JP2514033B2

JP2514033B2 - Ｂ型肝炎ウィルスの複製を可能とする新規な培養細胞

Info

Publication number: JP2514033B2
Application number: JP62123492A
Authority: JP
Inventors: 克郎小池; 克幸柳沼; 由美子白形; みどり小林; 晴夫菅野
Original assignee: GAN KENKYUKAI
Current assignee: GAN KENKYUKAI
Priority date: 1987-05-20
Filing date: 1987-05-20
Publication date: 1996-07-10
Anticipated expiration: 2011-07-10
Also published as: JPS63287487A

Description

【発明の詳細な説明】〈産業上の利用分野〉この発明は、例えばヒト肝細胞癌由来の培養細胞に、
Ｂ型肝炎ウイルスの複製に必要な転写単位を含むＢ型肝
炎ウイルスDNA断片が組込まれた組換プラスミドを導入
し培養することによって、ヒト血液中にみられるものと
同一の感染性のＢ型肝炎ウイルス粒子をインビトロで複
製させる系を確立することに関する。

〈従来の技術および発明が解決しようとする問題点〉Ｂ型肝炎ウイルス（以下HBウイルス、ウイルス粒子又
は単にウイルスという）の感染によって起る肝臓病は、
急性肺炎，慢性肝炎，劇症肝炎，肝硬変と多様である。
更に、HBウイルスの持続感染と肝細胞癌の発生が密接に
関係している。HBウイルスに起因する病態について遺伝
子レベルでの解析、肝炎の発症、肝発癌とウイルス感染
の因果関係等を明らかにするための分子生物学的研究に
は培養細胞を用いてのウイルス感染増殖系が確立される
必要がある。ところがHBウイルスはヒトおよびチンパン
ジー個体にのみ感染し増殖するというごく限られた宿主
特異性を示すことが知られている。現在まで培養細胞を
用いた感染増殖実験が数多く試みられてきたが全て失敗
に終ってきた。

〈問題点を解決するための手段〉本発明者らは、前記問題点を解決すべく種々研究して
きたところ、HBウイルスの遺伝子を再構築し、これをベ
クターを介して直接培養細胞にとり込ませることにより
HBウイルスを複製可能な培養細胞が得られることを見い
出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は複製開始点と薬剤耐性選択マーカ
ーを含む大腸菌プラスミドベクターのクローニング部位
に3.6Kb RNA（プレゲノム）合成の鋳型となるDNA領域
を少なくとも一つ含むＢ型肝炎ウイルスDNA断片が組込
まれている閉環状の組換プラスミドを含み、Ｂ型肝炎ウ
イルス粒子を産生するヒト肝細胞癌由来のHuH−７培養
細胞又はヒト肝芽細胞癌由来のHepG2培養細胞を提供す
るものである。

以下にその解決手段を詳細に説明する。

（１）HBウイルスDNA Ｂ型肝炎患者血清から得られる感染性のウイルス粒子
には、約3200bpの一部一本鎖部分を含む環状２本鎖DNA
が含まれる。このHBウイルスDNA（以下HBV−DNA）に存
在する唯一の制限酵素部位はXho1およびBamH1部位であ
り、通常これらの制限酵素で処理したゲノム全長のXho1
或いはBamH1断片を大腸菌系プラスミドベクターにクロ
ーニングして組換材料に供する。その調製方法は公知で
あり概略次の手順で行われる。HBs抗原陽性かつHBe抗原
陽性の供血者の血液中に含まれるウイルス粒子を常法に
より分離する。次に内在性DNAポリメラーゼにより完全
な環状２本鎖に修復したのち単一の切断点を持つ制限酵
素、例えばBamH1により切断しプラスミドベクターの同
一酵素部位に組込みこれを大腸菌によりクローニングし
て増幅し後述の組換プラスミドの構築に供する。

（２）組換プラスミドの構築本発明の第一の特徴である組換プラスミドは次のよう
にして構築される。

ゲノム全長のHBV−DNA断片を含むプラスミドベクター
を常法により宿主大腸菌から抽出精製し、BamH1又はXho
1でHBV−DNA断片を切り出す。第１図にこれらHBV−DNA
断片の遺伝子構成と転写されるmRNAの配置を示す。S.C.
PおよびＸは翻訳可能な構造遺伝子を示す。Ｓ遺伝子の
上流にはpre−S1、pre−S2と呼ばれる領域が同じフレー
ムで存在しており、Ｃ遺伝子の上流にもpre−Ｃと呼ば
れる領域が同じフレームで存在している。主たる転写物
のうち3.6Kb RNAではＣ遺伝子の５′末端に近接した位
置に転写開始点が、また2.2Kb RNAではＳ遺伝子上流のp
re−Ｓ領域に転写開始点が存在する。polyA付加点はゲ
ノム上１カ所しかないことが明らかにされている。3.6K
b RNAはプレゲノムRNAとも称され、ウイルス複製の際逆
転写酵素により（−）鎖DNAへ転写されさらにDNAポリメ
ラーゼにより（＋）鎖DNAが形成され、コア蛋白、外被
蛋白で覆われウイルス粒子となる。

本発明の組換プラスミドを構築する場合に用いるゲノ
ム全長のHBV−DNA断片は第１図から分るように3.6Kb RN
Aの鋳型となるDNA領域がBamH1部位或いはXho1部位で分
断されている。本発明の第一の特徴は3.6Kb RNAの鋳型
となるDNA領域からなる転写単位について、BamH1断片或
いはXho1断片を材料としてHBV−DNA断片を再構築するこ
とにある。なお転写活性を上昇させるエンハンサー領域
はＣ遺伝子の上流約450bpの位置にあるとされている。

本発明の第一の態様によれば、上述の転写単位を含む
HBV−DNA断片が、単一の切断点をもつ制限酵素（BamH1
およびXho1）により切り出されたゲノム全長のHBV−DNA
断片を複数個一列に連結した状態で大腸菌系プラスミド
ベクターのクローニング部位に組込まれた組換プラスミ
ドである。この場合複数個のHBV−DNA断片を一列に連結
するのに方向性を考慮すると転写単位を順方向に完結し
たHBV−DNA断片が得られる。本発明に用いられる大腸菌
系プラスミドベクターは大腸菌を宿主（例えばE.coli
χ 1776,E.coli HB101）とし宿主細胞中で複製可能な複
製開始点と薬剤耐性選択マーカーを含みクローニング部
位としてBamH1又はXho1部位をもつものが望ましい。具
体的にはEK2ベクターとして現在最も多用されているpBR
322がクローニング部位としてBamH1部位をもち、その詳
細な制限酵素切断地図がつくられ全塩基配列も決定され
ているので好適である。このベクターはアンピシリンお
よびテトラサイクリン耐性遺伝子を有し、前述のBamH1
部位はテトラサイクリン部位に存在する。Xho1部位をク
ローニング部位としてもつベクターとしてはpCR1或いは
pKC7等がある。

本発明の好適な態様はHBV−DNAのBamH1又はXho1断片
がそれぞれの部位で２分子が順方向に一列に連結（今後
タンデム配置という）された状態でベクターに組込まれ
たものである。これらをクローニング部位に含む組換プ
ラスミドの作成手順は次の通りである。

プラスミドベクターpBR322のBamH1部位或いはpCR1のX
ho1部位にクローニングされているゲノム全長のHBV−DN
A断片をそれぞれの同一酵素で切り出しタンデム配置の
２量体HBV−DNA断片を構築するための材料とする。一方
ベクターpBR322或いはpCR1を同様にBamH1或いはXho1で
開裂し、開裂部位のリン酸基をアルカリ性ホスファター
ゼ処理で除去し本発明の組換プラスミドベクターの材料
に供する。次にベクターに対し過剰のHBV−DNA断片（Ba
mH1又はXho1断片）と開裂処理済のベクターDNA（pBR322
又はpCR1）とをT4DNAリガーゼの存在下反応させる。こ
の時の反応分子数比はHBV−DNA3:ベクターDNA1が好まし
い。この反応液をカルシウム処理したE.coli HB101或い
はE.coli χ 1776株に取り込ませて、BamH1の場合はア
ンピシリンを含む寒天プレート上にまいて一晩置くとプ
ラスミドを含むアンピシリン耐性の大腸菌のコロニー
（形質転換菌）が多数出現してくる。このコロニーの中
からいくつかを選びそれぞれのプラスミドDNAを調製し
種々の制限酵素によってこれらプラスミドDNAを切断し
得られたDNA断片をアガロースゲル電気泳動にかけて分
析し目的のタンデム配置の２量体HBV−DNAを含む組換プ
ラスミドを得る。以上各段階に用いた遺伝子操作技術お
よびクローニング技術は公知である。このようにして得
られるタンデム配置の２量体HBV−DNA断片の転写単位以
外の非本質的な部分を欠失しているHBV−DNA断片も本発
明の技術思想から本発明に包含される。たとえば、タン
デム配置の２量体HBV−DNAのうち転写単位下流の余分な
DNA配列部分は除去可能である。

次に本発明の第二の態様によれば組換プラスミドに組
込むHBV−DNA断片は本質的に必要な転写単位以外の余分
な部分をなるべく除いたものである。この態様によれば
ベクターDNAに組込まれるHBV−DNA断片の長さが短くな
る利点があるが作成の操作手順はタンデム配置の場合よ
り複雑である。ベクターに組込むDNAの構築に供されるH
BV−DNAは3.6Kb RNAの鋳型の約3/4以上の長さを含むBam
H1断片が好ましく、BamH1部位を含みかつその両サイド
の近傍に平滑末端を生じさせる制限酵素部位、例えばSt
u1部位を各々１ケ所有するひと続きのHBV−DNA断片（例
えばXho1断片或いは前述のBamH1タンデム配置）が用い
られる。本発明の好適な態様を以下に記述する。

HBV−DNAのXho1断片又はBamH1断片のタンデム配置の
２量体から約0.9KbのStuI断片（平滑末端を生ずる）を
切り出す。該断片は上流末端から約290bpのところにBam
H1部位が、また下流末端から約30bp以上のところにBg1I
I部位が各々１ケ所存在する。この断片をベクターpBR32
2のBamH1部位に組込むために8bpのBg1II DNAリンカーを
つないだのち同酵素で消化し、上流末端のStuI部位をBa
mH1付着末満に相補的な末端に変化させ下流末端のBg1II
部位を切断させて同様の相補的末端を生じさせる。こう
して得られたHBV−DNA断片をアルカリ性ホスファターゼ
処理済のpBR322のBamH1部位に組込む。この組込みの結
果pBR322由来のBamH1部位は消失し組込まれたHBV−DNA
断片の有するBamH1部位のみとなる。この組換プラスミ
ドをBamH1で開裂し、同様にアルカリホスファターゼで
処理したのちゲノム全長のHBV−DNA BamH1断片を組込
む。このようにして得られた組換プラスミドを前記と同
様にカルシウム処理したE.coli HB101或いはE.coli χ
1776株に取り込ませ、アンピシリンを含む寒天プレート
に上にまいて一晩置くとプラスミドを含むアンピシリン
耐性の大腸菌のコロニーが多数出現してくる。このコロ
ニーの中からいくつかを選び前記と同様な方法により１
コピーの転写単位を含むように再構築されたHBV−DNA断
片が組込まれている組換プラスミドを同定した。

（３）閉環状組換プラスミドの調製組換プラスミドを保持する大腸菌（HB101）から閉環
状プラスミドを公知の方法で調製する。

本発明では純度の高いプラスミドDNAが得られるエチ
ジウムブロミド存在下の平衡密度勾配遠心法を用いて閉
環状組換プラスミドを調製し、後述の培養細胞への導入
に用いる。

（４）培養細胞への組換プラスミドの導入ヒト肝細胞癌由来のHuH−７（文献２）及びヒト肝芽
細胞癌由来のHepG2（文献５）が使用し得る。

これらの培養細胞への組換プラスミドの導入（以下DN
A感染又は単に感染という）方法としてはリン酸カルシ
ウム共沈法（文献７）が用いられる。この方法は特別の
機器を必要とせず簡便に行え、しかも一時に多くの細胞
が扱えることから本発明に好適である。培養細胞に感染
した前記第一の態様および第二の態様の組換プラスミド
はレプリコンとして独立に複製できないが比較的安定に
細胞内に存在し長時間感染性のウイルス粒子を培地中に
放出する。これを一時的形質発現（transient expressi
on）という。この一時的形質発現を利用している点が本
発明の第二の特徴である。

〈発明の効果〉本発明者らが新しく開発したHBウイルスの複製系はい
くつかの優れた特徴をもつ。

第一に、その方法がきわめて簡便でかつ短時間にウイ
ルス粒子の複製を観察できる点があげられる。したがっ
てこれまで増殖系がないために実験的に制約されていた
抗ウイルス剤のスクリーニングの有力な手段となること
が考えられる。

第二に、この実験系では外から感染導入するHBV−DNA
を人為的に操作してそのウイルス複製に対する影響を解
析できる点で画期的である。これによってHBウイルスの
各構造遺伝子および調節領域の機能の解析が進展するも
のと期待される。

第三に、HBV−DNAの細胞DNAへの組込みに関してこれ
まではヒトの組織から得られた組込み型HBV−DNAの構造
解析だけに限定されていたが、このようなインビトロ増
殖系の開発によってHBV−DNAの組込みのメカニズムの問
題も直接解析できる可能性が開けたといえる。

〈実施例〉以下に本発明を実施例に基づいてさらに具体的に説明
する。

実施例に使用する記号および反応液の意義は次の通り
である。

実施例１ pHBV−dimerの調製 HBV−DNAの供与体としてはサブタイプadr型HBV−DNA
のBamH1断片をプラスミドpBR322のBamH1部位にクローン
化したpHBV1−１（文献１）を用いた。pHBV1−1DNA10μ
ｇを含む50μの反応液（１）に20単位のBamH1を加え3
7℃で１時間反応させた。この反応液をそのまま１％ア
ガロースゲルのサンプル穴に移し、4V/cm一定電圧で２
時間電気泳動を行った。泳動用緩衝液は40mMトリス−塩
酸（pH8.3）、20mM酢酸ナトリウム,2mM EDTA Na₃であ
る。泳動終了後ゲルを0.5μg/mlのエチジウムブロミド
を含む泳動用緩衝液中で染色し、pHBV1−１から切り出
したBamH1断片を確認した。このBamH1断片を含むゲル片
をカミソリで切り出し電気泳動抽出緩衝液〔5mMトリス
−塩酸（pH8.0〕を入れた透析チューブ内に封入し前記
抽出緩衝液の入った泳動槽中で15V/cmの一定電圧を１時
間かけBamH1断片をチューブ内の緩衝液中に抽出した。
チューブ内のBamH1断片を回収しフェノール抽出１回、
エタノール沈澱を３回くりかえして混入物を除去しHBV
−DNAのBamH1断片３μｇを得た。

次にBamH1部位で開裂されその５′末端のリン酸基の
除去されたBamH1消化pBR322 DNAを以下のようにして調
製した。pBR322 5μｇを含む反応液（１）にBamH1 10単
位を加えて37℃で１時間反応させた。反応終了後50μ
の蒸留水を加えて倍に希釈し、アルカリ性ホスファター
ゼ（E.coli A19由来）0.08単位を加えて65℃で１時間反
応させBamH1切断個所における５′末端のリン酸基を除
去した。0.25M EDTA 10μを加えて反応を停止させた
後、フェノール抽出１回、エタノール沈澱を３回くり返
してホスファターゼ処理済のpBR322のBamH1断片を４μ
ｇ得た。

次に前記のBamH1断片1.1μｇとBamH1消化pBR322DNA
0.5μｇ（分子数比3:1）とを含む50μの反応液（２）
にT4DNAリガーゼ（350単位／μ宝酒造）0.1μを加
えて12℃で16時間反応させた。この反応液の一部をMand
e1らの方法（文献12）によりカルシウム処理した大腸菌
HB101株にDNA感染させ、その大腸菌をアンピシリナトリ
ウムを50μg/mlの濃度で含む寒天プレート（1.5％バク
トアガーを含むLB培地）上にまき37℃で一晩培養した。
出現した多数のアンピシリン耐性に形質転換したコロニ
ーからいくつかを選び、各々の大腸菌のプラスミドDNA
を調製しこれらのプラスミドDNAを各種の制限酵素（Bam
H1,EcoR1,Xba1等）で切断し、得られたDNA断片をアガロ
ース電気泳動で解析する。切断地図を作成することによ
って、HBV−DNAのBamH1断片が２分子タンデムに並んで
組込まれた目的の組換プラスミドを同定し、これをpHBV
−dimerと名付けた。その模式図を第２図に示す。図中
ＢはBamH1切断部位を、ＥはpBR322のEcoR1切断部位を示
す。また、X,C,pre S,およびＳはHBV−DNAの構造遺伝子
を示す。

次に前記pHBV−dimerを保持する大腸菌株からのpHBV
−dimerの調製は以下のようにして行った。該大腸菌株
をLB培地（バクトトリプトン10g、酵母エキス5g、NaCl5
gを水１に溶かしたもの、pH7.2）中で、波長600nmに
おける吸光度が約0.8になるまで37℃で振とう培養し
た。その時点で１当り180mgのクロラムフェニコール
を加えてさらに12〜14時間37℃で振とう培養した。培養
終了後遠心分離（5000rpm、10分）により集菌した。得
られた体調菌を溶菌用の緩衝液〔50mMトリス−塩酸（pH
8.0）,62.5mM EDTA,1％Brij 58,0.3mg/mlリゾチーム）
中に懸濁し37℃で８分間処理した後、遠心分離（30000r
pm,30分）してプラスミドを含む上清を得た。この上清
をフェノール処理して除タンパクを行い、さらに50μg/
mlのRNaseAを加えて37℃で１時間処理しRNAを分解し
た。次にこの溶液に最終濃度が1MのNaClと10％のポリエ
チレングリコールを加えて０℃で２時間静置した。これ
を遠心分離（10000rpm,30分）してプラスミドDNAを含む
高分子のDNAのみを沈澱させた。この沈澱を緩衝液〔20m
Mトリス−塩酸，（pH7.5）,0.1mM EDTA〕に溶解してフ
ェノール抽出によりRNaseAを除いた後、溶液1ml当り0.9
5gのCsClと0.2mgのエチジウムブロミドを加えた。これ
を遠心分離（35000rpm、40時間）してスーパーフイル状
のプラスミドDNAを分画した。分画後CsClとエチジウム
ブロミドを除きエタノール沈澱によってpHBV−dimer DN
Aを回収した。このようにして得られたpHBV−dimer DNA
をそのまま後述の培養細胞へのDNA感染実験に用いた。

実施例２ pHBV−２の調製実施例１で得たpHBV−dimer DNA 30μｇを含む100μ
の反応液（１）にStuI30単位を加えて37℃で２時間反
応させた。反応後実施例１の方法と同様にして１％アガ
ロースゲル電気泳動にかけて得られた約0.9KbpのStuI断
片を含むゲル片から電気泳動抽出法によってStuI断片を
抽出しフェノール抽出とエタノール沈澱を行って混入物
を除去しStuI断片1.5μｇを得た。

このStuI断片0.4μｇと５′末端をリン酸化したBg1II
リンカーDNA（宝酒造）1.0μｇとを含む20μの反応液
（３）にT4DNAリガーゼ（350単位／μ）0.5μを加
えて12℃で16時間反応させた。0.25M EDTA ２μを加
えて反応を停止しフェノール抽出１回、エタノール沈澱
を３回くり返してBg1IIリンカーDNAの連続したStuI断片
を得た。このStuI断片を100μの反応液（１）に溶解
してBg1II20単位を加えて37℃で２時間反応させた。0.2
5M EDTA 10μを加えて反応を停止させた後、フェノ
ール抽出とエタノール沈澱によって両端にBg1IIの切断
個所をもった0.87KbpのBg1II断片を得た。

このBg1II断片全量と実施例１と同様の方法で調製し
たBamH1消化pBR322DNA0.5μｇとを含む50μの反応液
（２）にT4DNAリガーゼ（350単位／μ）0.1μを加
えて12℃で16時間反応させた。この反応液を実施例１と
同様の方法でカルシウム処理した大腸菌HB101株にDNA感
染させアンピシリン含有培地に出現した多数のコロニー
からいくつかを選びプラスミドを調製し各種制限酵素
（BamH1,EcoR1,Hind III,Dra1等）による切断地図を作
り検討した結果、0.87KbpのBg1II断片がpBR322のBamH1
部位に挿入されたプラスミドを同定しこれをpHBVX−１
と名付けた。

このpHBVX−1DNA5μｇを含む50μの反応液（１）に
BamH1 10単位を加えて37℃で１時間反応させた後、蒸留
水50μ加えて倍に希釈し、実施例１と同様の方式でア
ルカリ性ホスファターゼを作用させフェノール抽出、エ
タノール沈澱によってBamH1消化pHBVX−1DNA3μｇを得
た。

このpHBVX−1DNA1μｇと実施例１の方法により得たHB
V−DNAのBamH1断片0.6μｇとを含む50μの反応液
（２）にT4DNAリガーゼ（350単位／μ）0.1μを加
えて12℃で16時間反応させた。この反応液を実施例１と
同様な方法でカルシウム処理した大腸菌HB101株にDNA感
染させアンピシリン含有培地に出現した多数のコロニー
からいくつかを選んでプラスミドを調製し、各種制限酵
素（Hind III,BamH1,Xba1等）による切断地図を作成し
検討した結果、pHBVX−１のBamH1部位に3.2KbpのHBV−D
NAのBamH1断片が挿入されており、しかもその遺伝子の
配置の方向性がpHBVX−１中の0.87KbpのHBV−DNAのそれ
と同一であるものを見い出しこれをpHBV−２と名づけ
た。その構造の模式図を第３図に示す。図中ＢはBamH1
切断部位を、ＥはpBR322のEcoR1切断部位を示す。また
X,C,preSおよびＳはHBV−DNAの構造遺伝子を示す。

pHBV−2DNAを保持する大腸菌株からのpHBV−２の調製
は実施例１と同じ方法で行った。

実施例３培養細胞への組換プラスミドDNA感染（１）細胞と培養条件用いたヒト由来の６種類の培養細胞のうちHeLa細胞以
外はすべて肝由来の細胞である。HuH−７（文献２参
照）、HLEC−１（文献３参照）とhuH2−２（文献４参
照）の３種は肝細胞癌由来の細胞でhuH2−２にのみHBV
−DNAの組み込みが認められる。HepG2（文献５参照）は
肝芽細胞癌由来であり、HBV−DNAの組込みはない。さら
にhuL−１（文献６参照）は正常ヒト胎児肝から樹立さ
れた細胞株である。その他ヒト以外の細胞としてNIH3T3
も試みた。

培養は、NIH3T3以外は、10％FBS（仔牛胎児血清）を
含むDM160（極東製薬工業（株））培地で行った。NIH3T
3は10％CS（牛血清）を含むDMEM（日水製薬（株））培
地を使った。37℃５％CO₂の条件下で培地交換（８〜10m
l/φ100mmプレート）は３日ごとに行った。

（２）DNA感染培養細胞へのpHBV−dimerの感染にはリン酸カルシウ
ム共沈法（文献７参照）を用いた。感染の前日（24時間
前）に細胞を３〜５×10⁶細胞数／φ100mmプレートの密
度でまいておき当日感染の２時間前に培地交換をしてお
く。pHBV−dimerのDNAとリン酸カルシウム共沈澱の調製
法は次の通りである。10μｇのpHBV−dimer DNAをエタ
ノール沈澱によりペレットにして乾燥後187.5μの滅
菌水に溶解する。これに250μの２倍濃度のHBS溶液
（１倍濃度は水１中に8.0g NaCl,0.37g KCl,0.125g N
a₂HPO₄,1.0gデキストローズ,5.0gHEPESを含む。pHは7.0
5に調整後フィルター滅菌する）を加えて室温におく。
このDNA溶液に62.5μの1M CaCl₂溶液（滅菌済）を加
えて即撹拌し室温で10〜15分間静置する。うすく白濁し
た沈澱溶液を培養プレート中に均一に滴下してそのまま
培養器中で培養を続ける。約６時間後プレートから培養
液を吸引して除き、10％グリセリンを含むDM160培地を5
ml加えて室温で約３分間放置する。その後グリセリン溶
液を除き5mlのPBSによる洗浄を２回くり返してから新し
い培養液と交換して培養を４〜５日間続ける。

（３）RNAの調製とブロットハイブリダイゼーション前記７種の培養細胞を用いてpHBV−dimerの感染を行
い各細胞におけるHBV−DNAの発現効率を、HBV−DNAのmR
NA転写効率を指標に検討した。

感染後のRNAの調製はグアニジニウム／塩化セシウム
法（文献８参照）を用いて行なった。感染後の３日目の
細胞を集め2.5mlのグアニジウム溶液（4Mグアニジウム
チオシアネート,5mMクエン酸ナトリウム,0.5％ラウリル
サルコシン酸ナトリウム,0.1％β−メルカプトエタノー
ル）を加えて激しく撹拌して蛋白を変性させる。この溶
液に1gにCsClを加えて溶解しベックマンSW50.1の遠心管
（滅菌済）に入れた2mlの5.7M CsCl,100mM EDTA溶液
（滅菌済）の上に重層して遠心分離（35000rpm,14時
間）した。遠心後RNAは管底に沈澱するがDNAおよびタン
パク質は浮遊するので、上清部分を丁寧に除き70％エタ
ノールで沈澱を乱さないようにまわりを洗う。次に緩衝
液〔0.1％ドデシル硫酸ナトリウム,10mMトリス−塩酸
（pH7.5）,1mM EDTA〕に溶解し、等量のクロロホルム/n
−ブタノール（4:1）を加えて再抽出を行う。水層部分
を回収しエタノール沈澱をくり返してRNA分画を得た。

RNAの電気泳動は2.2Mホルムアルデヒドを含む１％ア
ガロースゲルで行った。泳動用緩衝液の組成は0.02M MO
PS（pH7.0）,5mM酢酸ナトリウム,0.5mM EDTAである。泳
動前のRNAサンプルの変性にはRNA溶液4.5μに２μ
の10倍濃度泳動用緩衝液,3.5μのホルムアルデヒド,1
0μのホルムアミドを加えて65℃で15分間熱処理し
た。泳動後ゲルをそのままニトロセルロース膜にブロッ
ティング（文献９参照）して80℃で２時間処理した後、
HBV−DNAプローブ（後述）でハイブリダイゼーションを
行った。

HBV−DNAプローブの調製はHBV−DNAのBamH1断片（ゲ
ノム全長で3215bp）を用いてRigbyらの方法（文献13参
照）に基くニックトランスレーション法により32P標識H
BV−DNAを作成した。

実験結果を表１に示すようにHuH−７およびHepG2にお
いてのみ効率の良いmRNAの発現が見られた。特にHuH−
７が最も効率が良かったことから、HuH−７細胞におけ
るHBV−DNAの一時的形質発現で実際にウイルスのコア粒
子およびウイルス粒子の合成が起きているかについて検
討した。

（４）コア粒子およびウイルス粒子の調製調製はすべて４℃で行った。コア粒子の調製は次のよ
うにして行った。DNA感染の５日後の細胞をプレートか
ら掻き取り遠心して集めた。得られた細胞を2mlの低張
緩衝液〔20mMトリス−塩酸（pH7.5）,50mM NaCl,5mM Mg
Cl₂,0.1％β−メルカプトエタノール,0.5mM PMSF〕に懸
濁して氷中に10分間置いた後、Dounce型ホモジナイザー
でホモジナイズを行う。ストロークの回数は核と細胞質
の分離の程度を顕微鏡で観察しながら決定する。ホモジ
ナイズ後40％庶糖溶液0.5mlを加えて溶液を等張にし遠
心分離（2000rpm,10分間）で核分画を除く。上清をさら
に遠心分離（10000rpm,20分間）しミトコンドリア分画
を除く。この上清画分を、ベックマンSW50.1の遠心管に
入れた2.5mlの30％庶糖を含むTNE緩衝液〔20mMトリス−
塩酸（pH7.5）,150mM NaCl,1mM EDTA〕の上に重層し35
000rpmで16時間遠心する。この遠心による沈澱をTNE緩
衝液に懸濁して粗コア粒子分画とした。さらにこの分画
を4.5mlのCsCl密度勾配（1.1g/cm³−1.6g/cm³）に上層
し35000rpmで18時間遠心して精製する。遠心後管底から
10滴ずつ分画し、各分画についてHBc抗原/HBe抗原の検
出をアボットHBeRIAキット（ダイナボット（株））で行
った。

また各分画を透析後１％SDSと2mg/mlのプロティナー
ゼＫ（Proteinase K）で処理し、１％アガロースゲル電
気泳動にかけてからニトロセルロース膜へのブロッティ
ング（文献10参照）を行った。HBV−DNAの存在はこの膜
に対するHBV−DNAプローブのハイブリダイゼーションに
よって検出した。

その結果、第４図に示すようにフラクションNo18から
21にかけてHBV−DNAの複製中間体を伴ったコア粒子の存
在が認められた。その密度は1.35〜1.36g/cm³（第５
図）で通常血液中から得られるHBウイルスのコア粒子の
値（文献11参照）と一致した。フラクションNo22から23
に認められる高いピークはHBV−DNAが伴わないことから
HBc抗原あるいはHBe抗原のみの凝集体と考えられる。得
られたコア粒子分画を電顕で観察すると第６図に示すよ
うに直径約27nmのコア粒子の存在が確認された。

次に培地中に放出されたウイルス粒子の調製は次のよ
うに行った。

培養液を遠心分離（30000rpm,12時間）し、ウイルス
粒子画分を濃縮する。この遠心で得られた沈澱をTNE溶
液によく懸濁した後、ベックマンSW50.1遠心管の2.5ml
の庶糖20％を含むTNE緩衝液の上に重層し遠心分離（300
00rpm,16時間）した。この沈澱を少量のTNE緩衝液によ
く懸濁して粗ウイルス粒子画分とした。精製は、さらに
この画分を4.5mlのCsCl密度勾配（1.1g/cm³−1.6g/c
m³）に重層し35000rpmで18時間遠心をすることにより行
った。10滴ずつ分画後、各分画についてオースリアIIキ
ット（ダイナボット（株））でHBs抗原の検出を行う。
またHBV−DNAの存在についてはコア粒子の場合と同様に
ハイブリダイゼーションを行った。その結果、第７図に
示すようにフラクションNo29を中心としてフラクション
No25から31にかけてHBV−DNAの存在が認められ、それと
一致してHBs抗原も検出された（第８図）。ウイルス様
粒子の密度は1.22g/cm³−1.24g/cm³（第８図）で血液中
にみられるものと同一のウイルス粒子（文献11参照）が
形成されていることが示された。電顕写真によっても第
９図に示すように約42nmのHBウイルス粒子が約22nmの小
さいHBs抗原粒子とともに存在していることが確認され
た。

このようにHuH−７細胞にpHBV−dimerを感染させ一時
的形質発現させることによってHBウイルスが感染したヒ
トあるいはチンパンジーの場合と同様のHBウイルス粒子
の合成が起きることが明らかになった。この結果はpHBV
−２を用いても同じであった。

〈文献〉 1.Kobayashi,M.＆ Koike,k.（1984）Gene 30,227−232. 2.Nakabayashi,H.,Taketa,K.,Miyano,K.,Yamane,T.＆ S
ato,J.（1982）Cancer Res.42,−3858−3863 3.Doi,I.,Namba,M.＆ Sato,J.（1975）Gann66,385−39
2. 4.Yaginuma,K.,Kobayashi,M.,Yoshida,E.＆ Koike,K.
（1985）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,4458−4462. 5.Knowles,B.B.,Howe,C.C.＆ Aden,D.P.（1980）Scienc
e 209,497−499. 6.Katsuta,H.,Takaoka,T.＆ Huh,N.（1980）Japan.J.Ex
p.Med.50,329−337 7.Graham,F.L.＆ Van der Eb,A.J.（1973）J.Virol.52,
456−467. 8.Chirgwin,J.M.,Przybyla,A.E.,Macdonald.R.J.＆ Rut
ter,W.J.（1979）Biochemistry 18,5294−5299. 9.Thomas,P.S.（1980）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77,520
1−5205. 10.Southern,E.M.（1975）J.Mol.Biol.98,503−517. 11.Kaplan,P.M.,Ford,E.C.,Purcell,R.H.＆Gerin,J.L.
（1976）J.Virol.17,885−893. 12.Mandel,M.and A.Higa（1970）J.Mol.Biol.53,154. 13.Rigby,P.W.J.,Dieckmann,M.A.,Rhodes,C.＆ Berg,P.
（1977）J.Mol.Biol.113,237−251.

【図面の簡単な説明】

第１図a,bはHBウイルスの遺伝子構成と転写を示し、第
２図および第３図は本発明の組換プラスミドpHBV−dime
rおよびpHBV−２のそれぞれの構造を示す模式図であ
り、第４図は実施例３におけるコア粒子画分に含まれる
HBV−DNAのプローブDNAによるハイブリダイゼーション
像であり、第５図は同じくコア粒子画分のCsCl密度勾配
におけるそれぞれの密度と、HBc抗原/HBe抗原の活性を
示し、第６図は同じく合成されたコア粒子の構造を示す
電顕写真であり、第７図は同じくウイルス粒子画分に含
まれるHBV−DNAのプローブDNAによるハイブリダイゼー
ション像であり、第８図はウイルス粒子画分のCsCl密度
勾配におけるそれぞれの密度と、HBs抗原の活性を示
し、第９図は合成されたHBウイルス様粒子および小型の
HBs抗原粒子の構造を示す電顕写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開昭61−282078（ＪＰ，Ａ) 特表昭57−500768（ＪＰ，Ａ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】複製開始点と薬剤耐性選択マーカーを含む
大腸菌プラスミドベクターのクローニング部位に3.6Kb
RNA（プレゲノム）合成の鋳型となるDNA領域を少なく
とも一つ含むＢ型肝炎ウイルスDNA断片が組込まれてい
る閉環状の組換プラスミドを含み、Ｂ型肝炎ウイルス粒
子を産生するヒト肝細胞癌由来のHuH−７培養細胞又は
ヒト肝芽細胞癌由来のHepG2培養細胞。
【請求項２】大腸菌プラスミドベクターのクローニング
部位が、pBR322のBamHI部位である特許請求の範囲第１
項記載の培養細胞。
【請求項３】Ｂ型肝炎ウイルス断片が、adr型Ｂ型肝炎
ウイルスDNAのBamHI断片を転写方向に２分子連結したも
のである特許請求の範囲第１項又は第２項記載の培養細
胞。
【請求項４】Ｂ型肝炎ウイルス断片が、adr型Ｂ型肝炎
ウイルスDNAのStuI断片（唯一のBamHI部位を含む）の
５′及び３′末端をBamHI付着末端に相補的に変化させ
かつ該断片のBamHI部位にadr型Ｂ型肝炎ウイルスDNAのB
amHI断片が結合したものである特許請求の範囲第１項又
は第２記載の培養細胞。