DK175461B1

DK175461B1 - Ekspression af HIV-proteiner i Drosophila-celler

Info

Publication number: DK175461B1
Application number: DK104991A
Authority: DK
Inventors: Martin Rosenberg; Hanne Ranch Johansen
Original assignee: Smithkline Beecham Corp
Priority date: 1988-12-01
Filing date: 1991-05-31
Publication date: 2004-11-01
Also published as: FI113475B; WO1990006358A1; IL92470A0; JPH04501954A; KR910700344A; DK104991A; DK104991D0; NO912099D0; AU630649B2; NO912099L; AU4755290A; CA2003794A1; FI912635A0; JP3085704B2; KR0152525B1; ZA899150B; EP0446272A1; CA2003794C; EP0446272A4; PT92477A

Description

DK 175461 B1

Den foreliggende opfindelse angår generelt ekspression af HIV-proteiner i Drosophila-celler.

Den foreliggende opfindelse angår nærmere bestemt fremstilling af hidtil ukendte mu-5 tante gpl60 og gpl20 genprodukter ved hjælp af dette ekspressionssystem.

Human immundefektvirus type 1 (HIV-1) er det ætiologiske middel ved erhvervet im-mundefektsyndrom, der også kendes som AIDS. Denne retrovirus har en kompleks genetisk organisering, indbefattende de lange terminale gentagelser (LTRer), gag, pol og 10 env gener samt andre gener. Denne retrovirus bærer en række virale antigener, som er potentielle kandidater enten alene eller sammen som vaccinemidler i stand til at inducere et beskyttende immunrespons.

Blandt de mere lovende af HIV-1 antigenerne er det virale kappegiycoprotein (gpl60) 15 eller specifikke fragmenter deraf, env genet koder for 160 kilodalton (kd) precursor-glycoprotein af den virale kappe. gpl60 kløves posttranslationalt til et 120 kd glycoprotein (gpl20) og et 41 kd glycoprotein (gp41), som er til stede på virusoverfladen.

gpl20, et 511 aminosyreglycoprotein, er lokaliseret på de aminoterminale to tredjedele 20 af gpl60 glycoproteinet og lægges åbent på virussens yderside. gpl20 er afgørende for interaktion eller vekselvirkning mellem virussen og dens cellulære receptor, CD4-pro-teinet, som er til stede på overfladen af hjælper T4 lymfocytter, makrofager og andre celler i immunsystemet. gpl20 bestemmer således den virale infektions vævsselektivitet og bidrager til cytopatogeniciteten af HIV gennem dets engagement i syncytiadan-25 nelse.

gp41, et 345 aminosyreprotein afledt fra carboxylterminus af gpl60, er et integralmem-branprotein af HIV-1. gp41 indeholder en serie af hydrofobe aminosyrer, som forankrer proteinet i det lipide dobbeltlag af den cellulære plasmamembran. Carboxylenden af 30 gp41 menes at rage frem ind i viruspartiklen. gp41 eller en del deraf menes at være ansvarlig for sammenslutning af HIV-glycoproteineme, som udtrykkes på cellens over-

I DK 175461 B1 I

I 2 I

I flade, med celler, som udviser overflade T4-receptorer. Den del af gp41, som menes at I

I være ansvarlig for denne sammenslutning, er lokaliseret nær aminoterminalen. En så- I

I dan sammenslutning menes at spille en rolle i viral replikation. Se f.eks. M. Kowalski I

I et al., Science, 237; 1351-55 (1987); D.M. Knight et al., Science, 236: 837-36 (1987). I

I 5 I

I Disse virale glycoproteiner antager en tertiær struktur som virale spidser, der rager I

I frem fra viruspartiklens overflade. Ca. 70 til 80 spidser menes at være forbundet med I

I hver ny syntetiseret viruspartikel. Efterhånden som viruspartiklen ældes, forsvinder I

I spidserne, tilsyneladende fordi sammenknytningen mellem gpl20 og gp41 er svag. For I

I 10 nysyntetiserede viruspartikler menes denne virale glycoproteinspids således at være det I

I mest umiddelbare mål tilgængelig for immunsystemet efter infektion. I

I Virusneutraliserende antistoffer er blevet rapporteret rettet mod gpl20 og gp41 epito- I

I per. Det er specifikt blevet bemærket, at et målsted for typespecifikke neutraliserende I

I 15 antistoffer er lokaliseret i 3’-halvdelen af gpl20 glycoproteinmolekylet. I

I env genet af HIV-1 har således været målet for omfattende, nylig efterforskning. Eks- I

I pression af glycosyleret gpl 60 er tidligere blevet opnået i pattedyrsceJler og visse bacu- I

I lovirusinsektceller hos grupper, som også har rapporteret om fremkaldelse af både hu- I

I 20 morale og cellulære immunresponser på disse antigener, gpl20 er blevet udtrykt re- I

I kombineret ved anvendelse af heterologe promotorer i adskillige systemer. Se f.eks. S. I

I Chakrabarti et al., Nature (London), 320: 535 (1986); S. I. Hu et al., Nature (London), I

I 320: 537 (1986); og Μ. P. Kieny et al., Biotechnology, 4: 790 (1986). I

I 25 L. A. Lasky et al., Science, 233: 209-212 (1986) konstruerede en række plasmider in- I

I deholdende mutante env gener til transfektion i pattedyrsceller, specielt kinesisk ham- I

I sterovarie (CHO)-celler. Disse forskere udskilte et genprodukt kodet i et plasmid inde- I

I holdende de første 50 aminosyrer af glycoprotein D (gD) protein som i fase var forbun- I

I det til en aminosyresekvens (nr. 61-531) af env proteinet, et HBsAg polyA signal; et I

I 30 DHFR gen og SV40 origin for replikation. Et rekombineret kappeantigen blev fremstil- I

I let indeholdende 25 aminosyrer af gD ved dets aminoterminus og manglende 30 rester I

DK 175461 B1 3 fra den fuldt udviklede oparbejdede form af gpl20, og også omfattende en deletion af gp41 sekvensen (ca. 20 aminosyrer af carboxylterminus til det aktuelle 160 kd precur-sorprocessted). Det resulterende gen havde en længde på 520 aminosyrer. Ved trans- j

fektion ind i CHO- celler indeholdt de cellekonditionerede supematanter 130 kd prote- J

5 in, der betegnes gpl 30.

I en senere rapport diskuterer L. A. Lasky et al., Cell, 50: 975-986 (1987) interaktion eller vekselvirkning mellem gpl20 glycoproteinet og dets cellulære receptor, CD4. Ved at deletere 12 aminosyrer indeholdt i aminosyrer nr. 410-421 af gpl20 resulterede et 10 fuldstændigt bindingstab. En enkelt aminosyresubstitution ved stilling 417 resulterede ligeledes i formindsket binding.

Kowalski et al., som citeret ovenfor, indførte deletions- og insertions-mutationer i et plasmid, som koder for kappeglycoprotein afledt fra HTLV-niB-stammen af HIV-1.

15 Plasmidet indeholdt også art genet. CD4+ og CD4- pattedyrscellelinier, som udtrykker tat genproduktet, blev anvendt som transfektionsmodtagere til undersøgelse af de trans-ficerede cellers sammenslutningsevne.

Knight et al., som citeret ovenfor, beskriver ekspression af art/trs transaktivatorprotein 20 af HIV i pattedyrsceller. Den pattedyrscellelinie, der blev anvendt til ekspression af disse HlV-protioner, var COS-7 abecellelinie. Disse plasmider anvendte HIV LTR som en promotor og RNA-processsignaler fra SV40 til at udtrykke den indsatte DNA som funktionel messenger RNA. For at udtrykke gpl20 blev et plasmid pENV160 udviklet, som indeholder hele den kodende region af det env gen, som var sammensluttet til HIV 25 LTR.

S. W. Pyle, Aids Research and Human Retroviruses, 3(4): 387 (1987) beskriver oprensning af gpl20 glycoprotein fra dyrkningsvæsker af HIV-inficerede H9-cel!er ved im-munoaffmitetskromatografi.

30

DK 175461 B1 I

I US patentskrift nr. 4.725.669 beskrives også glycoproteiner på ca. 160 kd og 120 kd I

opnået fra human H9/HTLV-III cellelinie, som hver havde en uglycosyleret enhed på I

ca. 90 kd. I

.5 Fox, Biotechnology, 6: 116 (1988) rapporterer VAXSYN HIV-1 vaccine udviklet af I

MicroGeneSys. I rapporten beskrives ingen detaljer vedrørende denne vaccine. I

D. L. Lynn et al. beskriver i "Mechanisms of Control of Gene Expression", udgivet af I

Allan R. Liss Inc., side 359-368 (1988) kloning af hele gpl60 genet bag ved polyhe- I

10 dronpromotoren af baculovirus Autographacalifomica. Disse insektceller, som er infi- I

ceret med den rekombinante virus, udtrykker et protein, som frigives fra cellen ved ly- I

se. Dette protein comigrerer med gpl60, spaltes ikke til gpl20 og gp41 og glycosyleres I

og forbindes med cellemembranen. Efter deglycosylering med N-glycanase havde pro- I

teinet en molekylvægt på ca. 96 kd. Det rekombinante protein var immunoreaktivt med I

15 protein fra HIV-inficerede H9-celler, med antisera til en rekombinant fraktion af I

gpl20, med selve gpl20, med et peptidfragment af gp41 og med humane AIDS-sera. I

R. L. Willey et al., Proc. Nat'l Acad. Sci., USA, 83: 5038 (1986) diskuterer hyperva- I

riable regioner af aminosyrer i gpl20 protein. En senere rapport af R. L. Willey et al., I

20 J. Virol., 62(1): 139 (1988) undersøgte en region inden i env genet, som er nødvendig I

for infektionsevne. I dette skrift beskrives specielt aminosyresubstitutioner ved Asp-co- I

doner af fire N-koblede glycosyleringssteder inden i gp 120 genet. I

W. R. Gallagher, Cell, 50: 327 (1987) diskuterer en fusionpeptidsekvens af transmem- I

25 branproteinetgp41 af HIV. I

S. D. Putney at al., Science, 234:1392 (1986) beskriver fremstillingen af neutraliseren- I

de antistoffer for et E. coli-produceret fragment af HIV env genet. I 1

B. J. Bond et al., Mol. Cell. Biol., 6(6): 2080 (1986) beskriver strukturen af Drosophila I

melanogaster actin 5C gen. Denne rapport diskuterer de to transkriptionsstartsteder af I

5 DK 175461 B1 aktin 5C genet og sammenslutninger mellem promotorsekvenseme og det bakterielle chloramphenicolacetyltransferasegen indsat i D. melanogaster-værtsceller.

P. J. Barr et al., Vaccine, 5: 90 (1987) beskriver ekspression af HIV-proteiner i gæren 5 Saccharomyces cerevisiae.

H. Johansen et al., 28th Annual Drosophila Conference, side 41 (1987) er et sammendrag af opfinderne til nærværende ansøgning, som kort angiver, at E. coli gal K-gener reguleret ved hjælp af Drosophila metallothioneinpromotor blev udtrykt i Drosophi-10 la-cellelinier.

A. Vanderstraten et al., Proceedings of the 7th International Conference on Invertebrate and Fish Tissue Culture, Abstract, University of Tokyo Press, Japan, (1987) og A. Vanderstraten et al., i "Invertebrate and Fish Tissue Culture", udgivet af Y. Kuroda et 15 al., Japan Scientific Societies Press, Tokyo, side 131-134 (1988) er også publikationer af opfinderne til den foreliggende ansøgning, i hvilke der diskuteres et hygromycin B selektionssystem til anvendelse ved ekspression af fremmede gener i D. melanoga-ster-celler i kultur. I sammendraget bemærkes, at systemet blev anvendt til at cointro-ducere og overudtrykke E. coli gal K-genet og andre gener af pattedyrsoprindelse.

20

Der er således stadig et behov indenfor området for en produktion på højt niveau af HIV-proteiner til anvendelse som vaccinemidler og diagnostiske midler.

I et aspekt angår den foreliggende opfindelse en HTV env genekspressionsenhed, som 25 omfatter en DNA-kodende sekvens for det ønskede protein og regulatoriske sekvenser nødvendige for transkription af den proteinkodende sekvens og efterfølgende translation i en Drosophila-celle.

I yderligere relaterede aspekter angår den foreliggende opfindelse et HIV env protein 30 eller et derivat deraf fremstillet ved hjælp af de transficerede insektceller ifølge den foreliggende opfindelse. Derivatet omslutter ethvert HIV env protein, såsom deletioner,

DK 175461 B1 I

additioner, substitutioner eller omarrangement af aminosyrer eller kemiske modifikati- I

oner deraf, som bevarer evnen til at blive genkendt af antistoffer, som er vækket over- I

for vildtype HIV env protein. I

5 Den foreliggende opfindelse angår også en fremgangsmåde til fremstilling af et HIV I

env protein eller et immunogent derivat deraf. Fremgangsmåden omfatter dyrkning af I

Drosophila-celler transficeret med en HIV env genekspressionsenhed i et medium, som I

er velegnet til vækst af cellerne. De transficerede celler, som er dyrket i det velegnede I

medium, er i stand til at udtrykke proteinet af interesse. Proteinet kan derefter opsamles I

10 ffa cellen eller cellekulturmediet. I

Andre aspekter og detaljer ved den foreliggende opfindelse beskrives i det følgende. I

Fremgangsmåden og ekspressionssystemet ifølge den foreliggende opfindelse letter I

15 produktion på højt niveau af HIV-proteiner, der omfatter gpl20, gpl60 og derivater I

deraf, i en Drosophila-cellestruktur. Drosophila-celleme transficeres ved anvendelse af I

standardkloningsteknikker, som muliggør indføring af fremmed DNA i en værtscelle I

uden på skadelig måde at påvirke den fremmede DNA eller værtscellen. De således I

konstruerede rekombinante Drosophila-celler producerer HIV-proteiner. I

20 I

I modsætning til det kendte Baculovirussystem, hvor HIV-proteinet kun tilvejebringes I

efter lyse af de inficerede insektceller, giver fremgangsmåden ifølge den foreliggende I

opfindelse et kontinuerligt celleekspressionssystem for HIV-proteiner. Efter sekretion I

er proteinet tilgængeligt ved oprensning fra kulturmediet under anvendelse af konven- I

25 tionelle teknikker. Proteinet kan alternativt produceres intracellulært eller membran- I

bundet. Proteinet kan ekstraheres fra cellerne under anvendelse af konventionelle tek- I

nikker. Alternativt kan membranbundet protein anvendes i en varietet af celle-associ- I

erede analyser. I 1

En foretrukken Drosophila-cellelinie til anvendelse ved praktisk udøvelse af den fore- I

liggende opfindelse er D. melanogaster S2-linie. S2-celler [Schneider, J. Embryol. Exp. I

7 DK 175461 B1

Morph. 27: 353 (1972)] er stabile cellekulturer af polyploide, embryoniske Drosophi-la-celler. Indføring af den cDNA-kodende sekvens for gpl60 eller dens underenheder gpl20 eller gp41 eller derivater deraf i Drosophila S2-celler ved DNA-transfektionstek-nikker producerer uventet store mængder af glycoproteinet. Anvendelse af S2-Droso-5 phila-cellen har mange fordele, herunder men ikke begrænset til dens evne til at vokse til en høj densitet ved stuetemperatur. Stabil integration af selektionssystemet har produceret op til 1000 kopier af den transficerede genekspressionsenhed i cellekromoso-meme.

10 Andre Drosophila-cellekultursystemer kan også anvendes ved praktisk udøvelse af den foreliggende opfindelse. Celler, der sandsynligvis vil kunne anvendes, er f.eks. KC-0 Drosophila Melanogaster-cellelinien, som er en serumfri cellelinie [Schulz et al., Proc.

Nat'l Acad. Sci., USA, 83: 9428 (1986)]. Foreløbige undersøgelser under anvendelse af KC-0 linien har antydet, at transfektion er mere vanskelig end med S2-celler. En anden 15 cellelinie, som kan være nyttig, er en cellelinie fra Drosophila hydei. Proteinekspression kan opnås under anvendelse af hydei-cellelinien; transfektion i denne cellelinie kan imidlertid resultere i, at den transficerede DNA udtrykkes med en meget lav effektivitet [Sinclair et al., Mol. Cell. Biol., 5: 3208 (1985)]. Andre tilgængelige Drosophi-la-cellelinier, som kan anvendes ved praktisk udøvelse af den foreliggende opfindelse, 20 omfatter Sj og S3.

Drosophila-celler udvalgt til anvendelse ved praktisk udøvelse af den foreliggende opfindelse kan dyrkes i en varietet af velegnede kulturmedier, herunder f.eks. M3-medi-um. M3-mediet består af en formulering af balancerede salte og essentielle aminosyrer 25 ved en pH-værdi på 6,6. Fremstilling af mediet er i alt væsentligt som beskrevet af Lindquist i DIS, 58: 163 (1982). Andre konventionelle medier til dyrkning af Drosophila-celler kan også anvendes.

Et rekombinant DNA-molekyle eller en rekombinant DNA-vektor indeholdende en 30 HIV-proteingenekspressionsenhed kan anvendes til at transficere de udvalgte Drosophila-celler i overensstemmelse med opfindelsen. Genekspressionsenheden indeholder

DK 175461 B1 I

8 I

en DNA-kodende sekvens for et udvalgt HlV-protein eller for et derivat deraf. Sådanne I

derivater kan opnås ved manipulation af gensekvensen under anvendelse af traditionel- I

le gensplejsningsteknikker, f.eks. mutagenese, restriktionsendonukleasebehandling, li- I

gering af andre gensekvenser, herunder syntetiske sekvenser, og lignende. Se f.eks. T. I

5 Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Labora- I

tory, Cold Spring Harbor, NY (1982). I

HIV DNA kodningssekvensen er nyligt blevet publiceret. Se Ratner et al., Nature 313: I

277-284 (1985) eller Wain-Hobson et al., Cell 40: 9-17 (1985). Nukleotidsekvensen er I

10 også tilgængelig fra GenBank (klon BH 10, Ratner et al., ovenfor). I

DNA molekyler omfattende kodningssekvensen ifølge den foreliggende opfindelse kan I

afledes fra HTLV-III inficerede celler under anvendelse af kendte teknikker (se Hahn I

et al., Nature, 312: 166-169 (1984)) eller kan alternativt syntetiseres ved standardoligo- I

15 nukleotidteknikker. Endvidere er der talrige rekombinante værtsceller, som indeholder I

de klonede DNA-kodningssekvenser, som er tilgængelige i vidt omfang. I

Derivater kan derefter fremstilles ved standardteknikker, herunder DNA-syntese. Så- I

danne derivater kan f.eks. omfatte gpl20- eller gpI60-molekyler, hvori en eller flere I

20 aminosyrer er blevet substitueret, tilsat eller deleteret uden på signifikant måde i uhel- I

dig retning at påvirke proteinets bindingsevne eller biologiske egenskaber. Derivater af I

disse proteiner kan også fremstilles ved hjælp af kemiske standardmodifikationsteknik- I

ker, f.eks. acylering og methylering. I 1 2 3 4 5 6

Også indbefattet i genekspressionsenheden er regulatoriske regioner nødvendige eller I

2

ønskelige for transkription af HIV proteinkodningssekvensen og dens efterfølgende I

3

translation og ekspression i værtscellen. Den regulatoriske region indeholder typisk en I

4

promoteregion, der virker ved at binde RNA polymerase og ved at initiere RNA-tran- I

5

skription. Promotorregionen findes typisk opstrøms for HIV-proteinkodningssekven- I

6

sen. I

9 DK 175461 B1

Foretrukne promotore er af Drosophila-oprindelse, f.eks. Drosophila-metallothionein-promotor [Lastowski-Perry et al., J. Biol. Chem., 260: 1527 (1985)]. Denne inducerba-re promotor dirigerer transkription på højt niveau af genet i nærværelse af metaller, f.eks. CuS04. Anvendelse af Drosophila-metallothioneinpromotor resulterer i ekspres-5 sionssystemet ifølge den foreliggende opfindelse, som opretholder fuld regulering, selv ved meget højt kopital. Dette er en direkte modsætning til anvendelse af pattedyrsme-tallothioneinpromotor i pattedyrsceller, hvori metallets regulatoriske effekt mindskes, efterhånden som kopitallet stiger. I Drosophila-ekspressionssystemet forøger denne bibeholdte inducerbarhedseffekt ekspressionen af genproduktet i Drosophila-cellen ved 10 høje kopital.

Drosophila actin 5C genpromotor [B. J. Bond et al., Mol. Cell. Biol., 6: 2080 (1986)] er også en ønskelig promotorsekvens. Actin 5C promotoren er en konstitutiv promotor og kræver ikke tilsætning af metal. Derfor er den bedre egnet til anvendelse i et system 15 med produktion i stor målestok, såsom et perfusionssystem, end Drosophila-metallo-thioneinpromotoren. En yderligere fordel er, at fraværet af en høj koncentration af kobber i mediet holder cellerne i en sundere tilstand i længere tidsrum.

Eksempler på andre kendte Drosophila-promotore omfatter f.eks. de inducerbare var-20 mechok (Hsp70)- og COPIA LTR-promotore. SV40 tidlig promotor giver lavere niveauer af ekspression end Drosophila-metallothioneinpromotoren. Promotorer, som sædvanligvis anvendes i celleekspressionsvektorer, omfattende f.eks. Rous fiiglesarcomvi-rus LTR og simianvirus (SV40 tidlig promotor), viser dårlig funktion og ekspression i Drosophila-systemet.

25

En ønskelig genekspressionsenhed eller ekspressionsvektor for HIV-proteinet kan konstrueres ved at sammenslutte HIV-proteinkodningssekvensen med en ønskelig signalsekvens. Signalsekvensen virker til at dirigere sekretion af proteinet fra værtscellen. En sådan signalsekvens kan afledes fra sekvensen af vævsplasminogenaktivator (tPA). An-30 dre tilgængelige signalsekvenser omfatter f.eks. sådanne, der afledes fra Herpes Simplex virusgen HSV-I gD [Lasky et al., Science, ovenfor].

10 I

DK 175461 B1 I

HIV DNA-kodningssekvensen kan også efterfølges af en polyadenylerings (poly · I

A)-region, såsom en SV40 tidlig poly A-region. Poly A-regionen, der virker i polyade- I

nylering af RNA-transkripter, synes at spille en rolle med hensyn til at stabilisere tran- I

skription. En tilsvarende poly A-region kan afledes fra en varietet af gener, hvori den er I

5 naturligt forekommende. Denne region kan også modificeres for at ændre dens se- I

kvens, forudsat at polyadenylering- og transkriptstabiliseringfunktioner ikke signifikant

påvirkes på skadelig måde. I

Det rekombinante DNA-molekyle kan også bære en genetisk selektionsmarkør, såvel I

10 som HIV-proteingenfunktioner. Selektionsmarkøren kan være et hvilket som helst eller I

hvilke som helst gener, som bevirker en let påviselig fænotypisk ændring i en transfice- I

ret værtscelle. En sådan fænotypisk ændring kan f.eks. være lægemiddelresistens, så-

som genet for hygromycin B-resistens. I

15 Alternativt kan et selektionssystem under anvendelse af lægemidlet methotrexat og

prokaryotisk dihydrofolatreduktase (DHFR)-gen anvendes sammen med Drosophi- I

la-celler. Den endogene eukaryotiske DHFR af cellerne inhiberes af methotrexat. Ved I

transfektion af cellerne med et plasmid indeholdende den prokaryotiske DHFR, som er I

ufølsom overfor methotrexat, og udvælge med methotrexat, vil derfor kun celler trans- I

20 ficeret med og udtrykkene den prokaryotiske DHFR overleve. Ulig methotrexat, selek- I

tion af transformerede pattedyrs- og bakterieceller, kan methotrexat i Drosophila-syste- I

met anvendes transfektanter til med indledningsvis høje kopital. Kun celler, som har in-

korporeret det beskyttende prokaryotiske DHFR-gen, vil overleve. Samtidigt har disse I

celler genekspressionsenheden af interesse. I

25 . I

Et illustrativt plasmid produceret ifølge den foreliggende opfindelse er pgpl60A32, I

som indeholder et gpl60 derivat erstattende den N-terminale 32 aminosyresekvens i I

gpl60 med den første aminosyre af tPA, serin. Dette plasmid beskrives yderligere i ek- I

sempel 1. I

30 I

11 DK 175461 B1

En anden sådan plasmidvektor er pgpl20FA32, som indeholder gpl 60 sekvens, hvor de første 32 aminosyrer er erstattet med serin, og hvilken sekvens indeholder en carboxyl -deletion af 216 aminosyrer. Dette plasmid beskrives også i eksempel 1.

5 Endnu et plasmid, som illustrerer derivatproteinere ifølge den foreliggende opfindelse, er pgpl20A32, som indeholder hele kodningssekvensen for gpl20 minus de første 32 aminosyrer ved N-terminalen, som er erstattet med serin. Endvidere indeholder plasmid pgpl20A274 en gpl20 proteinsekvens, hvor de første 274 aminoterminale aminosyrer er erstattet med den første aminosyre af tPA, serin, og hvilken sekvens indeholder de 10 resterende aminosyrer af gpl20 op til processtedet af gpl60. Disse vektorkonstruktioner er beskrevet mere fuldstændigt i eksempel 1.

Når først et rekombinant DNA-molekyle eller -ekspressionsvektor indeholdende HIV proteingenekspressionsenheden er blevet konstrueret, kan det eller den transficeres ind 15 i den udvalgte Drosophila-celle under anvendelse af standardtransfektionsteknikker. Sådanne teknikker er kendt blandt fagfolk indenfor området og omfatter f.eks. calcium-phosphatcopræcipitering, cellefusion, elektroporation, mikroinjektion og virustransfek-tion. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Et to-vektofsystem kan anvendes ved praktisk udøvelse af den foreliggende opfindelse 2 til i Drosophila-cellen af cotransficere en genekspressionsenhed for det ønskede 3 HIV-protein eller derivat og kodningsregionen for det selektionssystem, der skal an 4 vendes. En foretrukken illustrativ udførelsesform for den foreliggende opfindelse er 5 fremstilling af et HIV-protein under anvendelse af en vektor, som indeholder en 6 HJV-proteinekspressionsenhed, f.eks. pgpl20A32, og en vektor, som indeholder en hy- 7 gromycin B-genekspressionsenhed, f.eks. pCOHYGRO. pgp!20A32 indeholder en eks 8 pressionsenhed omfattende Drosophila-metaHothionein-promotoren, et derivat af 9 gpl20-genet og SV40 poly A-stedet. Denne gpl20-ekspressionsenhed vil i kombinati 10 on med pCOHYGRO-vektorsystemet producere et gpl20-derivat i S2-Drosophila-celler 11 ved at maksimere fordelen ved hygromycin B-resistens ved selektion. Med dette system kan det antibiotiske hygromycin B anvendes til at udvælge sådanne celler, som

I DK 175461 B1 I

I 12 I

I indeholder de transficerede vektorer. En mere fuldstændig beskrivelse af denne udfø- I

I relsesform er givet i eksempel 2. I

I Som et andet eksempel kan et ekspressionssystem, som anvender DHFR gen/methotre- I

I 5 xatselektionssystemet bestående af vektorerne pgpl20A32 og pHGCO anvendes til at I

I udvælge methotrexatresistente cellers ekspression af gpl 20 eller et derivat deraf. Vek- I

I toren pgpl20A32 omfatter en gpl20-genekspressionsenhed, hvori promotoren er Dro- I

I sophila-metallothioneinpromotoren. pHGCO-vektoren omfatter en DHFR-genekspres- I

I sionsenhed og cotransficeres sammen med pgpl20A32-vektoren, hvorved der tilveje- I

I 10 bringes DHFR-gen nødvendig for selektion. Disse selekterbare markører er sammen I

I med cotransfektion af Drosophila-celler yderligere beskrevet af Johansen et al., i US I

I patentansøgning serie nr. 07/047.736, indleveret 8. maj 1987 og inkorporeres heri ved I

I reference. I

I 15 Ifølge opfindelsen cotransficeres to vektorer i S2 Drosophila-cellen under anvendelse af I

I den metode, som er beskrevet af Wigler et al. i Cell, 16: 777 (1979). Vektorerne co- I

I transfi ceres i varierende forhold afhængigt af det særlige kopital, der ønskes. De trans- I

I ficerede celler udvælges derefter, såsom i et M3 medium indeholdende serum og det I

I pågældende selektionsmiddel, f.eks. hygromycin B eller methotrexat. I

I 20 I

I Når først en passende vektor er blevet konstrueret og transficeret i den udvalgte Dro- I

I sophila-cellelinie, induceres ekspression af gpl20 ved tilsætning af et passende induk- I

I tionsmiddel for den inducerbare promotor. Cadmium eller kobber er f.eks. induktions- I

I midler for metallothioneinpromotoren. Varme er induktionsmiddel for Hsp70-promoto- I

I 25 ren. For konstitutive promotore, såsom actin 5C-promotoren, kræves der intet induk- I

I tionsmiddel for ekspression. I

I Transkription og ekspression af HTV-proteinkodningssekvensen i de ovenfor beskrevne I

I systemer kan overvåges. F.eks. kan der anvendes Southem-aftryksanalyse til at bestem- I

I 30 me kopitallet af gpl20-genet. Northem-aftryksanalyse giver information med hensyn I

I til størrelsen af den transkriberede gensekvens [se f.eks. Maniatis et al., som citeret I

DK 175461 B1 I

13 I

ovenfor]. Graden af transkription kan også bestemmes kvantitativt. Ekspression af det I

udvalgte HIV-protein i de rekombinante celler kan yderligere verificeres ved hjælp af I

Westem-aftryksanalyse og aktivitetsundersøgelser på det resulterende glycoprotein [se I

eksempel 5]. I

5 I

Drosophila S2-celler er særligt velegnede til produktion i højt udbytte af protein ved I

fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse. Cellerne kan holdes i suspensi- I

onskulturer ved stuetemperatur (24 ± 1°C). Kulturmedium er M3 suppleret med mellem I

5 og 10% (volumen/volumen) varmeinaktiveret føtal bovinserum (FBS). I en foretruk- I

10 ken udførelsesform for opfindelsen indeholder kulturmediet 5% FBS. Efter induktion I

dyrkes cellerne i serumfri medier. Når pCOHYGRO-vektorsystemet anvendes, forsy- I

nes medierne også med 300 pg/ml hygromycin B. I disse medier kan S2-celleme dyrkes I

i suspensionskulturer, f.eks. i 250 ml til 2000 ml roterende kolber med omrøring ved I

50-60 o/m. Celledensiteter holdes typisk mellem 106 og 107 celler per ml. I en udførel- I

15 sesform for den foreliggende opfindelse dyrkes cellerne forud for indføring i 1500 ml I

roterende kolber i medier indeholdende 5% serum. I

I Efterfølgende cellekultur kan HIV-proteinet isoleres fra de brugte medier, f.eks. ved I

I anvendelse af en monoklonal antistof-affinitetssøjle. Andre kendte proteinoprensnings- I 20 trin, f.eks. metalchelater, forskellige affinitetskromatografitrin eller absorptionskroma- I tografi, kan anvendes til oprensning af HIV-proteinet fra dyrkningsmedierne. Anven- I delse af cellelinien S2, som secernerer genproduktet direkte i medierne, er et vigtigt I træk ved den foreliggende opfindelse. Direkte sekretion i medierne muliggør anvendel- I se af et effektivt ettrins-oprensningssystem. Under anvendelse af en monoklonal anti- 25 stof-søjle rettet mod HIV-proteinet kan de brugte kulturmedier sættes direkte til søjlen I og proteinet elueres under anvendelse af 1,5 M KSCN i phosphatpufret saltopløsning I (PBS).

I Ved en foretrukken oprensningsteknik, som muliggør effektiv produktion i stor måle- I 30 stok af HIV-proteineme ifølge opfindelsen, anvendes en immunoaffinitetssøjle indehol- I dende et monoklonalt antistof rettet mod en epitop, som er til stede i gpl60 og til stede I DK 175461 B1 I 14 i fuldt udviklede, secernerede gpl20-proteiner. Et sådant monoklonalt antistof er for- delagtigt på grund af dets evne til at genkende proteinsekvensen i mere end en konfigu- ration. Et antistof med disse egenskaber, som er nyttigt i immunoaffinitetssøjler for for- skellige HIV-proteiner, derivater eller fragmenter deraf, betegnes 178,1. Dette mono- 5 klonale antistof beskrives mere detaljeret i eksempel 3. En sådan søjle kan fremstilles ved at koble et antistof med egenskaberne for 178,1 til en konventionel absorberende bærer, såsom "Sephadex", under passende, konventionelle betingelser med hensyn til pH-værdi, temperatur og lignende. En sådan oprensningssøjle og -procedure kan an- vendes til at separere HIV-proteineme og fragmenterne ifølge den foreliggende opfin- I 10 delse.

Andre monoklonale antistoffer kan anvendes ved denne oprensningsprocedure. En va- rietet af monoklonale antistoffer, som er i stand til at binde HIV-proteiner, især gpl60 I eller gpl20, er beskrevet inden for området og er tilgængelige. Andre hidtil ukendte 15 monoklonale antistoffer, som er nyttige ved praktisk udøvelse af den foreliggende op- I Endelse, kan udvikles ved hjælp af ikke-konventionelle teknikker.

De glycoproteiner, der produceres af Drosophila-celler i overensstemmelse med den fo- I religgende opfindelse, er fuldstændigt fri for kontaminerende materiale, f.eks. patte- I 20 dyrs-, gær- og bakteriemateriale og mere vigtigt andre HIV-virale materialer. Droso- I phila-producerede HIV-proteiner er også blevet vist at udvise forskellige glycosyle- ringsmønstre, end der er rapporteret for andre systemer, f.eks. pattedyrssystemer.

HIV-proteineme og derivaterne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse kan være I 25 nyttige i en varietet af produkter. F.eks. kan disse rekombinante proteiner anvendes i I farmaceutiske præparater til behandling af HlV-inficerede individer. Et sådant farma- I ceutisk præparat omfatter en terapeutisk effektiv mængde af HIV-proteinet eller deriva- I tet heraf ifølge opfindelsen i blanding med en farmaceutisk acceptabel bærer. Præpara- I tet kan indgives systemisk enten parenteralt, intravenøst eller subkutant. Når det indgi- I 30 ves systemisk, er det terapeutiske præparat til anvendelse i form af en pyrogenfri, pa- I renteralt acceptabel vandig opløsning. Fremstillingen af en sådan parenteralt acceptabel 15 DK 175461 B1 proteinopløsning under hensyntagen til pH-værdi, isotonicitet, stabilitet og lignende, er indenfor færdighederne blandt fagfolk på området.

Doseringskurven bestemmes af lægen, som tager forskellige faktorer, som modificerer 5 lægemidlers virkning, f.eks. patientens tilstand, legemsvægt, køn og diæt, alvorlighe-den af den pågældende infektion, administrationstidsrummet og andre kliniske faktorer, med i betragtning. Den farmaceutiske bærer og andre bestanddele i en farmaceutisk formulering udvælges af fagfolk indenfor området.

10 Rekombinante proteiner ifølge den foreliggende opfindelse kan endvidere anvendes som bestanddele af vacciner til at vaccinere pattedyrsindivider mod HIV-infektion.

Disse proteiner kan anvendes alene eller sammen med andre rekombinante proteiner eller terapeutiske vaccinemidler. Bestanddele af en sådan vaccine bestemmes af fagfolk indenfor området.

15

Endelig kan proteinerne ifølge den foreliggende opfindelse være nyttige som diagnostiske midler til påvisning af tilstedeværelse af HIV-infektion eller antistoffer mod et HIV-infektiøst middel i biologiske væsker, såsom blod, serum, spyt og lignende. Proteinerne ifølge opfindelsen kan også anvendes i metoder til at identificere og/eller isolere 20 HIV-bindingsproteiner eller andre HIV-bindingssubstanser i biologiske væsker og væv, f.eks. sCD4 eller derivater deraf. Proteinerne kan således være bestanddele af sæt til at udøve sådanne metoder. Til identifikation af en HIV-bindingssubstans bringes et protein ifølge den foreliggende opfindelse i kontakt med substansen eller en uren blanding indeholdende substansen under forhold til at fremme binding mellem proteinet og 25 HIV-bindingssubstansen. En konventionel analyse til påvisning af forekomsten af bin-I ding, f.eks. påvisning af radioaktive mærker eller lignende, er også del af metoden. Til- I stedeværelsen af binding mellem proteinet og bindingssubstansen er derfor tegn på I HIV-binding.

I 30 I en metode til isolering af en HIV-bindingssubstans fra blandingen kunne bindingsfor- I løbet tilsvarende følges ved en konventionel procedure til oprensning af den bundne I DK 175461 B1 I 16 enhed dannet af proteinet ifølge den foreliggende opfindelse og HIV-bindingssubstan- sen fra blandingen. Andre bestanddele af sådanne diagnostiske systemer og sæt kan | være konventionelle bestanddele af diagnostiske sæt og kan udvælges af fagfolk inden- for området.

Is’ ·

De følgende eksempler illustrerer konstruktionen af repræsentative vektorer og trans- H formanter ifølge opfindelsen, det foretrukne oprensningssystem og analyser til bestem- | H melse af produktionsniveauet af glycoproteineme gpl20 og gpl60. Disse eksempler skal ikke betragtes som værende begrænsende for opfindelsens omfang.

I 10

Restriktionsenzymer og andre reagenser blev anvendt i alt væsentligt i overensstem- melse med forhandlerens instruktioner. |

Eksempler I 15

Eksempel 1. Vektorkonstruktioner·

al pMTtPA

I 20 Som basisvektor for genekspression i Drosophila blev tPA-ekspressionsvektoren I pMTtPA (også betegnet pDMtPA) anvendt. Denne vektor er et derivat af vektor pMLl, en lille pBR322-vektor indeholdende Ø-lactamasegenet, som har deleteret giftsekven- I seme [Mellon et al., Cell, 27: 297 (1982)]. Disse sekvenser inhiberer amplifikation af I vektoren. Denne vektor blev fordøjet med Sall og Aat2, som fjerner et lille stykke 25 pBR322, og de fordøjede ender blev fyldt ind. Det manglende stykke af pBR322 erstat- I tes derefter med en kassette indeholdende Drosophila-metallothioneinpromotoren på et

I endefyldt EcoRl-Stul fragment efterfulgt af et ifyldt Hindlll-Sacl fragment fra pDSPI

I [D. S. Pfarr et al, DNA, 4(6): 461 (1985)] indeholdende en tPA-sekvens indeholdende I signalsekvensen, præpeptidet og hele kodningsregionen af tPA. tPA-genet på dette I 30 fragment efterfølges af et SV40 tidlig polyadenyleringssted.

DK 175461 B1 I

17 I

b) pgp!60A32 I

Et Hindlll-Xbal fragment indeholdende hele env genet blev isoleret fra en HIV-isolat- I

klon BH10 [L. Ratner et al, som citeret ovenfor, GenBankJ. Hele gpl60-sekvensen I

5 blev derefter indsat i en Ncol-Xbal fordøjet vektor pDSPl. Den resulterende vektor I

SU2 blev fordøjet med Ndel efterfulgt af behandling med mungbønnenuklease, hvoref- I

ter den blev fordøjet med Sacl, hvorved gpl60 genet blev isoleret. Fordøjelsen med I

Ndel skærer gpl60 sekvensen ved aminosyre nr. 32. Sacl-fordøjelsen skærer 3’ af I

gpl60 genet indbefattende i sekvensen en del af den oprindelige pDSPl-vektor inde- I

10 holdende en polylinker. Dette fragment blev indsat i den ovenfor beskrevne ekspressi- I

onsvektor pMTtPA, som var blevet fordøjet med BgHI, endefyldt og derefter skåret I

med Sacl, som deleterer den fuldt udviklede tPA-sekvens. Bglll-stedet er anbragt ved I

I den første aminosyre af tPA. Den resulterende vektor pgpl60A32 koder følgelig for et I modificeret gpl60-protein, hvor de N-terminale 32 aminosyrer af gp!60 er erstattet I 15 med serin.

I c) pep!20FA32 I En anden vektor indeholdende en modificeret gensekvens, som koder for HTV-1 over- 20 fladeglycoprotein gpl60, blev konstrueret ved at fordøje pgpl60A32 med Hindlll og I Sacl, hvorved carboxylterminalen af gpl60 blev jernet. Ca. to tredjedele af sekvensen, I som koder for gp41, fjernes ved denne fordøjelse. Denne gpl 60-sekvens mangler såle- I des de første 32 aminosyrer og de sidste 216 aminosyrer af den naturlige gpl60-se- I kvens. Den deleterede sekvens blev erstattet med en kort syntetisk linkersekvens, som I 25 koder for et stopcodon på et Hindlll-Sacl fragment. 6-aminosyre-linkersekvensen er I som følger: I 5'AGCTTTGACTGACTGAGCT 3'.

I 30 I DK 175461 B1 I 18 I d) pgp!20A32

Endnu en vektor indeholdende et mutant gpl60 gen blev konstrueret ved at fordøje pgpl60A32 med Styl og Xbal, hvorved hele sekvensen af protein gp41 og ca. 30 ami- 5 nosyrer ved carboxylterminuset af gp 120 glycoproteinsekvensen blev deleteret. Dette fragment blev erstattet med en syntetisk Styl-Xbal linkersekvens, som koder for det korrekte carboxylterminus fra Styl-stedet til processtedet af gpl20-gp41. Denne se- kvens blev fulgt af et stopcodon. Denne sekvens indeholdt derved hele kodningsse- kvensen for gpl20 minus de første 32 aminosyrer og intet af gp41 kodningssekvensen.

I e) pgpl20A274

Endnu en anden repræsentativ vektor indeholdende et mutant gpl20 gen blev konstrue- ret som følger: et 720 basepar carboxylterminalfragment af gpl20 blev isoleret ved par- 15 tiel fordøjelse af pgpl20A32 med Bglll efterfulgt af Xbal-fordøjelse. Dette fragment I blev nu indsat i stedet for tPA-genet i BgllDCbal-skåret pMTtPA-ekspressionsvektoren.

I Den resulterende vektor p 120Δ274 koder for et gp 120 protein, som har erstattet de før- ste 274 aminoterminale aminosyrer med den første aminosyre af tPA, serin.

I 20 f) pCOHYGRO

I Et kommercielt tilgængeligt plasmid, pUCl 8 [BRL] indeholdende et BamHI- og Smal- I sted blev anvendt. 5' LTR fra et integreret COPIA-element (357 basepar) blev klonet i I BamHI-stedet af vektor pUC18, hvilket resulterede i vektoren, som betegnes pUCO- I 25 PIA. COPIA er et repræsentativt medlem af de disperse midterrepetitionssekvenser, der I findes spredt over Drosophila-genomet [Rubin et al. i Cold Spring Harbor Symp.

I Quant. Biol., 45: 619 (1980)]. Vektoren pUCOPIA blev skåret ved Smal-stedet, og E.

I coli-genet kodende for hygromycin B phosphotransferase (hygromycin B kassette) blev I klonet i pUCOPIA under anvendelse af standardkloningsteknikker. Hygromycin B kas- I 30 setten blev isoleret på et Hindlll-BamHI-fragment på 1481 basepar fra vektoren I DSP-hygro [Gertz et al. Gene, 25: 179 (1983)]. Hygromycin B kassetten indeholder 19 DK 175461 B1

den sekvens, som koder for hygromycin B phosphotransferasegenet og SV40 tidlig poly A-regionen. Hindlll- og BamHl-stedeme blev fyldt i under anvendelse af T4 DNA- I

polymerase, og hygromycin B kassetten blev ligeret i Smal-stedet af den vektor pU- I

COPIA-producerende vektor pCOHYGRO. I

5

Eksempel 2. Transfektion i Drosophila S^-celler. I

pCOHYGRO blev cotransficeret i S2 Drosophila-celler sammen med en af de vektorer, I

som bærer et gpl60 mutantgen under regulering af Drosophila-metallothioneinpromo- I

10 toren som beskrevet ovenfor. I dette eksempel er den anvendte vektor pgpl20A32. De transficerede celler blev uvalgt i M3-medium indeholdende 5% serum og 300 pg/mT hygromycin B. Efter 2 til 3 dage under identiske forhold stoppede de utransficerede celler med at dele sig og begyndte at dø. Tidspunktet for udvælgelse med henblik på at opnå stabile, voksende hygromycin B-resistente celler i de transficerede kulturer er ca.

15 2 til 3 uger.

Til opnåelse af kulturer, som i deres kromosomer har integreret forskellige kopital af gpl20 mutantgenet, blev forholdene mellem de to vektorer varieret. Forholdet i dette I eksempel var 20:1. Tilsvarende forhold er blevet anvendt for andre gp 160 mutantvekto- I 20 rer ifølge den foreliggende opfindelse. Dette forhold er det samme for en hvilken som helst af de anvendte gp 160 mutantvektorer.

Ekspression af pgpl20A32 genproduktet blev verificeret efter indføring af metallothio- I neinpromotoren sammen med 500 μΜ CuS04. Westem-aftryksanalyse af den brugte I 25 supernatant fra de inducerede cellekulturer afslørede et enkelt bånd på ca. 100 kd.

I Niveauet af mutant gpl60 genprodukt i cellesupematanteme blev målt under anvendel- se af gp 120 ELISA-analyse, som er beskrevet i eksempel 4, og under anvendelse af op- I renset viral gpl20 som standarder. 5 x 106 celler per ml blev podet i M3-medium uden I 30 serum og induceret i 3 til 4 dage. Niveauet af gpl20 målt i supematanten er ca. 1-2 I mg/1.

I DK 175461 B1 I 20

Celler blev holdt som suspensionskulturer i 250 ml til 2000 ml roterende kolber. Kul- turmedium var M3 suppleret med 300 pg/ml hygromycin B. Kulturer blev inkuberet H ved 24 ± 1°C og omrørt ved 50-60 o/m. Celledensiteter blev typisk holdt mellem 106 og 107 celler per ml i M3-medium suppleret med hygromycin B. CuS04 blev tilsat til en 5 slutkoncentration på 500 μΜ, og kulturerne fik lov at vokse i 3 til 4 dage i serumfri medier forud for høstning af det modificerede gpl 20 glycoprotein.

Proteinerne, som blev produceret ifølge denne metode, havde en molekylvægt på ca.

100, og graden af ekspression var højere end nogen anden rapporteret gpl 20/- 10 gpl60-ekspression i noget eukaryotisk cellesystem. I biologiske standardaktivitetsana- lyser er det oprensede, modificerede, udtrykte gpl20 som beskrevet ovenfor i stand til at inhibere virusinfektion i vævskultur, binder T4 og reagerer med antistoffer overfor I gpl 20.

I 15 Det forventes, at fagfolk indenfor området kunne udtrykke de andre gpl 60- og I

gpI20-proteiner og fragmenter deraf, som beskrives ved den foreliggende opfindelse, under anvendelse af i alt væsentligt de samme systemer og procedurer og eksemplifice- I ret ovenfor for det proteinfragment, som der kodes for i pgpl20A32.

I 20 Eksempel 3. Monoklonalt antistof 178.1 I En affinitetsoprensningssøjle, som anvender et hidtil ukendt monoklonalt antistof, blev I anvendt i det oprensningsskema, der blev anvendt for de ovenfor beskrevne mutante I gpl60/gp 120-proteiner. Dette monoklonale antistof kan karakteriseres ved at være i I 25 stand til at reagere med ikke-denaturerede HIV-glycoproteinprodukter til stede i celle- I lysat og med fuldt udviklet gpl20 som secerneret i supematanten af en gærkultur. Et I sådant monoklonalt antistof, som er specifikt for epitopen, som er indeholdt både i det I ikke-bearbejdede rekombinante gpl60-molekyle og i det bearbejdede gpl20-protein i I fuldt størrelse, er et monoklonalt museantistof 178,1.

I 30

DK 175461 B1 I

21 I

Et ekspressionssystem, hvor man anvender C. albicans glucoamylasepromotor og sig- I

nalpeptid, blev anvendt til at producere delvis oprenset gærrekombinant gpl60 til pro- I

duktion af 178,1. Produktion af dette gær-afledte gpl60 er beskrevet i US patentansøg- I

ning serie nr. 07/236.699, Bruck et al., indleveret 25. august, 1988. Denne ansøgning I

5 inkorporeres heri ved reference. I

Otte uger gamle Balb/c-mus fik tre gange subkutant og intraperitonealt injiceret delvis I

oprenset (1,5- 3% renhed) gær-rekombinant gpl60 i Freunds adjuvans med 4 ugers in- I

tervaller. Efter en hvileperiode på 3 måneder blev én mus aflivet, og dens miltceller I

10 blev sammensluttet med myelomaceller [se feks. R. P. Siraganian et al., Meth. Enz., I

92: 17 (1983); EMBO Course on Hybridoma Production, Basel Inst, for Immunol. I

(1980)]. De anvendte myelomaceller er en subklon af Sp2/0-Agl4-linien tidligere ud- I

valgt til optimal vækst i agarmedium og høj fusionseffektivitet [J. D. Franssen et al., I

Proc. XXIX Colloq. Protids Biol. Fluids, 29: 645-649 (1981)]. Efter ca. tidage blev 15 supematanter udtaget til screening i en indfangnings-ELISA under anvendelse af et kommercielt, monospecifikt anti-gpl20 reagens [Biochorm. Seromed Ref. D7324] som indfangsningsantistof.

Kort fortalt blev Nunc-immunoplade I (nr. 4-39454) belagt natten over ved 4°C med 50 I 20 μΐ af en opløsning af 5 pg/ml af fåre anti-gpl20 IgGer i PBS. Pladerne blev vasket med I vaskepuffer (PBS, "Tween" 20 0,1%) og mættet med 100 μ! af en mætningspuffer I [PBS, nyfødt kalveserum 4%, bovinserumalbumin (BSA) 1%, "Tween" 20 0,1%] i 1 I time ved 37°C. Halvtreds μΐ/brønd af rå Molt3/HTLV-inB eller Molt3-cellelysat (107 I celler/ml i PBS, "Triton" X-100 1 %) eller af supematantfraktionen (S2-30) af rekombi- I 25 nant-gær gp 160 (eller tilsvarende behandlet negativ kontrol) blev anvendt som antigen I og inkuberet i pladerne i 3 til 5 timer ved stuetemperatur. Pladerne blev vasket grun- I digt, og 50 μΐ hybridomasupematanter blev sat til hver brønd og inkuberet natten over I ved 4°C. Efter et vasketrin blev 50 pl/-brønd af en 1/500 fortynding af biotinylerede I anti-muse immunoglobuliner (Iger) (Amersham Ref. RPN 1021) i mætningspuffer in- I 30 kuberet i pladerne i I time ved 37°C. Pladerne blev vasket igen, og 50 μΐ/brønd af en I DK 175461 B1 I 22 .

1/1000 fortynding af streptavidin biotynileret peberrodsperoxidasekompleks (Amer- sham Ref. RPN 1051) i mætningspuffer blev sat til hver brønd.

Efter et yderligere vasketrin blev 50 μΐ af en opløsning af 0,4 mg/ml af orthophenylen- I 5 diamindihydrochlorid (OPD, Sigma PI526) og 1 μΐ/ml af H2O2 (30% i citronsyre/natri- H umcitrat 0,1 M pH·værdi 5) suppleret med 0,1% "Tween" 20 sat til hver brønd. Plader- ne blev derefter inkuberet i 20 min. ved stuetemperatur i mørke, og reaktionen blev I stoppet ved tilsætning af 50 μΐ/brønd af 2M H2S04. Den optiske densitet ved X = 492 nm blev overvåget, og 50 positive kloner blev udvalgt til yderligere subkloning i blød .

I 10 agarose ifølge P. Herion et al., Proo. XXIX Colloq. Protids Biol. Fluids. 29: 627 (1981). De klonede hybridomaceller blev derefter dyrket in vivo ved injektion af 2 til 5 x 106 hybridomaer i peritonealhulrummet hos Balb/c-mus, som var forbehandlet ved intraperitoneal injektion afpristan (2,6,10,14-tetramethylpentadecan).

I 15 De monoklonale antistoffer udvalgt ved den ovenfor nævnte procedure blev karakteri- I seret ved Westem-aftryksanalyser (WB), radioimmunopræcipitationsanalyse (RIPA), I oprensning, biotinmærkning og kompetitionsanalyser. Resulterende monoklonale anti- stoffer blev yderligere karakteriseret ved analyse af deres reaktionsevne overfor for- I skellige rekombinante og naturligt forekommende antigener.

I 20

Et højt udbytte af hybridomaer blev opnået ved denne procedure. Mere end 200 brønde I var positive i screeningsanalyseme. Blandt disse blev imidlertid kun 50 brønde udvalgt, og efter kloning blev cellerne ekspanderet i ascitessyre. Alle ascitesvæskeme blev un* I dersøgt ved WB og RIPA. Blandt de undersøgte 39 monoklonale antistoffer viste 37 et 25 gpl60-bånd ved RIPA. Ingen reagerede med gpl20 formen i den samme analyse. Så* I danne monoklonale antistoffer, som kun udviste gpl60-genkendelse ved RIPA, idet de I var klart reaktionsdygtige med gpl20 ved WB, blev analyseret ved underklasse. Tre I monoklonale antistoffer, som var IgG2A, blev oprenset på en protein A-sepharosesøjle I og biotinmærket. Kompetitionsanalyser under anvendelse af vaccine gp!60 som anti- I 30 gen blev udført, og det opnåede resultat definerede mindst fem forskellige grupper af 23 DK 175461 B1 epitopgenkendeJse med gpl60-proteinet. Monoklonalt 178,1 blev udvalgt for en epitop til stede på fuldt udviklet gpl20 og ubearbejdet intracellulær gpl60.

En Westemaftryks (WB)-analyse blev udført i overensstemmelse med konventionelle 5 teknikker til at påvise, at 178,1 er i stand til at binde HIV-virus isoleret fra humane celler, som er inficeret med HTLV-ΠΙβ [Molt3/HTLV-IIIB].

Radioimmunopræcipitationsanalyser (RIPA) blev udført som beskrevet af P. J. Kanki et al. i Science, 228: 1199 (1985) til at påvise, at 178,1 kunne immunopræcipitere de 10 humane celler, som var inficeret med HTLV-III virusstammer.

Reaktionsevnen hos monoklonale antistoffer, som genkender ikke-overlappende epito-per mod et stort panel af antigener, blev vurderet under anvendelse af sandwich-ELISA involverende fåreanti-gpl20 som indfangningsreagens. Monoklonalt antistof 178,1 var 15 negativt i ELISA på divergente HJY-isoIater Moii3/'-firLV-IIiB, H9/HTLV-IiiRF) og Hut78/Arv2, men klart positive ved undersøgelse på HTLV-IIIB i RIPA, WB eller ELISA under anvendelse af rekombinante antigener. Dette monoklonale antistof genkender en epitop, som tilsyneladende er bevaret mellem gpl60 og gpl20, og giver således ved anvendelse i den i eksempel 4 nedenfor beskrevne oprensningsteknik en yderligere for-20 del til produktion af gp 160/gp 120-glycoproteiner i forskellige konstruktioner.

Eksempel 4. Oprensning af ετ>120Δ32 fra Drosophila-konditioneret cellekulturmedium.

I Det rekombinante gpl20-protein fra eksempel 2 blev oprenset som følger: 30 1 af Dro- I 25 sophila-konditionerede medier (CM) indeholdende gp!20A32 blev fremstillet med 1 I mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 10 mM ethylendiamintetraeddikesyre (ED- I TA) og 70 Kallikrein inhibitorenheder. CM blev filtreret gennem en 0,45 pm Durapo- I re-membran under anvendelse af en pellicon (millipore)-indretning. Filtreret CM blev I påført på S-sepharose hurtigt flow (Pharmacia) (5 liter; 25,2 cm x 11 cm) ved en lineær

I 30 flowhastighed (LFR) på 37 ml/cm2.time ækvilibreret i puffer A indeholdende 20 mM

I 2-[N-morfolino]ethansulfonsyre (MES) ved en pH-værdi på 6,0. Efter påføring af alt I DK 175461 B1 I 24 H CM blev søjlen elueret i et trin med puffer B Indeholdende 20 mM MES, pH-værdi 6,0, I 0,4M NaCl.

H Det S-sepharose-eluerede gpl20A32 blev påført på en anti-gpl20 musemonoklonal-se- 5 pharose 4B-søjle (60 ml; 3,2 cm x 6,5 cm) ved en LFR på 10 ml/cm2.time. Denne søjle H blev ækvilibreret i puffer B. Efter påføring af en halv S-sepharose pool blev søjlen va- I sket med 1 søjlevolumen af puffer B, 2 søjlevolumener af 20 mM MES, pH-værdi 6,0, 1,0M NaCl (puffer C) og 2 søjlevolumener af puffer A. gpl20Å32 blev elueret med H 0,1M eddikesyre, pH-værdi 2,8, og fraktioner blev øjeblikkelig neutraliseret ved tilsæt- I 10 ning af 0,1 volumen 1M tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris), pH-værdi 10,4.

I Muse anti-gpl 20 monoklonal antistofhybridoma 178,1 blev produceret ifølge eksempel I 3 ovenfor. Denne hybridoma blev podet ved 2 x 105 celler/ml og dyrket i fire dage i I Dulbeccos modificeret ømemedium [Hazelton Research Products] suppleret med 4,5 15 g/I glucose, 2 μΜ glutamin og 10% serum. CM indeholdende 178,1 antistof blev filtre- I ret (0,2 pm membran) og påført på en protein A-sepharose (Pharmacia) (17 ml; 1,5 cm I x 10 cm) ækvilibreret i 0,1M Tris, pH-værdi 8,2. Antistof blev elueret med 0,1 M na- triumcitrat, pH-værdi 3,5 og øjeblikkeligt neutraliseret med Tris.

I 20 Oprenset anti-gpl20 monoklonalt antistof blev koblet til CNBr-aktiveret sepharose 4B

I (Pharmacia), ifølge producentens instruktioner ved en densitet på 2 mg antistofrml har- I piks og med en koblingseffektivitet på 98%, resulterende i en anti-gpl 2 O-sepharose-af- I finitetsharpiks. Denne affinitetsharpiks vil specifikt binde gpl20-protein ved interakti- I on af antistoffet med en enestående strukturel epitop på gp 120.

I 25 I Renheden af det færdige gpl20 proteinprodukt ifølge denne oprensningsteknik er I 80-90% med et beregnet udbytte på 8,5 mg/30 1 konditioneret medium. Udvinding be- I regnes til mellem 25-50%.

I 30 Denne oprensningsteknik og affinitetsharpiks menes også at være effektiv overfor an- I dre HIV-proteiner eller fragmenter deraf, som har denne epitop.

DK 175461 B1 I

25 I

Eksempel 5 Analyse. I

Den ovenfor beskrevne analyse er en ikke-isotopanalyse, hvor der anvendes et enzym I

og et substrat til påvisning af gpI20 eller fragmenter deraf, hvilken analyse blev an- I

I 5 vendt til påvisning af de gpl20-proteiner, der blev produceret ved fremgangsmåden og I

I ved hjælp af præparaterne ifølge den foreliggende opfindelse. I

I Ved denne analyse er kriterierne for påvisning af gpl20 afhængig af antistofspecifici- I

I tet. Et anti-gpl20 monoklonalt antistof [DuPont, kat. nr. 9284], fortyndet i 0,1M natri- I

I 10 umcarbonatpuffer (pH-værdi 9,5) til to pg/ml, anvendes til at indfange gp 12O-proteinet. I

I 100 μΐ af denne antistoffortynding sættes til hver brønd dobbelt på en analyseplade, I

I bortset fra sådanne brønde, der er beregnet til at være kontroller. Pladerne blev inkube- I

I ret ved 4°C natten over. Antistoffet blev udvasket den næste dag, og pladen blev bloke- I

I ret ved at tilsætte 300 μΐ af en blokeringspuffer bestående af 1% BSA i PBS til hver I

I 15 brønd i 1 time ved stuetemperatur. I

I De virale gpl20-standarder blev fortyndet til 1 pg/ml, 0,5 pg/ml, 0,25 pg/ml, 0,1 pg/ml I

I og 0,2 pg/ml i en vaskepuffer bestående af PBS og 0,05% "Tween" 20. 100 μΐ aide I

I fortyndede standarder sættes til hver brønd dobbelt. Pladerne blev inkuberet på en pla- I 20 deomryster i 2 timer ved stuetemperatur, hvorefter hver plade blev vasket fire gange med vaskepuffer.

Til hver brønd blev der sat 100 μΐ af kaninanti-gpl20 antistof (beskrevet af DeBouck et I al. i US patentansøgning serie nr. 07/056.553, indleveret 29. maj, 1987) fortyndet I ' 25 1/1000 i vaskepuffer, og hver udpladede blev inkuberet på en omryster i en time. Dette andet antistof bringer gp!20 i sandwich mellem de to antistoffer. Pladerne blev derefter vasket fire gange med vaskepuffer. Til påvisning af dette kompleks blev et tredje anti- I stof, 100 μΐ af peroxidase (POD) mærket gedeanti-kanin antistof (for det meste IgG- og I IgM-antistof) fortyndet i vaskepufFer uden azid, sat til hver brønd. Pladerne blev deref- I 30 ter inkuberet i 2 timer på en omryster ved stuetemperatur.

I DK 175461 B1 Η H Efter pladerne var vasket fire gange, blev 100 μΐ af et farveløst substrat (1 mg/ml af OPD i citratpuffer sammen med 4 ml 35% hydrogenperoxid per 10 ml puffer) tilsat.

Hydrogenperoxidet blev tilsat lige forud for tilsætning af substrat til brøndene. Disse plader blev inkuberet i 8 min. på en omryster, og reaktionen blev stoppet ved at tilsætte 5 100 μΐ 0,1M natriumfluorid til hver brønd. I nærværelse af peroxidase-konjugerede an- H tistoffer bliver substratet mørkegult. Optisk densitet eller farveintensitet, som er pro- portionalt med mængden af indfanget gpl 20, blev aflæst på en pladeaflæser ved 450 nm, og der blev konstrueret en standardkurve iberegnet koncentrationer af ukendt ma- teriale. Mængden af gpl 20 i supematantkulturen blev bestemt ved sammenligning med 10 denne standardkurve.

Beskrivelsen ovenfor og eksemplerne beskriver fuldt ud opfindelsen, herunder fore- trukne udførelsesformer derfor. Modifikationer af de beskrevne fremgangsmåder, f.eks.

I anvendelse af andre afkortede gp 160/gp 120-sekvenser, som er åbenlyse for fagfolk in- I 15 den for området af molekylærgenetik og beslægtede videnskaber, er tilsigtet at falde I inden for rammerne af de følgende krav.

/

Claims

27 I PATENTKRAV I

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et HIV-protein i Drosophila-celler, kendetegnet I 5 ved, at den omfatter dyrkning i et egnet medium af Drosophila-celler, som er transfice- I ret med en HIV-proteingenekspressionsenhed, hvilke celler er i stand til at udtrykke I I proteinet, og hvor HIV-proteingenekspressionsenheden omfatter gpl20- eller gpl60- I I DNA-kodningssekvensen for proteinet og et regulatorisk element, som er nødvendigt I I for transkription afkodningssekvensen og translation i en Drosophila-celle. I I 10 I

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det regulatoriske element om- I I fatter en actin 5C-promotor eller en Drosophila-metallothioneinpromotor. I

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at DNA-kodningssekvensen om- I I 15 fatter HIV-DNA-kodningssekvensen, som er til stede i pgpl60A32, pgpl20FA32, I I pgpl20A32 eller pgpl20A274. I

4. HIV-gpl20- eller HIV-gpl60-protein, kendetegnet ved, at det er produceret ved I fremgangsmåden ifølge krav 1. I I 20 I

5. Fremgangsmåde til fremstilling af et HIV-protein i dyrkede Drosophila-celler, ken- I detegnet ved, at den omfatter transfektion af Drosophila-celler med en HIV-protein- I , genekspressionsenhed omfattende gpl20- eller gpl60-DNA-kodningssekvensen og en selektionsmarkør, og dyrkning af cellerne i et egnet medium og under sådanne betin- I 25 gelser, at proteinet udtrykkes.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at cellerne er transficeret med en I første vektor indeholdende kodningssekvensen for hygromycin B phosphotransferase I og en anden vektor indeholdende kodningssekvensen for en HIV-proteingenekspressi- I 30 onsenhed. I DK 175461 B1 I 28

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at den første vektor er pCOHY- I GRO.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at den anden vektor omfatter en I 5 HIV-genekspressionsenhed, som er til stede i pgpl60A32, pgpl20FA32, pgpl20A32 I eller pgpl20A274.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at Drosophila-celleme er D. mela- nogaster S2-celler. 10

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at S2-celleme cotransficeres med H vektoren pCOHYGRO og en vektor omfattende en genekspressionsenhed, som er til I stede i pgpl60A32, pgpl20FA32, pgpl20A32 eller pgpl20A274. I I 15