JP4062365B2 - 短い外部ガイド配列 - Google Patents
短い外部ガイド配列 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4062365B2 JP4062365B2 JP53278697A JP53278697A JP4062365B2 JP 4062365 B2 JP4062365 B2 JP 4062365B2 JP 53278697 A JP53278697 A JP 53278697A JP 53278697 A JP53278697 A JP 53278697A JP 4062365 B2 JP4062365 B2 JP 4062365B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- segs
- target
- sequence
- molecule
- oligonucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 0 C*NC=*(C)C Chemical compound C*NC=*(C)C 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
- C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
- C12N2310/126—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes involving RNAse P
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/312—Phosphonates
- C12N2310/3125—Methylphosphonates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/316—Phosphonothioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/321—2'-O-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/322—2'-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
- C12N2310/3527—Other alkyl chain
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Pens And Brushes (AREA)
- Seal Device For Vehicle (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Prostheses (AREA)
Description
本出願は、RNAse PによるRNAの切断を標的化するように設計された方法および外部ガイド配列組成物に関する。
リボ核酸(RNA)分子は、遺伝情報のキャリア(例えば、レトロウイルスゲノムRNAおよびメッセンジャーRNA(mRNA)分子)、およびタンパク質合成に不可欠な構造物(例えば、トランスファーRNA(tRNA)およびリボゾームRNA(rRNA)分子)として作用し得るだけでなく、核酸分子を特異的に切断する酵素としても作用し得る。このような触媒性RNA分子はリボザイムと呼ばれる。
Altman博士およびCech博士(彼らは、1989年にノーベル賞を授与された)による触媒性RNAの発見は、商業的適用(特に、治療物)において多くの関心を生み出した(Altman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10898-10900(1993); Symons, Annu. Rev. Biochem. 61:641-671(1992); Rossiら、Antisense Res. Dev., 1:285-288(1991); Cech, Annu. Rev. Biochem. 59:543-568,(1990))。数種のクラスの触媒性RNA(リボザイム)が記載され、その中には、イントロン由来リボザイム(WO 88/04300; また、Cech, T., Annu. Rev. Biochem., 59:543-568,(1990)も参照のこと)、ハンマーヘッド型リボザイム(GeneShearsによるWO 89/05852およびEP 321021)、アクスヘッド(axehead)型リボザイム(InnovirによるWO 91/04319およびWO 91/04324)が含まれる。
RNAse P
別のクラスのリボザイムには、酵素RNAse PのRNA部分が含まれる。RNAse Pは、トランスファーRNA(tRNA)のプロセシングに関与し、タンパク質合成機構の共通の細胞性成分である。細菌性RNAse Pは、2つの成分、タンパク質(C5)およびRNA(M1)を含む。Sidney Altmanおよび彼の共同研究者らは、M1 RNAがまさに完全な酵素のように機能し得ることを実証し、Escherichia coliにおいてこのRNAが本質的に触媒成分であることを示した(Guerrier-Takadaら、Cell 35:849-857(1983))。その後の研究において、Altman博士および同僚は、外部ガイド配列(EGS)を用いることによって、事実上いかなるRNA配列をも細菌性RNAse Pに対する基質に変換するための方法を開発した。外部ガイド配列は、切断されるべきRNA中の切断部位の3'側にヌクレオチドに相補的な少なくとも7ヌクレオチドをその5'末端に有し、そしてその5'末端にヌクレオチドNCCA(Nは任意のヌクレオチドである)を有する(YaleによるWO 92/03566ならびにForsterおよびAltman, Science 238:407-409(1990)。
同様の原理を用いて、EGS/RNAse Pが指示するRNAの切断が、真核生物系での使用のために開発されており、ここでは、外部ガイド配列は、tRNAのステムおよびループ構造に類似の構造を有し、そしてここでは、基質RNAは、EGSの末端にハイブリダイズして、tRNAのアクセプターおよびDステムに類似の構造を形成する(Yuanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8006-8010(1992);YaleによるWO 93/22432)。続いて、真核生物RNase Pと共に用いられるEGS分子がtRNAのTステムおよびループに類似の構造のみを形成する必要があることが示されており、ここでは、再度、基質RNAは、EGSの末端にハイブリダイズし、tRNAのアクセプターおよびDステムに類似の構造を形成する(WO 95/24489、Yale)。これらのEGS分子は、標的RNA分子のRNase P媒介切断を促進するのに有用である。それらは、比較的小さなEGS分子のみが投与される必要があるので、インビボでの使用に特に有用である。触媒RMase Pは、動物または患者の細胞中に既に存在し、かつ活性である。YuanおよびAltman, EMBO J 14:159-168(1995)、およびCarraraら、Proc. Natl. Acad. Sci.(USA)92:2627-2631(1995)、後者は、RNase Pによる基質の切断に必要な最小構造を決定した。
本発明の目的は、ウイルス性疾患および異常転写産物が関与する疾患の処置を目標とする治療薬、およびそれらの使用方法を提供することである。
本発明の別の目的は、RNase Pの短い外部ガイド配列、このような短い外部ガイド配列をコードするベクター、およびそれらの使用方法を提供することである。
本発明の別の目的は、ヌクレアーゼ分解に対して増強した耐性を有するRNAse Pの化学的に修飾した短い外部ガイド配列を提供することである。
本発明の別の目的は、RNAse Pの短い外部ガイド配列によって促進された標的RNA分子の切断方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、肝炎のようなウイルスに対して特異的に標的化されたRNAse Pの短い外部ガイド配列、このような外部ガイド配列をコードするベクター、およびそれらの使用方法を提供することである。
発明の要旨
真核生物RNAse Pに対する外部ガイド配列(EGS)分子は、標的RNAの効率的かつ特異的な切断を標的化するように操作される。それらは、DNAse Pの外部ガイド配列が、標的RNA分子に優先的に結合させ、かつ標的RNA分子のRNAse P媒介切断を促進することを可能にする特定のヌクレオチド配列を含有する。短い外部ガイド配列(SEGS)分子は、標的分子にハイブリダイズしたとき、RNAse Pによる基質として認識される最小構造を提供するように構築されている。小EGS/標的構造は、tRNAのAステムおよびTステム(RNAse Pの天然基質)に類似の構造を含む。SEGSは、これらのステム構造の半分のみを作出する。ステム構造の他方の半分は、標的分子によって提供される。標的分子によってRNAse P基質構造の大半を形成させることにより、開示されたSEGS分子は、以前のEGS分子より有意に小さいものとなり得る。これにより、SEGS分子は、治療剤として特に有用となる。なぜなら、それらは、量的に製造および投与のためにより簡単であり、かつさほど高価でないからである。
修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド連結を有するこれらのSEGS分子の化学的に修飾された型は、ヌクレオチド分解に対するそれらの耐性を増強するように設計される。RNAse P標的化活性を維持しながら安定性の増強を達成するように、特定の領域が修飾される。実施例は、肝炎ウイルスRNAに結合し、そして肝炎ウイルスRNAのRNAse P切断を促進するRNAse PのSEGS分子が構築されたことを実証する。構築物スクリーニングの目的のためのSEGSの活性の決定方法、およびこのようなRNA分子の使用方法および生産方法もまた、開示される。
【図面の簡単な説明】
図1は、標的RNA分子にハイブリダイズされた短い外部ガイド配列(SEGS)の構造の図である。SEGS(配列番号6)および標的RNA分子(配列番号7)の部分、各々がSEGS/標的RNA複合体における特異的構造上の役割を果たす。SEGSの部分は、5'から3'へ、T認識アームおよびA認識アームである。標的RNAの部分は、5'から3'へ、第1標的領域、突出(bulge)領域、第2標的領域、そしてターン領域である。SEGSと標的RNAとの間の一次構造の関連性は、A認識アームが第1標的領域に相補的であり、そしてT認識アームが第2標的領域に相補的である点にある。ターン領域の2つのヌクレオチドを除いて、示す配列は、単なる例であり、そして一般の標的RNAのRNAse P媒介性切断を得ることに対して重要でない。本例において、標的RNAは、HBV RNAである。
図2は、SEGS(EGS 3;配列番号1)およびヌクレオチド配列(配列番号2)を有する短いモデル標的RNA(T 10)の構造の図である。2つのオリゴヌクレオチドを、tRNAのAステムおよびTステムに類似する構造を形成する塩基対形成を示すように整列する。この構造は、真核生物のRNAse Pによって認識され、そして標的RNAのRNAse P媒介性切断を促進する。RNAse P切断部位を矢印で示す。
図3は、ヌクレオチド配列(配列番号3)を有するSEGS(EGS a)および配列番号4のヌクレオチド1〜36において示されるヌクレオチド配列を有する短いモデル標的RNA(T a)の構造の図である。2つのオリゴヌクレオチドを、tRNAのAステムおよびTステムに類似する構造を形成する塩基対形成を示すように整列する。この構造は、真核生物のRNAse Pによって認識され、そして標的RNAのRNAse P媒介性切断を促進する。RNAse P切断部位を矢印で示す。モデル標的RNAの部分は、HBV配列の一部と適合する。「壊れた」Tループに含まれる配列は、tRNATyrのTループにおける配列と同一である。
図4は、ヌクレオチド配列(配列番号3)を有するEGSおよびヌクレオチド配列(配列番号4)を有する短いモデル標的RNA(T a')の構造の図である。2つのオリゴヌクレオチドを、tRNAのAステムおよびTステムに類似する構造を形成する塩基対形成を示すように整列する。この構造は、真核生物のRNAse Pによって認識され、そして標的RNAのRNAse P媒介性切断を促進する。RNAse P切断部位を矢印で示す。モデル標的RNAは、HBV配列の一部と適合する。
図5は、EGSおよび標的RNAの構造の図である。短いモデル標的RNA(T 7;配列番号2)にハイブリダイズされた15ヌクレオチドSEGS(EGS 3;配列番号1)の構造を、左側に示す。短いモデル標的RNA(T 7;配列番号2)にハイブリダイズされた12ヌクレオチドSEGS(EGS 7;配列番号1のヌクレオチド4〜15)の構造を、右側に示す。SEGSおよび標的RNAを、tRNAのAステムおよびTステムに類似する構造を形成する塩基対形成を示すように整列する。この構造は、真核生物のRNAse Pによって認識され、そして標的RNAのRNAse P媒介性切断を促進する。RNAse P切断部位を矢印で示す。
図6は、SEGS/標的RNA複合体に類似する最少RNAse P基質の構造の図である。基質のヌクレオチド配列は、配列番号5である。この構造は、真核生物のRNAse Pによって認識され、そして切断される。RNAse P切断部位を矢印で示す。配列は、HBV配列の一部に対するモデルである。
図7は、2.1kb HBV RNAのヌクレオチド375〜424(配列番号7)に対応するHBV RNAの一部へのヌクレオチド配列(配列番号6)を有するSEGS(HBV B)のハイブリダイゼーションによって形成される構造の図である。SEGSおよびHBV RNAを、tRNAのAステムおよびTステムに類似する構造を形成する塩基対形成を示すように整列する。RNAse P切断部位を矢印で示す。
図8は、2.1kb HBV RNAのヌクレオチド543〜598(配列番号9)に対応するHBV RNAの一部へのヌクレオチド配列(配列番号8)を有するSEGS(HBV C)のハイブリダイゼーションによって形成される構造の図である。SEGSおよびHBV RNAを、tRNAのAステムおよびTステムに類似する構造を形成する塩基対形成を示すように整列する。RNAse P切断部位を矢印で示す。
図9は、2.1kb HBV RNAのヌクレオチド673〜718(配列番号11)に対応するHBV RNAの一部へのヌクレオチド配列(配列番号10)を有するSEGS(HBV F1)のハイブリダイゼーションによって形成される構造の図である。SEGSおよびHBV RNAを、tRNAのAステムおよびTステムに類似する構造を形成する塩基対形成を示すように整列する。RNAse P切断部位を矢印で示す。
図10は、2.1kb HBV RNAのヌクレオチド1559〜1606(配列番号13)に対応するHBV RNAの一部へのヌクレオチド配列(配列番号12)を有するSEGS(HBV H)のハイブリダイゼーションによって形成される構造の図である。SEGSおよびHBV RNAを、tRNAのAステムおよびTステムに類似する構造を形成する塩基対形成を示すように整列する。RNAse P切断部位を矢印で示す。
図11は、2.1kb HBV RNAのヌクレオチド1562〜1606(配列番号13のヌクレオチド4〜48)に対応するHBV RNAの一部に対するヌクレオチド配列(配列番号14)を有するSEGS(HBV H1)のハイブリダイゼーションによって形成される構造の図である。SEGSおよびHBV RNAを、tRNAのAステムおよびTステムに類似する構造を形成する塩基対形成を示すように整列する。RNAse P切断部位を矢印で示す。
図12は、SEGS/標的RNA複合体に類似する最少RNAse P基質の構造の図である。基質のヌクレオチド配列は、配列番号15である。この構造は、真核生物のRNAse Pによって認識され、そして切断される。RNAse P切断部位を矢印で示す。ステムおよびTループに含まれる配列は、AステムおよびTステムならびにtRNATyrのループにおける配列と同一である。
図13は、ヌクレオチド配列(配列番号1)を有するSEGS(EGS 3)および配列番号2のヌクレオチド1〜36に示されるヌクレオチド配列を有する短いモデル標的RNA(T 7)の構造の図である。2つのオリゴヌクレオチドを、tRNAのAステムおよびTステムに類似する構造を形成する塩基対形成を示すように整列する。この構造は、真核生物のRNAse Pによって認識され、そして標的RNAのRNAse P媒介性切断を促進する。RNAse P切断部位を矢印で示す。ステムおよび「壊れた」Tループに含まれる配列は、AステムおよびTステムならびにtRNATyrのループにおける配列と同一である。
発明の詳細な説明
標的RNA分子の切断を促進するのに適切なオリゴヌクレオチドが、構築されている。このオリゴヌクレオチドは、標的RNA分子に特異的に結合しそのRNAse P媒介性切断を促進するように、そして増強されたヌクレアーゼ耐性を有するように設計された、真核生物RNAse Pのための外部ガイド配列(EGS)分子である。これらのEGA分子は、以前の外部ガイド配列とは構造および大きさにおいて異なり、そして短い外部ガイド配列(SEGS)と言われる。重要な識別する特徴は、SEGSそれ自体がtRNAのTステムおよびループに類似の構造を形成しないことである。
B型肝炎ウイルス感染の処置における使用に適切なSEGSが構築されている。本明細書中で使用される「外部ガイド配列」および「EGS」は、標的RNAにおいてRNAse Pのための活性切断部位を形成する任意のオリゴヌクレオチドを言う。「短い外部ガイド配列」および「SEGS」は、以下に記載のEGSの短い形態を言う。用語「短い外部ガイド配列」および「SEGS」は、一般に「短い」EGS分子(即ち、単に「短い」EGS分子)よりもむしろ以下に記載されるような短い形態のEGS分子のみを言うことが意図される。この区別を強調するために、「短い外部ガイド配列」は本明細書中で大文字で表される。本明細書中で外部ガイド配列への参照がなされる場合、それはSEGSが包含されることが意図される。
以前のEGS分子は、標的RNA分子にハイブリダイズしてtRNAのAステムおよびDステムに類似の構造を形成するような3'テイルおよび5'テイルを有し、少なくともtRNAのTステムおよびループに類似する構造を形成するように設計された。TループおよびDステムに類似の構造は標的RNA/EGS構造の切断に不要であることが発見されている。開示された短い外部ガイド配列分子において、SEGSおよび標的RNA分子は共に、tRNAのAステムおよびTステムに類似の構造を形成する。以前のEGS分子とは異なり、SEGSは、Tループを形成せず、そしてそれ自体はTステムに類似の構造を形成しない。代わりに、標的RNA分子は、SEGSにハイブリダイズして、tRNAのTステムに類似の構造の半分を形成する。その標的RNA分子にハイブリダイズしたSEGSの例は、図1に示される。
SEGSは、1)インタクトなTループが存在しない、2)SEGSおよび標的RNAはtRNAのDステムに類似の構造を形成しない、および3)標的RNAはSEGSとともにtRNAのTステムに類似の構造の半分を形成する、という点で以前のEGS分子と区別される。
SEGSは、以前のEGS分子を越えるいくつかの利点を有する。1)これらのより短い長さのため、SEGSの合成および精製が容易であり、そしてより少ない費用ですむ、2)以前のEGS分子において標的認識のために使用された短いDステムはEGSにおいてより低い標的特異的配列を提供し、それにより切断の特異性が減少するので、標的認識のためのTステムの使用はEGSにより大きな特異性を与える、および3)SEGSは細胞により、より容易に取り込まれる。
I.SEGS分子の設計および合成
SEGS分子は、真核生物のRNAse Pの前駆体tRNAの天然の切断部位に類似した二次構造および三次構造を形成する標的基質に結合する合成オリゴヌクレオチドである。SEGS分子がRNAse P活性を標的化し、促進する能力は、以下により詳細に記載するように、標的RNA配列のRNAse Pによる切断についてのインビトロ活性アッセイを用いて容易に決定される。修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド連結を有するSEGS分子の場合、安定性アッセイにより種々のタイプの修飾のヌクレアーゼ耐性の決定が可能になる。活性アッセイは、異なる修飾を有するSEGS分子により促進されるRNAse P媒介性切断の効率の比較を可能にする。ならびに、アッセイは、修飾されたSEGS分子の安定性および切断効率を至適化および平衡化するために使用される。
ウイルス疾患の処置において使用するために適切である例示のSEGS分子が構築されている。特異的標的はB型肝炎ウイルスであり、より詳細には、B型肝炎表面抗原(HBsAg)コードRNAである。HBsAgがウイルス表面構造(suprastructure)および感染において不可欠な役割を果たすので、SEGSベースの治療は、HBsAg mRNAの切断を介して肝炎をダウンレギュレートするために使用され得る。B型肝炎RNAまたは他の標的RNA内の好ましい標的部位は、標的RNAの全ての形態において見られ、そして以下に記載するようにUNRモチーフを有する保存配列の領域である。このような好ましい5つの部位は、B型肝炎RNAのHBsAgコード領域内で同定され、そして配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、および配列番号14において示されるヌクレオチド塩基配列を有するSEGS分子により標的化される。
A.SEGS分子の設計
SEGS分子を、プレ-tRNA分子の基本構造の一部を基質認識配列を形成するように適合させることによって設計し得る。この認識配列は、標的RNA分子における標的配列の領域に相補的である。SEGSにおいて、認識配列は、A認識アームおよT認識アームといわれる2つの認識アームから構成される。これらのアームは、標的RNAの標的配列の領域と組合せて、それぞれtRNA分子のAステムおよびTステムに類似の構造を形成する。T認識アームは、A認識アームの5'でそれに隣接して位置している。認識アームの配列は、標的RNAの標的配列の2つの領域(第1標的領域および第2標的領域と呼ばれる)に特異的に相補的になるように選択される。第1標的領域は、RNAse P-媒介切断が起こる部位を含み、これに隣接しそして3'である。
認識アームの配列は、標的RNAの第1および第2標的領域が短い対合していない領域(突出(bulge)領域という)によって分離されるように選択される。この構造の形成は、SEGSのヌクレオチド配列を規定するための唯一の本質的な必要条件である。しかし、認識アームの配列がまた、UNRモチーフが第2標的領域に隣接し3'である標的RNA分子に存在するように選択されることが好ましい。UNRモチーフは、第2標的領域に直に隣接し得るか、またはそれは第2標的領域から1つまたはいくつかのスペーサーヌクレオチドによって分離され得る。UNRモチーフは、第2標的領域から0〜10スペーサーヌクレオチドによって分離されていることが好ましい。UNRモチーフは第2標的領域から0〜3スペーサーヌクレオチドだけ分離されていることがより好ましい。UNRモチーフは、第2標的領域から1スペーサーヌクレオチドだけ分離されていることが最も好ましい。UNRモチーフは、UNRのヌクレオチド配列を有し、ここでNは、任意のヌクレオチドを表し、Rは任意のプリンヌクレオチドを表し、そしてUは、ウリジンヌクレオチドを表す。UNRモチーフを形成する標的RNA分子の標的配列または対応する配列の領域、およびスペーサーヌクレオチドは、ターン領域といわれる。ターン領域は、もし存在すれば、第2標的領域に直に隣接しそして3'である。いかなる特定の理論に制限されることを所望せずに、標的RNAの標的配列のターン領域のウリジンターン構造(QuigleyおよびRich, Science 194:796-806(1976)、ならびにJunkerおよびPardi, RNA 1:219-222(1995))を形成する能力は、標的RNAのRNAse P-媒介切断を促進を助ける。
上記の関係に従って、標的RNAの標的配列は、5'から3'に向かって、第1標的領域、突出領域、および第2標的領域から構成され、ここで、SEGSのA認識アームは、第1標的領域に相補的であり、そしてSEGSのT認識アームは、第2標的領域に相補的である。UNRモチーフを有するターン領域はまた、第2標的領域の3'の標的配列に存在する。これらの領域および関係の例を図1に示す。
認識アームは、機能的SEGS分子を生じる任意の長さであり得る。A認識アームおよびT認識アームは合わせて12〜16ヌクレオチドになることが好ましい。A認識アームおよびT認識アームは合わせて12または13ヌクレオチドになることが最も好ましい。一般に、A認識アームは、7〜9ヌクレオチド長であり、T認識アームは、5〜7ヌクレオチド長であることが好ましい。A認識アームは、7または8ヌクレオチド長であり、そしてT認識アームは5または6ヌクレオチド長であることが最も好ましい。一般に、認識アームは、任意のヌクレオチド配列を有し得る。以下に議論されるように、配列の選択は、好ましくは目的の標的RNAの標的配列の配列に基づく。A認識アームの3'末端のヌクレオチドは、シチジンまたはグアニジンヌクレオチドであることが好ましい。A認識アームの3'末端のヌクレオチドは、シチジンヌクレオチドであることが最も好ましい。
突出領域は、機能的SEGS分子を生じる任意の長さであり得る。突出領域は、1〜30ヌクレオチド長であることが好ましい。突出領域は、5〜15ヌクレオチド長であることがより好ましい。突出領域は、9ヌクレオチド長であることが最も好ましい。ターン領域は、もし存在するならば、機能的SEGS分子を生じるコンセンサス式UNRを含む任意の配列を有し得る。ターン領域のヌクレオチド配列は、本明細書中で、標準的なヌクレオチド塩基シンボルを用いて表される。参照のために、Nは、任意のヌクレオチドを表し、Rは任意のプリンヌクレオチドを表し、Yは任意のピリミドヌクレオチドを表し、Aは、アデニンヌクレオチドを表し、Cは、シトシンヌクレオチドを表し、Gは、グアニンヌクレオチドを表し、Tは、チミンヌクレオチドを表し、そしてUはウラシルヌクレオチドを表す。ターン領域は、NUCRまたはUUNRの配列を有することがより好ましい。ターン領域はUUCRの配列を有することが最も好ましい。
標的RNAの標的配列のターン領域は、式NNNRで包含されるヌクレオチド配列を含むことが好ましい。標的RNAの標的配列のターン領域は、式NNYR、YNNR、またはNYNRのうちの少なくとも1つによって包含されるヌクレオチド配列を含むことがより好ましい。標的RNAの標的配列のターン領域は、式YNYR、NYYR、またはYYNRのうちの少なくとも1つによって包含されるヌクレオチド配列を含むことがなおより好ましい。標的RNAの標的配列のターン領域は、式YYYR、YUNR、またはNUYRのうちの少なくとも1つによって包含されるヌクレオチド配列を含むことがなおより好ましい。標的RNAの標的配列のターン領域は、式UYYRもしくはYYCRのうちの少なくとも1つ、または式YUYR、UUNR、またはNUCRのうちの少なくとも1つによって包含されるヌクレオチド配列を含むことがなおより好ましい。標的RNAの標的配列のターン領域は、式UYCR、または式UUYRもしくはYUCRのうちの少なくとも1つによって包含されるヌクレオチド配列を含むことがなおより好ましい。標的RNAの標的配列のターン領域は、式UUCRによって包含されるヌクレオチド配列を含むことが最も好ましい。
標的RNAの標的配列のターン領域が式NNNYによって包含されるヌクレオチド配列を包含する場合、ターン領域は、式YNNYによって包含されるヌクレオチド配列を含むことが好ましい。標的RNAの標的配列のターン領域が式YNYYまたはYYNYの少なくとも1つによって包含されるヌクレオチド配列を含むことがより好ましい。標的RNAの標的配列のターン領域が式YYYYによって包含されるヌクレオチド配列を含むことがなおより好ましい。標的RNAの標的配列のターン領域が式YUYYまたは式UYCYによって包含されるヌクレオチド配列を含むことがなおより好ましい。標的RNAの標的配列のターン領域が式UUYYまたはYUCYのうちの少なくとも1つによって包含されるヌクレオチド配列を含むことがなおより好ましい。標的RNAの標的配列のターン領域が式UUCYによって包含されるヌクレオチド配列を含むことが最も好ましい。
機能的SEGS分子は、それらが標的RNAと組合せて、非対合領域がtRNAのAステムおよびTステムに対応する構造の間の標的RNAに存在するように、前駆体tRNAのAステムおよびTステムに対応する構造を形成することのみを必要とする。tRNAのTループに対応する構造は必要とされない。従って、機能的SEGS分子は、標的RNA分子の2つの領域に相補的なヌクレオチド配列のみを必要とする。ここで、標的RNA分子の領域は、SEGSに相補的でない領域である突出領域によって分離されている。UNRモチーフまたは上記の別の好ましいターン領域ヌクレオチド配列を含むターン領域はまた、tRNAのTステムに対応する構造に隣接しそして3'である標的RNAに存在する。
SEGSは、目的の任意の標的RNA分子の任意の配列を標的化するために設計され得る。しかし、SEGSは、好ましくは、目的の標的RNAのヌクレオチド配列をUNRモチーフまたは上記の別の好ましいターン領域ヌクレオチド配列の位置について検索することによって設計される。より好ましいSEGSについては、検索は、上記のターン領域の好ましい配列に制限され得る。一旦所望のターン配列が同定されると、SEGSのT認識アームの配列は、ターン領域配列に隣接しそして5'であり、所望であれば、1つまたはいくつかのスペーサーヌクレオチドによって分離されている標的RNA中のヌクレオチドに相補的であるように選択される。標的RNA中のこれらのヌクレオチドは、第2標的領域を表す。SEGSのA認識アームの配列は、第2標的領域の5'であり、非対合領域によって分離されている標的RNA中のヌクレオチドに相補的であるように選択される。
SEGSの設計は、例とともに例示され得る。UNRモチーフを含むB型肝炎ウイルスのヌクレオチド配列の部分は:
(配列番号7;太字はUNRモチーフ)である。5ヌクレオチドのT認識アーム長、9ヌクレオチドの突出領域長、8ヌクレオチドのA認識アーム長、およびターン領域中の単一スペーサーヌクレオチドを選択して、SEGSの配列は、UNRモチーフの5'であるスペーサーヌクレオチド(U)、および続くターン領域の5'である15番目のヌクレオチドで始まる7ヌクレオチドの相補物を含む、ターン領域に隣接しそして5'である5つのヌクレオチドの相補物である。このSEGS(HBV B)は、配列
(配列番号6;太字はT認識アーム)を有する。SEGS HBV BおよびHBV RNAの複合体の構造を、図7に示す。HBVをまた含む他の例を図8、9、10、および11に示す。
SEGS分子はまた、A認識アームの3'末端およびT認識アームの5'末端のいずれかまたは両方でさらなるヌクレオチド配列を含み得る。このようなヌクレオチド領域は、それらが標的RNAの標的配列に相補的でないことにおいてSEGSの認識配列から区別される。このような配列は、SEGSの認識配列の一部であると考えられている。T認識アームの5'末端のこのようなさらなるヌクレオチド配列の例を、図2に示す。
SEGS分子は、Yuanら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:8006-8010(1992)に記載されるアッセイまたは下記のアッセイを用いて、RNAse Pによる標的RNA切断を促進する能力について容易にスクリーニングされ得る。
SEGSおよびRNAse Pの触媒RNAサブユニットは結合され、SEGSの標的化機能およびRNAse P触媒RNAの切断機能の両方を保有する単一のオリゴヌクレオチド分子を形成し得る。単一のオリゴヌクレオチド分子におけるこのような組み合わせは、RNAse P内部ガイド配列(RIGS)と呼ばれる。RIGSは、SEGSと同じ様式で標的RNA分子を切断するために用いられ得る。
RIGSは、任意の適切な手段によりガイド配列をRNAse P触媒配列へ連結することにより形成され得る。例えば、SEGSおよびRNAse P触媒RNAは、分離分子として調製され得、次いでインビトロにおいて共有結合される。あるいは、完全なRIGSは、化学合成によるか、あるいは連結されたSEGSおよびRNAse P触媒配列をコードするDNA分子のインビトロまたはインビボ転写によるかのいずれかで、単一の分子として合成され得る。SEGSとRIGSのRNAse Pドメインとの間の連結は、ドメインが標的RNAを切断することを可能にする任意の形態を有し得る。例えば、2つのドメインは、オリゴヌクレオチドリンカーにより接合され得る。好ましくは、リンカーは、ホスホジエステル結合により接合された通常のヌクレオチドからなる。SEGSおよびRNAse P触媒配列成分は、SEGS成分の3'末端または5'末端のいずれかに連結されたRNAse P触媒配列と、いずれかの順で接合され得る。RIGSの構築方法および使用方法は、Yale UniversityによるPCT出願公開番号WO95/24489に記載される。
SEGS分子はまた、調節可能であり得る。調節可能なSEGS分子は、上記のようにリガンド結合配列に連結され、このリガンドの制御下にSEGS分子の活性をおき、および活性化または不活性化のためにリガンドの存在を必要とする、SEGS配列である。RNA分子は、ある部分がリガンドに結合し得、そして他の部分がSEGS配列であるように構築される。リガンドを結合する分子を選択した後、リガンド結合分子を、リガンドまたは「co-drug」の存在下および非存在下においてその触媒機能についてアッセイする第2の選択プロセスを行う。この手段では調節可能なSEGS分子は、リガンドの存在下における標的RNAの切断、またはリガンドの非存在下における標的RNAの切断において使用するために選択される。
この方法および調節可能なSEGS分子は、制御様式での標的RNA分子の切断において有用である。これは、これらのRNA分子の完全な不活性化により宿主細胞を殺傷することが望ましくない細胞内に標的RNA分子が存在する場合、特に有用である。調節可能なEGS分子の形態、選択、および使用は、PCT出願公開番号WO94/13791および同WO94/13833に十分に記載される。同じ方法が、調節可能なSEGS分子を形成、選択、および使用するために使用され得る。
SEGS分子、および公知の配列を有するSEGS分子をコードするDNA配列を産生または合成するための方法は、自動化核酸合成を用いて、例えば、Applied Biosystems, Inc.(Foster City, CA)またはPharmacia Oligo Pilot(Pharmacia, Piscataway, NJ)によるDNA392型合成機でのシアノエチルホスホルアミダイト法を用いて、日常的に合成され得る。核酸分子を合成するための他の方法もまた利用可能である(例えば、Ikutaら, Ann. Rev. Biochem. 53: 323-356(1984)(ホスホトリエステルおよびホスファイト-トリエステル法);Narangら, Methods Enzymol. 65: 610-620(1980)(ホスホトリエステル法)を参照のこと)。あるいは、SEGS分子は、DNAテンプレートを例えば、T7 RNAポリメラーゼを用いて転写することにより合成され得る(Milliganら, Nucl Acids Res. 15: 8783(1987))。SEGS分子はまた、細胞中にSEGSをコードおよび発現するベクターを配置することにより、細胞中で合成され得る。
B.SEGS分子の活性
無制限の量のRNAse P存在下で、種々の量のSEGSとともにインキュベーションした後に残存する基質RNAのパーセントを測定するインビトロ切断アッセイは、SEGS/RNAse P複合体の潜在的な活性の指標として使用される。最も高いインビトロ活性を示すSEGS/RNAse P複合体を、さらなる試験のために選択する。残存するRNAのパーセントは、SEGS濃度の関数としてプロットされ得る。SEGS/RNAse Pの触媒効率は、kcat/Km(ここでkcatは切断の速度定数であり、そしてKmはミカエリス定数である)、遊離のSEGSおよび基質RNA分子の反応に対する二次速度定数として表され得る。HeidenreichおよびEcksteinの方法(J. Biol. Chem., 267:1904-1909(1992))によれば、kcat/Kmが式
−lnF/t=(kcat/Km)[C]
を用いて決定され、ここでFは、残存基質の画分であり、tは反応時間であり、そして[C]はSEGS濃度である。
好ましいSEGS構築物は、肝炎基質RNAに結合し、そしてその優先的なRNAse P切断を促進する構築物である。好ましい構築物は、実施例1に記載のリボザイム切断アッセイを用い、そして、上記のkcat/Km値により決定されるように、どの構築物が肝炎基質RNA配列の特異的RNAse P切断を媒介するのに最も効果的であるかを決定して選択され得る。
SEGSの細胞内活性は、目的の標的RNAを発現する細胞を用いて試験され得る。例えば、上記のNUNRモチーフを有するHBV RNAの種々の領域に標的化したSEGS分子は、HBV RNAを発現する細胞において試験され得る。このために、SEGSは、HepG2.2.15細胞(この細胞は、HBV RNAを構成的に発現し、そしてHBV粒子を完全に組み立てる(Sellsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 1005-1009(1987)))においてウイルス複製の阻害について試験され得る。このアッセイは、一般的にKorbaおよびGerin(Antiviral Res. 19: 55-70(1992))により記載されるように行われ得る。SEGS分子は、細胞にヘム脂質粒子、特にヘムに結合した1,2-ジオレオイルオキシ-3-(トリメチルアンモニウム)プロパン(DOTAP)およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)との複合体(DDHと呼ばれる)として10日間にわたって送達され得、そして培地中に分泌されたHBV粒子のDNAゲノムはドットブロットアッセイを用いてアッセイされ得る。
ヘム脂質粒子は、一般に以下の通りに調製され得る。ヘム(FeプロトポルフィリンIXクロリドとして、ヘミン)は、8.3mM NaOHを含有するエタノール中に溶解され、そして不溶性物質が14krpmで10分間でペレット化される。カルボジイミドを用いる有効な結合を可能にするために、ヘム溶液のpHを、少容量のHClの添加によりヘムの沈澱を伴わずに減少させる。典型的な反応において、200mgのヘミンは8.3mM NaOHを含有する10mlエタノールに添加される。HClをヘム溶液の上清に添加してpHを1.7へと低下させ、ヘム溶液(約1.6mgヘムを含有する)、760μl(10μmol)DOPE(10mg/ml)および500μl DCC(10mg/ml)を添加し、そして結合を暗黒下、室温にて一晩、進行させる。クロロホルム中の10μmol DOTAPを滅菌ガラス試験管中のヘム結合DOPEに添加し、そして脂質をvortexデシケーター中で50℃にて20分間減圧下で薄膜へと乾燥させる。1mlの滅菌150mM NaClを脂質膜に添加する。そしてエマルジョンを、Bransonic 1210バスソニケーター中で47kHzで20℃で操作して30分間超音波処理し、濁った溶液を得た。脂質粒子を、Lipex Extruder(Lipex Biomembranes, Vancouver, Canada)を用いてポリカーボネート膜を通して押出す。
SEGS/脂質組成物を、SEGS分子を含有する溶液を150mM NaClに入れることにより調製し、そしてDDH脂質粒子(150mM NaCl中)を、0.2mg/mlの最終濃度までSEGS溶液に添加する。室温にて15分間インキュベートした後、培養培地を添加し、そしてSEGS/脂質混合物を希釈して所望の最終濃度のSEGSを有するSEGS組成物を得る。等価な容量の150mM NaClをコントロールとして用いる。
HepG2.2.15細胞のコンフルエントな培養物を、96ウェル平底培養プレートで維持する。2連のプレートを、各SEGS処理のために用いる。各プレートで計3つの培養物を、希釈したSEGS組成物のそれぞれで処理する。培養物を、SEGS組成物の10日間連続の日用量で処理する。培地を、新鮮なSEGS組成物で毎日交換する。これらの処理の効果を、細胞外HBV DNAレベルを測定することによりモニターする。
これらのSEGSの抗ウイルス活性を、EC50として計算し得る。EC50は、コントロール組成物で処理した細胞と比較して産生されたHBVの量の50%低減が存在する、化合物の濃度である。比較のために、2'-3'-ddC(公知の強力な抗HBVヌクレオシドアナログ)の抗ウイルス効果が、同じアッセイにおいて測定され得る。
SEGSをうけた細胞の生存力を測定するフェノールレッドアッセイを用いて、SEGSの投与に関連した何らかの毒性(未処理細胞において観察される染料取り込みレベルの50%低下より大きいと定義される)が存在するか否かを決定し得る。
II.ヌクレアーゼ耐性SEGS分子
A.修飾のタイプ
未修飾のオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼのない環境における有効なSEGSとして機能し得るが、血清中および細胞内での短い半減期は、それらの治療としての有効性を減少させる。化学的修飾がなされ得、それは、標的RNAのRNase P媒介切断を促進するその生物学的機能を損なうことなくSEGSのヌクレアーゼ耐性を非常に増強する。一般的に、このような修飾は、SEGS中のヌクレオチドの2'位、SEGSの3'および5'末端、およびSEGS中のヌクレオチド間のリン酸結合においてなされ得る。例えば、SEGS構築物の塩基は、2'メトキシリボヌクレオチド、ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド、またはホスホロチオエートリボヌクレオチドにより、利用可能な核酸合成方法を用いて置換され得る。修飾されたヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド、ならびにそれらの合成方法は、公知である。これらのいくつかは、以下の文献に記載されている:Offenspergerら、
ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびSEGSを修飾するために使用される置換基を記載するにあたり、アルキルおよびアルキル基とは、直鎖、分岐鎖および環状アルキル基を含む、飽和脂肪族炭化水素をいう。この用途のためには、このようなアルキル基は、1から12個の炭素を有することが好ましい。このようなアルキル基は、1から6個の炭素を有することが、より好ましい。このようなアルキル基は、1から2個の炭素を有することが、さらにより好ましい。このようなアルキル基は、1個の炭素を有することが、最も好ましい。これらのアルキル基はまた、1つ以上のヒドロキシル基、1つ以上のアミノ基、またはそれらの両方を含み得る。このようなヒドロキシル基およびアミノ基は、アルキル基中の任意の炭素原子に結合され得る。本明細書中で用いる用語ヒドロキシアルキルは、1つ以上のヒドロキシル基を含むアルキル基をいうために使用され、用語アミノアルキルは、1つ以上のアミノ基を含むアルキル基をいうために使用され、そしてヒドロキシルアミノアルキルは、1つ以上のヒドロキシル基および1つ以上のアミノ基を含むアルキル基をいうために使用される。本明細書中で用いる、アリルまたはアリル基とは、直鎖、分枝差、および環式アリル基を含む、不飽和脂肪族炭化水素をいう。この用途のためには、このようなアリル基は、1から12個の炭素を有することが好ましい。このようなアリル基は、1から6個の炭素を有することが、より好ましい。このようなアリル基は、2から3個の炭素を有することが、さらにより好ましい。このようなアリル基は、3個の炭素を有することが、最も好ましい。他の置換基もまた、本明細書中に記載されたヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびSEGSを修飾するために使用され得る。例えば、アリール、アルカリール、およびアリールアルキルである。ここで、アリールとは、ベンジル基をいい、アルカリールとは、アリール基で置換されたアルキル基をいい、そしてアリールアルキルとは、アルキル基で置換されたアリール基をいう。
ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびSEGSに関連する用語、修飾の本明細書中での使用は、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの、従来のヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドに対する化学的相違をいうことを意図する。本明細書中での用語、修飾の使用は、修飾されたヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはSEGSが生産される様式を、限定することを意図しない。同様に、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはSEGS上の化学的基を置換することへの言及は、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの従来のヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドに対する化学的相違をいうことを意図し、そしてヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはSEGSが生産される様式を限定することを意図しない。
1.3'および5'末端における修飾。オリゴヌクレオチドアナログの分解が、主に3'-エキソヌクレアーゼによることが、現在の文献には十分に記述されている。いくつかの研究はまた、様々な3'-修飾が、これらのアナログのヌクレアーゼ感受性を非常に減少させ得ることを実証している。従って、3'エキソヌクレアーゼに対する感受性を減少させる他の方法は、遊離アミンの、SEGS分子の3'末端ヒドロキシル基の導入である(例えば、Orsonら、Nucl.Acids Res.、19:3435-3441(1991)を参照のこと)。他の有用な3'末端修飾は、3'から3'への結合を有するSEGSのチミンヌクレオチド末端をカップリングすることである。このような構造を、本明細書中では、3'-3'-チミンヌクレオチドまたはT(3'-3')という。
好ましい3'修飾は、短い外部ガイド配列の3'ヒドロキシルが、化学的基(例えば、-H、-O-R1, -NH2、-NH-R1、-N-R2、F、および-3'-ヌクレオチド)により置換されたものである。ここで、各R1は、独立して、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキル、アリル、-PR2(O)-R2、または-PR2(S)-R2であり、ここで、各R2は、独立して、O、S、F、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキル、アリル、O-R3、S-R3であり、ここで各R3は、独立して、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキル、またはアリルである。より好ましい3'修飾は、短い外部ガイド配列の3'ヒドロキシルが、化学的基(例えば、-H、-O-CH3, -NH2、-NH- CH3、-N-(CH3)2、F、-3'-チミンヌクレオチド、-OPO(O)-CH3、-OPO(S)-CH3、-OPO(O)OCH2CH(OH)-CH2NH2、および-OPO(S)OCH2CH(OH)-CH2NH2)で置換されたものである。最も好ましい3'修飾は、短い外部ガイド配列の3'ヒドロキシルが、-3'チミンヌクレオチド、-OPO(O)OCH2CH(OH)-CH2NH2、または-OPO(S)OCH2CH(OH)-CH2NH2により置換されたものである。本明細書中で用いる、SEGSの3'ヒドロキシルとは、通常、SEGSの3'末端ヌクレオチドのリボース残基の3'炭素上に存在するヒドロキシル基をいう。本明細書中で用いる、SEGSの3'炭素とは、SEGSの3'末端ヌクレオチドのリボース残基の3'炭素をいう。
SEGSの5'末端は、ヒドロキシルまたはリン酸基を有することが好ましいが、5'末端は、SEGSのヌクレアーゼに対する耐性を上昇させるために修飾され得る。好ましい5'修飾は、短い外部ガイド配列の5'ヒドロキシルが、化学的基(例えば、-H、-O-R4, -NH2、-NH-R4、-N-(R4)2、およびF)で置換されたものである。ここで、各R4は、独立してアルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキル、アリル、-PR5(O)-R5、または-PR5(S)-R5であり、ここで各R5は、独立して、O、S、F、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキル、アリル、O-R6、またはS-R6であり、そしてここで、各R6は、独立して、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキル、またはアリルである。より好ましい5'修飾は、短い外部ガイド配列の5'ヒドロキシルが化学的基(例えば、-H、-O-CH3, -NH2、-NH-CH3、-N-(CH3)2、F、-OPO(O)-CH3、-OPO(S)-CH3、-OPO(O)OCH2CH(OH)-CH2NH2、および-OPO(S)OCH2CH(OH)-CH2NH2)で置換されたものである。最も好ましい5'修飾は、短い外部ガイド配列の5'ヒドロキシルが、-OPO(O)OCH2CH(OH)-CH2NH2、または-OPO(S)OCH2CH(OH)-CH2NH2)で置換されたものである。本明細書中で用いる、SEGSの5'ヒドロキシルとは、通常はSEGSの5'末端ヌクレオチドのリボースの5'炭素に存在して、通常はそれにリン酸基が結合(attach)しているヒドロキシルをいう。本明細書中で使用する、SEGSの5'炭素とは、SEGSの5'末端ヌクレオチドのリボース残基の5'炭素をいう。他の有用な修飾は、インターカレート剤(例えば、酸性誘導体)の、5'末端リン酸への、(例えば、ペンタメチレンブリッジを用いた)共有結合である(例えば、Maherら、Science、245:725〜730(1989);Grigorievら、J. Biol. Chem.、267:3389-3395(1992)を参照)。WO 95/23225は、リボザイムの安定性を上昇させるための化学修飾(例えば、ヌクレオシドまたはヌクレオチドシュガーの5'炭素におけるアルキル基の導入)を記載する。このような修飾はまた、SEGS分子にも使用され得る。
2.ヌクレオチドの2'位における修飾。有用であることが期待される化学的修飾の他のクラスは、ヌクレオチドのリボース部分の2'OH基の修飾であり、これは、様々な細胞内および細胞外ヌクレアーゼの活性に関して重要であることが分かっている。代表的な2'修飾は、2'-O-メチルオリゴヌクレオチド(Paolellaら、EMBO J., 11:1913-1919、1992)および2'-アミノオリゴヌクレオチド(Piekenら、Science、253:314-317(1991);HeidenreichおよびEckstain、J. Biol. Chem.、267:1904-1909(1992))の合成である。SEGS分子はまた、デオキシリボヌクレオチドを含み得る。このような置換は、重要な2'OH基を除去することにより、ヌクレアーゼ耐性を改善する。WO 95/23225は、2'-デオキシ-2'-アルキルヌクレオチドを記載し、これは、オリゴヌクレオチドの安定性を増強するために存在し得る。
好ましい2'修飾は、ヌクレオチドの2'ヒドロキシルが、化学的基(例えば、-H、-O-R7, -NH2、-NH-R7、-N-R7 2、F、および-2'-ヌクレオチド)で置換されたものである。ここで、各R7は、独立してアルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキル、アリル、-PR8(O)-R8、または-PR8(S)-R8であり、ここで各R8は、独立して、O、S、F、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキル、アリル、O-R9、またはS-R9であり、そしてここで、各R9は、独立して、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキル、またはアリルである。より好ましい2'修飾は、ヌクレオチドの2'ヒドロキシルが化学的基(例えば、-H、-O-CH3、-NH2、-NH-CH3、-N-(CH3)2、F、-OCH2-CH=CH2、-OPO(O)-CH3、および-OPO(S)-CH3)で置換されたものである。最も好ましい2'修飾は、ヌクレオチドの2'ヒドロキシルが、-O-CH3で置換されたものである。
3.リン酸結合の修飾。SEGS中のヌクレオチドを結合するリン酸基結合の修飾は、SEGSのヌクレアーゼに対する耐性を増強させるために使用され得る。この目的のための代表的な修飾は、遊離酸素原子硫黄またはハロゲンの一方または両方を置換することを含む。遊離酸素原子、または硫黄原子は、存在する場合、また化学的基(例えば、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアルキルアミノアルキル、またはアリル)に結合し得る。3'および/または5'ジハロホスホネート置換ヌクレオチド(例えば、3'および/または5'-CF2-ホスホネート置換ヌクレオチド))のような、このような置換の例は、WO 95/23225に記載されている。SEGSに使用するのに好ましい修飾されたリン酸結合基は、-OPR10(O)O-、-OPR10(S)O-、および-OPO(S)O-、が挙げられ、ここで、R10は、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキル、アリル、-O-R11、-NH2、-NH-R11、-N-R11 2、またはFであり、そしてここで、各R11は、独立して、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキル、またはアリルである。SEGSに使用するのにより好ましい修飾リン酸結合基は、-OPR12(O)O-、-OPR12(S)O-、および-OPO(S)O-、が挙げられ、ここで、R12は、-CH3、-O-CH3、-OCH2-CH=CH2、-NH2、-NH-CH3、-N-(CH3)2、またはFである。SEGSに使用するのに最も好ましい修飾リン酸結合基は、-OPO(S)O-であり、これは、一般的に、ホスホロチオエートと呼ばれる。
他の有用な修飾は、配列中に存在し得るシトシン塩基のメチル化である。SEGS/標的RNAハイブリッドの安定性は、より強力な標的RNAに対する塩基対形成を有するオリゴヌクレオチドをもたらす修飾されたヌクレオチドを用いることにより上昇し得る。例えば、C-5プロピニルピリミドヌクレオチドは、核酸間の水素結合を増大させる(Froehlerら、Tetrahedron Letters 33:5307-5310(1992))。
修飾されたSEGS分子が標的RNAのリボザイム媒介切断を促進する効率に、修飾が影響する程度は、上記の切断アッセイを用いて、容易に決定され得る。
B.キメラSEGS分子
上記の修飾が、SEGS分子の全体を通じて、SEGS分子の限定した領域においておよび/または組み合わせて使用され、修飾SEGS分子のキメラを生じ得る。SEGSにおける全てのヌクレオチドは、標的RNAのRNAse P修飾切断を促進するその能力を有意に低減することなく化学的に修飾され得ることが予想される。例えば、2'-O-メチル修飾ヌクレオチドは、RNAse P標的活性の有意な損失を伴うことなくSEGSの全体を通して使用され得ることが発見されている。
修飾が、修飾SEGS分子が標的RNAのRNAseP媒介切断を促進する効率に影響する程度は、上記の切断アッセイを用いて容易に決定され得る。化学的に修飾されたSEGS分子は、非修飾SEGS(すなわち、修飾SEGSと同一のヌクレオチド配列を有するが、非修飾リボヌクレオチド、非修飾ホスホジエステル結合、および非修飾3'および5'末端からなるSEGS分子)によって促進されるリボザイム切断活性と比較される場合、修飾SEGSによって促進されるリボザイム切断活性のレベルに従って分類され得る。この比較は、修飾SEGS分子により促進される相対的なリボザイム切断活性を提供する。この活性は、好ましくは非修飾SEGS分子により促進されるリボザイム切断活性のパーセントとして表される。修飾SEGS分子は、これらの活性レベルに基づいてクラスに分けられる得る。この方法で、修飾SEGSは、例えば、4つのクラスに分けられ得る:(1)非修飾SEGSにより促進されるリボザイム切断活性の70%より高い活性を促進する修飾SEGS分子、(2)非修飾SEGSにより促進されるリボザイム切断活性の50%〜70%を促進する修飾SEGS分子、(3)非修飾SEGSにより促進されるリボザイム切断活性の25%〜50%を促進する修飾SEGS分子、(4)非修飾SEGSにより促進されるリボザイム切断活性の25%未満を促進する修飾SEGS分子。好ましい修飾SEGS分子は、非修飾SEGSにより促進されるリボザイム切断活性の少なくとも25%を促進する。より好ましいSEGS分子は、非修飾SEGSにより促進されるリボザイム切断活性の少なくとも50%を促進する。最も好ましいSEGS分子は、非修飾SEGSにより促進されるリボザイム切断活性の少なくとも70%を促進する。
III.クローン化および発現ベクター
哺乳動物細胞にSEGS分子を導入するための好ましいベクターは、レトロウイルスのようなウイルスベクターを含む。このウイルスベクターは核に直接SEGS分子をコードするDNAを導入し、次いで核においてこのDNAは転写され、コードされるSEGS分子を産生する。
遺伝子治療のためにレトロウイルスベクターを使用する方法の例は、米国特許第4,868,116号および同第4,980,286号;PCT出願WO 90/02806および同WO 89/07136;ならびにMulligan,Science 260:926-932(1993)に記載される。
宿主染色体にDNAの形態でそれ自体のRNA配列を組み込む、欠陥レトロウイルスベクターは、宿主の細胞にSEGSを組み込むように操作され得る。ここでSEGSのコピーが作製され、そして細胞質に放出されるか、または核中に保持され肝炎RNAの標的ヌクレオチド配列と相互作用する。
骨髄幹細胞および造血細胞は、ヒトから比較的容易に取り出され、そして置換され、そして移入された遺伝子の増殖のために自己再生する細胞集団を提供する。このような細胞は、SEGS分子をコードするレトロウイルスに基づくベクターを用いて、インビトロまたはインビボでトランスフェクトされ得る。幹細胞のインビトロトランスフェクションが実施される場合、一旦トランスフェクトされた細胞が特定のSEGS分子を産生し始めると、この細胞は、SEGSを発現する完全なクローン性細胞集団を樹立するために患者に戻され得、従ってウイルス感染、形質転換、および他の疾患に耐性である。
一例として、構築物をコードするDNA配列をクローン化し、そして発現するために使用されるベクターは、以下のものを含み得る:
1.発現されるべきSEGS分子をコードするDNA配列を挿入するためのクローン化部位。
2.エピソーム(非組み込み)複製を可能にする哺乳動物複製起点(任意)(例えば、エプスタインバールウイルス由来の複製起点)。
3.SEGS構築物をコードするDNAの必要とされる量を産生するための細菌細胞において機能する複製起点(例えば、pBR322プラスミドに由来する複製起点)。
4.哺乳動物細胞において発現されるべきSEGS構築物をコードする挿入されたDNA配列の転写を指向するプロモーター(例えば、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、サイトメガロウイルス(CMV)に由来するプロモーター、または哺乳動物U6遺伝子のプロモーター(RNAポリメラーゼIIIプロモーター))。
5.哺乳動物選択マーカー(任意)(例えば、ネオマイシンまたはハイグロマイシン耐性)、これは構築物でトランスフェクトされる哺乳動物細胞の選択を可能にする。
6.細菌抗生物質耐性マーカー(例えば、ネオマイシンまたはアンピシリン耐性)、これはプラスミドベクターで形質転換される細菌細胞の選択を可能にする。
インビボでSEGS分子を送達し、そして発現させるための好ましいベクターは、発現のためにRNAポリメラーゼIII(pol III)プロモーターを使用する。このようなプロモーターは、細胞型特異的発現なしに、構成的に転写物を産生し得る。pol IIIプロモーターはまた、多くの標的RNA分子の位置である、細胞の核に残存するように操作され得る転写物を産生する。完全なpol III転写単位(pol IIIプロモーター、キャッピングシグナル、および終結配列を含む)が使用されることが好ましい。pol IIIプロモーター、および他のpol III転写シグナルは、tRNA遺伝子、5S RNA遺伝子、核内低分子RNA遺伝子、および細胞質低分子RNA遺伝子に存在する。SEGS発現ベクターにおける使用のための好ましいpol IIIプロモーターは、ヒト核内低分子U6遺伝子プロモーターおよびtRNA遺伝子プロモーターである。インビボで短いRNA分子を産生するためのU6遺伝子転写シグナルの使用は、Noonbergら、Nucleic Acids.Res.22:2830-2836(1995)に記載され、そしてtRNA転写シグナルの使用は、Thompsonら、Nucleic Acids Res.,23:2259-2268(1995)に記載されている。
多くのpol IIIプロモーターは、内在性である(すなわち転写単位内に存在する)。従って、これらのpol III転写物はプロモーター配列を含む。SEGS分子の発現に有用であるために、これらのプロモーター配列は、SEGSの構造または機能を妨げるべきではない。SEGS分子はtRNA分子に由来するので、tRNA遺伝子プロモーター配列は、容易にSEGS分子に組み込まれ得る。内在性のtRNA遺伝子プロモーターは、2つの部分すなわちAボックスおよびBボックスに存在する。tRNA分子において、Aボックス配列は、一般にtRNA分子のDループおよびDステムの半分に存在し、そしてBボックス配列は、一般にTループおよびTステム中の近位のヌクレオチドに存在する。SEGS分子は、これらの構造のほとんどを欠く。しかし、BボックスおよびAボックス配列の両方が、AボックスとBボックスとの間の適切な間隔が維持されるように、T認識アームの後ろで、SEGSの5'末端に付加され得る。
U6遺伝子プロモーターは、内在性ではない(KunkelおよびPederson,Nucleic Acids Res.18:7371-7379(1989);Kunkelら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8575-8579(1987);Reddyら、J.Biol.Chem.262:75-81(1987))。SEGS分子の発現に有用な適切なpol IIIプロモーター系は、Hallら、Cell 29:3-5(1982)、Nielsenら、Nucleic Acids Res. 21:3631-3636(1993)、FowlkesおよびShenk,Cell 22:405-413(1980)、GuptaおよびReddy,Nucleic Acids Res.19:2073-2075(1990)、Kickoeferら、J.Biol.Chem.268:7868-7873(1993)、ならびにRomeroおよびBalckburn,Cell 67:343-353(1991)により記載される。リボザイムの発現のためのpol IIIプロモーターの使用はまた、Ribozyme Pharmaceuticals,Inc.によるWO 95/23225に記載される。
IV.治療
A.薬学的組成物
SEGS分子は、患者を処置するのに適切な薬学的組成物を形成するために、薬学的に受容可能なキャリアと直接組み合わせて使用され得る。あるいは、SEGSは、特定のRNAに特異的なSEGS分子をコードし、そして発現する配列を含むベクターを介して送達され得る。
直接送達は、通常、脂質複合体(リポソーム)の援助を伴って、細胞膜と他の分子(例えば、抗体または他の小さなリガンド(例えば、ヘムもしくは別のプリフィリンまたはフタロシアニン))との交差を容易にして、標的化を最大にするために、標的細胞内に予め合成したSEGS分子を挿入することを包含する。ポルフィリンはオリゴヌクレオチドと複合体を形成する。これは肝細胞のような細胞への送達を促進ならびに亢進する。RNAは分解に対して感受性であるため、多くの場合、直接送達したSEGS分子を、上記のように化学的に修飾して、ヌクレアーゼ耐性にし得る。この送達方法論は、治療用量のより正確なモニタリングを可能にする。
ベクター介在送達は、ベクター上に保有した配列中にコードされた大量のSEGSを産生する、自己複製系または非複製系(例えば、修飾されたウイルスベクターまたはプラスミド)を有する標的細胞の感染を包含する。細胞の標的化および侵入のメカニズムは、ウイルスによって提供され得るか、または、プラスミドが使用される場合、SEGS分子の直接送達について記載された方法に類似の方法を使用し得る。ベクター介在送達は、SEGS分子の維持量を産生する。それは、実質的に安価で、そして直接送達(例えば、SEGS分子の静脈内注射)ほど頻繁な投与を必要としない。
直接送達法は、感染の急性かつ重篤な時期の期間に使用され得る。好ましくは、静脈内注射または皮下注射が使用され、SEGS分子を直接送達する。オリゴヌクレオチドの有効量が、意図する標的部位に到達する前のオリゴヌクレオチドの分解を最小限にする形態で送達されることが必須である。
最も好ましくは、薬学的キャリアは、SEGSを、冒された細胞へ特異的に送達する。例えば、B型肝炎ウイルスは肝細胞に作用し、従って、好適な薬学的キャリアは、抗肝炎SEGS分子を肝細胞に送達する。
肝臓の持続性の非細胞変性性感染を引き起こす小さなDNAを含有するウイルス群のメンバーであるHBVは、世界中に見出され、そして慢性キャリアの多数の保有宿主のヒトの間で永続されるヒトの感染性病原体である。地球上の人口の約6〜7%が感染している(3億人のキャリア)と見積もられている。感染の普及率は、世界中で均一ではない。HBVの分布における地理的な勾配が存在する。これは、北アメリカおよび西ヨーロッパで最も低く(ここでこのウイルスは、人口の0.1〜0.5%に検出され得る)、そして、東南アジアおよびサハラ以南のアフリカで最も高い(ここで感染頻度は、人口の5〜20%に変化し得る)。この歪んだ分布は、肝細胞癌腫の分布と平行し、そして慢性のHBV感染とこのタイプの悪性腫瘍との間の関連についての強力な疫学的証拠を提供する。
B型肝炎は、おそらく、ヒトにおける肝細胞癌腫を含む慢性肝疾患の最も一般的な原因であるため、医学的に非常に重要である。感染した肝細胞はウイルス粒子を継続的に分泌し、このウイルス粒子は血液中に高レベルで蓄積する。これらの粒子には、2つのタイプがある:(i)過剰なウイルスコートタンパク質(HBsAg)からなり、かつ核酸を含有しない非感染性粒子(血液1mlあたり1013粒子までの濃度)、および(ii)主要ウイルスコートタンパク質、炭水化物、および脂質を含むエンベロープがその周りに集合した27nmのヌクレオキャプシドコア(HBcAg)からなり、低い濃度で存在する(血液1mlあたり109粒子)感染性のDNA含有粒子(デーン粒子)。ヒトB型肝炎ウイルスは、ヘパドナウイルス科のメンバーであり、ウッドチャック肝炎ウイルス(WHV)、カモ肝炎ウイルス(DHV)、およびハタリス肝炎ウイルス(GHV)を含む近縁種を有する(Robinson(1990))。レトロウイルスのように、ヘパドナウイルスはその3.2kbのDNAゲノムの逆転写を利用する(Pugh(1990))。B型肝炎ウイルスのゲノムは、環状かつ部分的に1本鎖であり、不完全なプラス鎖を含有する。不完全なプラス鎖は、ビリオン中でDNAポリメラーゼと複合体化する。DNAポリメラーゼは完全なマイナス鎖をテンプレートとして用いてプラス鎖を伸長することが示されている。これらの形態学的および構造的特性は、B型肝炎ウイルスと全ての既知のクラスのDNA含有ウイルスとを区別する。
B型肝炎ウイルスの複製サイクルはまた、他のDNA含有ウイルスとは著しく異なり、そしてRNA含有レトロウイルスとの近い関係を示唆する。主な珍しい特性は、DNAゲノムの複製において中間体としてゲノムのRNAコピーを用いることである。感染しているDNAゲノムは、2本鎖形態に変換され、これは、RNAの転写のテンプレートとして働く。多数のRNA転写物が、各々の感染ゲノムから合成され、メッセンジャー機能またはDNA複製機能のいずれかを有する。後者は、「プレゲノム」と呼ばれ、子孫のDNAゲノムの前駆体である。なぜならば、それらはヌクレオキャプシドコア中に集められ、そしてコーティングおよび細胞からの輸送の前にDNAに逆転写されるからである。従って、各々の成熟ビリオンは、RNAプレゲノムのDNAコピーおよびDNAポリメラーゼを含む。
合成されるべき最初のDNAは、マイナス鎖の極性のDNAであり、そしてウイルス遺伝地図上の独特の部位で始まる。非常に小さな発生期のDNAマイナス鎖(30ヌクレオチド未満)は、タンパク質に共有結合し、そしてマイナス鎖DNA合成のためのプライマーとして作用するようである。マイナス鎖DNAの成長は、産物が、RNA:DNAハイブリッドよりもむしろ完全長1本鎖DNAであるように、プレゲノムの同等の分解を伴う。プラス鎖DNA合成は、マイナス鎖の完了後にのみ観察されており、そしてマイナス鎖の5'末端の近くの独特の部位で始まる。プラス鎖の完全な伸長は、ヌクレオキャプシドコアのコーティングおよび輸送のための必要条件ではない。従ってほとんどの細胞外ビリオンは、そのゲノム中に不完全なプラス鎖および大きな1本鎖ギャップを含む。肝炎ウイルスゲノムは自律性であり、そしてその複製のためにDNAからDNAへの経路を利用しないので、そのゲノムの継続的な細胞内複製はウイルスの維持に不可欠である。
ウイルスエンベロープを形成するB型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)は、ウイルスのプレS1、プレS2、およびS遺伝子によりコードされるポリペプチドである。主要なタンパク質は、2.1kbサブゲノムメッセージ由来の226アミノ酸のS遺伝子産物である。以下の実施例において示されるように、HBV核酸を標的化し、そして複製を阻害する(これは、減少したウイルス負荷を導く)SEGSが設計される。
B.SEGS分子の送達
2つの送達方法が使用され得、(1)合成SEGS分子の送達、または(2)一過性の様式でSEGS分子を発現するベクターの送達である。選択の方法は、標準的な方法論を用いて前臨床試験において決定され、そしてそれらは、組み合わせて使用し得ることが可能である。それらの両方は、例えば、陽イオンリポソーム調製物を用いることにより、有効に送達され得る。
種々の非ベクター法は、SEGS分子を細胞に送達するのに利用することができる。例えば、一般に、SEGS分子、またはSEGS分子をコードするDNA配列は、マイクロパーティクル内またはマイクロパーティクル上に組み込まれ得る。本明細書中で使用されるように、マイクロパーティクルは、リポソーム、ビロソーム、マイクロスフェア、およびマイクロカプセルを含み、合成および/または天然のポリマーから形成される。マイクロカプセルおよびマイクロスフェアを作製する方法は、当業者において公知であり、そして溶媒蒸発、溶媒キャスティング、スプレー乾燥、および溶媒伸長(solvent extention)が挙げられる。種々のマイクロパーティクル内に組み込まれ得る有効なポリマーの例としては、ポリサッカライド、ポリ無水物、ポリオルソエステル、ポリヒドロキシド、ならびにタンパク質およびペプチドが挙げられる。
リポソームは、標準的な方法(例えば、Kimら、Biochim.Biophys.Acta、728:339-348(1983);Liuら、Biochim,Biophys.Acta.、1104:95-101(1992);およびLeeら、Biochim.Biophys.Acta.、1103:185-197(1992);Wangら、Biochem.、28:9508-9514(1989))によって産生され得、これらは、本明細書中で参考として援用される。SEGS分子またはこのような分子をコードするDNAは、マイクロパーティクルの調製の間にこの分子が存在する場合、リポソーム内でカプセル化され得る。簡単に述べれば、有機溶媒に溶解した選択の脂質は、混合されそしてガラス管の底で減圧下で乾燥される。この脂質フィルムをカプセル化されるべきSEGS分子、SEGS分子をコードするDNAの水溶性緩衝化溶液を用いて再水和し、次いで、物質をカプセル化する得られた水和脂質小胞またはリポソームは、遠心分離によって洗浄され得、そして濾過され、そして4℃で保存され得る。この方法は、核酸分子をMOLT-3白血病細胞株の細胞の核および細胞質に送達するために使用されている(ThierryおよびDritschilo、Nucl.Acids Res.、20:5691-5698(1992))。あるいは、SEGS分子、またはこのような分子をコードするDNAは、マイクロパーティクル内に組み込まれ得るか、またはマイクロパーティクルの外側にイオン的または共有的のいずれかで結合され得る。
陽イオンリポソームまたはマイクロカプセルは、負電荷の化合物(例えば、これらのリポソームの正に荷電した外側の表面にイオン的に結合し得る核酸に基づく化合物)を送達するのに特に有効なマイクロパーティクルである。種々の陽イオンリポソームは、インビトロおよびインビボの両方において核酸または核酸−タンパク質複合体を細胞に送達する場合、非常に有効であることが示されており、Felgnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84:7413-7417(1987);Felgner、Advanced Drug Delivery Reviews、5:163-187(1990)Clarencら,Anti-Cancer Drug Design、8:81-94(1993)によって報告されている。陽イオンリポソームまたはマイクロカプセルは、混合物から形成されたリポソームまたはマイクロカプセルが、負電荷の化合物にイオン結合する正味の正電荷(net positive charge)を所有するように、十分な量の陽イオン側鎖基を有する1つ以上の脂質を含む混合物を用いて調製され得る。陽イオンリポソームを産生するために使用され得る正電荷の脂質の例としては、アミノリピッドジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(PE)(これは正に荷電した一級アミノ頭部(head group)を所有する);ホスファチジルコリン(PC)(これは一級アミンではない正に電荷した頭部を所有する);そしてN[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリエチルアンモニウム(「DOTMA」、Felgnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84:7413-7417(1987);Felgnerら、Nature、337:387-388(1989);Felgner、Advanced Drug Delivery Reviews、5:163-187(1990)を参照のこと)が挙げられる。
SEGS分子の送達のために好適なマイクロパーティクルの形態は、ヘム運搬マイクロパーティクルである。これらのマイクロパーティクルにおいて、ヘムは、マイクロパーティクルの外側表面にインターカレートするかまたは共有結合する。ヘム運搬マイクロパーティクルは、それらが、ヘム受容体を発現する細胞(例えば、肝細胞)により優先的に結合し、そして取り込まれるため、有効用量に必要な薬物または他の化合物の量を、著しく減らせるという点で利点を提供する。このような標的送達はまた、非標的送達法において比較的高い薬物濃度を用いることから生じ得る全身性の副作用を減少する。ヘム運搬マイクロパーティクルを形成するための好ましい脂質は、1,2-ジオレオイルオキシ-3-(トリメチルアンモニウム)プロパン(DOTAP)およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)である。ヘム運搬マイクロパーティクルの産生および使用は、InnovirによるPCT出願WO 95/27480に記載されている。
核酸はまた、哺乳動物内に静脈注射し得る陽イオンリポソームによってカプセル化され得るか、またはリポソーム上を被覆し得る。この系は、造血細胞が存在する内皮および骨髄を含む成体マウスの多くの組織の細胞内へDNAを導入するために使用されている(例えば、Zhuら、Science、261:209-211(1993)を参照のこと)。
SEGS分子またはこれらの分子をコードするDNAのいずれかを含むリポソームは、抗肝炎SEGS分子の標的細胞への送達に有効な量で、例えば、静脈内投与または腹膜内投与によって全身に投与され得る。適切なマイクロパーティクルと共同で使用される場合、他の可能な経路は、経皮または経口を含む。一般に、個体に投与されるリポソーム結合核酸の総量は、同一の所望の効果または意図する効果のために投与されなければならない結合しない核酸の総量より少ない。
別の有用な送達系は、SEGSの陽イオン性ポルフィリンとの複合体である。これは、注入後、SEGSを保護し、ならびにSEGSを肝細胞へ標的化する。2つの主要な成分が正味全体で陰性電荷を有するポルフィリンおよび送達されるべきSEGS(これは、正味全体で陰性電荷を有する)であるので、この系は、極めて単純である。ポルフィリンは、送達されるべきSEGSを結合し、そして優先的にポルフィリンを結合する細胞に化合物を選択的に標的化する。
種々のポリマー(例えば、ポリ乳酸とポリグリコール酸とのコポリマー、ポリエチレン、およびポリオルソエステルならびに抗肝炎SEGS分子、またはこのような分子をコードするDNA)を含む組成物は、カテーテルまたはシリンジを用いることによって、適切な細胞に局所的に送達され得る。このような組成物を細胞に局所的に送達する他の手段は、注入ポンプ(例えば、Alza Corporation、Palo Alto、Carifornia)を用いることか、またはポリマーインプラント内へ組成物を組み込むこと(例えば、JohnsonおよびLloyd-Jones編、Drug Delivery Systems(Chichester、England:Ellis Horwood Ltd.、1987を参照のこと)を包含し、これは、治療用抗肝炎SEGS組成物のインプラントの隣接領域への徐放を引き起こし得る。
SEGSはまた、例えば、乾癬または眼疾患の処置のために、適切な局所的なキャリア(例えば、軟膏剤、軟膏、緩衝化生理食塩水、または他の薬学的に受容可能な局所的もしくは眼用キャリア)で局所的に適用され得る。
以下の実施例は、例示的目的およびさらなるガイダンスのために示す。
実施例
実施例1:SEGS分子の構築および分析のためのオリゴヌクレオチド合成、プラスミドおよび転写反応
オリゴヌクレオチド:5'-ジメトキシトリチル-2'-メチルシリル-リボヌクレオシド3'-CE-ホスホルアミデート(Biosearch,MA、またはChemGenes Corp.、MA)を用いて、オリゴリボヌクレオチド(RNA)を、Ogilvieら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、85:5764-5768(1988)の方法に従って調製した。2'-O-メチルオリゴリボヌクレオチド(2'-O-メチルRNA)を、BioseachまたはGlen ReseachのいずれかのRNA合成プロトコルを用いて合成し、そしてBioseachまたはGlen Reseachのいずれかからアミダイト(amidite)を購入した。Millipore 8909 Experdite DNA/RNAシンセサイザーで合成を行った。制御されたポアガラス(controlled pore glass)(CPG)を固体支持マトリックスとして使用した。カップリング時間は約13分間であった。チオリン酸結合を有するアナログの合成のため、酸化の代わりに硫化を行い、これは、Beaucage試薬を用いて10〜15分間実行した。平均カップリング収率は、トリチル測定によってアッセイして、96%〜98%であった。
支持体からの切断、塩基およびリン酸脱保護(deprotection)、および2'-O-TBDMS基の除去を、Scaringeら、Nucleic Acid Reseach、18:5433-5441(1990)による記載のように実行した。TBAF溶液中の粗オリゴヌクレオチドを、15〜20%のポリアクリルアミド/7M尿素ゲルを用いる標準的な電気泳動精製の前に、Sephadex G-25カラムで脱塩した。産物のバンドをUV-シャドーイングによって視覚化し、切り出し、そしてゲルマトリックスから溶出させた。溶出したオリゴマーを、C18 Sep-Pakカートリッジで最終的に脱塩し、そしてOD260測定により定量した。精製したアナログの均質性を、5'末端標識または分析HPLCによって確認した。それらは、SeelaおよびKaiser、Nucleic Acids Reseach.、15:3113-3129(1987)によって記載された塩基組成分析によりさらに特徴付けし、チオエート結合の含量を31P-NMRによって定量した。3'末端の末端修飾をアミノ基を含む修飾したCPG支持体から合成を開始することにより作製した。
RNAse P切断アッセイ:切断反応は、一般に、Yuanら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:8006-8010(1992)(これらは、本明細書中で参考として援用される)により記載の手順に従って実施した。簡単に説明すると、200nM〜400nMのSEGS濃度および20nM未満の標的分子濃度を伴う、50mM Tris-HCl pH7.4、10mM MgCl2、25mM KCl、0.1mM EDTAをを含む全量31μl中で短い基質反応を行った。反応物を37℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、反応溶液をローディング緩衝液(98%ホルムアミド、10mM EDTA、0.025%ブロモフェノールブルー)と混合した。切断した基質を、7Mの尿素を含む15%アクリルアミドゲル上で電気泳動によって非切断物(uncleaved)から分離した。バンドを、Molecular Dynamics Phosphorimagerで定量した。
前駆体のRNA基質および得られた2つの切断産物に相当するバンドを、Betascopeゲルアナライザー(Betagen)を用いて乾燥ゲルから計測した。
本質的にBartkiewiczら、Genes Dev. 3:488-499(1989)(これは、本明細書中で参考として援用される)に記載のDEAE Sepharoseクロマトグラフィーおよびグリセロール密度勾配遠心分離によってRNAse Pを精製した。
より長い標的RNA分子で切断を試験するために、異なる反応条件を用いた。反応物は、全量10μl中に、40mM Tris HCl(pH7.4)、10mM MgCl2、1mMスペルミジン、10mMジチオスレイトール、0.05μg/μlのヌクレアーゼを含まないウシ血清アルブミン、0.01%(v/v)Triton-X100、0.8Units/μl RNASIN、0.2mM ATP、0.2mM GTP、0.2mM UTP、0.2mM CTP、0.1μCi/μl[a32P]CTP、2mM m7G(5')pppG、0.06μg/μl酵母RNA、25mM KCl、3Units T7 RNAポリメラーゼ、250nM SEGS、1μlのヒトRNAse P、および3ng/μl直鎖化プラスミドを含有した。直鎖化プラスミドを添加することにより反応を開始し、そして37℃で30分間インキュベートした。10μlの80%ホルムアミド、10mM EDTA、0.1%ブロモフェノールブルーの添加により反応を終結した。90℃で2分間加熱後、サンプルを、5%変性ポリアクリルアミドゲル上、48ワットで2時間電気泳動した。60℃で1時間の減圧乾燥後、ゲルをホスホイメージング(phosphoimaging)によって分析した。
いずれかのアッセイで残存する前駆体RNA基質の割合を、SEGS濃度の関数としてプロットし、そして触媒効率をkcat/Km(ここで、kcatは、切断の速度定数であり、そしてKmは、ミカエリス定数である)として表した。これは遊離のSEGSと基質との反応に対する二次反応定数である。以下のHeidenreichおよびEcksteinの方法(J.Biol.Chem.、267:1904-1909(1992)、切断反応の効率(kcat/Km))を、以下の式を用いて決定した
-ln F/t=(kcat/Km)[C]
ここでFは、残存したRNA基質の割合、tは反応時間、そして[C]はSEGS濃度である。
仔ウシ胎児血清安定性アッセイ:修飾したSEGS分子のヌクレアーゼ耐性を、仔ウシ胎児血清(FCS)アッセイにおいて試験した。熱で不活化した場合、10%FCSは、むしろヒト血清を模倣することがShawら、Nucleic Acids Res. 19:747-750(1991)によって報告された。アッセイの条件は、Hokeら、Nucleic Acids Res. 19:5743-5748(1991)によって先に記載のアッセイ条件に極めて類似した。簡単に述べれば、試験すべきSEGSアナログは、T4ポリヌクレオチドキナーゼおよび[γ-35S]ATPを用いて標識した5'末端である(この手順は、脱リン酸化に対して耐性である放射性標識したオリゴヌクレオチドを生成し得る)。次いで、標識SEGSをフェノール/クロロホルム抽出によって精製し、その後Sephadex G-25スピンカラム濾過した。精製したSEGSを冷SEGSおよび10%熱不活化仔ウシ胎児血清(FCS)と混合し、最終SEGS濃度を約5μMとした。SEGSアナログを24時間処理した。アリコートを異なる時点で反応混合物より取り出し、2×ローディング染料と混合し、90℃で3分間熱不活化し、次いで-20℃で保存した。その結果得られたものを12%ポリアクリルアミド/7M尿素ゲル上で分析した。
実施例2:RNAse P切断の促進におけるSEGS分子の活性
tRNAに基づいてモデリングされたSEGS構築物:SEGS、およびtRNA配列に基づいてモデリングされた種々の配列および構造を有するモデル標的RNA分子の活性を試験した。実施例1に記載のとおり、活性を、1時間に切断された基質の割合として測定した。T認識アームに吊り下げられたTループ配列を有するSEGS(SEGS3;配列番号1;図2を参照)と、吊り下げられた配列を全く有さないSEGS(SEGS7;配列番号1のヌクレオチド4〜15;図5を参照)との間の比較を行なった。これは、一部、UNRモチーフ以外のTループ配列が、SEGSにおけるRNAse P媒介切断の促進に影響するかどうかを試験するために行なわれた。使用したSEGS分子を図5に示す。15ヌクレオチドのSEGSは、吊り下げられたTループ配列を有するが、12ヌクレオチドのSEGSは有さない。モデル基質(T10、図2および5にもまた示される)の切断の促進におけるこれら2つのSEGSの活性を、表1における列1および2に挙げる。吊り下げられたヌクレオチドが切断活性に対して有意な効果を何ら有さないことは明らかである。表1の第1欄は、ターン領域の配列、およびこれらの例の場合には、5または6個のアデニンヌクレオチドから作製された短いテイル配列を示す。これは、6個のアデニンヌクレオチドを有する標的については(A)で、5個のアデニンヌクレオチドを有する標的については(A)*で示す。
SEGS活性に対するターン領域および切断部位における配列の効果:ターン領域の配列のみが異なる種々のモデル標的RNA分子を設計した。基質は、ターン領域(配列番号2のヌクレオチド33〜36)を除いて、標的RNA T 10(配列番号2)と同一のヌクレオチド配列を有する。各基質のターン領域の配列を、表1に挙げた。EGS3(配列番号1)またはEGS7(配列番号1のヌクレオチド4〜15)を使用して活性をアッセイした。50nM標的RNA、400nM SEGS、および3μl RNAse Pを用いて、上記の様にアッセイを行なった。これらのSEGSの活性を、表1の列2〜7および列9〜18に示す。ほとんどすべての変形体が、有意な程度まで活発に切断される。これらの例において、特定の配列が他の配列より有利でない。例えば、GAAAおよびAUCU。これらの結果は、SEGSが、第2標的領域の3'側に広範な配列を有する標的配列について設計され得ることを確証する。
SEGS EGA 3のA認識アームの3'末端のヌクレオチド(これは、切断部位に隣接する塩基対に関与する)を、シチジンヌクレオチドからグアニンヌクレオチドに変化させた。標的RNA配列を対応させて変化させた。得られたSEGS(EGS 6)の活性を表1の列8に示す。この活性(45%切断)は、シチジンヌクレオチドを有するSEGS(表1の列2)より低いが、なお有意である。このことは、A認識アームの3'末端のシチジンヌクレオチドが好ましいが、必須ではないことを示す。変形のターン領域および3'末端の配列は、SEGSの活性に影響したが、すべて測定可能で有用な活性を有した。
SEGS活性に対する化学的修飾体の効果:2'-O-メチルオリゴリボヌクレオチドは、修飾するための論理的な選択としていくつかの好ましい特徴を有する。これらのアナログの合成は、DNA合成のものと非常に似ている。これらは、DNAアナログより、RNA標的に対してはるかに良好な結合アフィニティーを有し、得られる二重鎖は、RNA-RNA二重鎖の構造(A形態)とDNA-DBA二重鎖の構造(B形態)との間の構造を有する。さらに、これらは、RNA特異的ヌクレアーゼまたはDNA特異的ヌクレアーゼのいずれかによる分解にかなり抵抗性であることがわかる。2'-O-メチル-オリゴリボヌクレオチドSEGSをEGS 7(配列番号1のヌクレオチド4〜15)に基づいてモデリングした。2つの基質を有するこの化学的に修飾されたSEGSの活性を、表1の列19および20に示す。これらの活性は、非修飾のSEGSで得られた活性より低い(表1の列1および3と比較)が、なお有意である。このことは、SEGSは、そのヌクレオチドのすべてが化学的に修飾され得、そして有意な活性をなお維持し得ることを示す。
SEGSの活性に対する認識アームおよび突出領域の長さの効果:認識アームおよび突出領域の長さの効果を評価するために、これらの領域に関して異なる長さの組合せを有する、種々のSEGSおよびモデル標的RNAを構築した。基質を、標的RNA T 10を基にモデリングした。SEGS分子を、EGS 7を基にモデリングした。33nM標的RNA、333nM SEGS、および3μl RNAse Pを用いて上記のようにアッセイを実行した。試験した長さの組合せ、および観察した活性を表2に示す。変化させた出発の長さは、7塩基対のAステム、5塩基対のTステム、および9ヌクレオチドの突出領域であった。この組合せは高い活性を有する(表2の列1を参照)。
表2の列の第1群(列1〜4)は、7、8、9、および10塩基対のAステム長での結果を示す。すべてが活性であるが、A認識アームに10ヌクレオチドを有するSEGSは活性が弱い。このことは、7、8、または9ヌクレオチドのA認識アームが好ましいことを示す。表2の第2群の列(列5〜7)は、6および7塩基対のTステム長での結果を示す。列7は8塩基対のAステムと6塩基対のTステムとを組合せる。すべてが活性であるが、T認識アームに7ヌクレオチドを有するSEGSは活性が弱い。このことは、5または6ヌクレオチドのT認識アームが好ましいことを示す。表2の第3の群(列8〜11)は、7〜15ヌクレオチドの突出領域長での結果を示す。これらの構築物のすべてが高度に活性である。このことは、突出領域の長さが、SEGS活性の重要な決定要素ではないことを示す。まとめると、これらの結果は、7ヌクレオチドのA認識アームおよび5ヌクレオチドのT認識アームが最も好ましいことを示す。これらの変化はSEGSの活性に影響するが、ほとんどの変化は、効果をほとんど有さず、そしてすべてのSEGSは測定可能で有用な活性を有した。
SEGS活性とRNAse P基質の活性との比較:SEGS/標的RNA複合体と同様な構造を形成する最小RNAse P基質の切断活性を、SEGS分子の活性と比較した。RNAse P基質は、RNAse P切断部位およびガイド配列の両方を含む単一のヌクレオチド分子である。SEGS/標的RNA複合体とは異なり、RNAse P基質はインタクトなTループを有する。図12および13は、最小RNAse P基質およびSEGS/標的RNA複合体をそれぞれ示す。両方とも、+RNATyrの配列に基づいてモデリングした。実施例1に記載のようなRNAse P活性アッセイにおいて、RNAse P基質は1時間に99%切断され、そしてSEGSは標的RNAの95%の切断を促進した。
RNAse P基質およびSEGS/標的RNA対もまたHBV配列を基にモデリングした。図3および6は、このようなSEGS/標的RNA対およびRNAse P基質の例をそれぞれ示す。実施例1に記載のようなRNAse P活性アッセイにおいて、RNAse P基質は1時間に80%切断され、そしてSEGSは標的RNAの65%の切断を促進した。これらの結果は、任意の配列を基にモデリングしたSEGSの場合でさえ、SEGS/標的RNA複合体が、Tループを含むRNA P基質に存在する活性の重要な画分を保持することを示す。
実施例3:HBsAg RNAのRNAse P切断を促進するSEGS分子の構築および活性
HBsAgをコードするRNAにおいてRNAse Pによる切断を促進するようSEGS分子を設計した。標的の存在下、SEGS分子は、RNAse Pよる切断を誘発するtRNAのAステムおよびTステムと同様な構造を形成した。
HBsAgに標的付けられたSEGS構築物:B型肝炎表面抗原(HBsAg)をコードするRNAの領域を標的するように、SEGS配列HBV B(配列番号6)、HBV C(配列番号8)、HBV F1(配列番号10)、HBV H(配列番号12)、およびHBV H1(配列番号14)を設計した。HBsAgをコードするRNA中のUNRモチーフの位置を同定することによって、前述のように領域を選択した。図7に示されるように、SEGS HBV Bの一方の認識アームの配列(A認識アーム;配列番号6のヌクレオチド6〜13)は、HBsAgをコードする配列(配列番号7のヌクレオチド13〜20;2.1kb HBV転写物のヌクレオチド387〜394)中の8ヌクレオチドと相補的である。SEGS HBV Bの他方の認識アームの配列(T認識アーム;配列番号6のヌクレオチド1〜5)は、HBsAgをコードする配列(配列番号7のヌクレオチド30〜34;2.1kb HBV転写物のヌクレオチド404〜408)中の5ヌクレオチドと相補的である。従って、標的配列は、9個の対になっていないヌクレオチド(突出領域)によって分離された、SEGSの2つの認識アームと相補的な2つの領域(第1および第2の標的領域)を含む。
2'-O-メチル含有SEGS分子:2'-O-メチルヌクレオチドを含む、HBVを標的するSEGS分子を調製した。ヌクレオチド試薬が2'-O-メチル基を含んでいたことを除いて、前述のように、自動オリゴヌクレオチド合成装置において、これらのオリゴヌクレオチドを調製した。平均カップリング収率は、トリチル測定によってアッセイした場合、96〜98%の範囲であった。脱保護の終了の際、完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを、変性ゲル電気泳動によって精製し、そしてその純度を5'末端標識、分析HPLC、塩基組成分析、および31P-NMRによって評価した。
SEGSにより促進される大きな標的RNAの切断:HBV RNA配列に特異的なSEGSを、実施例1に記載されたRNAse P切断アッセイを使用してアッセイして、切断反応の効率を決定した。このためには、HBVのAYW株の2.1kb RNAをコードする配列を含むプラスミドpAYW2.1を、NotIでの消化により直線化し、次いで[α32P]CTPの存在下で、T7 RNAポリメラーゼにより転写させた。標識した転写物を、種々のSEGS分子の存在下でRNAse Pとともに37℃にて30分間インキュベートした。反応産物を変性ポリアクリルアミド電気泳動にかけ、そして蛍光画像化(phosphoimaging)により分析した。上記のHBV RNAに特異的なSEGSのそれぞれが、ゲル画像上の視認可能な切断バンドを生じた。これは、大きな天然の標的RNA分子中の任意の標的配列に対して設計されたSEGSが、機能的であることを示す。
実施例4:短い外部ガイド配列のインビボ効力
この実施例は、インビボで投与される場合、短い外部ガイド配列が機能的であり、標的RNAのマーカーに対して有意な測定可能な効果を有することを実証する。SEGS HBV Bをこの研究に使用した。このSEGSは、精製したRNase Pの存在下で、HBV HBsAg mRNAの切断を誘導した(実施例3を参照)。
インビボ投与のために、SEGS HBV Bを単独(遊離)で使用したか、またはポルフィリンとイオン的に複合体化した。具体的には、SEGSをテトラメソ(n-メチル4-ピリジル)ポルフィン(TMP)またはメソテトラ(トリメチルアニリニウム)ポルフィン(TMAまたはアニリニウム)のいずれかと複合体化した。
複合体化したEGSまたは遊離EGSを、完全に組み立てられたHBVウイルス粒子を発現するトランスジェニックマウス(Guidottiら、J.Virol. 69:6158-6169(1995))に注射した。これらのマウスは、肝臓においてHBVの複製を支持し、ウイルス複製のすべてのマーカーを産生する。5mg/Kg体重のSEGS HBV Bを、マウスの尾静脈を介して、5日間毎日注射した。6日めに動物を屠殺し、そして以下のウイルス複製マーカーを分析した。
A.動物の血液中に存在するHBVビリオンにおけるDNAのレベルを、標準的なドットブロット分析(Guidottiら)によって決定した。血液中のウイルスDNAのレベルは、ウイルス価の直接的な指標である。
B.肝臓中のウイルスDNAを、標準的なサザンブロット分析によって決定した。これは、肝臓におけるウイルスの複製の直接的な指標である。
C.肝臓組織切片中のウイルスコア粒子のレベルを、免疫細胞化学によって決定した。HBV RNAの逆転写(これは、ウイルスの複製プロセスの不可欠の部分である)は、コア粒子において生じる。従って、コア粒子の減少は、ウイルス複製の増加の別の指標である。
D.薬物の投与に起因する毒性の可能性を排除するために、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)を測定した。肝臓障害は血清ALTレベルの上昇を引き起こす。
これらの測定の結果(表3)は、SEGS分子が確かに、血液中のウイルスDNA、ウイルスDNA複製中間体、および肝臓中のコア粒子の減少によって理解される、インビボでのHBV複製を減少させることにおける効果を有することを示す。特に、HBVマーカーは、SEGSがポルフィリンキャリアと複合体化されているかどうかにかかわらず、減少したことに注目。このことは、SEGSのインビボ活性は、特定のまたは特殊化された投与形態を必要としないことを示す。血清ALTが、全ての処置で安定なままであり、有意な肝臓障害はSEGSの投与によって引き起こさないことにも注目。TMP単独を5mg/Kg体重にて10日間、同様なマウスへ尾静脈を介して投与しても、HBV複製に対して何らの効果も有さなかったことが以前に示された。このことによって、観察された抗ウイルス効果がTMPに起因しないことが確認された。
配列表
(1)一般的情報:
(i)出願人:イノーバー ラボラトリーズ,インコーポレイティッド
(ii)発明の名称:短い外部ガイド配列
(iii)配列数:15
(iv)連絡住所:
(A)名称:パトレア エル.パブスト
(B)番地:ワン アトランティック センター 2800
ウエスト ピーチツリー ストリート 1201
(C)市:アトランタ
(D)州:ジョージア
(E)国:アメリカ合衆国
(F)郵便番号:30309-3450
(v)コンピューター読み出し形態:
(A)媒体型:フロッピー ディスク
(B)コンピューター:IBM PC 互換用
(C)OS:PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア:パテントイン リリース #1.0,バージョン #1.25
(vi)現在の出願データ:
(A)出願番号:
(B)出願日:
(C)分類:
(vii)先願データ:
(A)出願番号:08/615,961
(B)出願日:1996年3月14日
(C)分類:
(viii)代理人/事務所情報:
(A)氏名:パブスト,パトレア エル.
(B)登録番号:31,284
(C)照会/記録番号:ILI115
(ix)電話回線情報:
(A)電話:(404)873-8794
(B)テレファックス:(404)873-8795
(2)配列番号1の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:15塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:RNA
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(iv)アンチセンス:NO
(xi)配列:配列番号1:
(2)配列番号2の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:43塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:RNA
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(iv)アンチセンス:NO
(xi)配列:配列番号2:
(2)配列番号3の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:15塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:RNA
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(iv)アンチセンス:NO
(xi)配列:配列番号3:
(2)配列番号4の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:43塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:RNA
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(iv)アンチセンス:NO
(xi)配列:配列番号4:
(2)配列番号5の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:51塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:RNA
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(iv)アンチセンス:NO
(xi)配列:配列番号5:
(2)配列番号6の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:13塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:RNA
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(iv)アンチセンス:NO
(xi)配列:配列番号6:
(2)配列番号7の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:50塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:RNA
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(iv)アンチセンス:NO
(xi)配列:配列番号7:
(2)配列番号8の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:13塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:RNA
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(iv)アンチセンス:NO
(xi)配列:配列番号8:
(2)配列番号9の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:56塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:RNA
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(iv)アンチセンス:NO
(xi)配列:配列番号9:
(2)配列番号10の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:13塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:RNA
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(iv)アンチセンス:NO
(xi)配列:配列番号10:
(2)配列番号11の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:46塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:RNA
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(iv)アンチセンス:NO
(xi)配列:配列番号11:
(2)配列番号12の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:13塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:RNA
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(iv)アンチセンス:NO
(xi)配列:配列番号12:
(2)配列番号13の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:48塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:RNA
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(iv)アンチセンス:NO
(xi)配列:配列番号13:
(2)配列番号14の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:13塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:RNA
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(iv)アンチセンス:NO
(xi)配列:配列番号14:
(2)配列番号15の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:51塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:RNA
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(iv)アンチセンス:NO
(xi)配列:配列番号15:
Claims (28)
- 標的ウイルスRNA分子中の標的化された配列の領域に相補的な認識配列を含むオリゴヌクレオチド分子であって、
ここで該認識配列は、A認識アームおよびT認識アームを含み、そして該標的化された配列は、5'から3'の順に、第1標的領域、突出領域、および第2標的領域を含み、
ここで、該A認識アームは、該第1標的領域に相補的でありかつ7〜9ヌクレオチド長であり、該T認識アームは、該第2標的領域に相補的でありかつ5〜7ヌクレオチド長であり、そして該T認識アームは、該オリゴヌクレオチド中で該A認識アームの5'側に位置しており、そして該標的RNA分子に結合される場合、該A認識アームおよび該第1の標的配列は、該オリゴヌクレオチド−標的RNA構造中のtRNAのAステムと類似する構造を形成し、該T認識アームおよび該第2の標的配列は、該オリゴヌクレオチド−標的RNA構造中のtRNAのTステムと類似する構造を形成し、そして該標的化された配列がターン領域をさらに含み、ここで該ターン領域が、NUNRの配列を有し、ここでNは任意のヌクレオチドであり、Rは任意のプリンヌクレオチドであり、そしてUはウリジンヌクレオチドであり、
ここで、該オリゴヌクレオチドは、該標的RNA分子の真核生物RNAse P媒介切断を促進する、オリゴヌクレオチド分子。 - 前記突出領域が1〜30ヌクレオチド長である、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド分子。
- 前記標的RNA分子がB型肝炎RNA分子である、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド分子。
- リボヌクレオチドの2'ヒドロキシル基の1つまたはそれ以上が、水素、O-アルキル基、O-アリル基、アミノ基、およびフッ素からなる群から選択される化学基と置換されている、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド分子。
- リン酸結合基の1つまたはそれ以上が、メチルホスホネートおよびホスホロチオエートからなる群から選択される結合基と置換されている、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド分子。
- 前記オリゴヌクレオチドの3'ヒドロキシルが、-OPO(O)OCH2CH(OH)-CH2NH2、-OPO(S)OCH2CH(OH)CH2NH2、および-3'-チミンヌクレオチドからなる群から選択される化学基と置換されている、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド分子。
- リガンドに結合するRNA配列をさらに含む請求項1に記載のオリゴヌクレオチド分子であって、ここで該オリゴヌクレオチドは、該リガンドに結合されたときにのみ、RNAse Pにより、前記標的RNA分子の切断を促進する、オリゴヌクレオチド分子。
- リガンドに結合するRNA配列をさらに含む請求項1に記載のオリゴヌクレオチド分子であって、ここで該オリゴヌクレオチドが、該リガンドに結合されないときにのみ、RNAse Pにより、前記標的RNA分子の切断を促進する、オリゴヌクレオチド分子。
- 標的RNA分子の切断を促進するための組成物であって、ここで該組成物は、薬学的に受容可能な送達系において請求項1に記載のオリゴヌクレオチド分子を含有する、組成物。
- 前記薬学的に受容可能な送達系が、リポソーム、ウイロソーム、マイクロスフェア、およびマイクロカプセルからなる群から選択される、請求項9に記載の組成物。
- 請求項1に記載のオリゴヌクレオチド分子を含む、ウイルスに感染した患者において標的ウイルスRNA分子を切断するための組成物であって、ここで該標的RNA分子および該オリゴヌクレオチドは、RNAse-P媒介切断を促進する条件下で接触させるのに適している、組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドは、患者または患者由来の細胞への投与に適しており、該オリゴヌクレオチドは、薬学的に受容可能な送達系の中にある、請求項11に記載の組成物。
- 前記薬学的に受容可能な送達系が、リポソーム、ウイロソーム、マイクロスフェア、およびマイクロカプセルからなる群から選択される、請求項12に記載の組成物。
- 前記ウイルスRNA分子が、B型肝炎RNA分子である、請求項12に記載の組成物。
- 患者においてウイルスを阻害する組成物であって、該組成物は、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド分子をコードする操作された発現ベクターを含む、組成物。
- 前記操作された発現ベクターが、薬学的に受容可能な送達系中にある、請求項15に記載の組成物。
- 前記薬学的に受容可能な送達系が、リポソーム、ウイロソーム、マイクロスフェア、およびマイクロカプセルからなる群から選択される、請求項16に記載の組成物。
- 前記薬学的に受容可能な送達系が、リポソームである、請求項17に記載の組成物。
- 前記ベクターが、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびエプスタインバールウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターである、請求項15に記載の組成物。
- 請求項1に記載のオリゴヌクレオチド分子をコードする操作された発現ベクター。
- B型肝炎RNA分子の切断を促進するための組成物であって、ここで該組成物は、薬学的に受容可能な送達系中に、請求項20に記載の操作された発現ベクターを含有する、組成物。
- 前記薬学的に受容可能な送達系が、リポソーム、ウイロソーム、マイクロスフェア、およびマイクロカプセルからなる群から選択される、請求項21に記載の組成物。
- 標的RNA分子を切断する生体外の方法であって、RNAse P媒介切断を促進する条件下で、RNAse P、該標的RNA分子、および請求項1に記載のオリゴヌクレオチド分子を接触させる工程を包含する、方法。
- ウイルスを阻害する生体外の方法であって、請求項1に記載のオリゴヌクレオチドをコードする操作された発現ベクターを、患者由来の細胞に投与する工程を包含する、方法。
- 前記ベクターが、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびエプスタインバールウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターである、請求項24に記載の方法。
- 標的RNA分子に結合しかつ該標的RNA分子のRNAse P媒介切断を促進するためのオリゴヌクレオチド分子であって、ここで該オリゴヌクレオチド分子は、標的RNA分子中の標的とされた配列の領域に相補的な認識配列を含み、該認識配列は、A認識アームおよびT認識アームを含み、そして該標的化された配列は、5'から3'の順に、第1標的領域、突出領域、および第2標的領域を含み、
ここで、該A認識アームは、該第1標的領域に相補的でありかつ7〜9ヌクレオチド長であり、該T認識アームは、該第2標的領域に相補的でありかつ5〜7ヌクレオチド長であり、そして該T認識アームは、該オリゴヌクレオチド中で該A認識アームの5'側に位置しており、そして該標的RNA分子に結合される場合、該A認識アームおよび該第1の標的配列は、tRNAのAステムと類似する構造を形成し、該T認識アームおよび該第2の標的配列は、tRNAのTステムと類似する構造を形成し、そして該標的化された配列がターン領域をさらに含み、ここで該ターン領域が、NUNRの配列を有し、ここでNは任意のヌクレオチドであり、Rは任意のプリンヌクレオチドであり、そしてUはウリジンヌクレオチドである、オリゴヌクレオチド分子。 - 標的RNA分子に結合しかつ該標的RNA分子の真核生物RNAse P媒介切断を促進するためのオリゴヌクレオチド分子を作製する方法であって、該方法は、
(a)標的RNA分子内の標的配列を選択する工程;
(b)標的RNA分子中の標的とされた配列の領域に相補的な認識配列を含むオリゴヌクレオチド分子を合成する工程であって、
ここで該認識配列は、A認識アームおよびT認識アームを含み、そして該標的化された配列は、5'から3'の順に、第1標的領域、突出領域、および第2標的領域を含み、
ここで、該A認識アームは、該第1標的領域に相補的でありかつ7〜9ヌクレオチド長であり、該T認識アームは、該第2標的領域に相補的でありかつ5〜7ヌクレオチド長であり、そして該T認識アームは、該オリゴヌクレオチド中で該A認識アームの5'側に位置しており、そして該標的RNA分子に結合される場合、該A認識アームおよび該第1の標的配列は、tRNAのAステムと類似する構造を形成し、該T認識アームおよび該第2の標的配列は、tRNAのTステムと類似する構造を形成し、そして該標的化された配列がターン領域をさらに含み、ここで該ターン領域が、NUNRの配列を有し、ここでNは任意のヌクレオチドであり、Rは任意のプリンヌクレオチドであり、そしてUはウリジンヌクレオチドである、オリゴヌクレオチド分子。 - 前記標的RNA分子は、ウイルスRNA分子である、請求項27に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US615,961 | 1984-05-31 | ||
US08/615,961 US5877162A (en) | 1996-03-14 | 1996-03-14 | Short external guide sequences |
PCT/US1997/003847 WO1997033991A1 (en) | 1996-03-14 | 1997-03-14 | Short external guide sequences |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2000506731A JP2000506731A (ja) | 2000-06-06 |
JP4062365B2 true JP4062365B2 (ja) | 2008-03-19 |
Family
ID=24467475
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP53278697A Expired - Fee Related JP4062365B2 (ja) | 1996-03-14 | 1997-03-14 | 短い外部ガイド配列 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5877162A (ja) |
EP (1) | EP0894129B1 (ja) |
JP (1) | JP4062365B2 (ja) |
AT (1) | ATE267866T1 (ja) |
AU (1) | AU2206197A (ja) |
DE (1) | DE69729292T2 (ja) |
DK (1) | DK0894129T3 (ja) |
ES (1) | ES2221955T3 (ja) |
WO (1) | WO1997033991A1 (ja) |
Families Citing this family (55)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002510319A (ja) * | 1997-07-01 | 2002-04-02 | アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド | オリゴヌクレオチドの消化管を介したデリバリーのための組成物及び方法 |
US20030165888A1 (en) * | 2001-07-18 | 2003-09-04 | Brown Bob D. | Oligonucleotide probes and primers comprising universal bases for diagnostic purposes |
US6518017B1 (en) * | 1997-10-02 | 2003-02-11 | Oasis Biosciences Incorporated | Combinatorial antisense library |
US6387703B1 (en) * | 1997-10-07 | 2002-05-14 | Smithkline Beecham Corporation | Method for modulating gene expression |
AU732321B2 (en) * | 1997-11-21 | 2001-04-12 | Yale University | Method for identifying and inhibiting functional nucleic acid molecules in cells |
US6013447A (en) * | 1997-11-21 | 2000-01-11 | Innovir Laboratories, Inc. | Random intracellular method for obtaining optimally active nucleic acid molecules |
US6248525B1 (en) | 1998-03-30 | 2001-06-19 | Yale University | Method for identifying essential or functional genes |
EP1469009A2 (en) * | 1998-05-21 | 2004-10-20 | Isis Parmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for non-parenteral delivery of oligonucleotides |
IL145586A0 (en) * | 1999-04-08 | 2002-06-30 | Oasis Biosciences Inc | Antisense oligonucleotides comprising universal and/or degenerate bases |
CA2378519C (en) | 1999-07-07 | 2011-01-25 | Zymogenetics, Inc. | Human cytokine receptor |
US6677445B1 (en) | 1999-08-27 | 2004-01-13 | Chiron Corporation | Chimeric antisense oligonucleotides and cell transfecting formulations thereof |
US8568766B2 (en) | 2000-08-24 | 2013-10-29 | Gattadahalli M. Anantharamaiah | Peptides and peptide mimetics to treat pathologies associated with eye disease |
WO2002030465A2 (en) | 2000-10-12 | 2002-04-18 | University Of Rochester | Compositions that inhibit proliferation of cancer cells |
EP1572168B1 (en) | 2002-02-06 | 2010-05-26 | Vicor Technologies, Inc. | Anti-infarction molecules |
EP1534729A2 (en) * | 2002-02-26 | 2005-06-01 | University of Utah Research Foundation | Variants of nedd4l associated with hypertension and viral budding |
EP2116604A1 (en) | 2002-08-05 | 2009-11-11 | University of Rochester | Protein transducing domain/deaminase chimeric proteins, related compounds, and uses thereof |
US8658377B2 (en) | 2002-11-15 | 2014-02-25 | Morehouse School Of Medicine | Detecting cancer with anti-CCL25 and anti-CCR9 antibodies |
US8512701B2 (en) | 2002-11-15 | 2013-08-20 | Morehouse School Of Medicine | Anti-CXCL13 and anti-CXCR5 antibodies for the prevention and treatment of cancer and cancer cell migration |
US9233120B2 (en) | 2002-11-15 | 2016-01-12 | Jyant Technologies | Anti-CCL25 and anti-CCR9 antibodies for the prevention and treatment of cancer and cancer cell migration |
WO2004106488A2 (en) * | 2003-05-12 | 2004-12-09 | Potomac Pharmaceuticals, Inc. | Gene expression suppression agents |
US8575327B2 (en) | 2003-06-12 | 2013-11-05 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Conserved HBV and HCV sequences useful for gene silencing |
EP2284268A3 (en) * | 2003-06-12 | 2012-05-30 | Alnylam Pharmaceuticals Inc. | Conserved HBV and HCV sequences useful for gene silencing |
US20080207539A1 (en) * | 2003-09-01 | 2008-08-28 | Patrick Arbuthnot | Self-Processing Rna Expression Cassette |
ATE449194T1 (de) * | 2003-12-16 | 2009-12-15 | Bio Rad Pasteur | Oligonukleotide zur detektion von hepatitis b viren |
WO2006097285A1 (en) | 2005-03-15 | 2006-09-21 | Innogenetics N.V. | Hepatitis-b viral variants with reduced susceptibility to nucleoside analogs and uses thereof |
SI2567976T1 (sl) | 2005-03-23 | 2017-11-30 | Genmab A/S | Protitelesa usmerjena proti cd38 za zdravljenje multiplega mieloma |
US7476733B2 (en) * | 2005-03-25 | 2009-01-13 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Development of a real-time PCR assay for detection of pneumococcal DNA and diagnosis of pneumococccal disease |
US20100255026A1 (en) * | 2005-10-06 | 2010-10-07 | Michael Jason Stump | Methods and compositions relating to anthrax spore glycoproteins as vaccines |
US8080534B2 (en) | 2005-10-14 | 2011-12-20 | Phigenix, Inc | Targeting PAX2 for the treatment of breast cancer |
AU2006304321B2 (en) | 2005-10-14 | 2012-10-04 | Musc Foundation For Research Development | Targeting PAX2 for the induction of DEFB1-mediated tumor immunity and cancer therapy |
EP2560001B1 (en) | 2006-09-21 | 2016-04-13 | University of Rochester | Compositions and methods related to protein displacement therapy for myotonic distrophy |
WO2008136852A2 (en) | 2006-11-01 | 2008-11-13 | University Of Rochester | Methods and compositions related to the structure and function of apobec3g |
EP2104509A4 (en) * | 2006-12-11 | 2010-03-24 | Univ Utah Res Found | COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF PATHOLOGICAL ANGIOGENESIS AND VASCULAR PERMEABILITY |
US20100239596A1 (en) * | 2007-08-22 | 2010-09-23 | University Of Southern California | Grp78 and tumor angiogenesis |
US8557767B2 (en) | 2007-08-28 | 2013-10-15 | Uab Research Foundation | Synthetic apolipoprotein E mimicking polypeptides and methods of use |
AU2008296478B9 (en) | 2007-08-28 | 2015-03-19 | The Uab Research Foundation | Synthetic apolipoprotein E mimicking polypeptides and methods of use |
WO2010070380A2 (en) * | 2007-12-03 | 2010-06-24 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health Of Human Services, National Institutes Of Health | Doc1 compositions and methods for treating cancer |
US20090233993A1 (en) * | 2008-03-06 | 2009-09-17 | Burnham Institute For Medical Research | Compositions and methods for inhibiting gsk3 activity and uses thereof |
AU2009233906A1 (en) * | 2008-04-08 | 2009-10-15 | Amyris, Inc. | Expression of heterologous sequences |
EP2288922B1 (en) | 2008-05-08 | 2016-08-17 | University of Utah Research Foundation | Sensory receptors for chronic fatigue and pain and uses thereof |
EP2370080A1 (en) | 2008-12-02 | 2011-10-05 | University of Utah Research Foundation | Pde1 as a target therapeutic in heart disease |
US20110318738A1 (en) | 2008-12-23 | 2011-12-29 | University Of Utah Research Foundation | Identification and regulation of a novel dna demethylase system |
AU2010211370A1 (en) * | 2009-02-06 | 2011-09-29 | Freie Universitat Berlin | Pharmaceutical composition containing L-ribozyme for treating adverse reactions by administering Spiegelmers |
CN101634047A (zh) * | 2009-08-12 | 2010-01-27 | 广州金琪基因技术研究发展中心 | 一种外指引序列文库筛选方法 |
WO2011031974A1 (en) | 2009-09-10 | 2011-03-17 | Southern Research Institute | Acridine analogs in the treatment of gliomas |
US20110207789A1 (en) | 2010-02-19 | 2011-08-25 | Ye Fang | Methods related to casein kinase ii (ck2) inhibitors and the use of purinosome-disrupting ck2 inhibitors for anti-cancer therapy agents |
WO2012064675A2 (en) * | 2010-11-10 | 2012-05-18 | Webb Nigel L | Nuclions and ribocapsids |
JP2014505239A (ja) | 2010-12-14 | 2014-02-27 | モアハウス スクール オブ メディスン | 癌の治療または検出のための抗cxcl13および抗cxcr5抗体の使用 |
CN107074923B (zh) | 2014-07-31 | 2021-08-03 | Uab研究基金会 | Apoe模拟肽及对清除血浆胆固醇的较高效力 |
IL294395A (en) | 2014-10-27 | 2022-08-01 | Univ Central Florida Res Found Inc | Methods and compositions for natural killer cells |
JOP20200092A1 (ar) | 2014-11-10 | 2017-06-16 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | تركيبات iRNA لفيروس الكبد B (HBV) وطرق لاستخدامها |
US10723794B2 (en) | 2015-03-18 | 2020-07-28 | University Of South Carolina | Anti-CcL8 antibodies and uses thereof |
CN110087665A (zh) | 2016-08-03 | 2019-08-02 | H·李·莫菲特癌症中心与研究所公司 | Tlr9靶向治疗 |
US11324820B2 (en) | 2017-04-18 | 2022-05-10 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Methods for the treatment of subjects having a hepatitis b virus (HBV) infection |
WO2020036862A1 (en) | 2018-08-13 | 2020-02-20 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | HEPATITIS B VIRUS (HBV) dsRNA AGENT COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF |
Family Cites Families (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4104466A (en) * | 1974-03-13 | 1978-08-01 | Eishun Tsuchida | Polymeric metal complex and method of manufacturing the same |
IL69720A (en) * | 1983-09-14 | 1987-08-31 | Univ Ramot | Anti-tumor pharmaceutical compositions comprising liposome-bound porphyrins |
FR2567892B1 (fr) * | 1984-07-19 | 1989-02-17 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons |
US4980286A (en) * | 1985-07-05 | 1990-12-25 | Whitehead Institute For Biomedical Research | In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells |
AU6131086A (en) * | 1985-07-05 | 1987-01-30 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Epithelial cells expressing foreign genetic material |
US4987071A (en) * | 1986-12-03 | 1991-01-22 | University Patents, Inc. | RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods |
US5166320A (en) * | 1987-04-22 | 1992-11-24 | University Of Connecticut | Carrier system and method for the introduction of genes into mammalian cells |
GB2213684A (en) * | 1987-12-11 | 1989-08-16 | Philips Electronic Associated | Data demodulator baud clock phase locking |
MC2115A1 (fr) * | 1987-12-15 | 1991-07-05 | Gene Shears Pty Ltd | Ribozynes |
JP2917998B2 (ja) * | 1988-02-05 | 1999-07-12 | ホワイトヘッド・インスティチュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ | 修飾された肝細胞およびその用途 |
JP3082204B2 (ja) * | 1988-09-01 | 2000-08-28 | ホワイトヘッド・インスティチュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ | 両栄養性および環境栄養性宿主域を持つ組換え体レトロウイルス |
US5168053A (en) * | 1989-03-24 | 1992-12-01 | Yale University | Cleavage of targeted RNA by RNAase P |
US5225337A (en) * | 1989-09-25 | 1993-07-06 | Innovir Laboratories, Inc. | Ribozyme compositions and methods for use |
US5225347A (en) * | 1989-09-25 | 1993-07-06 | Innovir Laboratories, Inc. | Therapeutic ribozyme compositions and expression vectors |
WO1993001286A2 (en) * | 1991-06-28 | 1993-01-21 | Massachusetts Institute Of Technology | Localized oligonucleotide therapy |
ATE140482T1 (de) * | 1992-04-28 | 1996-08-15 | Univ Yale | Gezielte spaltung von rna mittels eukaryontischer rnase p und externe führungssequenz |
WO1994013791A1 (en) * | 1992-12-04 | 1994-06-23 | Innovir Laboratories, Inc. | Regulatable nucleic acid therapeutic and methods of use thereof |
ATE217347T1 (de) * | 1992-12-04 | 2002-05-15 | Univ Yale | Diagnose mittels signalverstärkung durch ein ribozym |
US6012375A (en) * | 1993-07-06 | 2000-01-11 | Eckstein; Donald B. | Aircraft infrared guided defense missile system |
AU706417B2 (en) * | 1994-02-23 | 1998-06-17 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Method and reagent for inhibiting the expression of disease related genes |
US5869248A (en) * | 1994-03-07 | 1999-02-09 | Yale University | Targeted cleavage of RNA using ribonuclease P targeting and cleavage sequences |
AU4961996A (en) * | 1994-12-14 | 1996-07-03 | Innovir Laboratories, Inc. | Ribozyme-mediated inactivation of leukemia-associated rna |
-
1996
- 1996-03-14 US US08/615,961 patent/US5877162A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-03-14 JP JP53278697A patent/JP4062365B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-03-14 ES ES97915007T patent/ES2221955T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-14 DK DK97915007T patent/DK0894129T3/da active
- 1997-03-14 EP EP97915007A patent/EP0894129B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-14 AT AT97915007T patent/ATE267866T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-03-14 AU AU22061/97A patent/AU2206197A/en not_active Abandoned
- 1997-03-14 DE DE69729292T patent/DE69729292T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-14 WO PCT/US1997/003847 patent/WO1997033991A1/en active IP Right Grant
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ES2221955T3 (es) | 2005-01-16 |
EP0894129B1 (en) | 2004-05-26 |
AU2206197A (en) | 1997-10-01 |
EP0894129A1 (en) | 1999-02-03 |
JP2000506731A (ja) | 2000-06-06 |
US5877162A (en) | 1999-03-02 |
WO1997033991A1 (en) | 1997-09-18 |
DE69729292D1 (de) | 2004-07-01 |
ATE267866T1 (de) | 2004-06-15 |
DE69729292T2 (de) | 2005-06-02 |
DK0894129T3 (da) | 2004-09-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4062365B2 (ja) | 短い外部ガイド配列 | |
CA2210353C (en) | Stabilized external guide sequences | |
US6057153A (en) | Stabilized external guide sequences | |
US5869253A (en) | Method and reagent for inhibiting hepatitis C virus replication | |
US6849726B2 (en) | Non-nucleotide containing RNA | |
AU687001B2 (en) | Method and reagent for inhibiting cancer development | |
Akhtar | Delivery strategies for antisense oligonucleotide therapeutics | |
WO1998058058A1 (en) | Hammerhead ribozymes with extended cleavage rule | |
US6300483B1 (en) | Compositions inducing cleavage of RNA motifs | |
CA2223645A1 (en) | Antisense inhibition of hepatitis b virus replication | |
CA2154363A1 (en) | Localization of therapeutic agents | |
JPH1052264A (ja) | N‐ras発現阻害剤およびその方法 | |
WO1996018733A2 (en) | Ribozyme-mediated inactivation of leukemia-associated rna | |
US5622854A (en) | Method and reagent for inhibiting T-cell leukemia virus replication | |
Usman et al. | Catalytic RNA (ribozymes) as drugs | |
WO1995017414A1 (en) | Anti-hepatitis b viral oligonucleotides | |
Kiely | Recent advances in antisense technology | |
Akhtar | Revival: Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics (1995) | |
Netter et al. | Hepatitis delta virus | |
JPH09501318A (ja) | ヒト免疫不全ウイルスの複製を阻害するための方法および試薬 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040218 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20061024 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070122 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070717 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071012 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20071127 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20071218 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110111 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110111 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120111 Year of fee payment: 4 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |