JPS63287487A - Ｂ型肝炎ウィルスの複製を可能とする新規な培養細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ・　〈産業上の利用分野〉 この発明は、例えばヒト肝細胞癌由来の培養細胞に、Ｂ
型肝炎ウィルスの複製に必要な転写単位を含むＢ型肝炎
ウィルスＤＮＡ断片が組込まれた組換プラスミドを導入
し培養することによって、ヒト血液中にみられるものと
同一の感染性のＢ型肝炎ウィルス粒子をインビトロで複
製させる系を確立することに関する。

（従来の技術および発明が解決しようとする問題点〉 Ｂ型肝炎ウィルス（以下ＨＢウィルス、ウィルス粒子又
は単にウィルスという）の感染によって起る肝臓病は、
急性肝炎、慢性肝炎、劇症肝炎、肝硬変と多様である。

更に、ＨＢウィルスの持続感染と肝細胞筋の発生が密接
に関係している。ＨＢウィルスに起因する病態について
遺伝子レベルでの解析、肝炎の発症、肝発癌とウィルス
感染の因果関係等を明らかにするための分子生物学的研
究には培養細胞を用いてのウィルス感染増殖系が確立さ
れる必要がある。ところがＨＢウィルスはヒトおよびチ
ンパンジー個体にのみ感染し増殖するというごく限られ
た宿主特異性を示すことが知られている。現在まで培養
細胞を用いた感染増殖実験が数多く試みられてきたが全
て失敗に終ってきた。

く問題点を解決するための手段〉 本発明者らは、前記問題点を解決すべく種々研究してき
たところ、ＨＢウイスルの遺伝子を再構築し、これをベ
クターを介して直接培養細胞にとり込ませることにより
ＨＢウィルスを複製可能な組換プラスミドが得られるこ
とを見い出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は複製開始点と薬剤耐性選択マーカー
を含む大腸菌プラスミドベクターのクローニング部位に
、３．６Ｋｂ　ＲＮＡ　（プレゲノム）合成の鋳型とな
るＤＮＡ領域、エンハンサ−および遺伝子発現領域から
なる転写単位を少なくとも一つ含むＢ型肝炎ウィルスＤ
ＮＡ断片が組込まれていることを特徴とする閉環状の組
換プラスミドおよびこれを含むヒト肝細胞癌又ははヒト
胚芽細胞癌由来の培養細胞を提供するものである。

以下にその解決手段を詳細に説明する。

（１）ＨＢウィルスＤＮＡ Ｂ型肝炎患者血清から得られる感染性のウィルス粒子に
は、約３２００ｂｐの一部一本娘部分を含む環状２本＄
１　Ｄ　Ｎ　Ａが含まれる。このＨＢウィルスＤＮＡ（
以下ＨＢＶ−ＤＮＡ）に存在する唯一の制限酵素部位は
ＸｈｏｌおよびＢａｍＨ１部位であり、通常これらの制
限酵素で処理したゲノム全長のＸｈｏｌ或いはＢａｍＨ
１断片を大腸菌系プラスミドベクターにクローニングし
て組換材料に供する。その調製方法は公知であり概路次
の手順で行われる。ＨＢｓ抗原陽性かっ）ＩＢｅ抗原陽
性の供血者の血液中に含まれるウィルス粒子を常法によ
り分離する０次に内在性ＤＮＡポリメラーゼにより完全
な環状２本鎖に修復したのち単一の切断点を持つ制限酵
素、例えばＢａｍＨ１により切断しプラスミドベクター
の同一酵素部位に組込みこれを大腸菌によりクローニン
グして増幅し後述の組換プラスミドの構築に供する。

（２）組換プラスミドの構築 本発明の第一の特徴である組換プラスミドは次のように
して構築される。

ゲノム全長のＨＢＶ−ＤＮＡ断片を含むプラスミドベク
ターを常法により宿主大腸菌から抽出精製し、　Ｂａｍ
Ｈ１又はＸｈｏｌでＨＢＶ−ＤＮＡ断片を切り出す。第
１図にこれらＨＢＶ−ＤＮＡ断片の遺伝子構成と転写さ
れるｍＲＮＡの配置を示す。ｓ、ｃ、ｐおよびＸは翻訳
可能な構造遺伝子を示す。Ｓ遺伝子の上流にはｐｒｅ−
３１、ｐｒｅ−３２と呼ばれる領域が同じフレームで存
在しており、Ｃ遺伝子の上流にもｐｒｅ−Ｃと呼ばれる
領域が同じフレ−ムで存在している。主たる転写物のう
ち３．６　Ｋｂ　ＲＮＡではＣ遺伝子のＮ末端に近接し
た位置に転写開始点が、また２、２ＫｂＲＮＡではＳ遺
伝子上流のｐｒｅ−Ｓ領域に転写開始点が存在する。ｐ
Ｏ１ｙＡ付加点はゲノム上１カ所しかないことが明らか
にされている。

３．８　Ｋｂ　ＲＮＡはプレゲノムＲＮＡとも称され、
ウィルス複製のさい逆転写酵素により（−）　鎖Ｄ　Ｎ
　Ａへ転写されさらにＤＮＡポリメラーゼにより（＋）
！ｊｌＤＮＡが形成され、コア蛋白、外被蛋白で覆われ
ウィルス粒子となる。

本発明の組換プラスミドを構築する場合に用いるゲノム
全長のＨＢＶ−ＤＮＡ断片は第１図から分るように３．
６　Ｋｂ　ＲＮＡの鋳型となるＤＮＡ領域ががＢａｍＨ
１部位或いはＸ　ｈａ　１部位で分断されている０本発
明の第一の特徴は３．６ＫｂＲＮＡの鋳型となるＤＮＡ
領域、エンハンサ−および遺伝子発現領域からなる転写
単位について、Ｂａｗｌ　１断片或いはＸｈｏｌ断片を
材料としてＨＢＶ−ＤＮＡ断片を再構築することにある
。なお転写活性を上昇させるエンハンサ−領域はＣ遺伝
子の上流的４５０ｂｐの位置にあるとされている。

本発明の第一の態様によれば、上述の転写単位を含むＨ
ＢＶ−ＤＮＡ断片が、単一の切断点をもつ制限酵素（Ｂ
ａａ）Ｉ　１およびＸｈｏｌ）により切り出されたゲノ
ム全長のＨＢＶ−ＤＮＡ断片を複数個−列に連結した状
態で大腸菌系プラスミドベクターのクローニング部位に
組込まれた組換プラスミドである。この場合複数個のＨ
ＢＶ−ＤＮＡ断片を一列に連結するのに方向性を考慮す
ると転写単位を順方向に完結したＨＢＶ−ＤＮＡ断片が
得られる０本発明に用いられる大腸菌系プラスミドベク
ターは大腸菌を宿主（例えばＥ、ｃｏｌｌｚｌ）ＩＢ、
　Ｅ　、ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１）とし宿主細胞中で複
製可能な複製開始点と薬剤耐性選択マーカーを含みクロ
ーニング部位としてＢａ■Ｈ１又はＸｈｏ１部位をもつ
ものが望ましい。具体的にはＥＫ２ベクターとして現在
量も多用されているｐＢＲ３２２がクローニング部位と
してＢａｍＨ１部位をもち、その詳細な制限酵素切断地
図がつくられ全塩基配列も決定されているので好適であ
る。このベクターはアンピシリンおよびテトラサイクリ
ン耐性遺伝子を有し、前述のＢａｍＨ１部位はテトラサ
イタリン部位に存在する。Ｘｈｏ１部位をクローニング
部位としてもつベクターとしてはｐｃ　Ｒ１或いはｐＫ
Ｃ７等がある。

本発明の好適な態様はＨＢＶ−ＤＮＡのＢａｍＨ１又は
Ｘｈｏｌ断片がそれぞれの部位で２分子が順方向に一列
に連結（今後タンデム配置という）された状態でベクタ
ーに組込まれたものである。これらをクローニング部位
に含む組換プラスミドの作成手順は次の通りである。

プラスミドベクターｐＢＲ３２２のＢａｍＨ１部位或い
はｐｃ　Ｒ１のＸｈｏ１部位にクローニングされている
ゲノム全長のＨＢＶ−ＤＮＡ断片をそれぞれの同一酵素
で切り出しタンデム配置の２量体）ＩＢＶ−ＤＮＡ断片
を構築するための材料とする。一方ベクターｐＢＲ３２
２或いはｐｃ　Ｒ１を同様にＢａｍＨ１或いはＸｈｏｌ
で開裂し、開裂部位のリン酸基をアルカリ性ホスファタ
ーゼ処理で除去し本発明の組換プラスミドベクターの材
料に供する０次にベクターに対し過剰のＨＢＶ−ＤＮＡ
断片（ＢａｍＨ１又はＸｈｏｌ断片）と開裂処理済のベ
クターＤＮＡ　（ｐＢＲ３２２又はｐｃ　Ｒ１）とをＴ
４ＤＮＡリガーゼの存在下反応させる。この時の反応分
子数比はＨＢＶ−ＤＮＡ３　：べ’）ター〇ＮＡ　１が
好ましい、この反応液をカルシウム処理したＥ、ｃｏｌ
ｉ　ＨＢ　１０１或いはＥ　、ｃｏｌｉ　ｚ　１７７６
株に取り込ませて、ＢａｍＨ１の場合はアンピシリンを
含む寒天プレート上にまいて一装置くとプラスミドを含
むアンピシリン耐性の大腸菌のコロニー（形質転換菌）
が多数出現してくる。このコロニーの中からいくつかを
選びそれぞれのプラスミドＤＮＡを調製し種々の制限酵
素によってこれらプラスミドＤＮＡを切断し得られたＤ
ＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にかけて分析し目的
のタンデム配置の２量体ＨＢＶ−ＤＮＡを含む組換プラ
スミドを得る。以上各段階に用いた遺伝子操作技術およ
びクローニング技術は公知である。このようにして得ら
れるタンデム配置の２量体ＨＢＶ−ＤＮＡ断片の転写単
位以外の非本質的な部分を欠失しているＨＢＶ−ＤＮＡ
断片も本発明の技術思想から本発明に包含される。たと
えば、タンデム配置の２量体ＨＢＶ−ＤＮＡのうち転写
単位下流の余分なりＮＡ配列部分は除去可能である。

次に本発明の第二の態様によれば組換プラスミドに組込
むＨＢＶ−ＤＮＡ断片は本質的に必要な転写単位以外の
余分な部分をなるべく除いたものである。この態様によ
ればベクターＤＮＡに組込まれる）ＩＢＶ−ＤＮＡ断片
の長さが短くなる利点があるが作成の操作手順はタンデ
ム配置の場合より複雑である。

ベクターに組込むＤＮＡの構築に供されるＨＢＶ−ＤＮ
Ａは３．６Ｋｂ　ＲＮＡの鋳型の約３７４以上の長さを
含むＢａｍＨ１断片が好ましく、ＢａｍＨ１部位を含み
かつその両サイドの近傍に平滑末端を生じさせる制限酵
素部位、例えばＳｔｕ１部位を各々１ケ所有するひと続
き（ＤＨＢＶ−ＤＮＡ断片（例えばＸｈＯ１断片或いは
前述のＢａｍＨ１タンデム配置）が用いられる。本発明
の好適な態様を以下に記述する。

ＨＢＶ−ＤＮＡのＸｈｏｌ断片又はＢａｍＨ１断片のタ
ンデム配置の２量体から約０．９Ｋｂの５ｔｕＩ断片（
平滑末端を生ずる）を切り出す。該断片は上流末端から
約２９０ｂｐのところにＢａｍＨ１部位が、また下流末
端から約３ｏｂｐ以上のところにＢｇ１ＩＩ部位が各々
１ケ所存在す葛、この断片をベクターｐＢＲ３２２のＢ
ａｍＨ１部位に組込むためにａｂｐの８ｇ１ＩＩＤＮＡ
リンカ−をつないだのち同酵素で消化し、上流末端のＳ
ｔｕ　Ｉ部位をＢａｍＨ１付着末端に相補的な末端に変
化させ下流末端のＢｇｌ１１部位を切断させて同様の相
補的末端を生じさせる。こうして得られたＨＢＶ−ＤＮ
Ａ断片をアルカリ性ホスファターゼ処理済のｐＢＲ３２
２のＢａｍＨ１部位に組込む。この組込みの結果ｐＢＲ
３２２由来のＢａｍＨ１部位は消失し組込まれたＨ　Ｂ
Ｖ−ＤＮＡ断片の有する　Ｂａｍ８１部位のみとなる。

この組換プラスミドをＢａｍＨ１で開裂し、同様にアル
カリホスファターゼで処理したのちゲノム全長のＨＢ　
Ｖ　−Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｂａａ＋Ｈ１断片を組込む、このよ
うにして得られた組換プラスミドを前記と同様にカルシ
ウム処理したＥ、ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１或いはＥ　、
ｃｏｌｉ　ｚ　１７７６株に取り込ませ、アンピシリン
を含む寒天プレートに上にまいて一装置くとプラスミド
を含むアンピシリン耐性の大腸菌のコロニーが多数出現
してくる。このコロニーの中からいくつかを選び前記と
同様な方法により１コピーの転写単位を含むように再構
築された）ＩＢＶ−ＤＮＡ断片が組込まれている組換プ
ラスミドを同定した。

（３）閉環状組換プラスミドの調製 組換プラスミドを保持する大腸菌（ＨＢＩＯＩ）から閉
環状プラスミドを公知の方法で調製する。

本発明では純度の高いプラスミドＤＮＡが得られるエチ
ジウムプロミド存在下の平衡密度勾配遠心法を用いて閉
環状組換プラスミドを調製し、後述の培養細胞への導入
に用いる。

（４）培養細胞への組換プラスミドの導入用いた細胞は
ヒト肝細胞癌又は、ヒト胚芽細胞癌由来の株細胞である
。例えばヒト肝細胞癌由来のものとしてはＨｕＨ−７（
文献２）、ヒト胚芽細胞癌由来のものとしてはＨｅｐＧ
　２（文献５）などが使用し得る。

これらの培養細胞への組換プラスミドの導入（以下ＤＮ
Ａ感染又は単に感染という）方法としてはリン酸カルシ
ウム共沈法（文献７）が用いられる。この方法は特別の
機器を必要とせず簡便に行え、しかも一時に多くの細胞
が扱えることから本発明に好適である。

培養細胞に感染した前記第一の態様および第二の態・様
の組換プラスミドはレプリコンとして独立に複製できな
いが比較的安定に細胞内に存在し長時間感染性のウィル
ス粒子を培地中に放出する。これを一時的形質発現（ｔ
ｒａｎｓｉｅｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）という、こ
の一時的形質発現を利用している点が本発明の第二の特
徴である。

〈発明の効果） 本発明者らが新しく開発したＨＢウィルスの複製系はい
くつかの優れた特徴をもつ。

第一に、その方法がきわめて簡便でかつ短時間にウィル
ス粒子の複製を観察できる点があげられる。したがって
これまで増殖系がないために実験的に制約されていた抗
ウィルス剤のスクリーニングの有力な手段となることが
考えられる。

第二に、この実験系では外から感染導入するＨＢＶ−Ｄ
ＮＡを人為的に操作してそのウィルス複製に対する影響
を解析で縫る点で画期的である。これによって）ＩＢウ
ィルスの各構造遺伝子および調節領域の機能の解析が進
展するものと期待される。

第三に、ＨＢＶ−ＤＮＡ（７）細胞ＤＮＡへ（７）組込
みに関してこれまではヒトの組織から得られた組込み型
ＨＢＶ−ＤＮＡの構造解析だけに限定されていたが、こ
のようなインビトロ増殖系の開発によフて）ＩＢＭ−Ｄ
ＮＡの組込みのメカニズムの問題も直接解析できる可能
性が開けたといえる。

〈実施例〉 以下に本発明を実施例に基づいてさらに具体的に説明す
る。

実施例に使用する記号および反応液の意義は次の通りで
ある。

反応液（１）　　１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，５）
。

１　０　ｍＭ　　ＭｇＣｊ！　２．５０　ａＭ　　Ｎａ
Ｃｌ２　。

１　ｍＭジチオスレイトール 反応液（２）５０ａ１Ｍトリスー塩酸（ｐＨ７，５）　
。

５　ｍＭ　ＭｇＣｆ　２．５　ｍＭジチオスレイトール
、１ｍＭアデノシン三リシリ ン酸液（３）６６ｍＭトリス−塩酸（ＰＨ７，５）。

１ｍＭアデノシン三リシリン 酸　０ｍＭ　ＭｇＣｆＬ２．１５ｍＭジチオスレイトー
ル、　０．２ｍｇ／　ｍｊ２ゼラチンＥＤＴＡ　　エチ
レンジアミン四酢酸 ＨＥＰＥＳＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′
−２−エタンスルホン酸 ＳＤＳ　　　ドデシル硫酸ナトリウム ＭＯＰＳ　　３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン
酸 実施例１　　　ｐＨＢＶ−ｄｉｍｅｒの調製ＨＢＶ−Ｄ
ＮＡの供与体としてはサブタイプａｄｒ型ＨＢＶ−ＤＮ
ＡのＢａｍＨ１断片をプラスミド　ｐＢＲ３２２のＢａ
ｍＨ１部位にクローン化したＩ）ＨＢＶＩ−ｔ（文献１
）を用いた。

ｐＨＢＶｌ−Ｉ　ＤＮＡ　　１０７．ｔｇを含む５０μ
ｍの反応液（１）　に２０単位のＢａｍＨ１を加え３７
℃で１時間反応させた。この反応液をそのまま１％アガ
ロースゲルのサンプル穴に移し、４Ｖ／ｃ＋ａ一定電圧
で２時間電気泳動を行った。

泳動用緩衝液は４０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８，３）、
２０＋ａＭ酢酸ナトリウム、　　２ｍＭ　ＥＤＴＡ　Ｎ
ａｓである。泳動終了後ゲルを０．５μｇ／ＩＩＩｆｌ
のエチジウムプロミドを含む泳動用緩衝液中で染色し、
ｐ）Ｉ　Ｂ　Ｖ　１−１から切り出したＢａｍＨ１断片
を確認した。このＢａｗｌ（１断片を含むゲル片をカミ
ソリで切り出し電気泳動抽出緩衝液（５ｍＭトリス−塩
酸（ｐ）１８．０）　）を入れた透析チューブ内に封入
し前記抽出緩衝液の入った泳動槽中で１５Ｖ／ｃｍの一
定電圧を１時間かけＢａｍＨ１断片をチューブ内の［Ｔ
液中に抽出した。チューブ内のＢａｍＨ１断片を回収し
フェノール抽出１回、エタノール沈澱を３回くりかえし
て混入物を除去しＨＢＶ−ＤＮＡのＢａｍＨ１断片３ｕ
ｇを得た。

次にＢａｍＨ１部位で゛開裂されその５′末端のリン酸
基の除去されたＢａｍＨ１消化ｐＢＲ３２２ＤＮＡを以
下のようにして調製した。ｐＢＲ３２２５μｇを含む反
応液（１）にＢａｍＨ１１０単位を加えて３７℃で１時
間反応させた０反応終了後５０μにの蒸留水を加えて倍
に希釈し、アルカリ性ホスファターゼ（Ｅ、ｃｏｌｉ　
Ａ　１９由来）０．０８単位を加えて６５℃で１時間反
応させＢａｍＨ１切断個所における５′末端のリン酸基
を除去した。　０．２５Ｍ　ＥＤＴＡ　　１０μ互を加
えて反応を停止させた後、フェノール抽出１回、エタノ
ール沈澱を３回くり返してホスファターゼ処理済のｐＢ
Ｒ３２２のＢａｍＨ１断片を４８Ｍ得た。

次に前記のＢａｍＨ１断片１．ＩＪＪｇとＢａｍＨ１消
化ｐＢＲ３２２ＤＮＡ　０．５μｇ　（分子数比３：１
）とを含む５０μｍの反応液（２）に７４ＤＮＡリガー
ゼ（３５０単位／μｍ宝酒造）０．１μｍを加えて１２
℃で１６時間反応させた。この反応液の一部をＭａｎｄ
ｅｌらの方法（文献１２）によりカルシウム処理した大
腸菌Ｈ８１０１株にＤＮＡ感染させ、その大腸菌をアン
ビシリナトリウムを５０Ｍｇ／ｍＪｌの濃度で含む寒天
プレート（１，５％バクトアガーを含むＬＢ培地）上に
まき３７℃で一晩培養した。

出現した多数のアンピシリン耐性に形質転換したコロニ
ーからいくつかを選び、各々の大腸菌のプラスミドＤＮ
Ａを調製しこれらのプラスミドＤＮＡを各種の制限酵素
（ＢａｍＨＬ　。

ＥｃｏＲ１、Ｘｂａｌ等）で切断し、得られたＤＮＡ断
片をアガロース電気泳動で解析する。

切断地図を作成することによって、ＨＢＶ−ＤＮＡのＢ
ａ■Ｈ１断片が２分子タンデムに並んで組込まれた目的
の組換プラスミドを同定し、これをｐＨＢ　Ｖ　−ｄｉ
ｍｅｒと名付けた。その模式図を第２図に示す０図中Ｂ
はＢａｍＨ１切断部位を、ＥはｐＢＲ３２２のＥｃｏＲ
１切断部位を示す。また、Ｘ、　Ｃ，ｐｒｅ　Ｓ、およ
びＳはＨＢＶ−ＤＮＡの構造遺伝子を示す。

次に前記ｐＨＢ　Ｖ　−ｄｉａｐｅｒを保持する大腸菌
株からのｐＨＢ　Ｖ　−ｄｉｍｅｒの調製は以下のよう
にして行った。該大腸菌株をＬＢ培地（バクトドリブト
ン１０ｇ、酵母エキス５ｇ％ＮａＣｆ５ｇを水ｔｆＬに
溶かしたもの、ＤＨ７，２）中で、波長６００　ｎｍに
おける吸光度が約０．８になるまで３７℃で振とう培養
した。その時点で１１当り１８０ｍｇのクロラムフェニ
コールを加えてさらに１２〜１４時間３７℃で振とう培
養した。培養終了後遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分
）により集菌した。得られた大腸菌を溶菌用の１ＩＩ街
液（５０ｍＭトリス−塩酸（ｐ）１８．０）、６２．５
ｍＭ　ＥＤＴＡ。

１％Ｂ　ｒｉｊ　５８　、０．３ｍｇ／　ｍｌｌリゾチ
ーム）中に懸濁し３７℃で８分間処理した後、遠心分離
（３００００ｒｐｍ、　３０分）してプラスミドを含む
上清を得た。この上清をフェノール処理して除タンパク
を行い、さらに５０Ｍｇ／ｍｌ！のＲＮａｓｅＡを加え
て３７℃で１時間処理しＲＮＡを分解した。次にこの溶
液に最終濃度がＩＭのＮａＣＪ！と１０％のポリエチレ
ングリコールを加えて０℃で２時間静置した。これを遠
心分ｌ！ＩＩ　（１００００ｒｐｍ。

３０分）してプラスミドＤＮＡを含む高分子のＤＮＡの
みを沈澱させた。この沈澱を緩衝液（２０１Ｍトリス−
塩酸、　（ｐＨ７，５）、０．１ｍＭ　ＥＤＴ＾〕に溶
解してフェノール抽出によりＲＮａｓｅＡを除いた後、
溶液１　ｔａｉｌ当り０．９５　ｇのＣ５ＣｆＬと０．
２Ｂのエチジウムプロミドを加えた。これを遠心分ＩＩ
　（３５０００ｒｐｍ、　４０時間）してスーパーコイ
ル状のプラスミドＤＮＡを分画した０分画後Ｃ５ＣＡと
エチジウムプロミドを除きエタノール沈澱によってｐＨ
Ｂ　Ｖ−ｄｉｎｎｅｒ　Ｄ　Ｎ　Ａを回収した。このよ
うにして得られたｐＨＢ　Ｖ　−ｄｉｍｅｒ　Ｄ　Ｎ　
Ａをそのまま後述の培養細胞へのＤＮＡ感染実験に用い
た。

実施例２　　ｐＨＢＶ−２の調製 実施例１で得たｐＨＢ　Ｖ−ｄｉｍｅｒ　Ｄ　Ｎ　Ａ　
３０Ｍｇを含むｔｏｏμｎの反応液（１）に５ｔｕＩ３
０単位を加えて３７℃で２時間反応させた。

反応後実施例１の方法と同様にして１％アガロースゲル
電気泳動にかけて得られた約０．９ＫｂｐのＳｔｕ　Ｉ
断片を含むゲル片から電気泳動抽出法によフて５ｔｕｌ
断片を抽出しフェノール抽出とエタノール沈澱を行って
混入物を除去し５ｔｕＩ断片１．５μｇを得た。

このＳｔｕ　Ｉ断片０．４μｇと５′末端をリン酸化し
た８ｇ１ＩＩリンカ−ＤＮＡ　（宝酒造）１．０μｇと
を含む２０μｍの反応液（３）　に７４ＤＮＡリガーゼ
（３５０単位／μｊ２）０．５μ℃を加えて１２℃で１
６時間反応させた。

０．２５ＭＥＤＴＡ　　２μ℃を加えて反応を停止しフ
ェノール抽出１回、エタノール沈澱を３回くり返して８
ｇ１ＩＩリンカ−ＤＮＡの連結した５ｔｕｌ断片を得た
。この５ｊｕｌ断片を１００μｍの反応液（１）に溶解
してＢｇｌｌ１２０単位を加えて３７℃で２時間反応さ
せた。０．２５ＭＥＤＴＡ　　１０μｍを加えて反応、
を停止させた後、フェノール抽出とエタノール沈澱によ
って両端にＢｇ１ＩＩの切断個所をもったＯ４０　Ｋ　
ｂｐのＢｇ１ＩＩ断片を得た。

このＢｇ１ＩＩ断片全量と実施例１と同様の方法で調製
したＢａｍＨ１消化ｐＢＲ３２２ＤＮＡ０．５μｇとを
含む５０μＡの反応液（２）　に７４ＤＮＡリガーゼ（
３５０単位／μｊ２　）　０．１μＡを加えて１２℃で
１６時間反応させた。この反応液を実施例１と同様の方
法でカルシウム処理した大腸菌Ｈ８１０１株にＤＮＡ感
染させアンピシリン含有培地に出現した多数のコロニー
からいくつかを選びプラスミドを調製し各種制限酵素（
ＢａｍＨ１、ＥｃｏＲ１、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ。

Ｄｒａｌ等）による切断地図を作り検討した結果、０．
８７　Ｋ　ｂｐのＢｇ１ＩＩ断片がｐＢＲ３２２のＢａ
ｍＨ１部位に挿入されたプラスミドを同定しこれをｐｉ
（ＢＶＸ−１と名付けた。

このｐＨＢＶＸ−Ｉ　ＤＮＡ５μｇ’を含ム５０μｍの
反応液（１）にＢａ＋ｓＨ１１０単位を加えて３７℃で
１時間反応させた後、蒸留水５０μＬ加えて倍に希釈し
、実施例１と同様の方法でアルカリ性ホスファターゼを
作用させフェノール抽出、エタノール沈澱によってＢａ
ｗｌ（１消化ｐＨＢＶＸ−ＩＤＮＡ３μｇを得た。

このｐＨＢＶＸ−ＩＤＮＡ１８ｇと実施例１の方法によ
り得たＨＢＶ−ＤＮＡ＋７）ＢａｍＨ１断片０．６μｇ
とを含む５０μｍの反応液（２）　に７４ＤＮＡリガー
ゼ（３５０単位／μＡ）　　０．１μｍを加えて１２℃
で１６時間反応させた。この反応液を実施例１と同様な
方法でカルシウム処理した大腸菌１（８１０１株にＤＮ
Ａ感染させアンピシリン含有培地に出現した多数のコロ
ニーからいくつかを選んでプラスミドを調製し、各種制
限酵素（Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ、　　ＢａｍＨ１、Ｘｂａｌ
等）による切断地図を作成し検討した結果、ｐｉ（ＢＶ
Ｘ−１のＢａｍＨ１部位に３．２　ＫｂｐのＨＢＶ−Ｄ
ＮＡのＢａｍ）（１断片が挿入されており、しかもその
遺伝子の配置の方向性が＄１）ＩＢＶＸ−１中１７）　
０．８７　Ｋ　ｂｐのＨＢＶ−ＤＮＡのそれと同一であ
るものを見い出しこれをｐＨＢＶ−２と名づけた。その
構造の模式図を第３図に示す。図中ＢはＢａｌｌ１ｌ　
１切断部位を、ＥはｐＢＲ３２２のＥｃｏＲ１切断部位
を示す。

またＸ、　Ｃ，ｐｒｅ　ＳおよびＳはＨＢＶ−ＤＮＡの
構造遺伝子を示す。

ｐＨＢＶ−２ＤＮＡを保持する大腸菌株からのｐＨＢ　
Ｖ　−２の調製は実施例１と同じ方法で行った。

実施例３　培養細胞への組換プラスミドＤＮＡ感染 （１）細胞と培養条件 用いたヒト由来の６種類の培養細胞のうちＨｅＬａ細胞
以外はすべて肝由来の細胞である。

ＨｕＨ−７（文献２参照）、ＨＬＥＣ−１（文献３参照
）とｈｕＨ２−２（文献４参照）の３種は肝細胞癌由来
の細胞でｈｕＨ２−２にのみＨＢＶ−ＤＮＡの組み込み
が認められる。

ＨｅｐＧ２（文献５参照）は胚芽細胞癌由来であり、Ｈ
ＢＶ−ＤＮＡの組込みはない、ざらにｈｕＬ−１（文献
６参照）は正常ヒト胎児肝から樹立された細胞株である
。その他ヒト以外の細胞としてＮＩＨ３Ｔ３も試みた。

培養は、ＮＩＨ３Ｔ３以外は、ｉｏ％ＦＢＳ（仔牛脂児
血清）を含むＤＭ１６０（極東製薬工業■）培地で行フ
た。Ｎ　Ｉ　Ｈ３Ｔ３は１０％ＣＳ（牛血清）を含むＤ
ＭＥＭ　（日本製薬■）培地を使った。３７℃５％Ｃ０
２の条件下で培地交換（８〜１０ＩｌｆＬ／φ１００ｍ
ｌ１１プレート）は３日ごとに行った。

（２）ＤＮＡ感染 培養細胞へのｐｌ（Ｂ　Ｖ　−ｄｉｍｅｒの感染にはリ
ン酸カルシウム共沈法（文献７参照）を用いた。感染の
前日（２４時間前）に細胞を３〜５×１０６細胞数／φ
１１００ａプレートの密度でまいておき当日感染の２時
間前に培地交換をしておく、　　ｐＨＢＶ−ｄｉｍｅｒ
　ＤＮＡとリン酸カルシウム共沈澱の調製法は次の通り
である。１０ＭｇのｐＨＢ　Ｖ−ｄｉｍｅｒ　Ｄ　Ｎ　
Ａをエタノール沈澱によりペレットにして乾燥後１８７
．５μｌの滅菌水に溶解する。これに２５０μｍの２倍
濃度の）ＩＢＳ溶液（１倍濃度は水ＩＪＺ中に８．Ｏｇ
　ＮａＣｊ！　、　０．３７ｇ　ＫＣｆ　。

０．１２５ｇ　ＮａＪＰＯ４，ｔ、ｏｇデキストローズ
。

５、ＯｇＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓを含む、　ｐＨは７．０５に
調整後フィルター滅菌する）を加えて室温におく、この
ＤＮＡ溶液に６２．５ＪＪ　ｎのＩ　Ｍ　ＣａＣＩｔ　
２溶液（滅菌済）を加えて即攪拌し室温で１０〜１５分
間静置する。うずく白濁した沈澱溶液を培養プレート中
に均一に滴下してそのまま培養器中で培養を続ける。約
６時間後プレートから培養液を吸引して除き、１０％グ
リセリンを含むＤＭ１６０培地を５　ｆｆ１Ｌ加えて室
温で約３分間放置する。その後グリセリン溶液を除き５
　ｍＩｌのＰＢＳによる洗浄を２回くり返してから新し
い培養液と交換して培養を４〜５日間続ける。

（３）ＲＮＡの調製とプロットハイブリダイゼーション 前記７種の培養細胞を用いてｐＨＢＶ−ｄｉｍｅｒの感
染を行い各細胞におけるＨＢＶ−ＤＮＡ＋７）発現効率
を、ＨＢＶ−ＤＮＡの＋＊ＲＮＡ転写効率を指標に検討
した。

感染後のＲＮＡの調製はグアニジニウム／塩化セシウム
法（文献８参照）を用いて行なった。感染後の３日目の
細胞を集め２．５ｍｊ２のグアニジウム溶液（４Ｍグア
ニジウムチオシアネート、５ｍＭクエン酸ナトリウム、
０．５％ラウリルサルコシン酸ナトリウム、０．１％β
−メルカプトエタノール）を加えて激しく攪拌して蛋白
を変性させる。この溶液に１ｇのＣｓ（：Ｊ２を加えて
溶解しベックマンＳ　Ｗ　５０．１の遠心管（滅菌済）
に入れた２ｆｉｌｆｔの５．７Ｍ　Ｃ５Ｃｊ！　、　　
１００　ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液（滅菌済）の上に重層して
遠心分１ｍｌ　（３５０００ｒｐｍ、　１４時間）した
、遠心後ＲＮＡは管底に沈澱するがＤＮＡおよびタンパ
ク質は浮遊するので、上清部分を丁寧に除き７０％エタ
ノールで沈澱を乱さないようにまわりを洗う。次に緩衝
液（０，１％ドデシル硫酸ナトリウム、１０ｍＭトリス
−塩酸（ｐＨ７，５）、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　）に溶解
し、等量のクロロホルム／ｎ−ブタノール（４：１）を
加えて再抽出を行う。水層部分を回収しエタノール沈澱
をくり返してＲＮＡ分画を得た。

ＲＮＡの電気泳動は２．２Ｍホルムアルデヒドを含む１
％アガロースゲルで行った。泳動用＆ｌｌ液液組成は０
．０２Ｍ　Ｍ　ＯＰ　Ｓ　（ｐＨ７，０）。

５ＩＩＩＭ酢酸ナトリウム、　０．５ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ
　Ａである。泳動前のＲＮＡサンプルの変性にはＲＮＡ
溶液４．５μｍに２μｌの１００倍濃泳動用緩衝液、３
．５μｍのホルムアルデヒド。

１０μｌのホルムアミドを加えて６５℃で１５分間熱処
理した。泳動後ゲルをそのままニトロセルロース膜にプ
ロッティング（文献９参照）して８０℃で２時間処理し
た後、ＨＢＶ−ＤＮＡプローブ（後述）でハイブリダイ
ゼーションを行った。

ＨＢＶ−ＤＮＡプローブの調製はＨＢＶ−ＤＮＡのＢａ
ｍＨ１断片（ゲノム全長で３２１５ｂｐ）を用いてＲｉ
ｇｂｙらの方法（文献１３参照）に基くニックトランス
レーション法により３２Ｐ標識ＨＢＶ−ＤＮＡを作成し
た。

実験結果を表１に示すようにＨｕ）Ｉ　−７およびＨｅ
ｐＧ　２においてのみ効率の良いｍＲＮＡの発現が見ら
れた。ｉにＨｕ）Ｉ−７が最も効率が良かったことから
、　）ｌｕＨ−７細胞における）（ＢＶ−ＤＮＡの一時
的形質発現で実際にウィルスのコア粒子およびウィルス
粒子の合成が起きているかについて検討した。

表１ 細胞株　　　　　　　　ｐＨＢＶ−ｄｉｍｅｒ　ＤＮ＾
ＲＮＡ転写物 ３、［ｉＫｂ　　　（２，６Ｋｂ）　　　２．２ＫｂＨ
ｕＨ−７＋　＋　　　　（＋　）　　　　＋　＋ｈｕＨ
２−２±　　　　（＋）　　　　±ＨｕＬ−１−−− ＨｅｐＧ２　　　　　　＋　　　　　（＋　）　　　　
＋）ＩＬＥＣ−１−−− ＨｅＬａ　　　　　　　　　　　　　−−−ＮＩＨ３Ｔ
３　　　　　　　　　　−　　　　　　　　−　　　　
　　　　−各種培養細胞でのＨＢＶｍＲＮＡの発現＋＋
：強く検出される ＋　：明らかに検出される （＋）：検出されるがバンドかうすい ±　：バンドが不明瞭 −二検出されない （４）コア粒子およびウィルス粒子の調製調製はすべて
４℃で行った。コア粒子の調製は次のようにして行った
。ＤＮＡ感染の５日後の細胞をプレートから掻き取り遠
心して集めた。得られた細胞を２　　ｍｆｔの低張緩衝
液（２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，５）　。

５０　ｍＭ　ＮａＣＪｌ、　　５　ｍＭ　ＭｇＣＪ２２
．０．１％β−メルカプトエタノール、　Ｏ，ＳｍＭ　
Ｐ　Ｍ　Ｓ　Ｆ　）に懸濁して水中に１０分間装いた後
、Ｄｏｕｎｃｅ型ホモジナイザーでホモジナイズを行う
。ストロークの回数は核と細胞質の分離の程度を顕微鏡
で観察しながら決定する。ホモジナイズ後４０％庶糖溶
液０．５ｍｌを加えて溶液を等張にし遠心分＠　（２０
００ｒｐ＋ｏ、　１０分間）で核分画を除く、上清をさ
らに遠心分！Ｉ！　（１１００００ｒｐ。

２０分間）しミトコンドリア分画を除く、この上清画分
を、ベックマン５Ｗ５０．１の遠心管に入れた２、５Ｉ
ｌｆＬの３０％庶糖を含むＴＮＥ緩衝液（２０ｍＭトリ
ス−塩酸（ｐＨ７，５）　。

１５０ｍＭ　ＮａＣｆｔ、　　１　ｍＭ　　ＥＤＴ＾〕
の上に重層し３５０００ｒｐｍで１６時間遠心する。こ
の遠心による沈澱をＴＮＥＩＪｉ衝液に懸濁して粗コア
粒子分画とした。さらにこの分画を４．５ｍｆｔのＣ５
ＣＪｌ密度勾配（１，１ｇ／ｃｍ’　−１，６ｇ／ｃｍ
’）に上層し３５０００ｒｐｍで１８時間遠心して精製
する。

遠心後管底から１０滴ずつ分画し、各分画についてＨＢ
ｃ抗原／　ＨＢ　ｅ抗原の検出をアボットＨＢｅＲＩＡ
キット（ダイナボット■）で行った。

また各分画を透析後１％ＳＤＳと２　ｍｇ／ｍｆＬのブ
ロティナーゼＫ　（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ）で処理
し、１％アガロースゲル電気泳動にかけてからニトロセ
ルロース膜へのプロッティング（文献１０参照）を行っ
た。ＨＢＶ−ＤＮＡの存在はこの膜に対するＩ（ＢＶ−
ＤＮＡプローブのパイプリダイゼーションによって検出
した。

その結果、第４図に示すようにフラクションＮｏ１８か
ら２１にかけてＨＢＶ−ＤＮＡの複製中間体を伴ったコ
ア粒子の存在が認められた。その密度は１．３５〜１．
３６８／ｃｍ３（第５図）で通常血液中から得られるＨ
Ｂウィルスのコア粒子の値（文献１１参照）と一致した
。フラクションＮｏ２２から２３に認められる高いピー
クは）ＩＢＶ−ＤＮＡが伴わないことがらＨＢｃ抗原あ
るいはＨＢｅ抗原のみの凝集体と、考えられる。得られ
たコア粒子分画を電顕て観察すると第６図に示すように
直径約２７ｎｍのコア粒子の存在が確認された。

次に培地中に放出されたウィルス粒子の調製は次のよう
に行った。

培養液を遠心分＠　（３００００ｒｐｍ、　　１２時間
）し、ウィルス粒子画分を濃縮する。この遠心で得られ
た沈澱をＴＮＥ溶液によく懸濁した後、ベックマン５Ｗ
５０．１遠心管の２．Ｓｍ旦の庶Ｗ２０％を含むＴＮＥ
緩衝液の上に重層し遠心分離（３００００ｒｐｍ、　　
１６時間）した。この沈澱を少量のＴ　Ｎ　Ｅ　ｉｓ街
液によく懸濁して粗ウィルス粒子画分とした。精製は、
さらにこの両分を４．５ｍＩＬの（：ｓ（４密度勾配（
１１ｇ７ｃｍ３−１．８ｇ／ｃｍ３）に重層し３５００
０ｒｐｍで１８時間遠心をすることにより行った。１０
滴ずつ分画後、各分画についてオースリアＩＩキット（
ダイナボット■）でＨＢｓ抗原の検出を行う。またＨＢ
Ｖ−ＤＮＡの存在についてはコア粒子の場合と同様にパ
イプリダイゼーションを行った。その結果、第７図に示
すようにフラクションＮｏ２９を中心としてフラクショ
ンＮｏ２５か６３１にかけてＨＢＶ−ＤＮＡの存在が認
められ、それと一致してＨＢｓ抗原も検出された（第８
図）、ウィルス様粒子の密度は１２２ｇ／ｃｍ’　−１
，２４ｇ／ｃｍ’　　（第８図）で血液中にみられるも
のと同一のウィルス粒子（文献１１参照）が形成されて
い、ることが示された。電顕写真によっても第９図に示
すように約４２ｎｍのＨＢＢウイルス子が約２２ｎｍの
小さいＨＢｇ抗原粒子とともに存在していることが確認
された。

このようにＨｕＨ−７細胞にｐＨＢ　Ｖ　−ｄｉｎａｒ
を感染させ一時的形質発現させることによってＨＢＢウ
イルス感染したヒトあるいはチンパンジーの場合と同様
のＨＢウィスル粒子の合成が起きることが明らかになっ
た。この結果はｐＨＢＶ−２を用いても同じであった。

（文　献〉 １、　Ｋｏｂａｙａｓｈｉ、Ｍ、　＆　Ｋｏｉｋｅ、に
、（１９８４）　Ｇｅｎｅ　３０゜２２７−２３２゜ ２、　Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉ、Ｈ，、Ｔａｋｅｔａ、
に、、　Ｍｉｙａｎｏ、に・・Ｙａｍａｎｅ、Ｔ、　＆
　５ａｔｏ、Ｊ、（１９８２）　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ
。

４２、３８５８−３８６３ ３、　Ｄｏｉ、１．、　Ｎａａ＋ｂａ、Ｍ、　＆　５ａ
ｔｏ、Ｊ、（１９７５）　Ｇａｎｎ６’６．３８５−３
９２゜ ４、　Ｙａｇｉｎｕｍａ＋に、、にｏｂａｙａｓｈｉ、
Ｍ、、　Ｙｏｓｈｉｄａ、Ｅ。

＆　ＫｏｉｋｅＪ、（１９８５）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　８２．４４５８−４４６２゜ ５、　　Ｋｎｏｗｌｅｓ、Ｂ、Ｂ、、　　）Ｉｏｗｅ、
Ｃ，Ｃ，＆　　Ａｄｅｎ、Ｄ、Ｐ。

（１９８０）　５ｃｉｅｎｃｅ　２０９．４９７−４９
９゜６、　Ｋａｔｓｕｔａ、Ｉｌ、、　Ｔａｋａｏｋａ
、Ｔ、　＆　Ｈｕｈ、Ｎ、（１９８０）Ｊａｐａｎ、　
Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍａｄ、　５０．３２９−３３７７、
　Ｇｒａｈａｍ、Ｆ、Ｌ、　＆　Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ
、　Ａ、　Ｊ、（１９７３）Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　　５２
．　４５６−４６７゜８、ＣｈｉｒｇｗＬｎ、Ｊ、Ｍ、
、Ｐｒｚｙｂｙｌａｊ、Ｅ、、Ｍａｃｄｏｎａｌｄ。

Ｒ，Ｊ、＆　　Ｒｕｔｔｅｒ、Ｗ、Ｊ、（１９７９）Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８、　５２９４−５２９９゜ ９、Ｔｈｏｍａｓ、Ｐ、Ｓ、（１９８０）Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、　　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ｔｌｓ＾　７７、　５２０１−５２０５゜１０
．５ｏｕｔｈｅｒｎ、Ｅ、Ｍ、（１９７５）Ｊ、１Ｊｏ
１．Ｒｌａｌ、９８゜５０３−５１７゜ １１、　　Ｋａｐｌａｎ、ｌ’、Ｍ、、　　Ｆｏｒｄ、
Ｅ、Ｃ，、Ｐｕｒｃｅｌｌ、Ｒ，Ｈ，＆Ｇｅｒｉｎ、Ｊ
、Ｌ、（１９７６）Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、１７，８８５−８
９３゜１２、Ｍａｎｄｅｌ、Ｍ、ａｎｄ　　Ａ、）ｌｉ
ｇａ　　（１９７０）Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ。

５３、　１５４゜ １３、　　Ｒｉｇｂｙ、Ｐ、Ｗ、Ｊ、、Ｄｉｅｃｋｍａ
ｎｎ、Ｍ、Ａ、、Ｒｈｏｄｅｓ、Ｃ。

＆　　Ｂｅｒｇ、Ｐ、（１９７７）Ｊ、Ｍｏ１．８ｉｏ
１，１１３，２３７−２５１゜

【図面の簡単な説明】

第１図ａ、ｂはＨＢＢウイルス遺伝子構成と転写を示し
、第２図および第３図は本発明の組換プラスミドｐＨＢ
　Ｖ　−ｄｉｍｅｒおよびｐＨＢ　Ｖ−２のそれぞれの
構造を示す模式図であり、第４図は実施例３におけるコ
ア粒子画分に含まれるＨＢＶ−ＤＮＡ＋７３プローブＤ
ＮＡによルパイプリダイゼーシコン像であり、第５図は
同じく。 コア粒子画分のＣ５Ｃｊ！密度勾配におけるそれぞれの
密度と、ＨＢｃ抗原／　ＨＢ　ｅ抗原の活性を示し、第
６図は同じく合成されたコア粒子の電顕像を示し、第７
図は同じくウィルス粒子画分に含まれるＨＢＶ−ＤＮＡ
（７）プローブＤＮＡによるパイプリダイゼーション像
であり、第８図はウィルス粒子画分のＣ５ＣＪｉ密度勾
配におけるそれぞれの密度と、ＨＢｓ抗原の活性を示し
、第９図は合成されたＨＢウィルス様様子子よび小型の
ＨＢｓ抗原粒子の電顕像を示す。 以上 ｂ　　ＨＢＶ　−ＤＮＡのＸｈｏ　ｌ断片ｐＨＢＶ−ｄ
ｉｍｅｒ 第３図 図面の浄書 ＳＳＳニ一本復複製中間体位置 ＲＣ：開環状の複製中間体の位置 第４図 ＨＢｃＡｇ＋ＨＢｅＡｇ　　（１２５１ｋｃｐｍ）図面
０：：、４距 第６図 Ｑ方の序と ＳＳＳニ一本復複製中間体位置 ＲＣ＝開環状の複製中間体の位置 第７図 ＨＢｓＡＱ　　　（１２５１ｋｃｐｍ）贋　卜 図面の浄書 第９図 ２、　発明の名称 Ｂ型肝炎ウィルスの複製を可能とする新規な組換シラス
ミドおよびこれを含む培養細胞 ３、補正をする者 事件との関係　　出願人 名　称　財団法人　癌研究會 ４、代理人 α　補正の対象 明細書の「図面の簡単な説明」の欄および図面 ７　補正の内容 （１）明細書中筒３８頁、第５〜６行 「第６図は同じく合成されたコア粒子の電顕像を示し、
」とあるを 「第６図は同じく合成されたコア粒子の構造を示す電顕
写真であり、」と訂正する。 （２）同第３８頁、第１２行 「粒子の電顕像を示す。」とあるを 「粒子の構造を示す電顕写真である。」と訂正する。 （３）　　図面中、第４．６．７および９図を添付の通
し訂正する。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）複製開始点と薬剤耐性選択マーカーを含む大腸菌
   プラスミドベクターのクローニング部位に、３．６Ｋｂ
   ＲＮＡ（プレゲノム）合成の鋳型となるＤＮＡ領域、エ
   ンハンサーおよび遺伝子発現領域からなる転写単位を少
   なくとも一つ含むＢ型肝炎ウィルスＤＮＡ断片が組込ま
   れていることを特徴とする閉環状の組換プラスミド。
2. （２）プラスミドベクターｐＢＲ３２２のＢａｍＨ１部
   位に、ゲノム長のＢ型肝炎ウィルスＤＮＡのＢａｍＨ１
   断片が２分子連結して組込まれている特許請求の範囲第
   １項記載の閉環状の組換プラスミド。
3. （３）Ｂ型肝炎ウィルスＤＮＡのＳｔｕ I 断片（Ｂａ
   ｍＨ１部位を含む）の５′末端側が Ｂｇ１II付着末端に変化されており３′末端側がＢｇ１
   II部位で切断されているＤＮＡ断片のＢａｍＨ１部位に
   ゲノム全長の該ウィルスＤＮＡのＢａｍＨ１断片を含む
   ＨＢウィルスＤＮＡ断片が組込まれている特許請求の範
   囲第１項記載の閉環状の組換プラスミド。
4. （４）複製開始点と薬剤耐性選択マーカーを含む大腸菌
   プラスミドベクターのクローニング部位に、３．６Ｋｂ
   ＲＮＡ（プレゲノム）合成の鋳型となるＤＮＡ領域、エ
   ンハンサーおよび遺伝子発現領域からなる転写単位を少
   なくとも一つ含むＨＢウィルスＤＮＡ断片が組込まれて
   いる閉環状の組換プラスミドを有することを特徴とする
   ヒト肝細胞癌又はヒト胚芽細胞癌由来の培養細胞。
5. （５）一時的に形質発現する特許請求の範囲第４項記載
   の培養細胞。
6. （６）ヒト肝細胞癌由来の細胞がＨｕＨ−７である特許
   請求の範囲第４項又は第５項記載の培養細胞。
7. （７）ヒト胚芽細胞癌由来の細胞がＨｅｐＧ２である特
   許請求の範囲第４項又は第５項記載の培養細胞。