JPH08502167A - Ｈｃｖタンパク質の翻訳を制御するための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ウィルス核酸からのウイルスのペプチドおよびタンパク質の翻訳を制御するための方法および組成物であって、特にペスチウイルスおよびHCVに適用することを特徴とする。本方法および組成物はウイルスゲノムの５’UT領域の制御エレメントを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】HCVタンパク質の翻訳を制御するための方法および組成物 技術分野 本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）タンパク質の翻訳を制御するための方法 および組成物に関する。HCVは血液由来（blood-borne）の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイル ス（NANBV）感染症に言及されてきた。さらに詳細には、本発明の実施態様は、 インビボでのHCV翻訳の制御および調節のための方法および組成物を特徴とする 。この組成物および方法は、HCV複製を低減または増加するために、ならびにHCV タンパク質の発現を減少または増加するために適用される。 発明の背景 HCVのプロトタイプの分離株はEPO公開公報第318,216号；第388,232号において 特徴付けられた。本明細書に用いられるように、用語「HCV」は同じウイルス種 の新しい群、遺伝子型、および分離株を包含する。用語「HCV-1」は、EPO公開公 報第318,216号中と同じ意味で用いる。 HCVは、既知の肝炎ウイルス（例えばＡ型肝炎ウイルス（HAV）、Ｂ型肝炎ウイ ルス（HBV）、およびデルタ型肝炎ウイルス（HDV））により引き起こされる疾患 、ならびにサイトメガロウイルス（CMV）またはエプスタインーバーウイルス（E BV）により誘発される肝炎を包含する他の形態のウイルス関連肝疾患から区別 し得る伝染性疾患てある。HCVは輸血された個体で最初に同定された。輸血後肝 炎（PTH）は、輸血患者の約10％で起こり、そしてHCVはこれらのケースの90％に まで数えられる。この疾患はしばしば慢性の肝障害（25〜55％）に進行する。 現在、ウイルス核酸に関する翻訳プロセスの制御が大いに必要とされている。 翻訳プロセスの制御は、効果的なウイルス疾患の治療を制定する。例えば限定は しないが、ウイルスタンパク質の発現を低減する能力は疾患を制限し得る。イン ビボでウイルスタンパク質の発現を増加する能力は、強い免疫刺激を誘発し得る 。ウイルスタンパク質の発現を増加する能力はまた、より容易に精製し得る大量 のウイルスタンパク質を産生し得る。 HCVゲノムは一本のRNAポジティブ鎖から構成される。HCVゲノムの概略を図１ に示す。HCVゲノムは約3,000のアミノ酸から成るポリタンパク質をコードする、 連続して翻訳されるオープンリーディングフレーム（ORF）を有する。ORF中で、 構造タンパク質はN-末端領域の最初の約４分の１にコードされているようであり 、残りのポリタンパク質は非構造タンパク質をコードするのに関する。 HCVゲノムは、５’末端にいかなるタンパク質またはポリタンパク質を翻訳す るのか知られていない領域を有する。この領域は、５’非翻訳領域（５’UT領域 または５’UTRという）あるいは５’リーダー領域と呼ばれる。 ５’UT領域は５つの上流のORFまで包含し、最初の４つはHC V-1（プロトタイプのHCV分離株）に重複する（Chooら、「Ｃ型肝炎ウイルスの遺 伝子構成および変化」Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1991）88：2451-2455；Han ら、「Ｃ型肝炎ウイルスRNAの末端領域の特徴：５’非翻訳領域および３’末端 のポリ（Ａ）部における保存配列の同定」Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1991）88 ：1711-1715）。５’UT領域はヌクレオチド配列においてペスチウイルスと相 同性がある（Hanら）。 プライマー伸長分析で、HCV RNAの２つの顕著な種が感染患者由来のサンプル 中に存在することが明らかにされた（Hanら）。 １つの種はより長い完全長のゲノムRNAであると仮定される。 より長い完全長のゲノムRNAは、ヘアピン構造を形成することが予測される５’ 末端を有する（Hanら；Inchauspeら、抜粋、HCVについての第３回国際シンポジ ウム、V．19、ストラスブルグ、フランス、1991；Okamotoら、「ヒトキャリアか ら単離されたＣ型肝炎ウイルスのゲノムRNAのヌクレオチド配列：報告された分 離株との保存領域および可変領域についての比較」、J．Gen Vlrol．（1991）72 :2697-2704）。もう一方の種は短い、おそらく５’サブゲノムRNAであり、その ５’末端は、より長いRNAの５’末端から145番目のヌクレオチドから始まる（Ha nら）。 HCVのアンチセンスポリヌクレオチド分子は、一般的にはＥＰ公開公報第388,2 32号に開示されている。 発明の開示 本発明は、HCV核酸からのHCVタンパク質の翻訳を制御する 組成物および方法を特徴とする。本発明は、HCV RNAの５’末端由来の小領域に 相補的な核酸の利用に基づく。本発明の１つの実施態様は、ハイブリダイズする 条件下で天然に存在しない第１の核酸とHCV核酸とを接触させる工程を包含するH CV核酸からのHCVタンパク質の翻訳を制御する方法を特徴とする。 第１の核酸はアンチセンス核酸であってHCV核酸の５’UT領域内にあるセンス鎖 の配列と実質的に相補的な配列を有する。 センス鎮は、翻訳プロセスに関与するゲノムまたはメッセンジャーRNAの鎖であ る。第１の核酸が、２つの核酸がハイブリダイゼーション産物を形成し得る条件 下でHCV核酸に配置され、このハイブリダイゼーション産物がHCV核酸の翻訳レベ ルを変える。 本方法はHCVで感染した被験体内で行われ得る。この方法はまた、インビトロ で細胞内に用いて目的のウイルスタンパク質を生じさせ得る。この方法はHCV感 染の治療として用いられ得る。 従って、本発明の１つの局面では、HCV核酸からのＣ型肝炎ウイルス（HCV）タ ンパク質の翻訳を制御する方法は、以下の工程を包含して提供される：（a）天 然に存在しない第１の核酸であって、HCV核酸の５’UT領域内にあるセンス鎖に 相補的な配列を含有する、第１の核酸を提供する工程；および、（b）上記HCV核 酸と上記第１の核酸とを、上記第１の核酸および上記HCV核酸がハイブリダイゼ ーション産物を形成し得る条件下で接触させる工程、ここで上記ハイブリダイゼ ーション産物は、 上記HCV核酸の翻訳レベルを変え得る。 本発明の他局面では、HCV核酸からのHCVタンパク質の翻訳を制御する組成物が 提供される。この組成物は第１の核酸、またはHCV核酸の５’UT領域内にセンス 鎖の配列に相補的な配列を有する第１の核酸を作製する手段を包含する。好まし くは、第１の核酸の配列は配列番号１の中から選択される配列に相補的である。 本発明のさらなる局面では、HCVを制御する方法は以下の工程を包含して提供 される：（a）プロモーターに作動可能に連結した第２の核酸の転写産物として 第１の核酸を生じさせる工程；（b）HCVで感染した細胞に第２の核酸およびプロ モーターを配置する工程、ここで該細胞は、第２の核酸を転写して第１の核酸を 産生し得る。この方法はまた、HCVに感染していないが将来感染し得る細胞（「 易感染」細胞という）内でのHCVタンパク質の発現を予防するために用いられ得 る。 本発明のさらに他の局面では、５’UTヘアピンのヌクレオチドを介してHCVタ ンパク質の翻訳を制御する方法が提供される。この方法では、２つの位置の１つ にヘアピン配列を配置して保持する工程を包含し、ここで上記の位置の少なくと も１つはヘアピン状立体配置である。 本発明のさらに他の局面では、HCV感染の治療および制御のためのキットが提 供される。このキットは本発明の組成物を製造品目として含有する。好ましくは 、このキットはその使用についての指示書を含有し、細胞または個体に核酸を配 置 するためのベクターおよび他の媒体を必要に応じて含み得る。 本発明の他の局面では、第１の核酸の翻訳を増大させる方法が提供される。こ の方法はHCVのペスチウイルスホモロジーボックスIV内の配列と相補的な配列を 有する天然に存在しない第２の核酸と第１の核酸とを作動可能に連結する工程を 包含する。第１の核酸の翻訳を増大させる組成物もまた提供される。この組成物 はHCVのペスチウイルスホモロジーボックスIV内の配列に対応する配列を有する 天然に存在しない第２の核酸を含有し、この配列は第１の核酸に作動可能に連結 され得る。 図面の簡単な説明 図１にHCVウイルスゲノムの概略を示す。 図２にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）のmRNA配列 を含むように改変されているHCVウイルスRNAゲノムの概略を示す。 図３に改変HCVウイルスRNAゲノムの概略を付随する欠失および改変とともに示 す。 図４に５つのRNA構築物、pSV₂、CAT、SVCAT、SVACATN、pT7EMCAT、およびEMCV CATの概略を示す。 図５に３つのRNA構築物、pCMV（CAT/SV40/LacZ）、pCMV（CAT／HCV／LacZ）、 およびpCMV（CAT／ポリオ／LacZ）の概略を示す。 図６に図５のLacZおよびLacZ/CAT構築物の活性をグラフで示す。 図７にR6転写におけるAS5アンチセンス分子の効果の結果を示す。 発明を実施するための形態 本発明を、HCV核酸の翻訳を制御するための方法および組成物として詳述する 。この組成物および方法をHCV核酸に関して詳述する。しかし、HCV核酸に関する 記載は、本発明の特性を例示するためにのみ用いられ、本発明をHCVに限定する 意図はない。 本発明の実施は、他に記載がない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換え DNA、および免疫学の従来技法を用い、これらは当該分野の範囲内にある。この ような技法は文献に十分記載されている。例えば、Sambrook、Fitsch＆Maniatis 、Molecular Cloning；A Laboratory Manual（1989）；DNA Cloning、Ｉ巻およ びII巻（D．N Glover編、1985）；OligonucleotideSynthesis（M．J．Gait編、1 984）；Nucleic Acid Hybridization（B．D．Hames＆S．J．Higgins編、1984） ；シリーズMethods inEnzymology（Academic Press，Inc.）、特に154巻および1 55巻（WuおよびGrossman編）を参照のこと。 定義： 本明細書中に選択され用いられた用語の定義を、本発明の理解を速めるために 以下に示す。用語「対応する」は、特定の核酸配列に相同的である、または相補 的であることを意味する。核酸とペプチドとの間に関して、対応するとは、ある 核酸またはその相補体の配列に由来する順序にあるペプチドのアミノ酸をいう。 用語「天然に存在しない核酸」は、ゲノム核酸の一部、cDNA、半合成核酸、ま たは合成由来の核酸をいい、その起源またはその操作により、（1）自然界にお いて関連のある全ての核酸に関連がない、（2）自然界において連結している核 酸以外の核酸または他の化学物質に連結している、あるいは（3）自然界に存在 しないものをいう。 本明細書に用いられるように、用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオ チド」、および「核酸」は、ポリデオキシリボヌクレオチド（2-デオキシ-D-リ ボースを含有する）、ポリリボヌクレオチド（D-リボースを含有する）、プリン またはピリミジン塩基のN-グリコシドである他のあらゆるタイプのポリヌクレオ チド、ならびに非ヌクレオチド骨格（例えば、タンパク質核酸、およびNeugene^{T M} ポリマーとしてAnti-Gene Development Group，Corvallis，Oregonから市販さ れている合成の配列特異的核酸ポリマー）または一般的ではない連結を含む他の ポリマーの総称であるべきであり、このポリマーは、DNAおよびRNAに見出される ような塩基のペアまたは塩基の積み重ねを可能にする形状で塩基の核を含むもの と規定する。用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」の間で長 さを区別することは意図せず、これらの用語は交換して用いられる。これらの用 語は分子の一次構造のみを言及する。従って、これらの用語は、二本鎖および一 本鎖のDNAならびに 二本鎖および一本鎖のRNA、ならびにRNA:RNAハイブリッドを包含し、そして既知 のタイプの改変物、例えば当該分野で公知の標識、メチル化、１つまたはそれ以 上の天然に存在するヌクレオチドのアナログでの「キャップ」置換、例えば非荷 電結合（例えば、メチルホスホネート（methyl phosphonate）、ホスホトリエス テル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）、および荷電結合（例えば、ホ スホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を用いる改変のようなヌクレオ チド間改変物、例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチ ド、ポリ-L-リジンなど）のようなペンダント分子を含有するもの、挿入物（例 えば、アクリジン、ソラレン（psoralen）など）を含有するもの、キレート（例 えば、金属、放射活性金属、ボロン、酸化金属など）を含有するもの、アルキレ ーターを含有するもの、改変された結合をもつもの（例えば、αアノメリック核 酸など）ならびにポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの改変していない ものもまた包含する。 本明細書中に用いられる用語「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」、および「 核酸」は、既知のプリンおよびピリミジン塩基だけではなく、改変された他の複 素環式塩基を包含する部分を含むことが認識される。このような改変は、メチル 化プリンまたはメチル化ピリミジン、アシル化プリンまたはアシル化ピリミジン 、あるいは他の複素環を包含する。改変ヌクレオシドまたは改変ヌクレオチドは 、例えば１つまたはそれ以上の水酸基が、ハロゲン、脂肪族に置換されて、エー テル、アミンなどとして機能する糖部分の改変も包含する。 HCVゲノムの構成： HCVのcDNAライブラリーはHCV感染チンパンジーまたはヒトの血漿中に存在する 核酸配列に由来する。これらのライブラリーの１つの構築物である「ｃ」ライブ ラリー（ATCC番号40394）がPCT公開公報第WO9O/14436号に記載されている。本発 明に関連のある対応するDNA配列を、本明細書中では配列番号１として示した。 これまで報告された少なくとも５つの推定の完全長HCVクローンに基づけば、 ５’UT領域は約341ヌクレオチド長である（Hanら、Inchauspeら、Okamotoら）。 ポリタンパク質領域とは異なり、HCV分離株の５’UT領域は非常によく保存され ている。図２に示すように、この５’UT領域は５つの上流のORFまで包含し、最 初の４つは、プロトタイプのHCV分離株であるHCV-1に重複する（Chooら；Hanら ）。この５’UT領域は、ヌクレオチド配列でペスチウイルスと実質的に相同であ る（Hanら）。従って、HCV核酸の翻訳の調節に関する考察は他のペスチウイルス に適用し得る。 プライマー伸長分析で、２つの顕著な種のHCV RNAが見出された（Hanら）。１ つの種のものはより長く、完全長のゲノムRNAと推測される。その５’末端はヘ アピン構造を形成していると予測される（Hanら；Inchauspeら；Okamotoら）。 より短い５’サブゲノムRNAの５’末端は、より長いRNAの５’末端から145番目 のヌクレオチドから始まる（Hanら）。 核酸： 本発明の実施態様は、異なるシスに作用するHCVの制御エレメントと相互作用 し得る核酸を特徴とし、従ってHCV核酸の翻訳をブロック、抑制、または増大し 得る。 本発明の１つの実施態様は、天然に存在しない第１の核酸をHCV核酸に配置す る工程を包含し、HCV核酸からのHCVタンパク質の翻訳を制御する方法を特徴とす る。この第１の核酸は、HCV核酸の５’UT領域内のセンス鎖の配列と相補的な配 列を有する。この第１の核酸は、第１の核酸がハイブリダイゼーション産物を形 成し得、そしてHCV核酸の翻訳レベルを変え得る条件下でHCV核酸に配置される。 好ましくは、本発明のアンチセンス核酸は、RNA、DNA、または改変された核酸 である。改変された核酸の例は、分解抵抗性の硫化誘導体、チオホスフエート誘 導体、ならびにポリヌクレオシドアミドであるがそれらに限定されない（Stecら のPCT公開公報第WO91/16331号；ZonらのPCT公開公報第WO88/07544号；P．E．Nel senら、Science（1991）254:1497-1500；M．Egholm，JACS，（1992）114；1895- 1897）。本発明のアンチセンス核酸の特に好ましい設計改変は、（1）該核酸の 細胞内安定性を増加するように、（2）該核酸の細胞透過性を増加するように、 （3）センス鎖への該核酸の親和性を増加するように、または（4）該核酸の毒性 （もしあれば）を低減するように設計される改変である。多くのこのような改変 は、ANTISENSE RESEARCH AND APPLICATIONS（S．T．CrookeおよびB．Lebleu編、 CRC Press， 1993）に記載されるように当該分野で公知である。従って、核酸は変更されたま たは改変された塩基、糖、または結合を含み得、リポソームまたは遺伝子治療に よるような特殊なシステムで送達され、あるいは付着分子を有し得る。このよう な付着分子は、細胞膜との相互作用を増強する脂質のような疎水性分子、または リン酸骨格の電荷中和剤として作用するポリリジンのようなポリカチオニック分 子を含有する。付着し得る特に好ましい脂質はコレステロールである。この分子 は核酸の３’末端または５’末端で付着し得、そしてまた塩基、糖、またはヌク レオシド間リンケージを介して付着し得る。 他の分子はこの核酸の３’末端または５’末端に特異的に配置され、エキソヌ クレアーゼ切断を防ぐキャッピング基であり得る。このようなキャッピング基は 、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのようなグリコール を含む当該分野で公知のヒドロキシル保護基が包含されるがこれに限定されない 。 好ましくは、第１の核酸はHCVの５’UT領域内のセンス鎖の配列に実質的に相 補的な配列中の少なくとも10ヌクレオチドを有する。さらに好ましくは、第１の 核酸は、このような相補的な配列中の少なくとも12ヌクレオチド、さらに好まし くは15ヌクレオチド、そしてさらに好ましくは20ヌクレオチドを有する。好まし くは、第１の核酸は、このような相補的な配列中の100ヌクレオチドより少なく 、さらに好ましくは50ヌクレオチドより少ない。最も好ましくは、この核酸はHC Vの５ ’UT領域のセンス配列と安定なハイブリダイゼーション産物を形成し得る約20〜 30ヌクレオチドを有する。 HCVウイルスの５’UT領域を配列番号１に示す。本発明の１つの好ましい核酸 は、５’ヘアピン構造の約23ヌクレオチドを結合し得る。この23ヌクレオチドは 配列番号１の１〜23の位置にある。好ましくは、この核酸はヘアピンに関連する 配列と３重らせんを形成し、メッセンジャーRNAの残りの部分からの切断を阻害 する。 本発明の他の好ましい核酸は、ペスチウイルスホモロジーボックスIVとして知 られている28ヌクレオチド領域に結合し得る。このペスチウイルスホモロジーボ ックスIV領域は配列番号１の291〜318塩基にわたる。 本発明のさらに好ましい核酸は、上記長い完全長のゲノムRNAが切断されて短 いサブゲノムRNAが形成される部位で規定される領域に結合し得る。この切断領 域は、配列番号１の145位の上流および下流の約50ヌクレオチド領域にわたる。 さらに他の好ましい核酸は、配列番号１の277〜300塩基にわたるペスチウイル スホモロジーボックスIVに重複する領域に結合し得る「AS5」をいう。本発明の 好ましい実施態様では、このAS5核酸は完全にホスホロチオエート化されている 。すなわち、天然のホスホジエステル結合に代わりホスホロチオエート結合のみ を含有する。本発明の他の好ましい実施態様では、このAS5核酸はコレステロー ル分子に、（好ましくはヌクレオシドの３’末端を介して）共有結合している。 核酸の送達： 上記核酸は、当該分野で公知のいくつもの方法を介して細胞内に配置し得る。 細胞は、転写産物として第１の核酸が得られ得る第２の核酸でトランスフェクト し得る；例えばDulbeccoの米国特許第4,593,002号に示されるようなウイルス性 キャリア中に第２の核酸を含むことにより；あるいはレトロウイルスベクター中 の第２の核酸を含むような遺伝子治療の方法による。アンチセンス遺伝子治療の １つの例は、Mukhopadhyayら「アンチセンスRNAによるK-RAS発現および肺癌細胞 の腫瘍形成の特異的阻害」、Cancer Research，51:1744-1748（1991）による記 事に記載されている。 本発明はまた、HCV感染細胞またはHCV感染から予防すべき細胞内に、第１の核 酸または第２の核酸を配置するための媒体を意図する。このような媒体の例には 、ベクター、リポソーム、および、N-（1-（2,3-ジオレオイルオキシ）プロピル ）-N，N，N-トリメチルアンモニウムメチルスルフェート（DOTAP）、N-［1-（2, 3-ジオレイルオキシ）プロピル］-N，N，N-トリメチルアンモニウムクロリド（D OTMA）などのような脂質懸濁液が包含される。あるいは、この脂質は第１の核酸 に直接共有結合され得る。 アンチセンス核酸はまた、該核酸の細胞取り込みを増加する分子と連結され得 る。これらの分子は、リン脂質またはステロイド（例えば、コレステロール）の ような脂質のごとき疎水性であり得るか、またはポリカチオニック（例えば、ポ リリ ジン）であり得る。疎水性またはポリカチオニックな分子は、アンチセンス核酸 のあらゆる所（３’末端および５’末端を含むアンチセンス核酸、塩基、糖ヒド ロキシル、およびヌクレオチド間結合を包含する）で付着する。 取り込みを増加する特に好ましい分子は、コレステリル基である。コレステリ ル様基は、例えば、活性化コレステリルクロロホルメート（cholesteryl chloro formate）またはコール酸を介してANTISENSE RESEARCH AND APPLICATIONS（前出 ）に反映されるような当該分野で公知の手段により、付着され得る。１つの例（ 318頁）では、コレステロール分子は、アミノリンカーおよびアミンと反応する コレステロール上の官能基を用いて２’ヒドロキシル基にコンジュゲートされ得 る。他の方法では、コレステリル基は、R．L．Letsingerら、Proc．Natl．Acad ．Sci．USA （1989）86:6553-6556に記載されるように、CCl₄およびコレステリル オキシカルボニルアミノエチルアミンを用いて３’ホスフエートに連結される。 ５’ヘアピンの使用： 翻訳の増大は、免疫応答を増強し得る。ウイルス核酸の翻訳のブロックまたは 低減が、ウイルス感染の病因を低減し得る。本発明の１つの局面では、ヌクレオ チド１〜23位でのヘアピンの中のヌクレオチドを介してHCVタンパク質の翻訳を 制御する方法を提供する。この方法は２つの位置の１つにヘアピン配列を配置お よび維持する工程を包含し、ここで該位置の少なくとも１つはヘアピン状立体配 置である。ヘアピン状立 体配置において、インビボでのウイルス核酸の翻訳はブロックされるかまたは実 質的に低減される。上記位置の少なくとも１つには、ヘアピンではない直線状立 体配置またはヘアピンと関連するヌクレオチドの完全な除去が包含される。直線 状立体配置により、ウイルス核酸が翻訳される。上記ヘアピンヌクレオチドの除 去により、ウイルス核酸の翻訳が増大される。好ましくは、ヘアピン構造は、天 然に存在しない第１の核酸がヘアピン構造と共に３重らせんを形成する条件下で 、該第１の核酸をHCV核酸に配置することにより安定化される。 ヘアピンに関連する配列は翻訳を阻害する。本発明の１つの実施態様は、ヘア ピン状立体配置を形成し得る第１の配列およびmRNAに結合し得る第２の配列を有 する第１の核酸を特徴とする。好ましくは、第１の配列は配列番号１の１〜23塩 基に対応する配列を有する。好ましくは、第２の配列は上記のより短いサブゲノ ムRNAにハイブリダイズする。 薬学的処方物： 本発明の組成物は、薬学的投与のために調製され得る。注射用調製物および坐 薬は通常、１〜10mg/アンプルまたはカプセルの上記核酸または核酸アナログを 含む。ヒトの患者に対して、一日投与量は約0.1〜1,000mgであり、好ましくは１ 〜100mgである（10〜20mg/kg休重から1000〜2000mg/kg体重）。しかし、各患者 に応じた投与量は、広範囲の因子、例えば使用する特定の核酸または核酸アナロ グの有効性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与の時点および形 態、排 出速度、一緒に用いられる他の薬剤との組合せ、治療が施される所定の疾患の重 篤さに依存する。 本発明の範囲内にある薬学的製造品は、その意図した目的を達成するために有 効な量の活性成分を含んでいる製造品を包含する。好ましい範囲は上述した通り であり、各々のHCV感染症の治療用の最も有効な量の決定は当該分野に公知であ る。 本発明の核酸ならびにそれらの硫化およびホスホロチオエートアナログに加え て、薬学的調製物には適切な賦形剤および活性化合物のプロセスが促進される補 助物質を含み得る。この調製物、錠剤、糖衣錠、およびカプセルのような、特に 経口投与され得るおよび好ましいタイプの投与に用いられ得る調製物、および坐 薬のような直腸に投与し得る調製物、ならびに非経口または経口投与に適する溶 液、および口腔内投与または舌下投与し得る組成物には、0.1％から99％重量の 活性成分を賦形剤とともに含み得る。好ましい投与方法は非経口投与、特に静脈 内投与である。 非経口投与に適切な処方物には、水溶性のまたは水懸濁性の形態での活性化合 物の水溶液が含まれる。さらに、適切な油性の注射用懸濁液として活性化合物の 懸濁液が投与され得る。適切な親油性溶媒または媒体には、脂肪油（例えば、ゴ マ油）あるいは合成脂肪酸エステル（例えば、エチルオレエートまたはトリグリ セリド）が包含される。水性注射用懸濁液には、懸濁液の粘度を増加する物質（ 例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／また はデキストラ ン）が含まれ得る。必要に応じて、この懸濁液はさらに安定剤を含み得る。 さらに、本発明の化合物はリポソームにカプセル化された薬学的組成物に処理 され得、ここで活性成分は分散されるかまたは脂質層に付着する水性の同心性の 層からなる顆粒小体中に種々存在するかのいずれかで含まれる。活性成分は、そ の溶解性に依存して水層中および脂質層中の両方に、あるいは一般的にリポソー ム懸濁液と呼ばれる液中に存在し得る。 疎水性層には、一般的にしかし排他的ではなく、レシチンおよびスフィンゴミエ リンのようなリン脂質、コレステロールのようなステロイド、ジセチルホスフェ ート、ステアリルアミン、またはホスファチジン酸のような多少のイオン性界面 活性剤、および／または疎水性の他の物質が包含される。リポソームの直径は一 般的に約15nm〜５ミクロンの範囲にわたる。リポソーム調製液および／または脂 質懸濁液のための特に好ましい脂質は、DOTMAおよびDOTAPである。 DOTAPは、Boehringer Mannheimから購入するか、あるいはL．Stamatatosら、B iochem ，27:3917-25（1988）；H．Eiblら、Biophvs Chem，10:261-71（1979）に 記載された以下の方法で調製し得る。DOTMAは、Lipofectin*の名で市販されてい る（BRL，Gaithersburg，MDから入手可能）、そしてP．L．Felgnerら、Proc Nat Acad Sci USA84:7413-17（1987）に記載されている。 本発明は、特に有利な実施態様を示す以下の実施例を参照として例示する。し かし、これらの実施態様は例示であり、 本発明はいかなる様にも制限されるように解釈されないことに気を付けるべきで ある。 実施例 Ｉ．材料と方法 Ａ．細胞、細菌株、およびプラスミド HUH7、HeLa、およびHepG2細胞を、10％ウシ胎児血清（Gibco-BRL，Gaithersbu rg，MD）を補足したダルベッコの改変イーグル培地中で増殖させた。これらの細 胞は７％C0₂の存在下で増殖させた。全てのプラスミドは、Gibco-BRLから購入し たEscherichia coli HB101中で増殖させた。 Ｂ．酵素 制限酵素およびT4 DNAリガーゼをBoehringer Mannheim（Indianapolis，IN） から、TaqポリメラーゼをPerkin Elmer（Norwalk，CT）から、T7 RNAポリメラー ゼおよびRNasinをPromega（Madison，WI）から購入した。 Ｃ．発現プラスミドの構築 プラスミドpT7EMCATおよびpSV₂CATの構築は記載されている（Elroy-Steinら、 「脳心筋炎ウイルス５’配列により与えられたmRNAのキャップ依存性翻訳が、ワ クシニアウイルス／バクテリオファージT7ハイブリッド発現システムの作用を改 善する」Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）（1989）86:6126-6130；Gormanら、「 哺乳類細胞中でクロラムフェニコールアセチルトランスフエラーゼを発現する組 換えゲノム」Mo1．Cell Biol．（1989）2 ：1044-1051）。PCR（Saikiら、「熱安定DNAポリメラーゼを用いるプライマーに よる酵素的DNA増幅」Sclence（1988）230:1350-1354）によりHCV cDNA（Hanら） の５’UT領域の両末端にHlndIII部位を付着することにより、およびpSV₂CATのHi nd III部位に得られた断片をクローニングすることにより、プラスミドpHCVCATを 構築した。 プラスミドpEQ355を、βガラクトシダーゼ（βgal）発現プラスミドのpEQ176 （Schleissら、「ヒトサイトメガロウイルスgp48発現における翻訳の制御」J．V lrol． （1991）65:6782-6789）のマルチプルクローニングサイトに固有のHindII I／Asp718部位に、341bpのHCV-1の５’領域を挿入することにより構築した。 HCV-1 ５’UT領域を、テンプレートとしてラムダベクター由来EcoR1断片である B114を用いてHlndIII/Asp718 PCR断片として得た。 プラスミドpEQ391［pCMV（CAT/HCV/LacZ）］を、プラスミドpSV₂CAT（Gorman ら）から単離されたCAT遺伝子をコードする716bpのHindIII/BanI断片を、プラス ミドpEQ355中のHindIII部位で連結することにより得た。上記HindIII部位を連結 し、そしてBanI部位およびpEQ355中の連結されていないHindIII部位をクレノウ で平滑末端化し、再連結した。 プラスミドpEQ416［pCMV/（CAT/ポリオ/LacZ）］を、pSV₂CATをテンプレート として用いて得られた716bpのHindIII／BamHI CAT遺伝子をコードするPCR断片、 およびポリオウイルス５’UT領域をコードする995bpのBamHI/XhoI断片を、ポリ リンカー中 のHindIII/XhoI部位で切断したβga1発現プラスミドpEQ176に連結することによ り構築した。 pEQ396は、pLNP0Z（Adamら、「ピコルナウイルス５’非翻訳領域を有するレト ロウイルスベクターにおける翻訳の内部開始」J.Vlrol．（1991）65:4985-4990 ）から得られた５’UT領域ポリオウイルス配列を、クレノウを用いて平滑末端化 したXhoI／PstI断片として、ポリリンカー中のXbaI／SnaBI部位で切断したpEQ37 7中へクローニングすることにより構築されたβgaI発現プラスミドである。上記Xba I部位もまた平滑末端を作製するためにクレノウで埋められた。pEQ377中のβ galの転写はT7バクテリオファージプロモーターにより進行する。 プラスミドｐ（CAT/SV40/LacZ）を、716bpのHindIII/BamHI CAT遺伝子をコー ドする上記PCR断片を、SV40ポリアデニル化シグナル、およびHindIII／BglIIで 切断したβgal発現プラスミドpEQ176とともに連結することにより構築した。全 てのPCR産物の確実性を、プラスミド中の得られた各セグメントの配列決定をす ることにより確認した（ChenおよびSeeburg、「スーパーコイル配列決定：プラ スミドDNAを配列決定する迅速で簡易な方法」DNA（1985）4:165-170）。 Ｄ．ハイブリ ドCAT RNAの構築 pSV₂CATベクターの各セグメントを、Saikiら；ShyamalaおよびAmes、「インビ トロでの変異に基づく迅速なポリメラーゼ連鎖反応のためのエキソヌクレアーゼ の使用」Gene（1991）97:1-6に記載のようにPCRで増幅した。各セグメントを図 ２お よび３に示す。各センスプライマー（PSVまたはP1〜P9）を、５’末端にバクテ リオファージT7プロモーター（TAATACGACTCACTATAG）、および３’末端に16〜18 塩基のSV40またはHCV配列を有するように設計した。アンチセンスプライマーは 、５’末端に40個のＴの長鎖、および３’末端に相補的なSV40配列（GGAGGAGTAG ）を有していた。この配列は、CAT遺伝子の停止コドンの350bp後て、テンプレー トDNAに存在する10個のヌクレオチドおよび付加ポリＡトラックの完全な合致に よりベクターに結合する。pT7EMCATのセグメントをプライマ−T7およびＴ30によ り増幅した。 各PCR産物を、キャップアナログ（Promega，P2010）を有するまたは有さないT 7ポリメラーゼにより転写し、DNアーゼで処理し、フエノールークロロホルムで 抽出し、そして2.5Mの酢酸アンモニウムの存在下でエタノールにより２回沈澱さ せた。各ポリ（Ａ）＋RNAの濃度はUV吸収により見積もり、そしてHanら、「胎児 の分化期間でのラット膵臓遺伝子の選択発現」Proc．Natl．Acad．Sci．（USA） （1986）83:110-114に記載されるように、JHC271をプローブとして用いたノーザ ンおよびドットブロットハイブリダイゼーションにより確認した。SV*CAT、R11 、R13、およびR14において、配列を重複PCR法により内部挿入または削除した（S hyamalaおよびAmes）。上記PCR産物は配列決定により正確であることが確認され た。 Ｅ．インビトロでのハイブリッドCAT RNAの翻訳 合成RNAを、製造業者により指示されるように、140mMの酢 酸カリウムの存在下でヌクレアーゼ処理されたウサギ網状赤血球溶解物（Gibco- BRL）中で翻訳した。キャップ依存性におけるＫ⁺イオン濃度の影響を試験する付 随研究を、50、100、150、および200mMの酢酸カリウムの存在下て行った。［³⁵ Ｓ］メチオニンで標識した翻訳産物のアリコートを、以前に記載されているよう に（Laemmli、 「バクテリオフアージT4のヘツドのアセンブリ期間中の構造タ ンパク質の切断」Nature（1970）227:680-685）、12％のポリアクリルアミドゲ ルで電気泳動することにより分析した。 Ｆ． CATアッセイのための哺乳類細胞中へのハイブリッドCAT RNAのトランス フェクション 各２マイクログラムの合成RNAを、製造業者により改変されたFelgnerら（「リ ポフェクション：高率の脂質媒介DNAトランスフェクション手法」Proｃ．Natl． Acad．Sci．（USA） （1987）84:7413-7417）の手法に従って、15mgのリポフェク チン（lipofectin）（Gibco-BRL）を用いて3.5cmのCostarプレート（ThomasScie ntific，Swedesboro，NJ）中の１×10⁶細胞にトランスフェクトした。その細胞 を、以前に記載されたように（Gormanら）一晩インキュベートし、CATアッセイ のために回収した。CATの相対活性は、トランスフェクトされたRNAが0.5mｇと５ mgとの間で直線関係を示した。６時間と一晩との間のトランスフエクション後の インキュベーションはCAT活性にあまり影響しなかった。 ポリオウイルス感染細胞におけるRNAの翻訳のために、HUH ７細胞を100の感染多重度（MOI）でポリオウイルス（Mahoney株、ATCC VR-59） に感染させた。細胞は感染後２時間でRNAでトランスフエクトし、トランスフェ クション後４時間で回収した。感染６時間、細胞は通常の形態を維持し、その後 、それらは形態を変え、培養ディッシュから剥がれた。 Ｇ． ジシストロン性DNA構築物の細胞へのトランスフェクション CsC1グラジエントでの分画により精製された各プラスミドDNA20マイクログラ ムを、リン酸カルシウム法（Gormanら）により２×10⁶個のHUH7細胞にトランス フェクトした。その細胞をトランスフェクション後48時間で回収し、そして凍結 融解を繰り返すことにより細胞抽出液を調製した。CATアッセイは、Gormanらに 記載されたように行った。LacZアッセイはMillerに従った（Miller，βガラクト シダーゼアッセイ「分子遺伝子学の実験」352-355頁、Cold Spring Harbour Lab oratory，Cold Spring Harbour，New York，1972）。 実施例１HCVゲノムの５’UT領域に欠失を有するRNAの構築およびこの方法に関する合理性 HCVゲノム中で翻訳を制御する、シスに作用するエレメントの正確な位置を示 すために、HCV-1 RNAの５’UT領域の完全長のもの（ヌクレオチド１〜341）また は欠失したものを、クロラムフエニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）m RNAのコー ディング領域に連結した。この構築物を図３に例示し、そして以下の表１に記載 する。 T7ポリメラーゼでDNA断片を転写することにより各RNAを合成し、特定の５’ま たは３’欠失を含むようにまずPCRにより増幅した。各RNAを、細胞中での安定性 を増強するために、５’末端でのキャップおよび３’末端でのポリＡテール（A4 0）を有するように設計した。このアプローチで、単一に規定された５’および ３’末端を有する大量のRNAの効果的な生産を可能に した。従来のDNAトランスフェクション戦略とは異なり、このアプローチを用い る細胞のRNAトランスフェクションは、特定のRNA分子が核内で直面する、起こり 得るスプライシングおよび輸送上の問題を回避する。 同じ方法により２つの追加のRNAを合成した：１）従来のキャップ依存性翻訳 （Kozak、「翻訳のスキャニングモデル：最新版」J．Cell Blol.（1989）108:22 9-241）の陽性コントロールとして作用する、SV40の初期mRNAの５’リーダーを 有するSVCAT、およびキャップ非依存性内部開始（Jangら、「インビボでの脳心 筋炎ウイルスRNAの５’非翻訳領域へのリボソームの内部エントリーによるタン パク質合成の開始」J．Virol.（1989）63:1651-1660）の陽性コントロールとし て作用するEMCVの５’リーダーを有するEMCVCAT。 実施例２インビトロでのハイブリッドCAT RNAの翻訳 合成RNAが生物学的に活性であることを確認するために、およびインビトロで の翻訳特性を決定するために、実施例１のRNAをウサギ網状赤血球溶解物中で翻 訳した。SVCATを含有する全てのRNAが、期待したサイズのCATタンパク質を生じ た。 インビトロの結果は以下のようにまとめ得る：１）HCVCAT構築物では、R1〜R5 はCATタンパク質を産生するが、わずかに検出可能なレベルでのみであった。こ のレベルの翻訳は、R6およびR7で徐々に増加し、R8では最大12倍の増加に達する 。２） 140mMのKCl濃度ては、キャッピングSVCATおよびHCVCAT RNA（R7，R8）のインビ トロでの翻訳は、キャッピングされていないRNAの翻訳より平均20倍効果的てあ った。３）低KCl濃度（50〜100mM）では、キャッピングされていないR1テンプレ ートの翻訳で、キャッピングR1テンプレートの翻訳と同レベルのCATタンパク質 が得られ、これはおそらく弱い内部開始の発生を示す。 驚くべきことにそして予期されないことに、これらの結果は、ウサギ網状赤血 球溶解物およびHeLa細胞抽出物を用いてHCV RNAの５’UT領域にある内部リボソ ームエントリー部位の検出を報告しているTsukiyama-Koharaら（「Ｃ型肝炎ウイ ルスのRNAにある内部リボソームエントリー部位」J．Virol.（1992）66:1476-14 83）による最近のデータと対照的である。細胞溶解物を用いるインビトロでのタ ンパク質合成は常にインビボでの翻訳条件を正確に再現するわけではない（Koza k、「原核生物、真核生物、およびオルガネラ中におけるタンパク質合成開始の 比較」Microbiol．Rev．（1983）47:1-45）。代わりのアプローチが用いられた 。 実施例３インビボでのハイブリッドCAT RNAの翻訳および制御エレメントの同定 インビボでの単シストロン性構築物の翻訳特性を決定するために、上記各RNA を、コントロールRNAのSVCATも含めて、リポフェクチン（Felgnerら）を用いて ヒト肝癌細胞株（HUH7）中に トランスフェクトした（R1〜R18）。CAT活性をモニターし、そして得られたデー タを表２にまとめた。 完全長の構築物R1ではRNAの量が10倍に増加し、そしてより多い細胞抽出液を 用いたにもかかわらす、CAT活性は繰り返し検出されなかった。この結果は、完 全長のHCV RNAが、インビボでの有効な翻訳テンプレートであり得ないことを示 唆している。 実施例１に記載されるような、一連の５’欠失構築物を分析した。CAT活性は 、23個のヌクレオチドの５’末端ヘアピンが除去されたR2でまず検出された。こ の活性はR3で４倍に増加し、同レベルの活性を、R4、R5、およびR6で検出し、こ れはORF１〜４について規則的に欠失させたものである。 R6の５’UT配列は、インビボで検出された５’サブゲノムRNAの配列に一致す る（Hanら、1991）。CAT活性は、ORF5のAUGコドンが除去されたR7で２倍、およ び３’末端付近の配列の86ヌクレオチドのみを維持したR8でさらに1.5倍増加し た。構築物R8は最大のCAT活性を示す。これらのデータは、上記の小さい各ORFを 含むヌクレオチド255から上流の配列が、ポリタンパク質の主要開始コドンから の翻訳を阻害することを示唆する。 R8で見られる最大のCAT活性は、R9構築物中の67個のヌクレオチドをさらに欠 失させると急激に低減した。この結果は、翻訳を刺激する効果的な正に制御する エレメントがヌクレオチド255から下流に存在し得ることを示唆する。この86個 のヌクレオチドからなる領域は、ペスチウイルスに対して90％の一致率を有する 28個のヌクレオチドからなる配列を含み、そしてペスチウイルスホモロジーボッ クスIVと呼ばれ、図２お よび３にPEST-IVとして示した（Hanら、1991）。PEST-IVエレメントが観察され る翻訳刺激に単独で関連するのかどうかを決定するために、RNA構築物R6を欠失 分析に供した。 構築物R6は、不活性構築物に結合しているHCV RNAの５’末端部分を除去した1 -145配列を欠失した５’UT領域を有する。R6はR8までの欠失分析に好ましかった 。R8における３’欠失は短い５’UT領域を有するRNAを生じた。 トランスフェクションにおいて、R6で見られるCAT活性はR6の３’末端から20 個のヌクレオチドを欠失させた構築物R17中で1.5倍、および28個のヌクレオチド をさらに欠失させた構築物R18中でさらに2.5倍低減した。 これらのデータは、PEST-IVの上流および下流の配列が最大の翻訳増大に必要 であることを示した。PEST-IV配列は、異種の５’リーダーに転移し得るポジテ ィブシスエレメントの一部である。図４を見ると、この28塩基からなる配列を上 記SVCATに挿入してSV^*CATを作製し、CAT活性を３倍増加した。 ３’欠失によりその他のRNA構築物を作製した。CAT活性はR11およびR14、なら びにR13では検出さなかった。これらは全て、上記５’ヘアピンを含んでいた。 これらのデータは、上記５’ヘアピンがHCV RNAの翻訳を阻害するという点から みて一貫している。 実施例４CAT RNAの翻訳におけるHCVの５’ヘアピンの影響 インタクトな５’末端を有するRNAは、下流の配列に関わりなく全て不活性で あったので、最も末端の23個のヌクレオチドに内在する潜在的５’ヘアピン構造 を、観察される翻訳阻害に関して評価した。すなわち、この５’ヘアピンを上記 ２つの活性RNA（R6およびR8）の５’末端に連結した。これらのRNA（R6hp、R8hp ）をHUH7細胞にトランスフェクトし、CAT活性を測定した。 表２に、これらの構築物においてヘアピンを並置すると、CATの相対活性によ り示されるように、翻訳はほとんど停止した。このデータは、完全な阻害には上 記23ヌクレオチドヘアピンのみより多いヌクレオチド部分を必要とするが、５’ ヘアピンが潜在的な翻訳インヒビターであることを示唆している。 実施例５ポリオウイルス感染細胞におけるハイブリッドCAT RNAの翻訳 ポリオウイルス感染は細胞のmRNAのキャップ依存性翻訳を阻害し、それにより 自身のRNAまたは５’UT領域の内部リポソームエントリ一部位（IRES）を含む異 種RNAの翻訳を促進することが知られている（Jangら、「インビボで脳心筋炎ウ イルスRNAの５’非翻訳領域中へのリボソーム内部エントリーによるタンパク質 合成の開始」J．Virol.（1989）63:1651-1660；Macejakおよびsarnow、「細胞ｍ RNAの５’リーダーにより介される翻訳の内部開始」Nature（1991）353:90-94； PelletierおよびSonenberg、「ポリオウイルスRNA由来の配列による真核細胞mR NAの翻訳の内部開始」Nature（1988）334:320-325）。この阻害は、細胞のキャ ップ結合タンパク質複合体（e1F-4F）の成分であるp220を順に切断する、同定さ れていない潜在性の細胞プロテアーゼの活性化により、プロテアーゼ２Ａをコー ドするポリオウイルスにより間接的に媒介されると考えられている（Soneneberg 、「真核細胞のmRNAのキャップ結合タンパク質：翻訳の開始および制御における 機能」Prog． Nucleic Acid Res． Molec． Blol.（1988）35:173-297）。 種々の５’UT領域を有するハイブリッドCAT RNAをポリオウイルスで感染したH UH7細胞にトランスフェクトした。この戦略は、各RNAのキャップ依存性を決定す るように、およびHCV５’UT領域中に存在し得る弱い内部リボソームエントリ一 部位（IRES）の潜在的な存在を検出するように設計された。 予測されるように、ポリオウイルス感染は、EMCVCATでCAT活性を内部開始のた めの陽性コントロールRNAの７倍増加した（Elroy-Steinら）。対照的に、上記ポ リオ感染は、SVCATならびに２つのHCV構築物（R6およびR8）におけるCAT活性を 実質的に低減した。ポリオウイルス感染細胞に見られる低減されたCAT活性は、 感染細胞がRNAトランスフェクションに先立ってより長い時間（2.5時間）インキ ュベートされた場合にはさらに減少した。R1のCAT活性は、ポリオウイルス感染 にかかわらず検出不可能のままであった。この結果は、IRESがHCV RNAの５’UT 領域に存在しないことを強く示唆している。 R1構築物を除いて、上記の実験で試験した構築物は５’UT領 域に大きな欠失を含んでいた。このような欠失は推定のIRES構造および／または 機能に影響し得る。このような欠失の影響を評価するために、広範囲にわたらな い欠失を有する構築物を、ポリオウイルス感染細胞中のCATタンパク質を翻訳す る能力について試験した。以前の結果と一致して、R1構築物のCAT活性は、ポリ オウイルス感染の存在または非存在において検出不可能なままであった。構築物 R2〜R5は、ポリオウイルス感染の非存在下で試験した場合に、以前に記載された レベルと似ているCAT活性の相対レベルを示した。しかし、HCVリーダーテンプレ ートのCAT活性は、ポリオウイルス感染細胞で事実上停止された。 さらに、テンプレートSVCATおよびR1〜R3について、非キャッピングメッセー ジを用いて同様のプロトコールで試験した。上記非キャッピングテンプレートは 、細胞をポリオウイルスで連続的に感染してもしなくてもトランスフエクト細胞 中で不活性であった。これらの結果は、HCV５’UT領域由来のシス調節エレメン トを有する単シストロン性メッセージがキャップ依存的に翻訳されることおよび HCVの５’非コーディング領域がIRESエレメントを有しないことを強く支持して いる。 実施例６HUH7細胞でのジシストロン性mRNAの翻訳 HCVの５’UT領域内のIRESの潜在的な存在を、ジシストロン性のmRNAを転写す るように設計されたDNA構築物でHUH7細胞を トランスフェクトすることによりさらに試験した。すなわち、HCV RNAの５’UT 領域を第１のシストロンとしてのCATと第２のシストロンとしてのLacZとの間の シストロン間スペーサーとして配置した。この連結したDNAを、翻訳がサイトメ ガロウイルス（CMV）中の主要な初期遺伝子の強力なエンハンサー／プロモータ ーにより支配される発現ベクター中にクローニングした。陽性および陰性コント ロールとしてのジシストロン性ベクターは、HCVの５’UT領域とポリオウイルス の５’UT領域およびSV40初期遺伝子の３’UT領域とを置換して図５に示すように 構築された。 HUH7細胞へのトランスフェクションにおいては、３つ全ての構築物は、第１の CATシストロンの翻訳を同レベルで維持した。図６に、３つの構築物の酵素活性 を棒グラフの形で示した。HCVリーダーを有するジシストロン性構築物は、第２ のLacZシストロンの翻訳を、ポリオウイルスリーダーを用いている上記ジシスト ロン性コントロール構築物と同レベルでは維持しなかった。これらのデータは、 単シストロン性の構築物を用いて得られたHCVゲノムの完全長５’UT領域がIRES を含まないことの先の証拠を支持するものである。 実施例７HeLa細胞およびHepG2細胞におけるHCV RNA構築物の翻訳 トランジェントトランスフェクションアッセイは、細胞株に依存する種々のリ ードアウト（readout）を与え得る。得られ た結果がHUH7細胞に限られないことを確認するために、R1、R7、およびR8構築物 をHeLa細胞およびHepG2細胞にトランスフエクトした。得られたCAT活性パターン はHUH7細胞で観察されたものに質的に類似していた。 実施例８アンチセンス分子によるHCV ５’UT域の制御エレメントの制御 オリゴヌクレオチドアナログおよびその誘導体を作製する方法およびそれらの 抗ウイルス剤としての使用は、特にPCTWO88/07544号およびPCT WO91/16 331号に 報告されている。 硫化オリゴヌクレオチドアナログを、PCT WO91/16331号の教示に従ってアンチ センス剤として用いるために調製する。配列番号１の１〜23塩基のアンチセンス に対応する23塩基からなるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、自動合成 機（38OB型Applied Biosystems，Foster City， California）でホスホルアミダ イト法により合成する。酸化工程のかわりに硫化工程（硫化工程はキャッピング 工程に先立つ）で置き換えられる以外は、標準合成プロトコールに従った。すな わち、この合成は、脱トリチル化、カップリング、硫化、およびキャッピングの サイクルの繰り返しからなる。合成カラムからの最終産物の分離および精製は標 準の手段により完了する。 硫化工程は、0.2Mの0,0-ジイソプロピルホスホロジチオ酸ジスルフィドのピリ ジン溶液に室温で１分間、伸長している 鎖をさらすことにより行う。脱トリチル化工程の間に放出されたトリチルカチオ ンの収率は平均99％と予測される。オリゴヌクレオチドにおける非硫化または酸 化された３価のリン酸結合は、脱トリチル化期間に不安定化されて切断されるの で、トリチル収率はカップリング効果および硫化測定の両方の尺度である。 配列番号１の1-23塩基のアンチセンスに対応する23merを、支持体から切断し 、そして55℃で６時間、濃水酸化アンモニウムで脱保護基する。トリチル化オリ ゴヌクレオチドはHPLCにより単離し、脱トリチル化し、そしてナトリウム塩とし て沈澱させる。ホスホロチオエートアナログは、通常細胞内に存在するヌクレア ーゼに耐性である。 ホスホロチオエートオリゴマーの濃縮物とともに培養された細胞は、0.5mMと 同じくらい低い濃度でHCVウイルス感染に耐性であることが予期される。 センスRNAの1-23配列に相補的な23merのオリゴヌクレオチドアナログは、ヘア ピン状立体配置に結合して安定化することによりHCVメッセンジャーRNAの翻訳を 低減する。 実施例９坑ヘアピン分子を用いる５’UT領域の制御 この実施例は、ペスチウイルスホモロジーボックスIVの配列に対応する28個か らなるヌクレオチド配列を用いる。国際特許出願番号PCT W088/07544号に従って 、配列番号１の291〜 318塩基に相補するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドアナログを合成する 。 本発明のホスホロチオエート物はApplled Biosystems 380-B DNA Synthesizer で、O-メチルホスホルアミダイトを用いる通常のリン酸オリゴヌクレオチドの合 成サイクルと同じように合成される。主な違いは酸化工程の間に用いられる試薬 にある。 7.5グラムのＳ₈分子の硫黄をまず71mlのピリジンおよび7.5mlのトリエチルア ミンとともに71mlの二硫化炭素に溶解した５％硫黄溶液を酸化試薬として用いる 。得られた全量は３つのカラムでの30merの合成に十分である。 上記酸化工程の前後に、カラムを二硫化炭素とピリジンとの１：１溶液で繰り 返し洗浄してライン上に沈澱し得るあらゆる残留硫黄を除去する。30merの３つ のカラムでの合成には、総量380mlのこの溶液で十分である。この溶液はできる だけ無水であるべきであり、各々新しい合成のために再調製するべきである。 硫黄酸化はヨウ素酸化ほどは速くなく、従って合成サイクル間でのヨウ素酸化 の待ち時間30秒に比べて、450秒の待ち時間が必要である。さらに最後の手順を 、チオフェノールがカラムに送達された後、メタノール中に溶解している生じた あらゆる塩の除去を確実にするために、逆洗浄（reverse flush）を通常より５ 秒間長く、全部で10秒行うように少し変える。 28個からなるヌクレオチドホスホロチオエート核酸アナロ グを、必要な時点で酸化サイクルを自動的に変化させることにより合成する。カ ラムから切断して、アンモニア水（60゜、10時間）で脱保護した後、ホスホロチ オエートオリゴマーおよびブロックコポリマーを逆相HPLC（PRP-1カラム、１％ 酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（pH7）-アセトニトリル（20分間で20％から 40％に増加））を介して精製し、そしてこの溶液を２等量の酢酸エチルで抽出し 、ドライアイスで凍結し、そして凍結乾燥する。 この固形物を0.3mlの１M NaClに溶解し、そして生成物を3.5倍容量の無水エタ ノールを添加して沈澱させる。ホスホロチオエートオリゴマーの酢酸塩（特にホ モポリマーｄＣ₂₈）は、１M NaClにほとんど不溶性である。パスツールピペット による少量のアンモニア蒸気（アンモニア水ではない）の導入は、全ての固形物 を溶解する。 0.5mM濃度の上記28ヌクレオチドアナログを含む溶液と接触させた細胞は、HCV 感染またはHCVのウイルスタンパク質の発現に耐性を示す。 実施例10AS5アンチセンス分子を用いる５’UT領域の制御 AS5という24merのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、HCVの５’UT領域のヌ クレオチド277位〜300位に結合するが、以下の配列を有し上記のように合成され た： AS5-POは通常のホスホジエステル結合を有するAS5オリゴヌクレオチドを指す 。AS5-PSはAS5オリゴヌクレオチドをいい、ここで全てのヌクレオシド間結合が ホスホロチオエート結合であり、そして上記の実施例９のように合成される。AS 5-3’CHOL-PSおよびAS5-3’CHOL-POはそれそれAS5-PSおよびAS5-POオリゴヌクレ オチドを指し、コレステリル基がこの分子の３’末端に付加され、そして「Lynx Pharmaceuticals（Foster City，CA）」により合成された。コレステリル基は また、本明細書中に記載された方法によっても３’末端に付着し得る。 上記各アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）を以下のアッセイで試験し、H CVの５’UT領域により制御される翻訳を阻害する能力を測定した。HUH7細胞を「 材料と方法」に記載したように増殖させた。種々のアンチセンス分子（AS5-PO、 AS5-PS）AS5-３’CHOL-PS）ならびに-PO、-PS）および３’-CHOLの実施態様の単 純ヘルペスウィルス（HSV）由来のコントロール21mer配列）を、最終濃度を0.1 〜1.0μMに変化させてHUH7細胞培地に補充し、12〜24時間インキュベートした。 上記ASOでのインキュベーション後、次いで細胞を試験RNA（実施例５ならびに 図２および３に記載のR6およびSVCAT RNA）で、以下のようにトランスフェクト した：２〜４μgの各RNAを、200μlのリン酸緩衝生理食塩水中の15μgのリポフ ェクチン（Glbco-BRL）と混合し、15分間インキュベートし、そして上記の「材 料と方法」の項目Ｆに記載のように細胞に添加した。CAT活性を上記の項目Ｆに おけるようにアッセイした（C．M．Go rmanら、Mol．Cell．Blol.（1982）2:1044-1051）。図７に結果を示す。 カラム２および11〜13は、SVCATテンプレートRNAを含むが、カラム３〜９およ び14〜18はR6テンプレートRNAを含む。カラム１〜３、10〜11、および14は、上 記ASOインキュベーションしていないコントロールである。残りのカラムは、示 されるようにAS5またはHSVコントロールASOを含む。データは、AS5-3’CHOL-PO およびAS5-3’CHOL-PSのASOが、HCV５’UT領域の制御下においてCAT転写および 翻訳を特異的に阻害し、SV40プロモーター領域の制御下ではこのような転写およ び翻訳を阻害しないことを示す。 これまでの特定の実施態様の記載は本発明の一般的性質を十分に開示しており 、第三者が一般概念から離れることなく現在の知識を適用することにより、この ような特定の実施態様を種々の適用に容易に修正および／または改造し得、従っ てこのような改造および修正は、開示された実施態様の均等の意味および範囲内 に含まれることを意図する。 配列表 （1）一般的情報： （i）出願人：カイロン コーポレイション （ii）発明の名称：HCVタンパク質の翻訳を制御するための方法および組成物 （iii）配列数：２ （iv）連絡住所： （A）住所人：カイロン コーポレイション （B）番地：4560 ホートン ストリート （C）市：エミリービル （D）州：カリフォルニア （E）国：アメリカ合衆国 （F）郵便番号：94608-2916 （v）コンピューター読み出し形態： （A）媒体型：フロッピーディスク、5.25インチ （B）コンピューター：IBM PC互換用 （C）操作システム：MS-DOS Ver．3.3 （D）ソフトウェア：ワードパーフェクト5.1 （vi）現在の出願データ： （A）出願番号：入手していない （B）出願日：入手していない （C）分類：入手していない （vii）先願データ： （A）出願番号：07/952,799 （B）出願日：1992年９月28日 （viii）代理人／事務所情報： （A）氏名：ゴールドマン，ケネス エム． （B）登録番号：34,174 （C）照会／記録番号：0044.002 （ix）電話回線情報： （A）電話：（510）601-2719 （B）テレファックス：（510）655-3542 （C）テレックス：入手していない （2）配列番号（SEQ ID NO）：１の情報： （i）配列の特色： （A）長さ：341ヌクレオチド （B）型：核酸 （C）鎖の数 一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ （vi）起源：（ATCC番号 40394） （C）固体・単離クローン名：ns5hcv1 （xi）配列の特徴：配列番号（SEQ ID NO）：１ （2）配列番号（SEQ ID NO）：２の情報： （i）配列の特色 （A）長さ：24ヌクレオチド （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ （xi）配列の特徴：配列番号（SEQ ID NO）：２

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/18 8318−4Ｈ (72)発明者 ヨー，ビヤング ジェイ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94549, ラファイエット，エヌオー．23，ブルック ストリート 3520 (72)発明者 スー，ビヨング エス. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94549, ラファイエット，エヌオー．207，イース ト ストリート 949 (72)発明者 セルビー，マーク ジェイ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94131, サンフランシスコ，ゲールウッド サーク ル 136 (72)発明者 ホートン，マイケル アメリカ合衆国 カリフォルニア 94526, ダンビル，ローズミード コート 53

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）核酸からのHCVタンパク質の翻訳を制御す る方法であって、以下の工程： 天然に存在しない第１の核酸であって、HCV核酸の５’UT領域内にある センス鎖に相補的な配列を含有する第１の核酸を提供する工程、ここで、該第１ の核酸は、ヘアピン形成領域、ペスチウイルスホモロジーボックスIV領域、およ び完全長HCV RNAを切断してサブゲノムHCV RNAを形成する切断領域からなる群よ り選択される配列を含有する；および 該HCV核酸と該第１の核酸とを、該第１の核酸およびHCV核酸がハイブリ ダイゼーション産物を形成し得る条件下で接触させる工程、ここで、該ハイブリ ダイゼーション産物は該HCV核酸の翻訳レベルを変え得る；を包含する、方法。 ２．前記第１の核酸が配列番号１の中から選択される配列と相補的な配 列を有する、請求項１に記載の方法。 ３．前記第１の核酸に相補的な配列に作動可能に連結したプロモーター を含有する、天然に存在しない第２の核酸を転写する工程をさらに包含する、請 求項１に記載の方法。 ４．前記第１の核酸がホスホロチオエート核酸アナログである、請求項 ２に記載の方法。 ５．前記第１の核酸が３’末端に連結したコレステロール分子をさらに 含有する、請求項１に記載の方法。 ６．核酸の翻訳を増大する方法であって、該核酸とペスチウイルスホモ ロジーボックスIVの配列に対応する配列を有する核酸とを作動可能に連結して翻 訳され得るこれらの複合核酸を形成する工程、を包含する方法。 ７．核酸の翻訳を増大する組成物であって、翻訳されるべき核酸に作動 可能に連結するための、ペスチウイルスホモロジーボックスIV領域の配列に対応 する配列を有する核酸を含有する、組成物。 ８．Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）核酸からのHCVタンパク質の翻訳を制御す るための組成物であって、HCVの５’UT領域内のセンス鎖にある配列に相補的な 配列を有する天然に存在しない第１の核酸を含有する、あるいは該相補的な配列 を有する核酸を転写して形成し得る、組成物： ここで該第１の核酸は、ヘアピン形成領域、ペスチウイルスホモロジーボック スIV領域、および完全長HCV RNAを切断してサブゲノムHCV RNAを形成する切断領 域からなる群より選択される配列を含有する。 ９．前記第１の核酸が、配列番号１の中から選択される配列に対応する 配列を有する、請求項８に記載の組成物。 １０．前記第１の核酸がホスホロチオエート核酸アナログである、請求 項８に記載の組成物。 １１．前記第１の核酸が３’末端に連結したコレステロール分子をさら に含有する、請求項８に記載の組成物。