KR0152525B1

KR0152525B1 - 드로소필라 세포에서의 hiv 단백질의 발현

Info

Publication number: KR0152525B1
Application number: KR1019900701678A
Authority: KR
Inventors: 란취 요한센 하네; 로젠베르그 마틴
Original assignee: 스튜아트 알·슈터; 스미스클라인 비참 코포레이션
Priority date: 1988-12-01
Filing date: 1989-11-29
Publication date: 1998-10-01
Anticipated expiration: 2009-11-29
Also published as: DK104991D0; IL92470A0; JP3085704B2; CA2003794C; AU4755290A; JPH04501954A; FI113475B; IL92470A; AU630649B2; NO912099D0; PT92477A; KR910700344A; WO1990006358A1; ZA899150B; NO912099L; DK175461B1; EP0446272A4; CA2003794A1; EP0446272A1; DK104991A

Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]

드로소필라 세포에서의 HIV 단백질의 발현

[발명의 분야]

본 발명은 일반적으로 드로소필라(Drosophila) 세포에서의 HIV 단백질의 발현 및 발현된 유전자 생성물의 정제방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 본 발명 발현 시스템에 의한 신규의 돌연변이 gp160 및gp120 유전자 생성물의 제조방법에 관한 것이다.

[발명의 배경]

사람면역결핍증 바이러스 형태(HIV-1)은 AIDS로 공지된 후천성 면역 결핍증의 병인제이다. 이 레트로바이러스는 긴 말단 반복(long ternimal repeat : LTR), gag, pol 및 env 유전자 및 기타 유전자를 포함하는 복잡한 유전적 조직체를 갖는다. 이 레트로바이러스는 단독으로 또는 보호 면역 반응을 유도할 수 있는 백신 시약과 협력하여 효능있는 캔디 데이트인 다수의 바이러스 항원을 함유한다.

더욱 유망한 HIV-1 항원중에는 바이러스 외막 당단백질(gp160) 또는 이의 특이성 단편이 있다. env 유전자는 바이러스 외막의 160킬로달톤(Kd) 전체구 당단백질을 암호화한다. gp160은 해독 후 120kd 당단백질(gp120) 및 41kd 당단백질(gp41)로 분해되는데, 이들은 바이러스 표면에 존재한다.

gp120 즉 511 아미노산 당단백질은 gp160 당단백질의 아미노말단 2/3 상에 존재하고 바이러스의 외부에 노출되어 있다. gp120은 바이러스와 이의 세포수용체, 헬퍼 T₄임파구, 대식세포 및 면역시스템의 다른 세포의 표면상에 존재하는 CD4 단백질과의 상호작용에 중요하다. 따라서 gp120은 바이러스 감염의 조직 선택성을 결정하고 합포세포 형성에서 이의 연루를 통해 HIV의 세포병원성에 기여한다.

gp41 즉 pg160의 카복실 말단으로부터 유도된 345 아미노산 단백질은 HIV-1의 구성막 단백질이다. gp41은 세포원형질 막의 지질 이층에서 단백질을 정착시키는 소수성 아미노산 계열을 함유한다. gp41의 카복실 말단은 바이러스 입자내로 둘출되어 있는 것으로 여겨진다. gp41 또는 이의 부분은 세포의 표면에서 발현된 HIV 당단백질과 표면 T₄수용체를 나타내는 세포사이의 융합에 관여하는 것으로 믿어진다. 이융합에 관여하는 것으로 믿어지는 gp41의 부분은 아미노 말단에 위치한다. 이러한 융합은 바이러스 복제에서 작용하는 것으로 믿어진다. [참조: M. Kowalski et al, Science, 237: 1351-55(1987); D.M. knight et al, Science, 236: 837-36(1987)]

이들 바이러스 당단백질은 바이러스 입자의 표면으로부터 외부로 돌출하는 바이러스 스파이크로서 3차 구조인 것으로 추정된다. 약 70 내지 80 스파이크는 각각 새로이 합성된 바이러스 입자와 관련이 있는 것으로 믿어진다. 바이러스 입자 수명으로서, 스파이크는 명백하게 gp120과 gp41사이의 연관도가 약해지기 때문에 사라진다. 따라서, 새로이 합성된 바이러스 입자에 대하여, 이 바이러스 당단백 스파이크는 감염을 수반하는 면역 시스템에 근접하기 쉬운 가장 인접한 표적인 것으로 믿어진다.

바이러스 중화 항체는 gp120 및 gp41 에피토프에 대해 지시되는 것으로 보고되었다. 특히 형태 특이적 중화 항체에 대한 표적부위는 gp120 당단백질 분자의 3'반에 위치하는 것으로 알려졌다.

따라서 HIV-1의 env 유전자는 수많은 최근의 조사의 표적이 되어왔다. 글리코실화된 gp160의 발현은 포유동물 세포 및 특정의 바큐로바이러스 곤충 세포에서 이들 항원에 대한 체액 및 세포 면역반응 둘 다를 유도하는 것으로 보고된 그룹에 의해 수득되었다. gp120은 여러 시스템에서 이종성 프로모터를 사용함으로써 재조합적으로 발현되었다. [참조: S. Chakrabarti et al, Nature (London), 320: 535(1986); S. I. Hu et al, Nature(London), 320: 537(1986); 및 M.P. Kieny et al, Biotechnology, 4: 790(1986)].

문헌[참조: L.A. Laske et al, Science, 233: 209-212(1986)]에는 포유동물 세포, 특히 중국산 햄스터 난소(CHO)세포 내로 형질감염시키기 위한 돌연변이체 env 유전자를 함유하는 다수의 플라스미드를 작제하였다. 이들 연구원은 env 단백질의 아미노산 서열(#61-#531), HBsAg 폴리A 시그널, DHFR 유전자 및 SV40복제원 장에 연결된 당단백질 D(gD) 단백질의 첫 번째 50아미노산을 함유하는 플라스미드에서 암호화된 유전자 생성물을 분비한다. 재조합 외막 항원은 이의 아미노 말단에서 gD의 25 아미노산을 함유하고 gp120으로부터 진행된 성숙체로부터의 30잔기가 부족하고, 또한 gp41 서열(카복실말단의 약 20아미노산 내지 전구체 진행 부위의 실제적인 160kd)의 결실을 갖는 것으로 생성된다. 생성된 유전자는 520 아미노산 길이이다. CHO 세포내로 형질감염되는 경우, 세포-조절된 상등액은 gp130으로 칭하는 130kd 단백지을 함유한다.

그후의 보고[참조: L.A. Lasky et al, Cell, 50: 975-986(1987)]에는 gp120 당단 백질과 이의 세포 수용체, CD4와의 상호작용이 논의되어 있다. gp120의 아미노산 #410-421내에 함유되어 있는 12 아미노산을 결실시킴에 의해, 결합의 완전한 손실이 야기된다. 유사하게, 417위치에서의 단일 아미노산 치환으로는 감소된 결합이 야기된다.

상기 언급된 코발스키(Kowalski)등은 HIV-1의 HTLV-III_B균주로부터 유도된 외막 당단백질을 암호화 하는 플라스미도 내로 결실 및 삽입 돌연변이 유발을 도입하였다. 플라스미드는 또한 art 유전자를 함유한다. tat 유전자 생성물을 발현하는 포유동물 CD4+ 및 CD4- 셀라인은 형질 감염된 세포의 융합에 대한 능력을 연구하기 위한 형질감염 수용체로서 사용된다.

상기 언급된 나이트(Knight)등은 포유동물 세포에서 HIV의 art/trs 교차 활성화제 단백질의 발현을 기술하였다. 이들 HIV 단백질의 발현을 위해 사용되는 포유동물 셀라인은 COS-7 원숭이 셀라인이다. 이들 프라스미드는 프로모터 및 SV40으로 부터의 RNA로서 삽입된 DNA를 발현한다. gp120을 발현시키기 위해, 플라스미드 pENV 160을 HIV LTR에 융합된 env 유전자의 전체 암호와 영역을 함유하도록 발전시킨다.

문헌 [참조: S.W. Pyle, Aide Research and Human Retroviruses, 3(4): 387(1987)]에는 HIV 감염된 H9 세포의 배양액으로부터의 gp120 당단백질을 면역친화성 크로마토그라피에 의해 정제하는 방법이 기술되어 있다.

미합중국 특허 제4,725,669호에는 또한 각각 대략90kd의 글리코실화 되지 않은 잔기를 갖는, 인체 H9/HTLV-III 셀라인으로부터 수득된 대략 160kd 및 120kd의 당단백질이 기술되어 있다.

문헌[참조: Fox, Biotechnology, 6: 116(1988)]에는 MicroGeneSys에 의해 개발된 VAXSYN HIV-1 백신이 보고되었다. 이보고에는 이 백신의 어떠한 설명도 기술되어 있지 않다.

문헌[참조: D.L.Lynn, et al, in Mechani는 of Control of Gene Expression, Eds. Allan R. Liss Inc., pp. 359-368(1988)]에는 바큐로바이러스 오토그라파캘리포니카(Autographa californica)의 폴리헤드론 프로모터 뒤에 있는 전체 gp160 유전자의 클로닝이 기술되어 있다. 재조합 바이러스로 감염된 이들 곤충세포는 용해시 세포로부터 방출되는 단백질을 발현한다. 이 단백질은 gp160과 함께 이동하며, gp120 및 gp41로는 분해되지 않고, 글리코실화되어 세포막과 연관된다. N-글리카나제로 탈글리코실화되는 경우, 단백질은 대략 96kd의 분자량을 갖는다. 재조합 단백질은 HIV-감염된 H9 세포로부터의 단백질, gp120의 재조합 분획에 대한 항혈청, gp120자체, gp41의 펩타이드 단편 및 인체 AIDS 혈청과 면역반응성이다.

문헌 [참조: R.L. Willey, et al, Proc. Nat'l Acad. Sci., USA, 83: 5038(1986)]에는 gp120 단백질에서 아미노산의 고변화성 영역이 논의되어 있다. 그후의 보고[참조: R.L. Willey et al, J. Virol., 62(1): 139(1988)]에는 감염성에 필요한 env 유전자내의 영역이 연구되어 있다. 여기에는 특히 gp120 유전자내의 4개의 N-연결된 글리코실화 부위의 Asp 콘도에서의 아미노산 치환이 기술되어 있다.

문헌[참조: W. R. Gallagher, Call, 50: 327(1987)]에는 HIV의 교환막 단백질 gp41의 융합 펩타이드 서열이 논의되어 있다.

문헌[참조: S. D. Putney et al, Science, 234: 1392(1986)]에는 HIV env 유전자의 이. 콜라이(E. Coli)-생성된 단편에 대한 중화항체의 생성이 기술되어 있다.

문헌[참조: B. J. Bond et al, Mol. Cell. Biol., 6(6): 2080(1986)]에는 드로소 필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) 액틴 5C 유전자의 구조가 기술되어 있다. 이 보고에는 액틴 5C 유전자의 2개의 전사 개시 부위 및 프로모터 서열과 드로소필라 멜라노가스터 숙주 세포내에 삽입된 세균 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자 사이의 융합이 논의되어 있다.

문헌[참조: P.J. Barr et al, Vaccine, 5: 90(1998)]에는 효모 사카로마이세스 세레비지애(Xaccharomyces cerevisiae)에서의 HIV 단백질의 발현이 기술되어 있다.

문헌[참조 H. Johansen et al, 28th Annual Drosophila Conference, p. 41(1987)]에는 드로소필라 메탈로티오네인 프로모터에 의해 조절된 이. 콜라이gal K 유전자가 드로소필라셀라인에서 발현된다는 것을 간략하게 설명한 본 출원 발명자들에 의한 초록이 기술되어 있다.

문헌[참조: A. Vandergtraten et al, Proceedings of the 7th International Conference on Invertebrate and Fish Tissue Gulture, Abstract, Univer sity of Tokyo Press, Japan, (1987) 및 A. Vanderstraten et al, in Invertebrate and Fish Tissue Culture, Tokyo, pp. 131-134,(1988)]또한 배양시 드로소필라 멜라노가스터 세포에서 외래 유전자를 발현하는데 사용하기 위한 하이그로마이신 B 선택 시스템을 설명하는 본 발명 발명자들에 의한 발표문이다. 초록은 이. 콜ㄹ이 gal K 유전자 및 표유동물 기원의 다른 유전자를 함께 도입하여 과발현시키는데 시스템을 사용한다고 기술하고 있다.

따라서 백신 및 진단시약으로서 사용하기 위한 HIV 단백질을 고-수준으로 생산하는 것이 본 분야에서는 필요하였다.

[발명의 개요]

한 관점에서, 본 발명은 HIV env 단백질에 대한 DNA 암호화 서열, 및 이 단백질 암호화 서열의 드로소필라 세포내에서의 전사 및 해독에 필요한 조절 서열을 포함하는 HIV env 유전자 발현 단위에 관한 것이다

관련된 관점에서, 본 발명은 본 발명의 유전자 발현단위를 포함하는 DNA 벡터에 관한 것이다.

또다른 관련된 관점에서, 본 발명은 DNA 벡터로 형질감염된 드로소필라 세포에 관한 것이다.

또다른 관련된 관점에서, 본 발명은 본 발명의 형질감염된 곤충 세포에 의해 생성된 HIV env 단백질 또는 이의 유도체에 관한 것이다. 유도체는 야생형 HIV env 단백질에 대해 상승된 항체에 의해 인식될 수 있는 능력을 보유하는 아미노산의 결실, 첨가, 치환 또는 재배열 또는 이의 화학적 변형과 같은 HIV env 단백질을 포함한다.

다른 관점에서 본 발명은 본 발명에 의해 생성된 HIV env 단백질의 면역보호 및 무독성량을 포함하는 HIV 감염에 대한 보호를 자극하기 위한 백신에 관한 것이다.

또한 본 발명에 의하면 본 발명의 드로소필라 세포-생성된 HIV 단백질을 함유하는 생물학적 유체 샘플에서 HIV 감염의 존재를 탐지하는데 유용한 진단 시약이 제공된다. 부가적으로, 본 발명의 env 단백질은 HIV 결합 단백질 또는 물질, 예를들면 CD4 또는 이의 유도체를 동정하거나 분리하는데 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 HIV env 단백질 또는 이의 면역원성 유도체의 생상 방법에 관한 것이다. 이방법은 세포의 성장에 적합한 배지에서 HIV env 유전자 발현 단위로 형질 감염된 드로소필라 세포를 배양하는 방법을 수반한다. 상기 적합한 배지에서 배양된 형질 감염된 세포는 당해 단백질을 발현할 수 있다. 그후 세포 또는 세포 배양 배지로부터 단백질을 수거할 수 있다.

본 발명은 또한 성숙 gp120상에 및 또한 gp160 비프로세싱된 세포내 단백질 내에 존재하는 에피토프와 반응성인 모노클로날항체에 결합하는 HIV 단백질 또는 이의 단편을 정제하는 방법을 제공한다. 이 부류의 항체중에 178.1으로 표기되는 마우스모노크로날 항체가 있다.

본 발명의 다른 관점 및 상세한 설명은 하기에 기술한다:

[발명의 상세한 설명]

본 발명의 방법 및 발현 시스템은 드로소필라 세포구조물에서 HIV 단백질, 특히 gp120, gp160 및 이들의 유도체의 고-수준 생산을 용이하게 한다. 드로소필라 세포는 외래 DNA의 숙주 세포로의 도입을 허용하는 표준 클로닝 기술을 사용하여 형질감염시킨다. 이렇게하여 작제된 재조합 드로소필라 세포는 HIV 단백질을 생성한다.

HIV 단백질이 감염된 곤충 세표의 용해시에만 제공되는 선행기술의 바큐로바이러스 시스템과는 대조적으로, 본 발명의 방법은 HIV 단백질에 대해 연속 세포 발현 시스템을 제공한다. 분비시, 단백질을 통상의 기술로 사용하여 배양배지로부터 정제함에 의해 유용하게 된다. 또는 단백질은 세포내에 또는 막-결합되어 생성될 수 있다. 단백질은 통상의 기술을 사용하여 세포로부터 추출할 수 있다. 또는, 막-결합된 단백질은 다양한 세포-연관된 검정에서 사용될 수 있다.

본 발명의 실시에 사용하기에 바람직한 드로소필라 셀라인은 드로소필라 멜라노가스터 S₂셀라인이다. S₂세포[참조: Schneider, J. Embryol. Exp. Morph. 27 : 353(1972)]는 폴리폴로이드 배아드로소필라 세포의 안정한 세포 배양물이다. gp160, 또는 이의 아단위 gp120 또는 gp41 또는 이의 유도체에 대한 cDNA 암호하서여의 DNA 형질감염 기술에 의한 드로소필라 S₂세포내료의 도입으로 기대치않은 다량의 당단백질이 생성된다. S₂드로소필라 세포의 사용은 실온에서 고밀도로 성장할 수 있는 이의 능력을 제한 없이 포함하는 많은 잇점을 갖는다. 선택 시스템의 안정한 이입으로 세포 염색체내로 형질감염된 유전자 발현 단위가 1000개 복사본까지 생성된다.

다른 드로소필라 세포 배양 시스템 또한 본 발명에 유용할 수 있다. 일부의 가능하게 유용한 세포는 예를 들면 혈청-비함유 셀라인인 Kc-O 드로소필라 멜라노가스터 셀라인이다[참조: Schulz et al, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 83 : 9428(1986)]. KC-O 라인을 사용한 이전의 연구는 형질감염이 S₂세포를 사용하는 경우보다 더욱 어렵다고 제시하였다. 유용할 수 있는 다른 셀라인은 드로소필라 하이데이(Drsophila hydei)로 부터의 셀라인이다. 단백질 발현을 하이데이 셀라인을 사용하여 수득할 수 있지만; 이 셀라인내로의 형질감염은 매우 낮은 효능을 갖도록 발현되는 형질감염된 DNA를 생성시킬 수 있다[참조: Sinclair et al, Mol Cell. Biol. 5 3208(1985)]. 본 발명에 사용될 수 있는 다른 유용한 드로소필라 셀라인은 S₁및 S₃를 포함한다.

본 발명에 사용하기 위해 선택된 드로소필라 세포는 예를 들면 M₃배지를 포함하는 여러 가지 적합한 배양 배지에서 배양할 수 있다. M₃배지는 pH 6.6에서 균형염 및 필수 아미노산의 제형화로 이루어진다. 배지의 제조는 실질적으로 문헌[참조: Lindquist, DIS, 58 : 163(1982)]에 기술된 바와 같다. 드로소필라 세포의 성장을 위한 다른 통상의 배지도 사용될 수 있다.

HIV 단백질 유전자 발현 단위를 함유하는 재조함 DNA 분자 또는 벡터를 사용하여 본 발명에 따르는 선택된 드로소필라 세포를 형질감염시킬 수 있다. 유전자 발현 단위는 선택된 HIV 단백질 떠는 이의 유도체에 대한 DNA 암호화 서열을 함유한다. 이러한 유도체는 전통적인 유전공학 기술, 예를 들면 돌연변이 유발, 제한 엔도뉴클레아제 처리, 합성 서열을 포함하는 다른 유전자 서열의 연결법등을 사용하여 유전자 서열을 조작함에 의해 수득할 수 있다. [참조: T. Maniatis et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1982)].

HIV DNA 암호화 서열은 최근에 발표되었다.[참조 : Ratner et al, Nature 313 : 277-284(1985) 또는 Wain-Hobson et al, Cell 40 : 9-17(1985)]. 뉴클레오타이드 서열 또한 GenBank (클론 BH10, Ratner et al, 상기 참조)로부터 입수가능하다.

본 발명의 암호화 서열을 포함하는 DNA 분자는 공지의 기술[참조 : Hahn et al, Nature 312 : 166-169(1984)]을 사용하여 HTLV-III 감염된 세포로부터 유도할 수 있거나, 또는 올리고뉴클레타이드 기술에 의해 합성할 수 있다. 또한 광범위하게 이용 가능한 클로닝된 DNA 암호화 서열을 함유하는 수많은 재조합숙주 세포가 있다.

이어서 유도체는 DNA 합성을 포함하는 표준 기술에 의해 제조할 수 있다. 이러한 유도체는 단백질의 결합능력 또는 생물학적 특성에 중대한 역효과를 주지 않으면서 하나 이상의 아미노산이 치환되거나, 첨가되거나 또는 결실된 gp120 또는 gp160분자를 포함할 수 있다. 이들 단백질의 유도체는 또한 표준 화학적 변형 기술, 예를 들면 아실화, 메틸화에 의해 제조할 수 있다.

또한 유전자 발현 단위에는 숙주세표에서의 HIV 단백질 암호화 서열의 전사 및 후속의 이의 해독 및 발현에 필요하거나 바람직한 조절 영역이 포함된다. 조절영역은 전형적으로 RNA 폴리머라제의 결합 및 RNA 전자의 개시에 작용하는 프로모터 영역을 함유한다. 프로모터 영역은 전형적으로 HIV 단백질 암호화 서열로부터 상향인 것으로 밝혀졌다.

바람직한 프로모터는 드로소필라 기원의 것, 예를 들면 드로소필라 메탈로티오네인 프로모터이다[참조: Lastowski-Perry et al, J. Biol. Chem. 260 : 1527(1985)]. 이 유도성 프로모터는 금속, 예를 들면 CuSO₄의 존재하에 유전자의 고-수준 전사를 지시한다. 드로소필라 메탈로티오네인 프로모터의 사용으로 매우 높은 복제수에서 조차도 전(full) 조절을 보유하는 본 발명의 발현 시스템이 생성된다. 이것은 금속의 조절효과가 복제수의 증가에 따라 감소하는 포유동물 세포에서의 포유동물 메탈로티오네인 프로모터의 사용과 직접적으로 대조된다. 드로소필라 발현 시스템에서, 이것은 고 복제수에서 드로소필라 세포에서의 유전자 생성물의 발현을 증가시키는 유도력 효과를 보유한다.

드로소필라 액틴 5C 유전자 프로모터 [참조: B. J. Bond et al, Mol. Cell. Biol., 6: 2080(1986)]는 또한 바람직한 프로모터 서열이다. 액틴 5C 프로모터는 구성프로모터이며 금속의 첨가를 필요로 하지 않는다. 그러므로, 이것은 퍼퓨젼 시스템과 같은 대규모 생산 시스템에서 드로소필라 메탈로티오네인 프로모터보다 사용에 훨씬 더 적합하다. 부가의 잇점은 배지에서 고농도의 구리 부재가 더 오랜시간 동안 세포를 더욱 건강한 상태로 유지한다는 것이다.

다른 공지의 드로소필라 프로모터의 예는 예를들면 유도성열쇼크(Hsp 70) 및 COPIA LTR 프로모터를 포함한다. SV40 추기 프로모터는 드로소필라 메타로티오네인 프로모터보다 저 수준의 발현을 제공한다. 예를 들면 조류 로우스 사르코마 바이러스 LTR 및 원숭이 바이러스 SV 40초기 프로모터)를 포함하는 세포 발현벡터에서 통상적으로 사용되는 프로모터는 드로소필라 시스템에서 불충분한 작용 및 발현을 입증한다.

HIV 단백질에 대한 바람직한 유전자 발현 단위 또는 발현 벡터는 HIV 단백질 암호화 서열을 바람직한 시그널 서열에 융합시킴에 의해 작제할 수 있다. 시그널 서열은 숙주 세포로부터 단백질의 분비를 지시하는 작용을 한다. 이러한 시그널 서열은 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA)의 서열로부터 유도될 수 있다. 다른 이용가능한 시그널 서열은 예를 들면 헤르페스 심플렉스 바이러스 유전자 HSU-I gD로부터 유도된 것을 포함한다[참조: Lasky et al, Science, 상기 참조].

HIV DNA 암호화 서열은 또한 폴리아데닐화(폴리A) 영역, 예를 들면 SV40 초기 폴리A 영역은 전사를 안정화시키는 작용을 하는 것으로 보인다. 유사한 폴리A 영역은 천연적으로 존재하는 다양한 유전자로부터 유도할 수 있다. 이영역은 또한 폴리아데닐화 및 전사 안정화 작공이 중대한 역효과를 받지 않는한 이의 서열을 변화시키도록 변경시킬 수 있다.

재조합 DNA 분자는 또한 HIV 단백질 유전자 작용 뿐만 아니라 유전 선택 마커(maker)를 함유할 수 있다. 선택 마커는 형질 감염된 숙주 세포에서 용이하게 탐지가능한 표현형 변화를 야기시키는 유전자 또는 유전자들일 수 있다. 이러한 표현형 변화는 예를 들면 약제 내성, 예를 들면 하이그로마이신 B 내성에 대한 유전자 일 수 있다.

또한 약제 메토트렉세이트 및 원핵 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자를 사용하는 선택 시스템은 드로소필라 세포를 사용할 수 있다. 세포의 내인성 진핵 DHFR은 모트렉세이트에 의해 억제된다. 그러므로 메토트렉세이트에 대해 감수성이 없고 원핵 DHFR을 함유하는 플라스미드로 세포를 형질 감염시키고 메토트렉세이트를 사용하여 선택함에 의해, 형질감염되어 원핵 DHFR을 발현하는 세포만이 생존할 것이다. 메토트렉세이트와는 달리, 드로소필라 시스템에서 형질전환된 포유동물 및 세균 세포의 선택에 대해서는 메토트렉세이트는 초기에 고-복제 수 형질감염체에 대해 사용할 수 있다. 보호 원핵 DHFR 유전자가 혼입된 세포만이 생존할 것이다. 부수적으로, 이들 세포는 당해 유전자 발현 단위를 갖는다.

본 발명에 따라 생성된 대표적인 플라스미드는 gp160의 n-말단 32 아미노산 서열이 tPA의 첫 번째 아미노산인 세린으로 대체된 gp160 유도체를 함유하는 pgp160△32이다. 이 플라스미드는 실시예 1에 상세히 기술되어 있다.

다른 플라스미드 벡테는 첫 번째 32 아미노산이 세린으로 대체되고 216 아미노산의 카복실 결실을 함유하는 gp160 서열을 함유하는 gp120F△32이다. 이 플라스미드는 또한 실시예 1에 기술되어 있다.

본 발명의 유도체 단백질을 설명하는 또 다른 플라스미드는 세린으로 대체된 n-말단에서 첫 번째 32 아미노산이 없는 gp120에 대한 전체 암호화 서열을 함유하는 pgp120△32이다. 부가적으로, 플라스미드 pgp120△274는 첫 번째 아미노 말단 아미노산이 tPA의 첫 번째 아미노산인 세린으로 대체되고 gp160의 진행 부위까지 gp120의 남아 있는 아미노산을 함유하는 gp120단백질 서열을 함유한다. 이들 벡터 작제는 실시예 1에서 더욱 완전하게 설명한다.

일단 HIV 단백질 유전자 발현 단위를 함유하는 재조합 DNA 분자 또는 발현 벡터가 작제되며, 이것을 표준 형질감염 기술을 사용하여 선택된 드로소필라 세포를 형질감염시키는데 사용할 수 있다. 이러한 기술은 본 분야의 숙련가에겐 공지되어 있으며 예를 들면 인산칼슘 공-침전, 세포융합, 전기 천공, 마이크로주사 및 바이러스 형질감염을 포함 한다.

2-벡터 시스템은 본 발명에서 드로소필라 세포내로 목적 HIV 단백질 또는 유도체에 대한 유전자 발현 단위 및 사용할 선택 시스템에 대한 암호화 영역을 함께 형질감염시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 예시적 양태는 HIV 단백질 발현 단위를 함유하는 벡터, 예를 들면 pgp120△32, 및 하이그로마이신 B 유전자 발현 단위를 함유하는 벡터, 예를 들면 pCOHYGRO를 사용하는 HIV단백질의 생산이다. pgp120△32는 드로소필라 메탈로티오네인 프로모터를 포함하는 발현 단위, gp120 유전자의 유도체 및 SV40 폴리A 부위를 함유한다. pCOHYGRO 벡터 시스템과 혼합된 이 gp120발현단위는 S₂드로소필라 세포에서 선택에 대해 하이그로마이신 B 내성의 잇점을 최대화시킴에 의해 gp120 유도체를 생성할 것이다. 이 시스템을 사용하여, 항생물질 하이그로마이신 B는 형질감염된 벡터를 함유하는 세포를 선별하는데 사용할 수 있다. 이 양태의 더욱 완전한 설명은 실시예 2에 기술되어 있다.

다른 예로서, 벡터 pgp120△32 및 pHGCO로 이루어진, DHFR 유전자/메토트렉세이트 선택 시스템을 사용하는 발현 시스템을 사용하여 메토트렉세이트-내성 세포는 프로모터가 드로소필라 메탈로티오네인 프로모터인 gp120 유전자 발현 단위를 포함한다. pHGCO 벡터는 DHFR 유전자 발현 단위를 포함하며pgp120△32 벡터와 함께 공-형질감염시켜 선택에 필요한 DHFR 유전자를 제공한다. 드로소필라 세포의 공형질감염과 함께 이들 선택성 마커는 본 명세서에서 참조문헌으로 인용한 1987년 5월 8일자로 출원된 요한센(Johansen)등의 미합중국 특허원 제07/047,736호에 자세히 기술되어 있다.

본 발명에 따라 2개의 벡터로 문헌[참조: Wigler et al, Cell, 16 : 777(1979)]에 기술된 방법을 사용하여 S₂드로소필라 세포를 공-형질감염시킨다.벡터는 원하는 특정 복제수에 따라 여러 가지 비율로 공-형질감염시킨다. 벡터는 원하는 특정 복제수에 따라 여러 가지 비율로 공-형질감염시킨다. 이어서 형질감염된 세포를 예를 들면 혈청 및 적절한 선택제, 예를 들면 하이그로마이신 B 또는 메토트렉세이트를 함유하는 M₃배지에서 선별한다.

일단 적절한 벡터가 작제되어 선택된 드로소필라 셀라인을 형질감염시키면, gp120의 발현은 유도성 프로모터에 대한 적절한 유도체의 첨가에 의해 유도된다. 예를 들면, 카드뮴 또는 구리는 메탈로티오네인 프로모터에 대한 유도제인다. 열은 Hsp 70 프로모터에 대한 유도제이다. 예를 들면 액틴 5C 프로모터와 같은 구성 프로모터에 대해서는 발현에 유도제가 필요치 않다.

상기 기술된 시스템에서 HIV 단백질 암호화 서열의 전사 및 발현은 모니터될 수 있다. 예를 들면, 사우던 블럿 분석을 사용하여 gp120 유전자의 복제수를 측정할 수 있다. 노오던 블릿 분석은 전사된 유전자 서열의 크기에 대한 정보를 제공한다[참조: Maniatis et al, 상기참조]. 전사 수준 또한 정량화 될 수 있다. 재조합세포에서 선택된 HIV 단백질의 발현은 웨스턴 블릿 분석을 통해 더 입증될 수 있으며 활성은 생성된 당단백질 상에서 시험한다[실시예 5]

드로소필라 S₂세포는 본 발명의 방법에서 단백질의 고-수율 생산에 특히 적합하다. 세포는 실온(24 ± 1℃)의 현탁 배양물에서 유지할 수 있다. 배양 배지는 5내지 10%(v/v)열-실활된 소 태자혈청(FBS)으로 보충된 M₃이다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 배양 배지는 5% FBS를 함유한다. 유도후, 세포는 혈청-비함유 배지에서 배양한다. pCOHYGRO 벡터 시스템을 사용하는 경우, 배지는 또한 300㎍/㎖ 하이그로마이신 B로 보충된다. 이 배지에서, S₂세포는 현탁 배양물에서, 예를 들면 250㎖ 내지 2000㎖ 스피너 플라tm크에서, 50 내지 60rpm으로 교반시키면서 성장시킬 수 있다. 세포 밀도는 전형적으로 10⁶내지 10⁷세포/㎖ 로 유지된다. 본 발명의 한 양태에서, 세포는 5% 혈청을 함유하는 배지에서 1500㎖ 스피너 플라스크에서 유도시키기 전에 성장시킨다.

세포 배양후에, HIV 단백질은 예를 들면 모노클로날 항체 친화성 컬럼을 사용함에 의해 소비된 배지로부터 분리할 수 있다. 다른 공지된 단백질 정제 단계, 예를 들면 금속 킬레이트, 여러 가지 친화성 크로마토그라피 단계 또는 흡착크로마토그라피를 사용하여 배양 배지로부터 HIV 단백질을 정제할 수 있다. 유전자 생성물을 배지로 직접 분비하는 세노라인 S의 사용은 본 발명의 중요한 점이다. 배지로의 직접분비는 효능있는 1-단계 정제 시스템의 이용을 허용한다. HIV 단백질에 대한 모노클로날 항체 컬럼을 사용하여, 소비된 배양 배지를 직접 컬럼에 첨가하고 단백질을 인산염-완충 염수(PBS)중의 1.5M KSCN을 사용하여 용출시킬 수 있다.

본 발명의 HIV 단백질의 대-규모 효과적인 생산을 가능하게 하는 바람직한 정제 기술은 헤160에 존재하고 성숙 분비된 헤120단백질에 존재하는 에피토프에 대한 모노클로날 항체를 함유하는 면역친화성 컬럼을 사용한다. 이러한 모노클로날은 하나 이상 배위의 단백질 서열을 인식 할 수 있는 이의 능력 때문에 유리하다. 이들 특성을 가지며 여러 가지 HIV 단백질, 이의 유도체 또는 단편에 대한 면역친화성 칼럼에 유용한 항체는 178.1로 표기 된다. 이 모노클로날 항체는 실시예3에 더욱 상세히 기술되어 있다. 이러한 본 발명의 컬럼은 178.1의 특성을 갖는 항체를 PH, 온도등의 적절한 통상의 조건하에서 통상의 흡착 담체, 예를 들면 세파덱스에 커플링시킴에 의해 제조할 수 있다. 이러한 정제 컬럼 및 방법을 사용하여 본 발명의 HIV 단백질 및 단편을 분리할 수 있다.

다른 모노클로날 항체도 본 정제 방법에 사용될 수 있다. HIV 단백질, 특히 gp160 또는 gp120에 결합할 수 있는 여러 가지 모토클로날 항체는 본 분야에 기술되어 있으며 이용가능하다. 본 발명에 유용한 다른 신규의 모노클로날 항체는 통상의 기술에 의해 개발할 수 있다.

본 발명에 따르는 드로소필라 세포에 의해 생성된 당단백질은 오염물질, 예를 들면 포유동물, 효모, 세균 및 더욱 중요하게는 다른 HIV 바이러스 물질을 완전히 함유하지 않는다. 드로소필라-생성된 HIV 단백질은 또한 다른 시스템, 예를들면 포유동물 시스템에 이해 보고된 것보다 상이한 형태의 클리코실화를 갖는 것으로 입증되었다.

본 발명에 따라 생성된 HIV 단백질 및 유도체는 여러 가지 생성물에 유용할 수 있다. 예를 들면, 이들 재조합 단백질은 HIV-감염된 대상의 치료를 위한 약제학적 조성물에 사용할 수 있다. 본 발명에 따르는 이러한 약제학적 조성물은 본 발명의 HIV 단백질 또는 유도체의 치료 유효량을 약제학적으로 허용되는 담체와의 혼합물로 포함한다. 조성물은 비경구, 정맥내 또는 피하로 전신적으로 투여할 수 있다. 전신적으로 투여하는 경우, 본 발명에 사용하기 위한 치료 조성물은 파이로겐-비함유, 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태이다. PH, 등장성, 안정성 등에 관해 적당한 이러한 비경구적으로 허용되는 단백질 용액의 제조는 본 분야의 기술내에 있다.

용량요법은 약제의 작용을 변화시키는 여러 가지 인자, 예를 들면 환자의 상태, 체중, 성별 및 식이요법, 감염의 중증도, 투여기간 및 다른 임상적 인자를 고려하여 주치의에 의해 결정될 것이다. 약제학적 제형화의 약제학적 담체 및 다른 성분을 본 분야의 숙력가에 의해 선택될 것이다.

부가적으로 본 발명의 재조합 단백질은 HIV 감염에 대한 포유동물 환자의 접종을 위한 백신 성분으로서 사용될 수 있다. 이들 단백질은 단독으로 또는 다른 재조합 단백질 또는 치료 백신 시약과 함께 사용될 수 있다. 이러한 백신의 성분은 본 분야의 숙련가에 의해 결정될 것이다.

최종적으로, 본 발명의 단백질은 생물학적 유체, 예를 들면 혈액, 혈청, 타액 등에서 HIV 감염제에 대한 HIV 감염 또는 항체의 존재를 탐지하기 위한 진단 시약으로서 유용할 수 있다. 본 발명의 이들 단백질은 또한 생물학적 유체 및 조직, 예를 들면 sCD 4 또는 이의 유도체에서 HIV-결합 단백질 또는 다른 HIV-결합 물질을 동정하고/하거나 분리시키는 방법에 사용할 수 있다. 따라서 단백질은 이러한 방법을 수행하기 위한 키트내의 성분일 수 있다. HIV-결합 물질을 동정하기 위하여, 본 발명에 따르는 단백질을 사용하여 단백질과 HIV-결합 물질 사이의 결합을 촉진시키는 조건하에서 물질 또는 물질을 함유하는 불순한 혼합물을 접촉시킨다. 결합의 발생을 탐지하는 통상의 검정법, 예를 들면 방사성 표지물의 탐지등은 본 발명의 부분이다. 단백질과 결합 물질 사이의 결합의 존재는, 그러므로 HIV 결합의 지표이다.

유사하게 혼합물로부터 HIV-결합 물질을 분리하는 방법에서, 결합 후에 본 발명의 단백질 및 HIV-결합 물질에 의해 형성된 결합된 실재물을 혼합물로부터 정제하는 통상의 방법을 수행한다. 이러한 진단 시스템 및 키트의 다른 성분은 진단 키트의 통상의 성분일 수 있으며 본 분야의 숙련가에 의해 선택될 수 있다.

하기 실시예는 본 발명의 예시적인 벡터 및 형질전환체의 작제, 바람직한 정제 시스템 및 당단백질 gp120 및 gp160의 생성수준의 측정을 위한 검정법을 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 범주를 제한시키도록 고려된 것은 아니다.

제한 효소 및 다른 시약을 실질적으로 판매자의 지시에 따라 사용한다.

[실시예]

[실시예1. 벡터 작제]

a) pMTtPA

드로소필라에서의 유전자 발현에 대한 기본 벡터로서, tPA 발현 벡터 pMTtPA(pDMtPA로도 칭함)를 사용한다. 이벡터는 독성서열이 결실된 베타-락타마제 유전자를 함유하는 작은 pBR322 벡터인 벡터 pML1의 유도체이다. [참조: Mellon et al, Cell, 27: 297(1982)]. 이들 서열은 벡터의 증폭을 억제한다. 이 벡터는 pBR322의 작은 조각을 제거하는 Sall 및 Aat2로 분해시키며 분해된 말단을 채운다. 이어서 pBR322의 손실된 조각을 말단-충진된 EcoR1-Stu1 단편 및 계속해서 시그널 서열, 프리펩타이드 및 tPA의 전체 암호화 영역을 함유하는 tPA서열을 함유하는 pDSPI[참조: D.S. Pfarr et al, DNA, 4(6): 461(1985)]로부터의 충진된 HindIII-Sac1 단편상에서 드로소필라메탈로티오네인 프로모터를 함유하는 카세트로 대체한다. 이 단편상의 tPA 유전자는 SV40 초기 폴리아데닐화 부위를 수반한다.

b) pgp160△32

전체 env 유전자를 함유하는 HindIII-XbaI 단편을 HIV-분리 클론 BH10으로부터 분리한다[참조: L. Ratner et al, 상기 참조; GenBank]. 이어서 전체 gp160 서열을 Nco1-Xba1 분해된 벡터 pDSP1에 삽입한다. 생성된 벡터인 SU2를 Nde1으로 분해된 벡터 PDSP1에 삽입한다. 생성된 벡터인 SU2를 Nde1으로 분해시키고, 멍빈(mung bean) 뉴클레아제로 처리한 다음 계속해서 Sac1으로 분해시켜 gp160 유전자를 분리한다. Nde1으로의 분해로 아미노산 #32에서 gp160 서열을 절단한다. Sac1 분해로 폴리링커를 함유하는 근원 pDSP1의 서열 일부를 포함하는 gp160 유전자가 3'가 절단된다. 이 단편을, Bg1II로 분해시키고, 말단-충진한 다음 계속해서 Sac1으로 절단하여 성숙 tPA 서열이 결실된 상기 언급된 발현 벡터 pMTtPAdp 삽입한다. Bg1II 부위를 tPA의 첫 번째 아미노산에 위치시킨다. 결과적으로, 생성된 벡터 pgp160△32는 gp160의 n-말단 32 아미노산이 세린으로 대체된 변형된 gp160 단백질을 암호화한다.

c) pgp120F△32

HIV-1 표면 당단백질 gp160을 암호화하는 변형된 유전자 서열을 함유하는 다른 벡터는 pgp160△32를 HindIII 및 Sac1으로 분해하여 gp160의 카복실 말단을 제거함에 의해 작제한다. 이 분해로 gp41을 암호화하는 서열의 대략2/3가 제거된다. 따라서, 이 gp160 서열은 천연 gp160 서열의 첫 번째 32 아미노산 및 마지막 216 아미노산이 결실된다. 결실된 서열을 HindIII-Sac1 단편상에서 정지 코돈을 암호화하는 짧은 합성 링커 서열로 대체한다. 6-아미노산 링커 서열은 다음과 같다: 5' AGCTTTGACTGACTGAGCT 3'

d) pgp120△32

돌연변이체 gp160유전자를 함유하는 또다른 벡터는 pgp160△32를 sty1 및 xba1으로 분해시켜 단백질 gp41 서열의 모두 및 gp120 당단백질 서열의 카복실 말단에서 약 30 아미노산을 결실시킴에 의해 작제한다. 이단편은 sty1 부위로부터 gp120-gp41의 진행부위까지의 정확한 카복실 말단을 암호화하는 합성 sty1-xba1 링커 서열로 대체한다. 이 서열은 정지 코돈을 수반한다. 따라서 이 서열은 첫 번째 32 아미노산이 없는 gp120의 암호화 서열 모두를 함유하지만 gp41 암호화 서열은 함유하지 않는다.

e) pgp120△ 274

돌연변이체 gp120 유전자를 함유하는 또다른 예시적 벡터는 다음과 같이 작제한다: gp120의 720-염기쌍 카복실 말단 단편은 pgp120△32를 BalII로 부분 분해시킨 다음 xbaI으로 분해시킴에 의해 분리한다. 이 단편을 tPA 유전자 대신 Bg1II-xbaI 절단 pMTtPA 발현 벡터에 삽입한다. 생성된 벡터 pgp120△274는 첫 번째 274 아미노말단 아미노산이 tPA의 첫 번째 아미노산인 세린으로 대체된 gp120 단백질을 암호화한다.

f) pCOHYGRO

BamHI 및 SmaI 부위를 함유하는 시판 플라스미드 pUC18[BRL]을 사용한다. 이입된 COPIA 성분(357 염기쌍)으로부터의 5'STR을 벡터 pUC18의 BamHI부위로 클로닝시키면, pUCOPIA로 표기되는 벡터가 생성된다. COPIA는 드로소필라 제놈을 통해 산란된 분산 중앙 반복서열을 대표적 일원이다[참조: Rubin et al, in Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 45: 619(1980)]. 벡터 pUCOPIA를 SmaI 부위에서 절단하고 하이그로마이신 B 포스토트랜스퍼라제를 암호화하는 이 콜라이 유전자(하이그로마이신 B 카세트)를 표준 클로닝 기술을 사용하여 pUCOPIA 내로 클로닝시킨다. 하이그로마이신 B 카세트를 1481 염기쌍의 HindIII-BanHI 단편상에서 벡터 DSP-하이그로로부터 분리한다.[참조: Gertz et al, Gene, 25: 179(1983)]. 하이그로마이신 B 카세트는 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 유전자 및 SU40 초기 폴리 A 영역을 암호화하는 서열을 함유한다. HindIII 및 BamHI 부위를 T₄DNA 폴리머라제를 사용하여 충진시키고 하이그로마이신 B 카세트를 벡터 pUCOPIA의 SmaI 부위에 연결시켜 벡터 pCOHYGRO를 생성한다.

[실시예 2. 드로소필라 S₂세포의 형질감염]

pCOHYGRO를 사용하여 상기 기술된 바와 같은 드로소필라메탈로티오네인 프로모터의 조절하에서 S₂드로소필라 세포를 gp160 돌연변이체 유전자를 함유하는 벡터중 하나와 함께 공-형질감염시킨다. 이 실시예의 목적을 위해, 사용되는 벡터는 pgp120△32이다. 형질감염된 세포를 5% 혈청 및 300㎍/㎖ 하이그로마이신 B를 함유하는 M₃배지에서 선별한다. 동일 조건하에서 2 내지 3일 후, 형질감염되지 않은 세포는 분할을 중지하고 하이그로마이신 B-내성세포를 수득하기 위한 선별 시간은 대략 2 내지 3주이다.

이들의 염색체내로 상이한 복제수의 gp120 돌연변이체 유전자가 이입된 배양물을 수득하기 위하여, 2개의 벡터 비율을 변화시킨다. 이 실시예에서의 비율은 20:1이다. 본 발명의 다른 gp160 돌연변이체 벡터를 위하여 유사한 비율을 사용하다. gp160 돌연변이체 벡터를 사용하는 경우 이 비율은 동일하다.

pgp120△32 유전자 생성물의 발현은 500μM CuSO₄를 사용하여 메탈로티오네인 프로모터를 유도시킨 후 입증한다. 유도된 세포 배양물로부터 소비된 상등액의 웨스턴 블럿 분석으로 대략 100kd에서 단일 밴드가 나타난다.

세포 상등액중의 돌연변이체 gp160 유전자 생성물의 수준은 실시예 4에 기술되어 있는 gp120 ELISA 검정 및 표준으로서 정제된 바이러스 gp120을 사용하여 측정한다. 5 x 10⁶세포/㎖를 혈청을 함유하지 않은 M₃배지에 씨딩하고 3 내지 4일 동안 유도시킨다. 상등액에서 측정된 gp120의 수준은 대략 1-2mg/ℓ이다.

세포를 250㎖ 내지 2000㎖ 스피너 플라스크에서 현탁 배양물로서 유지시킨다. 배양 배지는 300㎍/㎖ 하이드로마이신 B가 보충된 M₃이다. 배양물을 24±℃에서 배양하고 50 내지 60rpm에서 교반한다. 세포 밀도는 전형적으로 하이그로마이신 B가 보충된 M₃배지에서 ㎖당 10⁶내지 10⁷세포로 유지시킨다. CuSO₄를 500μM의 최종 농도에 첨가하고 배양물을 혈청-비함유 배지에서 3 내지 4일 동안 성장시킨 다음 변형된 gp120 당단백질을 수거한다.

본 방법에 따라 생성된 단백질은 대략 100MW이며, 발현 수준은 진핵 세포 시스템에서 다른 보고된 gp120/gp160 발현보다 높다. 표준 생물학적 활성 검정에서, 상기 기술된 바와 같이 발현된 정제된 변형된 gp120은 조직 배양물에서 바이러스 감염을 억제시킬 수 있고, T₄를 결합시키고 gp120에 대한 항체에 반응한다.

본 분야의 숙련가라면 pgp120△32에서 암호화되는 단백질 단편에 대해 상기 예시한 바와 실질적으로 동일한 시스템 및 방법을 사용하여, 본 발명에 의해 기술된 다른 gp160 및 gp120 단백질 및 이들의 단편을 발현시킬 수 있다고 기대된다.

[실시예3. 모노클로날 항체 178.1]

신규의 모노클로날 항체를 이용하는 친화성 정제 칼럼을 상기 기술된 돌연변이체 gp160/gp120 단백질에 적용할 정제 도식에 사용한다. 이 모노클로날 항체는 세포 용해물에 존재하는 비-변성된 HIV 당단백질 생성물과 반응할 수 있고 효모 배양물의 상등액 내로 분비되는 성숙 gp120과 반응할 수 있다는 점에서 특징화될 수 있다. 비프로세싱된 gp160 재조합 분자 및 완전-크기 프로세싱된 gp120 단백질 둘 다에 함유되어 있는 에피토프에 대해 특이적인 이러한 모노클로날 항체중 하나는 마우스 모노클로날 항체 178.1이다.

캔디다 앨비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제 프로모터 및 시그널 펩타이드를 사용하는 발현 시스템을 사용하여 178.1의 생성물을 위해 부분적으로 정제된 효모-재조합 gp160을 생성한다. 이 효모-유도된 gp160의 생성은 1988년 8월 25일자로 출원된, 공동소유의 계류중인 브룩(Bruck)등의 미합중국 특허원 제SN07/236,699호에 기술되어 있다. 이 특허원은 본 명세서에 참조문헌으로 인용되어 있다.

생후 8주된 Balb/c 마우스를 프로인트 보조제에서 4주 간격으로 부분 정제된(1.5 내지 3%순도) 효모-재조합 gp160으로 3회 피하 및 복강내 주사한다. 3개월 동안 휴식시킨 후, 한 마리의 마우스를 희생시키고, 이의 비장 세포를 골수종 세포와 융합시킨다[참조: R.P. Siraganian et al, Meth. Enz., 92: 17(1983); EMBO Course on Hybridoma Production, Basel Inst. for Immunol. (1980)]. 사용된 골수종 세포는 아가 배지에서의 최적 성장 및 고융합 효능에 대해 이미 선택한 Sp 10-Ag14 라인의 아클론이다[참조: J.D. Franssen et al, Proc. XXIX Collog. Protids Biol. Fluids, 29: 645-649(1981)]. 약 10일 후, 포획 항체로서 시판 모노특이성 안티-gp120 시약[Biochorm, Seromed Ref. D7324]을 사용하여 포획 ELISA에서 스크리닝하여 상등액을 회수한다.

간단하게, Nunc 면역플레이트(Immunoplate) I(nr 4-39454)를 4℃에서 밤새 PBS 중의 양의 안티-gp120 IgGs 5㎍/㎖의 용액 50㎕로 피복시킨다. 플레이트를 세척 완충액(PBS, Tween20 0.1%)으로 세척하고 포화 완충액[PBS, 갓난 송아지 혈청 4%, 소의 혈청 알부민(BSA) 1%, 트윈 20 0.1%] 100㎕로 37℃에서 1시간 동안 포화시킨다. 조 Molt₃/HTLV-III_B또는 Molt₃세포 용해물(PBS 중의 10⁷세호/㎖, 트리톤 x-100 1%), 또는 재조합-효모 gp160(또는 유사하게 처리된 음성 대조군)의 상등액 분획(S2-30) 50㎕/웰을 항원으로서 사용하고 실온에서 3 내지 5시간 동안 플레이트 중에서 배양한다. 플레이트를 철저하게 세척하고, 하이브리도마 상등액 50㎕를 각 웰에 첨가하고 4℃에서 밤새 배양한다. 세척단계 후에 포화 완충액중의 바이오티닐화된 안티-마우스 면역글로블린(Igs)(Amersham Ref RPN1021)1/500 희석액 50㎕/웰을 37℃의 플레이트중에서 1시간 동안 배양한다. 플레이트를 다시 세척하고 포화 완충액중의 스트렙트아비딘 바아오티닐화된 호오스래디쉬 퍼옥시다제 복합물(Amersham Ref. RPN1051) 1/1000 희석액 50㎕/웰을 각 웰에 첨가한다.

추가의 세척 단계후에, 0.1% 트윈 20으로 보충된 오르토페닐렌디아민 디하이드로클로라이드(OPD, Sigma P1526) 0.4mg/㎖ 및 H₂O₂(시트르산/Na 시트레이트 0.1M PH5 중의 30%) 1㎕/㎖의 용액 50㎕를 각 웰에 첨가한다. 이어서 플레이트를 암실중 실온에서 20분 동안 배양하고, 2M H₂SO₄50㎕/웰을 첨가하여 반응을 중지시킨다. 람다=492nm에서 광학 밀도를 모니터하고, 50 양성 클론을 문헌[참조: P. Herion et al, Proc. XXIX Collog. Protids Biol. Fluids, 29: 627(1981)]에 따라 연질 아가로즈에 추가로 아클로닝시켜 선별한다. 이어서 2내지 5 x 10⁶하이브리도마 세포를 프리스탄(2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸)의 복강내 주사에 의해 미리 처리된 Balb/c 마우스의 복강에 주사함에 의해, 클로닝된 하이브리도마를 생체내에서 성장시킨다.

상기 방법으로부터 선택된 모노클로날 항체를 웨스턴 블럿분석(WB), 방사성 면역침전 검정(RIPA), 정제, 바이오틴-표지 및 경쟁 검정에 의해 특징화한다. 생성된 모노클로날 항체를 여러 가지 재조합 및 천연항원에 대한 이들의 반응성을 분석함에 의해 더욱 특징화한다.

이 방법에 의해 고수율의 하이브리도마가 수득된다. 스크리닝 검정에서 200웰 이상이 양성이다. 그러나, 이들 중에서 단지 50웰만을 선택하여 클로닝시킨 후, 세포를 복수산에서 성장시킨다. 모든 복수액을 WB 및 RIPA에서 시험한다. 시험된 39 모노클로날 중에서 37개가 RIPA에서 gp160 밴드를 보여준다. 동일한 검정에서 어느것도 gp120형과는 반응하지 않는다. RIPA에서 gp160만 인식하고 WB에서는 gp120에 대해 명확하게 반응성인 모노클로날 항체를 아부류에 의해 분석한다. IgG2A인 3개의 모노클로날을 단백질 A-세파로즈칼럼상에서 정제하고 바이오틴-표지한다. 항원으로서 백시니아 gp160을 사용하는 경쟁 검정을 수행하고 수득된 결과는 gp160 단백질을 갖는 적어도 5개의 상이한 그룹의 에피토프 인식을 정의한다. 모노클로날 178.1은 성숙 gp120 및 비진행된 세포내 gp120 및 비프로세싱된 세포내 gp160상에 존재하는 에피토프에 대해 선택된다.

웨스턴 블럿(WB) 분석을 통상의 기술에 따라 수행하여 178.1이 HTLV-III_B로 감염된 인체 세포로부터 분리된 HIV 바이러스[Molt/HTLV-III_B]를 결합시킬 수 있다는 것을 입증한다.

방사성 면역 침전 검정(RIPA)을 문헌[참조: P.J. Kanki et al, Science, 228: 1199(1985)]에 기술된 바와 같이 수행하여 178.1이 HTLV-III 바이러스 균주로 감염된 인체세포를 면역 침전시킬 수 있다는 것을 설명한다.

항원의 큰 패널에 대한 비-오버랩핑 에피토프를 인식하는 모노크로날 항체의 반응성은 포획 시약으로서 양의 안티-gp120을 포함하는 샌드위치 ELISA를 사용하여 평가한다. 모노클로날 항체 178.1은 ELISA에서 분기하는 HIV 분리물 Molt₃/HTLV-III_B, H9/HTLV-III^RFI및 Hut78/ArV₂상에서 음성인 반면, 재조합 항원을 사용하는 RIPA, WB 또는 ELISA에서는 HTLV-III_B상에서 시험하는 경우 확실히 양성이다. 이 모노클로날은 gp160과 gp120 사이에 명백하게 보존된 에피토프를 인식하며, 따라서 하기 실시예 4에 기술된 정제 기술에 사용하는 경우 여러 가지 작제물중에서 gp160/gp120 당단백질의 생성에 대해 추가의 잇점을 제공한다.

[실시예 4. 드로소필라-조절된 세포 배양 배지로부터]

gp120 32의 정제

실시예 2로부터 재조합 gp120 단백질을 다음과 같이 정제한다: gp120△32를 함유하는 드로소필라-조절된 배지(CM) 30ℓ를 1mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF), 10mM 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA) 및 70칼리크레인 억제제 단위로 만든다. CM을 펠리콘(Millipore) 장치를 사용하여 0.45㎛ Durapore 막을 통해 여과한다. 여과된 CM을 20mM 2-CN-모르폴리노 탄설폰산(MES), PH6.0을 함유하는 완충액 A 중에 평형화된 37㎖/Cm²hr의 선형 유속(LFR)에서 S-세팔즈 패스트 플로우(Pharmacia)(5리터; 25.2㎝ x 11㎝)에 적용한다. 모든 CM을 적용한 후, 칼럼을 1단계로 20mM MES. pH6.0, 0.4M NaCl을 함유하는 완충액 B로 용출시킨다.

S-세파로즈-용출된 gp120△32를 10㎖/cm²hr의 LFR에서 안티-gp120 마우스 모노클로날-세파로즈 4B 칼럼(60㎖; 3.2㎝ x 6.5㎝)에 적용한다. 이 칼럼을 완충액 B 중에서 평형화시킨다. 1.5 S-세파로즈 모음을 적용한 후 칼럼을 완충액 B 1컬럼 용적, 20mM MES, pH6.0, 1.0M NaCl(완충액 C) 2컬럼 용적, 및 완충액 A 2 칼럼 용적으로 세척한다. gp120△32을 0.1M 아세트산, pH2.8로 용출시키고 분획을 0.1용적의 1M 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(트리스), pH10.4를 첨가함에 의해 즉시 중화시킨다.

마우스 안티-gp120 모노클로날 항체 하이브리도마 178.1을 상기 실시예 3에 따라 생성한다. 이 하이브리도마를 2 x 10⁵세포/㎖로 씨딩하고, 4.5g/ℓ 글루코즈, μM 글루타민 및 10% 혈청으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지[Hazelton Research Products]에서 4일 동안 배양한다. 178.1 항체를 함유하는 CM을 여과하고 (0.2㎛ 막) 0.1M 트리스, pH8.2 중에서 평형화시킨 단백질 A-세파로즈(Pharmacia) (17㎖; 1.5㎝ x 10㎝)에 적용한다. 항체를 0.1M 나트륨 시트레이트, pH3.5로 용출시키고 트리스로 즉시 중화시킨다.

정제된 안티-gp120 모노클로날 항체를 제조자의 지시에 따라 2mg 항체/㎖ 수지 밀도에서 98%의 커플링 효능으로 CNBr-활성화된 세파로즈 4B(Pharmacia)에 커플링시켜 안티-gp120-세파로즈 친화성 수지를 수득한다. 이 친화성 수지는 gp120 상에서 항체화 독특한 조성 에피토프와의 상호작용을 통해 gp120 단백질을 특이적으로 결합시킨다. 이 정제 기술에 따르는 최종 gp120 단백질 생성물의 순도는 8.5mg/30ℓ 조절된 배지의 추정 수율로 80 내지 90%이다. 회수는 25 내지 50% 추정된다.

이 정제 기술 및 친화성 수지는 또한 이 에피토프를 갖는 다른 HIV 단백질 또는 이의 단편을 사용하는 경우에도 효과적이라고 믿어진다.

[실시예 5. 검정]

하기 기술된 검정은 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 생성된 gp120 단백질을 탐지하는데 사용되는, gp120 또는 이의 단편의 탐지를 위한 기질 및 효소를 이용하는 비-동위성 검정이다.

검정에서, gp120을 탐지하는 기준은 항체 특이성에 의존한다. 0.1M 탄산나트륨 완충액(pH 9.5)에 2μgs/㎖까지 희석된 안티-gp120 모노클로날 항체[DuPont, Cat. No. 9284]를 사용하여 gp120 단백질을 포획한다. 이 항체 희석액 100㎕를 대조로 표시된 웰을 제외하고는 검정 플레이트에서 각 웰에 이중으로 첨가한다. 플레이트를 4℃에서 밤새 배양한다. 다음날 항체를 세척해내고, PBS중의 1% BAS로 이루어진 차단 완충액 300㎕를 실온에서 1시간 동안 각 웰에 첨가함에 의해 플레이트를 차단한다.

바이러스 gp120 표준을 PBS 및 0.05% 트윈 20으로 이루어진 세척 완충액중에서 1㎍/㎖, 0.5㎍/㎖, 0.25㎍/㎖, 0.1㎍/㎖ 및 0.2㎍/㎖로 희석한다. 희석된 표준 100㎕를 각 웰에 이중으로 첨가한다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 플레이트 진탕기 상에서 배양한 다음, 각 플레이트를 세척 완충액으로 4회 세척한다.

각 웰에, 세척 완충액중에 1/1000 희석된 래비트의 안티-gp120 항체(1987년 5월 29일자로 출원된 데보우그(DeBouck) 등의 미합중국 특허원 제07/056,553호에 기술되어 있음)100㎕를 첨가하고 각 플레이트를 1시간 동안 진탕기상에서 배양한다. 이 두 번째 항체는 gp120을 두 개의 항체사이에 샌드위치시킨다. 그후, 플레이트를 세척 완충액으로 4회 세척한다. 이 복합물, 세 번째 항체를 탐지하기 위해, 아지드를 함유하지 않은 세척 완충액중에 희석된 퍼옥시다제(POD) 표지된 염소의 안티-래비트 항체(대개 IgG 및 IgM 항체) 100㎕를 각 웰에 첨가한다. 이어서 플레이트를 실온에서 2시간 동안 진탕기상에서 배양한다.

플레이트를 4회 세척한 후, 무색기질(완충액 10㎖당 35% 과산화수소 4㎕를 함유하는 시트레이트 완충액중의 OPD 1㎎/㎖) 100㎕를 첨가한다. 과산화수소는 기질을 웰에 첨가하기 직전에 첨가한다. 이들 플레이트를 진탕기상에서 8분 동안 배양하고 각 웰에 0.1M 불소화나트륨 100㎕를 첨가함에 의해 반응을 중지시킨다. 퍼옥시다제-결합된 항체의 존재하에서, 기질은 질은 황색으로 변한다. 포획된 gp120의 양에 비례하는 광학 밀도 또는 색도는 플레이트 판독기상 450㎜에서 판독하고 계산된 알려지지 않은 농도로 표준 곡선을 만든다. 상등액 배양물중의 gp120의 양은 이 표준 곡선과 비교하여 측정한다.

상기 기술 및 실시예는 바람직한 양태를 포함하는 본 발명을 충분히 설명한다. 분자 유전학 및 관련된 과학 분야의 숙련가에게는 명백한 다른 절두 gp160/gp120 서열을 사용하는, 기술된 방법의 변형은 하기 특허청구범위의 범주내에 포함된다.

Claims

gp120 암호화 서열 및 gp160 암호화 서열로 이루어진 그룹중에서 선택된 DNA 서열과 이 DNA 서열이 드로소필라(Droshphila) 세포내에서 전사하고 해독하는데 필요한 조절성분을 포함하는 유전자 발현 단위.
제1항에 있어서, 상기 조절성분이 액틴 5C 프로모터 또는 드로소필라 메탈로티오네인 프로모터를 포함하는 유전자 발현 단위.
제1항에 있어서, pgp160△32, pgp120F△32, pgp120△32 또는 pgp120△274에 존재하는 HIV DNA 암호서열을 포함하는 유전자 발현 단위.
제1항의 유전자 발현 단위를 포함하는 DNA 벡터.
제4항의 벡터로 형질감염된 드로소필라 세포.
제5항의 곤충 세포의 배양에 의해 생성된 HIV gp120 또는 gp160 단백질.
제6항의 단백질을 면역보호 및 무독성 량으로 포함하는 HIV 감염에 대해 보호를 자극하기 위한 백신.
제6항의 단백질을 포함하는 인간에게 HIV 감염을 탐지하기 위한 진단시약.
gp120 암호화 서열 및 gp160 암호화 서열로 이루어진 그룹중에서 선택된 DNA 서열을 포함하는 유전자 발현 단위로 형질감염되고 HIV 단백질을 발현할 수 있는 드로소필라 세포를 적절한 배지에서 배양함을 특징으로하여, 드로소필라 세포에서 HIV gp120또는 gp160 단백질을 생성하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 세포를 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제의 암호화 서열을 함유하는 첫 번째 벡터 및 HIV 단백질 유전자 발현 단위의 암호화 서열을 함유하는 두 번째 벡터로 형질 감염시키는 방법.
제10항에 있어서, 상기 첫 번째 벡터가 pCOHYGRO인 방법.
제10항에 있어서, 상기 두 번째 벡터가 pgp160△32, pgp120F△32, pgp120△32 또는 pgp120△274에 존재하는 유전자 발현 단위를 포함하는 방법.
제9항에 있어서, 드로소필라 세포가 드로소필라 멜라노가스터 S₂세포인 방법.
제13항에 있어서, 상기 S 세포를 벡터 pCOHYGRO 및 pgp160△32, pgp120F△32, pgp120△32 또는 pgp120△274에 존재하는 유전자 발현 단위를 포함하는 벡터로 공-형질감염시키는 방법.
HIV-결합 물질을 드로소필라 세포의 배양에 의해 생성된 HIV gp120 또는 gp160 단백질과 접촉시키고 HIV 결합의 지표가 되는 상기 물질과 단백질 사이의 결합을 검정함을 특징으로하여, HIV-결합 물질을 시험관내에서 검정하는 방법.
비-변성된 gp160 단백질 생성물 및 성숙한 gp120 단백질에 존재하는 에피토프와 반응할 수 있는 모노클로날 항체를 함유하는 친화성 수지를 사용함을 특징으로 하여, 제6항의 HIV 단백질을 정제하는 방법.
비-변성된 gp160 단백질 생성물 및 성숙한 gp120 단백질에 존재하는 에피토프와 반응할 수 있는 모노클로날 항체를 함유하는 친화성 수지를 사용함을 특징으로 하여, 제9항의 방법에 의해 생성된 HIV 단백질을 정제하는 방법.