｐｇｐ１２０△２７４中ｌこ存在するＨＩＶ遺伝子発 現ユニットからなる請求項１１記載の方法。

１４、ドロソフィラ細胞がディー・フラノガスター５．細胞である請求項１０記 載の方法。

１５、ｓｘ細胞をベクターｐｃＯＨＹＧＲｏと、ｐｇｐ１６０Δ３２、ｐｇｐ　 １２０Ｆ△３２、ｐｇｐ　１２０Δ３２またはｐｇｐ　１２０Δ２７４中に存在 する遺伝子発現ユニットからなるベクターで共トランスフェクシヨンする請求” Ｊ１４記載の方法。

１６、ＨＩＶ結合物質を請求項７記載の蛋白と接触させ、該物質と該蛋白との間 の結合の存在を検定し、かかる結合がＨＩＶの結合を示すことを特徴とするＨＩ Ｖ結合物質の同定方法。

ＩＬ非変性ｇｐ　ｌ　６０蛋白産生物およびマチュアｇｐ１２０蛋白に存在する エピトープと反応能を有するモノクローナル抗体を含有するアフィニティー樹脂 を用いることを特徴とする請求項７記載のＨＩＶ蛋白の精製方法。

１８、非変性ｇｐ１６０蛋白産生物およびマチュアｇｐ１２０蛋白に存在するエ ピトープと反応能を有するモノクローナル抗体を含有するアフィニティー樹脂を 用いることを特徴とする請求項ｌＯ記載の方法によフて産生されるＨＩＶ蛋白の 精製方法。

明　細　書 ドロソフィラ細胞におけるＨＩＶ蛋白の発現発明の分野 本発明は、一般に、ドロソフイラ細胞におけるＨＩＶ蛋白の発現および発現した 遺伝子産生物の精製に関する。さらに詳しくは、本発明は、この発現系による新 規な変異体ｇｐ　ｌ　６０およびｇｐ１２０遺伝子度遺伝子産生物関する。

発明の背景 ヒト免疫不全ウィルス型１（ＨＩＶ−１）は、ＡＩＤＳとして公知の後天性免疫 不全症候群の病因学的作用体である。このレトロウィルスは、長末端繰返し構造 （ＬＴＲｓ）、ｇａｇ％ｐｏｌおよびｅｎν遺伝子、および他の遺伝子を含む完 全遺伝構造を有する。このレトロウィルスは、単独でまたは協力して、保護免疫 応答誘発能を有するワクチン剤としての可能性のある多くのウィルス抗原を有す る。

その中で、より有望なＨＩ　Ｖ−１抗原は、ウィルスエンベロープ糖蛋白（ｇｐ １６０）またはその特異フラグメントであるｏ　ｅ　ｎ　Ｖ遺伝子はウィルスエ ンベロープの１６０キロダルトン（ｋｄ）先ＩＫ糖蛋白をコードする。ｇｐ１６ ０は、翻訳後、ウィルス表面に存する１２０ｋｄ糖蛋白（ｇｐ１２０）と４１ｋ ｄ糖蛋白（ｇｐ４１）に分割される。

ｇｐ１２０．５１１アミノ酸糖蛋白は、ｇｐ　１６０糖蛋白のアミノ末端の３分 の２に位置し、ウィルスの表面に暴露される。ｇｐ１２０はウィルスとその細胞 レセプター、ヘルパーＴ、リンパ球、マクロファージおよび免疫系の他の細胞と の相互作用に重要である。

かくしてｇｐ１２０はウィルス感染の組織選択性を決定し、シンシチウム形成と の関連を介してＨＩＶの細胞変性に関与している。

ｇｐ１８０のカルボキシル末端から誘導されるｇｐ４１．３４５アミノ酸蛋白は 、ＨＩＶ−１の細胞膜内蛋白である。ｇｐ４１は細胞原形質膜の脂質二重層に蛋 白を固定する一連の疎水性アミノ酸を含有する。ｇｐ４１のカルボキシル末端は ウィルス粒子に突き出ていると考えられている。ｇｐ４１またはその一部は、細 胞の表面で発現したＨＩＶ糖蛋白と表面Ｔ、レセプターを表示する細胞との融合 の原因であると考えられている。この融合の原因であると考えられているｇｐ４ １部はアミノ末端に位置する。かかる融合はウィルス複製の役割を果たすと考え られている。例えば、エム・コワルスキー（Ｍ、Ｋｏｗａｌｓｋｉ−）ら、サイ エンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、　２３７　：　１３５１〜５５　（１９８７）； ディー・エム・ナイト（Ｄ、Ｍ、Ｋｎｉｇｈｔ）ら、サイエンス、２３６　：　 ８３７〜３６　（１９８７）参照。

これらのウィルス糖蛋白は、ウィルス粒子の表面から外部に突出しているウィル ス性スパイクのような３次構造をとる。約７０〜８０のスパイクが各新規合成ウ ィルス粒子を結合していると考えられる。ウィルス粒子は年数を経ると、スパイ クが消滅するため、ｇｐ１２０とｇｐ４１の間の関連が弱くなることは明らかで ある。かくして、新規合成ウィルス粒子の場合、このウィルス糖蛋白スパイクが 、感染後の免疫系に対して影響を受けやすい最も直接的な標的であると考えられ る。

ウィルス中和抗体はｇｐ１２０およびｇｐ４１エピトープに対抗して定方向であ ると報告されている。特異中和抗体の標的部位が、ｇｐ　ｌ　２０糖蛋白分子の ３′ハーフに位置することが特に注目に値する。

したがって、ＨＩＶ−１のｅｎｖ遺伝子が多くの最近の研究の標的となっている 。体液および細胞の両方のこれら抗原に対する免疫応答の誘発を報告したグルー プにより、グリコジル化ｇｐ１６０の発現が、以前に、哺乳動物細胞およびある 種のバキュロウィルス昆虫細胞にて得られた。ｇｐ　１２０をいくつかの系で異 種プロモーターと組み合わせて使用して発現させた。例えば、ニス・チャクラバ ルチ（Ｓ　、Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ）ら、ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　（ Ｌｏｎｄｏｎ）　。

３２０　：　５３５　（１９８６）？ニス・アイ・７−　（５，１、Ｈｕ）ら、 ネイチャー　（Ｌｏｎｄｏｎ）　、　３２０　：　５３７　（１９８６）　；お よびエム・ピー・キエ二一（Ｍ、Ｐ　、Ｋ　１ｅｎｙ）ら、バイオテクノロジー （Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　、　４　：　７９０　（１９８６）参照。

エル・エイ・ラスキー（Ｌ、Ａ、Ｌａ５ｋｙ）らは、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ ｅ）　、　２３３　：　２０９−２１２　（１９８６）において、哺乳動物細胞 、特に、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）ｍ胞にトランスフェクション についてのｅｎｖ遺伝子変異体を含有する多くのプラスミドを構築した。これら は、ｅｎｖ蛋白のアミノ酸配列（＃６１〜＃５３１）、ＨＢｓＡｇポリＡシグナ ル、ＤＨＦＲ遺伝子およびＳＶ４０の複製開始点に相にて接合した糖蛋白Ｄ（ｇ Ｄ）蛋白の最初の５０のアミノ酸を含むプラスミドにおいてコードされる遺伝子 産生物を分泌した。組換体エンベロープ抗原はそのアミノ末端でｇＤの２５アミ ノ酸を有し、ｇｐ１２０から調製された変異体からの３０残基を欠き、さらにｇ ｐ４１配列を欠失して産生された。得られた遺伝子は長さが５２０のアミノ酸で あった。ＣＨＯ細胞にトランスフェクションした場合、細胞−調整上澄はｇｐ１ ３０と称される１３０ｋｄ蛋白を含有した。

近年の論文、エル・エイ・ラスキー（Ｌ　、　Ａ　、　Ｌ　ａｓｋｙ）ら、セル （Ｃｅｌｌ）、５０　：　９７５−９８６　（１９８７）は、ｇｐ１２０糖蛋白 とその細胞レセプター、ＣＤ４の間の相互作用を論じている。

ｇｐ１２０のアミノ酸＃４１０〜４２１中に含まれる１２アミノ酸を欠失させる ことにより、完全な結合喪失が得られた。同様に、４１７位での１個のアミノ酸 置換は結合の減少をもたらした。

前記のコワルスキーらは、欠失および挿入突然変異をＨＩＶ−１のＨＴＬＶ　Ｉ 　Ｉ　Ｉｓ株から誘導されるエンベロープ糖蛋白をコードするプラスミドに導入 した。さらに、該プラスミドはａｒｔ遺伝子を有した。ｔａｔ遺伝子産生物を発 現する哺乳動物のＣＤｄ＋およびＣＤ４−細胞株をトランスフェクション受容株 として用い、形質変換された細胞の融合する能力を研究した。

前記のナイトらは、哺乳動物細胞におけるＨＩＶのａｒｔ／１ｒｓ）ランスアク チベーター蛋白の発現を記載している。これらＨＩＶ蛋白の発現に用いられる哺 乳動物細胞株はＣＯ３−７サル細胞株であった。これらのプラスミドはプロモー ターとしてＨＩＶＬＴＲおよびＳＶ４０からのＲＮＡプロセッシングシグナルを 用い、機能性メツセンジャーＲＮＡとしての挿入ＤＮＡを発現した。ｇｐ１２０ を発現するために、プラスミドｐＥＮＶ１６０が開発され、それはＨＩＶ　ＬＴ Ｒに融合されるｅｎｖ遺伝子の完全なコード領域を有する。

ニス・ダブリュ・パイル（Ｓ　、　Ｗ、　Ｐ　ｙｌｅ）は、エイズ・レサーチ・ アンド・ヒユーマン・レトロウィルセス（Ａｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）　、　３　（４）　：　３８７　（１ ９８７）において、イムノアフィニティクロマトグラフィーによるＨＩＶ感染Ｈ ９細胞の培養液からのｇｐ１２０糖蛋白の精製を開示している。

さらに米国特許第４７２５６６９号はヒトＨ９／ＨＴＬＶ−Ｉ　ＩＩ細胞株から 得られる約１６０ｋｄおよび１２０ｋｄの糖蛋白を開示し、それは各々、約９０ ｋｄの非グリコジル化基を有する。

７オツクス（Ｆ　ＯＸ）は、バイオテクノロジー（Ｂ　ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ）　＋６　：１１６　（１９８８）において、ＭｉｃｒｏＧｅｎｅＳｙｓによ り開発されたＶＡＸＳＹＮ　ＨＩＶ−１ワクチンを報告している。この報告はこ のワクチンのいずれのａＳも開示していない。

ディー・エル・ライン（Ｄ　、　Ｌ　、　Ｌ　ｙｎｎ）らは、「遺伝子発現の調 整機構Ｊ　、Ｅｄｓ、Ａ１１ａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ　Ｉｎｃ−，３５９〜３６８頁 （１９８８）において、バキュロウィルスであるオートグラファカリフォルニカ （Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）のポリへドロンプロモーター のビハインドの完全ｇｐ１６０遺伝子のクローニングを開示している。

これらの組換体ウィルスで感染された昆虫細胞は、細胞溶解によって細胞から放 出される蛋白を発現する。ｇｐ１６０との該蛋白共移入はｇｐ　１２０およびｇ ｐ４１に分裂せず、グリコジル化され、細胞膜に付着する。Ｎ−グリカナーゼで 脱グリコジル化すると、該蛋白は約９６ｋｄの分子量を有した。該組換体蛋白は 、ＨＩＶ感染Ｈ９細胞からの蛋白と、ｇｐ１２０の組換体フラクシ町ンに対する 抗血清と、ｇｐ１２０そのものと、ｇｐ４１のペプチド７ラグメントと、と）Ａ 　Ｉ　ＤＳ血清と免疫反応性であった。

アール・エル・ウィリー（Ｒ，Ｌ、Ｗｉｌｌｅｙ）らは、プロシーデインダス・ オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエンシス・オプーＬ−−！ス・ エイ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ）　＋８３　：　５ ０３８　（１９８６）において、ｇｐ１２０蛋白におけるアミノ酸の超可液部を 論じている。最近の報告、アール・エル・ウィリーらのジャーナル・オプ・パイ ロロジー（Ｊ　、Ｖｉｒｏｌ、）、５２　（１）：１３９　（１９８８）は、感 染性に必要なｅｎｖ遺伝子内の領域を研究した。特に、ｇｐ　ｌ　２０遺伝子内 の４つのＮ−結合グリコシル化部位のＡｓｐコドンでのアミノ酸置換が開示され ている。

ダブリュ・アール・ガラ／％　−（Ｗ、Ｒ，Ｇａｌｌａｇｈａｒ）は、セル、５ ０　：　３２７　（１９８７）　において、ＨＩｖの膜内外蛋白ｇｐ４１（７） 融合ペプチド配列を開示している。

ニス・ディー・ブトニー（Ｓ、Ｄ、Ｐｕｔｎｅｙ）らは、サイエンス。

２３４　：　１３９２　（１９８６）において、ＨＩＶ　ｅｎｖ遺伝子のイー・ コリー産生フラグメントに対する中和抗体の産生を開示している。

ビー・ジェイ・ボンド（Ｂ　−’Ｊ　、　Ｂ　ａｎｄ）らは、モレキュラー・ア ンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）　、　６　（ ６）：　２０８０　（１９８６）において、ドロソフィラ・メラノガスタ−（Ｄ ｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）アクチン５０遺伝子の構築を 開示している。該報告はアクチン５Ｃ遺伝子の２つのトランスクリプション出発 部位およびディー・メラノガスター宿主細胞に挿入された細菌クロラムフェニコ ールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子とプロモーター配列の間の融合を開示し ている。

ビー・ジェイ・パー（Ｐ、Ｊ、Ｂａｒｒ）らは、ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅ）　 。

５　：　９０　（１９８７）において、酵母サツカロミセス・セレビジア工（Ｓ 　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＨＩＶ蛋白の発現を開 示している。

エッチ・ヨハンセン（Ｈ、Ｊ　ｏｈａｎｓｅｎ）　ラ、第２８　回７ニユアル・ ドロン７（う・コンファレンス（２８ｔｈ　Ａｎｎｕａｌ　Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌ ａＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅ）　、　ｐ　、４１　（１９８７）は、主に、ドロソフ イラ・メタロチオネイン・プロモーターによって調整されたイー・コリーｇａｌ Ｋ遺伝子がドロソフィラ細胞株にて発現されたことを示す要約である。

エイ・ヴアンデルストラテン（Ａ　、　Ｖａｎｄｅｒｓｔｒａｔｅｎ）らの、日 本、ユニバージティー・オプ・トーキヨー・プレス（１９８７）の無を推動物お よび魚組織培養における第７回国際会議の会報、要約、およびエイ・ヴアンデル ストラテンらの「無を椎動物および無組織培養」、東京、日本科学学会、ワイ・ クロダら編、１３１−１３４頁（１９８８）は、培養中、ディー・メラノガスタ ー細胞の外来性遺伝子の発現において用いるヒグロマイシンＢ選択系を開示して いる出版物である。該要約は核子を共導入に用い、イー・コリー・ｇａＩＫ遺伝 子および哺乳動物オリジンの他の遺伝子を過剰発現することに着目している。

かくして、当該分野において、ワクチンおよび診断薬として使用するＨＩＶ蛋白 の高濃度産生に対する要望がなお残っている。

発明の要約 第１の態様において、本発明は、所望の蛋白についてのＤＮＡコーディング配列 およびドロンフィラ細胞内での蛋白コーディング配列の転写およびその後の翻訳 に必要な調節配列からなるＨＩＶｅｎｖ遺伝子発現ユニットを提供する。

関連態様において、本発明は本発明の遺伝子発現ユニットからなるＤＮＡベクタ ーを提供する。

もう一つの関連態様において、本発明は本発明のＤＮＡベクターでトランスフェ クションしたドロソフィラ細胞を提供する。

さらなる関連態様において、本発明はＨＩＶ　ｅｎｖ蛋白または本発明のトラン スフェクションした昆虫細胞で産生されるその誘導体を提供する。該誘導体はア ミノ酸の欠失、付加、置換または再配列またはその化学修飾のような、野性ｆｆ ＨＩＶｅｎｖ蛋白における抗体によって認識される能力を保持するいずれのＨＩ Ｖ　ｅｎｖ蛋白も包含する。

別の態様において、本発明は免疫保護量および非毒性量の本発明によって産生さ れたＨＩＶｅｎｖ蛋白からなる、ＨＩＶ感染に対する保護を刺激するワクチンを 提供する。

さらに本発明は、本発明のドロソフィラ細胞産生ＨＩＶ蛋白を有する、生物流体 試料中のＨＩＶ感染の存在を検出するのに宵月な診断薬を提供する。加えて、本 発明のｅｎｖ蛋白は、ＣＤ、またはその誘導体のようなＨＩＶ結合蛋白または蛋 白様物質の同定または単離に用いることができる。

本発明はまた、ＨＩＶ　ｅｎｖ蛋白またはその免疫原性誘導体の調製方法に関す る。該方法は、細胞の培養に適した培地中、ＨＩＶｅｎＶ遺伝子発現ユニットで トランスフェクションしたドロソフイラ細胞を培養することを包含する。該適当 な培地中にて培養したトランスフェクション細胞は問題の蛋白を発現する能力を 有する。その後、該蛋白を細胞または細胞培地から収集することができる。

本発明はさらに、マチュアｇｐ１２０にて、さらにまたｇｐ１６０非プロセス細 胞間蛋白内に存するエピトープと反応するモノクローナル抗体に結合するＨＩＶ 蛋白またはそのフラグメントを精製する方法を提供する。この種の抗体のうち、 マウスモノクローナル抗体を１７８．１と称する。

本発明の他の態様および詳細を以下の記載にて開示する：発明の詳細 な説明の方法および発現系は、ドロソフイラ細胞構造における高水準のＨＩＶ蛋 白、特にｇｐ１２０、ｇｐ１６０およびその誘導体の産生を促進する。外来性Ｄ ＮＡまたは宿主細胞に悪影響を及ぼすことなく、外来性ＤＮＡを宿主細胞に導入 させる標準クローニング技法を用いることによって該ドロソフィラ細胞をトラン スフェクションする。そのように構築した組換体ドロソフィラ細胞はＨＩＶ蛋白 を産生ずる。

ＨＩＶ蛋白が感染昆虫細胞の細胞溶解によってのみ得られる従来のバキュロウィ ルス系とは対照的に、本発明の方法は、ＨＩＶ蛋白に関する連続細胞発現系を提 供する。分泌後、従来技法を用いて培地から精製することによって蛋白を得るこ とができる。また、蛋白は細胞間または膜結合で得られるかもしれない。該蛋白 は従来技法を用いて細胞から抽出してもよい。さらには、膜結合蛋白は種々の細 胞関連検定を用いてもよい。

本発明の実施に用いる好ましいドロソフイラ細胞株は、ディー・フラノガスター ３２株である。Ｓ２細胞［シュナイダ−（Ｓ　ｃｈｎｅｉｄｅｒ）　。

ジャーナル・オフ・エンブリオロジー・アンド・エクスベリメンタルーモルホロ ジー（Ｊ　、Ｅｍｂｒｙｏｌ、Ｅｘｐ、Ｍｏｒｐｈ、）　２７　：　３５３　（ １９７２）］は、多倍数胚ドドロフイラ細胞の安定細胞培養体である。

ＤＮＡトランスフェクシシン技法によるドロソフイラＳ２細胞中へのｇｐ１６０ またはそのサブユニットｇｐ１２０またはｇｐ４１またはその誘導体用のｃＤＮ Ａコーディング配列の導入は、意外にも大量の糖蛋白を産生ずる。Ｓ、ドロソフ イラ細胞の使用は、室温にて高密度まで増殖するその能力を含み、しかしそれに 限定されることなく、多くの利点を有する。該選択系の安定な組込みは、細胞染 色体中に１００Ｑコピーまでのトランス７エクシＨンした遺伝子発現ユニットを 産生じた。

他のドロソフィラ細胞媒体系もまた本発明において有用である。

おそらく有用な細胞は、例えば、無血清細胞株であるＫＣ−０ドロソフイラ・メ ラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　Ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）細胞株［シ ュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）ら、プロシーディング・オフ・ザ・ナショナル・アカ デミ−・オフ・サイエンシス・オフ・ニー・ニス・エイ。

８３．９４２８　（１９８６）］である。ＫＣ−０株を用いる予備研究は、トラ ンスフェクションはＳ２細胞の場合よりもより困難であることを示唆している。

有用であるかもしれない別の細胞株は、ドロソフィラ・ハイダイ（Ｄｒｏｓｏｐ ｈｉｌａ　ｈｙｄｅｉ）からの細胞株である。

該ハイダイ細胞株を用いて蛋白発現を得ることができる；しかしながら、この細 胞株へのトランス７エクシコンは非常に低い効率で発現されるトランスフェクシ ョンしたＤＮＡをもたらしうる［シンフレイア−（Ｓ　１ｎｃｌａｉｒ）ら、モ レキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、 ）　、　５　：　３２０８　（１９８５）　）。

本発明にて用いることのできる他の利用可能なドロップイラ細胞株はＳＩおよび Ｓ、を包含する。

本発明の使用に選択されるドロップィラ細胞は、例えば、Ｍｓ培地を包含する種 々の適当な培地にて培養することができる。、Ｍ３培地は、Ｉ）Ｈ６，６での平 衡塩と必須アミノ酸の処方からなる。該培地の調製法は、実質的にりンドクイス ト（Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ）　、　Ｄ　Ｉ　Ｓ、　５８：１６３　（１９８２）に 記載されている。ドロンフイラ細胞の増殖用の他の通常の培地もまた用いること ができる。

本発明によれば、ＨＩＶ蛋白遺伝子発現ユニットを含む組換体ＤＮＡ分子または ベクターを用い、選択したドロソフィラ細胞をトランスフェクションすることが できる。遺伝子発現ユニットは、選択したＨＩＶ蛋白用またはその誘導体用のＤ ＮＡコーディング配列を有する。かかる誘導体は、伝統的遺伝子処理法、例えば 、変異誘発、制限エンドヌクレアーゼ処理、合成配列を含む他の遺伝子配列の連 結を用いて遺伝子配列を操作することにより得ることができる。例えば、ティー ・マニアティス（Ｔ　、Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、ニューヨーク。

コールド・スプリング・ハーバ−、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラト リ−、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュアル（１９８２ ）参照。

ＨＩＶＤＮＡコーディング配列が最近公表された。ラトナー（Ｒａｔｎｅｒ）ら 、ネイチ＋＋、３１３　：　２７７−２８４　（１９８５）またはワインーホプ ソ：／　（Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ）ら、セル、４０：９〜１７（１９８５）参 照。ヌクレオチド配列もまたＧ　ｅｎ　Ｂ　ａｎｋから入手可能である（クロー ンＢＨＩ　Ｏ，ラトナーら、前掲）。

本発明のコーディング配列からなるＤＮＡ分子は、公知方法を用いてＨＴＬＶ− ｒ　Ｉ　Ｉ感染細胞から誘導することができる（ハン（Ｈａｈｎ）ら、ネイチ＋ 　−，３１２：１６６〜１６９　（１９８４）、または別法として標準オリゴヌ クレオチド技法により合成することができる。さらには、広く入手可能なりロー ン化ＤＮＡコーディング配列を有する多くの組換体宿主細胞がある。

ついで、該誘導体はＤＮＡ合成法を包含する標準技法により調製することができ る。かかる誘導体は、例えば、蛋白の結合能力または生物特性に有意な悪影響を 及ぼすことなく、■またはそれ以上のアミノ酸が置換され、付加されまたは欠失 したｇｐ１２０またはｇｐ１６０分子を包含する。これら蛋白の誘導体はまた、 標準化学修飾法、例えば、アシル化、メチル化により調製してもよい。

さらに遺伝子発現ユニットは、ＨＩＶ蛋白コーディング配列の転写およびその後 の宿主細胞における翻訳および発現に必要であるかまたは望ましい調節領域から なる。該調節領域は、代表的には、ＲＮＡポリメラーゼの結合において、ＲＮＡ 転写の開始において作用するプロモーター領域を有する。該プロモーター領域は 、代表的には、ＨＩＶ蛋白コーディング配列より上流にて見いだされている。

好ましいプロモーターはドロップィラ起源のもの、例えば、ドロソフィラ・メタ ロチオネイン・プロモーターである［ラストフスキー−べり−（Ｌ　ａｓｔｏｗ ｓｋｉ　−Ｐ　ｅｒｒｙ）ら、ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミストリ ー（Ｊ　、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　、　２６０　：　１５２７（１９８５）］ 。この誘導性プロモーターは、金属、例えば、ＣｕＳＯｓの存在下に・て遺伝子 の高水準転写を示す。ドロソフイラ・メタロチオネイン・プロモーターの使用は 、該発明の発現系において非常に高いコピー数においてさえ十分な調節の保持が 得られる。

これは、該金属の調節効果がコピー数が増加するにつれて減少する哺乳動物細胞 における哺乳動物メタロチオネイン・プロモーターの使用と全く対照的である。

ドロソフイラ発現系において、この保持した誘導効果は高コピー数でのドロソフ ィラ細胞における遺伝子産生物の発現を増加させる。

ドロンフィシアクチン５Ｃ遺伝子プロモーター［ビー・ジェイ・ボンド（Ｂ、Ｊ 、Ｂｏｎｄ）ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃ ｅ１１．Ｂｊｏｌ、）　、　６　：　２０８０　（１９８６）　］もまた望まし いプロモーター配列である。アクチン５ｃプロモーターは構成プロモーターであ り、金属の付加を要しない。したがって、パーヒユージョン系のような大規模の 生産系において用いるには、ドロソフィラ・メタロチオネイン・プロモーターよ りも該プロモーターが好適である。さらなる利点は、培地中にて高濃度の銅が不 在である二七が、長期間、細胞のより活性な状態を維持することである。

他の公知ドロソフィラ・プロモーターの例は、例えば、誘導熱衝撃（Ｈｓｐ７０ ）およびＣ０ＰＩＡ　ＬＴＲプロモーターを包含する。ＳＶ４０初期プロモータ ーは、ドロンフイラ・メタロチオネイン・プロモーターよりも低水準の発現を示 す。例えば、鳥類のラウス肉腫ウィルス（Ｒｏｕｓ　ｓａｒｃｏｍａ　ｖｉｒｕ ｓ）　Ｌ　Ｔ　Ｒおよびシミアンウィルス（ＳＶ４０初期プロモーター）を包含 する細胞発現ベクターに通常用いられるプロモーターは、ドロソフィラ系にて低 い機能および発現を示す。

ＨＩＶ蛋白用の望ましい遺伝子発現ユニットまたは発現ベクターは、ＨＩＶ蛋白 コーディング配列を望ましいシグナル配列に融合することにより構築してもよい 。該シグナル配列が宿主細胞からの蛋白の分泌に直接機能する。かかるシグナル 配列は組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）の配列から誘導してもよい。

他の利用可能なシグナル配列は、例えば、ヘルペス・シンプレックスウィルス遺 伝子Ｈ５Ｖ−１ｇＤから誘導されるものを包含する［ラスキー（Ｌ　ａｓｋｙ） も、サイエンス、前掲］。

ＨＩＶＤＮＡコーディング配列が、ついでＳＶ４０初期ポリＡ領域のようなポリ アデニル化（ポリＡ）領域が続く。ＲＮＡ転写物のポリアデニル化にて機能する ポリＡ領域が、転写の安定化に役割を果たしていることは明らかである。同様の ポリＡ領域が、天然に存する種々の遺伝子から誘導できる。ポリアデニル化およ び転写物安定化機能が有意に悪影響を及ぼさないならば、この領域もまた修飾し 、その配列を変えることができる。

組換体ＤＮＡ分子はまた、遺伝子選択マーカー、ならびにＨＩＶ蛋白遺伝子機能 を有していてもよい。該選択マーカーは、トランスフェクションした宿主細胞に おいて容易に検出しうる表現型変化をもたらすいずれの遺伝子または遺伝子類と することができる。かかる表現型変化は、例えば、ヒグロマイシンＢ耐性につい ての遺伝子のような薬剤耐性とすることができる。

別法として、薬剤メトトレキセイト（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）および原核生 物のジヒドロホレートレダクターゼ（Ｄ　ＨＦ　Ｒ）遺伝子を用いる選択系をド ロップィラ細胞で用いることができる。該細胞の内因性真核生物のＤＨＦＲはメ トトレキセイトにより抑制される。したがって、メトトレキセイトに対して非感 受性である原核生物のＤＨＰＲを含有するプラスミドで細胞をトランスフェクシ ョンし、メトトレキセイトで選択することによって、原核生物ＤＨＦＲでトラン スフェクションし、発現する細胞のみが生存する。形質転換した哺乳動物および 細菌細胞のメトトレキセイト選択と異なり、ドロソフイラ系において、最初に、 高コピー数のトランス７エクタントまでメトトレキセイトを用いることができる 。保護原核生物ＤＨＦＲ遺伝子を組み入れた細胞のみが生存する。付随して、こ れらの細胞が重要な遺伝子発現ユニットを有する。

本発明に従って得られる例示的プラスミドはｐｇｐ１６０△３２であり、それは ｇｐ１６０のＮ−末端３２アミノ酸配列をｔＰＡの第１のアミノ酸、セリンで置 換しているｇｐ１６０誘導体を包含する。このプラスミドをさらに実施例１に記 載する。

もう一つＩＩＩのかかるグラスミドベクターは、最初の３２アミノ酸をセリンで 置換し、２１６アミノ酸のカルボキシル欠失を含むｇｐ１６０配列を有するｐｇ ｐ　１２０ＦΔ３２である。このプラスミドもまた実施例１に記載する。

本発明の誘導体蛋白を示すさらにもう一つ別のプラスミドはｐｇｐ１２０Δ３２ であり、セリンで置換されるＮ−末端での第１の３２アミノ酸を減じたｇｐ１２ ０の完全なコーディング配列を有する。

加えて、プラスミドｐｇｐ　１２０△２７４は、第１の２７４１ミノ末端アミノ 酸をｔＰＡの第１のアミノ酸、セリンで置換し、ｇｐ１６０のプロセッシング部 位までのｇｐ　ｌ　２０の保持アミノ酸を有するｇｐ　１２０蛋白配列を含有す る。これらのベクター構築を実施例１においてさらに詳細に記載する。

いったん、ＨＩＶ蛋白遺伝子発現ユニットを含有する組換体ＤＮ八へ子または発 現ベクターが構築されたならば、標準トランスフェクション技法を用いて選択さ れたドロソフイラ細胞中にそれをトランスフェクションすることができる。かか る技法は当該分野における当業者にとって公知であり、例えば、リン酸カルシウ ム共沈降、細胞融合、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏ ｎ）　、微量注入およびウィルス性トランスフェクションを包含する。

本発明においては、２つのベクター系を用いて、ドロソフイラ細胞中に所望のＨ ＩＶ蛋白または誘導体の遺伝子発現ユニットおよび用いる選択系のコーディング 領域を共トランスフェクションすることができる。本発明の好ましい具体例は、 ＨＩＶ蛋白発現ユニツ、トを有するベクター、例えば、ｐｇｐ　ｌ　２０△３２ 、およびヒグロマイシンＢ遺伝子発現ユニットを含有するベクター、例えば、ｐ ＣＯＨＹＧＲＯを用いるＨＩｖ蛋白の調製である。ｐｇｐ　１２０Δ３２は、ド ロソフィラ・メタロチオネイン・プロモーターからなる発現ユニット、ｇｐ１２ ０遺伝子の誘導体、およびＳＶ４０ポリＡ部位を有する。ｇｐ　１２０発発現ユ ニットｐｃＯＨＹＧＲｏベクター系と組み合わせ、ヒグロマイシンＢ耐性の選択 についての利点を極限まで高めることにより、Ｓ、Ｆロソフイラ細胞中において ｇｐ１２０誘導体を得る。この系と共に、抗生物質のヒグロマイシンＢを用い、 トランス７エクシコンベクターを有するこれらの細胞を選択することができる。

この具体例についてのさらに完全な記載を実施例２に示す。

もう一つ別の例として、ベクターｐｇｐ１２０Δ３２およびｐＨＧＣＯからなる 、ＤＨＦＲ遺伝子／メトトレキセイト選択系を用し−る発現系を用い、メトトレ キセイト耐性細胞発現ｇｐ１２０またはその誘導体を選択することができる。該 ベクターｐｇｐ１２０△３２は、プロモーターがドロソフイラ・メタロチオネイ ン・プロモーターである、ｇｐ１２０遺伝子発現ユニットとからなる。該ｐＨＧ ＣｏベクターはＤＨＦＲ遺伝子発現ユニットからなり、ｐｇｐ１２０△３２と一 緒に共トランスフェクションし、選択に必要なりＨＦＲ遺伝子を提供する。ドロ ソフイラ細胞の共トランスフェクションで選択可能なマーカーが、参考のために ここに挙げる１９８７年５月８日付けのヨハンセン（Ｊ　ｏｈａｎｓｅｎ）らの 米国特許出願第０７１０４７７３６号に記載されている。

本発明によれば、ウィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）ら、セル、１６：７７７（１９７ ９）に記載されている方法を用いて、該２つのベクターをＳ２ドロソフイラ細胞 に共トランスフェクションする。該ベクターを所望の個々のコピー数に依存する 種々の割合にて共トランスフェクションする。ついで、該トランスフェクション 細胞を、例えば、血清および適当な選択剤、例えば、ヒグロマイシンＢまたはメ トトレキセイト含有のＭ、培地中にて選択する。

いったん適当なベクターが構築され、選択ドロソフイラ細胞株中にトランスフェ クションされた場合、ｇｐ１２０の発現は誘発性プロモーター用の適当な誘発剤 を添加することにより誘発される。例えば、カルシウムまたは銅がメタロチオネ インプロモーターの誘発剤である。熱がＨｓｐ７０プロモーターの誘発剤である 。アクチン５Ｃプロモーターのような構成プロモーターの場合、いずれの誘発剤 も発現に必要としない。

前記系におけるＨＩＶ蛋白コーディング配列の転写および発現はモニター観察す ることができる。例えば、サザンプロット分析を用い、ｇｐ１２０遺伝子のコピ ー数を測定することができる。ノザンプロット検定は転写遺伝子配列の大きさに 関する知見を提供する［例えば、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、前記、 参照］。転写水準もまた定量することができる。組換体細胞における選択ＨＩＶ 蛋白の発現は、得られた糖蛋白についてのウェスタンプロット分析および活性試 験を介して証明することができる［実施例５参照］。

ドロップィラＳ、細胞が、特に、本発明の方法における蛋白の高収率産生に適し ている。該細胞は室温（２４±ｌ’ｃ）で懸濁培養中に維持しうる。培地は、５ 〜１０％（Ｖ／Ｖ）熱不活性化胎児ウシ血清（Ｆ　Ｂ　Ｓ）を補足したＭ、であ る。本発明の好ましい具体例において、培地は５％ＦＢＳを有する。誘導後、細 胞を不血清培地にて培養する。ｐｃＯＨＹＧＲｏベクター系を用い°る場合、該 培地をさらに３００μｇ　／　ｍ　＋のヒグロマイシンＢで補足する。この培地 において、Ｓ２細胞を、例えば、２５０　ｍ　ｌ−２０００ｍ　ｌのスピナーフ ラスコ中、５０〜６０ｒｐｍで撹拌しながら、懸濁培養中にて増殖させることが できる。細胞密度を、一般的には、１ｍｌ当たり１０’〜ＩＯ’ｊｉｌｌ胞に維 持する。本発明の１具体例において、細胞を誘導前に、５％血清含宵の培地中、 １５００ｍｌスピナーフラスコにて増殖させる。

細胞培養後、ＨＩＶ蛋白を消費培地から、例えば、モノクローナル抗体アフィニ ティーカラムを使用することにより単離することができる。他の公知蛋白精製工 程、例えば、金属キレート、種々のアフィニティークロマトグラフィ一工程また は吸着クロマトグラフィーを用い、培地からＨＩＶ蛋白を精製することができる 。遺伝子産生物を直接培地中に分泌する細胞株Ｓ、の使用は、本発明の重要な特 徴である。培地への直接分泌は、効果的なｌ工程精製系の利用を可能とする。Ｈ ＩＶ蛋白に対して定方向のモノクローナル抗体カラムを用いる場合、消費培地を 直接数カラムに加え、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１．５Ｍ　ＫＳＣ Ｎを用いて該蛋白を溶出することができる。

本発明のＨＩＶ蛋白の大規模の効果的産生を容易にする好ましい精製方法は、ｇ ｐｌａｏ中に存在する、およびマチュア分泌ｇｐ１２０蛋白中に存在するエピト ープに対して定方向のモノクローナル抗体を含有するイムノアフィニティーカラ ムを用いる。かかるモノクローナル抗体は、１以上の構造にて蛋白配列を認識す る能力を有しているため好ましい。これらの特性を有し、種々のＨＩＶ蛋白、そ の誘導体またはフラグメントのイムノアフィニティーカラムにおいて有用な抗体 を１７８．１を称する。このモノクローナル抗体を実施例３においてさらに詳細 に記載する。該発明のこのようなカラムは、ｐＨ％温度等の適当な従来条件下、 １７８．１の特性を有する抗体をセファデックス（Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘ）のよう な従来の吸着担体と組み合わせることによって製造してもよい。かかる精製カラ ムおよび操作を用い、本発明のＨＩＶ蛋白およびフラグメントを分離することか でさる。

この精製方法において、他の七ツクローナル抗体を用いることができる。ＨＩＶ 蛋白、特に、ｇｐｌａｏまたはｇｐ１２０に対する結合能を有する種々のモノク ローナル抗体が当該分野において開示されており、入手可能である。本発明にて 有用な他の新規モノクローナル抗体は、現在の常法に従って開発することができ る。

本発明によれば、ドロンフイラ細胞によって産生される糖蛋白は、完全に汚染物 質、例えば、哺乳動物酵母、細菌、さらに重要なのは、他のＨＩＶウィルス性物 質物質していない。さらに、ドロソフイラ産生ＨＩＶ蛋白は、他の系、例えば、 哺乳動物系によって報告されているものと異なる型のグリコジル化を有している ことが示されている。

本発明に従って得られたＨＩＶ蛋白および誘導体は、種々の生成物において有用 である。例えば、これら組換体蛋白を、ＨＩＶ感染患者の治療用の医薬組成物に 用いてもよい。本発明によれば、かかる医薬組成物は、治療上有効量の本発明の ＨＩＶ蛋白または誘導体を医薬上許容される担体と混合してなる。該組成物は、 非経口的、静脈内的または皮下的のいずれかにより全身的に投与することができ る。全身投与する場合、本発明にて用いる治療組成物は、パイロジエン不含の非 経口的に許容される水溶液の形態である。ｐＨ，等張性、安定性等を充分に考慮 した、かがる非経口的に許容される蛋白溶液調製は、当該分野における技術範囲 内にある。

投与方法は、薬剤の作用を修飾する種々の因子、例えば、患者の症状、体重、性 別および規定食、感染の重篤度、投与期間および他の臨床因子を考慮して顧問医 が決定する。医薬処方の医薬担体および他の成分は当業者によって選択される。

加えて、本発明の組換体蛋白をワクチン成分として用い、ＨＩＶ感染の予防に哺 乳動物患者に接種してもよい。これらの蛋白は、単独でまｔ；は他の組換体蛋白 または治療掌上のワクチン剤と一緒に用いてもよい。かかるワクチンの成分は当 該分野における当業者によって決定される。

最後に、本発明の蛋白は、ＨＩＶ感染の存在の検出用の診断薬または血液、血清 、唾液等のような生物流体におけるＨＩＶ感染に対する抗体として用いることが できる。さらに、該発明のこれらの蛋白を、生物流体および組織におけるＨＩＶ −結合蛋白または他のＨＴＶ−結合物質、例えば、５ＣＤ４またはその誘導体の 同定および／または単離する方法に用いることができる。したがって、該蛋白は かかる方法を実施するための構成要素である。ＨＩＶ−結合物質を同定するには 、本発明の蛋白とＨＩＶ−結合物質の間の結合を促進する条件下、該蛋白を該物 質または該物質含有の不純混合物と接触させて用いる。結合の存在を検出する従 来の検定、例えば、放射能濃度等の検出もまた該方法の一つである。したがって 、蛋白と結合物質の間の結合の存在はＨＩＶ結合の存在を示唆している。

同様に、混合物からＨＩＶ−結合物質を単離する方法において、結合事象を従来 の操作に付し、混合物から本発明の蛋白によって形成された結合存在物およびＨ ＩＶ−結合物質を精製することができる。かかる診断系およびキットの他の成分 は、診断キットの従来成分であり、当業者によって選択される。

以下の実施例は、本発明の例示的ベクターおよび形質転換体の構築、好ましい精 製系および糖蛋白ｇｐ１２０およびｇｐ１６０の産生水準の測定検定を示す。こ れら実施例は本発明の範囲を限定するものと考えるべきではない。

実質的には業者の指示に従って、制限酵素および他の試薬を用いｔこ。

哀鼻見 実施例１．ベクターの構築 ａ）ｐＭＴｔＰＡ ドロップィラの遺伝子発現用の基本ベクターとして、ｔＰＡ発現ベクターｐＭＴ ｔＰＡ（別に、ｐ　Ｄ　Ｍ　ｔ　Ｐ　Ａと称される）を用いた。

このベクターはベクターｐ　Ｍ　Ｌ　１　％ポイゾン配列を欠失したβ−ラクタ マーゼ遺伝子を含有するスモールｐＢＲ３２２ベクターの誘導体である［メロン （Ｍｅｌｌｏｎ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）　、　２７　＋　２９７　（１９８２） Ｊ。これらの配列はベクターの増幅に対して抑制的である。

このベクターを小片のｐＢＲ３２２を除去する５ａｌｌおよびＡａｔ２で消化し 、消化末端を充填した。ついで、ｐＢＲ３２２の欠失片を、末端−充填ＥｃｏＲ １−５ｔｕ１７ラグメントにおけるドロソフイラ・メタロチオネイン・プロモー ター、つづいてｔＰＡのシグナル配列、プレペプチドおよび完全なコーディング 領域を含有するｔＰＡ配列を有するｐＤｓＰＩ　［ディー・ニス・プファ−（Ｄ 、Ｓ、Ｐｆａｒｒ）ら、ＤＮＡ、４　（６）：　４ａ　Ｉ　（１９８５）］　か らの充填Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　ｌ−３ａｃ　１７ラグメント含有のカセットと置き 換える。このフラグメント上にｔＰＡ遺伝子が、つづいてＳＶ４０初期ポリアデ ニル化部位がある。

ｂ）ｐｇｐ１６０△３２ 完全ｅｎｖ遺伝子含有のＨｉｎｄｌ　ＩＩ−ＸｂａｌフラグメントをＨＩＶ−単 離クローンＢＨ１’０［エル・ラトナー（Ｌ　、　Ｒａｔｎｅｒ）ら、前記；Ｇ ｅｎＢａｎｋ］から単離した。ついで、完全なｇｐ１６０配列をＮｃｏｌ’−Ｘ ｂａｌ消化ベクターｐＤＳＰ　１に挿入した。

得られたベクター、ＳＵ２をＮｄｅｌで消化し、ついで交互ヌクレアーゼで処理 し、その後５ａｃｌで消化し、ｇ　ｐ　１’　６０遺伝子を単離した。Ｎｄｅｌ での消化は、アミノ酸＃３２でｇｐ１６０配列を切断する。Ｓａｃ　ｌ消化は、 ポリリンカー含有のオリジナルｐＤＳＰＩベクターの配列部を含む、ｇｐ１６０ 遺伝子の３′を切断する。

このフラグメントを、Ｂｇｌｌｌで消化した前記の発現ベクターｐＭＴｔＰＡに 挿入し、末端−充填し、その後、５ａｃｌで切断し、マチュアｔＰＡ配列を欠失 させる。該Ｂｇ１１１部位はｔＰＡの第１のアミノ酸に位置・する。その結果、 得られたベクターｐｇｐ１６０△３２は、ｇｐ１６０のＮ−末端３２アミノ酸を セリンで置換した修飾ｇｐｔａｏ蛋白をコードする。

ｃ）ｐｇｐ１２０ＦΔ３２ ＨＩＶ−１表面糖蛋白ｇｐ１６０をフードする修飾遺伝子配列含有の他のベクタ ーを、ｐｇｐ１６０△３２をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃ　ｌで消化し、ｇｐ１ ６０のカルボキシル末端を除去することによって構築した。ｇｐ４１をコードす る配列の約３分の２がこの消化により除去される。すなわち、このｇｐ１６０配 列は、本来のｇＰ１６０配列の最初の３２アミノ酸および最後の２１６アミノ酸 を失っている。該欠失配列を、Ｈｉｎｄ　ｒ　Ｉ　Ｉ　−５ａｃ　ｌフラグメン ト上の停止コドンをコードするショート合成リンカ−配列と置き換えた。６−ア ミノ酸リンカ−配列は以下のとおりである：５’　ＡＧＣＴＴＴＧＡＣＴＧＡＣ ＴＧＡＧＣＴ３″変異体ｇｐ１６０遺伝子含有のさらに別のベクターを、ｐｇｐ 　１６０△３２を５ｔｙ１８よびＸｂａ　ｌで消化し、蛋白ｇｐ４１のすべての 配列およびｇｐ１２０糖蛋白配列のカルボキシル末端での約３０アミノ酸を欠失 することにより構築した。このフラグメントを、５ｔ７１部位からｇｐ　１２０ −ｇｐ４１のプロセッシング部位までの適当なカルボキシル末端をコードする合 成５ｔｙｌ−Ｘｂａｌリンカ−配列で置換した。この配列の後に停止コドンがあ った。その結果、この配列はｇｐ　１２０から最初の３２アミノ酸を減じたすべ てのコーディング配列を有し、ｇｐ４１コーディング配列を全く有変異体ｇｐ　 ｌ　２０遺伝子含有のさらに別の例示的ベクターを以下のように構築した：ｇｐ １２０の７２０塩基対カルボキシル末端７ラグメントを、ｐｇｐ１２０△３２を ＢｇｌｌＩで、ついでＸｂａＩ消化で部分消化することにより単離した。このフ ラグメントをｔＰＡ遺伝子の代わりにＢｇｌＩＩ−Ｘｂａｌ切断ｐＭＴｔＰＡ発 現ベクターに挿入した。得られたベクターｐ１２０△２７４は、最初の２７４ア ミノ末端アミノ酸の代わりにｔＰＡの最初のアミノ酸、セリンを用いたｇｐ１２ ０蛋白をコードする。

ｆ）ｐｃＯＨＹＧＲｏ ＢａｍＨＩおよびＳｍａ　１部位含有の商業上入手可能なプラスミド、ｐＵＣｌ 　８　［ＢＲＬ］　を用いた。組入れＣ０ＰＩＡ因子（３５７塩基対）からの５ ’　ＬＴＲをベクターｐＵｃ１８のＢａｍＨ１部位にクローンし、ｐＵｃＯＰＩ Ａと称されるベクターを得た。Ｃ０ＰＩＡは、ドロンフィラゲノムから散乱する ことが判明した分散中位反復配列の代表的なものである［ルピン（Ｒｕｂｉｎ） ら、コールド・スプリング・ハーバ−・シンブト・ファント・パイオール（Ｃｏ ｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ、）　＋　 ４５　：　６１９　（１９８０）〕。ベクターｐＵＣＯＰＩＡをＳｍａ　Ｉ部位 で切断し、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼをコードするイー・コリ ー遺伝子（ヒグロマイシンＢカセット）を、標準クローニング法を用いてｐＵｃ ＯＰＩＡにクローンした。該ヒグロマイシンＢカセットはベクターＤＳＰ−ｈｙ ｇｒｏから１４８１塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ７ラグメントにて単離 した［ゲルツ（Ｇｅｒｔｚ）ら、シフ　（Ｇｅｎｅ）、２５　：１７９　（１９ ８３）］　。該ヒグロマイシンＢカセットは、ヒグロマイシンＢホスホトランス フェラーゼ遺伝子をコードする配列およびＳＶ４０初期ポ初期ポリ全領域る。Ｈ ｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ部位をＴ、ＤＮＡポリメラーゼを用いて充填し、 ヒグロマイシンＢカセットをベクターｐｃＯＨＹＧＲｏ産生のベクターｐＵｃＯ Ｐ　ＩＡのＳｍａ　１部位に連結した。

実施例２．ドロソフィラＳ２細胞へのトランスフェクションｐｃＯＨＹＧＲｏを 、前記のドロップィラ・メタロチオネイン・プロモーターの調節下、ｇｐ１６０ 変異体遺伝子を保持する１個のベクターと一緒にＳ２ドロソフイラ細胞に共トラ ンスフェクションした。この実施例の目的に使用したベクターはｐｇｐ１２０△ ３２である。トランスフェクション細胞を、５％血清および３００μｇ／ｍ＋の ヒグロマイシンＢ含有のＭ、培地にて選択した。同一条件下で２〜３日後、非ト ランスフェクション細胞は分割を停止し、死滅し始める。トランスフェクション 培養にて安定した増殖ヒグロマイシンＢ耐性細胞を得るための選択期間は約２〜 ３週間である。

種々のコピー数のｇｐ１２０変異体遺伝子をその染色体中に組み入れた培養体を 得るために、２種のベクターの比率を変えた。該実施例における比率は２０：ｌ であった。本発明の他のｇｐ　ｌ　６０変異体ベクターに対して同様の比率を用 いた。この比率は、いずれのｇｐ１６０変異体ベクターを用いる場合でも同じで ある。

５００μＭのＣｕＳＯ４でメタロチオネイン・プロモーターを誘発した後、ｐｇ ｐ１２０△３２遺伝子産生物の発現を確認した。誘発細胞培養からの消費上澄の ウェスタンプロット分析は、約１００ｋｄにて単−帯を示した。

細胞上澄における変異体ｇｐ１６０遺伝子産生物の濃度を、実施例４に記載のｇ ｐ１２０ＥＬＩｓＡ検定を用い、標準体として精製したウィルスｇｐ１２０を用 いて測定した。５ＸｌＯ’細胞／ｍｌを血清不含のＭ３培地に接種し、３〜４日 間日間口た。該上澄にて測定したｇｐ１２０の濃度は約１〜２ｍｇ／ｌである。

２５０ｍ１〜２０００ｍ１のスピナー７２スコ中、細胞を懸濁培養として維持し た。培地は３００μｇ／ｍＩのヒグロマイシンＢを補足したＭ、であった。培養 体を２４±１℃にてインキュベートし、５０〜６０ｒｐｍで撹拌した。典型的に は、ヒグロマイシンＢを補足したＭ、培地中、細胞密度を１０’〜ｌ、　Ｑ　’ ｍ胞／ｍ目こ維持した。

Ｃｕ　Ｓ　Ｏａを５００μＭの最終濃度まで加え、修飾ｇｐ１２０糖蛋白を収集 する前に、該培養体を血清不含培地中にて３〜４日間増殖させた。

この方法に従って得られた蛋白は約１００ＭＷであり、発現水準はいずれかの真 核細胞系にて報告されている他のいずれのｇｐ１２０／ｇｐ１６０発現よりも高 度であった。標準生物活性検定において、前記のように発現した精製修飾ｇｐ１ ２０は、組織培養にてウィルス感染を阻害する能力を有し、Ｔ４と結合し、ｇｐ １２０に対する抗体に反応する。

ｐｇｐ１２０△３２にてコードした蛋白フラグメントについての前記に例示した 系および操作と実質的に同様の系および操作を用いて、他のｇｐ１６Ｑおよびｇ ｐ１２０蛋白およびそのフラグメントを発現しうると考えられる。

実施例３．モノクローナル抗体　１７８．１新規なモノクローナル抗体を用いる アフィニティー精製カラムを、前記の変異体ｇｐ１６０／ｇｐ１２０蛋白に適用 される精製系に用いた。このモノクローナル抗体は、細胞溶解産物中に存在する 非変性ＨＩＶ糖蛋白産生物および酵母培養の上澄中に分泌されるようなマチュア ｇｐ１２０との反応能を有することで特徴付けられる。非プロセスｇｐ１６０組 換体分子およびフルサイズのプロセスｇｐ１２０蛋白の両方に含まれるエピトー プに対して特異的であるかかるモノクローナル抗体の一つは、マウスモノクロー ナル抗体１７８゜１である。

シー・アルビカンス（Ｃ、ａｌｂｉｃａｎｓ）のグルコアミラーゼプロモーター およびシグナルペプチドを用いる発現系を用い、部分的に精製した１７８．１産 生用の酵母−組換体ｇｐ１６０を得た。この酵母誘導ｇｐ１６０の産生は、共同 で継続中の１９８８年８月２５日付けのプルツク（Ｂ　ｒｕｃｋ）ら、米国特許 出願第０７／２３６６９９号に記載されている。この出願を参考のためにここに 挙げる。

８週齢のＢａ１ｂ／ｃマウスに、４週間間隔で、７０インド・アジュバント中の 部分精製（１，５〜３％純度）酵母組換体ｇｐ１６０を皮下内および腹腔内に３ 回注射した。３力月の休息期間後、１匹のマウスを殺し、その牌臓細胞を骨髄腫 細胞と融合させた【例えば、アール・ピー・シラガニアン（Ｒ、Ｐ　、　Ｓ　ｉ ｒａｇａｎｉａｎ）ら、メト・エンズ（Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ−）、９２　：１７　 （１９８３）；　ＥＭＢＯＣｏｕｒｓｅ　ｏｎ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｐｒｏｄ ｕｃｔｉｏｎ、　Ｂａ５ｅｌ　Ｉ　ｎｓｔ、ｆｏｒ　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ）（１９ ８０）参照］。用いた骨髄腫細胞は、寒天培地における最適増殖用に予め選択し たＳＰ、／○−Ａｇ１４株のサブクローンである［ジェイ・ディー・７ランセン （Ｊ　、　Ｄ　、　Ｆ　ｒａｎｓｓｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ。

ＸＸ　ＩＸ　Ｃｏ１１ｏｑ、　Ｐｒｏｔｉｄｓ　Ｂｉｏｌ、　Ｆｌｕｉｄｓ）　 、２９　：　６４５−６４９　（１９８１）］。約１０日後、捕獲抗体として市 販の単特異性抗ｇｐ１２０試薬［バイオコルム・セロメト・レフ（Ｂ　ｉｏｃｈ ｏｒｍ。

Ｓｅｒｏｍｅｄ　Ｒｅｆ、　Ｄ　７３２４］を用い、捕獲ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法にお けるスクリーニングにて摂取した。

簡単には、Ｎ　ｕｎｃ免疫プレートＩ　（ｎｒ４−３９４５４）を、５ｐｇ／ｍ Ｉのヒツジ抗ｇｐ１２０１ｇＧｓ／ＰＢＳ溶液５ｏｐｌを用い、４℃にて一夜コ ートした。該プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ。

０．１％ツウィーン２０　（Ｔｗｅｅｎ２０）　）で洗浄し、３７℃にて１時間 、浸潤緩衝液［ＰＢＳ、４％新生子ウシ血清ＣＮｅｗｂｏｒｎ　Ｃａ１ｆＳ　ｅ ｒｕｍ）、１％ウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）、０．１％ツウィーン２０１ で浸潤させた。粗Ｍｏ１Ｌｓ／　ＨＴ　Ｌ　Ｖ−１１１ｓまたはＭ　ｏ　ｌ　ｔ 　ｓ細胞溶解産物ＣＰＢＳ１ｍｌ当たり１０７細胞、１％トリトンＸ−１００） または組換体−酵母ｇｐ　ｌ　６０の上澄フラクション（Ｓ２−３０）（または 同様に処理した陰性対照）５０μｌ／ウエルを抗原として用い、室温にて３〜５ 時間、該プレートにてインキュベートした。該プレートを十分に洗浄し、雑種細 胞上澄５０Ｐ＋を各ウェルに加え、４℃にて一夜インキュベートしｔ；。洗浄工 程後、浸潤緩衝液中、ビオチニル化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）抗マウスイム ノグロブリン（Ｉ　ｇ　ｓ）　（Ａｍｅｒｓｈａｎ＋　Ｒｅｆ、　ＲＰＮ　１０ ２１）の１１５００希釈溶液５０μｍ／ウェルを、３７℃にて１時間、該プレー トにてインキュベートした。該プレートを再度洗浄し、浸潤緩衝液中、ストレプ タビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）ビオチニル化ホースラディツシュパーオ キシダーゼ複合体（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｒｅｆ、　ＲＰ　Ｎ　１０５１　）の１ ／１０００希釈溶液５０μｍ／ウェルを各ウェルに加えた。

さらに洗浄工程を行った後、０．４ｍｇ／ｍｌのオルトフェニレンジアミンジヒ ドロクロリド（ＯＰＤ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）　Ｐ　ｌ　５２６）および０．１ ％ツウィーン２０を補足した１μ！／ｍ１のＨｌｏ。

（３０％、クエン酸／クエン酸ナトリウム０，１Ｍ％ｐＨ５）の溶液５０μｌを 各ウェルに加えた。ついで、該プレートを、暗室中、室温にて２０分間インキュ ベートし、２ＭＨ！Ｓ０．５０μｍ／ウェルを添加して反応を停止した。λ＝４ ９２ｎｍでの最適密度をモニター観察し、さらに、ビー−ヘリオン（Ｐ、Ｈｅｒ ｉｏｎ）らのＰｒｏｃ、ＸＸｒＸ　Ｃｏ１１ｏｑ、　Ｐｒｏｔｉｄｓ　Ｂｉｏｌ 、　Ｆｌｕｉｄｓ、　２９　：　６２７　（１９８１）に従って、５０の陽性ク ローンをソフトアガロースにおけるサブクローニングで選択した。ついで、プリ スタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を腹腔内注射するこ とにより予め処理したＢａ１ｂ／ｃマウスの腹膜腔に、２〜５Ｘ１０’個の雑種 細胞を注射することで、クローン化雑種細胞をｉｎ　ｖｉｖｏにて増殖しｔこ。

前記操作より選択されたモノクローナル抗体は、ウェスタンプロット分析（ＷＢ ）、ラジオイムノ沈降検定（ＲＩ　ＰＡ）　、精製、ビオチン−標識および競合 検定によって特徴付けられた。得られたモノクローナル抗体はさらに、種々の組 換体および原生抗原に対する反応性を分析することにより特徴付けられた。

高収率の雑種細胞がこの方法によって得られた。２００以上のウェルがスクリー ニング検定において陽性であった。しかしながら、それらのうち、５０個のウェ ルのみを選択し、クローニング後、該細胞は腹水酸（ａｓｃｉｔｉｃ　ａｃｉｄ ）にて発展した。該腹水流体のすべてをＷＢおよびＲＩＰＡで試験した。試験し た３９個のモノクローナルのうち、３７個はＲＩＰＡにてｇｐ１６０結合を示し た。その同じ検定においていずれもｇｐ　ｌ　２０フオームと反応しなかった。

ＷＢにてｇｐ　１２０に対して明らかに反応性であるが、ＲＩＰＡにおいてはｇ ｐ１６０認識のみを示すモノクローナル抗体をサブクラスで分析した。ＩｇＧ２ Ａである３種のモノクローナルを蛋白Ａ−セファａ−スカラムおよびビオチン標 識において精製した。抗原としてワクシニアｇｐ１６０を用いる競合検定を行い 、得られた結果により、ｇｐ　ｌ　６０蛋白で、少なくとも５種の異なる群のエ ピトープ認識が明らかとなった。マチュアｇｐ１２０および非プロセス細胞間ｇ ｐ１６０に存在するエピトープにてモノクローナル１７８．１を選択しｊこ。

ウェスタンプロット（ＷＢ）分析を常法に従って行い、１７８゜１がＨＴＬＶ− Ｉ　Ｉ　１．感染のヒト細胞から単離したＨＩＶウィルス［Ｍｏｌ　ｔｓ／　Ｈ Ｔ　Ｌ　Ｖ　ｒ　Ｉ　Ｉ　ｌｌｌ　と結合する能力を有することを測定した。

ラジオイムノ沈降検定（ＲＩ　ＰＡ）を、アール・ジェイ・カンキ（Ｒ，Ｊ、Ｋ ａｎｋｉ）らのサイエンス、２２８　：１１９９　（１９８５）の記載方法に従 って行い、１７８．１がＨＴＬＶ−Ｉ　Ｉ　Ｉウィルス株で感染したヒト細胞を 免疫沈降させうろことを測定した。

ラージパネルの抗原に対する非オーバーラツプエピトープを認識するモノクロー ナル抗体の反応性を、捕獲試薬としてヒツジ抗ｇｐ１２０を包含するサンドイッ チＥＬ　Ｉ　ＳＡを用いて検定した。組換体技１１にヲ用イ、ＲＩ　ＰＡ、ＷＢ またはＥＬ　Ｉ　ＳＡ４：てＨＴＬＶ−ｌｌ１Ｂについて試験した場合、明らか に陽性であったが、モノクローナル抗体１７８．１は、ディバージエントＨＩＶ 単離体、Ｍ　ｏ　ｌ　ｔ。

／ＨＴＬＶ−１１Ｉｎ、Ｈ９／ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｉ　Ｉ”’およびＨｕｔ７８　／ 　Ａ　ＲＶ　ｘでのＥＬ　Ｉ　ＳＡにて陰性であった。このモノクローナルは、 ｇｐ１６０およびｇｐ１２０の間で明らかに保護されているエピトープを認識す るため、以下の実施例４に記載の精製方法を用いた場合、種々の構築のｇｐ１６ ０／ｇｐ１２０糖蛋白の生成において付加的な利点を提供する。

実施例４．ドロンフィラー調整細胞培地がらのｇｐ１２０Δ３２の精製 実施例２からの組換体ｇｐ１２０蛋白を以下のように精製した：ｇｐ　ｌ　２０ Δ３２含有のドロンフィラー調整培地（ＣＭ）３０リツトルを、１ｍＭフェニル メチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ ＥＤＴＡ）および７０カリクレイン抑制剤ユニツトで調製した。ＣＭをペリコン （ｐｅｌｌｉｃｏｎ）　（ミリボール（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）　）装置を用い、 ０．４５μｍのデュラポール（Ｄ　ｕｒａｐｏｒｅ）膜を介して濾過した。濾過 したＣＭを、２０ｍＭの２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（ ｐＨ６，０）含有の緩衝液Ａにて平衡にした、Ｓ−セファロース・ファーストフ ォロー（ｙ７−？シア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　）　（５、１リットル；２５． ２ｃｍＸｌ１ｃｍ）に３７ｍ１／Ｃｍ２・時の線状流速（ＬＦＲ）で加えた。す べてのＣＭを加えた後、該カラムを２０ｍＭのＭＥＳ（＋）Ｈ６−０）、０．４ ＭのＮａＣＩ含有の緩衝液Ｂで１工程にて溶出した。

セファロース溶出のｇｐ１２０△３２を、１０ｍ１／Ｃｍ”時のＬＦＲで抗−ｇ ｐ１２０マウスモノクローナル−セファロース４Ｂカラム（６０ｍｌ　；　３． ２ｃｍＸ６．５ｃｍ）に加えた。こりカラムを緩衝液Ｂで平衡にした。ワン−ハ ーフＳ−セファロースプールの適用後、該カラムを１カラム容量の緩衝液Ｂ、２ カラム容量の２０ｍＭ　ＭＥＳ　（ｐＨ６，０）、１．ＯＭのＮａＣ１（緩衝液 Ｃ）、および２カラム容量の緩衝液Ａで洗浄した。ｇｐ１２０△３２を０６１Ｍ 酢酸、ｐＨ２，８で溶出し、７ラクシヨンを直ちに０．１容量の１Ｍトリス（ヒ ドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒ　ｉ　ｓ）　、ｐＨ１０，４を加えること により中和した。

マウス抗−ｇｐ１２０モノクローナル抗体雑種細胞１７８．１を前記の実施例３ に従って産生じた。この雑種細胞を２ＸＩＯ’細胞／ｍ　ｌ　ｆｍｌＬ、４．５ ｇ／ｌのグルコース、２μＭグルタミンおよび１０％血清を補足したヅルベツコ 修飾イーグル培地（Ｄ　ｕ　１ｂｅｃｃｏ’　ｓＭｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ 　Ｍｅｄｉｕｍ）　［ハゼルトン・リサーチ・プロダクツ（Ｈａｚｅｌｔｏｎ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）コにて４日間培養した。１７８．１抗体 含有のＣＭを濾過（０，２μｍ膜）し、Ｏ，１Ｍ）リス、ｐＨ８，２にて平衡の 蛋白Ａ−セファロース（フデー？シフ）（１７ｍｌ　；　１．５ｃｍＸｌｏｃｍ ）に適用する。抗体をＯ，１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ３，５で溶出し、直ち にトリスで中和した。

精製した抗ｇｐ１２０モノクローナル抗体を、製造業者の指示に従い、２ｍｇ抗 体／ｍｌ［脂の密度で、９８％のカップリング効率テＣＮ　Ｂ　ｒ　−活性化セ ７アロース４Ｂ（７アーマシア）に用い、抗−ｇｐ１２０−セファロース−アフ ィニティー樹脂を得た。このアフィニティー樹脂は、特異的に、抗体とｇｐ　ｌ 　２０における独特構造のエピトープとの相互作用を介してｇｐ１２０蛋白と結 合する。

この精製方法によれば、最終ｇｐ　ｌ　２０蛋白産生物の純度は、８゜５ｍｇ／ ３０リットルの調整培地の概算値で８０〜９０％である。

回収は２５〜５０％と概算する。

この精製方法およびアフィニティー樹脂はまた、このエピトープを有する他のＨ Ｉ　Ｖｉ白またはそのフラグメントでも効果的であると考えられる。

実施例５．検定 以下の検定は、ｇｐ１２０またはその７ラグメントの検出用の酵素および基質を 用いる非−同位元素検定であり、それを本発明の方法および構成によって産生さ れるｇｐ　ｌ　２０蛋白の検出に用いる。

該検定において、ｇｐ１２０を検出する判断基準は、抗体の特異性に依存してい るｓ　Ｏ，１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）中にて２μｇ　／　ｍ　ｌ に希釈した抗−ｇｐ　１２０モノクローナル抗体［デュポン（ＤｕＰｏｎｔ）　 、　Ｃａｔ、Ｎｏ−９２８４］　を用い、ｇｐ１２０蛋白を捕獲する。この抗体 希釈溶液１００μｍを、対照のウェル以外、検定プレートにおける全く同一の各 ウェルに加える。該プレートを４℃にて一夜インキユベートする。該抗体を翌日 に洗い流し、ＰＢＳ中、１％ＢＳＡからなる遮断緩衝液３００μｍを各ウェルに 加えることにより、該プレートを室温にて１時間遮断した。

ウィルス性ｇｐ１２０標準体を、ＰＢＳおよび０．０５％ツウィーン２０からな る洗浄緩衝液中、ｌμｇ／ｍ＋、０．５μｇ／ｍ＋。

０．２５μｇ／ｍｌｓ　０．１μｇ／ｍｌおよび０．２μｇ／ｍｌに希釈した。

該希釈標準体１００μｌを全く同一の各ウェルに加える。

該プレートを室温にて２時間、プレート振盪器上にてインキュベートし、その後 、各プレートを洗浄緩衝液で４回洗浄した。

各ウェルに、洗浄緩衝液中、１／１０００に希釈したウサギ抗−ｇｐ　ｌ　２０ 抗体（デポラフ（Ｄ　ｅ　Ｂ　ｏｕｃｋ）ら、１９８７年５月２９日付けの米国 特許出願第０７１０５６５５３号）１００μｌを加え、各々を振盪器上にて１時 間インキュベートした。この第２の抗体はｇｐ　１２０を２つの抗体の間にはさ みこむ。その後、該プレートを洗浄緩衝液で４回洗浄した。この複合体を検出す るのに、第３の抗体、アジドを有さない洗浄緩衝液にて希釈した、パーオキシダ ーゼ（ＰＯＤ）　ｓ［識のヤギ抗−ウサギ抗体（大部分、ＩｇＧおよび■ｇＭ抗 体）１００μｍを各ウェルに加える。ついで、該プレートを振盪器上、室温にて ２時間インキュベートした。

該プレートを４回洗浄した後、無色基質（緩衝液１０ｍ１中、３５％過酸化水素 ４μｍで、クエン酸塩緩衝液中、１ｍｇ／ｍｌの０ＰＤ）１００μｌを加えた。

基質をウェルに加える直前に過酸化水素を加えた。このプレートを振盪器上にて ８分間インキュベートとし、Ｏ，１Ｍフッ化ナトリウム１００μｌを各ウェルに 加えて反応を停止させた。パーオキシダーゼ結合抗体の存在下、該基質は深黄色 に変わる。光学濃度、または色相強度は捕獲ｇｐ１２０の量に比例し、それを４ ５０ｎｍにてプレート読み取り機にて読み取り、算定した同定試料濃度で標準曲 線を作成する。上澄培養体におけるｇｐ１２０の量をこの標準曲線と比較するこ とにより決定した。

前記記載およに実施例は、その好ましい具体例を含め、本発明を十分に開示して いる。記載方法の修飾、例えば、他の切形のｇｐ１６０／ｇｐ１２０配列を用い ることは、分子遺伝学および関連科学の分野における当業者にとっては明らかで あり、以下の請求の範囲の範囲内とする意図である。

国際調査報告 １ｆｌｌ＃Ｉ、ａｌ１６Ｍａｌ　Ａｏ＋ｌｌｌ＋＃１１６゜ｋ　ＰＣＴ／ＬＩＳ 　８９１０５１５５ＰＣＴ／ＩＪＳｋ１９１０５１５５ 飄セｔａｃｈｍｅｎセ　セｏ　ｐＣＴ　てｓｘ／２１ｕＰａｒｅ　Ｔ工、Ｆｉｅ ｌｄｓ　５ｅａｒｃｈｅｄ’、ＴＶ、イｒＬＶ、ｇｐ　Ｌもｕ、ｇｐ　１２υ、 ｔｎｓｅｃセ　ｃｅｌｌ、ＤｒｏｓｏｐｈｉＬａ　ｃｅＬｌ＋ｒｅｃｏｍｂｉｎ ａｎｅ、ｅｘｐｒｅｌｓ、ｖａｃｅｏｔ、ａｔｆｉｎｉｔｙ、ｉｍ＋ｎｕｎｏｐ ｕｒｉｆｙ。

＋ｎｏｎｏｃ１ｏｎａｔ　ｒｅｖｉｅｗ、ｖａｃｃｉｎｅ＋　ａｃｔｉｎ　ｐｒ ｏｍｏｔｅｒ、ｍ＠ｔａ−′Ｌｏしｈｉｏｎ＊ｉｎ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ、Ｓｃｈ ｎｅｉｄｍｒ　ｃｅｌｌ、ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎＰＣＴ／１Ｊ５ｓ９／ｕ５１５ ｓ ζセセａｃｈｍｓｎセ　ヒＯＰＣＴ／ｌ５ＩＩ／２１ＬＪＶＸ、○ＢｓＥ＄ｌＶ ％ＴＩ凸Ｎ５　Ｗ’ＪＥローＩＪＮＹτＹ＾Ｆ　Ｉ”ＭＮＴ工＾Ｎ　ｔｓ　ｆ、 （ＣＫＴＮＧ

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．ＨＩＶ蛋白についてのＤＮＡコーディング配列と、ドロソフィラ細胞内での 該コーディング配列の転写および翻訳に必要な調節要素とからなるＨＩＶ蛋白遺 伝子発現ユニット。
2. ２．調節要素がアクチン５Ｃプロモーターまたはドロンフイラ・メタロチオネイ ン・ブロモ−ターからなる請求項１記載の遺伝子発現ユニット。
3. ３．ｇｐ１２０またはｇｐ１６０ＤＮＡコーディング配列からなる請求項２記載 の遺伝子発現ユニット。
4. ４．ｐｇｐ１６０Δ３２、ｐｇｐ１２０ＦΔ３２、ｐｇｐ１２０Δ３２またはｐ ｇｐ１２０Δ２７４中に存在するＨＩＶ　ＤＮＡコーディング配列からなる請求 項３記載の遺伝子発現ユニット。
5. ５．請求項１記載の遺伝子発現ユニットからなるＤＮＡベクター。
6. ６．請求項５記載のベクターでトランスフェクションしたドロソフィラ細胞。
7. ７．請求項６記載の昆虫細胞の培養にて産生されるＨＩＶｇｐ１２０またはｇｐ １６０蛋白。
8. ８．ＨＩＶ感染に対する保護を刺激するワクチンであって、免疫保護量および非 毒性量の請求項７記載の蛋白からなるワクチン。
9. ９．請求項７記載の蛋白からなるヒト患者におけるＨＩＶ感染検出用診断薬。
10. １０．ＨＩＶ蛋白遺伝子発現ユニットでトランスフェクションした、該蛋白の発 現能を有するドロンフィラ細胞を適当な培地にて培養することを特徴とするドロ ソフィラ細胞におけるＨＩＶ蛋白の産生方法。
11. １１．細胞を、ヒグロマイシンＢホスホトランス７フェーゼについてのコーディ ング配列を有する第１のベクター、およびＨＩＶ蛋白遺伝子発現ユニットについ てのコーディング配列を有する第２のベクターでトランスフェクションする請求 項１０記載の方法。
12. １２．第１のベクターがｐＣＯＨＹＧＲＯである請求項１１記載の方法。
13. １３．第２のベクターが、ｐｇｐ１６０Δ３２、ｐｇｐ１２０ＦΔ３２、ｐｇｐ １２０Δ３２またはｐｇｐ１２０Δ２７４中に存在するＨＩＶ遺伝子発現ユニッ トからなる請求項１１記載の方法。
14. １４．ドロソフィラ細胞がディー・メラノガスターＳ２細胞である請求項１０記 載の方法。
15. １５．Ｓ２細胞をベクターｐＣＯＨＹＧＲＯと、ｐｇｐ１６０Δ３２、ｐｇｐ１ ２０ＦΔ３２、ｐｇｐ１２０Δ３２またはｐｇｐ１２０Δ２７４中に存在する遺 伝子発現ユニットからなるベクターで共トランスフェクションする請求項１４記 載の方法。
16. １６．ＨＩＶ結合物質を請求項７記載の蛋白と接触させ、該物質と該蛋白との間 の結合の存在を検定し、かかる結合がＨＩＶの結合を示すことを特徴とするＨＩ Ｖ結合物質の同定方法。
17. １７．非変性ｇｐ１６０蛋白産生物およびマチュアｇｐ１２０蛋白に存在するエ ピトープと反応能を有するモノクローナル抗体を含有するアフィニティー樹脂を 用いることを特徴とする請求項７記載のＨＩＶ蛋白の精製方法。
18. １８．非変性ｇｐ１６０蛋白産生物およびマチュアｇｐ１２０蛋白に存在するエ ピトープと反応能を有するモノクローナル抗体を含有するアフィニティー樹脂を 用いることを特徴とする請求項１０記載の方法によって産生されるＨＩＶ蛋白の 精製方法。