JPH01500999A - Ｈｓｖの治療的処置に用いるワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＨＳＶの治療的処置に用いるワクチン 発明の背景 発明の分野 ヘルヘスウイルスニは、１型（ＨＳＶ−１）および２型（ＨＳＶ−２）とと名付 けられた２つの密接に関連する変異体を含む単純ヘルペスウィルスが包含される 。これらの型のウィルスは９強い交差反応を示すが、中和滴定により区別するこ とができる。 ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２は様々なヒトの疾患（例えば、皮膚感染。 陰部ヘルペス、ウィルス性脳炎など）の原因となっている。 単純ヘルペスウィルスは２本鎖ＤＮＡウィルスであって、膜内に被包された二十 面体の核キャプシド内に約１５０〜１６０ｋｂｐのゲノムを有する。この膜には 、数多くのウィルス特異的な糖タンパクが含まれ、それらのうち最も多いのは、 　ｇＢ、　ｇＣ。 ｇＤ、およびｇＥである。ここで、　ｇＢおよびｇＤは、１型と２型との間で交 差反応を示す。 ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両方に対するヒトへの安全で効果的なワクチンを 提供すること、および感染が生じた場合は、その疾患の治療法を提供することは 、医学的にも科学的にも非常に興味ある問題である。 ある有望な試みは、単離された糖タンパクを予防に用いることであった。この糖 タンパクは、マウスに注射し３次いで生きたウィルスを感染させた場合に、防御 性を与えることが示されていた。しかし、単純ヘルペス糖タンパクの利用は。 これまで、主にウィルスの培養と膜タンパクの単離とに依存してきた。糖タンパ クの商業的生産においては、危険な病原体の取り扱い、培養細胞中におけるウィ ルスの維持、ウィルスゲノムまたはその一部を含まない糖タンパクの単離などに 関する問題が、糖タンパクをワクチンとして用いることを妨げてきた。従って、 ウィルスを培養し、そして膜タンパクを分離すること以外の方法により生産され た塘タンパクを用いたワクチンを提供することが望ましい。 ヘルペスの感染を治療的に処置するための方法、すなわち個体がウィルスに感染 した後で、その疾患を軽減したり、その疾患の再発を防止する処置法を開発する こともまた非常に興味が持たれる。ウィルスの感染は１通常、抗生物質による治 療に対しては抵抗性を示すので、著しい副作用を持たない他の方法に非常に興味 が持たれている。再発性ヘルペス疾患の治療には、いくつかの薬剤（特に、アシ クロビール（Ａｃｙｃｌｏｖｉｒ））が有効であったが、再発を防止するために 長期間にわたって連続投与を行う必要性があるので望ましくなく、治療の過程で 薬剤抵抗性の変異体が生じる。 参考文献に関する記述 ＥｂｅｒｌｅおよびＭｏｕ（Ｊ、　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓ ｅｓ　（１９８３）１４８：４３６−４４４）は、ヒト血清中におけるＨＳＶ− １に特有のポリペプチド抗原に対する抗体の相対的な力価を報告している。　Ｍ ａｒｓｄｅｎら（Ｊ、　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏ　（１９７Ｂ）２８：６２４−６４ ２）は、　ｎ５ｖ−ｉ　と）ＩＳＶ−２との間におけるタイプ内の組み換えによ り、１１７キロダルトン（ｋｄ）の糖タンパクに対応する遺伝子がＨＳＶの遺伝 子地図上の０．３５〜０．４０地図単位内に位置することを報告している。 Ｒｕｙｅｃｈａｎら（同上（１９７９）２９：６７７−６７９）は、糖タンパク Ｂ遺伝子の位置が、　０．３０〜０．４２地図単位の間にあることを報告してい る。　５ｋａｒｅおよびＳｕｍｍｅｒｓ　亘匹に■（１９７７）７６：５８１〜 ５９５）は。 ＨＳＶ−Ｉ　ＤＮＡ上（７）ＥｃｏＲｌ　、　Ｘｂａ　Ｉ　、　ＨｉｎｄＩ［［ のエンドヌクレアーゼ切断部位を報告している。Ｒｏｉｚ＋＋＋ａｎ（Ａｎｎ、 　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９７９）１３：２５〜５７）は、ＨＳＶゲ／ ム（７）構成を報告しテイル。 ＤｅＬｕｃｃａ　ら（ｕ匹旦■（１９８２）　１２２：４１１）　は、　０．３ ４５〜０．３６８地図単位の間のｇＢ１構造遺伝子内に変異があると考えられる いくつかの表現型変異体の位置を決定している。 ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２に感染したニワトリ胚細胞から抽出されたサブユニ ットワクチンが、米国特許第４．３１７，８１１号および第４．３７４．１２７ 号に述べられている。また、　１ｉｌｆｅｎｈａｕｓら（ル狂ゴＡＬ−影ｏ１． −鎧且回互ｒｄ　（１９８２）刹：３２１−３３１）により、特定のＨＳＶ−１ 種（ＢＨ３）からのサブユニットワクチンの調製が述べられているのを参照され たい。Ｒｏｉｚｍａｎら（同上（１９８２）５２：２８７−３０４）は、免疫感 作したマウスにおいて効力を有することが示されている非感染性のＨＳＶ−１ｘ 　ＨＳＶ−２組換え体および欠失変異体の調製について述べている。Ｋａ　ｔｓ ｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８２）　２１８：　３８１−３８４）は、カエル 卵母細胞の核への注入によるクローン化断片の発現だけでなく、Ｈｓｖ〜１　ｇ Ｄ遺伝子のクローニングおよびエセリヒア・コリー（Ｅ、ｃａｄｉ）内における 該遺伝子の低レベル発現について述べている。彼らはまた。 ｇＤ遺伝子の塩基配列も示している。Ｗｅｉｓら（Ｎａｔｕｒｅ　（１９８３） ３０２ニア２−７４）は、エセリヒア・コリー内におけるｇＤの高レベル発現に ついて報告している。このポリペプチドは、ウサギにおいて中和抗体を誘導する 。Ｂｅｒｔａａｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８３）２２２：５２４−５２７）は 、＠乳動物培養細胞中における糖タンパクＤの発現について報告している。Ｌａ ５ｋｙら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１■１（１９８４年６月）　５２７−５３２）は 、この糖タンパクＤをマウスの免疫化に用いることを報告している。Ｃｏｈｅｎ ら（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ　（１９８４）旦：１０２−１０８）は、成熟タンパクの ８〜２３残基内に含まれる。　ｇＤの特定の抗原決定基の位置および化学合成に ついて報告している。 ＨＳＶを感染させた細胞からの膜タンパク調製物を、ヒトの感染後ワクチンとし て、「治療」に用いることについては。 Ｄｕｎｄａｒｏｖ、　Ｓ−ら（Ｄｏｖ、　Ｂｉｏｌ、　５ｔａｎｄａｒｄ　（１ ９８７）５７：３５１−３５７）および５ｋｉｎｎｅｒ、　Ｇ、Ｒ，Ｂ、　ら（ 同上（１９８２）５２：３３３−３４）により報告されている。 発明の要旨 単純ヘルペスウィルス１型および２型に対する治療に用いるワクチンおよび組成 物、ならびにそれらの生産方法が提供される。これらの治療法は１組換えＤＮＡ 技術により生産されるウィルス特異的ポリペプチドの組み合わせを用いている。 特に、　ＨＳＶ　ｇＢおよびｇＤは、改変された哺乳動物宿主で生産され、そし て組み合わせて用いられた。これらのポリペプチドは、ヒトを含む動物における 単純ヘルペスウィルス感染の治療に°用いられうる。 従って２本発明のある局面は単純ヘルペスウィルス（）ＩｓＶ）感染の治療的処 置に用いられるワクチンである。該ワクチンは。 ａ、免疫的に活性な単純ヘルペスウィルス糖タンパクＢ　（ｇＢ）ポリペプチド ；および す、免疫的に活性な単純ヘルペスウィルス糖タンパクＤ　（ｇＤ）ポリペプチド を含有する。 ここで、該ポリペプチドは哺乳動物細胞中において組換えＤＮＡ構築物を発現さ せて調製されたものであり、該ポリペプチドは、このワクチンが、ＨＳＶに一次 感染した後の個体に投与される場合には、）ＩｓＶに感染した該個体において） ＩＳＶにより誘導される疾患の再発を防止するのに効果的な量で存在する。 本発明の他の局面は、単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）感染の治療に用いられる ワクチンである。該ワクチンは。 ａ、免疫的に活性な単純ヘルペスウィルス糖クンバクＢ（ｇＢ）ポリペプチド； または す、免疫的に活性な単純ヘルペスウィルス糖タンパクＤ（ｇＤ）ポリペプチドを 含有する。 ここで、該ポリペプチドは、＠乳動物細胞中において組換えＤＮＡ構築物を発現 させて得られたものであり、該ポリペプチドは、このワクチンが、ＨＳＶに一次 感染した後の個体に投与される場合には、）ＩｓＶに感染した該個体においてＨ ＳＶにより誘導される疾患の再発を防止するのに効果的な量で存在する。 図面の簡単な説明 第１図は、　ＨＳシー１およびＨＳシー２の物理的地図、プロトタイプのアイソ マーの配置に対するＥｃｏＲＩ切断地図、および）ＩＳＶ−２のＨｉｎｄｌ［［ 制限酵素切断地図を表す。 第２図はＨＳＶ−１地図におけるｇＢ１コード領域の制限酵素切断地図を表す。 第３図はｇＢ１コード領域の制限酵素切断地図である。 第４図はｇＢｌおよびｇＢ２のＤＮＡアミノ酸配列を表す。 第５図は）ＩＳＶ−２の物理的地図であり、ｇＢ２コード領域が示されている。 第６図はプラスミドｐＨ５１３７のいくつかの重要な特徴を示す地図である。 第７図はｇＢ２の制限酵素切断地図である。 第８図はｇＤｌの哺乳動物発現ベクターであるｐＨ３１３２の構築に関するフロ ーチャートである。 第９図（ＡおよびＢ）はＨＳＶ−２の物理的地図であり、ｇＤ２コードＳＪ［が 示されている。 第１０図はｇＢ２に対する哺乳動物ベクターの構築に関するフローチャートであ る。 第１１図は一次感染した後に行われる組換えｇＢ−ｇＤを用いたワクチン接種が 再発性ヘルペス疾患に及ぼす効果を表す。 第１２図Ａはヘルペスウィルス糖タンパクによる免疫化が再発性ヘルペスの感染 率に及ぼす効果を表す。 第１２図Ｂは対照のモルモットと感作したモルモットとの間における週単位の再 発率の差を表す。 第１３図はｇＢｇＤワクチンの投与時間がヘルペス疾患の再発に及ぼす効果を表 すグラフである。 の　ピ　に　るｔ庸 ワクチン 本発明のワクチンは、１型および２型の両方の組換えＨＳＶ糟タンパクＢおよび Ｄを用いている。成熟（全長）ｇＢおよびｇｏタンパクは、これら成熟タンパク と免疫学的に等価な（すなわち、感染に対して防御性を与える）断片、前駆体、 および類似体と同様に用いられる。請求の範囲で用いているように、「糖タンパ クＢポリペプチド」および「糖タンパクＤポリペプチド」という用語は、このよ うな断片、前駆体、および類似体を含むことが意図される。組換えｇＢおよびｇ Ｄポリペプチドは、真核細胞、好ましくは酵母または哺乳動物細胞。 最も好ましくは哺乳動物細胞において生産される。断片の長さは、少なくとも約 １５アミノ酸、好ましくは少な（とも約３０アミノ酸である。ワクチンは、１型 ポリペプチドの混合物。 ２型ポリペプチドの混合物、または１型および２型ポリペプチド両方の混合物、 あるいは個々のポリペプチドのいずれをも含有し得る。 ｇＢおよびｇＤポリペプチド混合物は、単独でも用いられるが。 通常は、生理学的および薬理学的に受容される媒体、一般的には水、生理食塩水 、リン酸緩衝液、糖などと共に用いられる。さらに、該ポリペプチド混合物は、 生理学的に受容されるアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム、ムラミルジ ペプチド誘導体など）と共に用いられ得る。実施例６．３で示されるように、様 々なアジュバントが有効である。アジュバントの選択は、少なくとも部分的には 、アジュバントを含んだワクチンの安定性、投与経路、ワクチン接種される個体 種に対するアジュバントの効能、そしてヒトの場合には、このアジュバントが食 品医薬凸周（ＦＤＡ）によってヒトへの使用が認可されているかいないかといっ たことに依存する。ワクチンは、リポソームにより運搬されるか、および／また はインターロイキン１および２のような免疫調節剤と共に運搬される。ワクチン は都合のよい非経口経路（例えば、静脈内、動脈内、皮下、真皮内、筋肉内、ま たは腹腔内）により投与されうる。同一または異なった経路で投与されるワクチ ンを分割して投与することは有利である。ワクチンは、単純ヘルペスウィルスに 一次感染した後に投与される。 感染後投与の効能は、実施例６．１に示されている。ウィルス感染後の宿主にお ける免疫応答の増大に及ぼすワクチンの効果は、実施例６．２に示されている。 単純ヘルペスウィルスのウィルス表面糖タンパクは、抗体が介在するウィルスの 中和化と、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）とによって認識される抗原であるこ とが示されている。Ｎｏｒｒｉｌｄ　Ｂ、ら、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｔｍｍｕｎ。 （１９８０）　１：３８−４４゜頻繁ニＨ５Ｖ惑染を再発する患者は、しばしば 中和抗体およびＡＤＣＣの両方を高いレベルで有する。Ｃｏｒｅｙ。 Ｌ、および５ｐｅａｒ、　Ｐ、Ｇ、、　Ｅｎｇ、　Ｎ、、　Ｊ、Ｍｅｄ、　３１ ４：６８６−６９１．１９８６゜このような患者にとって、Ｈ５Ｖ特異的抗体の 有力な誘導物質が、ウィルス糖タンパクであることが示された。Ｅｂｅｒｌｅ、 　Ｒ，。 Ｍｏｕ、　ＳＪ、、およびＺａｉａ、　Ｊ、八、、Ｊ、Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ、　 ６５：１８３９−１８４３゜１９８４゜従って、２つのウィルス糖タンパクだけ から構成され。 他のウィルス抗原を含まない組換えサブユニットワクチンを。 再発性陰部ヘルペスの治療へしｎ法的に利用することは期待されなかった。 糖タンパクＢおよびＤは改変することなく用いられる。しかし、より小さな関連 ポリペプチド（例えば、断片など）を用いる場合、および分子量が約５．０００ ダルトンより小さい（例えば、１．５００〜５．０００ダルトン）場合には、所 望の免疫応答を誘導するために改変が必要とされる。より小さなハプテンは、適 切な免疫原キャリアー（例えば、破傷風トキソイドなど）に結合させなければな らない。 ｇＢまたはｇｏポリペプチドをコードする短いＤＮ八へ片を、他の病原性生物や ウィルスからのタンパクを発現する遺伝子に連結することもできる。このように して、得られた融合タンパクは１種類より多くの病気に対して免疫性を与え得る 。 １回の投与量あたりに用いられる組換えｇＢおよびｇＤポリペプチドの総量は９ 通常、宿主の体重１ｋｇあたり、約０．１μｇ〜２■、より一般的には約０．５ μｇ〜１■、そして特に約０．５μｇ〜１０μｇである。ワクチン中のｇＤに対 するｇＢの割合は１通常。 約”０．１：１〜１０：１．より一般的には約０．５：１〜１０：１゜そして好 ましくは約Ｏ，Ｓ：１〜５：１である。１回の投与は。 日単位から週単位の間隔で繰り返して行われ１通常は２週間から４週間の間隔で ９通常は約２回から１０回を越えずに行われる。しかし、実施例６．４に示され るように、ウィルスに一次恣染した後の投与時間が、疾患の再発率に影響を及ぼ す。 従って、治療される種および／または個体に依存して、最も効果的な投与時間を 決定する必要がある。最も効果的な時間は１例えば疾患の状態をモニターする疾 患症候学または抗体価を用いる基本的な検査により決定し得る。さらに、疾患の 急性期、すなわち個体がＨＳＶにより誘導される病変を体に示す場合に、ワクチ ン投与が疾患の再発を著しく低減させることは、実施例６．４のデータに示され ている。 え　ンパクＢ 組換えｇＢポリペプチドの調製は、　１９８５年１０月２４日に公開された国際 公開Ｎｏ、Ｗｏ　８５１０４５８７の国際出願Ｎｏ、ＰＣＴ／ＵＳ８５１００５ ８７に詳述されている。組換えｇＢポリペプチドを生産するのに用いる材料およ び方法については、以下で簡単に記述する。 実施例における第４図は、ｇＢ１バットン株のヌクレオチド配列と、そのヌクレ オチド配列によりコードされるアミノ酸配列とを表す。第４図には、ｇＢｌとｇ Ｂ２との間の実質的な相同性も示されている。ヌクレオチド配列には多くの変化 があり得る。独立した機能を有する種々の断片が用いられ得る。 これら断片は成熟ｇＢ以外のタンパクに結合し得る。さらに。 種々のコドンは、同じアミノ酸をコードするように改変され得るが、宿主の性質 に従ってより効果的な発現を示す０例えば、これらコドンは、１種またはそれ以 上のタンパク、あるいはタンパク群における特定コドンの出現頻度に従って改変 され得る。これらタンパクは２例えば解糖系タンパクであって、特定の宿主（例 えば、酵母）の全タンパクにおいて高い比率を占める。ある場合には、１個また はそれ以上のコドンは、あるアミノ酸を別のアミノ酸で置き換えることにより。 異なるアミノ酸をコードするように改変し得る。この場合。 変化の影響はタンパクの免疫原性や興味ある他の生物学的因子に有害ではない。 ある場合には、　Ｎ末端またはＣ末端にアミノ酸を付加することが望ましい。こ のようなアミノ酸の付加は好ましい結果をもたらす。このことは、成熟ｇＢ１ま たはその前駆体をコードする配列の５°末端または３”末端にコドンを付加する ことにより、容易に達成し得る。さらにｇＢ２のアミノ酸配列はｇＢｌのアミノ 酸配列と２０％だけ数が異なっているが、　ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２の他の 株は、それぞれｇＢ１バットン株またはｇＢ２３３３株と同一または類似のｇＢ ｔＪ！タンパクを持っている。これらｇＢ糖タンパクは１通常は５％より少ない 数だけ、より一般的には２％より少ない数だけ、そして多くの場合は０．５％よ り少ない数だけのアミノ酸が、ｇＢ１バットン株またはｇＢ２３３３株のアミノ 酸配列と異なっている。 ｇＢｌの配列、特にｇＢ１パットン株は、タンパクのＮ末端から始まる４つのド メインに分けられる：１番目のアミノ酸から約３０番目のアミノ酸にまで広がる 第１の疎水性領域；第１の疎水性領域から約７２６番目のアミノ酸にまで広がり 、極性が変化し得る領域；極性が変化し得る該領域から約７９５番目のアミノ酸 にまで広がる第２の疎水性領域；そして９０４番目のアミノ酸のＣ末端にまで広 がり、極性が変化し得る第２の領域である。 ｇＢは膜の糖タンパクであるから、他の糖タンパクから類推すると、第１の疎水 性領域は分泌および／または膜の配置を支配するシグナルリーダー配列であると 考えられる。従って。 極性が変化し得る第１の配列は、膜の外側にあり、　ｇＢが別のタンパクに対す る受容体として、あるいはワクチン中の免疫原として作用する程度まで、認識配 列として役立つ、第２の疎水性配列は、トランスメンブレン・インチクグレイタ ー配列（ｔｒａｎｓｗ＋ｅｍｂｒａｎｅ　ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ　５ｅｑｕｅｎ ｃｅ）　（Ｌばしば、「アンカー（ａｎｃｈｏｒ）　Ｊと呼ばれる）としての役 目を果たし得る。 極性が変化し得る第２のアミノ酸配列は、細胞質内に存在すると考えられ、受容 体がトランスメンブレン・インチクグレイター配列の外部にあるという程度まで 、１つまたはそれ以上の細胞質プロセスを変更する役目を果たし得る。 ｇＢの前駆体またはその機能的な断片をコードしているポリヌクレオチド配列は 、適当な発現ベクターに該ポリヌクレオチド配列を挿入し、得られた発現構築産 物を適合する宿主に導入することにより、クローン化され、そして発現され得る 。 コードしている断片は、約０．１地図単位未満９通常は約０．０５地図単位未満 である；ここで、１．０地図単位とはＨ３ｖゲノム全体の大きさである。発現ベ クターは、染色体外に存在するか、あるいは宿主細胞のゲノム内に組み込まれた 。低レベルまたは高レベルのマルチコピーベクターであり得る。そして。 発現ベクターは、興味のあるポリペプチドを分泌または排泄させるか、あるいは 興味のあるポリペプチドを細胞質内または膜内に保持させる。非常に数多くの発 現ベクターが文献に発表されており、一般に、真核宿主で用いるのに有用である 。 真核宿主には、酵母（例えば、サツカロマイセス・セルビシア（Ｓ、ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ））および広範囲の永久増殖性哺乳動物細胞（例えば、マウス細胞、 サル細胞、ハムスター細胞（例えば、３Ｔ３．ベロ（Ｖｅｒｏ）　、チャイニー ズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）　、または初代細胞系）が含まれる。分泌が必 要とされる場合には、宿主に依存して、天然または非天然のいずれかの分泌リー ダー配列を用いることができる。分泌リーダー配列を切断するプロセッシングシ グナルは、天然のシグナル、または非天然の分泌リーダー配列に関連するシグナ ル、あるいはこの両方がタンデムになったものであり得る。 ｇＢ１Ｂ１バラトンードするポリヌクレオチド配列を得るために、影但Ｒ１制限 酵素断片Ｆ上に、ｇＢｌコード配列の位置を地図に示した。Ｆ断片の３つの割断 片が、単離され、　ｐＢＲ３２２中にサブクローン化された（第２図）。次いで ９これらサブクローンのＤＮＡ断片は、　ＨＳＶ−１が感染した細胞から単離し たポリ　Ａ″ｍＲＮＡのノーザンプロットに対するプローブとして用いられた。 ｇＢに対して予測された大きさのｍＲＮＡにハイブリダイズした断片は、　ｇＢ コード領域内に存在すると推定された。 ｇＢの転写方向もまた。　ＤＮＡプローブのどの鎖がｍＲＮＡとハイブリダイズ したかを決定することにより明らかにされた。ｇＢ配列の同一性を確認するため に、ＤＮＡ断片をハイブリッド−セレクトＨ５Ｖ−１ｍＲＮＡに対して用いた。 このｍＲＮＡは９次いでインビトロで翻訳され、得られたタンパクはｇＢ特異的 抗体を用いてｇＢに関して分析された。 ｇＢｌをコードする断片は、今日では、制限酵素地図作成や塩基配列の決定を含 む様々な方法で取り扱われ、制限酵素切断部位や発現のためのオープンリーディ ングフレーム領域が確証される。次いで、ＤＮＡ配列は、完全なｇＢ前駆体また はその断片をコードしている配列を与えることに限定される。次いで、これら配 列は、適当な位置にある転写シグナルおよび適当な翻訳シグナルを有する適当な 発現ベクターに挿入される。これは、突出部分を充填し、そしてアダプターなど を用いて平滑末端結合を行うことにより達成し得る。 増幅能力を有する遺伝子に対して遺伝子をタンデムに導入することは特に興味深 いことである。有用な遺伝子には、メトトレキセートを用いることにより増幅し 得るジヒドロ葉酸レダクターゼ（並）遺伝子（ここで、前遺伝子および隣接領域 は反復している）；および重金属（例えば、銅）などで増幅し得るメタロチオネ インが含まれる０発現構築産物は。 形質転換、トランスフェクション、リン酸カルシウム沈澱などを否むいかなる有 用な手段によっても、適当な宿主に導入することができる。次いで、宿主細胞は 、特定の遺伝子を増幅することを選択するレベルに、適当な生物前によりストレ スがかけられる。次いで、これら細胞は培養され、所望のポリペプチドを有効に 生産するまで増殖される。 上述の手順に従って、　）ＩＳＶ−２３３３株由来のｇＢ２をコードしているポ リヌクレオチド配列は、前駆体および成熟体の両方が単離され、クローン化され 、そして構築物を与えるために操作される。その結果、１種またはそれ以上の宿 主で発現し得る。ｇＢ１Ｂ１バラトンードする断片の有用性を考慮すると。 これら断片は、特異的）Ｉｓシー２制限断片クローンへのＤＮＡ部分をコードす るｇＢ２の位置付け、または感染した宿主細胞由来のｇＢ２　ｍＲＮＡの単離の いずれのプローブとしても用いられる。 便宜的には、ｇＢ１遺伝子の異なる領域をコードする複数のプローブが用いられ る。このプローブにハイブリダイズするのにおおよそ適当な大きさを有する陽性 ＤＮＡ断片または豊富なｍＲＮＡのいずれもが選択される。次いで、　ｍＲＮＡ は逆転写されてｃＤＮＡを与えるか、および／またはＨＳＶ−２ゲノムの断片と のハイブリダイゼーションに用いて、ｇＢ２をコードしているその機能を確認す ることができる。必要に応じて、ｇＢ２構造遺伝子の一部を含む１個より多くの クローン化された断片は、適当に、全コード領域および隣接領域を与えるために 操作され。 そして結合され得る。次いで、このコード領域は発現ベクター中に導入される。 え　タンパクＤ 組換えｇＤｌの調製は、　１９８５年１０月２４日に公開された国際公開ＮｃＬ Ｗ０８５１０４５８７の国際出願ｋＰＣＴ／ＵＳ８５１００５８７に詳述されて いる。組換えｇｏポリペプチドを生産するのに用いられる材料および方法につい ては、以下で簡単に述べる０組換えｇＤ２の調製に関する詳しい記述は以下の実 施例に与えられている。 天然に存在する糖タンパクＤと免疫学的に交差反応を行うポリペプチドは９例え ば酵母や哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）の真核宿主において３組換えＤＮＡ の方法論により生産される。真核生物での生産は、真核宿主に関連して１例えば 翻訳後修飾および／または分泌などの利点を与える。ｇＤポリペプチドは、少な （とも約９個のアミノ酸をコードする比較的短い合成りＮＡ断片から生産され、 　ｇｏに特異的な免疫応答を誘導するのに有効なハブテンを与える。 ｇＤ　ＤＮＡ断片は、天然起源または合成起源のものであり得る。 ＨＳＶ−１の天然のｇｏ遺伝子は、ウィルスゲノム上において、短い内部繰り返 しくＩＲ，）配列と、その３”末端にある短い終結繰り返しくＴＲ，）配列との 間に位置する。成熟タンパクをコードしているということは、約１．６ｋｂｐの 断片がゲノムの２．９ｋｂｐシにＩ制限酵素断片上に位置しているのを見い出せ ることである。成熟タンパクの全コード領域は、　２．９ｋｂｐ　Ｓａｃ　Ｉ断 片のうちのＨｉｎｄ　ｍ　Ｎｒｕ　Ｉ断片中に位置している。天然に存在するｇ Ｄ遺伝子は、修飾を受ける場合もあれば、受けない場合もある、遺伝子の領域は 、望み通りに欠失させるか、および／または他のＤＮＡ断片と結合させ得る。　 ｇＤ　ＤＮＡ断片は、　ｇＢ　ＤＮＡの発現について上述したものと同様の材料 および手順を用いて１発現ベクターに挿入され、そして発現され得る。天然に存 在するｇｏ遺伝子の特定断片の調製、クローニング、および発現については、以 下の実施例において詳述する。 以下の実施例は１例示を目的として与えられたものであり。 限定するものではない、以下の実施例において、第１節では組換えタンパクを生 産するのに用いられる一般的な手順について；第２節では組換えｇＢｌの調製に ついて；第３節では組換えｇＢ２の調製について；第４節では組換えｇＤｌの調 製について；第５節では組換えｇＤ２の調製について；第６節ではｇＢおよびｇ Ｄのポリペプチド混合物を用いたワクチンの研究について述べる。 実施± １、材料友よ話方法 ＨＳＶ−１バラトン株およびＨＳＶ−２３３３株の生きた保存株は。 Ｄｒ、　Ｒｉｃｈａｒｄ　ＨｙＩＩｌａｎ　（Ｈｅｒｓｈｅｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ 　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｈｅｒｓｈｅｙ。 Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ）より入手した。これらのウィルスは、　Ｄｒ、　Ｅ ｖｅｌｙｎＬｉｎｎｅｔｔｅ（Ｖｉｒｏ　Ｌａｂｓ、　Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、 　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）またはＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃ ｕ１ｔｕｒｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙより入手したベロ細胞中で増殖させ得る。 この増殖は標準的な手順に従って行われる。 プラスミドｐＡｃＹｃ１８４　（ＣｈａｎｇおよびＣｏｈｅｎ、　Ｊ、Ｂａｃｔ ｅｒｉｏｌｏ■（１９７８）　１．３４　：１１４Ｌ）のＥｃｏＲ１部位にクロ ーン化されたＨＳＶ−１バソトンＥｃｏＲＩ　ＤＮＡ断片（Ｋｕｄｌｅｒら、■ 工虹犯■（１９８３）　１２４：８６−９９）のライブラリーは、叶、Ｈｙｍａ ｎより得るか２あるいは簡便法で独自に調製し得る。２つのＨＳＶ−２３３３ク ローン、すなわちｐＢＲ３２２（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ（１９７８）　５　：　２７３１）のＨ４ｎｄＩ［［部 位に挿入されたわｎｄＩ［Ｉ断片ＨおよびＬもまた。　Ｄｒ。 Ｈｙｍａｎより得ることができる。 並欠損Ｃ）ｔｏ細胞系は、　Ｄｒ、Ｙ、Ｗ、Ｋａｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏ ｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ。 Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）より得た。この細胞系はもともと、　Ｕｒｌａｕ ｂおよびＣｈａｓｉｎ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ Ａ（１９８０）７７：４２１６−４２２０）により記述されている。非選択条件 下で、これらの細胞は。 １０％生胎児血清、１００１１／成ペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマ イシン、そして１５０μｇ／ｄ　Ｌ−プロリンを追加したノ＼ムのＦ−１２培地 （Ｇｉｂｃｏより入手、　ｃａｔ、　ｎｏ、　１７６）で増殖させた。選択培地 は、１０％の透析された牛胎児血清と、ペニシリン、ストレプトマイシン、およ び１５０μｇ、／ｍ！２Ｌ−プロリンとを追加したＯＥＭであった。メトトレキ セート（？ＩＴＸ）選択のために、濃縮ＭＴＸ保存培地は、　Ｌｅｄｅｒｌｅよ り得たＭＴＸから調製し、使用直前に上記のＤＭＥ選択培地に加えた。 １．１　クローニング すべてのＤＮＡ操作は、標準的な手順に従って行われた。 Ｍａｎｉａｔｉｓら＋　Ｍｏ１ｅｃｕユａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　、Ｃ５Ｈ（１９８ ２）を参照されたい。 制限酵素、　Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ、エセリヒア・コリーＤＮＡポリメラーゼＩ クレノー断片、そして他の生物学的試薬は、　ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃ ｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、あるいは他の表示した市販品供給業者から購入 し、製造業者の指示書に従って使用した。２本鎖ＤＮＡ　’＆！　１％アガロー スゲル上で分離し、電気溶出により単離した。 １．２　ＲＮＡ■単皇エノーザンプロット７　およびハイブリ１」ｊ■Ｉ」凡失 全ＲＮＡは、細胞あたり１０個のウィルスという多重度でＨＳＶ−１またはＨＳ Ｖ−２に感染して６時間後のベロ細胞より調製した。 細胞単分子層を洗浄し、抽出緩衝液でインキュベートシ、そしてＰａｃｈｌ　ら （Ｃｅｌｌ（１９８３）３３：３３５−３４４）によって述べられているように 処理した。ポリＡ′″ＲＮＡは、５００ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭＴｒｉｓ　Ｈ ＣＩ（ｐＨ７，５）、　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．１％ｓｎｓ中に入ったオリ ゴｄＴセルロース（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈより得た） の３ｄカラムに、２■の全ＲＮＡを通し９次いで１００ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍ Ｍ　ＴｒｉｓＨＣＩ（ｐＨ７，５）、ＩＩｅＭ　ＥＤＴＡ、　０．１％ＳＤＳで カラムを洗浄し、そして１０ａ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、１ｍＭ 　ＥＤＴＡ、　０．１％ＳＯＳでポリ　Ａ゛分画溶出させることにより調製した 。 ノーザンプロット解析を行うために、ポリＡ″ＲＮＡを、グリオキサール（Ｍｃ Ｍａｓ　ｔｅｒら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪＳ Ａ（１９７７）亙：４８３５−４８３８）で変性させ、１％アガロースゲルの電 気泳動により分別し、ニトロセルロースペーパー（Ｔｈｏｍａｓ。 同上（１９８０）　７７　：　５２０１−５２０５）に移し、そして３２ｐ標識 プローブでハイブリダイズさせた。 ハイブリッド選択翻訳法に用いられる方法の詳細は、以前に記述されている（Ｐ ａｃｈｌ　ら、並置（１９８３）３３：３３５−３４４）　、　ＤＮＡフィルタ ーは、　ｇＢをコードする３、５ｋｂのχｈｏ−Ｋｐｎ断片３μｇ。 またはＨＳＶ−１ｇＤをコードする３、０ｋｂのＳｓｔ　Ｉ　−５ｓｔ　Ｉ断片 ２ｕｇのいずれかを用いて調製した。このフィルターを、　ＦＩＳＶ−１が感染 した細胞由来のポリＡ”ＲＮＡ　４０Ｍｇと共にインキュベートした。結合ＲＮ Ａを溶出し、網状赤血球無細胞系（Ｐａｃｈｌ　ら。 Ｊ、Ｖｉｒｏｌ　、　（１９８３）旦：１３３−１３９）で翻訳させた。翻訳産 物は。 欠損ＣＨＯ細胞（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ　（１９８０）前出）の形質 転換は、キャリアー〇Ｎ＾を省略したこと以外は、　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂおよ 改変された手順を用いて行った。プラスミドＤＮＡのリン酸カルシウム沈澱は、 ２５０ｍＭ　ＣａＣｌ□中のプラスミドＤＮＡに、これと等容量の２倍に：ａ縮 したＨＥＰＥＳ−緩衝化生理食塩水（２Ｘ　ＨＢＳ）を１滴ずつ加えて混合する ことにより調製した（ＩＸＨＢＳは。 ０．１４Ｍ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＫＣＩ、　０．７ｍＭ　ＮａｚＨＰＯａ、　２ ．８ｍＦＩグルコース。 １０ＤＩＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，０）である）。室温で約２０分間インキュベ ートした後、１ｍ！のリン酸カルシウム−ＤＮＡ懸濁液（１５ＭｇのＤＮＡを含 む）を、　１０ｃｍ＋の平板上で集密度が５０％に達するまで増殖した細胞の培 地へ加えた。６〜８時間後、ＤＮＡを含んだ培地を取り除き、細胞を１５％グリ セロール−１×ＨＢＳと共に４分間インキュベートした。次いで、これら細胞を ２日間非選択培地（Ｆ１２）で増殖させ、その後これら細胞を選択培地中に分割 、すなわち植え継いだ。１０日後には、前隅性の細胞コロニーが現れ、１４日後 に、パスツールピペットで平板からコロニーの細胞を移すことにより、これらコ ロニーを分離した。 分離した細胞を増殖のためにマルチウェルの平板に移した。 １．４　細　のインビボー：および　疫゛。 ３５３−メチオニンで標識するために、細胞を３．５ｃｍの平板で集音的に増殖 させ、ＰＢＳ　（０，１４Ｍ　ＮａＣ１２ｊｍＭ　ＸＣＩ、　１５．３ｒｎＦＮ ａＪＰＯ４）で１回洗浄し２次いでメチオニンを除いた０、５ｍｌの標識培地Ｄ ＥＭ（Ｇｉｂｃｏから得たダルベツコの修正イーグル培地。 ｃａｔ、　ｎｏ、１８８Ｇ）に、１％の透析された牛胎児血清と、　４００　ｇ 　Ｃｉ／雄の３ＳＳ−メチオニン（＞　１０００　ｕ　Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を加え たものを、各平板に添加した。これら細胞を３７°Ｃにて適当な時間インキュベ ートした。標識期間の終わりには、培地を取り除き、単分子層をＰＢＳで１回洗 浄した。「冷」メチオニンチェイス（“ｃｏｌｄ”ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ　ｃｈ ａｓｅ）として、　２．５ｍＭのメチオニンを含むＤＭＥで標識培地を置き換え た。免疫沈澱を行うために、細胞を、０．１雄の細胞溶液緩衝液（２０ａ＋Ｍ　 Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８）、　１００ｍＭ　ＮａＣ１，Ｉｎ＋Ｍ　ＥＤＴＡ、 　０．５　％ノニデットＰ４０．０．５％デオキシコール酸ナトリウム、牛血清 アルブミン、０．１％ＳＤＳ、　１．０ｍ１１フエニルメチルスルホニルフルオ リド、　１０ｍＭベンズアミジン、１％アプロチニン、　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙより得た）中で熔解させた。細胞溶解物を、チューブ にかき集め９手早くポルテックスミキサーにかけ２次いで４°Ｃにて５〜ｌＯ分 間放置した。細胞破片物は、遠心分離により取り除き、透明になった溶解物は一 ７０°Ｃで貯蔵した。 免疫沈澱を行うために、細胞溶解物０．１ｍは、普通血清と４℃で３０分間イン キュベートすることにより予め清澄させ。 次いでプロティンＡセファロース（ＰＡＳ）の２０％溶液（溶解緩衝液中）５０ μｌを加え、４°Ｃで３０分間、静かに振盪しながらインキュベートし続けた。 ＰＡＳは、　１４．０００Ｘ　ｇで１分間遠心分離することにより取り除き、５ μ２のＨＳＶ−１ポリクロ一ナル抗体（ＤＡＫＯより得た）またはｇＢ特異的モ ノクローナル抗体Ｆ３ＡＢ　（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　５ｏｕｔｈ　Ａｌ ａｂａｍａの叶、　Ｊｏｈｎ　０ａｋｅｓより得た）を加えた。Ｆ３ＡＢ抗体を 用いる場合は、溶解緩衝液から０．１％ＳＤＳを省いた。４°Ｃで３０分間の後 、７５μ！のＰＡＳを加え。 上述のようにインキュベートした。ＰＡＳ−免疫複合体を遠心分離により集め、 ＢＳＡとプロテアーゼ阻害剤とを欠く溶解緩衝液で３回洗浄し、　０．１２Ｍ　 Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ（ｐＨ７，０）で１回洗浄した。 免疫沈澱したタンパクをＳＯＳサンプル緩衝液中で煮沸することによりＰＡＳか ら解離させ９次いで１２％ポリアクリルアミドゲルで解析した。細胞培地から標 識タンパクを免疫沈澱させるために、培地をまず遠心分離により清澄にし１次い で１／１０容量の１０倍溶解緩衝液を加えると、タンパクが上述のように沈澱し た。 （以下余白） １．５１ＩＬｉｌＬＩ ＣＯ３細胞またはＣＨＯクローンにおけるｇＢまたはｇＤの発現を分析するため に、スライドのウェル内で増殖した細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１００％メタノ ールを用いて一２０°Ｃにて１０分間固定し、続いてさらにＰＢＳで３回洗浄し 、５％ヤギ血清（ＧＳ）を足したＰＢＳで１回洗浄した。次いで、固定された細 胞を。 １次抗体ＣＰＢＳ−５％ＧＳテ１／１００　ニ希釈したＨＳＶ−１またはＨＳＶ −２ポリクロ一ナル抗体）とともに３７°Ｃにて３０分間インキュベートした０ 次に、この細胞をＰＢＳ−５％ＣＳで３回洗浄し、２次抗体（ＰＢＳ−５％ＣＳ で１／１０に希釈したＦＩＴＣ−結合ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（カペル）とともに ３７°Ｃにて３０分間インキュベートした。 ＰＢＳ−５％ＧＳで４回洗浄した後、スライドを５０％グリセロール−１００ｍ Ｍ　）リス（ｐＨ８，０）を用いてカバー片でマウントし、螢光光学系を装備し たライツ光学顕微鏡で観察した。生細胞の免疫螢光は、細胞をＰＢＳ−５％ＧＳ での最初の洗浄に引き続き直ちに１次抗体とともにインキュベートしたことを除 いては、上述のようにして行った。カバー片でマウントする前に、生細胞を５％ ホルムアルデヒドを含有するＰＢＳで固定した。螢光染色した細胞は、コダック のエフタフロムフィルム（ＫｏｄａｃＥｋｔａｃｈｒｏａｏｅ　ｆｉｌｍ；ＡＳ Ａ４００）を用いて写真を撮った。 １．６．旦旦り光灰 ＣＩＯ細胞を培養した培地中のｇＢタンパク濃度を、標準物質として精製した組 換えｇＢ調製物を用いた間接酵素結合免疫吸着分析法（ＥＬＩＳＡ）により測定 した。　ＰＢＳで１　：　１０００に希釈されたＦ３ＡＢ抗体５０μｌを、室温 で１時間インキュベートすること北より、９６−ウェルの塩化ポリビニルプレー ト（ＤｙｎａｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、）のウェルに吸着 させた。過剰な抗体をＰＢＳ−５％ＧＳで３回洗浄することにより除去した。５ ０μｌの培地試料またはＰＢＳ−１％ＧＳで希釈したｇＢタンパク標準物質をウ ェルに添加し、室温にて１時間インキュベートした０次いで、このプレートをＰ ＢＳ＋　１％ＧＳで３回洗浄し、その後同じ緩衝液で１：１０００に希釈した５ ０μｌのウサギ抗ＨＳＶ−１ポリクローナル抗体（ＤＡＫＯより入手）とともに ３回目のインキュベーションを１時間行った。過剰な２次抗体は、ＰＢＳ＋１％ ＧＳで３回洗浄することにより除去した。最後に、ＰＢＳ−１％ＧＳで１＝５０ ０に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体（Ｂｏｅｈｒｉ ｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）の５ｏｕｐ、を各ウェルに添加し、１時間イン キュベートした０次いで、ウェルをＰＢＳ＋　１％ＧＳで１回洗浄し、続いてＰ ＢＳで８回洗浄した後、１■／Ｉｄの濃度の２．２′−アジドージ〔３−エチル ベンズ−チオアゾリンスルホネート）　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅ ｉｍ　）を０．１Ｍクエン酸（ｐＨ４，０）。 ０．００３％Ｈ２０□中に含有する液５０μ２で呈色させた。この呈色反応を、 ５分後に５０μｌの１０％ＳＤＳを添加することによって停止させ、吸光度をマ イクロタイタープレートリーダーで４１４ｎｓにて読み取った。 ｇＤタンパクの濃度は２標準物質として精製した組換えｇＤおよびＦ３ＡＢの代 わりにｇＤ−特異的モツクローナル抗体８Ｄ２　（Ｒｅｃｔｏｒら、　Ｉｎｆｅ ｃｔ、　ａｎｄ　Ｉ＋ｕ＋ｕｎ、　（１９８２）　３８：１６８−１７４）を使 用したことを除いては、同様の方法で測定した。 ２．鵜ｊ５乙パｊ− ２，１Ｂ１゛　云　の　、クローニングおよび　・４糟タンパクｇＢ１に対応す る遺伝子を単離するために、）ＩｓＶ−１バラトン株（ＰａｔｔｏｎＨ５ｋａｒ ｅおよびＳ　ｕ　ＤＩ　ＩＱ　ｅ　ｒ　ｓ　、　ｕ匹昆■（１９７７）７６：５ ８１−５９５）のＥｃｏＰＩ　Ｆ制限断片の地図ノ座標０．３４５−０．４０ニ 及ぶＤＮＡ断片を、プラスミドｐＢＲ３２２にサブクローン化した。 これらの断片は、プラスミドｐＡｃＹ１８４のＥｃｏＲＩ領域の適当な制限酵素 消化物から調製され、　ＴＡＢ緩衝液（０，０４？Ｉ　トリス−酢酸。 ０．００２Ｍ　ＥＤＴＡ）を用いた１％アガロースゲルでの電気泳動により分離 され、電気溶出された。単離された断片を、前もって適当な制限酵素で切断し、 アルカリホスファターゼで処理しであるｐＢＲ３２２に結合した。ＨＳＶ−１の 全ゲノムの制限酵素切断地図を第１図に示し、サブクローン化された領域のより 詳細な地図を第２図に示す、第１図を参照すると、従来の地図が最初の２行で示 されている（Ｒｏｉｚｍａｎ、１９７９）　、点線はＬ−３連結部を示す、プロ トタイプのアイソマーの配列のＥｃｏＲＩ制限酵素切断地図を、ハツチングを施 した枠で囲むことにより示される違遼Ｒ１断片Ｆとともに第３行に示す（Ｓｋａ ｒｅおよび５ｕｒａｔａｅｒｓ。 １９７７；　Ｒｏｉｚ＋ａａｎ、１９７９）　、　ＨＳＶ−２のＢｉｎｄｌｌｒ 制限酵素切断地図を。 ハツチングを施した枠で囲んだＨｉｎｄＩ［［断片Ｈとともに第４行に示す（Ｒ ｏｉｚｍａｎ、１９７９）　、１地図単位は、ＨＳＶ−１のＤＮＡの９８．９メ ガダルトンまたは１４８．９ｋｂｐに相当し、ＨＳＶ−２のＤＮＡの１０５．６ メガダルトンまたは１６０．５ｋｂｐに相当する。 第２図を参照すると、詳細な地図ライン（Ｉ）に示された制限酵素切断部位は次 の通りである：　Ｅ、　ＥｃｏＲＩ　；　Ｂ、　影υＨ１，Ｓ。 ５ａｉｌ；　Ｐ、　ＰｓｔＩＨＸ、珈Ｉ　（ＤｅＬｕｃｃａらより、　１９８３ ）；　Ｎ、　Ｎｄｅｌ；Ｘｎ、　Ｘｍｎ１ＨＶ、　ＥｃｏＲＶ、　０．３５５の ＤｅＬｕｃｃａらによってマツピングむ３つのプラスミドのサブクローンを示す 。これらは、　０．３４５のシ但Ｈ１部位から０．３６０のシｔ１１部位までの 範囲のｐＨ５１０６；　０．３６のＳａｌ１部位から０．３８８の５ａｉｌ部位 までの範囲のｐＨ５１０７；および０．３４５から０．４０地図単位までの範囲 のＢａｍ旧断片である。ラインＩＩＩはｇＢｌのａ＋ＲＮＡをマツピングするた めに用いられる３つのプローブを示し；ライン■はハイブリッド選択のために用 いられる断片を示し：そして、ライン■はｇＢ２遺伝子の位置を決定するために 用いられるこれらのプローブを示す（以下を参照）。これらの断片を作製するた めに用いた追加の制限酵素切断部位は、　Ｎｃ、連速Ｉ；　Ｋ、　ｊｌ狙■；お よびＡ、　ＡｌｕＩである。 ＥｃｏＲＩ断片におけるｇＢ１コード領域の位置を決定するために、　ＨＳＶ− １が感染したベロ細胞から単離したポリＡ′″ｍＲＮＡのノザンブロッティング を、　ｐＨ５１０６およびｐＨ５１０７から単離された詳細な地図に示されたＤ ＮＡ断片をプローブとして行った。ｐＨ５１０６から単離された０、５ｋｂ力＋ ｔＩ−５ａｉｌ断片をＨＳＶ−１についてのプローブとして用いたとき、検出さ れた主な種類は３ｋｂのｍＲＮＡであった。均匹Ｉ−ジａｌＩ断片の約１ｋｂ上 流に位置する０、４９ｋｂＮｃｏｌ断片をプローブとして同様のプロッティング を行うと。 ｇＢｌの−ＲＮＡと推定される３ｋｂのｍＲＮＡとのハイブリダイズも検出され た。このことは、　ｇＢｌをコードする配列がＰｓｔＪ−Ｓａｌｌ断片の少なく ともｌｋｂ上流まで延長されていることを示唆する。３ｋｂのｍＲＮＡは、　Ｐ ｓｔｌ−５ａｉｌ断片から下流の最初のＸｈｏ１部位よりは延長されていない、 なぜならば、　０．５ｋｂ　ＸｈｏＩ−Ｘｈｏｌ断片がこのｍＲＮＡとハイブリ ダイズしないからである。　ｇＢ１転写単位の転写の方向は右から左（３゛←５ °）であり、このことば力＋ｔＩ−Ｓａｌ！および連速Ｉ−違冴■断片の５’− ３’の方向の鎖のみが３ｋｂ　ｇＢｌ　５ＲＮＡにハイブリダイズすることによ り証明される。 バイブリアＦ選択翻訳は、　ＨＳＶ−１ポリＡ”　ｍＲＮＡを３．２ｋｂ　匙即 Ｉ−ＸｈｏＩ断片（ｇＢ１コード領域として示される領域を含む）とハイブリダ イズさせることにより行った。結合した＋＊ＲＮＡを溶出し、インビトロで翻訳 させたとき、ＨＳＶ−１感染ベロ細胞由来のｇＢｌと同様の大きさの１００ｋｄ タンパクが検出された。この１００　ｋｄタンパクの同定の確認は、ｇＢｌ−特 異的モツクローナル抗体と免疫沈降することより行われた。七１ｌ−Ｘｈｏｌ断 片を用いたハイブリッド選択により、その他のいくつかのタンパクも検出された が、おそらくこれはＤＮＡのＧ＋Ｃ含有量が高いためにおこった＋ｍＲＮＡの非 特異的なハイブリダイズの結果である。ＨＳＶ−１１！タンパクｇＤをコードす る３、Ｏｋｂ　（７）ＳｓｔＩ　−５ｓｔｌＤＮＡ断片を用いて同じＲＮＡを選 択すると、同様のタンパクのパターンが観察されたが、　１００　ｋｄのｇＢタ ンパクは検出されなかった。この結果は、　ｇＢが石Ｉ−ＸｈｏＩ断片に特異的 であることを示唆する。 第３図は、　０．３４５地図単位の坦−旧制限酵素切断部位から０．３７３地図 単位のＸｈｏ　１部位までの、　３．９５ｋｂ　ＤＮＡ断片の制限酵素切断地図 を示す。ｇＢ１オーブンリーディングフレームは枠で囲んで示されており、転写 の方向は図示されているように右から左へである。実際のコード領域は５地図単 位０．３４８から０゜３６７までである。勿旧部位から３，６４０番目の唯一で はないＡｌｕ１部位までのＤＮＡ配列を示し、Ａｌｕ１部位は（Ａ）で示す。 図示されている制限酵素切断部位は＋　Ｂ＋　ＢａｍＨＩ　：　ＢＬ　Ｂａｌ　 ■；Ｂｓ、　ＢｓｔＥＩ［；に、」匹１　；Ｎｃ、　Ｎｃｏｌ　；Ｐ、　Ｐ旦１ 　；Ｐｖ、　Ｐｖｕｎ　；Ｓｒ　Ｓａｌ　Ｉ　；Ｓｃ、５ａｃＩ　；Ｘ、　Ｘｈ ｏＴ　；Ｘｍ、Ｘｍａ３を含む。右側に示すＡｌｕ　Ｉ部位から末端のＸｈｏ　 Ｔ部位までの制限酵素切断部位は示されていない、生産されたｇＢ１タンパクの グリコジル化の可能性があ部位および疎水性アンカーおよびシグナル領域（枠で 囲い塗りつぶした部分）が示されている。 Ｂａｍ旧部位からヌクレオチド残基の３．６４０番目の唯一ではないＡｌｕ　１ 部位までのＤＮＡ配列を、　ＳａｎｇｅｒのＭ１３ジデオキシヌクレオチド合成 法を用いて決定した。コード領域の両ＤＮＡ鎖を配列決定した。完全なりＮＡ配 列が、並べた制限酵素切断断片から集められ、このようにして該配列は該断片全 部を通して読み取られる。第４図はｇＢｌのＤＮＡ配列を示しく第３行）；ｇＢ ｌに対する予想アミノ酸配列は、ＤＮＡ配列の下に示す（第４行）。 第４図に示したｇＢｌに対応するアミノ酸配列およびＤＮＡ配列は１国際特許公 開第罰８５１０４５８７号（１９８５年１０月２４日公開）の表１に初めて示さ れた配列とは異なる。ということは注意すべきである。この表１の中のＤＮＡ配 列には誤りがあり、配列の６０７番目の位置にヌクレオチド（Ｇ）が付は加えら れている。第４回ではこのヌクレオチドは削除されており、この図は正しいＤＮ Ａ配列を示す。上記表１中のアミノ酸配列は、その中に示されている誤ったＤＮ Ａ配列から推定されたものであり；上記付は加えられたヌクレオチドによりリー ディングフレームが変わっているため、該表１に示された配列は正しくない。第 ４図は正しいＤＮＡ配列に基づいたアミノ酸配列を示し；第４回のアミノ酸配列 は、ｇＢｌのＮ−末端領域のアミノ酸配列決定により確認されている。この推定 アミノ酸配列における変化は、疎水性および親水性の領域の推定された位置。 およびｇＢ１分子内のグリコジル化部位に関する訂正も結果する。正しい配列に 基づいた推定アミノ酸配列を、該配列の下に示す。 ２２ｂｐのオリゴヌクレオチド（残基４７３−４９４）を用いたプライマー延長 は、ｇＢｌのｍＲＮＡの５゛末端が残基１８８に位置することを示した。ＣＡＴ およびＴＡＴＡ転写調節シグナルは、残基５５−６２および１２５−１３１であ ると推定される。残基４３８−４４０のＡＴＧから開始し、　ＴＧＡ停止コドン で終結する。　２７１２個のヌクレオチドのオープンリーディングフレームが存 在する。２つの推定されるポリアデニル化シグナルが、残基３１６６−３１７３ および３４０９−３４１６の３′側の非コード領域に位置している。 記述されたアミノ酸配列は膜タンパクの特徴を示す。カルボキシ末端近くのアミ ノ酸残７２６から７９５番目までの範囲の非常に疎水性の領域が存在し、６９個 のアミノ酸は膜に結合し得る。Ｎ−末端における最初の３０個のアミノ酸は主に 疎水性である。この疎水性アミノ酸ドメインは、荷電したアミノ酸または親水性 のアミノ酸が高度に集中した領域の前にある。 Ｎ−末端の親水性の配列は分泌リーダーまたはシグナル配列として働き、該配列 の次に分泌リーダーの切断および除去のためのプロセッシングシグナルがある。 Ｃ−末端近くの疎水性の領域は、タンパクを細胞膜に結合するためのトランスメ ンブレン・インテグレーション配列として作用できる。 配列のデータは親水性の外部ドメイン内のａｓｎ−χ−ｔｈｒ／ｓｅｒ配列（第 ３図も参照のこと）により定義されるような９個の可能性のあるＮ−結合型グリ コシル化部位が存在することも示唆する。もしも最初の３０個のアミノ酸がプロ セッシングにより除去され、可能性のある各Ｎ−結合型グリコシル化部位が部位 あたり平均２ｋｄの炭水化物を付加するのに利用されるならば、成熟タンパクの 分子量は約１２３ｋｄとなる。 ２．２　憂　６　におけるＢ１の　− 哺乳動物細胞でｇＢｌを発現させるために、並を欠＜　Ｃ）１０細胞にプラスミ ドｐＨ５１１２およびｐ）ＩＳ１１４を導入して形質転換させた。この形質転換 は、材料および方法に記述したようなカルシウム沈澱法を用いて行った。プラス ミドｐＨ５１１２およびｐＨ３１１４で形質転換したＥ、　ｃｏｌｉ　Ｈ８１０ １株は、　ＡＴＣＣに寄託されており、それぞれ受託番号３９６５０および３９ ６５１で受託されている。これらの株の構築は１国際特許公開第一０８５１０４ ５８７号（前出）に記載されている。形質転換された細胞は、チミジン。 プリンおよびグリシンを欠いた選択培地を用いて選択した。 細胞は、パスツールピペットで取り出すことにより単離し。 複数のウェルを持つプレートで増殖させた。多数のクローンが単離され、該クロ ーンは）ＩＳＶ−１ポリクロ一ナル抗体またはｇＢに特異的なモノクローナル抗 体を用いた免疫螢光および放射性免疫沈降によりｇＢを生産することが示された 。３個の細胞クローンｐ）ｌｓ１１２−１．　ｐＨ５１１２−９およびｐＨ５１ １２−２３が単離され。 該クローンは細胞内にある形の完全なｇＢ膜タンパク合成した。 これら細胞で生産されたｇＢは、グリコジル化されていると考えられる。なぜな らば、１時間パルス標識し、続いて５時間チェイスした後に、チェイスを行わな かった細胞に比べてより大きな分子量の形が検出され得、約１０％のｇＢが培地 中に分泌されたからである。不完全なｇＢを発現する５個の細胞クローン（ｐＨ ５１１４−５，ｐＨ５１１４−６，ｐＨ５１１４−７，ｐＨ５１１４−１１およ びｐｌ（Ｓ１１４−１２）も分析され、やはり培地中にいくらかのｇＢを分泌す ることが示された。これらの細胞系の１つであるｐＨ５１１４−７は、　ＭＴＸ でさらに増幅するために選択された。クローンは最初は０．０１゜０．０５．０ ．１０および０．３μＭ　ＭＴＸで選択された。免疫螢光分析で検出すると高レ ベルのｇＢを合成する３個のクローンが、０．３μＭ　ＭＴＸで選択されたもの から単離された。放射性免疫沈降により、これらのクローンｐＨ５１１４−０， ３μ？！−６，２３および２５は。 ２５５−メチオニンで１時間標識している間に、増幅しなかったクローンｐＲｓ １１４−７よりも２〜３倍多くのｇＢを合成する。パルスチェイス実験は、１時 間のパルスの間にこれらのクローンで合成されるｇＢの少なくとも８％が、５時 間で細胞外に分泌されることを示す。 発現は２発現ベクターｐＨ５１３７を用いても行われた。このベクターの地図を 第６図に示す。プラスミドｐＨ５１３７は、シグナル配列の切断後の長さが６９ ０個のアミノ酸である不完全なｇＢ１タンパクをコードする。 ｐＨ３１３７は、　ｐＦ１３１０８（２，１章で記述した）をＸｈｏ’Ｉおよび Ｂａｗｌ　Ｉで分解し、続いて、得られた３、５ｋｄＵｒ片を単離することによ り構築した。この断片の末端はクレノーで平滑末端とした。 この平滑末端とされたＸｈｏ　Ｉ　−Ｂａｍ旧断片をｐｖｕ　ｎで部分分解し、 ゲルで２０９８ｂｐのバンドとして移動したＤＮＡを該部分分解物から単離した 。単離されたＸｈｏ　Ｉ　−ＰＶＵ　ＩＴバンドを、前もってＳｍａ　１で分解 されているｐＳＶ７ｄに連結し、得られたＤＮＡをＥ、ｃｏｌｉを形質転換する のに用いた。得られた細菌クローンを、ｇＢ１インサートが適当な方向で挿入さ れているプラスミドについてスクリーニングした。 発現を得るために、　ｐＨ５１３７をプラスミドｐＡＤｄｈｆｒとともにｄｈｆ ｒ欠損ＣＨＯ細胞に導入して形質転換させた。得られたクローンはｇＢｌを生産 し１分泌した。このようなりローンの１つであるｐＨ５１３７−７−Ｂ−５０は 、１０ｄの完全培地を入れたＴ７５培養フラスコ中で、２４時間に１−３　Ｘ　 １０’細胞あたり６．９１　＋／−１，５３μｓ／ｌＲ１ｇＢ１ター１．を生産 した。 ３、稠ｊジ２と色旺 ｇＢ２遺伝子の単離、特徴付け、およびクローニングは９国際特許公開第ＷＯ３ ５１０４８５７号（前出）に記載されている。 ３．１狙上皇囮惣−でｐ」 Ｈ５Ｖ−２糖タンパクｇＢの発現は、　ｐＨ５２１ｏ単独で形質転換するか、ま たはｐＨ５２１０とともに同時形質転換することにより、　ＣＯＳ細胞（一時的 な発現）行われる。この２番目のプラスミドは肋を含む。 プラスミドｐｌ（Ｓ２１０は以下のようにして構築した；全ｇＢ２遺伝子を３． ８ｋｂ　Ｎｒｕ　Ｉ−Ｂａｍ旧断片としてｐＢＲ３２２にサブクローン化し、　 ｐＨ５２０８を作製した。第７図を参照のこと。遺伝子の５′１．９ｋｂの則工 ｄＩ［［からハラ■までの断片を、ｐｓＶ１／此旦を積重ｄＩ［Ｉおよび４ｍで 分解することにより得られるｐｓＶｌに挿入した。 第７図を参照のこと；　ｐｓＶ１／　ｄｈｆｒは、　ＰＣＴ国際特許公開第ＷＯ ３５１０４５８７号に記載されている。このクローニング工程のために、　ｐＨ ５２０８をＰｖｕ　ＩＩで切断し、末端を平滑末端に修復した。 次いで、この分子を形ユｄＩ［で切断し、　１．９ｋｂ形ｎｄ！［［−（ハ１１ １）断片をゲル電気泳動により単離した。同様にｐｓＶ１／ｄｈｆｒをシＬＬＩ Ｉで切断し、平滑末端に修復し、　ＨｉｎｄＩ［ｒで切断し、ゲル電気泳動ニヨ リ４．８５ｋｂ　Ｈ江ｄｌｌ［−（ＩＩＩ）ベクター断片を単離した。 これら２つの断片（１，９ｋｂおよび４．８５ｋｂ）を９発現ベクターであるｐ Ｈ５２１０（第７図）を作製するために連結した。 プラスミドｐＨ５２１０は、直接にＣＯ３細胞を形質転換するのに用いた；発現 は、１次抗体スクリーニング用として、　ｇＢ特異的モノクローナル抗体である Ｆ３ＡＢおよび市販のポリクローナル抗体であるＨＳシー２抗体（ＤＡＫＯ）も 用いた。免疫螢光分析により検出された。ｇＢ２の培地への分泌は、ｇＢ２−特 異的ＥＬＩＳＡ分析により検出された。この目的のために、プレートをモノクロ ーナル抗体でコートした。細胞培養培地試料をコートしたプレートに添加し２次 いで結合したｇＢ２を、ウサギ抗ＨＳシー２ポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ）に 続いて西洋ワサビ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧを用いて検出した。 ＣＨＯ細胞形質転換のためのプラスミドｐＨ５２１０は、同時形質ｋｌプロトコ ルでは９選択マーカとして他を含む第２のプラスミドとともに用いられた（第７ 図）。選択培地で続いて形質転換および増殖させることにより、約１００個の並 紅゛クローンが単離され、　ＥＬＩＳＡ分析（ＥＬＩＳＡプレートはＦ３ＡＢ特 異的モノクローナル抗体でコートされている）を用いてｇＢ２の合成および分泌 についてスクリーニングされた。ｇＢ分泌のレベルが最も高いクローンｐＨ５２ １０＄１３−１は、さらにｇＢ２ポリペプチドの特徴について選択された。ｇＢ ２クンバクは　（：１Ｓｓ）−メチオニンで標識し、続いて放射性免疫沈降を行 うことにより検出された。１時間パルス後、　７９ｋｄおよび８４ｋｄのポリペ プチドに相当する２つの拡散したバンドが細胞内で検出された。 これらのタンパクは２６３７残基の不完全な遺伝子産物について推測された大き さよりも６８，９９１ダルトン大きく、該タンパクは部分的にグリコジル化され た前駆体に相当すると推測された。５時間チェイスした後、細胞内にｇＢ２は検 出されなかった。そして、　８９ｋｄのポリペプチドが培地中に検出された。 クローンｐＨ５２１０１１３−１の培地中に分泌された成熟型の大きさの完全な グリコジル化されたｇＢ２は、　ｐＨ５１１４−６により分泌された１００ｋｄ のｇＢｌよりもいくぶん小さかった。これは、ｇＢ１プラスミドに含まれる９４ アミノ酸に対応するコード配列が。 ｐＨ５２１０から除去されたためである。 （以下余白） ４、鵜多−乙バノーＪ： ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＴ部位にクローン化したパラトン株のＨＳシー１のＥｃ ｏＲＩ断片のライブラリーは、叶、Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｈｙｍａｎ、　Ｈｅｒｓｈ ｅｙＭｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｈｅｒｓｈｅｙ、ＰＡにより作製された 。ｇＤ１遺伝子は、このライブラリーのクローンＨのＥｃｏＲＩ断片内の２．９ ｋｂ　ＳｉにＩ断片中に完全に含まれている。１５ｋｂ　ＥｃｏＲＩ挿入物を含 むクローンＨはＤｒ、Ｈｙｍａｎから得た。この２．９ｋｂ断片をゲル電気泳動 で精製し９次にＨｉｎｄＩ［［とＮｃｏ　Ｉとで完全分解した。７４ｂｐの５゛ 非翻訳配列とアミノ末端２０アミノ酸をコードする６０ｂｐとからなるｇＤ遺伝 子の５”末端を１３４ｂｐの断片としてゲルから単離した。 ｇＤ遺伝子の３′末端は、　ｐＨ５１１４（国際公開Ｎｏ、　ＷＯ３５１０４５ ８７（前出）を参照されたい）を、　Ｎｃｏｌと５ａｌＩとで分解し、　８７３ ｂｐ断片を単離することにより得られた。これらの２断片（５′末端および３゛ 末端）をあらかじめＨｉｎｄＩ［［および５ａｌＩで分解したプラスミドｐＵｃ １２と連結した。ｐＵｃ１２ベクターは、　ＰｈａｒｍａｓｉａおよびＰ−Ｌ　 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから市販されており、得られたプラスミドはｐＨ５１ ３１と名付けた。プラスミドｐＨ５１３１をＨｉｎｄＩＩ［で分解し。 ５゛側の４塩基対の突出部をタレノーポリメラーゼで充填し。 次に５ａｌｌで分解した。ｇＤ遺伝子を含む１００７ｂｐ断片をゲル単離し、そ してあらかじめＳｍａ　Ｉおよび５ａ１１で切断したプラスミドｐＳＶ７ｄに連 結した。このプラスミドｐＳＶ７ｄについては以下に述べる。得られた発現ベク ターはｐＨ５１３２と名付ける。その誘導は第８図に概略を示す。 このプラスミドは、完全なタンパクの合計３９９個のアミノ酸のうちの２５個の アミノ酸のシグナル配列を含むｇＤ１タンパクの３１５個のアミノ酸をコードす る。このタンパクはカルボキシル末端で切断されており、疎水性の膜アンカード メインと細胞質ドメインとを含む８４アミノ酸を欠いており、得られたタンパク は培地に分泌される。 プラスミドｐＳＶ７ｄを以下のように構築した：　ＳＶ４０の複製起点と初期プ ロモーターを含む４００ｂｐのＢａｍ旧／ＨｉｎｄＩ［［断片を、　ＳＶｇｔＩ （Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｒ，ら、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、（１９８１ ）上：８５４−８６４）から切り出し、そして精製した。ＳＶ４０のポリＡ付加 部位を含む２４０ｂｐのＳＶ４０　Ｂｃｌｌ／Ｂａ！ｇ旧断片を、　ｐＳＶ２／ ｄｈｆｒ　（Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、（１ ９８１）上：８５４−８６４）から切り出し、そして精製した。これらの断片を 下のリンカー：５゛−八ＧＣＴＡＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＧＴＣＴＡＧＡＴＡＡＧ ＴＡＡＴ−３′ＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＣＣＡＧＡＴＣＴＡＴＴＣＡＴＴＡＣＴＡ ＧＭｉｎｄｆｕｌ　ｆｉｒ、ＬＩＥ　Ｓｍａｌ珈　Ｂｃｌｌ突出部により融合さ せた。このリンカ−は３つの全ての読み取り枠での停止コドンと共に５つの制限 部位を含む。得られた６７０ｂｐ断片（ＳＶ４０の複製起点、　ＳＶ４０の初期 プロモーター、停止コドンを有するポリリンカー、およびＳＶ４０のポリアデニ ル化部位を含む）を約１．５ｋｂが欠失したｐＢＲ３２２誘導体（Ｌｕｓｋｙお よびＢｏｔｃｈａｎ、Ｃｅ旦（１９８４）３６：３９１）であるｐｌＩＬのＢａ ｍ旧部位にクローン化し、　ｐＳＶ６を得た。ｐｓｖ６のｐ肚配列内のＥｃｏＲ Ｉおよびし但Ｒν部位を、　ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶで分解することにより 除去した後。 各末端の約２００ｂｐを除去するために、　Ｂａ１３１ヌクレアーゼで処理し、 最後に再連結してｐＳＶ７ａを得た。町σ３１切除により。 は遼ＲＶ部位から約２００ｂｐ離れたＳＶ４０領域に隣接する１つのＢａｍ旧制 限部位を除去した。ＳＶ４０領域に隣接する第２の担旧部位を除去するために、 　ｐＳＶ７ａをＮｒｕｌで分解した。この酵素はｐＭＬ配列を複製起点の上流で 切断する。これを平滑末端連結により再環化させ、　ｐＳＶ７ｂを得た。 ｐＳＶ７ｃおよびｐＳシフｄは連続したポリリンカー置換物を意味する。まず、 　ｐＳＶ７ｂを５ｔｕｌおよびＸｂａＩで分解した。次に、以下のリンカ−をベ クターに連結させ、　ｐＳＶ７ｃを得た：ＢＥｉＩＩシ改Ｒ１シ暖Ｉｊｌ副Ｉ珈 Ｉ５’　−ＡＧＡＴＣＴＣＧＡＡＴＴＣＣＣＣＧＧＧＧＧＴＡＣＣＴＴＣＴＡＧ ＡＧＣＴＴＡＡＧＧＧＧＣＣＣＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＣ（以下余白） その後、ｐＳｖ７ｃをシｄＩｒおよびＸｂａ　Ｉで分解し、以下のリンカ−と連 結させ、　ｐＳＶ７ｄを得たニ ジｄＪＩシ遼ＲＩ　違υＩ珈１　町狸Ｈ１Σ１工Ｉ５’　−ＧＡＴＣＴＣＧＡＡ ＴＴＣＣＣＣＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＡＧＣＴＴＡＡＧＧ ＧＧＣＣＣＡＧＡＴＣＴＣＣ丁ＡＧＧＣＡＣＧＴＧＡＴＣ４，２Ｄｌの啼　類　 での プラスミドｐＨ５１３２のｇ０１発現は多くの実験で示されている。 第１に、前述の方法を用い、かつ検出に市販の対ＨＳシー１ウサギ血清（ＤＡＫ Ｏ）を用いて感染させた後、特異的免疫螢光が。 ＣＯＳ　７細胞で観察された。第２に、　ｇＤｌを分泌する安定なＣＩＯ細胞系 が確立された。発現レベルはＥＬＩＳＡで分析され、パルス標識し、チェイスし た細胞溶解物と培地との放射免疫沈降により確認された。第３に、　ｇＤｌがＣ ＨＯ細胞系Ｄ６４のローラーボトル培養の培地から、硫安沈澱、免疫アフィニテ ィークロマトグラフィー、および限外濾過という一連の工程により精製された。 アフィニティークロマトグラフィーには、　Ｒｅｃｔｏｒら（１９８２）　（前 出）に記載のｇロモノクローナル抗体８Ｄ２を臭化シアン活性化セファロース４ Ｂに結合させたものを用いた。 Ｈ５Ｖ−２の３３３株のＨ４ｎｄｌｌＩ　Ｌ断片は１文献（Ｍｕｄ　ｌｅｒら、 ｆ（１９８３）　１２４：８６−９９）に示されているように、叶、Ｒ４ｃｈａ ｒｄ　ＨｙｍａｎによりｐＢＲ３２２にクローン化された。糖タンパクｇＤ２の 遺伝子は、　Ｒｕｙｅｃｈａｎら、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、（１９７０）２９：６７ ７−６９７により、０．９０〜０．９４５地図単位間のウィルスの短い特異領域 に地図化されている。ＢｉｎｄＩＩ　Ｌ断片の占める領域は、　Ｒｏｉｚｍａｎ 、Ｂ、、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ。 むμ匹（１９７９）　１３：２５−２７のゲノム地図に示されている。ｇＤ２遺 伝子のＤＮＡ配列が、　Ｉｄａｔｓｏｎ、　Ｇｅｎｅ（１９８３）２６：３０７ −３１２により報告されている。 ｐＢＲ３２２にクローン化されたＨ４ｎｄｌｌｌ　Ｌ断片を、叶、　Ｒｉｃｈａ ｒｄＨｙｍａｎから入手し、第９口角に示す制限地図を決定した。　ｇＩ］２の 遺伝子は、　ｇＤｌをコードする２、９ｋｂ　５ａｃＴ断片をプローブとしてＨ ｉｎｄｎＩ　Ｌ断片の制限酵素分解物をサザンプロットすることにより、　２． ４ｋｂ　Ｘｈｏｌ断片上に存在することが見いだされた。 ＸｈｏＩ断片の地図とｇＤ２遺伝子の位置とを第９図Ｂに示す。この２．４ｋｂ 　Ｘｈｏｌ断片を珈１部位を含むｐ　Ｂ　Ｒ３２２ｍ　導体ベクターにクローン 化し、プラスミドｐＨ５２０４を得た。３つの異なるｇＤ２発現ベクター、プラ スミドｐＨ５２１１，ｐＨ５２１２，およびｐｉ（Ｓ２１３を次のように構築し 、模式図を第１０図に示した。プラスミドｐＨ３２１１はシグナル配列を含むｇ Ｄ２の初めの３０５個のアミノ酸をコードする。その構築には、　ｐＨ５２０４ をジ咀■および坦狸旧で切断し、２つの制限断片をゲルから単離した：５゛非翻 訳配列の８２ｂｐを含む該遺伝子の５°末端を含む２５０ｂｐ　５ｒａａｌ断片 、および該遺伝子の内部を含む３″隣接の７４６ｂｐのＳａ＋ａ　Ｉ　−Ｂａｍ ［断片。 哺乳類細胞発現ベクターｐＳＶ７ｄ　（第４．２節に記載）をＥｃｏＲＩで切断 し、５°の４ｂｐの突出部分をタレノーポリメラーゼで平滑末端にし１次いでＢ ａｍＨＩで切断した。ｐＨ５２０４の２断片を分解されたｐＳＶ７ｄに連結し、 そして細菌の形質転換体からＳｍａ　Ｉ断片が正しい方向に入っているものを選 択し、ベクターｐＨ５２１１を得た。 ｇＤ２の３５２個のアミノ酸およびｐＨ５２１１に存在する遺伝子を越える付加 的な４７個の残基をコードするプラスミドｐＨ５２１２を。 ｐＨ５２０４のＨａｅ　ＩＩでの分解、そしてタレノーポリメラーゼでの末端平 滑化、および石旧での分解により構築した。（Ｈａｅ　Ｕ　）（括弧は末端が充 填されていることを表わす）からＢａｍＨまでの１４１ｂｐの断片をゲル単離し た。プラスミドｐＨ５２１１をＥ、ｃｏｌｉＧＭ２７２株に導入し、プラスミド ＤＮＡを調製し、それを次にＢｃｌｒで分解後、クレノーポリメラーゼで平滑化 し、そしてＢａｍＨで分解した。大きいベクター断片（約３．４ｋｂ）をゲル単 離し。 １４１ｂｐ（ＨａｅＩＩ）−Ｂａｍ旧断片に連結し、プラスミドｐＨ５２１２を 得た。ｇＤ２配列とプラスミドベクター配列の１該遺伝子の３゛末端側での融合 により、　ｇＤ２遺伝子の３１末端側にナンセンスＤＮＡの２７コドンが付加さ れる。これらのナンセンス配列を除去するために、プラスミドｐＨ５２１３を、 　ｐＨ５２１１の５ａｌｌでの部分分解。 １ケ所切断されたプラスミドのゲル単離１次いでタレノーポリメラーゼでの平滑 化およびＢａｍＨでの分解、により構築した。ｐ）ＩＳ２０４の（地組■）から 影馴旧の１４１ｂｐ断片を、線状化したｐＨ３２１１に連結し、プラスミドｐＨ ５２１３を得た。 ５．２　におしるＤ２の 哺乳類細胞におけるｇＤ２の発現は、　ｐＨ５２１１，ｐＨ５２１２およびｐＨ ５２１３でＣＯＳ　７細胞にトランスフェクトすることにより、一過性め発現に ついてまず分析した。ｇＤ２の発現は、免疫螢光。 およびＣＯ５７が培養された培地の捕捉ＥＬＩＳＡ分析、の両方法により、免疫 螢光に対してはウサギ抗）ＩＳＶ−２抗体を用いて。 そしてＥＬＩＳＡにおける捕捉抗体については、　ｇＤ型の共通抗体である８Ｄ ２　（Ｒｅｃ　ｔｏｒら（１９８２）前出）を用いて検出した。 次に、Ａｄ　ｄｈｆｒを有するプラスミドｐＨ５２１１またはｐＨ５２１３でト ランスフェクトし、仙獲得について選択し、　ｇＤ２の発現についてＥＬＩＳＡ 分析でスクリーニングすることにより、永久ＣＨＯ細胞系を確立した。 の主要好気プロモーター（Ａｄ−ＮＬＰ、地図単位１６〜１７．３）を５′末端 でマウスｄｈｆｒ　ｃＤＮＡに融合させることにより構築した。 ＳＶ４０小を抗原に対するイントロンとＳＶ４０初期領域ポリアデニル化部位と をコードするＤＮＡを、　５ｏｕｔｈｅｒｎおよびＢｅｒｇ、　Ｊ、Ｍｏｌ。 ｌ四ニーＧｅｎｅｔ、　（１９８２）工：３２７−３４１に記載されているｐＳ Ｖ２−ｎｅｏより得て＋　ｄｈｆｒ　ｃＤＮＡの３”末端に融合させた。これら ３つの断片をｐＢＩ’１３２２にサブクローン化し、プラスミドＡｄ−ｄｈｆｒ を得た。 このプラスミドは、　Ｋａｕｈ＋ｎａｎおよび５ｈａｒｐ、Ｍｏ１ｅｃ、　ａｎ ｄ　Ｃｅ１ｌ影且１．、（１９８２）　２：１３０４−１３１９に記載されてい る装置プラスミドと機能的には同様である。 ６、８−Ｄワクチンを　しまた汁５、・ｎ１６．１−゛感汎′に１　した　えＨ ＳＶ　タンパクワクチンが。 モルモ・トの　ヘルペス　声に　ぼ　六雌のハートレイモルモットの膣内に、第 １日日に５Ｘ１０’ｐｆｕ　ＨＳＶ−２ＭＳ株を接種した。これら動物を、アシ クロビール（５■／ｄ）を飲料水に加えることにより、第１〜１０日目において 処置した。アシクロビールは、−次怒染の症状を軽減し、従って２次的な細菌感 染の発生、および生殖器の傷の発生を減少させる。−次感染中におけるアシクロ ビールの使用は９モルモットに対する処置を停止した後の疾患の経過には影響が ないことが示されている（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、■ｍｌＪヱ、（１９８６）　 ６７：１６０１）、−次感染から回復した後、これら動物を。 ＨＳＶ−２全糖タンパク調製物（ｇＰ２）で免疫化し９組換えｇＢｌおよびｇＤ ｌの混合物（ＨＳＶ−１ｇＢ＋ｇＤ）で免疫化するか、あるいは処置しなかった 。処置グループを下に示している。 グ！二Ｚｕ　ユ支ＩＬ７ジユｌτント　１多−一一足４　ＮＩ　なし　なし　な し　なし　１１ １Ｉ　ＨＳＶ−１ｇＢ＋ｇＤ　２５ｕｇ＋２５μｇ　フロインＦ３￥　跳　１１ ｍ　ｇＰ２　５０μｇ　フロインＦ　足　跳　１１後方の足諺にワクチンを注射 することにより、第２１日日と。 さらに第４２日日に動物を免疫化した。組換えタンパクｇＢ１およびｇＤｌの両 方を、前述のように哺乳類細胞において生産した。結果は表１および第１１図に 報告する。 これらの結果は、再発性ヘルペス疾患のパターンが１群および■群について同じ であったことを示しており、それ故にこれらの群を分析用にプールした（対照、 　ｎ＝２０）。 表１および第１１図に示されている結果は１組換え糖タンパクによるワクチン接 種が疾患の再発頻度に対して顕著な影響を及ぼすことを示している。加えて、　 ｇＢ十ｇＤの組み合わせは天然の糖タンパクの混合物より優れている。 特定の時間内に起こる病害日数により測定した疾患の再発率は、再発エピソード の頻度と持続期間との両方を考慮する評価である。第１２図Ａは、ヘルペス疾患 が認められた週あたりの平均日数として表されている再発性ヘルペス疾患の感染 率を示している。免疫化したグループは、　ｇＢｇＤおよびｇＤ−２でワクチン 投与された動物の両方を含む。第１２図Ａに示されているように、疾患の再発率 （週あたりの病害日数）は、評価期間が最初の感染から遠ざかるにつれて、全て のグループで低下したが、低下率はワクチン投与した動物では大きかった。 対照動物と免疫化した動物との間における再発性ヘルペス疾患の感染率の差を第 １２図Ｂに示す。第１２図Ｂから明らかなように、糖タンパクによる免疫化が疾 患の再発率に及ぼす効果は、第１１図より推論されるように、２回目の投与後よ りもむしろ１回目の免疫化投与に続いて確立されているようであった。 （以下余白） ６．２　、ｉ感汎″に７　した　えＨＳＶ　タンパクワクチ怒染後の垢タンパク 投与が宿主の免疫応答に及ぼす効果は。 感染した動物によって生産される抗）ＩＳＶ抗体を、感染前と。 ＨＳＶ　糖タンパクワクチンで免疫化した後とに測定することにより、決定され た。 ６．１節で述べたように、これら動物にＨＳＶ−２ｍｓ株で接種し。 アシクロビールで処置し、そしてＨＳＶ　ｌｉタンパクワクチンで処置した。こ れら動物から血清を第４１日目と第９５日日に集めた。血清中の抗Ｈ５Ｖ抗体は ９本質的にはＰａｃｈｌ、　Ｃ，ら、Ｊｏｆ■烈旦［（１９８７）　６１：３１ ５−３２５に記載されているように、１．６節に述べた方法である。　ＥＬＩＳ Ａにより測定した。捕捉抗原にハ、　ＨＳＶ−１１ｉ　夕７ハ’）混合物（ｇＰ −１）　、　ＨＳＶ−１１１Ｍタフハク０＜ｇＤ−１）　、あるいはＨＳＶ−２ ｍタンパクＤ　（ｇＤ−２）が含まれティた。 ）１ｓＶ　ｌｉタンパクワクチン投与が抗Ｈ５Ｖ抗体の力価に及ぼす効果は、デ ータが幾何平均で表されている表２に示されている。抗体は、）ＩＳＶ接種前に 集めた血清中には検出されなかった。表２に見られるように、未処置の対照動物 では、抗）１ｓＶ抗体の力価は第９５日日よりも第４１日目の方が大きかった。 それとは対照的に、糖タンパクで処置した動物は、一般的に第９５日日までずっ と高い力価を示していた。またＨＳＶ　糖タンパクでワクチン接種すると、未処 置の対照に比べて抗ＨＳＶ抗体の力価が顕著に増加した（Ｐ＜、０５）。さらに 、　ｇＰ−２混合物での処置は、抗体の力価が１．４〜７倍上昇したが５組換え ＨＳＶ−１ｇＢｇＤワクチンでの処置は、対照値に比べて力価が９〜３１倍昇し た。このように、　ＨＳＶ　糖タンパクを動物に投与するこ特に組換えＨＳＶ　 糖タンパクｇＢｇ［ｌを投与することは、宿主の疫応答を増加させ、そして６． １節に示したように、再発性疾患の頻度および症状を軽減する。 （以下余白 ６．３　ＤＩ　Ａ″Ｈ５Ｖ　ンパクワクチンによ　沃）れた疫応答におけるアジ ュバントの≦１ いくつかのアジュバントを、Ｈ５Ｖ［タンパクワクチンによる免疫治療処置にお けるその影響を調べるために試験した。 試験を行なったアジュバントは、完全フロインドアシュパン）（ＣＦＡ）　、水 酸化アルミニウム、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグル タミニルーし一アラニンー２−（１’−２”−ジパルミトイル−５ｎ−グリセロ −３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ　−ＰＥと呼ばれ る）であった。 アジュバントの影響は、　ｇＤｌを含むワクチン（これはまた。 種々のアジュバントを含む）を投与した後の抗ｇＤ１抗体量を測定することによ り調べられた。ｇＤｌのみを含むワクチンは。 ｇＢｇＤを含むワクチンのモデルとして働く。なぜなら、アジュバントの影響は 、ワクチン中のＨ５Ｖ　糖タンパクの型に特異的であるようには考えられないた めである。 以下の研究において、　ｇＤｌをｐＨ５１３２から合成し、４．２節に記載され ているように、単離した。雌のモルモットに、３５μｇのｇＤｌと種々のアジュ バント組成物とから成る混合物を３週間間隔で３回にわたり足跡から投与し免疫 化した。２回目の免疫化の１週間後、そして３回目の免疫化のＬ５．９および１ ３週間後に、動物から採血し、そして抗ｇｏ力価を、１．６節に述べたようにＥ ＬＩＳ＾により決定した。 次に示す結果により、試験したアジュバントのうちで最も有望なのはＭＴＰ−Ｐ Ｅであることが示唆される。なぜなら、　ＭＴＰ−ＰＥは実験動物中で高い抗ｇ Ｄ１力価を恒常的に生産するためである。力価についてはＣＦＡはどは長期間保 持されなかったが。 これらのレベルはＣＦＡについて見られたものと同等であった。 ６．３．Ｉ　ＣＦＡと　−　ヒアルミニラムとの　“動物を、　ｇＤｌとＣＦＡ または水酸化アルミニウムのいずれかとを含むワクチンで免疫化した。抗ｇＤ力 価におけるアジュバントの影響を表３に示す。表３ではデータを幾何平均で表し ている。表５に見られるように、最も効果的なアジュバントはＣＦＡであった。 最も長く持続し最も高い抗体力価は、　ＣＦＡワクチンで免疫化した群に見られ た。他のアジュバントの影響を、　ＣＦＡで得られた力価に比較した割合（パー セント）として示す。１０％水酸化アルミニウム＝、−＝Ｓ液をアジュバントと して用いることにより、最も低い抗ｇＤ１力価が得られた。 （以下余白） ６．３．２　け工ｎｏｒ　−ＭＤＩ−履３ｕｎｒｐ−ｐ＋炙ｕＬ校動物を、　ｇ Ｄｌと、　ＣＦＡ、　ｎｏｒ−ＭＤＰ、およびＭＴＰ−ＰＥのうちのいずれかと を含むワクチンで免疫化した。ＭＴＰ−ＰＥをリポソーム中にカプセル化し、そ してこの後者のアジュバントを、外因性のｇＤｌとともに、そして、リポソーム に取込まれたｇＤｌとともに、投与した。リポソームは２合成ホスファチジルコ リン、ホスファチジルセリンおよび？１ＴＰ−ＰＥ　（またはＭＴＰ−ＰＥおよ びｇＤｌ　）を、懸濁媒体（滅菌したＣａ”およびＭｇ”塩を含まない等張ダル ベツコ緩衝液、　ｐＨ７，２）中に１７５ニア５：１の割合加え。 ポルテックスにより撹拌することにより調製された。表４に見られるように、　 ＣＦＡを含むワクチンでの免疫化により最も高い抗ｇＤ１平均力価を得た。ｎｏ ｒ　−ＭＤＰで得られた力価は。 ＣＦＡで免疫化した群で得られた平均力価の４４から７４％の範囲であった。Ｍ ＴＰ−ＰＥおよび外因性ｇＤ１で得られた平均力価は。 ｎｏｒ　−ＭＤＰで得られたものよりもいくらか低く、ＣＦＡで得られたものの ３２から７２％の範囲であった。ＭＴＰ−ＰＥおよびリポソームでカプセル化さ れたｇＤｌで得られた力価が非常に低いのは、カプセル化された形のｇＤｌのレ ベルが非常に低いためであり得る。カプセル化されたｇＤｌの投与量は外因性の ｇＤｌの投与量の約７％のみであった。この低い投与量は、リポソーム中へのｇ Ｄｌの取込みが、非常に低い効率であることに起因するものであった。この非常 に低い取込みは、抗原のサイズにより引き起こされ得る。リポソームの他の処方 によれば。 抗原をさらによい効率で取込むことができた。 ６．３．Ｓ　ＭＴＰ−ＰＥ　Ａ−なる几　の　ゞ動物を、高油性デリバリ−系（ スクアレン／アルラセル）中のＭＴＰ−ＰＥで処方されたワクチン、および低油 性デリバリ−系中のＭＴＰ−ＰＥで処方されたワクチンを含むｇＤｌで免疫化し た。 油性層の低いＭＴＰ−ＰＥ処方物は、４％のスクアレンおよび０．００８％のＴ ｗｅｅｎ８０を含んでいた。これらのアジュバント処方物で得たｇＤ１抗体力価 を表５に示す。 表５に見られるように、　ＭＴＰ−ＰＥ処方物は、オイル−界面活性剤の割合の 低い処方物中の唯一の成分として用いたときでさえも、アジュバントとして効果 的であった。［それは、　ＲＩＢＩ中のＣ−３成分の効果的な代替物でもあった し、さらにＲＩＢＩと比較してもその効果は時間とともに増大した。３回目の採 血時に、　ＭＴＰ　−ＲＩＢＩで得られた力価はＲＩＢＩで得られたものの２倍 であった。］１１回の採血後、　？ＩＴＰ−ＰＥ低油性処方物は、高油性デリバ リ−システム（スクアレン／アルラセル）よりも高い力価を示した。 （以下余白） 表６ 几 ２　１３　ｎｏｎｅ” ３　１０　ｇＢｇＤ　ＣＦＡ　ＦＰ　１５．３５４　１２　ｇＢｇＤ　ＣＦＡ　 ＦＰ　２１．４２５　１０　ｇＢｇＤ”　ＣＦＡ　ＦＰ　２１．４２６　１１　 ｇＢｇＤ　ｎｏｎｅ　ＩＭ／ＳＣ２１，４２８１０ｇＢｇＤ　ｎｏｒ−Ｍ叶　Ｉ Ｍ／ＳＣ２１，４２９ｂ−一一一一 １０　１０　ｇＢｇＤ　ｎｏｎｅ　ＦＰ　２１．４２１２　１１　ｇＢｇＤ　ｎ ｏｒ−ＭＤＰ　ＦＰ　２１．４２１３　６　ｇＢｇＤ　ＣＦＡ　ＦＰ　８．２８ ａ、ウィルスの力価検定と無症候性の脱落を評価するために。 ２２〜１００日において膣の清拭を毎日行なった。 ｂ、９群は省いた。 Ｃ０第１日に最初にウィルスに接触させて感染させた後のワクチンの投与の日。 体重３５０〜４００　ｇの雌のハートレイモルモットに、第１日日に５．７　／ 　ｌｏｇ＋ｏｐｆｕの１（ＳＶ−２ＭＳ株を膣内に植菌した。膣内植菌２４時間 後に収集した膣からの清拭試料からＨ５Ｖを回収することにより、動物が感染し ていることを確めた。−次感染の医療経過を、　５ｔａｎｂｅｒｒｙら、　Ｊ　 Ｉｎｆｅｃ　Ｄｉｓ（１９８７）１５５　：　９１４で述べられているように、 生殖器の皮膚の病変により、追跡し。 定量化した。−次怒染より回復後、動物を表１０に示しであるような処理群に無 作為化した。象、性の疾病が消散後、１１日凹から１００日目までの間、疾病の 再発の徴候について、動物を毎日調べた。疾病臼は、再発した疾病が観察された 日として定義し９重症の再発は１個を越える数の水泡が認められた日であり、そ してエピソードは、病変のない日に続いて新しく疾病が発生することを示す。 第２２日から第７６日の間の動物の分析より得た結果を表７に示す。表９のデー タにより、■−注射において、　ｎｏｒ−ＭＤＰが効果的なアジュバントである ことが示唆される。これは、疾病全日数がより低いこと１重症の再発がより低率 であること。 および、ヘルペス性のエピソードの全数が減少することに反映される。さらに、 　ｎｏｖ−ＭＤＰを含むワクチンおよび投与されたＩＭは、　ＣＦＡを含みそし て足踵中に投与されたワクチンと同程度に効果的であると考えられる。 制 種々のアジュバントを含むワクチンの注射により生じる局所的な反応もまた。監 視した。その結果を表８に示す、注射部位での局所的な紅斑および硬変の発生率 は、　ｎｏｒ−Ｍ叶を含むワクチンについて同様であった。さらに２局所的な反 応生成性に基づき、　ｎｏｒ−ＭＤＰはワクチンにおける使用が可能であると考 えられる。 （以下余白） 表７の結果によっても、免疫治療の開始と急性の疾病の始まりとの間の間隔が減 少するにつれて、処置の相対的な効力が増強することが示される。最初の感染後 、　８．１５または２１日後にＣＦＡを含むｇＢｇＤワクチンの接種を受けた動 物のうち、膣内植菌後置も短時間のうちワクチンを受けた動物が、未処置のコン トロールに比較すると、疾病の期間が最も短く２重い再発の割合が最も低く、そ して、全エピソードが最も少なかった。感染１５日後に、ワクチンを接種した動 物について得た値は、８日後にワクチン接種した群について得たものよりも高く 、そして２１日後に接種した群は１５日後に接種した群よりも高かった。この効 果は第Ｉ３図にも示されている。第１３図は。 ）１ｓＶ−２植菌８，１５または２１日後に、最初にワクチン接種した動物につ いて、膣内に植菌した後の日々における再発数のグラフを示す。 第１３図のデータは、再発した疾病の割合の減少（％）を計算するために用いら れた（疾病の再発率の有意性についての説明は６．１節を参照されたい）。この データは表Ｈに示されている。表■では、最も早い期間（つまり１４〜５０日） において８日目に最初のワクチンを接種することにより、再発した疾病の割合（ パーセント）が最も大きく減少するのが観察され得る。しかし、　）ＩｓＶを膣 内に植菌した１５日後に最初のワクチン接種を行なうことにより、５１〜９２日 目から日日も効果的な保護が得られた。Ｈ５Ｖ−２に初めに接触させてから２１ 日後に最初のワクチン接種を行なったときに最も弱い保護効果が得られた。 モルモットにおいては、病気の急性な時期が、ウィルスの感染後１４〜２１日の 期間に起こるということを銘記すべきである。この急性な時期において、　Ｈ５ Ｖにより誘導された疾病力動物の身体に見い出される。従って２表１３のデータ により。 ５１〜９２日目にお日日最も効果的な保護が、感染の急性な時ルの期間でのワク チンの投与により得られたことが示される。 （以下余白） 表９ 糖タンパク処理後の再発率（１週間ごとの割合）本発明によれば、単純ヘルペス ウィルスの感染後に投与することにより、単純ヘルペスウィルス１型および２型 の治療処置に効果のあるワクチンが提供される。 上記発明は、その内容を明快に理解するために１例示し。 実施例を挙げることによりい（ぶん詳細に述べてきたが、添付の請求の範囲内に おいて、ある変更および修飾がなされ得ることは明らかである。 ３層目５速拍ｉピ藤Ｈ囲５ ：’ｉＡ８：　ｂｊ６ご１起　！璽ヨ ４　ＬｊＬ５（ｊＬ５　Ｌ５Ｌ５ｔｊＬ５３ＭＷＥ　ｔＸ’ｊ’Ｊｔ：　５ｕ置 　５Ｕ　ｊ　ＥＬ藁讐ミ　士ＢＢｋ　’；：と；　ミ冒鵞ミ←←ト）４　ｈ４４ ＃４　＞ｕｔＪ＞　ｅ−ｑｈｈｅ−４３目！　３　ＥＦｊ、Ｆ４　、ｗ　ｅ　％ 　；　ｉ　Ｈ囲ｕｅ■二Ｎ目と針蒔綽５９ １淋ｉ朋眠篩拍９Ｈξ ：甚拍　５’４ＥＪ　易、、、＞Ｍ６Ｅ５　’ｌ：’ｌ：、ｚ　ｊｊ；ｇｊ　： 肝（Ｑ−ＥＥｌ１４：　’４’４：　；’５！、；　＝ａ：；、＝　ｊ；８ｊ： ；ツ七と１　才璽鵞才　、Ｊ３Ｂ、−：　ｉ！８じよ、−＋　ｒ＋　ｄ　ｒ−（ ｒＪ ｅ淋こ８５酷膏と基旧柱Ｈ ｏｕｕご　巳′ｔ３ご已　Ｆ　ｕｕＨｗｕｕｓｃ　ｖ　Ｖ３８＜　ａ、ｕｕａ、 　ＬＱ）４）４゜＜１：　ＣＬＥＥＱ。 シ８二；旧七　；８８を北寥々冊々 鴫ｕｕ＜　＞　ａ＞　ｔ／’ｔ）ｑｔ−４Ｆ　＜ｕａ＜　ｕｕａｔ＊＋４＜ｗ　 ＜Ｕ（ｊ＜　＜（ｊ（ｊ＜　＋＜鴫←τＦＥ；　；ドと；　之８８上　１８８二 に４４Ｋ　＞（ｊＬｊ＞　←＜　＜　ｈ　＜　Ｌ５　Ｃ３にとＥ；　往Ｃ３二ｕ 　４４　狂言 ＞（ｊｔｊ＞　Ｊ ＾　−α ｋ　工　。 ○ 宝　達　蛎　杏　鮒　失

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）感染の治療的処置に用いられるワクチンで あって，次のａおよびｂを含むワクチン：ａ．免疫的に活性な単純ヘルペスウィ ルス糖タンパクＢ（ｇＢ）ポリペプチド；および ｂ．免疫的に活性な単純ヘルペスウィルス糖タンパクＤ（ｇＤ）ポリペプチド； 該ポリペプチドは，哺乳類細胞内で組換えＤＮＡ構築物を発現させることにより 調製され，そして，該ワクチンをＨＳＶ−次感染後に個体に投与すると，ＨＳＶ で感染した個体の再発性ＨＳＶ誘導疾病を阻止するのに有効な量で該ポリペプチ ドが存在する。
2. ２．単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）感染の治療的処置に用いられるワクチンで あって，次のａおよびｂを含むワクチン：ａ．免疫的に活性な単純ヘルペスウィ ルス糖タンパクＢ（ｇＢ）ポリペプチド；または ｂ．免疫的に活性な単純ヘルペスウィルス糖タンパクＤ（ｇＤ）ポリペプチド； 核ポリペプチドは，哺乳類細胞内で組換えＤＮＡ構築物を発現させることにより 調製され，そして，該ワクチンをＨＳＶ−次感染後に個体に投与すると，ＨＳＶ で感染した個体の再発性ＨＳＶ誘導疾病を阻止するのに有効な量で該ポリペプチ ドが存在する。
3. ３．前記ｇＢが１型または２型であり，そして前記ｇＤがＩ型または２型である 請求の範囲第１項または第２項に記載のワクチン。
4. ４．前記ワクチンがＨＳＶ感染の急性期に個体に投与された場合に，前記ポリペ プチドが再発性ＨＳＶ誘導疾病を阻止するのに有効な量で存在する，請求の範囲 第１項または第２項に記載のワクチン。
5. ５．前記ワクチンが薬理学的に受容され得るキャリアーを含む請求の範囲第１項 または第２項に記載のワクチン。
6. ６．ＨＳＶに感染した前記個体がヒトである請求の範囲第１項または第２項に記 載のワクチン。
7. ７．前記ワクチンがアジュバントを含む請求の範囲第１項または第２項に記載の ワクチン。
8. ８．前記アジュバントがＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタ ミニル−Ｌ−アラニン−２−（１′−２′−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ− ３−ヒドロキシホスホロリルオキシ−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）である請求 の範囲第７項に記載のワクチン。
9. ９．前記ＭＴＰ−ＰＥが低油性処方物中に存在する請求の範囲第８項に記載のワ クチン。