JP2000506731A

JP2000506731A - 短い外部ガイド配列

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Publication number: JP2000506731A
Application number: JP9532786A
Authority: JP
Inventors: ウェーナー，マーティナ; マ，マイケル; ティー．ジョージ，シャジ
Original assignee: イノーバーラボラトリーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1996-03-14
Filing date: 1997-03-14
Publication date: 2000-06-06
Anticipated expiration: 2017-03-14
Also published as: DE69729292D1; EP0894129B1; ATE267866T1; US5877162A; DE69729292T2; AU2206197A; DK0894129T3; JP4062365B2; EP0894129A1; ES2221955T3; WO1997033991A1

Abstract

(57)【要約】真核生物RNAse Pの外部ガイド配列（EGS）分子は、標的RNAの効率的および特異的切断を標的化するように操作される。DNAse Pの外部ガイド配列が、標的RNA分子に優先的に結合させ、かつ標的RNA分子のRNAse P媒介切断を促進することを可能にする特定のヌクレオチド配列を含有する操作されたRNA分子が、設計され、合成される。短い外部ガイド配列(SEGS)分子は、標的分子にハイブリダイズしたとき、RNAse Pによる基質として認識される最小構造を提供するように構築されている。SEGS／標的構造は、tRNAのＡステムおよびＴステム（RNAse Pの天然基質）に類似の構造で構成される。SEGSは、これらのステム構造の半分のみを作出する。ステム構造の他方の半分は、標的分子によって提供される。標的分子によってRNAse P基質構造の大半を形成させることにより、開示されたSEGS分子は、以前のEGS分子より有意に小さいものとなり得る。これにより、SEGS分子は、治療剤として特に有用となる。なぜなら、それらは、量的に製造および投与のためにより簡単であるからである。

Description

【発明の詳細な説明】短い外部ガイド配列発明の背景本出願は、RNAse PによるRNAの切断を標的化するように設計された方法および外部ガイド配列組成物に関する。リボ核酸（RNA）分子は、遺伝情報のキャリア（例えば、レトロウイルスゲノムRNAおよびメッセンジャーRNA（mRNA）分子）、およびタンパク質合成に不可欠な構造物（例えば、トランスファーRNA（tRNA）およびリボゾームRNA（rRNA）分子）として作用し得るだけでなく、核酸分子を特異的に切断する酵素としても作用し得る。このような触媒性RNA分子はリボザイムと呼ばれる。 Altman博士およびCech博士（彼らは、1989年にノーベル賞を授与された）による触媒性RNAの発見は、商業的適用（特に、治療物）において多くの関心を生み出した（Altman，Proc．Natl．Acad．Sci．USA90:10898-10900(1993)；Symons， Annu．Rev．Biochem．61:641-671(1992)；Rossiら、Antisense Res．Dev.，1： 285-288(1991)；Cech，Annu．Rev．Biochem．59:543-568，(1990)）。数種のクラスの触媒性RNA（リボザイム）が記載され、その中には、イントロン由来リボザイム（WO 88/04300；また、Cech，T.，Annu．Rev．Biochem.，59:543-568，(1 990)も参照のこと）、ハンマーヘッド型リボザイム（GeneShearsによるWO 89/05 852およびEP 321021）、アクスヘッド（axehead）型リボザイム（Innovirによる WO 91/04319およびWO 91/04324）が含まれる。 RNAse P 別のクラスのリボザイムには、酵素RNAse PのRNA部分が含まれる。RNAse Pは、トランスファーRNA（tRNA）のプロセシングに関与し、タンパク質合成機構の共通の細胞性成分である。細菌性RNAse Pは、２つの成分、タンパク質（C5）およびRNA（M1）を含む。Sidney Altmanおよび彼の共同研究者らは、M1 RNAがまさに完全な酵素のように機能し得ることを実証し、Escherichia coliにおいてこの RNAが本質的に触媒成分であることを示した（Guerrier-Takadaら、Cell 35:849- 85 7(1983)）。その後の研究において、Altman博士および同僚は、外部ガイド配列（EGS）を用いることによって、事実上いかなるRNA配列をも細菌性RNAse Pに対する基質に変換するための方法を開発した。外部ガイド配列は、切断されるべき RNA中の切断部位の3'側にヌクレオチドに相補的な少なくとも７ヌクレオチドをその5'末端に有し、そしてその5'末端にヌクレオチドNCCA（Nは任意のヌクレオチドである）を有する（YaleによるWO 92/03566ならびにForsterおよびAltman， Science 238:407-409（1990）。同様の原理を用いて、EGS/RNAse Pが指示するRNAの切断が、真核生物系での使用のために開発されており、ここでは、外部ガイド配列は、tRNAのステムおよびループ構造に類似の構造を有し、そしてここでは、基質RNAは、EGSの末端にハイブリダイズして、tRNAのアクセプターおよびＤステムに類似の構造を形成する（ Yuanら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:8006-8010(1992)；YaleによるWO 93/2 2432）。続いて、真核生物RNase Pと共に用いられるEGS分子がtRNAのＴステムおよびループに類似の構造のみを形成する必要があることが示されており、ここでは、再度、基質RNAは、EGSの末端にハイブリダイズし、tRNAのアクセプターおよびＤステムに類似の構造を形成する（WO 95/24489、Yale）。これらのEGS分子は、標的RNA分子のRNase P媒介切断を促進するのに有用である。それらは、比較的小さなEGS分子のみが投与される必要があるので、インビボでの使用に特に有用である。触媒RMase Pは、動物または患者の細胞中に既に存在し、かつ活性である。YuanおよびAltman，EMBO J 14:159-168(1995)、およびCarraraら、Proc．Na tl．Acad．Sci．(USA)92:2627-2631(1995)、後者は、RNase Pによる基質の切断に必要な最小構造を決定した。本発明の目的は、ウイルス性疾患および異常転写産物が関与する疾患の処置を目標とする治療薬、およびそれらの使用方法を提供することである。本発明の別の目的は、RNase Pの短い外部ガイド配列、このような短い外部ガイド配列をコードするベクター、およびそれらの使用方法を提供することである。本発明の別の目的は、ヌクレアーゼ分解に対して増強した耐性を有するRNAse Pの化学的に修飾した短い外部ガイド配列を提供することである。本発明の別の目的は、RNAse Pの短い外部ガイド配列によって促進された標的R NA分子の切断方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、肝炎のようなウイルスに対して特異的に標的化された RNAse Pの短い外部ガイド配列、このような外部ガイド配列をコードするベクター、およびそれらの使用方法を提供することである。発明の要旨真核生物RNAse Pに対する外部ガイド配列（EGS）分子は、標的RNAの効率的かつ特異的な切断を標的化するように操作される。それらは、DNAse Pの外部ガイド配列が、標的RNA分子に優先的に結合させ、かつ標的RNA分子のRNAse P媒介切断を促進することを可能にする特定のヌクレオチド配列を含有する。短い外部ガイド配列(SEGS)分子は、標的分子にハイブリダイズしたとき、RNAse Pによる基質として認識される最小構造を提供するように構築されている。小EGS／標的構造は、tRNAのＡステムおよびＴステム（RNAse Pの天然基質）に類似の構造を含む。SEGSは、これらのステム構造の半分のみを作出する。ステム構造の他方の半分は、標的分子によって提供される。標的分子によってRNAse P基質構造の大半を形成させることにより、開示されたSEGS分子は、以前のEGS分子より有意に小さいものとなり得る。これにより、SEGS分子は、治療剤として特に有用となる。なぜなら、それらは、量的に製造および投与のためにより簡単であり、かつさほど高価でないからである。修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド連結を有するこれらのSEGS分子の化学的に修飾された型は、ヌクレオチド分解に対するそれらの耐性を増強するように設計される。RNAse P標的化活性を維持しながら安定性の増強を達成するように、特定の領域が修飾される。実施例は、肝炎ウイルスRNAに結合し、そして肝炎ウイルスRNAのRNAse P切断を促進するRNAse PのSEGS分子が構築されたことを実証する。構築物スクリーニングの目的のためのSEGSの活性の決定方法、およびこのようなRNA分子の使用方法および生産方法もまた、開示される。図面の簡単な説明図１は、標的RNA分子にハイブリダイズされた短い外部ガイド配列（SEGS）の構造の図である。SEGS（配列番号６）および標的RNA分予（配列番号７）の部分、各々がSEGS/標的RNA複合体における特異的構造上の役割を果たす。SEGSの部分は、 5'から3'へ、Ｔ認識アームおよびＡ認識アームである。標的RNAの部分は、5'から3'へ、第１標的領域、突出(bulge)領域、第２標的領域、そしてターン領域である。SEGSと標的RNAとの間の一次構造の関連性は、Ａ認識アームが第１標的領域に相補的であり、そしてＴ認識アームが第２標的領域に相補的である点にある。ターン領域の２つのヌクレオチドを除いて、示す配列は、単なる例であり、そして一般の標的RNAのRNAse P媒介性切断を得ることに対して重要でない。本例において、標的RNAは、HBV RNAである。図２は、SEGS（EGS 3；配列番号1）およびヌクレオチド配列（配列番号２）を有する短いモデル標的RNA（T 10）の構造の図である。２つのオリゴヌクレオチドを、tRNAのＡステムおよびＴステムに類似する構造を形成する塩基対形成を示すように整列する。この構造は、真核生物のRNAse Pによって認識され、そして標的RNAのRNAse P媒介性切断を促進する。RNAse P切断部位を矢印で示す。図３は、ヌクレオチド配列（配列番号３）を有するSEGS（EGS a）および配列番号４のヌクレオチド1〜36において示されるヌクレオチド配列を有する短いモデル標的RNA（T a）の構造の図である。２つのオリゴヌクレオチドを、tRNAのＡステムおよびＴステムに類似する構造を形成する塩基対形成を示すように整列する。この構造は、真核生物のRNAse Pによって認識され、そして標的RNAのRNAse P媒介性切断を促進する。RNAse P切断部位を矢印で示す。モデル標的RNAの部分は、HBV配列の一部と適合する。「壊れた」Ｔループに含まれる配列は、tRNA^Tyr のＴループにおける配列と同一である。図４は、ヌクレオチド配列（配列番号３）を有するEGSおよびヌクレオチド配列（配列番号４）を有する短いモデル標的RNA（T a'）の構造の図である。２つのオリゴヌクレオチドを、tRNAのＡステムおよびＴステムに類似する構造を形成する塩基対形成を示すように整列する。この構造は、真核生物のRNAse Pによって認識され、そして標的RNAのRNAse P媒介性切断を促進する。RNAse P切断部位を矢印で示す。モデル標的RNAは、HBV配列の一部と適合する。図５は、EGSおよび標的RNAの構造の図である。短いモデル標的RNA（T 7；配列番号２）にハイブリダイズされた15ヌクレオチドSEGS（EGS 3；配列番号１）の構造を、左側に示す。短いモデル標的RNA（T 7；配列番号２）にハイブリダイズされた12ヌクレオチドSEGS（EGS 7；配列番号１のヌクレオチド４〜15）の構造を、右側に示す。SEGSおよび標的RNAを、tRNAのＡステムおよびＴステムに類似する構造を形成する塩基対形成を示すように整列する。この構造は、真核生物の RNAse Pによって認識され、そして標的RNAのRNAse P媒介性切断を促進する。RNA se P切断部位を矢印で示す。図６は、SEGS/標的RNA複合体に類似する最少RNAse P基質の構造の図である。基質のヌクレオチド配列は、配列番号５である。この構造は、真核生物のRNAse Pによって認識され、そして切断される。RNAse P切断部位を矢印で示す。配列は、HBV配列の一部に対するモデルである。図７は、2.1kb HBV RNAのヌクレオチド375〜424（配列番号７）に対応するHBV RNAの一部へのヌクレオチド配列（配列番号６）を有するSEGS（HBV B）のハイブリダイゼーションによって形成される構造の図である。SEGSおよびHBV RNAを、t RNAのＡステムおよびＴステムに類似する構造を形成する塩基対形成を示すように整列する。RNAse P切断部位を矢印で示す。図８は、2.1kb HBV RNAのヌクレオチド543〜598（配列番号９）に対応するHBV RNAの一部へのヌクレオチド配列（配列番号８）を有するSEGS（HBV C）のハイブリダイゼーションによって形成される構造の図である。SEGSおよびHBV RNAを、tRNAのＡステムおよびＴステムに類似する構造を形成する塩基対形成を示すように整列する。RNAse P切断部位を矢印で示す。図９は、2.1kb HBV RNAのヌクレオチド673〜718（配列番号11）に対応するHBV RNAの一部へのヌクレオチド配列（配列番号10）を有するSEGS（HBV F1）のハイブリダイゼーションによって形成される構造の図である。SEGSおよびHBV RNAを、tRNAのＡステムおよびＴステムに類似する構造を形成する塩基対形成を示すように整列する。RNAse P切断部位を矢印で示す。図10は、2.1kb HBV RNAのヌクレオチド1559〜1606（配列番号13）に対応するH BV RNAの一部へのヌクレオチド配列（配列番号12）を有するSEGS（HBV H）のハイブリダイゼーションによって形成される構造の図である。SEGSおよびHBV RNA を、tRNAのＡステムおよびＴステムに類似する構造を形成する塩基対形成を示すように整列する。RNAse P切断部位を矢印で示す。図11は、2.1kb HBV RNAのヌクレオチド1562〜1606（配列番号13のヌクレオチド４〜48）に対応するHBV RNAの一部に対するヌクレオチド配列（配列番号14）を有するSEGS（HBV H1）のハイブリダイゼーションによって形成される構造の図である。SEGSおよびHBV RNAを、tRNAのＡステムおよびＴステムに類似する構造を形成する塩基対形成を示すように整列する。RNAse P切断部位を矢印で示す。図12は、SEGS/標的RNA複合体に類似する最少RNAse P基質の構造の図である。基質のヌクレオチド配列は、配列番号15である。この構造は、真核生物のRNAse Pによって認識され、そして切断される。RNAse P切断部位を矢印で示す。ステムおよびＴループに含まれる配列は、ＡステムおよびＴステムならびにtRNA^Tyrのループにおける配列と同一である。図13は、ヌクレオチド配列（配列番号１）を有するSEGS（EGS 3）および配列番号２のヌクレオチド１〜36に示されるヌクレオチド配列を有する短いモデル標的RNA（T 7）の構造の図である。２つのオリゴヌクレオチドを、tRNAのＡステムおよびＴステムに類似する構造を形成する塩基対形成を示すように整列する。この構造は、真核生物のRNAse Pによって認識され、そして標的RNAのRNAse P媒介性切断を促進する。RNAse P切断部位を矢印で示す。ステムおよび「壊れた」Ｔループに含まれる配列は、ＡステムおよびＴステムならびにtRNA^Tyrのループにおける配列と同一である。発明の詳細な説明標的RNA分子の切断を促進するのに適切なオリゴヌクレオチドが、構築されている。このオリゴヌクレオチドは、標的RNA分子に特異的に結合しそのRNAse P媒介性切断を促進するように、そして増強されたヌクレアーゼ耐性を有するように設計された、真核生物RNAse Pのための外部ガイド配列(EGS)分予である。これらのEGA分子は、以前の外部ガイド配列とは構造および大きさにおいて異なり、そして短い外部ガイド配列(SEGS)と言われる。重要な識別する特徴は、SEGSそれ自体がtRNAのTステムおよびループに類似の構造を形成しないことである。 B型肝炎ウイルス感染の処置における使用に適切なSEGSが構築されている。本明細書中で使用される「外部ガイド配列」および「EGS」は、標的RNAにおいてRN Ase Pのための活性切断部位を形成する任意のオリゴヌクレオチドを言う。「短い外部ガイド配列」および「SEGS」は、以下に記載のEGSの短い形態を言う。用語「短い外部ガイド配列」および「SEGS」は、一般に「短い」EGS分子（即ち、単に「短い」EGS分子）よりもむしろ以下に記載されるような短い形態のEGS分子のみを言うことが意図される。この区別を強調するために、「短い外部ガイド配列」は本明細書中で大文字で表される。本明細書中で外部ガイド配列への参照がなされる場合、それはSEGSが包含されることが意図される。以前のEGS分子は、標的RNA分子にハイブリダイズしてtRNAのAステムおよびDステムに類似の構造を形成するような3'テイルおよび5'テイルを有し、少なくとも tRNAのTステムおよびループに類似する構造を形成するように設計された。TループおよびDステムに類似の構造は標的RNA／EGS構造の切断に不要であることが発見されている。開示された短い外部ガイド配列分子において、SEGSおよび標的RN A分子は共に、tRNAのAステムおよびTステムに類似の構造を形成する。以前のEGS 分子とは異なり、SEGSは、Tループを形成せず、そしてそれ自体はTステムに類似の構造を形成しない。代わりに、標的RNA分子は、SEGSにハイブリダイズして、t RNAのTステムに類似の構造の半分を形成する。その標的RNA分子にハイブリダイズしたSEGSの例は、図１に示される。 SEGSは、1)インタクトなＴループが存在しない、2)SEGSおよび標的RNAはtRNA のDステムに類似の構造を形成しない、および3)標的RNAはSEGSとともにtRNAのT ステムに類似の構造の半分を形成する、という点で以前のEGS分子と区別される。 SEGSは、以前のEGS分子を越えるいくつかの利点を有する。1)これらのより短い長さのため、SEGSの合成および精製が容易であり、そしてより少ない費用ですむ、2)以前のEGS分子において標的認識のために使用された短いDステムはEGSにおいてより低い標的特異的配列を提供し、それにより切断の特異性が減少するので、標的認識のためのＴステムの使用はEGSにより大きな特異性を与える、および3)SEGSは細胞により、より容易に取り込まれる。Ｉ．SEGS分子の設計および合成 SEGS分子は、真核生物のRNAse Pの前駆体tRNAの天然の切断部位に類似した二次構造および三次構造を形成する標的基質に結合する合成オリゴヌクレオチドである。SEGS分子がRNAse P活性を標的化し、促進する能力は、以下により詳細に記載するように、標的RNA配列のRNAse Pによる切断についてのインビトロ活性アッセイを用いて容易に決定される。修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド連結を有するSEGS分子の場合、安定性アッセイにより種々のタイプの修飾のヌクレアーゼ耐性の決定が可能になる。活性アッセイは、異なる修飾を有するSEGS分子により促進されるRNAse P媒介性切断の効率の比較を可能にする。ならびに、アッセイは、修飾されたSEGS分子の安定性および切断効率を至適化および平衡化するために使用される。ウイルス疾患の処置において使用するために適切である例示のSEGS分子が構築されている。特異的標的はＢ型肝炎ウイルスであり、より詳細には、Ｂ型肝炎表面抗原（HBsAg）コードRNAである。HBsAgがウイルス表面構造(suprastructure) および感染において不可欠な役割を果たすので、SEGSベースの治療は、HBsAg mR NAの切断を介して肝炎をダウンレギュレートするために使用され得る。Ｂ型肝炎 RNAまたは他の標的RNA内の好ましい標的部位は、標的RNAの全ての形態において見られ、そして以下に記載するようにUNRモチーフを有する保存配列の領域である。このような好ましい５つの部位は、Ｂ型肝炎RNAのHBsAgコード領域内で同定され、そして配列番号６、配列番号８、配列番号10、配列番号12、および配列番号14において示されるヌクレオチド塩基配列を有するSEGS分子により標的化される。Ａ．SEGS分子の設計 SEGS分子を、プレーtRNA分子の基本構造の一部を基質認識配列を形成するように適合させることによって設計し得る。この認識配列は、標的RNA分子における標的配列の領域に相補的である。SEGSにおいて、認識配列は、Ａ認識アームおよＴ認識アームといわれる２つの認識アームから構成される。これらのアームは、標的RNAの標的配列の領域と組合せて、それぞれtRNA分子のＡステムおよびＴステムに類似の構造を形成する。Ｔ認識アームは、Ａ認識アームの5'でそれに隣接して位置している。認識アームの配列は、標的RNAの標的配列の２つの領域（第１標的領域および第２標的領域と呼ばれる）に特異的に相補的になるように選択される。第１標的領域は、RNAse P-媒介切断が起こる部位を含み、これに隣接しそして3'である。認識アームの配列は、標的RNAの第１および第２標的領域が短い対合していない領域（突出(bulge)領域という）によって分離されるように選択される。この構造の形成は、SEGSのヌクレオチド配列を規定するための唯一の本質的な必要条件である。しかし、認識アームの配列がまた、UNRモチーフが第２標的領域に隣接し3'である標的RNA分子に存在するように選択されることが好ましい。UNRモチーフは、第２標的領域に直に隣接し得るか、またはそれは第２標的領域から１つまたはいくつかのスペーサーヌクレオチドによって分離され得る。UNRモチーフは、第２標的領域から０〜10スペーサーヌクレオチドによって分離されていることが好ましい。UNRモチーフは第２標的領域から０〜３スペーサーヌクレオチドだけ分離されていることがより好ましい。UNRモチーフは、第２標的領域から１スペーサーヌクレオチドだけ分離されていることが最も好ましい。UNRモチーフは、UNRのヌクレオチド配列を有し、ここでＮは、任意のヌクレオチドを表し、Ｒは任意のプリンヌクレオチドを表し、そしてＵは、ウリジンヌクレオチドを表す。UNRモチーフを形成する標的RNA分子の標的配列または対応する配列の領域、およびスペーサーヌクレオチドは、ターン領域といわれる。ターン領域は、もし存在すれば、第２標的領域に直に隣接しそして3'である。いかなる特定の理論に制限されることを所望せずに、標的RNAの標的配列のターン領域のウリジンターン構造(QuigleyおよびRich，Science 194:796-806(1976)、ならびにJunkerおよびPardi，RNA 1:219-222(1995))を形成する能力は、標的RNAのRNAse P-媒介切断を促進を助ける。上記の関係に従って、標的RNAの標的配列は、5'から3'に向かって、第１標的領域、突出領域、および第２標的領域から構成され、ここで、SEGSのＡ認識アームは、第１標的領域に相補的であり、そしてSEGSのＴ認識アームは、第２標的領域に相補的である。UNRモチーフを有するターン領域はまた、第２標的領域の3' の標的配列に存在する。これらの領域および関係の例を図１に示す。認識アームは、機能的SEGS分子を生じる任意の長さであり得る。Ａ認識アームおよびＴ認識アームは合わせて12〜16ヌクレオチドになることが好ましい。Ａ認識アームおよびＴ認識アームは合わせて12または13ヌクレオチドになることが最も好ましい。一般に、Ａ認識アームは、７〜９ヌクレオチド長であり、Ｔ認識アームは、５〜７ヌクレオチド長であることが好ましい。Ａ認識アームは、７または８ヌクレオチド長であり、そしてＴ認識アームは５または６ヌクレオチド長であることが最も好ましい。一般に、認識アームは、任意のヌクレオチド配列を有し得る。以下に議論されるように、配列の選択は、好ましくは目的の標的RNAの標的配列の配列に基づく。Ａ認識アームの3'末端のヌクレオチドは、シチジンまたはグアニジンヌクレオチドであることが好ましい。Ａ認識アームの3'末端のヌクレオチドは、シチジンヌクレオチドであることが最も好ましい。突出領域は、機能的SEGS分子を生じる任意の長さであり得る。突出領域は、１〜30ヌクレオチド長であることが好ましい。突出領域は、５〜15ヌクレオチド長であることがより好ましい。突出領域は、９ヌクレオチド長であることが最も好ましい。ターン領域は、もし存在するならば、機能的SEGS分子を生じるコンセンサス式UNRを含む任意の配列を有し得る。ターン領域のヌクレオチド配列は、本明細書中で、標準的なヌクレオチド塩基シンボルを用いて表される。参照のために、Ｎは、任意のヌクレオチドを表し、Ｒは任意のプリンヌクレオチドを表し、Ｙは任意のピリミドヌクレオチドを表し、Ａは、アデニンヌクレオチドを表し、Ｃは、シトシンヌクレオチドを表し、Ｇは、グアニンヌクレオチドを表し、Ｔは、チミンヌクレオチドを表し、そしてＵはウラシルヌクレオチドを表す。ターン領域は、NUCRまたはUUNRの配列を有することがより好ましい。ターン領域はUUCR の配列を有することが最も好ましい。標的RNAの標的配列のターン領域は、式NNNRで包含されるヌクレオチド配列を含むことが好ましい。標的RNAの標的配列のターン領域は、式NNYR、YNNR、またはNYNRのうちの少なくとも１つによって包含されるヌクレオチド配列を含むことがより好ましい。標的RNAの標的配列のターン領域は、式YNYR、NYYR、またはYYN Rのうちの少なくとも１つによって包含されるヌクレオチド配列を含むことがなおより好ましい。標的RNAの標的配列のターン領域は、式YYYR、YUNR、またはNUY Rのうちの少なくとも１つによって包含されるヌクレオチド配列を含むことがなおより好ましい。標的RNAの標的配列のターン領域は、式UYYRもしくはYYCRのうちの少なくとも１つ、または式YUYR、UUNR、またはNUCRのうちの少なくとも１つによって包含されるヌクレオチド配列を含むことがなおより好ましい。標的RNA の標的配列のターン領域は、式UYCR、または式UUYRもしくはYUCRのうちの少なくとも１つによって包含されるヌクレオチド配列を含むことがなおより好ましい。標的RNAの標的配列のターン領域は、式UUCRによって包含されるヌクレオチド配列を含むことが最も好ましい。標的RNAの標的配列のターン領域が式NNNYによって包含されるヌクレオチド配列を包含する場合、ターン領域は、式YNNYによって包含されるヌクレオチド配列を含むことが好ましい。標的RNAの標的配列のターン領域が式YNYYまたはYYNYの少なくとも１つによって包含されるヌクレオチド配列を含むことがより好ましい。標的RNAの標的配列のターン領域が式YYYYによって包含されるヌクレオチド配列を含むことがなおより好ましい。標的RNAの標的配列のターン領域が式YUYYまたは式UYCYによって包含されるヌクレオチド配列を含むことがなおより好ましい。標的RNAの標的配列のターン領域が式UUYYまたはYUCYのうちの少なくとも１つによって包含されるヌクレオチド配列を含むことがなおより好ましい。標的RNA の標的配列のターン領域が式UUCYによって包含されるヌクレオチド配列を含むことが最も好ましい。機能的SEGS分子は、それらが標的RNAと組合せて、非対合領域がtRNAのＡステムおよびＴステムに対応する構造の間の標的RNAに存在するように、前駆体tRNA のＡステムおよびＴステムに対応する構造を形成することのみを必要とする。tR NAのＴループに対応する構造は必要とされない。従って、機能的SEGS分子は、標的RNA分子の２つの領域に相補的なヌクレオチド配列のみを必要とする。ここで、標的RNA分子の領域は、SEGSに相補的でない領域である突出領域によって分離されている。UNRモチーフまたは上記の別の好ましいターン領域ヌクレオチド配列を含むターン領域はまた、tRNAのＴステムに対応する構造に隣接しそして3'である標的RNAに存在する。 SEGSは、目的の任意の標的RNA分子の任意の配列を標的化するために設計され得る。しかし、SEGSは、好ましくは、目的の標的RNAのヌクレオチド配列をUNRモチーフまたは上記の別の好ましいターン領域ヌクレオチド配列の位置について検索することによって設計される。より好ましいSEGSについては、検索は、上記のターン領域の好ましい配列に制限され得る。一旦所望のターン配列が同定されると、SEGSのＴ認識アームの配列は、ターン領域配列に隣接しそして5'であり、所望であれば、１つまたはいくつかのスペーサーヌクレオチドによって分離されている標的RNA中のヌクレオチドに相補的であるように選択される。標的RNA中のこれらのヌクレオチドは、第２標的領域を表す。SEGSのＡ認識アームの配列は、第２標的領域の5'であり、非対合領域によって分離されている標的RNA中のヌクレオチドに相補的であるように選択される。 SEGSの設計は、例とともに例示され得る。UNRモチーフを含むＢ型肝炎ウイルスのヌクレオチド配列の部分は：CUGGAUGUGUCUGCGGCGUUUUAUCAUCUUCCUCUUCAUCCU GCUGCUAU（配列番号７；太字はUNRモチーフ）である。５ヌクレオチドのＴ認識アーム長、９ヌクレオチドの突出領域長、８ヌクレオチドのＡ認識アーム長、およびターン領域中の単一スペーサーヌクレオチドを選択して、SEGSの配列は、UN Rモチーフの5'であるスペーサーヌクレオチド（Ｕ）、および続くターン領域の5 'である15番目のヌクレオチドで始まる７ヌクレオチドの相補物を含む、ターン領域に隣接しそして5'である５つのヌクレオチドの相補物である。このSEGS(HBV B)は、配列GAGGAAACGCCGC（配列番号６；太字はＴ認識アーム）を有する。SEGS HBV BおよびHBV RNAの複合体の構造を、図７に示す。HBVをまた含む他の例を図８、９、10、および11に示す。 SEGS分子はまた、Ａ認識アームの3'末端およびＴ認識アームの5'末端のいずれかまたは両方でさらなるヌクレオチド配列を含み得る。このようなヌクレオチド領域は、それらが標的RNAの標的配列に相補的でないことにおいてSEGSの認識配列から区別される。このような配列は、SEGSの認識配列の一部であると考えられている。Ｔ認識アームの5'末端のこのようなさらなるヌクレオチド配列の例を、図２に示す。 SEGS分子は、Yuanら、Proc．Natl．Acad．Scl.，USA，89:8006-8010(1992)に記載されるアッセイまたは下記のアッセイを用いて、RNAse Pによる標的RNA切断を促進する能力について容易にスクリーニングされ得る。 SEGSおよびRNAse Pの触媒RNAサブユニットは結合され、SEGSの標的化機能およびRNAse P触媒RNAの切断機能の両方を保有する単一のオリゴヌクレオチド分子を形成し得る。単一のオリゴヌクレオチド分子におけるこのような組み合わせは、 RNAse P内部ガイド配列（RIGS）と呼ばれる。RIGSは、SEGSと同じ様式で標的RNA 分子を切断するために用いられ得る。 RIGSは、任意の適切な手段によりガイド配列をRNAse P触媒配列へ連結することにより形成され得る。例えば、SEGSおよびRNAse P触媒RNAは、分離分子として調製され得、次いでインビトロにおいて共有結合される。あるいは、完全なRIGS は、化学合成によるか、あるいは連結されたSEGSおよびRNAse P触媒配列をコードするDNA分子のインビトロまたはインビボ転写によるかのいずれかで、単一の分子として合成され得る。SEGSとRIGSのRNAse Pドメインとの間の連結は、ドメインが標的RNAを切断することを可能にする任意の形態を有し得る。例えば、２つのドメインは、オリゴヌクレオチドリンカーにより接合され得る。好ましくは、リンカーは、ホスホジエステル結合により接合された通常のヌクレオチドからなる。SEGSおよびRNAse P触媒配列成分は、SEGS成分の3'末端または5'末端のいずれかに連結されたRNAse P触媒配列と、いずれかの順で接合され得る。RIGSの構築方法および使用方法は、Yale UniversityによるPCT出願公開番号WO95/24489 に記載される。 SEGS分子はまた、調節可能であり得る。調節可能なSEGS分子は、上記のようにリガンド結合配列に連結され、このリガンドの制御下にSEGS分子の活性をおき、および活性化または不活性化のためにリガンドの存在を必要とする、SEGS配列である。RNA分子は、ある部分がリガンドに結合し得、そして他の部分がSEGS配列であるように構築される。リガンドを結合する分子を選択した後、リガンド結合分子を、リガンドまたは「co-drug」の存在下および非存在下においてその触媒機能についてアッセイする第２の選択プロセスを行う。この手段では調節可能な SEGS分子は、リガンドの存在下における標的RNAの切断、またはリガンドの非存在下における標的RNAの切断において使用するために選択される。この方法および調節可能なSEGS分子は、制御様式での標的RNA分子の切断において有用である。これは、これらのRNA分子の完全な不活性化により宿主細胞を殺傷することが望ましくない細胞内に標的RNA分子が存在する場合、特に有用である。調節可能なEGS分子の形態、選択、および使用は、PCT出願公開番号WO94/1 3791および同WO94/13833に十分に記載される。同じ方法が、調節可能なSEGS分子を形成、選択、および使用するために使用され得る。 SEGS分子、および公知の配列を有するSEGS分子をコードするDNA配列を産生または合成するための方法は、自動化核酸合成を用いて、例えば、Applied Biosys tems，Inc．(Foster City，CA)またはPharmacia Oligo Pilot（Pharmacia，Pisc ataway，NJ）によるDNA392型合成機でのシアノエチルホスホルアミダイト法を用いて、日常的に合成され得る。核酸分子を合成するための他の方法もまた利用可能である（例えば、Ikutaら，Ann．Rev．Biochem．53:323-356(1984)（ホスホトリエステルおよびホスファイト-トリエステル法）;Narangら，Methods Enzymol ．65:610-620(1980)（ホスホトリエステル法）を参照のこと）。あるいは、SEGS 分子は、DNAテンプレートを例えば、T7 RNAポリメラーゼを用いて転写することにより合成され得る（Milliganら，Nucl Acids Res．15:8783(1987)）。SEGS分子はまた、細胞中にSEGSをコードおよび発現するベクターを配置することにより、細胞中で合成され得る。 B.SEGS分子の活性無制限の量のRNAse P存在下で、種々の量のSEGSとともにインキュベーションした後に残存する基質RNAのパーセントを測定するインビトロ切断アッセイは、S EGS/RNAse P複合体の潜在的な活性の指標として使用される。最も高いインビトロ活性を示すSEGS/RNAse P複合体を、さらなる試験のために選択する。残存する RNAのパーセントは、SEGS濃度の関数としてプロットされ得る。SEGS/RNAse Pの触媒効率は、k_cat/K_m（ここでk_catは切断の速度定数であり、そしてK_mはミカエリス定数である）、遊離のSEGSおよび基質RNA分子の反応に対する二次速度定数として表され得る。HeidenreichおよびEcksteinの方法（J．Biol．Chem.，267:1 904-1909(1992)）によれば、k_cat/K_mが式 -lnF/t＝(k_cat/K_m）[C] を用いて決定され、ここでＦは、残存基質の画分であり、ｔは反応時間であり、そして[C]はSEGS濃度である。好ましいSEGS構築物は、肝炎基質RNAに結合し、そしてその優先的なRNAse P切断を促進する構築物である。好ましい構築物は、実施例１に記載のリボザイム切断アッセイを用い、そして、上記のk_cat/K_m値により決定されるように、どの構築物が肝炎基質RNA配列の特異的RNAse P切断を媒介するのに最も効果的であるかを決定して選択され得る。 SEGSの細胞内活性は、目的の標的RNAを発現する細胞を用いて試験され得る。例えば、上記のNUNRモチーフを有するHBV RNAの種々の領域に標的化したSEGS分子は、HBV RNAを発現する細胞において試験され得る。このために、SEGSは、Hep G2.2.15細胞（この細胞は、HBV RNAを構成的に発現し、そしてHBV粒子を完全に組み立てる(Sellsら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，84:1005-1009(1987))）においてウイルス複製の阻害について試験され得る。このアッセイは、一般的にKo rbaおよびGerin（Antiviral Res．19:55-70(1992)）により記載されるように行われ得る。SEGS分子は、細胞にヘム脂質粒子、特にヘムに結合した1,2-ジオレオイルオキシ-3-(トリメチルアンモニウム)プロパン（DOTAP）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）との複合体（DDHと呼ばれる）として1 0日間にわたって送達され得、そして培地中に分泌されたHBV粒子のDNAゲノムはドットブロットアッセイを用いてアッセイされ得る。ヘム脂質粒子は、一般に以下の通りに調製され得る。ヘム（FeプロトポルフィリンIXクロリドとして、ヘミン）は、8.3mM NaOHを含有するエタノール中に溶解され、そして不溶性物質がl4krpmで10分間でペレット化される。カルボジイミドを用いる有効な結合を可能にするために、へム溶液のpHを、少容量のHCIの添加によりへムの沈澱を伴わずに減少させる。典型的な反応において、200mgのヘミンは8.3mM NaOHを含有する10mlエタノールに添加される。HClをヘム溶液の上清に添加してpHを1.7へと低下させ、ヘム溶液（約1.6mgヘムを含有する）、760μl （10μmol）DOPE（10mg/ml）および500μl DCC（10mg/ml）を添加し、そして結合を暗黒下、室温にて一晩、進行させる。クロロホルム中の10μmol DOTAPを滅菌ガラス試験管中のヘム結合DOPEに添加し、そして脂質をvortexデシケーター中で50℃にて20分間減圧下で薄膜へと乾燥させる。1mlの滅菌150mM NaClを脂質膜に添加する。そしてエマルジョンを、Bransonic 1210バスソニケーター中で47kH zで20℃で操作して30分間超音波処理し、濁った溶液を得た。脂質粒子を、Lipex Extruder（Lipex Biomembranes，Vancouver，Canada）を用いてポリカーボネート膜を通して押出す。 SEGS/脂質組成物を、SEGS分子を含有する溶液を150mM NaClに入れることにより調製し、そしてDDH脂質粒子(150mM NaCl中）を、0.2mg/mlの最終濃度までSEGS 溶液に添加する。室温にて15分間インキュベートした後、培養培地を添加し、そしてSEGS/脂質混合物を希釈して所望の最終濃度のSEGSを有するSEGS組成物を得る。等価な容量の150mMNaClをコントロールとして用いる。 HepG2.2.15細胞のコンフルエントな培養物を、96ウェル平底培養プレートで維持する。２連のプレートを、各SEGS処理のために用いる。各プレートで計３つの培養物を、希釈したSEGS組成物のそれぞれで処理する。培養物を、SEGS組成物の 10日間連続の日用量で処理する。培地を、新鮮なSEGS組成物で毎日交換する。これらの処理の効果を、細胞外HBVDNAレベルを測定することによりモニターする。これらのSEGSの抗ウイルス活性を、EC₅₀として計算し得る。EC₅₀は、コントロール組成物で処理した細胞と比較して産生されたHBVの量の50％低減が存在する、化合物の濃度である。比較のために、2'-3'-ddC（公知の強力な抗HBVヌクレオシドアナログ）の抗ウイルス効果が、同じアッセイにおいて測定され得る。 SEGSをうけた細胞の生存力を測定するフェノールレッドアッセイを用いて、SE GSの投与に関連した何らかの毒性（未処理細胞において観察される染料取り込みレベルの50％低下より大きいと定義される）が存在するか否かを決定し得る。 II.ヌクレアーゼ耐性SEGS分子Ａ．修飾のタイプ未修飾のオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼのない環境における有効なSEGS として機能し得るが、血清中および細胞内での短い半減期は、それらの治療としての有効性を減少させる。化学的修飾がなされ得、それは、標的RNAのRNase Ｐ媒介切断を促進するその生物学的機能を損なうことなくSEGSのヌクレアーゼ耐性を非常に増強する。一般的に、このような修飾は、SEGS中のヌクレオチドの2'位、SEGSの3'および5'末端、およびSEGS中のヌクレオチド間のリン酸結合においてなされ得る。例えば、SEGS構築物の塩基は、2'メトキシリボヌクレオチド、ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド、またはホスホロチオエートリボヌクレオチドにより、利用可能な核酸合成方法を用いて置換され得る。修飾されたヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド、ならびにそれらの合成方法は、公知である。これらのいくつかは、以下の文献に記載されている：Offenspergerら、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびSEGSを修飾するために使用される置換基を記載するにあたり、アルキルおよびアルキル基とは、直鎖、分岐鎖および環状アルキル基を含む、飽和脂肪族炭化水素をいう。この用途のためには、このようなアルキル基は、１から12個の炭素を有することが好ましい。このようなアルキル基は、１から６個の炭素を有することが、より好ましい。このようなアルキル基は、１から２個の炭素を有することが、さらにより好ましい。このようなアルキル基は、１個の炭素を有することが、最も好ましい。これらのアルキル基はまた、１つ以上のヒドロキシル基、１つ以上のアミノ基、またはそれらの両方を含み得る。このようなヒドロキシル基およびアミノ基は、アルキル基中の任意の炭素原子に結合され得る。本明細書中で用いる用語ヒドロキシアルキルは、１つ以上のヒドロキシル基を含むアルキル基をいうために使用され、用語アミノアルキルは、１つ以上のアミノ基を含むアルキル基をいうために使用され、そしてヒドロキシルアミノアルキルは、１つ以上のヒドロキシル基および１つ以上のアミノ基を含むアルキル基をいうために使用される。本明細書中で用いる、アリルまたはアリル基とは、直鎖、分枝差、および環式アリル基を含む、不飽和脂肪族炭化水素をいう。この用途のためには、このようなアリル基は、１から12個の炭素を有することが好ましい。このようなアリル基は、１から６個の炭素を有することが、より好ましい。このようなアリル基は、２から３個の炭素を有することが、さらにより好ましい。このようなアリル基は、３個の炭素を有することが、最も好ましい。他の置換基もまた、本明細書中に記載されたヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびSEGSを修飾するために使用され得る。例えば、アリール、アルカリール、およびアリールアルキルである。ここで、アリールとは、ベンジル基をいい、アルカリールとは、アリール基で置換されたアルキル基をいい、そしてアリールアルキルとは、アルキル基で置換されたアリール基をいう。ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびSEGSに関連する用語、修飾の本明細書中での使用は、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの、従来のヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドに対する化学的相違をいうことを意図する。本明細書中での用語、修飾の使用は、修飾されたヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはSEGSが生産される様式を、限定することを意図しない。同様に、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはSEGS上の化学的基を置換することへの言及は、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの従来のヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドに対する化学的相違をいうことを意図し、そしてヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはSEGSが生産される様式を限定することを意図しない。１．3'および5'末端における修飾。オリゴヌクレオチドアナログの分解が、主に3'-エキソヌクレアーゼによることが、現在の文献には十分に記述されている。いくつかの研究はまた、様々な3'-修飾が、これらのアナログのヌクレアーゼ感受性を非常に減少させ得ることを実証している。従って、3'エキソヌクレアーゼに対する感受性を減少させる他の方法は、遊離アミンの、SEGS分子の3'末端ヒドロキシル基の導入である（例えば、Orsonら、Nucl.Acids Res.、19:3435-3441 (1991)を参照のこと）。他の有用な3'末端修飾は、3'から3'への結合を有するSE GSのチミンヌクレオチド末端をカップリングすることである。このような構造を、本明細書中では、3'-3'−チミンヌクレオチドまたはT(3'-3'）という。好ましい3'修飾は、短い外部ガイド配列の3'ヒドロキシルが、化学的基（例えば、-H、-O-R¹，-NH₂、-NH-R¹、-N-R₂、Ｆ、および-3'-ヌクレオチド）により置換されたものである。ここで、各Ｒ¹は、独立して、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキル、アリル、-PR²(O)-R²、または-PR²(S)-R²であり、ここで、各Ｒ²は、独立して、Ｏ，Ｓ、Ｆ、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキル、アリル、 O-R³、S-R³であり、ここで各Ｒ³は、独立して、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキル、またはアリルである。より好ましい3'修飾は、短い外部ガイド配列の3'ヒドロキシルが、化学的基（例えば、 -H、-O-CH₃，-NH₂、-NH-CH₃、-N-(CH₃)₂、Ｆ、-3'-チミンヌクレオチド、-OPO(O )-CH₃、-OPO(S)-CH₃、-OPO(O)OCH₂CH(OH)-CH₂NH₂、および-OPO(S)OCH₂CH(OH)-CH₂ NH₂）で置換されたものである。最も好ましい3'修飾は、短い外部ガイド配列の 3'ヒドロキシルが、-3’チミンヌクレオチド、-OPO(O)OCH₂CH(OH)-CH₂NH₂、または-OPO(S)OCH₂CH(OH)-CH₂NH₂により置換されたものである。本明細書中で用いる、SEGSの3'ヒドロキシルとは、通常、SEGSの3'末端ヌクレオチドのリボース残基の3'炭素上に存在するヒドロキシル基をいう。本明細書中で用いる、SEGSの3'炭素とは、SEGSの3'末端ヌクレオチドのリボース残基の3'炭素をいう。 SEGSの5'末端は、ヒドロキシルまたはリン酸基を有することが好ましいが、5' 末端は、SEGSのヌクレアーゼに対する耐性を上昇させるために修飾され得る。好ましい 5'修飾は、短い外部ガイド配列の5'ヒドロキシルが、化学的基（例えば、-H、-O-R⁴，-NH₂、-NH-R⁴、-N−(R⁴)₂、およびＦ）で置換されたものである。ここで、各Ｒ⁴は、独立してアルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキル、アリル、-PR⁵(O)-R⁵、または-PR⁵(S)-R⁵であり、ここで各Ｒ⁵は、独立して、Ｏ、Ｓ，Ｆ、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキル、アリル、O-R⁶、またはS-R⁶であり、そしてここで、各Ｒ⁶は、独立して、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキル、またはアリルである。より好ましい5'修飾は、短い外部ガイド配列の5'ヒドロキシルが化学的基（例えば、-H、-O-CH₃， -NH₂、-NH-CH₃、-N-(CH₃)₂、Ｆ、-OPO(O)-CH₃、-OPO(S)-CH₃、-OPO(O)OCH₂CH(OH )-CH₂NH₂、および-OPO(S)OCH₂CH(OH)-CH₂NH₂)で置換されたものである。最も好ましい5'修飾は、短い外部ガイド配列の5'ヒドロキシルが、-OPO(O)OCH₂CH(OH)- CH₂NH₂、または-OPO(S)OCH₂CH(OH)-CH₂NH₂)で置換されたものである。本明細書中で用いる、SEGSの5'ヒドロキシルとは、通常はSEGSの5'末端ヌクレオチドのリボースの5'炭素に存在して、通常はそれにリン酸基が結合(attach)しているヒドロキシルをいう。本明細書中で使用する、SEGSの5'炭素とは、SEGSの5'末端ヌクレオチドのリボース残基の5'炭素をいう。他の有用な修飾は、インターカレート剤（例えば、酸性誘導体）の、5'末端リン酸への、（例えば、ペンタメチレンブリッジを用いた）共有結合である（例えば、Maherら、Science、245:725 〜730(1989)；Grigorievら、J．Biol．Chem.、267:3389-3395(1992)を参照）。W O 95/23225は、リボザイムの安定性を上昇させるための化学修飾（例えば、ヌクレオシドまたはヌクレオチドシュガーの5'炭素におけるアルキル基の導入）を記載する。このような修飾はまた、SEGS分子にも使用され得る。２．ヌクレオチドの２’位における修飾。有用であることが期待される化学的修飾の他のクラスは、ヌクレオチドのリボース部分の2'OH基の修飾であり、これは、様々な細胞内および細胞外ヌクレアーゼの活性に関して重要であることが分かっている。代表的な2'修飾は、2'-O−メチルオリゴヌクレオチド（Paolellaら、EMBO J.，11:1913-1919、1992）および2'-アミノオリゴヌクレオチド（Pieken ら、Science、253:314-317(1991)；HeidenreichおよびEckstain、J．Biol．Chem .、267:1904-1909(1992)）の合成である。SEGS分子はまた、デオキシリボヌクレオチドを含み得る。このような置換は、重要な2'OH基を除去することにより、ヌクレアーゼ耐性を改善する。WO 95/23225は、2'-デオキシ-2’-アルキルヌクレオチドを記載し、これは、オリゴヌクレオチドの安定性を増強するために存在し得る。好ましい2'修飾は、ヌクレオチドの2'ヒドロキシルが、化学的基（例えば、-H 、-O-R⁷，-NH₂、-NH-R⁷、-N-R⁷ ₂、Ｆ、および-2'−ヌクレオチド）で置換されたものである。ここで、各Ｒ⁷は、独立してアルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキル、アリル、-PR⁸(O)-R⁸、または-PR⁸(S )-R⁸であり、ここで各Ｒ⁸は、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｆ、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキル、アリル、O-R⁹、または S-R⁹であり、そしてここで、各Ｒ⁹は、独立して、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキル、またはアリルである。より好ましい2'修飾は、ヌクレオチドの2'ヒドロキシルが化学的基（例えば、-H、-O -CH₃、-NH₂、-NH-CH₃、-N−(CH₃)₂、Ｆ、-OCH₂-CH=CH₂、-OPO(O)-CH₃、および-O PO(S)-CH₃）で置換されたものである。最も好ましい2'修飾は、ヌクレオチドの2'ヒドロキシルが、-O-CH₃で置換されたものである。３．リン酸結合の修飾。SEGS中のヌクレオチドを結合するリン酸基結合の修飾は、SEGSのヌクレアーゼに対する耐性を増強させるために使用され得る。この目的のための代表的な修飾は、遊離酸素原子硫黄またはハロゲンの一方または両方を置換することを含む。遊離酸素原子、または硫黄原子は、存在する場合、また化学的基（例えば、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアルキルアミノアルキル、またはアリル）に結合し得る。3'および／または 5'ジハロホスホネート置換ヌクレオチド（例えば、3'および／または5'-CF_２-ホスホネート置換ヌクレオチド))のような、このような置換の例は、WO 95/23225 に記載されている。SEGSに使用するのに好ましい修飾されたリン酸結合基は、-O PR¹⁰(O)O-、-OPR¹⁰(S)O-、および-OPO(S)O-、が挙げられ、ここで、Ｒ¹⁰は、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキル、アリル、-O-Ｒ¹¹、-NH₂、-NH-R¹¹、-N-R¹¹ ₂、またはＦであり、そしてここで、各Ｒ¹¹は、独立して、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキル、またはアリルである。SEGSに使用するのにより好ましい修飾リン酸結合基は、-OPR¹²(O)O-、-OPR¹²(S)O-、および-OPO(S)O-、が挙げられ、ここで、Ｒ¹²は、-CH₃、-O-CH₃、-OCH₂-CH=CH₂、-NH₂、-NH-CH₃、-N-(CH₃)₂ 、またはＦである。SEGSに使用するのに最も好ましい修飾リン酸結合基は、-OPO (S)O-であり、これは、一般的に、ホスホロチオエートと呼ばれる。他の有用な修飾は、配列中に存在し得るシトシン塩基のメチル化である。SEGS /標的RNAハイブリッドの安定性は、より強力な標的RNAに対する塩基対形成を有するオリゴヌクレオチドをもたらす修飾されたヌクレオチドを用いることにより上昇し得る。例えば、C-5プロピニルピリミドヌクレオチドは、核酸間の水素結合を増大させる（Froehlerら、Tetrahedron Letters 33:5307-5310(1992)）。修飾されたSEGS分子が標的RNAのリボザイム媒介切断を促進する効率に、修飾が影響する程度は、上記の切断アッセイを用いて、容易に決定され得る。Ｂ．キメラSEGS分子上記の修飾が、SEGS分子の全体を通じて、SEGS分子の限定した領域においておよび/または組み合わせて使用され、修飾SEGS分子のキメラを生じ得る。SEGSにおける全てのヌクレオチドは、標的RNAのRNAse P修飾切断を促進するその能力を有意に低減することなく化学的に修飾され得ることが予想される。例えば、2'-O -メチル修飾ヌクレオチドは、RNAse P標的活性の有意な損失を伴うことなくSEGS の全体を通して使用され得ることが発見されている。修飾が、修飾SEGS分子が標的RNAのRNAseP媒介切断を促進する効率に影響する程度は、上記の切断アッセイを用いて容易に決定され得る。化学的に修飾された SEGS分子は、非修飾SEGS（すなわち、修飾SEGSと同一のヌクレオチド配列を有するが、非修飾リボヌクレオチド、非修飾ホスホジエステル結合、および非修飾３ 'および５'末端からなるSEGS分子）によって促進されるリボザイム切断活性と比較される場合、修飾SEGSによって促進されるリボザイム切断活性のレベルに従って分類され得る。この比較は、修飾SEGS分子により促進される相対的なリボザイム切断活性を提供する。この活性は、好ましくは非修飾SEGS分子により促進されるリボザイム切断活性のパーセントとして表される。修飾SEGS分子は、これらの活性レベルに基づいてクラスに分けられる得る。この方法で、修飾SEGSは、例えば、４つのクラスに分けられ得る：(1)非修飾SEGSにより促進されるリボザイム切断活性の70％より高い活性を促進する修飾SEGS分子、(2)非修飾SEGSにより促進されるリボザイム切断活性の50％〜70％を促進する修飾SEGS分子、(3)非修飾S EGSにより促進されるリボザイム切断活性の25％〜50％を促進する修飾SEGS分子、(4)非修飾SEGSにより促進されるリボザイム切断活性の25％未満を促進する修飾SEGS分子。好ましい修飾SEGS分子は、非修飾SEGSにより促進されるリボザイム切断活性の少なくとも25％を促進する。より好ましいSEGS分子は、非修飾SEGSにより促進されるリボザイム切断活性の少なくとも50％を促進する。最も好ましい SEGS分子は、非修飾SEGSにより促進されるリボザイム切断活性の少なくとも70％を促進する。 III．クローン化および発現ベクター哺乳動物細胞にSEGS分子を導入するための好ましいベクターは、レトロウイルスのようなウイルスベクターを含む。このウイルスベクターは核に直接SEGS分子をコードするDNAを導入し、次いで核においてこのDNAは転写され、コードされる SEGS分子を産生する。遺伝子治療のためにレトロウイルスベクターを使用する方法の例は、米国特許第4,868,116号および同第4,980,286号；PCT出願WO 90/02806および同WO 89/0713 6;ならびにMulligan,Science 260:926-932(1993)に記載される。宿主染色体にDNAの形態でそれ自体のRNA配列を組み込む、欠陥レトロウイルスベクターは、宿主の細胞にSEGSを組み込むように操作され得る。ここでSEGSのコピーが作製され、そして細胞質に放出されるか、または核中に保持され肝炎RNA の標的ヌクレオチド配列と相互作用する。骨髄幹細胞および造血細胞は、ヒトから比較的容易に取り出され、そして置換され、そして移入された遺伝子の増殖のために自己再生する細胞集団を提供する。このような細胞は、SEGS分子をコードするレトロウイルスに基づくベクターを用いて、インビトロまたはインビボでトランスフェクトされ得る。幹細胞のインビトロトランスフェクションが実施される場合、一旦トランスフェクトされた細胞が特定のSEGS分子を産生し始めると、この細胞は、SEGSを発現する完全なクローン性細胞集団を樹立するために患者に戻され得、従ってウイルス感染、形質転換、および他の疾患に耐性である。一例として、構築物をコードするDNA配列をクローン化し、そして発現するために使用されるベクターは、以下のものを含み得る：１．発現されるべきSEGS分予をコードするDNA配列を挿入するためのクローン化部位。２．エピソーム（非組み込み）複製を可能にする哺乳動物複製起点（任意）（例えば、エプスタインバールウイルス由来の複製起点）。３．SEGS構築物をコードするDNAの必要とされる量を産生するための細菌細胞において機能する複製起点（例えば、pBR322プラスミドに由来する複製起点）。４．哺乳動物細胞において発現されるべきSEGS構築物をコードする挿入された DNA配列の転写を指向するプロモーター（例えば、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、サイトメガロウイルス(CMV)に由来するプロモーター、または哺乳動物U6遺伝子のプロモーター(RNAポリメラーゼIIIプロモーター））。５．哺乳動物選択マーカー（任意）（例えば、ネオマイシンまたはハイグロマイシン耐性）、これは構築物でトランスフェクトされる哺乳動物細胞の選択を可能にする。６．細菌抗生物質耐性マーカー（例えば、ネオマイシンまたはアンピシリン耐性）、これはプラスミドベクターで形質転換される細菌細胞の選択を可能にする。インビボでSEGS分子を送達し、そして発現させるための好ましいベクターは、発現のためにRNAポリメラーゼIII(pol III)プロモーターを使用する。このようなプロモーターは、細胞型特異的発現なしに、構成的に転写物を産生し得る。po l IIIプロモーターはまた、多くの標的RNA分子の位置である、細胞の核に残存するように操作され得る転写物を産生する。完全なpol III転写単位(pol IIIプロモーター、キャッピングシグナル、および終結配列を含む)が使用されることが好ましい。pol IIIプロモーター、および他のpol III転写シグナルは、tRNA遺伝子、5SRNA遺伝子、核内低分子RNA遺伝子、および細胞質低分子RNA遺伝子に存在する。SEGS発現ベクターにおる使用のための好ましいpol IIIプロモーターは、ヒト核内低分子U6遺伝子プロモーターおよびtRNA遺伝子プロモーターである。インビボで短いRNA分子を産生するためのU6遺伝子転写シグナルの使用は、Noonber gら、Nucleic Aclds.Res.22:2830-2836(1995)に記載され、そしてtRNA転写シグナルの使用は、Thompsonら、Nucleic Acids Res.,23:2259-2268(1995)に記載されている。多くのpol IIIプロモーターは、内在性である（すなわち転写単位内に存在する）。従って、これらのpol III転写物はプロモーター配列を含む。SEGS分子の発現に有用であるために、これらのプロモーター配列は、SEGSの構造または機能を妨げるべきではない。SEGS分子はtRNA分子に由来するので、tRNA遺伝子プロモーター配列は、容易にSEGS分子に組み込まれ得る。内在性のtRNA遺伝子プロモーターは、２つの部分すなわちＡボックスおよびＢボックスに存在する。tRNA分子において、Ａボックス配列は、一般にtRNA分子のＤループおよびＤステムの半分に存在し、そしてＢボックス配列は、一般にＴループおよびＴステム中の近位のヌクレオチドに存在する。SEGS分子は、これらの構造のほとんどを欠く。しかし、ＢボックスおよびＡボックス配列の両方が、ＡボックスとＢボックスとの間の適切な間隔が維持されるように、Ｔ認識アームの後ろで、SEGSの5'末端に付加され得る。 U6遺伝子プロモーターは、内在性ではない(KunkelおよびPederson,Nucleic Ac ids Res.18:7371-7379(1989);Kunkelら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8575-8579 (1987);Reddyら、J.Blol.Chem.262:75-81(1987))。SEGS分子の発現に有用な適切なpol IIIプロモーター系は、Hallら、Cell 29:3-5(1982)、Nielsenら、Nucleic Acids Res．21:3631-3636(1993)、FowlkesおよびShenk,Cell 22:405-413(1980) 、GuptaおよびReddy,Nucleic AcidsRes.19:2073-2075(1990)、Kickoeferら、J.B iol.Chem.268:7868-7873(1993)、ならびにRomeroおよびBalckburn,Cell 67:343- 353(1991)により記載される。リボザイムの発現のためのpol IIIプロモーターの使用はまた、Ribozyme Pharmaceuticals,Inc.によるWO 95/23225に記載される。 IV．治療Ａ．薬学的組成物 SEGS分子は、患者を処置するのに適切な薬学的組成物を形成するために、薬学的に受容可能なキャリアと直接組み合わせて使用され得る。あるいは、SEGSは、特定のRNAに特異的なSEGS分子をコードし、そして発現する配列を含むベクターを介して送達され得る。直接送達は、通常、脂質複合体（リポソーム）の援助を伴って、細胞膜と他の分子（例えば、抗体または他の小さなリガンド（例えば、ヘムもしくは別のプリフィリンまたはフタロシアニン））との交差を容易にして、標的化を最大にするために、標的細胞内に予め合成したSEGS分子を挿入することを包含する。ポルフィリンはオリゴヌクレオチドと複合体を形成する。これは肝細胞のような細胞への送達を促進ならびに冗進する。RNAは分解に対して感受性であるため、多くの場合、直接送達したSEGS分子を、上記のように化学的に修飾して、ヌクレアーゼ耐性にし得る。この送達方法論は、治療用量のより正確なモニタリングを可能にする。ベクター介在送達は、べクター上に保有した配列中にコードされた大量のSEGS を産生する、自己複製系または非複製系（例えば、修飾されたウイルスベクターまたはプラスミド）を有する標的細胞の感染を包含する。細胞の標的化および侵入のメカニズムは、ウイルスによって提供され得るか、または、プラスミドが使用される場合、SEGS分子の直接送達について記載された方法に類似の方法を使用し得る。ベクター介在送達は、SEGS分子の維持量を産生する。それは、実質的に安価で、そして直接送達（例えば、SEGS分子の静脈内注射）ほど頻繁な投与を必要としない。直接送達法は、感染の急性かつ重篤な時期の期間に使用され得る。好ましくは、静脈内注射または皮下注射が使用され、SEGS分子を直接送達する。オリゴヌクレオチドの有効量が、意図する標的部位に到達する前のオリゴヌクレオチドの分解を最小限にする形態で送達されることが必須である。最も好ましくは、薬学的キャリアは、SEGSを、冒された細胞へ特異的に送達する。例えば、Ｂ型肝炎ウイルスは肝細胞に作用し、従って、好適な薬学的キャリアは、抗肝炎SEGS分子を肝細胞に送達する。肝臓の持続性の非細胞変性性感染を引き起こす小さなDNAを含有するウイルス群のメンバーであるHBVは、世界中に見出され、そして慢性キャリアの多数の保有宿主のヒトの間で永続されるヒトの感染性病原体である。地球上の人口の約６〜７％が感染している（３億人のキャリア）と見積もられている。感染の普及率は、世界中で均一ではない。HBVの分布における地理的な勾配が存在する。これは、北アメリカおよび西ヨーロッパで最も低く（ここでこのウイルスは、人口の 0.1〜0.5％に検出され得る）、そして、東南アジアおよびサハラ以南のアフリカで最も高い（ここで感染頻度は、人口の５〜20％に変化し得る）。この歪んだ分布は、肝細胞癌腫の分布と平行し、そして慢性のHBV感染とこのタイプの悪性腫瘍との間の関連についての強力な疫学的証拠を提供する。Ｂ型肝炎は、おそらく、ヒトにおける肝細胞癌腫を含む慢性肝疾患の最も一般的な原因であるため、医学的に非常に重要である。感染した肝細胞はウイルス粒子を継続的に分泌し、このウイルス粒子は血液中に高レベルで蓄積する。これらの粒子には、２つのタイプがある：(i)過剰なウイルスコートタンパク質（HBsAg ）からなり、かつ核酸を含有しない非感染性粒子（血液１mlあたり10¹³粒子までの濃度）、および(ii)主要ウイルスコートタンパク質、炭水化物、および脂質を含むエンベロープがその周りに集合した27nmのヌクレオキャプシドコア（HBcAg ）からなり、低い濃度で存在する（血液１mlあたり10⁹粒子）感染性のDNA含有粒子（デーン粒子）。ヒトＢ型肝炎ウイルスは、ヘパドナウイルス科のメンバーであり、ウッドチャック肝炎ウイルス（WHV）、カモ肝炎ウイルス（DHV）、およびハタリス肝炎ウイルス（GHV）を含む近縁種を有する（Robinson(1990)）。レトロウイルスのように、ヘパドナウイルスはその3.2kbのDNAゲノムの逆転写を利用する（Pugh(1990)）。Ｂ型肝炎ウイルスのゲノムは、環状かつ部分的に１本鎖であり、不完全なプラス鎖を含有する。不完全なプラス鎖は、ビリオン中でDNA ポリメラーゼと複合体化する。DNAポリメラーゼは完全なマイナス鎖をテンプレートとして用いてプラス鎖を伸長することが示されている。これらの形態学的および構造的特性は、Ｂ型肝炎ウイルスと全ての既知のクラスのDNA含有ウイルスとを区別する。Ｂ型肝炎ウイルスの複製サイクルはまた、他のDNA含有ウイルスとは著しく異なり、そしてRNA含有レトロウイルスとの近い関係を示唆する。主な珍しい特性は、DNAゲノムの複製において中間体としてゲノムのRNAコピーを用いることである。感染しているDNAゲノムは、２本鎖形態に変換され、これは、RNAの転写のテンプレートとして働く。多数のRNA転写物が、各々の感染ゲノムから合成され、メッセンジャー機能またはDNA複製機能のいずれかを有する。後者は、「プレゲノム」と呼ばれ、子孫のDNAゲノムの前駆体である。なぜならば、それらはヌクレオキャプシドコア中に集められ、そしてコーティングおよび細胞からの輸送の前にDNAに逆転写されるからである。従って、各々の成熟ビリオンは、RNAプレゲノムのDNAコピーおよびDNAポリメラーゼを含む。合成されるべき最初のDNAは、マイナス鎖の極性のDNAであり、そしてウイルス遺伝地図上の独特の部位で始まる。非常に小さな発生期のDNAマイナス鎖（30ヌクレオチド未満）は、タンパク質に共有結合し、そしてマイナス鎖DNA合成のためのプライマーとして作用するようである。マイナス鎖DNAの成長は、産物が、R NA:DNAハイブリッドよりもむしろ完全長１本鎖DNAであるように、プレゲノムの同等の分解を伴う。プラス鎖DNA合成は、マイナス鎖の完了後にのみ観察されており、そしてマイナス鎖の5'末端の近くの独特の部位で始まる。プラス鎖の完全な伸長は、ヌクレオキャプシドコアのコーティングおよび輸送のための必要条件ではない。従ってほとんどの細胞外ビリオンは、そのゲノム中に不完全なプラス鎖および大きな１本鎖ギャップを含む。肝炎ウイルスゲノムは自律性であり、そしてその複製のためにDNAからDNAへの経路を利用しないので、そのゲノムの継続的な細胞内複製はウイルスの維持に不可欠である。ウイルスエンベロープを形成するＢ型肝炎ウイルス表面抗原（HBsAg）は、ウイルスのプレS1、プレS2、およびＳ遺伝子によりコードされるポリペプチドである。主要なタンパク質は、2.1kbサブゲノムメッセージ由来の226アミノ酸のＳ遺伝子産物である。以下の実施例において示されるように、HBV核酸を標的化し、そして複製を阻害する（これは、減少したウイルス負荷を導く）SEGSが設計される。Ｂ．SEGS分子の送達２つの送達方法が使用され得、（１）合成SEGS分子の送達、または（２）一過性の様式でSEGS分子を発現するベクターの送達である。選択の方法は、標準的な方法論を用いて前臨床試験において決定され、そしてそれらは、組み合わせて使用し得ることが可能である。それらの両方は、例えば、陽イオンリポソーム調製物を用いることにより、有効に送達され得る。種々の非ベクター法は、SEGS分子を細胞に送達するのに利用することができる。例えば、一般に、SEGS分子、またはSEGS分子をコードするDNA配列は、マイクロパーティクル内またはマイクロパーティクル上に組み込まれ得る。本明細書中で使用されるように、マイクロパーティクルは、リポソーム、ビロソーム、マイクロスフェア、およびマイクロカプセルを含み、合成および／または天然のポリマーから形成される。マイクロカプセルおよびマイクロスフェアを作製する方法は、当業者において公知であり、そして溶媒蒸発、溶媒キャスティング、スプレー乾燥、および溶媒伸長(solvent extention)が挙げられる。種々のマイクロパーティクル内に組み込まれ得る有効なポリマーの例としては、ポリサッカライド、ポリ無水物、ポリオルソエステル、ポリヒドロキシド、ならびにタンパク質およびペプチドが挙げられる。リポソームは、標準的な方法（例えば、Kimら、Biochim.Biophys.Acta、728:3 39-348(1983)；Liuら、Biochim,Biophys.Acta.、1104:95-101(1992)；およびLee ら、Biochim.Biophys.Acta.、1103：185-197(1992)；Wangら、Biochem.、28:950 8-9514(1989)）によって産生され得、これらは、本明細書中で参考として援用される。SEGS分子またはこのような分子をコードするDNAは、マイクロパーティクルの調製の間にこの分子が存在する場合、リポソーム内でカプセル化され得る。簡単に述べれば、有機溶媒に溶解した選択の脂質は、混合されそしてガラス管の底で減圧下で乾燥される。この脂質フィルムをカプセル化されるべきSEGS分子、 SEGS分子をコードするDNAの水溶性緩衝化溶液を用いて再水和し、次いで、物質をカプセル化する得られた水和脂質小胞またはリポソームは、遠心分離によって洗浄され得、そして濾過され、そして４℃で保存され得る。この方法は、核酸分子をMOLT-3白血病細胞株の細胞の核および細胞質に送達するために使用されている（ThierryおよびDritschilo、Nucl.Acids Res.、20:5691-5698(1992)）。あるいは、SEGS分子、またはこのような分子をコードするDNAは、マイクロパーティクル内に組み込まれ得るか、またはマイクロパーティクルの外側にイオン的または共有的のいずれかで結合され得る。陽イオンリポソームまたはマイクロカプセルは、負電荷の化合物（例えば、これらのリポソームの正に荷電した外側の表面にイオン的に結合し得る核酸に基づく化合物）を送達するのに特に有効なマイクロパーティクルである。種々の陽イオンリポソームは、インビトロおよびインビボの両方において核酸または核酸− タンパク質複合体を細胞に送達する場合、非常に有効であることが示されており、Felgnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84:7413-7417(1987);Felgner、Advance d Drug Delivery Reviews、5:163-187(1990)Clarencら,Anti-Cancer Drug Desig n、8:81-94(1993)によって報告されている。陽イオンリポソームまたはマイクロカプセルは、混合物から形成されたリポソームまたはマイクロカプセルが、負電荷の化合物にイオン結合する正味の正電荷(net positive charge)を所有するように、十分な量の陽イオン側鎖基を有する１つ以上の脂質を含む混合物を用いて調製され得る。陽イオンリポソームを産生するために使用され得る正電荷の脂質の例としては、アミノリピッドジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ PE）(これは正に荷電した一級アミノ頭部(head group)を所有する)；ホスファチジルコリン(PC)(これは一級アミンではない正に電荷した頭部を所有する)；そしてＮ[1−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N−トリエチルアンモニウム（「DOTMA」、Felgnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84:7413-7417(1987);Felg nerら、Nature、337:387−388(1989);Felgner、Advanced Drug Delivery Review s、5:163-187(1990)を参照のこと）が挙げられる。 SEGS分子の送達のために好適なマイクロパーティクルの形態は、ヘム運搬マイクロパーティクルである。これらのマイクロパーティクルにおいて、ヘムは、マイクロパーティクルの外側表面にインターカレートするかまたは共有結合する。ヘム運搬マイクロパーティクルは、それらが、ヘム受容体を発現する細胞（例えば、肝細胞）により優先的に結合し、そして取り込まれるため、有効用量に必要な薬物または他の化合物の量を、著しく減らせるという点で利点を提供する。このような標的送達はまた、非標的送達法において比較的高い薬物濃度を用いることから生じ得る全身性の副作用を減少する。ヘム運搬マイクロパーティクルを形成するための好ましい脂質は、1,2-ジオレオイルオキシ-3-（トリメチルアンモニウム）プロパン(DOTAP)およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン( DOPE)である。ヘム運搬マイクロパーティクルの産生および使用は、InnovirによるPCT出願WO 95/27480に記載されている。核酸はまた、哺乳動物内に静脈注射し得る陽イオンリポソームによってカプセル化され得るか、またはリポソーム上を被覆し得る。この系は、造血細胞が存在する内皮および骨髄を含む成体マウスの多くの組織の細胞内へDNAを導入するために使用されている（例えば、Zhuら、Science、261:209-211(1993)を参照のこと）。 SEGS分子またはこれらの分子をコードするDNAのいずれかを含むリポソームは、抗肝炎SEGS分子の標的細胞への送達に有効な量で、例えば、静脈内投与または腹膜内投与によって全身に投与され得る。適切なマイクロパーティクルと共同で使用される場合、他の可能な経路は、経皮または経口を含む。一般に、個体に投与されるリポソーム結合核酸の総量は、同一の所望の効果または意図する効果のために投与されなければならない結合しない核酸の総量より少ない。別の有用な送達系は、SEGSの陽イオン性ポルフィリンとの複合体である。これは、注入後、SEGSを保護し、ならびにSEGSを肝細胞へ標的化する。２つの主要な成分が正味全体で陰性電荷を有するポルフィリンおよび送達されるべきSEGS（これは、正味全体で陰性電荷を有する）であるので、この系は、極めて単純である。ポルフィリンは、送達されるべきSEGSを結合し、そして優先的にポルフィリンを結合する細胞に化合物を選択的に標的化する。種々のポリマー（例えば、ポリ乳酸とポリグリコール酸とのコポリマー、ポリエチレン、およびポリオルソエステルならびに抗肝炎SEGS分子、またはこのような分子をコードするDNA）を含む組成物は、カテーテルまたはシリンジを用いることによって、適切な細胞に局所的に送達され得る。このような組成物を細胞に局所的に送達する他の手段は、注入ポンプ（例えば、Alza Corporation、Palo A lto、Carifornia）を用いることか、またはポリマーインプラント内へ組成物を組み込むこと（例えば、JohnsonおよびLloyd-Jones編、Drug Delivery Systems （Chichester，England:Ellis Horwood Ltd.、1987を参照のこと）を包含し、これは、治療用抗肝炎SEGS組成物のインプラントの隣接領域への徐放を引き起こし得る。 SEGSはまた、例えば、乾癬または眼疾患の処置のために、適切な局所的なキャリア（例えば、軟膏剤、軟膏、緩衝化生理食塩水、または他の薬学的に受容可能な局所的もしくは眼用キャリア）で局所的に適用され得る。以下の実施例は、例示的目的およびさらなるガイダンスのために示す。実施例実施例１：SEGS分子の構築および分析のためのオリゴヌクレオチド合成、プラスミドおよび転写反応オリゴヌクレオチド：5'-ジメトキシトリチル-2'-メチルシリル-リボヌクレオシド3'-CE-ホスホルアミデート(Biosearch,MA、またはChemGenes Corp.、MA)を用いて、オリゴリボヌクレオチド(RNA)を、Ogilvieら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S .A.、85:5764-5768(1988)の方法に従って調製した。2'-O−メチルオリゴリボヌクレオチド（2'-O-メチルRNA）を、BioseachまたはGlen ReseachのいずれかのRN A合成プロトコルを用いて合成し、そしてBioseachまたはGlen Reseachのいずれかからアミダイト（amidite）を購入した。Millipore 8909 Experdite DNA/RNA シンセサイザーで合成を行った。制御されたポアガラス(controlled poreglass) (CPG)を固体支持マトリックスとして使用した。カップリング時間は約13分間であった。チオリン酸結合を有するアナログの合成のため、酸化の代わりに硫化を行い、これは、Beaucage試薬を用いて10〜15分間実行した。平均カップリング収率は、トリチル測定によってアッセイして、96％〜98％であった。支持体からの切断、塩基およびリン酸脱保護(deprotection)、および2'-O-TBD MS基の除去を、Scaringeら、Nucleic Acid Reseach、18:5433-5441(1990)による記載のように実行した。TBAF溶液中の粗オリゴヌクレオチドを、15〜20％のポリアクリルアミド／７M尿素ゲルを用いる標準的な電気泳動精製の前に、Sephadex G-25カラムで脱塩した。産物のバンドをUV-シャドーイングによって視覚化し、切り出し、そしてゲルマトリックスから溶出させた。溶出したオリゴマーを、C₁ ₈ Sep-Pakカートリッジで最終的に脱塩し、そしてOD₂₆₀測定により定量した。精製したアナログの均質性を、5'末端標識または分析HPLCによって確認した。それらは、SeelaおよびKaiser、Nucleic Acids Reseach.、15:3113-3129(1987)によって記載された塩基組成分析によりさらに特徴付けし、チオエート結合の含量を³¹ P-NMRによって定量した。3'末端の末端修飾をアミノ基を含む修飾したCPG支持体から合成を開始することにより作製した。 RNAse P切断アッセイ：切断反応は、一般に、Yuanら、Proc.Natl.Acad.Sci.US A、89:8006-8010(1992)（これらは、本明細書中で参考として援用される）により記載の手順に従って実施した。簡単に説明すると、200nM〜400nMのSEGS濃度および20nM未満の標的分子濃度を伴う、50mM Tris-HCl pH7.4、10mM MgCl₂、25mM KCl、0.1mM EDTAをを含む全量31μl中で短い基質反応を行った。反応物を37℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、反応溶液をローディング緩衝液（98％ホルムアミド、10mM EDTA、0.025％ブロモフェノールブルー）と混合した。切断した基質を、７Mの尿素を含む15％アクリルアミドゲル上で電気泳動によって非切断物（uncleaved）から分離した。バンドを、Molecular Dynamics Phosphorimagerで定量した。前駆体のRNA基質および得られた２つの切断産物に相当するバンドを、Betasco peゲルアナライザー（Betagen）を用いて乾燥ゲルから計測した。本質的にBartkiewiczら、Genes Dev．3:488-499(1989)（これは、本明細書中で参考として援用される）に記載のDEAE Sepharoseクロマトグラフィーおよびグリセロール密度勾配遠心分離によってRNAse Pを精製した。より長い標的RNA分子で切断を試験するために、異なる反応条件を用いた。反応物は、全量10μl中に、40mM Tris HCl(pH7.4)、10mM MgCl₂、１mMスペルミジン、10mMジチオスレイトール、0.05μg/μlのヌクレアーゼを含まないウシ血清アルブミン、0.01％(v/v)Triton-X100、0.8Units/μl RNASIN、0.2mM ATP、0.2m M GTP、0.2mM UTP、0.2mM CTP、0.1μlCi/μl[a³²P]CTP、2mM m⁷G(5')pppG、0.0 6μg/μl酵母RNA、25mM KCl、3Units T7 RNAポリメラーゼ、250nM SEGS、１μl のヒトRNAse P、および3ng/μl直鎖化プラスミドを含有した。直鎖化プラスミドを添加することにより反応を開始し、そして37℃で30分間インキュベートした。 10μlの80％ホルムアミド、10mM EDTA、0.1％ブロモフェノールブルーの添加により反応を終結した。90℃で２分間加熱後、サンプルを、５％変性ポリアクリルアミドゲル上、48ワットで２時間電気泳動した。60℃で１時間の減圧乾燥後、ゲルをホスホイメージング(phosphoimaging)によって分析した。いずれかのアッセイで残存する前駆体RNA基質の割合を、SEGS濃度の関数としてプロットし、そして触媒効率をk_cat/K_m（ここで、k_catは、切断の速度定数であり、そしてK_mは、ミカエリス定数である）として表した。これは遊離のSEGSと基質との反応に対する二次反応定数である。以下のHeidenreichおよびEckstein の方法（J.Biol.Chem.、267:1904-1909(1992)、切断反応の効率(k_cat/K_m)）を、以下の式を用いて決定した -1n F/t=(k_cat/K_m)[C] ここでFは、残存したRNA基質の割合、tは反応時間、そして[C]はSEGS濃度である。仔ウシ胎児血清安定性アッセイ：修飾したSEGS分子のヌクレアーゼ耐性を、仔ウシ胎児血清(FCS)アッセイにおいて試験した。熱で不活化した場合、10％FCSは、むしろヒト血清を模倣することがShawら、Nuclelc Aclds Res．19:747-750(19 91)によって報告された。アッセイの条件は、Hokeら、Nucleic Acids Res．19:5 743-5748(1991)によって先に記載のアッセイ条件に極めて類似した。簡単に述べれば、試験すべきSEGSアナログは、T4ポリヌクレオチドキナーゼおよび[γ-³⁵S] ATPを用いて標識した5'末端である（この手順は、脱リン酸化に対して耐性である放射性標識したオリゴヌクレオチドを生成し得る）。次いで、標識SEGSをフェノール/クロロホルム抽出によって精製し、その後Sephadex G-25スピンカラム濾過した。精製したSEGSを冷SEGSおよび10％熱不活化仔ウシ胎児血清(FCS)と混合し、最終SEGS濃度を約５μMとした。SEGSアナログを24時間処理した。アリコートを異なる時点で反応混合物より取り出し、２×ローディング染料と混合し、90℃で３分間熱不活化し、次いで、-20℃で保存した。その結果得られたものを12％ポリアクリルアミド/7M尿素ゲル上で分析した。実施例２：RNAse P切断の促進におけるSEGS分子の活性 tRNAに基づいてモデリングされたSEGS構築物：SEGS、およびtRNA配列に基づいてモデリングされた種々の配列および構造を有するモデル標的RNA分子の活性を試験した。実施例１に記載のとおり、活性を、１時間に切断された基質の割合として測定した。Ｔ認識アームに吊り下げられたＴループ配列を有するSEGS(SEGS3 ；配列番号１；図２を参照)と、吊り下げられた配列を全く有さないSEGS(SEGS7 ；配列番号１のヌクレオチド４〜15；図５を参照)との間の比較を行なった。これは、一部、UNRモチーフ以外のＴループ配列が、SEGSにおけるRNAse P媒介切断の促進に影響するかどうかを試験するために行なわれた。使用したSEGS分子を図５に示す。15ヌクレオチドのSEGSは、吊り下げられたＴループ配列を有するが、 12ヌクレオチドのSEGSは有さない。モデル基質(T10、図２および５にもまた示される)の切断の促進におけるこれら２つのSEGSの活性を、表１における列１および２に挙げる。吊り下げられたヌクレオチドが切断活性に対して有意な効果を何ら有さないことは明らかである。表１の第１欄は、ターン領域の配列、およびこれらの例の場合には、５または６個のアデニンヌクレオチドから作製された短いテイル配列を示す。これは、６個のアデニンヌクレオチドを有する標的については(Ａ)で、５個のアデニンヌクレオチドを有する標的については(Ａ)*で示す。表１：異なるターン領域配列の切断活性 SEGS活性に対するターン領域および切断部位における配列の効果：ターン領域の配列のみが異なる種々のモデル標的RNA分子を設計した。基質は、ターン領域( 配列番号２のヌクレオチド33〜36)を除いて、標的RNA T 10(配列番号２)と同一のヌクレオチド配列を有する。各基質のターン領域の配列を、表１に挙げた。 EGS3(配列番号１)またはEGS7(配列番号１のヌクレオチド４〜15)を使用して活性をアッセイした。50nM標的RNA、400nM SEGS、および３μl RNAse Pを用いて、上記の様にアッセイを行なった。これらのSEGSの活性を、表１の列２〜７および列９〜18に示す。ほとんどすべての変形体が、有意な程度まで活発に切断される。これらの例において、特定の配列が他の配列より有利でない。例えば、GAAAおよびAUCU。これらの結果は、SEGSが、第２標的領域の３'側に広範な配列を有する標的配列について設計され得ることを確証する。 SEGS EGA 3のＡ認識アームの３'末端のヌクレオチド(これは、切断部位に隣接する塩基対に関与する)を、シチジンヌクレオチドからグアニンヌクレオチドに変化させた。標的RNA配列を対応させて変化させた。得られたSEGS(EGS 6)の活性を表１の列８に示す。この活性(45％切断)は、シチジンヌクレオチドを有するSE GS(表１の列２)より低いが、なお有意である。このことは、Ａ認識アームの３' 末端のシチジンヌクレオチドが好ましいが、必須ではないことを示す。変形のターン領域および３'末端の配列は、SEGSの活性に影響したが、すべて測定可能で有用な活性を有した。 SEGS活性に対する化学的修飾体の効果：2'-O-メチルオリゴリボヌクレオチドは、修飾するための論理的な選択としていくつかの好ましい特徴を有する。これらのアナログの合成は、DNA合成のものと非常に似ている。これらは、DNAアナログより、RNA標的に対してはるかに良好な結合アフィニティーを有し、得られる二重鎖は、RNA-RNA二重鎖の構造(Ａ形態)とDNA-DBA二重鎖の構造(Ｂ形態)との間の構造を有する。さらに、これらは、RNA特異的ヌクレアーゼまたはDNA特異的ヌクレアーゼのいずれかによる分解にかなり抵抗性であることがわかる。2'-O-メチル-オリゴリボヌクレオチドSEGSをEGS 7（配列番号１のヌクレオチド４〜15）に基づいてモデリングした。２つの基質を有するこの化学的に修飾されたSEGSの活性を、表１の列19および20に示す。これらの活性は、非修飾のSEGSで得られた活性より低い(表１の列１および３と比較)が、なお有意である。このことは、SE GSは、そのヌクレオチドのすべてが化学的に修飾され得、そして有意な活性をなお維持し得ることを示す。 SEGSの活性に対する認識アームおよび突出領域の長さの効果：認識アームおよび突出領域の長さの効果を評価するために、これらの領域に関して異なる長さの組合せを有する、種々のSEGSおよびモデル標的RNAを構築した。基質を、標的RNA T 10を基にモデリングした。SEGS分子を、EGS 7を基にモデリングした。33nM標的RNA、333nM SEGS、および３μl RNAse Pを用いて上記のようにアッセイを実行した。試験した長さの組合せ、および観察した活性を表２に示す。変化させた出発の長さは、７塩基対のＡステム、５塩基対のＴステム、および９ヌクレオチドの突出領域であった。この組合せは高い活性を有する(表２の列１を参照)。表２．異なる構築物の切断活性表２の列の第１群(列１〜４)は、７、８、９、および10塩基対のＡステム長での結果を示す。すべてが活性であるが、Ａ認識アームに10ヌクレオチドを有する SEGSは活性が弱い。このことは、７、８、または９ヌクレオチドのＡ認識アームが好ましいことを示す。表２の第２群の列(列５〜７)は、６および７塩基対のＴステム長での結果を示す。列７は８塩基対のＡステムと６塩基対のＴステムとを組合せる。すべてが活性であるが、Ｔ認識アームに７ヌクレオチドを有するSEGS は活性が弱い。このことは、５または６ヌクレオチドのＴ認識アームが好ましいことを示す。表２の第３の群(列８〜11)は、７〜15ヌクレオチドの突出領域長での結果を示す。これらの構築物のすべてが高度に活性である。このことは、突出領域の長さが、SEGS活性の重要な決定要素ではないことを示す。まとめると、これらの結果は、７ヌクレオチドのＡ認識アームおよび５ヌクレオチドのＴ認識アームが最も好ましいことを示す。これらの変化はSEGSの活性に影響するが、ほとんどの変化は、効果をほとんど有さず、そしてすべてのSEGSは測定可能で有用な活性を有した。 SEGS活性とRNAse P基質の活性との比較：SEGS/標的RNA複合体と同様な構造を形成する最小RNAse P基質の切断活性を、SEGS分子の活性と比較した。RNAse P基質は、RNAse P切断部位およびガイド配列の両方を含む単一のヌクレオチド分子である。SEGS/標的RNA複合体とは異なり、RNAse P基質はインタクトなＴループを有する。図12および13は、最小RNAse P基質およびSEGS/標的RNA複合体をそれぞれ示す。両方とも、+RNA^Tyrの配列に基づいてモデリングした。実施例１に記載のようなRNAse P活性アッセイにおいて、RNAse P基質は１時間に99％切断され、そしてSEGSは標的RNAの95％の切断を促進した。 RNAse P基質およびSEGS/標的RNA対もまたHBV配列を基にモデリングした。図３および６は、このようなSEGS/標的RNA対およびRNAse P基質の例をそれぞれ示す。実施例１に記載のようなRNAse P活性アッセイにおいて、RNAse P基質は１時間に80％切断され、そしてSEGSは標的RNAの65％の切断を促進した。これらの結果は、任意の配列を基にモデリングしたSEGSの場合でさえ、SEGS/標的RNA複合体が、Ｔループを含むRNA P基質に存在する活性の重要な画分を保持することを示す。実施例３：HBsAg RNAのRNAse P切断を促進するSEGS分子の構築および活性 HBsAgをコードするRNAにおいてRNAse Pによる切断を促進するようSEGS分子を設計した。標的の存在下、SEGS分子は、RNAse Pよる切断を誘発するtRNAのＡステムおよびＴステムと同様な構造を形成した。 HBsAgに標的付けられたSEGS構築物：Ｂ型肝炎表面抗原(HBsAg)をコードするRN Aの領域を標的するように、SEGS配列HBV B(配列番号６)、HBVC(配列番号８)、HB V F1(配列番号10)、HBVH(配列番号12)、およびHBV H1(配列番号14)を設計した。 HBsAgをコードするRNA中のUNRモチーフの位置を同定することによって、前述のように領域を選択した。図７に示されるように、SEGS HBV Bの一方の認識アームの配列(Ａ認識アーム；配列番号６のヌクレオチド６〜13)は、HBsAgをコードする配列(配列番号７のヌクレオチド13〜20；2.1kb HBV転写物のヌクレオチド387 〜394)中の８ヌクレオチドと相補的である。SEGS HBV Bの他方の認識アームの配列(Ｔ認識アーム；配列番号６のヌクレオチド１〜５)は、HBsAgをコードする配列(配列番号７のヌクレオチド30〜34；2.1kb HBV転写物のヌクレオチド404〜408 )中の５ヌクレオチドと相補的である。従って、標的配列は、９個の対になっていないヌクレオチド(突出領域)によって分離された、SEGSの２つの認識アームと相補的な２つの領域(第１および第２の標的領域)を含む。 2'-O-メチル含有SEGS分子：２'-O-メチルヌクレオチドを含む、HBVを標的する SEGS分子を調製した。ヌクレオチド試薬が2'-O-メチル基を含んでいたことを除いて、前述のように、自動オリゴヌクレオチド合成装置において、これらのオリゴヌクレオチドを調製した。平均カップリング収率は、トリチル測定によってアッセイした場合、96〜98％の範囲であった。脱保護の終了の際、完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを、変性ゲル電気泳動によって精製し、そしてその純度を５'末端標識、分析HPLC、塩基組成分析、および³¹P-NMRによって評価した。 SEGSにより促進される大きな標的RNAの切断：HBV RNA配列に特異的なSEGSを、実施例１に記載されたRNAse P切断アッセイを使用してアッセイして、切断反応の効率を決定した。このためには、HBVのAYW株の2.1kb RNAをコードする配列を含むプラスミドpAYW2.1を、NotIでの消化により直線化し、次いで[α³²P]CTPの存在下で、T7 RNAポリメラーゼにより転写させた。標識した転写物を、種々のSE GS分子の存在下でRNAse Pとともに37℃にて30分間インキュベートした。反応産物を変性ポリアクリルアミド電気泳動にかけ、そして蛍光画像化(phosphoimagin g)により分析した。上記のHBV RNAに特異的なSEGSのそれぞれが、ゲル画像上の視認可能な切断バンドを生じた。これは、大きな天然の標的RNA分子中の任意の標的配列に対して設計されたSEGSが、機能的であることを示す。実施例４：短い外部ガイド配列のインビボ効力この実施例は、インビボで投与される場合、短い外部ガイド配列が機能的であり、標的RNAのマーカーに対して有意な測定可能な効果を有することを実証する。SEGS HBV Bをこの研究に使用した。このSEGSは、精製したRNase Pの存在下で、HBV HBsAg mRNAの切断を誘導した(実施例３を参照)。インビボ投与のために、SEGS HBV Bを単独（遊離）で使用したか、またはポルフィリンとイオン的に複合体化した。具体的には、SEGSをテトラメソ(n-メチル4 -ピリジル)ポルフィン(TMP)またはメソテトラ(トリメチルアニリニウム)ポルフィン(TMAまたはアニリニウム)のいずれかと複合体化した。複合体化したEGSまたは遊離EGSを、完全に組み立てられたHBVウイルス粒子を発現するトランスジェニックマウス(Guidottiら、J.Virol．69:6158-6169(1995) )に注射した。これらのマウスは、肝臓においてHBVの複製を支持し、ウイルス複製のすべてのマーカーを産生する。５mg/Kg体重のSEGS HBV Bを、マウスの尾静脈を介して、５日間毎日注射した。６日めに動物を屠殺し、そして以下のウイルス複製マーカーを分析した。Ａ．動物の血液中に存在するHBVビリオンにおけるDNAのレベルを、標準的なドットブロット分析(Guidottiら)によって決定した。血液中のウイルスDNAのレベルは、ウイルス価の直接的な指標である。Ｂ．肝臓中のウイルスDNAを、標準的なサザンブロット分析によって決定した。これは、肝臓におけるウイルスの複製の直接的な指標である。Ｃ．肝臓組織切片中のウイルスコア粒子のレベルを、免疫細胞化学によって決定した。HBV RNAの逆転写(これは、ウイルスの複製プロセスの不可欠の部分である)は、コア粒子において生じる。従って、コア粒子の減少は、ウイルス複製の増加の別の指標である。Ｄ．薬物の投与に起因する毒性の可能性を排除するために、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)を測定した。肝臓障害は血清ALTレベルの上昇を引き起こす。これらの測定の結果(表３)は、SEGS分子が確かに、血液中のウイルスDNA、ウイルスDNA複製中間体、および肝臓中のコア粒子の減少によって理解される、インビボでのHBV複製を減少させることにおける効果を有することを示す。特に、H BVマーカーは、SEGSがポルフィリンキャリアと複合体化されているかどうかにかかわらず、減少したことに注目。このことは、SEGSのインビボ活性は、特定のまたは特殊化された投与形態を必要としないことを示す。血清ALTが、全ての処置で安定なままであり、有意な肝臓障害はSEGSの投与によって引き起こさないことにも注目。TMP単独を５mg/Kg体重にて10日間、同様なマウスへ尾静脈を介して投与しても、HBV複製に対して何らの効果も有さなかったことが以前に示された。このことによって、観察された抗ウイルス効果がTMPに起因しないことが確認された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 35/76 Ａ６１Ｋ 35/76 48/00 48/00 Ｃ１２Ｎ 9/22 Ｃ１２Ｎ 9/22 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ (72)発明者マ，マイケルアメリカ合衆国ニューヨーク 10044, ルーズベルトアイランド，リバーロード 30，アパートメント３エフ (72)発明者ジョージ，シャジティー. アメリカ合衆国ニューヨーク 10021, ニューヨーク，イースト 70ティーエイチストリート 220，アパートメント４ディー

Claims

【特許請求の範囲】１．標的RNA分子中の標的化された配列の領域に相補的な認識配列を含むオリゴヌクレオチド分子を含む短い外部ガイド配列であって、ここで該認識配列は、Ａ認識アームおよびＴ認識アームを含み、そして該標的化された配列は、5'から3'の順に、第１標的領域、突出領域、および第２標的領域を含み、ここで、該Ａ認識アームは、該第１標的領域に相補的であり、該Ｔ認識アームは、該第２標的領域に相補的であり、そして該Ｔ認識アームは、該短い外部ガイド配列中で該Ａ認識アームの5'およびこれに近接して位置しており、そしてここで、該短い外部ガイド配列は、該標的RNA分子の真核生物RNAse P媒介切断を促進する、短い外部ガイド配列。２．前記Ａ認識アームが７〜９ヌクレオチド長であり、前記Ｔ認識アームが５〜７ヌクレオチド長であり、そして前記突出領域が1〜30ヌクレオチド長である、請求項１に記載の短い外部ガイド配列。３．前記Ａ認識アームが７または８ヌクレオチド長であり、前記Ｔ認識アームが５または６ヌクレオチド長であり、そして前記突出領域が５〜15ヌクレオチド長である、請求項２に記載の短い外部ガイド配列。４．前記標的化された配列がターン領域をさらに含み、ここで該ターン領域が、 NUNRの配列を有し、ここでＮは任意のヌクレオチドであり、Ｒは任意のプリンヌクレオチドであり、そしてＵはウリジンヌクレオチドである、請求項１に記載の短い外部ガイド配列。５．前記ターン領域が、NUCRまたはUUNRの配列を有する、請求項１に記載の短い外部ガイド配列。６．前記ターン領域が、UUCRの配列を有する、請求項５に記載の短い外部ガイド配列。７．配列番号３、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４からなる群から選択されるヌクレオチド塩基配列を含む、請求項１に記載の短い外部ガイド配列。８．前記標的RNA分子がＢ型肝炎RNA分子である、請求項１に記載の短い外部ガイド配列。９．標的RNA分子の切断を促進するための組成物であって、ここで該組成物は、薬学的に受容可能な送達系において請求項１に記載の短い外部ガイド配列を含有する、組成物。１０．前記薬学的に受容可能な送達系が、リポソーム、ウイロソーム、マイクロスフェア、およびマイクロカプセルからなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。１１．リボヌクレオチドの2'ヒドロキシル基の１つまたはそれ以上が、水素、O- アルキル基、O-アリル基、アミノ基、およびフッ素からなる群から選択される化学基と置換されている、請求項１に記載の短い外部ガイド配列。１２．リン酸結合基の１つまたはそれ以上が、メチルホスホネートおよびホスホロチオエートからなる群から選択される結合基と置換されている、請求項１に記載の短い外部ガイド配列。１３．リボヌクレオチドの2'ヒドロキシル基の１つまたはそれ以上が、水素、O- アルキル基、0-アリル基、アミノ基、およびフッ素からなる群から選択される化学基と置換され、そしてリン酸結合基の１つまたはそれ以上が、メチルホスホネートおよびホスホロチオエートからなる群から選択される結合基と置換されている、請求項１に記載の短い外部ガイド配列。１４．前記リボヌクレオチドの2'ヒドロキシル基の１つまたはそれ以上が、水素またはメトキシ基と置換され、そして前記リン酸結合基の１つまたはそれ以上が、ホスホロチオエートと置換されている、請求項13に記載の短い外部ガイド配列。１５．前記短い外部ガイド配列の3'ヒドロキシルが、-OPO(O)OCH₂CH(OH)-CH₂NH₂ 、-OPO(S)OCH₂CH(OH)CH₂NH₂、および-3'-チミンヌクレオチドからなる群から選択される化学基と置換されている、請求項１に記載の短い外部ガイド配列。１６．前記短い外部ガイド配列の3'ヒドロキシルが、-3'−チミンヌクレオチドと置換されている、請求項１５に記載の短い外部ガイド配列。１７．標的RNA分子を切断する方法であって、以下の工程を包含する、方法： RNAse P媒介切断を促進する条件下で、RNAse P、該標的RNA分子、および短い外部ガイド配列を接触させる工程であって、ここで該短い外部ガイド配列は、標的RNA分子中の標的化された配列の領域に相補的な認識配列を含むオリゴヌクレオチド分子を含み、ここで該認識配列は、Ａ認識アームおよびＴ認識アームを含み、そして該標的化された配列は、5'から3'の順に、第１標的領域、突出領域、および第２標的領域を含み、ここで、該Ａ認識アームは、該第１標的領域に相補的であり、該Ｔ認識アームは、該第２標的領域に相補的であり、そして該Ｔ認識アームは、該短い外部ガイド配列中で該Ａ認識アームの5'およびこれに近接して位置しており、そしてここで、該短い外部ガイド配列は、該標的RNA分子の真核生物RNAse P媒介切断を促進する、方法。１８．前記標的RNA配列が、ウイルスRNA分子であり、ここで、前記接触させる工程が、患者または患者由来の細胞に前記短い外部ガイド配列を投与する工程により達成され、そしてここで、該短い外部ガイド配列が、薬学的に受容可能な送達系中にある、請求項１７に記載の方法。１９．前記薬学的に受容可能な送達系が、リポソーム、ウイロソーム、マイクロスフェア、およびマイクロカプセルからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。２０．前記ウイルスRNA分子が、Ｂ型肝炎RNA分子である、請求項１８に記載の方法。２１．ウイルスを阻害する方法であって、患者または患者由来の細胞に、短い外部ガイド配列をコードする操作された発現ベクターを投与する工程を包含し、ここで該短い外部ガイド配列は、標的RNA分子中の標的化された配列の領域に相補的な認識配列を含むオリゴヌクレオチド分子を含み、ここで該認識配列は、Ａ認識アームおよびＴ認識アームを含み、そして該標的化された配列は、5'から3'の順に、第１標的領域、突出領域、および第２標的領域を含み、ここで、該Ａ認識アームは、該第１標的領域に相補的であり、該Ｔ認識アームは、該第２標的領域に相補的であり、そして該Ｔ認識アームは、該短い外部ガイド配列中で該Ａ認識アームの5'およびこれに近接して位置しており、そしてここで、該短い外部ガイド配列は、該標的RNA分子の真核生物RNAseP媒介切断を促進する、方法。２２．前記操作された発現ベクターが、薬学的に受容可能な送達系中にある、請求項２１に記載の方法。２３．前記薬学的に受容可能な送達系が、リポソーム、ウイロソーム、マイクロスフェア、およびマイクロカプセルからなる群から選択される、請求項２２に記載の組成物。２４．前記薬学的に受容可能な送達系が、リポソームである、請求項２３に記載の方法。２５．前記ベクターが、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびエプスタインバールウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターである、請求項２１に記載の方法。２６．短い外部ガイド配列をコードする操作された発現ベクターであって、該短い外部ガイド配列は、標的RNA分子中の標的化された配列の領域に相補的な認識配列を含むオリゴヌクレオチド分子を含み、ここで該認識配列は、Ａ認識アームおよびＴ認識アームを含み、そして該標的化された配列は、5'から3'の順に、第１標的領域、突出領域、および第２標的領域を含み、ここで、該Ａ認識アームは、該第１標的領域に相補的であり、該Ｔ認識アームは、該第２標的領域に相補的であり、そして該Ｔ認識アームは、該短い外部ガイド配列中で該Ａ認識アームの5'およびこれに近接して位置しており、そしてここで、該短い外部ガイド配列は、該標的RNA分子の真核生物RNAse P媒介切断を促進する、ベクター。２７．Ｂ型肝炎RNA分子の切断を促進するための組成物であって、ここで該組成物は、薬学的に受容可能な送達系中に、請求項２６に記載の操作された発現ベクターを含有する、組成物。２８．前記薬学的に受容可能な送達系が、リポソーム、ウイロソーム、マイクロスフェア、およびマイクロカプセルからなる群から選択される、請求項２７に記載の組成物。２９．リガンドに結合するRNA配列をさらに含む請求項１に記載の短い外部ガイド配列であって、ここで該短い外部ガイド配列は、該リガンドに結合されたときにのみ、RNAsa Pにより、前記標的RNA分子の切断を促進する、短い外部ガイド配列。３０．リガンドに結合するRNA配列をさらに含む請求項１に記載の短い外部ガイド配列であって、ここで該短い外部ガイド配列が、該リガンドに結合されないときにのみ、RNAsa Pにより、前記標的RNA分子の切断を促進する、短い外部ガイド配列。