ES2221955T3 - Secuencias guia externas cortas. - Google Patents

Secuencias guia externas cortas.

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ES2221955T3 ES97915007T ES97915007T ES2221955T3 ES 2221955 T3 ES2221955 T3 ES 2221955T3 ES 97915007 T ES97915007 T ES 97915007T ES 97915007 T ES97915007 T ES 97915007T ES 2221955 T3 ES2221955 T3 ES 2221955T3
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Abstract

SE HA REALIZADO INGENIERIA CON MOLECULAS DE SECUENCIA GUIA EXTERNA (EGS) PARA ARNSE P DE LOS EUCARIOTAS PARA MARCAR UN EFICAZ Y ESPECIFICO FRACCIONAMIENTO DE ARN OBJETO. LAS MOLECULAS DE ARN INGENIADAS SON DISEÑADAS Y SINTETIZADAS CONTIENIENDO SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS ESPECIFICOS QUE PERMITEN UNA SECUENCIA CON GUIA EXTERNA PARA QUE ARNSE P SE UNA PREFERENTEMENTE Y PROMUEVA UN FRACCIONAMIENTO DE ARNSE CON P COMO INTERMEDIARIO DE MOLECULAS DE ARN MARCADAS. LAS MOLECULAS DE SECUENCIAS CON GUIA EXTERNA CORTA (SEGS) HAN SIDO CONSTRUIDAS DE TAL FORMA QUE, CUANDO SE HIBRIDIZAN PARA UNA MOLECULA MARCADA, APORTAN UNA MINIMA ESTRUCTURA RECONOCIDA COMO UN SUSTRATO POR EL ARNES P. LA ESTRUCTURA SEGS/MARCADA SE COMPONE DE ESTRUCTURAS SIMILARES A LA RAMA A Y A LA RAMA T DE UN ARNT, EL SUSTRATO NATURAL DE ARNSE P. LA SEGS SOLAMENTE INCORPORA LA MITAD DE ESTAS ESTRUCTURAS DE RAMA. LA OTRA MITAD DE LAS ESTRUCTURAS DE RAMA ES SUMINISTRADA POR LA MOLECULA MARCADA. PERMITIENDO QUE LA MOLECULA MARCADA FORME MAS ESTRUCTURA DEL SUSTRATO ARNSE P, LAS MOLECULAS SGS DESCUBIERTAS PUEDEN SER SIGNIFICATIVAMENTE MAS PEQUE¥AS QUE LAS ANTERIORES MOLECULAS EGS. ESTO HACE A LAS MOLECULAS SEGS ESPECIALMENTE UTILES COMO AGENTES TERAPEUTICAS PUESTO QUE SON MAS FACILES DE FABRICAR Y ADMINISTRAR EN CANTIDAD.

Description

Secuencias guía externas cortas.
Antecedentes de la invención
Esta solicitud está dirigida a los métodos y las composiciones de secuencias guía externas diseñadas para dirigir la escisión de ARN por la ARNasa P.
Las moléculas de ácido ribonucleico (ARN) pueden servir no sólo como portadoras de información genética, por ejemplo, moléculas de ARN retroviral genómico y ARN mensajero (ARNm) y como estructuras esenciales para la síntesis de proteínas, por ejemplo, moléculas de ARN de transferencia (ARNt) y de ARN ribosómico (ARNr), sino también como enzimas que escinden específicamente moléculas de ácido nucleico. Tales moléculas de ARN catalítico son denominadas ribozimas.
El descubrimiento del ARN catalítico, por los Doctores Altman y Cech, que fueron galardonados con el premio Nóbel en 1.989, ha generado mucho interés en las aplicaciones comerciales, concretamente en terapéutica (Alman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10898-10900 (1.993); Symons. Annu. Rev. Biochem. 61:641- 671 (1.992); Rossi y col., Antisense Res. Dev., 1:285-288 (1.991); Cech, Annu. Rev. Biochem. 59:543-568, (1.990)). Se han descrito diversas clases de ARN catalíticos (ribozimas), incluyendo ribozimas derivadas de intrones (WO 88/04300; ver también, Cech, T., Annu. Rev. Biochem., 59:543-568, (1.990)), ribozimas cabeza de martillo (WO 89/05852 y EP 321021 de GeneShears), ribozimas con cabeza de hacha (WO 91/04319 y WO 91/04324 de Innovir).
ARNasa P
En otra clase de ribozimas se incluye la porción de ARN de una enzima, la ARNasa P, que está implicada en la maduración del ARN de transferencia (ARNt), un componente celular común de la maquinaria de la síntesis de proteínas. En la ARNasa P bacteriana se incluyen dos componentes, una proteína (C5) y un ARN (M1). Sidney Altman y sus colaboradores demostraron que el ARN M1 es capaz de funcionar exactamente como una enzima completa, mostrando que en Escherichia coli el ARN es esencialmente el componente catalítico, (Guerrier-Takada y col., Cell 35:849-857 (1.983)). En un trabajo posterior, el Dr. Altman y sus colegas desarrollaron un método para convertir virtualmente cualquier secuencia de ARN en un sustrato para la ARNasa P bacteriana utilizando una secuencia guía externa (EGS en sus siglas en inglés), que tiene en su extremo 5' al menos siete nucleótidos complementarios a los nucleótidos 3' con respecto al sitio de escisión en el ARN que va a ser escindido y en sus extremo 5' los nucleótidos NCCA (N es cualquier nucleótido) (WO 92/03566 de Yale, Y. Forster y Altman, Sience 238:407-409 (1.990)).
Utilizando principios similares, se ha desarrollado la escisión del ARN dirigida por EGS/ARNasa P para su uso en sistemas eucariotas, donde la secuencia guía externa forma estructuras similares a las estructuras del tallo y lazo del ARNt y donde el ARN sustrato hibrida con los extremos de la EGS para formar estructuras similares a los tallos aceptor y D del ARNt (Yuan y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8006-8010 (1.992); WO 93/22434 de Yale). Posteriormente se ha demostrado que las moléculas de EGS para su uso con la ARNasa P eucariótica sólo necesita formar una estructura similar al tallo y al lazo T del ARNt, donde, de nuevo, el ARN sustrato hibrida con los extremos de la EGS para formar estructuras similares a los tallos aceptor y D del ARNt (WO 95/24489 de Yale). Estas moléculas de EGS son útiles para promover la escisión mediada por ARNasa P de las moléculas grandes de ARN. Son especialmente útiles para su uso in vivo puesto que sólo se necesita administrar la molécula de EGS relativamente pequeña. La ARNasa P catalítica ya está presente y activa en las células del animal o paciente. Yuan y Altman, EMBO J 14:159-168 (1.995), y Carrara y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 92:2627-2631 (1.995), determinaron más tarde una estructura mínima necesaria para la escisión de un sustrato por la ARNasa P.
Es un objeto de la presente invención proporcionar un agente terapéutico dirigido al tratamiento de enfermedades virales y enfermedades que implican productos de transcripción anómalos, y los métodos para su uso.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar secuencias guía externas cortas para la ARNasa P, vectores que codifiquen tales secuencias guía externas cortas, y los métodos para su uso.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar secuencias guía externas cortas químicamente modificadas para la ARNasa P con una resistencia intensificada a la degradación por nucleasas.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar los métodos para escindir moléculas de ARN diana promovida por las secuencias guía externas cortas para la ARNasa P.
Otro objeto adicional de la presente invención es proporcionar secuencias guía externas cortas para la ARNasa P dirigidas específicamente contra virus tales como el de la hepatitis, los vectores que codifican tales secuencias guía externas cortas, y los métodos para el uso de las mismas.
Un primer aspecto de la presente invención proporciona una molécula de oligonucleótido según la 
\hbox{reivindicación 1.}
Un segundo aspecto de la presente invención proporciona el uso de un oligonucleótido según la reivindicación 13.
Un tercer aspecto de la presente invención proporciona un vector de expresión diseñado que codifica un oligonucleótido según la reivindicación 22.
Un cuarto aspecto de la presente invención proporciona una composición para promover la escisión de la molécula de ARN de la hepatitis B según la reivindicación 23.
Un quinto aspecto de la presente invención proporciona un método ex vivo para escindir una molécula de ARN diana según la reivindicación 25.
Un sexto aspecto de la presente invención proporciona el uso de una molécula de oligonucléotido según la reivindicación 28.
Un séptimo aspecto de la presente invención proporciona el uso ex vivo de una molécula de oligonucleótido según la reivindicación 29.
Un octavo aspecto de la presente invención proporciona un método para elaborar un oligonucleótido según la reivindicación 30.
Compendio de la invención
Las moléculas de la secuencia guía externa (EGS) para la ARNasa P eucariótica son diseñadas para dirigir una escisión eficaz y específica del ARN diana. Contienen secuencias de nucleótidos específicas que permiten que una secuencia guía externa para la ARNasa P se una preferentemente y promueva la escisión de moléculas de ARN diana mediada por ARNasa P. Se han construido moléculas de Secuencia Guía Externa Cortas (SEGS en sus siglas en inglés) que, cuando hibridan con una molécula diana, proporcionan una estructura mínima reconocida como sustrato por la ARNasa P. En la estructura EGS pequeña/diana se incluyen estructuras similares al tallo A y el tallo T de un ARNt, el sustrato natural de la ARNasa P. La SEGS constituye sólo la mitad de estas estructuras del tallo. La otra mitad de las estructuras del tallo es proporcionada por la molécula diana. Permitiendo que la molécula diana forme más de la estructura sustrato de la ARNasa P, las moléculas SEGS descritas pueden ser significativamente más pequeñas que las moléculas de EGS anteriores. Esto hace especialmente útiles las moléculas de SEGS como agentes terapéuticos puesto que son más fáciles y menos costosas de fabricar y administrar en cantidad.
Las versiones modificadas químicamente de estas moléculas de SEGS que tienen nucleótidos o conexiones de nucleótidos modificados se diseñan para aumentar su resistencia a la degradación por nucleasas. Las regiones específicas son modificadas para lograr un aumento de estabilidad a la vez que mantienen la actividad de dirigir la ARNasa P. Los ejemplos demuestran que se han construido moléculas de SEGS para la ARNasa P que se unen y promueven la escisión con ARNasa P del ARN viral de la hepatitis. También se describen los métodos para la determinación de la actividad de una SEGS, con el fin de construir-rastrear, así como los métodos en los que se utilizan y producen tales moléculas de ARN.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un diagrama de la estructura de una Secuencia Guía Externa Corta (SEGS) hibridada a una molécula de ARN diana. Las partes de la SEGS (SEC ID NUM. 6) y la molécula de ARN diana (SEC ID NUM. 7), desempeñando cada una un papel estructural específico en el complejo SEGS/ARN diana. Las partes de la SEGS son, de 5' a 3', el brazo de reconocimiento T y el brazo de reconocimiento A. Las partes del ARN diana son, de 5' a 3', la primera región diana, la región protuberancia, la segunda región diana, y la región rotada. La relación estructural primaria entre la SEGS y el ARN diana consiste en que el brazo de reconocimiento A es complementario a la primera región diana y el brazo de reconocimiento T es complementario a la segunda región diana. Excepto para dos de los nucleótidos de la región rotada, las secuencias mostradas son meros ejemplos y no son críticas para obtener la escisión mediada por ARNasa P del ARN diana en general. En este ejemplo, el ARN diana es el ARN de HBV.
La Figura 2 es un diagrama de la estructura de una SEGS (EGS 3; SEC ID NUM. 1) y un ARN diana modelo corto (T 10) con la secuencia de nucleótidos SEC ID NUM. 2. Los dos oligonucleótidos están alineados para mostrar el emparejamiento de bases que forma una estructura similar al tallo A y el tallo T del ARNt. Esta estructura es reconocida por la ARNasa P eucariótica y promueve la escisión mediada por ARNasa P del ARN diana. El sitio de escisión de la ARNasa P está indicado con una flecha.
La Figura 3 es un diagrama de la estructura de una SEGS (EGS a) con la secuencia de nucleótidos SEC ID NUM. 3 y un ARN diana modelo corto (T a) con la secuencia de nucleótidos mostrada en los nucleótidos 1 a 36 de la SEC ID NUM. 4. Los dos oligonucleótidos están alineados para mostrar el emparejamiento de bases que forma una estructura similar a la del tallo A y el tallo T del ARNt. Esta estructura es reconocida por la ARNasa P eucariótica y promueve la escisión mediada por ARNasa P del ARN diana. El sitio de escisión de la ARNasa P está indicado con una flecha. Parte del ARN diana modelo se empareja con una porción de la secuencia de HBV. La secuencia implicada en el lazo T "roto" es la misma que la secuencia del lazo T del ARNt^{Tyr}.
La Figura 4 es un diagrama de la estructura de EGS con la secuencia de nucleótidos SEC ID NUM. 3 y un ARN diana modelo corto (T a') con la secuencia de nucleótidos SEC ID NUM. 4. Los dos oligonucleótidos están alineados para mostrar el emparejamiento de bases que forma una estructura similar a la del tallo A y el tallo T del ARNt. Esta estructura es reconocida por la ARNasa P eucariótica y promueve la escisión mediada por ARNasa P del ARN diana. El sitio de escisión de la ARNasa P está indicado con una flecha. El ARN diana modelo se empareja con una porción de la secuencia de HBV.
La Figura 5 es un diagrama de la estructura de EGS y un ARN diana. A la izquierda se muestra la estructura de la SEGS de 15 nucleótidos (EGS 3; SEC ID NUM. 1) hibridada con el ARN diana modelo corto (T 7; SEC ID NUM. 2). A la derecha se muestra la estructura de la SEGS de 12 nucleótidos (EGS 7; nucleótidos 4 a 15 de la SEC ID 
\hbox{NUM. 1)}
hibridada con el ARN diana modelo corto (T 7; SEC ID NUM. 2). Las SEGS y el ARN diana está alineados para mostrar el emparejamiento de bases que forma una estructura similar al tallo A y al tallo T del ARNt. Esta estructura es reconocida por la ARNasa P eucariótica y promueve la escisión del ARN diana mediada por la ARNasa P. El sitio de escisión de la ARNasa P está indicado con una flecha.
La Figura 6 es un diagrama de la estructura de un sustrato de ARNasa P mínimo que es similar a un complejo SEGS/ARN diana. La secuencia de nucleótidos del sustrato es la SEC ID NUM. 5. Esta estructura es reconocida y escindida por la ARNasa P eucariótica. El sitio de escisión de la ARNasa P está indicado con una flecha. La secuencia es un modelo en una porción de la secuencia de HBV.
La Figura 7 es un diagrama de la estructura formada por la hibridación de una SEGS (HBV B) con la secuencia de nucleótidos SEC ID NUM. 6 con una porción de ARN de HBV correspondiente a los nucleótidos 375-424 del ARN de HBV de 2,1 kb (SEC ID NUM. 7). La SEGS y el ARN de HBV está alineados para mostrar el emparejamiento de bases que forma una estructura similar a la del tallo A y el tallo T del ARNt. El sitio de escisión de la ARNasa P está indicado con una flecha.
La Figura 8 es un diagrama de la estructura formada por la hibridación de una SEGS (HBV C) con la secuencia de nucleótidos SEC ID NUM. 8 con una porción de ARN de HBV correspondiente a los nucleótidos 543-598 de un ARN de HBV de 2,1 kb (SEC ID NUM. 9). La SEGS y el ARN de HBV están alineados para mostrar el emparejamiento de bases que forma una estructura similar a la del tallo A y el tallo T del ARNt. El sitio de escisión de la ARNasa P está indicado con una flecha.
La Figura 9 es un diagrama de la estructura formada por la hibridación de una SEGS (HBV F1) con la secuencia de nucleótidos SEC ID NUM. 10 con una porción de ARN de HBV correspondiente a los nucleótidos 673-718 de un ARN de HBV de 2,1 kb (SEC ID NUM. 11). La SEGS y el ARN de HBV están alineados para mostrar el emparejamiento de bases que forma una estructura similar a la del tallo A y el tallo T del ARNt. El sitio de escisión de la ARNasa P está indicado con una flecha.
La Figura 10 es un diagrama de la estructura formada por la hibridación de una SEGS (HBV H) con la secuencia de nucleótidos SEC ID NUM. 12 con una porción de ARN de HBV correspondiente a los nucleótidos 1559-1606 de un ARN de HBV de 2,1 kb (SEC ID NUM. 13). La SEGS y el ARN de HBV están alineados para mostrar el emparejamiento de bases que forma una estructura similar a la del tallo A y el tallo T del ARNt. El sitio de escisión de la ARNasa P está indicado con una flecha.
La Figura 11 es un diagrama de la estructura formada por la hibridación de una SEGS (HBV H1) con la secuencia de nucleótidos SEC ID NUM. 14 con una porción de ARN de HBV correspondiente a los nucleótidos 1562-1606 de un ARN de HBV de 2,1 kb (nucleótidos 4-48 de la SEC ID NUM. 13). La SEGS y el ARN de HBV están alineados para mostrar el emparejamiento de bases que forma una estructura similar a la del tallo A y el tallo T del ARNt. El sitio de escisión de la ARNasa P está indicado con una flecha.
La Figura 12 es un diagrama de la estructura de un sustrato de la ARNasa P mínimo que es similar a un complejo SEGS/ARN diana. La secuencia de nucleótidos del sustrato es la SEC ID NUM. 15. Esta estructura es reconocida y escindida por la ARNasa P eucariótica. El sitio de escisión de la ARNasa P está indicado con una flecha. Las secuencias implicadas en los tallos y el lazo T son las mismas que las secuencias del tallo A y el tallo T del lazo del ARNt^{Tyr}.
La Figura 13 es un diagrama de la estructura de una SEGS (EGS 3) con la secuencia de nucleótidos SEC ID NUM. 1 y un ARN diana modelo corto (T 7) con la secuencia de nucleótidos mostrada en los nucleótidos 1 a 36 de la SEC ID NUM. 2. Los dos oligonucleótidos están alineados para mostrar el emparejamiento de bases que forma una estructura similar a la del tallo A y el tallo T del ARNt. Esta estructura es reconocida por la ARNasa P eucariótica y promueve la escisión del ARN diana mediada por la ARNasa P. El sitio de escisión de la ARNasa P está indicado con una flecha. Las secuencias implicadas en los tallos y en el lazo "roto" son las mismas que las secuencias del tallo A y el tallo T y el lazo de ARNt^{Tyr}.
Descripción detallada de la invención
Se han construido oligonucleótidos adecuados para promover la escisión de moléculas de ARN diana. Los oligonucleótidos son moléculas de secuencia guía externa (EGS) para la ARNasa P eucariótica que se diseñan para que se unan específicamente y promuevan la escisión de las moléculas de ARN diana mediada por ARNasa P y para que tengan una resistencia a la nucleasa incrementada. Estas moléculas de EGS difieren en estructura y tamaño de las secuencias guía externas anteriores, y son referidas como Secuencias Guía Externas Cortas (SEGS). Una característica distintiva clave es que las SEGS, por sí mismas, no forman una estructura similar a la del tallo T y el lazo del ARNt.
Se han construido SEGS adecuadas para su uso en el tratamiento de las infecciones virales de hepatitis B. Según se utiliza aquí, "secuencia guía externa" y "EGS" hacen referencia a cualquier oligonucleótido que forme un sitio de escisión activo para la ARNasa P en un ARN diana. "Secuencia Guía Externa Corta" y "SEGS" hacen referencia a las formas cortas de las EGS descritas más abajo. Se pretende que los términos "Secuencia Guía Externa Corta" y "SEGS" hagan referencia solamente a las formas cortas de las moléculas de EGS descritas más abajo en lugar de a las moléculas de EGS "cortas" en general, esto es, moléculas de EGS que son meramente "cortas". Para enfatizar esta distinción, "Secuencia Guía Externa Corta" se escribe con mayúscula. Cuando se hace referencia aquí a secuencias guía externas se pretende que las SEGS estén incluidas.
Las moléculas de EGS anteriores fueron diseñadas para formar una estructura similar como mínimo al tallo T y el lazo de ARNt, con una cola 3' y una cola 5' que hibridan con una molécula de ARN diana para formar estructuras similares al tallo A y al tallo D del ARNt. Se ha descubierto que las estructuras similares al lazo T y al tallo D no son necesarias para escindir una estructura de ARN diana/EGS. En las moléculas de Secuencias Guía Externas Cortas descritas, las SEGS y la molécula de ARN diana forman juntas estructuras similares al tallo A y el tallo T del ARNt. A diferencia de las moléculas de EGS anteriores, una SEGS no forma un lazo T y no forma, por si misma, una estructura similar a un tallo T. En lugar de eso, la molécula de ARN diana hibrida con la SEGS para formar la mitad de una estructura similar al tallo T del ARNt. Un ejemplo de una SEGS hibridada con su molécula de ARN diana se muestra en la Figura 1.
Las SEGS se distinguen de las moléculas de EGS anteriores en que 1) no hay lazo T intacto, 2) las SEGS y el ARN diana no forman una estructura similar al tallo D del ARNt, y 3) el ARN diana, combinado con la SEGS, forma la mitad de una estructura similar al tallo T del ARNt.
Las SEGS tienen diversas ventajas sobre las moléculas de EGS anteriores. 1) Las SEGS son más fáciles de sintetizar y purificar, y costarán menos, debido a su longitud más corta, 2) el uso del tallo T para el reconocimiento de la diana conferirá más especificidad a la EGS puesto que los tallos D cortos utilizados para el reconocimiento de la diana en las moléculas de EGS anteriores proporciona una secuencia menos específica a la diana en la EGS, disminuyendo de ese modo la especificidad de la escisión, y 3) una SEGS será absorbida por la célula más fácilmente.
I. Diseño y Síntesis de Moléculas de SEGS
Las moléculas de SEGS son oligonucleótidos sintéticos que se unen a un sustrato diana para formar una estructura secundaria y terciaria que se asemeja al sitio de escisión natural del ARNt precursor para la ARNasa P eucariótica. La capacidad de las moléculas de SEGS para dirigir y promover la actividad de la ARNasa P es fácilmente determinada utilizando un análisis de actividad in vitro para la escisión por la ARNasa P de una secuencia de ARN diana, como se describe con más detalle más abajo. En el caso de las moléculas de SEGS con nucleótidos o conexiones de nucleótidos modificados, un análisis de estabilidad permite la determinación de la resistencia a la nucleasa de diversos tipos de modificación. El análisis de actividad permite la comparación de la eficacia de la escisión mediada por ARNasa P promovida por moléculas de SEGS con diferentes modificaciones. Juntos, los análisis son utilizados para optimizar y equilibrar la estabilidad y la eficacia de la escisión de las moléculas de SEGS modificadas.
Se han construido moléculas de SEGS ejemplares que son adecuadas para su uso en el tratamiento de las enfermedades virales. La diana específica es el virus de la hepatitis B, más concretamente, el ARN que codifica el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg). Puesto que el HbsAg juega un papel esencial en la supraestructura y la infección viral, los agentes terapéuticos basados en SEGS pueden ser utilizados para infra-regular la hepatitis por medio de la escisión del ARNm de HBsAg. Los sitios diana preferidos en el ARN de la hepatitis B, u otros ARN diana, son las regiones de secuencia conservada que aparecen en todas las formas del ARN diana y que tienen una unidad UNR como se describe más abajo. Cinco de tales sitios preferidos han sido identificados en la región que codifica HBsAg del ARN de la hepatitis B y son dirigidos por las moléculas de SEGS que tienen las secuencias de bases nucleotídicas mostradas en las SEC ID NUM. 6, SEC ID NUM. 8, SEC ID NUM. 10, SEC ID NUM. 12, y SEC ID NUM. 14.
A. Diseño de Moléculas de SEGS
Se pueden diseñar moléculas de SEGS adaptando una porción de la estructura básica de una molécula de pre-ARNt para formar una secuencia de reconocimiento sustrato. Esta secuencia de reconocimiento es complementaria a las regiones de una secuencia elegida como diana de una molécula de ARN diana. En la SEGS, la secuencia de reconocimiento está compuesta por dos brazos de reconocimiento, referidos como brazo de reconocimiento A y brazo de reconocimiento T, que, combinados con las regiones de la secuencia elegida como diana en el ARN diana, forman estructuras similares al tallo A y al tallo T, respectivamente, de una molécula de ARNt. El brazo de reconocimiento T está localizado 5' y adyacente con respecto al brazo de reconocimiento A. Las secuencias de los brazos de reconocimiento se eligen específicamente para que sean complementarias a dos regiones de la secuencia elegida como diana en el ARN diana, referidas como primera región diana y segunda región diana. La primera región diana abarca, o es adyacente y está situada 3', con respecto al sitio en el que se produce la escisión mediada por ARNasa P.
Las secuencias de los brazos de reconocimiento se eligen de manera que la primera y segunda regiones diana del ARN diana estén separadas por una corta región desemparejada, referida como región protuberancia. La formación de esta estructura es el único requerimiento esencial para definir la secuencia de nucleótidos de una SEGS. No obstante, se prefiere que las secuencias de los brazos de reconocimiento también se elijan de manera que se encuentre presente una unidad UNR en la molécula de ARN diana adyacente y 3' con respecto a la segunda región diana. La unidad UNR puede estar inmediatamente adyacente a la segunda región diana, o puede estar separada de la segunda región diana por uno o unos pocos nucleótidos espaciadores. Se prefiere que la unidad UNR esté separada de la segunda región diana por cero a diez nucleótidos espaciadores, es más preferido que la unidad UNR esté separada de la segunda región diana por cero a tres nucleótidos espaciadores, y es muy preferido que la unidad UNR esté separada de la segunda región diana por un nucleótido espaciador. La unidad UNR tiene una secuencia de nucleótidos UNR donde N representa cualquier nucleótido, R representa cualquier nucleótido de purina, y U representa un nucleótido de uridina. La región de la secuencia elegida como diana de la molécula de ARN diana que constituye la unidad UNR, o la secuencia correspondiente, y los nucleótidos espaciadores es referida a su vez como región rotada. La región rotada, si está presente, es inmediatamente adyacente a y está 3' con respecto a la segunda región diana. Sin desear estar ligado a ninguna teoría concreta, se cree que el potencial de la región rotada de la secuencia elegida como diana en el ARN diana para formar una estructura rotada de uridina (ver Quigley y Rich, Science 194:796-806 (1.976), y Junker y Pardi, RNA 1:219-222 (1.995)) ayuda a promover la escisión mediada por ARNasa P del ARN diana.
Según las relaciones descritas antes, la secuencia elegida como diana en el ARN diana está compuesta, de 5' a 3', por la primera región diana, la región protuberancia, y la segunda región diana, donde el brazo de reconocimiento A de la SEGS es complementario a la primera región diana y el brazo de reconocimiento T de la SEGS es complementario a la segunda región diana. Se prefiere que también se encuentre presente una región rotada, que tenga una unidad UNR, en la secuencia elegida como diana 3' con respecto a la segunda región diana. Un ejemplo es estas regiones y relaciones se muestra en la Figura 1.
Los brazos de reconocimiento pueden tener cualquier longitud que de como resultado una molécula de SEGS funcional. Se prefiere que el brazo de reconocimiento A y el brazo de reconocimiento T juntos sumen de 12 a 16 nucleótidos. Es muy preferido que el brazo de reconocimiento A y el brazo de reconocimiento T juntos sumen de 12 ó 13 nucleótidos. En general, se prefiere que el brazo de reconocimiento A tenga una longitud de siete a nueve nucleóticos, y que el brazo de reconocimiento T tenga una longitud de cinco a siete nucleótidos. Es muy preferido que el brazo de reconocimiento A tenga una longitud de siete u ocho nucleótidos y el brazo de reconocimiento T tenga una longitud de cinco o seis nucleótidos. En general, Los brazos de reconocimiento pueden tener cualquier secuencia de nucleótidos. Como se discute más abajo, la elección de la secuencia se basa preferiblemente en la secuencia elegida como diana del ARN diana de interés. Se prefiere que el nucleótido del extremo 3' del brazo de reconocimiento A sea un nucleótido de citidina o guanidina. Es muy preferido que el nucleótido del extremo 3' del brazo de reconocimiento A sea un nucleótido de citidina.
La región protuberancia puede tener cualquier longitud que de como resultado una molécula de SEGS funcional. Se prefiere que la región protuberancia tenga una longitud de 1 a 30 nucleótidos. Es más preferido que la región protuberancia tenga una longitud de cinco a quince nucleótidos. Es muy preferido que la región protuberancia tenga una longitud de nueve nucleótidos. La región rotada, si está presente, puede tener cualquier secuencia que incluya la fórmula consenso UNR que da como resultado una molécula de SEGS funcional. Las secuencias de nucleótidos de la región rotada están indicadas aquí utilizando los símbolos de bases nucleotídicas normalizados. Como referencia, N representa cualquier nucleótido, R representa cualquier nucleótido de purina, Y representa cualquier nucleótido de pirimida, A representa cualquier nucleótido de adenina, C representa cualquier nucleótido de citosina, G representa cualquier nucleótido de guanina, T representa cualquier nucleótido de timina, y U representa cualquier nucleótido de uracilo. Se prefiere que la región rotada tenga una secuencia NUNR. Es más preferido que la secuencia rotada tenga una secuencia NUCR o UUNR. Es muy preferido que la secuencia rotada tenga una secuencia UUCR.
Se prefiere que la región rotada de una secuencia elegida como diana en el ARN diana comprenda una secuencia de nucleótidos abarcada por la fórmula NNNR. Es más preferido que la región rotada de una secuencia elegida como diana en el ARN diana comprenda una secuencia de nucleótidos abarcada por al menos una de las fórmulas NNYR, YNNR, o NYNR. Es aún más preferido que la región rotada de una secuencia elegida como diana en el ARN diana comprenda una secuencia de nucleótidos abarcada por al menos una de las fórmulas YNYR, NYYR, o YYNR. Es aún más preferido que la región rotada de una secuencia elegida como diana en el ARN diana comprenda una secuencia de nucleótidos abarcada por al menos una de las fórmulas YYYR, YUNR, o NUYR. Es aún más preferido que la región rotada de una secuencia elegida como diana en el ARN diana comprenda una secuencia de nucleótidos abarcada por al menos una de las fórmulas UYYR o YYCR, o al menos una de las fórmulas YUYR, UUNR, o NUCR. Es aún más preferido que la región rotada de una secuencia elegida como diana en el ARN diana comprenda una secuencia de nucleótidos abarcada por al menos una de las fórmulas UYCR o al menos una de las fórmulas UUYR o YUCR. Es muy preferido que la región rotada de una secuencia elegida como diana en el ARN diana comprenda una secuencia de nucleótidos abarcada por la fórmula UUCR.
Cuando la región rotada de una secuencia elegida como diana de un ARN diana comprende una secuencia de nucleótidos abarcada por la fórmula NNNY, se prefiere que la región rotada comprenda una secuencia de nucleótidos abarcada por la fórmula YNNY. Es más preferido que la región rotada de una secuencia elegida como diana de un ARN diana comprenda una secuencia de nucleótidos abarcada por al menos una de las fórmulas YNYY o YYNY. Es aún más preferido que la región rotada de una secuencia elegida como diana en un ARN diana comprenda una secuencia de nucleótidos abarcada por la fórmula YYYY. Es aún más preferido que la región rotada de una secuencia elegida como diana de un ARN diana comprenda una secuencia de nucleótidos abarcada por la fórmula YUYY o la fórmula UYCY. Es aún más preferido que la región rotada de una secuencia elegida como diana de un ARN diana comprenda una secuencia de nucleótidos abarcada por al menos una de las fórmulas UUYY o YUCY. Es muy preferido que la región rotada de una secuencia elegida como diana de un ARN diana comprenda una secuencia de nucleótidos abarcada por la fórmula UUCY.
Las moléculas de SEGS funcionales requieren sólo que formen, combinadas con un ARN diana, una estructura correspondiente al tallo A y al tallo T del ARNt precursor de manera que la región no emparejada esté presente en el ARN diana entre las estructuras correspondientes al tallo A y al tallo T del ARNt. No se requiere una estructura correspondiente al lazo T de un ARNt. Así, una molécula de SEGS funcional requiere sólo una secuencia de nucleótidos complementaria a las dos regiones de la molécula de ARN diana, donde las regiones de la molécula de ARN diana están separadas por una región, la región protuberancia, que no es complementaria a la SEGS. Se prefiere que una región rotada que contiene una unidad UNR, u otra secuencia de nucleótidos de la región rotada preferida como se ha descrito antes, también esté presente en el ARN diana adyacente y 3' con respecto a la estructura correspondiente al tallo T del ARNt.
Las SEGS pueden ser diseñadas para ser dirigidas a cualquier secuencia en cualquier ARN diana de interés. No obstante, las SEGS son diseñadas preferiblemente investigando la secuencia de nucleótidos del ARN diana de interés para la localización de las unidades UNR, u otra secuencia de nucleótidos de la región rotada preferida como se ha descrito antes. Para las SEGS más preferidas, la investigación se puede limitar a las secuencias preferidas de las regiones rotadas como se ha descrito antes. Una vez que una secuencia rotada deseada es identificada, se elige la secuencia del brazo de reconocimiento T de la SEGS para que sea complementaria a los nucleótidos del ARN diana adyacente y 5' con respecto a la secuencia de la región rotada, separada por uno o unos pocos nucleótidos espaciadores, si se desea. Estos nucleótidos del ARN diana representan la segunda región diana. La secuencia del brazo de reconocimiento A de la SEGS se elige para que sea complementaria a los nucleótidos del ARN diana 5' con respecto a la segunda región espaciadora, separada por una región desemparejada. La región desemparejada es la región protuberancia de la secuencia elegida como diana.
El diseño de una SEGS puede ser ilustrado con un ejemplo, una porción de la secuencia de nucleótidos del virus de la hepatitis B que contiene una unidad UNR es: CUGGAUGUGUCUGCGGCGUUUUAUCAUCUUCCU
CUUCAUCCUGCUGCUAU (SEC ID NUM. 7; unidad UNR en negrita). Eligiendo una longitud del brazo de reconocimiento T de cinco nucleótidos, una longitud de la región protuberancia de nueve nucleótidos, una longitud del brazo de reconocimiento A de ocho nucleótidos, y un nucleótido espaciador único en la región rotada, la secuencia de la SEGS es el complemento de los cinco nucleótidos adyacentes y 5' respecto a la región rotada, que incluye un nucleótido espaciador (U) 5' respecto a la unidad UNR, seguido del complemento de los siete nucleótidos que empieza en el nucleótido quince 5' con respecto a la región rotada. Esta SEGS (HBV B) tendrá una secuencia GAG
GAAACGCCGC (SEC I D NUM. 6; brazo de reconocimiento T en negrita). La estructura del complejo de HBV B de SEGS y el ARN de HBV se muestra en la Figura 7. Otros ejemplos que también implican HBV se muestran en las Figuras 8, 9, 10 y 11.
Las moléculas de SEGS también pueden contener secuencias de nucleótidos adicionales en uno cualquiera de los extremos 3' del brazo de reconocimiento A y 5' del brazo de reconocimiento T o en ambos. Tales regiones de nucleótidos se distinguen de la secuencia de reconocimiento de la SEGS en que no son complementarias a la secuencia elegida como diana del ARN diana. Se considera que tales secuencias no son parte de la secuencia de reconocimiento de la SEGS. Un ejemplo de semejante secuencia de nucleótidos adicional, en el extremo 5' del brazo de reconocimiento T, se muestra en la Figura 2.
Las moléculas de SEGS pueden ser fácilmente rastreadas en cuanto a la capacidad para promover a escisión, por la ARNasa P, del ARN diana utilizando el análisis descrito por Yuan y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:8006-8010 (1.992) o el análisis descrito más abajo.
Una SEGS y la subunidad de ARN catalítica de una ARNasa P pueden ser acopladas para formar una única molécula oligonucleotídica que posee tanto la función directora de la SEGS como la función de escisión del ARN catalítico de la ARNasa P. Semejante combinación, en una única molécula oligonucleotídica, es referida como secuencia guía interna de la ARNasa P (RIGS). Una RIGS puede ser utilizada para escindir una molécula de ARN diana de la misma manera que la SEGS.
La RIGS puede estar formada conectando una secuencia guía a una secuencia catalítica de la ARNasa P mediante cualquier método adecuado. Por ejemplo, una SEGS y una ARN catalítica de la ARNasa puede ser preparada en forma de moléculas separadas que después son acopladas covalentemente in vitro. Alternativamente, una RIGS completa puede ser sintetizada en forma de una única molécula, o bien mediante síntesis química, o bien mediante transcripción in vitro o in vivo de una molécula de ADN que codifica la SEGS y la secuencia catalítica de la ARNasa P conectadas. La conexión entre la SEGS y los dominios de la ARNasa P de una RIGS pueden adoptar cualquier forma que permita a los dominios escindir un ARN diana. Por ejemplo, los dos dominios podrían ser reunidos mediante un conector oligonucleotídico. Preferiblemente, el conector estará compuesto por nucleótidos ordinarios unidos por enlaces fosfodiéster. Los componentes de la SEGS y la secuencia catalítica de la ARNasa P pueden ser reunidos en cualquier orden, con la secuencia catalítica de la ARNasa P conectada a cualquiera de los extremos 3' o 5' del componente de la SEGS. Los métodos para la construcción y el uso de RIGS se describen en la solicitud PCT WO 95/24489 de la Universidad de Yale.
Las moléculas de SEGS también pueden ser regulables. Una molécula de SEGS regulable es una secuencia SEGS, como se ha descrito antes, conectada a una secuencia de unión a un ligando, colocando la actividad de la molécula de SEGS bajo el control de ese ligando y requiriendo la presencia del ligando para la activación y desactivación. Se construyen moléculas de ARN en la que una porción es capaz de unirse al ligando y la otra porción es una secuencia SEGS. Tras la selección de las moléculas que se unen al ligando, se produce un segundo proceso de selección en el que las moléculas de unión al ligando son analizadas en cuanto a su función catalítica en presencia o ausencia del ligando o "co-fármaco". De esta manera se seleccionan las moléculas de SEGS regulables para su uso en la escisión de un ARN diana en presencia de un ligando, o en la escisión de un ARN diana en ausencia de un ligando.
Este método y las moléculas de SEGS regulables son útiles en la escisión de una molécula de ARN diana de una manera controlada. Es particularmente útil cuando la molécula de ARN diana está presente en una célula en la que no es deseable destruir la célula huésped mediante la desactivación completa de estas moléculas de ARN. La formación, selección y uso de las moléculas de EGS regulables se describe completamente en las solicitudes PCT WO 94/13791 y WO 94/13833. Se pueden utilizar los mismos métodos para formar moléculas de SEGS de uso regulable y selectas.
Los métodos para producir o sintetizar moléculas de SEGS, y las secuencias de ADN que codifican las moléculas de SEGS que tienen una secuencia conocida, pueden ser sintetizadas rutinariamente utilizando la síntesis de ácidos nucleicos automatizada, por ejemplo, utilizando el método de la cianoetil-fosforoamidita en un Sintetizador de ADN modelo 392 de Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA) o un Pharmacia Oligo Pilot (Pharmacia, Piscataway, NJ). También se encuentran disponibles otros métodos para sintetizar moléculas de ácido nucleico (ver, por ejemplo, Ikuta y col., Ann. Rev. Biochem. 53:323-356 (1.984) (métodos del fosfotriéster y del fosfito-triéster); Narang y col.,
Methods Enzymol. 65:610-620(1.980) (método del fosfotriéster). Alternativamente, las moléculas de SEGS pueden ser sintetizadas transcribiendo moldes de ADN, por ejemplo con ARN polimerasa de T7 Milligan y col., Nucl. Acids Res. 15:8783 (1.987)). Las moléculas de SEGS también pueden ser sintetizadas en células colocando un vector que codifique y exprese las SEGS en las células.
B. Actividad de las Moléculas de SEGS
Un análisis de escisión in vitro que mide el porcentaje de ARN sustrato que queda tras la incubación con diferentes cantidades de una SEGS, en presencia de una cantidad no limitante de ARNasa P, se utiliza como indicador de la actividad potencial del complejo SEGS/ARNasa P. Los complejos SEGS/ARNasa P que manifiestan la actividad
in vitro más elevada se seleccionan para un ensayo adicional. El porcentaje de ARN que queda puede ser trazado como una función de la concentración de SEGS. La eficacia catalítica de un SEGS/ARNasa P puede ser expresada como k_{cat}/K_{m} (donde k_{cat} es la constante de velocidad de escisión y K_{m} es la constante de Michaelis), la constante de velocidad de segundo orden para la reacción de una SEGS libre y una molécula de ARN sustrato. Siguiendo los métodos de Heidenreich y Eckstein (J. Biol. Chem., 267:1904-1909 (1.992)), k_{cat}/K_{m} se determina utilizando la fórmula
-ln \ F/t = (k_{cat}/K_{m}) \ [C]
donde F es la fracción de sustrato que queda, t es el tiempo de reacción, y [C] es la concentración de SEGS.
Los constructos de SEGS preferidos son aquellos que unen y promueven la escisión de ARNasa P preferente del ARN sustrato de la hepatitis. Los constructos preferidos pueden ser seleccionados utilizando el análisis de escisión de la ribozima, como se describe en el Ejemplo 1, y determinando qué constructos son los más eficaces al mediar en la escisión con ARNasa P específica de la secuencia de ARN sustrato de la hepatitis como se determina mediante el valor de k_{cat}/K_{m}, como se ha descrito antes.
La actividad intracelular de SEGS puede ser sometida a ensayo utilizando células que expresan el ARN diana de interés. Por ejemplo, las moléculas de SEGS dirigidas a diversas regiones del ARN de HBV que tienen unidades NUNR como se ha descrito antes pueden ser sometidas a ensayo en células que expresan el ARN de HBV. Para esto, las SEGS pueden ser sometidas a ensayo en células HepG2.2.15, que expresan constitutivamente el ARN de HBV y las partículas de HBV completamente ensambladas (Sells y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 1005-1009 (1.987)), en cuanto a la inhibición de la replicación viral. Los análisis pueden ser realizados generalmente como describen Korba y Gerin (Antiviral Res. 19:55-70 (1.992)). Las moléculas de SEGS pueden ser liberadas a las células en forma de complejo con partículas lipídicas de hem, específicamente 1,2-dioleiloxi-3-(trimetilamonio)propano (DOTAP) y dioleil-fosfatidil-etanolamina (DOPE) conjugadas con hem (referido como DDH), durante diez días y el genoma de ADN de las partículas de HBV secretado a los medios puede ser analizado utilizando análisis de hibridación puntual.
Se pueden preparar partículas lipídicas de hem generalmente como sigue. Se disuelve hem (en forma de cloruro de Fe-protoporfirina IX, hemina) en etanol conteniendo NaOH 8,3 mM, y el material insoluble se sedimenta a 14 krpm durante 10 minutos. Para permitir la conjugación eficaz utilizando carbodiimida, el pH de la solución de hem es reducido mediante la adición de pequeños volúmenes de HCl sin precipitación de hem. En una reacción típica, se añaden 200 mg de hemina a 10 ml de etanol conteniendo NaOH 8,3 mM. Se añade HCl a la solución de hem sobrenadante para bajar el pH a 1,7, la solución de hem (conteniendo aproximadamente 1,6 mg de hem), 760 \mul (10 \mumoles) de DOPE (10 mg/ml) y se añaden 500 \mul de DCC (10 mg/ml) y se deja que la conjugación continúe durante la noche a la temperatura ambiente en la oscuridad. Se añaden 10 micromoles de DOTAP en cloroformo al DOPE conjugado con hem en un tubo de ensayo de vidrio y los lípidos se secan hasta una película fina, a vacío en una secadora de vórtice a 50ºC durante 20 minutos. Se añade un mililitro de NaCl 150 mM estéril a la película lipídica y la emulsión se somete a sonicación durante 30 minutos en un sonicador de baño Bransonic 1210, que se hace funcionar a 47 kHz a 20ºC, para dar una solución turbia. Las partículas de lípido se extruden a través de una membrana de policarbonato utilizando Lipex Extruder (Lipex Biomembranes, Vancouver, Canadá).
Las composiciones de SEGS/lípido se preparan llevando las soluciones que contienen las moléculas de SEGS a NaCl 150 mM, y las partículas de lípido DDH en NaCl 150 mM) se añaden a la solución de SEGS a una concentración final de 0,2 mg/ml. Tras incubar durante 15 minutos a la temperatura ambiente, se añade medio de cultivo y la mezcla de SEGS/lípido se diluye para obtener composiciones de SEGS con la concentración final de SEGS deseada. Se utiliza un volumen equivalente de NaCl 150 mM como control.
Los cultivos confluentes de células HepG2.2.15 se mantienen en placas de cultivo de fondo plano de 96 pocillos. Se utilizan placas por duplicado para cada tratamiento de SEGS. Se tratan un total de tres cultivos en cada placa con cada una de las composiciones de SEGS diluidas. Los cultivos se tratan con 10 dosis diarias consecutivas de las composiciones de SEGS. El medio se cambia diariamente con composiciones de SEGS de nueva aportación. El efecto de estos tratamientos se controla midiendo los niveles de ADN de HBV extracelular.
Las actividades anti-virales de estas SEGS pueden ser calculadas como la CE_{50}. La CE_{50} es la concentración de un compuesto a la cual hay una reducción del 50% en la cantidad de HBV producido en relación con las células tratadas con la composición de control. Como comparación, se puede medir en los mismos análisis el efecto anti-viral de 2',3'-ddC, un potente análogo nucleosídico anti-HBV conocido.
Se puede utilizar un análisis con rojo fenol que mide la viabilidad de las células que reciben las SEGS para determinar si hay alguna toxicidad (definida cono una depresión de más del 50% de los niveles de absorción de colorante observados en las células no tratadas) asociada con la administración de SEGS.
II. Moléculas de SEGS Resistentes a la Nucleasa A. Tipos de Modificaciones
Aunque los oligorribonucleótidos no modificados pueden funcionar como SEGS eficaces en un entorno libre de nucleasas, la corta vida media en suero y dentro de las células reduce su eficacia como agentes terapéuticos. Se pueden realizar modificaciones químicas que intensifiquen enormemente la resistencia a las nucleasas de las SEGS sin comprometer su función biológica de promotoras de la escisión del ARN diana mediada por la ARNasa P. En general, tales modificaciones se pueden realizar en la posición 2' de los nucleótidos de una SEGS, en los extremos 3' y 5' de una SEGS, y en los enlaces fosfato entre los nucleótidos de una SEGS. Por ejemplo, se pueden remplazar una o más bases de un constructo de SEGS por 2'-metoxi-ribonucleótidos, fosforotioato-desoxirribo-nucleótidos, o fosforotioato-ribonucleótidos tilizando métodos de síntesis de ácidos nucleicos asequibles. Los nucleótidos y oligonucleótidos modificados, y los métodos para su síntesis, son conocidos. Algunos de estos los describen Offensperger y col., EMBO J., 12:1257-1262 (1.993); WO 93/01286 de Rosenberg y col., Agrawal y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:7079-7083 (1.988); Sarin y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:7448-7794 (1.989); Shaw y col., Nucleic Acids Res, 19:747-750 (1.991); Orson y col., Nucl. Acids Res., 19:3435-3441 (1.991); Paolella y col., EMBO J., 11:1913-1919 (1.992); Pieken, y col., Science, 253-314-317 (1.991); Heidenreich y Eckstain, J. Biol. Chem, 267:1904-1909 (1.992); WO 91/17093 de Hybridon, Inc.; EP 0339842 de Ajinomoto Co., Inc.; WO 95/23225 de Ribozyme Pharmaceuticals, Inc.; WO 94/15619 de Johns Hopkins University; y Patente de los Estados Unidos 5.334.711 de Sproat y col.
Al describir los sustituyentes utilizados para modificar los nucleótidos, los oligonucleótidos y las SEGS, alquilo o grupo alquilo hace referencia a un hidrocarburo alifático saturado, incluyendo los grupos alquilo de cadena lineal, de cadena ramificada, y cíclicos. Para este uso se prefiere que tales grupos alquilo tengan de 1 a 12 carbonos. Es más preferido que tales grupos alquilo tengan de 1 a 6 carbonos. Es aún más preferido que tales grupos alquilo tengan de 1 a 2 carbonos. Es muy preferido que tales grupos alquilo tengan 1 carbono. Entre estos grupos alquilo también se pueden incluir uno o más grupos hidroxilo, uno o más grupos amino, o ambos. Tales grupos hidroxilo y amino pueden estar acoplados a cualquier átomo de carbono del grupo alquilo. Según se utiliza aquí, el término hidroxialquilo se utiliza para hacer referencia a un grupo alquilo que incluye uno o más grupos hidroxilo, el término aminoalquilo se utiliza para hacer referencia a un grupo alquilo que incluye uno o más grupos amino, e hidroxilaminoalquilo se utiliza para hacer referencia a un grupo alquilo que incluye uno o más grupos hidroxilo y uno o más grupos amino. Según se utiliza aquí, alilo o grupo alilo hace referencia a un hidrocarburo alifático insaturado, incluyendo grupos alilo de cadena lineal, de cadena ramificada y cíclicos. Para este uso se prefiere que tales grupos alilo tengan de 1 a 12 carbonos. Es más preferido que tales grupos alilo tengan de 1 a 6carbonos. Es aún más preferido que tales grupos alilo tengan 2 ó 3 carbonos. Es muy preferido que tales grupos alilo tengan 3 carbonos. También se pueden utilizar otros sustituyentes para modificar los nucleótidos, oligonucleótidos y SEGS descritos aquí, tales como arilo, alcarilo, y arilalquilo, donde arilo hace referencia a un grupo bencilo, alcarilo hace referencia a un grupo alquilo sustituido con un grupo arilo, y arilalquilo hace referencia a un grupo arilo sustituido con un grupo alquilo.
Utilizado aquí se pretende que el término modificación en referencia a los nucleótidos, oligonucleótidos y SEGS haga referencia a las diferencias químicas de un nucleótido u oligonucleótidos en relación con los nucleótidos y oligonucleótidos convencionales. El uso del término modificación aquí no pretende limitar la manera en la que son producidos los nucleótidos, oligonucleótidos o SEGS modificados. De un modo similar, se pretende que las referencias al reemplazo de un grupo químico de un nucleótido o SEGS haga referencia a las diferencias químicas de un nucleótido u oligonucleótido en relación con los nucleótidos y oligonucleótidos convencionales, y no se pretende que limiten la manera en la que son producidos los nucleótidos, los oligonucleótidos o las SEGS.
1. Modificaciones en los extremos 3' y 5'
Está bien documentado en la literatura actual que la degradación de análogos oligonucleotídicos es atribuible principalmente a las 3'-exonucleasas. Diversos estudios han demostrado que algunas modificaciones en 3' pueden disminuir enormemente la susceptibilidad a la nucleasa de estos análogos. Así, otro método para reducir la susceptibilidad a las 3'-exonucleasas es la introducción de una amina libre en el grupo hidroxilo 3'-terminal de la molécula de SEGS (ver, por ejemplo, Orson y col., Nucl. Acids Res., 19:3435-3441 (1.991)). Otra modificación 3'-terminal útil es el acoplamiento de un nucleótido terminal de timina de una SEGS con un enlace 3' a 3'. Semejante estructura es referida aquí como 3'-3'-nucleótido de timina o T(3'-3').
Las modificaciones en 3' preferidas son aquellas en las que el hidroxilo 3' de la Secuencia Guía Externa Corta es reemplazado por un grupo químico tal como -H, -O-R^{1}, -NH_{2}, -NH-R^{1}, -N-R^{1}_{2}, F, y 3'-nucleótido, donde cada R^{1} es independientemente alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, hidroxilaminoalquilo, alilo, -PR^{2}(O)-R^{2}, o 
\hbox{-PR ^{2} (S)-R ^{2} ,}
donde cada R^{2} es independientemente O, S, F, alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, hidroxil-aminoalquilo, alilo, 
\hbox{O-R ^{3} ,}
o 
\hbox{S-R ^{3} ,}
y donde cada R^{3} es independientemente alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, hidroxilaminoalquilo, o alilo. Son modificaciones 3' más preferidas aquellas en las que el hidroxilo 3' de la Secuencia Guía Externa Corta es reemplazado por un grupo químico tal como -H, -O-CH_{3}, -NH_{2}, -NH-CH_{3}, -N-(CH_{3})_{2}, F, -3'-nucleótido de timina, -OPO(O)-CH_{3}, -OPO(S)-CH_{3}, -OPO(O)OCH_{2}CH(OH)-CH_{2}NH_{2}, y -OPO(S)OCH_{2}CH(OH)-CH_{2}NH_{2}. Las modificaciones 3' más preferidas con aquellas en las que el hidroxilo 3' de la Secuencia Guía Externa Corta es reemplazado por -3'-nucleótido de timina, -OPO(O)OCH_{2}CH(OH)-CH_{2}NH_{2}, o -OPO(S)OCH_{2}CH(OH)-CH_{2}NH_{2}. Según se utiliza aquí, el hidroxilo 3' de una SEGS hace referencia al grupo hidroxilo que normalmente estaría presente en el carbono 3' del resto ribosa en el nucleótido 3' terminal de la SEGS. Según se utiliza aquí, el carbono 3' de una SEGS hace referencia al carbono 3' del resto ribosa en el nucleótido 3' terminal de la SEGS.
Aunque se prefiere que el extremo 5' de la SEGS tenga un grupo hidroxilo o fosfato, el extremo 5' puede ser modificado para incrementar la resistencia de la SEGS a las nucleasas. Las modificaciones en 5' preferidas son aquellas en las que el hidroxilo 5' de la Secuencia Guía Externa Corta es reemplazado por un grupo químico tal como -H, 
\hbox{-O-R ^{4} ,}
-NH_{2}, -NH-R^{4}, -N-R_{2}^{4}, y F, donde cada R^{4} es independientemente alquilo hidroxialquilo, aminoalquilo, hidroxilaminoalquilo, alilo, -PR^{5}(O)-R^{5}, o -PR^{5}(S)-R^{5}, donde cada R^{5} es independientemente O, S, F, alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, hidroxilaminoalquilo, alilo, O-R^{6}, o S-R^{6}, y donde cada R^{6} es independientemente alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, hidroxilamino-alquilo, o alilo. Las modificaciones 5' más preferidas son aquellas en las que el hidroxilo 5' de la Secuencia Guía Externa Corta es reemplazado por un grupo químico tal como -H, -O-CH_{3}, 
\hbox{-NH _{2} ,}
-NH-CH_{3}, -N-(CH_{3})_{2}, F, -OPO(O)-CH_{3}, -OPO(S)-CH_{3}, -OPO(O)OCH_{2}CH(OH)-CH_{2}NH_{2}, y -OPO(S)OCH_{2}CH(OH)-CH_{2}NH_{2}. Las modificaciones 5' más preferidas son aquellas en las que el hidroxilo 5' de la Secuencia Guía Externa Corta es reemplazado por -OPO(O)OCH_{2}CH(OH)-CH_{2}NH_{2}, o -OPO(S)OCH_{2}CH(OH)-CH_{2}NH_{2}. Según se utiliza aquí, el hidroxilo 5' de una SEGS hace referencia al hidroxilo que estaría normalmente presente en el carbono 5' el resto ribosa del nucleótido 5' terminal de la SEGS al cual estaría anclado normalmente un grupo fosfato. Según se utiliza aquí, el carbono 5' de una SEGS hace referencia al carbono 5' del resto ribosa en el nucleótido 5' terminal de la SEGS. Otra modificación útil es el anclaje covalente de un agente intercalante, tal como un derivado de acridina, al fosfato 5' terminal (por ejemplo, utilizando un puente de pentametileno) (ver, por ejemplo, Maher y col., Science, 245:725-730 (1.989); Grigoriev y col., J. Biol. Chem., 267:3389-3395 (1.992)). En WO 95/23225 se describen modificaciones químicas para incrementar la estabilidad de las ribozimas, tales como la introducción de un grupo alquilo en el carbono 5' de un azúcar nucleosídico o nucleotídico. Tales modificaciones también pueden ser utilizadas en moléculas de SEGS. 2. Modificaciones en la posición 2' de los nucleótidos
Otra clase de modificaciones químicas que se espera que sea útil es la modificación del grupo OH 2' de un radical ribosa de un nucleótido, que se ha demostrado que es crítico para la actividad de diversas nucleasas intracelulares y extracelulares. Las modificaciones en 2' típicas son la síntesis de 2'-O-Metil-oligonucleótidos (Paolella y col., EMBO J., 11:1913-1919, 1.992) y de 2'-fluoro y 2'-amino-oligonucleótidos (Pieken, y col., Science, 253:314-317 (1.991); Heidenreich y Eckstain, J. Biol. Chem, 267:1904-1909 (1.992)). Las moléculas de SEGS también pueden contener desoxirribonucleótidos. Tales sustituciones mejoran la resistencia a las nucleasas eliminando el grupo OH 2' crítico. En WO 95/23225 se describen 2'-desoxi-2'-alquilnucleótidos que pueden estar presentes para aumentar la estabilidad de los oligonucleótidos.
Las modificaciones en 2' preferidas son aquellas en las que el grupo hidroxilo 2' de un nucleótido es reemplazado por un grupo químico tal como -H, -O-R^{7}, -NH_{2}, -NH-R^{7}, -N-R^{7}_{2}, F, y -2'-nucleótido, donde cada R^{7} es independientemente alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, hidroxilaminoalquilo, alilo, -PR^{8}(O)-R^{8}, o -PR^{8}(S)-R^{8}, donde cada R^{8} es independientemente O, S, F, alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, hidroxilamino-alquilo, alilo, O-R^{9}, o S-R^{9}, y donde cada R^{9} es independientemente alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, hidroxilaminoalquilo, o alilo. Las modificaciones 2' preferidas son aquellas en las que el grupo hidroxilo 2' de un nucleótido es reemplazado por un grupo químico tal como -H, -O-CH_{3}, -NH_{2}, -NH-CH_{3}, -N-(CH_{3})_{2}, F, -OCH_{2}-CH=CH_{2}, -OPO(O)-CH_{3}, y -OPO(S)-CH_{3}. La modificación 2' más preferida es aquella en la que el hidroxilo 2' de un nucleótido es reemplazado por -O-CH_{3}.
3. Modificaciones de las conexiones fosfato
La modificación de los grupos fosfato que conectan los nucleótidos en la SEGS también puede ser utilizada para aumentar la resistencia de las SEGS a las nucleasas. Entre las modificaciones típicas para este propósito se incluyen el reemplazamiento de uno o ambos átomos de oxígeno libre, azufre o halógeno. Los átomos de oxígeno libre, o un átomo de azufre, si está presente, también puede ser conectado a grupos químicos tales como alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, hidroxilaminoalquilo, o alilo. Los ejemplos de tales sustituciones, tales como el uso de los nucleótidos sustituidos con dihalofosfonato en 3' y/o 5' (por ejemplo, nucleótidos sustituidos con 3' y/o 5'-CF_{2}-fosfonato), se describen en WO 95/23225. Entre los grupos conectores de fosfato modificados preferidos para su uso en SEGS se incluyen -OPR^{10}(O)O-, -OPR^{10}(S)O-, y -OPO(S)O-, donde R^{10} es alquilo, hidroxilaquilo, aminoalquilo, hidroxilaminoalquilo, alilo, -O-R^{11}, -NH_{2}, -NH-R^{11}, -N-R^{11}_{2}, o F, donde cada R^{11} es independientemente alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, hidroxilaminoalquilo, o alilo. Entre los grupos conectores de fosfato modificados más preferidos para su uso en SEGS se incluyen -OPR^{12}(O)O-, -OPR^{12}(S)O-, y -OPO(S)O-, donde R^{12} es -CH_{3}, -O-CH_{3}, -OCH_{2}-CH=CH_{2}, -NH_{2}-NH-CH_{3}, -N-(CH_{3})_{2}, o F. El grupo conector de fosfato modificado más preferido para su uso en SEGS es -OPO(S)O-, que es referido comúnmente como fosforotioato.
Otra modificación útil es la metilación de las bases de citosina que pueden estar presentes en la secuencia. La estabilidad de los híbridos SEGS/ARN diana se puede incrementar utilizando nucleótidos modificados que dan como resultado oligonucleótidos con un emparejamiento de bases más fuerte al ARN diana. Por ejemplo, los nucleótidos de propinilpirimida C-5 aumentan los enlaces de hidrógeno entre ácidos nucleicos (Froehler y col., Tetrahedron Letters 33:5307-5310 (1.992)).
El grado en el que las modificaciones afectan a la eficacia con la que una molécula de SEGS promueve la escisión mediada por ribozimas del ARN diana puede ser fácilmente determinada utilizando el análisis de escisión descrito antes.
B. Moléculas de SEGS Quiméricas
Las modificaciones anteriores pueden ser utilizadas en toda la molécula de SEGS, en regiones limitadas de una molécula de SEGS y/o en combinaciones que dan como resultado quimeras de moléculas de SEGS modificadas. Se espera que todos los nucleótidos de una SEGS puedan ser modificados químicamente sin reducir significativamente su capacidad para promover la escisión de un ARN diana mediada por ARNasa P. Por ejemplo, se ha descubierto que los nucleótidos modificados con 2'-O-metilo pueden ser utilizados en toda una SEGS sin una pérdida significativa de actividad de búsqueda de la diana de la ARNasa P.
El grado en el cual las modificaciones afectan a la eficacia con la cual la molécula de SEGS modificada promueve la escisión de un ARN diana mediada por la ARNasa P puede ser fácilmente determinada utilizando el análisis de escisión descrito antes. Las moléculas de SEGS modificadas químicamente pueden ser clasificadas según el nivel de actividad de escisión de la ribozima promovido por la SEGS modificada cuando se compara con la actividad de escisión de la ribozima promovida por una SEGS no modificada, esto es, una molécula de SEGS que tiene la misma secuencia de nucleótidos que la SEGS modificada pero que está formada por ribonucleótidos no modificados, enlaces fosfodiéster no modificados, y extremos 3' y 5' no modificados. Esta comparación proporciona la actividad de escisión de la ribozima relativa promovida por la molécula de SEGS modificada, que es expresada preferiblemente como un porcentaje de la actividad de escisión de la ribozima promovida por la molécula de SEGS no modificada. Las moléculas de SEGS modificadas pueden ser divididas en clases basándose en estos niveles de actividad. De este modo, las moléculas de SEGS modificadas pueden ser divididas, por ejemplo, en cuatro clases: (1) moléculas de SEGS modificadas que promueven más del 70% de la actividad de escisión de la ribozima promovida por una SEGS no modificada, (2) moléculas de SEGS modificadas que promueven del 50% al 70% de la actividad de escisión de la ribozima promovida por una SEGS no modificada, (3) moléculas de SEGS modificadas que promueven del 25% al 50% de la actividad de escisión de la ribozima promovida por una SEGS no modificada, y (4) moléculas de SEGS modificadas que promueven menos del 25% de la actividad de escisión de la ribozima promovida por una SEGS no modificada. Las moléculas de SEGS modificadas preferidas promueven al menos un 25% de la actividad de escisión de la ribozima promovida por una SEGS no modificada. Las moléculas de SEGS modificadas más preferidas promueven al menos un 50% de la actividad de escisión de la ribozima promovida por una SEGS no modificada. Las moléculas de SEGS modificadas muy preferidas promueven al menos un 70% de la actividad de escisión de la ribozima promovida por una SEGS no modificada.
III. Vectores de Clonación y Expresión
Entre los vectores preferidos para introducir moléculas de SEGS en células de mamífero se incluyen vectores virales, tales como retrovirus, que introducen ADN que codifica una molécula de SEGS directamente en el núcleo en el que el ADN es transcrito después para producir la molécula de SEGS codificada.
Los ejemplos de los métodos para utilizar vectores retrovirales para la terapia génica se describen en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.868.116 y 4.980.286; las solicitudes PCT WO 90/02806 y WO 89/07136; y Mulligan, Science 260:926-932 (1.993).
Se puede diseñar vectores retrovirales defectuosos, que incorporan su propia secuencia de ARN en forma de ADN en el cromosoma del huésped para incorporar una SEGS en las células de un huésped, donde las copias de la SEGS serán elaboradas y liberadas en el citoplasma o son conservadas en el núcleo para interaccionar con las secuencias de nucleótidos diana del ARN de la hepatitis.
Las células madre de la médula ósea y las células hematopoyéticas son eliminadas y reemplazadas fácilmente relativamente de los humanos, y proporcionan una población auto-regenerativa para la propagación de los genes transferidos. Tales células pueden ser transfectadas in vitro o in vivo con vectores basados en virus que codifican las moléculas de SEGS. Cuando se realiza la transfección in vitro de células madre, una vez que las células transfectadas empiezan a producir las moléculas de SEGS concretas, las células pueden ser añadidas de nuevo al paciente para establecer poblaciones clónicas completas de células que están expresando la SEGS y son por lo tanto resistentes a la infección viral, la transformación, y otras alteraciones.
Como ejemplo, un vector utilizado para clonar y expresar secuencias de ADN que codifican constructos podría incluir:
1. Un sitio de clonación en el cual insertar una secuencia de ADN que codifica una molécula de SEGS que va a ser expresada.
2. Un origen de replicación de mamífero (opcional) que permite la replicación episómica (no integrativa), tal como el origen de replicación derivado del virus de Epstein-Barr.
3. Un origen de replicación funcional en células bacterianas para producir cantidades requeridas del ADN que codifica los constructos de SEGS, tal como el origen de replicación derivado del plásmido pBR322.
4. Un promotor, tal como uno derivado del virus del Sarcoma de Rouss (RSV), citomegalovirus (CMV), o el promotor del gen U6 de mamíferos (un promotor de la ARN polimerasa III) que dirige la transcripción en células de mamífero de la secuencia de ADN insertada que codifica el constructo de SEGS que va a ser expresado.
5. Un marcador de selección de mamíferos (opcional), tal como una resistencia a la neomicina o a la higromicina, que permite la selección de células de mamífero que son transfectadas con el constructo.
6. Un marcador de resistencia a antibióticos bacteriano, tal como la resistencia a la neomicina o a la ampicilina, que permite la selección de células bacterianas que son transformadas con el vector plasmídico.
Un vector preferido para liberar y expresar moléculas de SEGS in vivo utiliza un promotor de la ARN polimerasa III (pol III) para la expresión. Tales promotores pueden producir transcritos constitutivamente sin expresión específica del tipo de célula. Los promotores Pol III también generan transcritos que pueden ser diseñados para que permanezcan en el núcleo de la célula, la localización de muchas moléculas de ARN diana. Se prefiere utilizar una unidad de transcripción de pol III completa, incluyendo un promotor pol III, un señal de formación de caperuza, y una secuencia de terminación. los promotores pol III, y otras señales de transcripción de pol III, se encuentran presentes en los genes del ARNt, genes del ARN 5S, genes del ARN nuclear pequeños, y genes de ARN citoplásmico pequeños. Los promotores de pol III preferidos para su uso en los vectores de expresión de SEGS son el promotor del gen U6 nuclear pequeño humano y los promotores del gen del ARNt. El uso de las señales de transcripción del gen U6 para producir moléculas de ARN cortas in vivo es descrito por Noonberg y col., Nucleic Acids Res., 22:2830-2836 (1.995), y el uso de las señales de transcripción de ARNt es descrito por Thompson y col. Nucleic Acids Res., 23:2259-2268 (1.995).
Muchos promotores de pol III son internos, esto es, están dentro de la unidad de transcripción. Así, estos transcritos de pol III incluyen secuencias promotoras. Para que sean útiles para la expresión de las moléculas de SEGS, estas secuencias promotoras no deben interferir en la estructura o función de la SEGS. Puesto que las moléculas de SEGS derivan de moléculas de ARNt, las secuencias promotoras del gen del ARNt pueden ser fácilmente incorporadas a las moléculas de SEGS. El promotor interno de los genes del ARNt aparece en dos partes, una caja A y una caja B. En las moléculas de ARNt, las secuencias de la caja A están generalmente presentes en el lazo D y la mitad del tallo D de las moléculas de ARNt, y las secuencias de la caja B están generalmente presentes en el lazo T y los nucleótidos proximales del tallo T. Las moléculas de SEGS carecen de la mayoría de estas estructuras. Sin embargo, las secuencias tanto de la caja B como de la caja A pueden ser anexadas al extremo 5' de la SEGS, después del brazo de reconocimiento T, de manera que se mantenga el espaciamiento apropiado entre la caja A y la caja B.
El promotor del gen U6 no es interno (Kunkel y Pederson, Nucleic Acids Res. 18:7371-7379 (1.989); Kunkel y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8575-8579 (1.987); Reddy y col., J. Biol. Chem. 262:75-81 (1.987)). Los sistemas promotores de pol III adecuados útiles para la expresión de las moléculas de SEGS son descritos por Hall y col., Cell 29:3-5 (1.982), Nielsen y col., Nucleic Acids Res. 21:3631-3636 (1.993), Fowlkes y Shenk, Cell 22:405-413 (1.980), Gupta y Reddy, Nucleic Acids Res. 19:2073-2075 (1.990), Kickoefer y col., J. Biol. Chem. 268:7868-7873 (1.993), y Romero y Blackburn, Cell 67:343-353 (1.991). El uso de promotores de pol III para la expresión de ribozimas también se describe en WO 95/23225 por Ribozyme Pharmaceuticals, Inc.
IV. Terapia A. Composiciones Farmacéuticas
Las moléculas de SEGS pueden ser utilizadas directamente combinadas con un portador farmacéuticamente aceptable para formar una composición farmacéutica adecuada para tratar a un paciente. Alternativamente, una SEGS puede ser liberada por medio de un vector que contiene una secuencia que codifica y expresa la molécula de SEGS específica para un ARN concreto.
La liberación directa implica la inserción de moléculas de SEGS pre-sintetizadas en las células diana, normalmente con la ayuda de complejos lipídicos (liposomas) para facilitar la travesía de la membrana celular y de otras moléculas, tales como anticuerpos u otros ligandos pequeños tales como hem u otra porfirina o ftalocianina, para maximizar la búsqueda de la diana. El complejo de porfirina con oligonucleótidos, protege a la vez que aumenta la liberación a las células tales como los hepatocitos. Debido a la sensibilidad del ARN a la degradación, en muchos casos, las moléculas de SEGS liberadas directamente pueden estar modificadas químicamente, haciéndolas resistentes a las nucleasas, como se ha descrito antes. Esta metodología de la liberación permite un control más preciso de la dosis terapéutica.
La liberación mediada por vectores implica la infección de las células diana con un sistema auto-replicante o no replicante, tal como un vector viral modificado o un plásmido, que produce una gran cantidad de la SEGS codificada en una secuencia portada por el vector. La búqueda como diana de las células y el mecanismo de entrada pueden ser proporcionados por el virus, o, si se está utilizando un plásmido, se pueden utilizar métodos similares a los descritos para la liberación directa de las moléculas de SEGS. La liberación mediada por vectores produce una cantidad sostenida de moléculas de SEGS. Es sustancialmente más barato y requiere una administración menos frecuente que una liberación directa tal como una inyección intravenosa de las moléculas de SEGS.
El método de liberación directa puede ser utilizado durante las fases críticas agudas de infección. Preferiblemente, se utiliza la inyección intravenosa o subcutánea para liberar directamente moléculas de SEGS. Es esencial que se libere una cantidad eficaz de oligonucleótidos de forma que se minimice la degradación del oligonucleótido antes de que éste alcance el sitio diana pretendido.
Muy preferiblemente, el portador farmacéutico libera específicamente las SEGS en las células afectadas. Por ejemplo, el virus de la hepatitis B afecta a las células del hígado, y por lo tanto, un portador farmacéutico preferido libera las moléculas de SEGS anti-hepatitis en las células del hígado.
El HBV, un miembro de un grupo de virus que contienen ADN pequeño que causa infecciones no citopáticas persistentes del hígado, es un agente infeccioso de humanos que se encuentra en todo el mundo y que se perpetúa entre los humanos en un gran reservorio de portadores crónicos. Se estima de aproximadamente el 6-7% de la población de la tierra está infectada (300 millones de portadores). La prevalencia de la infección no es uniforme en todo el mundo. Existe un gradiente geográfico en la distribución del HBV. Es mínimo en Norte América y Europa del Este, donde el virus puede ser detectado en un 0,1 a 0,5% de la población, y máximo de el Sudeste de Asia y en Africa sub-Sahariana, donde la frecuencia de infección puede variar entre el 5 y el 20% de la población. Esta distribución sesgada es paralela a la del carcinoma hepatocelular y proporciona una fuerte evidencia epidemiológica de una asociación entre la infección por HBV crónica y este tipo de malignidad.
La hepatitis B tiene una gran importancia médica debido a que es probablemente la causa más común de enfermedad crónica del hígado, incluyendo el carcinoma hepatocelular en humanos. Los hepatocitos infectados secretan continuamente partículas virales que se acumulan a elevados niveles en la sangre. Estas partículas son de dos tipos: (i) partículas no infecciosas que constan de un exceso de proteína de la envuelta viral (HBsAg) y que no contienen ácido nucleico (en concentraciones de hasta 10^{3} partículas/ml de sangre), y (ii) partículas que contienen ADN, infecciosas (partículas de Dane) que constan de un núcleo de la nucleocápsida de 27 nm (HbcAg) alrededor del cual se ensambla una envuelta que contiene las principales proteínas, carbohidratos y lípidos de la envuelta viral, presentes a concentraciones inferiores (10^{9} partículas/ml de sangre). El virus de la hepatitis B humana es un miembro de la familia Hepadna Viridae, entre cuyos parientes próximos se incluyen el virus de la hepatitis de la marmota de América (WHV), el virus de la hepatitis del pato (DHV), y el virus de la hepatitis de la ardilla terrera (GHV) (Robinson (1.990)). Como los retrovirus, el hepadnavirus utiliza la transcripción inversa de su genoma de ADN de 3,2 kb (Pugh (1.990)). El genoma del virus de la hepatitis B es circular y parcialmente de hebra sencilla, conteniendo una hebra más incompleta. La hebra más incompleta forma un complejo con una ADN polimerasa en el virión que se ha demostrado que alarga la hebra más utilizando la hebra menos completa como molde. Estas características morfológicas y estructurales distinguen el virus de la hepatitis B de todas las clases de virus que contienen ADN conocidas.
El ciclo de replicación de los virus de la hepatitis B también es sorprendentemente diferente de otro virus que contienen ADN y sugiere una íntima relación con los retrovirus que contienen ARN. La característica inusual principal es el so de una copia de ARN del genoma como intermedio en la replicación del genoma de ADN. Los genomas de ADN infectantes se convierten en una forma de doble hebra que sirve como molde para la transcripción del ARN. Se sintetizan múltiples transcritos de ARN a partir de cada genoma infectante, que tienen o bien función de mensajero o bien función replicativa del ADN. Los últimos, denominados "pre-genomas", son precursores de los genomas de ADN progenie debido a que están ensamblados en los núcleos de la nucleocápsida y son transcritos de forma inversa en ADN antes de ser revestidos y exportados de la célula. Así cada virión maduro contiene una copia de ADN del pre-genoma de ARN y una ADN polimerasa.
El primer ADN que se va a sintetizar tiene una polaridad de la hebra menos y se inicia en un sitio único del mapa genético viral. Las hebras menos de ADN naciente muy pequeñas (menos de 30 nucleótidos) son conectadas covalentemente a una proteína, y es probable que actúen como cebador para la síntesis de ADN de hebra menos. El crecimiento del ADN de hebra menos está acompañado por una degradación coordinada del pre-genoma de manera que el producto es un ADN de hebra sencilla en toda su longitud, en vez de un híbrido de ARN:ADN. La síntesis del ADN de hebra más ha sido observada sólo una vez completada la hebra menos, y se inicia en un sitio único cerca del extremo 5' de la hebra menos. La elongación completa de la hebra más no es un requerimiento para el revestimiento y la exportación de los núcleos de la nucleocápsida, así la mayoría de los viriones extracelulares contienen hebras más incompletas y un espacio de hebra sencilla grande en sus genomas. Debido a que el genoma del virus de la hepatitis es autónomo y no utiliza una ruta ADN-a-ADN para su replicación, la replicación intracelular continua de su genoma es esencial para el mantenimiento del virus.
Los antígenos de superficie del virus de la hepatitis B (HbsAg), que componen la envuelta viral, son polipéptidos codificados por los genes pre-S1, pre-S2 y S del virus. La proteína principal es el producto del gen S de 226 aminoácidos derivado de un mensaje subgenómico de 2,1 kb. Como se demuestra mediante el siguiente ejemplo, se han diseñado SEGS que se dirigen al ácido nucleico de HBV, e inhiben la replicación, conduciendo a una disminución de las cargas de virus.
B. Liberación de Moléculas de SEGS
Se puede emplear dos métodos de liberación, (1) la liberación de moléculas de SEGS sintéticas, o (2) la liberación de un vector que expresa moléculas de SEGS de una manera transitoria. El método de elección será determinado en estudios clínicos previos, utilizando la metodología normalizada, y es posible que puedan ser utilizadas combinadas. Ambas pueden ser liberadas eficazmente, por ejemplo, utilizando preparaciones de liposomas catiónicos.
Se encuentran disponibles una variedad de métodos sin vectores para la liberación de moléculas de SEGS en células. Por ejemplo, en general, las moléculas de SEGS, o las secuencias de ADN que codifican las moléculas de SEGS, pueden ser incorporadas dentro o sobre micropartículas. Según se utiliza aquí, entre las micropartículas se incluyen liposomas, virosomas, microesferas y microcápsulas formadas por polímeros sintéticos y/o naturales. Los métodos para elaborar microcápsulas y microesferas son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen la evaporación del disolvente, el moldeo del disolvente, el secado de rocío y el aumento del disolvente. Entre los ejemplos de los polímeros útiles que se pueden incorporar en las diversas micropartículas se incluyen polisacáridos, polianhídridos, poliortoésteres, polihidróxidos y proteínas y péptidos.
Los liposomas pueden ser producidos mediante métodos normalizados tales como los referidos por Kim y col., Biochim. Biophys. Acta, 1104:95-101 (1.92); y Lee y col., Biochim. Biophys. Acta., 1103:185-197 (1.992); Wang y col., Biochem., 28:9508-9514 (1.989)). Las moléculas de SEGS o el ADN que codifica tales moléculas, pueden ser encapsulados dentro de liposomas cuando las moléculas están presentes durante la preparación de las micropartículas. Brevemente, los lípidos de elección, disueltos en un disolvente orgánico, se mezclan y se secan sobre la superficie de un tubo de vidrio a vacío. La película de lípido se rehidrata utilizando una solución acuosa tamponada de las moléculas de SEGS, el ADN que codifica las moléculas de SEGS que va a ser encapsulado, y las vesículas lipídicas hidratadas resultantes o liposomas que encapsulan el material pueden ser lavadas después mediante centrifugación y pueden ser filtradas y almacenadas a 4ºC. Este método ha sido utilizado para liberar moléculas de ácido nucleico en los núcleos y el citoplasma de células de la línea celular de leucemia MOLT-3 (Thierry y Dritschilo, Nucl. Acids Res., 20:5691-5698 (1.992)). Alternativamente, las moléculas de SEGS, o el ADN que codifica tales moléculas, pueden ser incorporadas dentro de las micropartículas, o unidas al exterior de las micropartículas, o bien iónicamente o bien covalente-
mente.
Los liposomas catiónicos o microcápsulas son micropartículas que son particularmente útiles para liberar compuestos cargados negativamente tales como compuestos a base de ácidos nucleicos, que se pueden unir iónicamente a la superficie externa cargada positivamente de estos liposomas. Se ha demostrado previamente que diversos liposomas catiónicos son eficaces en la liberación de ácidos nucleicos o de complejos ácido nucleico-proteína en las células tanto in vitro como in vivo, como informan Felgner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417 (1.987); Felgner, Advanced Drug Delivery Reviews, 5:163-187 (1.990); Clarenc y col., Anti-Cancer Drug Design, 8:81-94 (1.993). Los liposomas catiónicos o microcápsulas pueden ser preparados utilizando mezclas que incluyen uno o más lípidos que contienen un grupo lateral catiónico en una cantidad suficiente de manera que los liposomas o microcápsulas formados a partir de la mezcla posean una carga neta positiva que se unirá iónicamente con los compuestos cargados negativamente. Entre los ejemplos de los lípidos cargados positivamente que se pueden utilizar para producir liposomas catiónicos se incluye el aminolípido dioleil-fosfatidil-etanolamina (PE), que posee un grupo de cabeza amino cargado positivamente; la fosfatidilcolina (PC), que posee grupos de cabeza cargados positivamente que no son aminas primarias; y el N[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trietilamonio ("DOTMA", ver Felgner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417 (1.987); Felgner y col., Nature, 337:387-388 (1.989); Felgner, Advanced Drug Delivery Reviews, 5:163-187 (1.990)).
Una forma preferida de micropartícula para la liberación de moléculas de SEGS son las micropartículas que portan hem. En estas micropartículas, se intercala hem dentro o conjugado covalentemente con la superficie externa de las micropartículas. Las micropartículas que portan hem ofrecen una ventaja ya que puesto que se unen y son absorbidas preferentemente por las células que expresan el receptor de hem, tales como los hepatocitos, la cantidad de fármaco u otro compuesto requerida para una dosis eficaz se reduce significativamente. Semejante liberación dirigida también puede reducir los efectos secundarios generalizados que se originan del uso de concentraciones de fármaco relativamente elevadas en los métodos de liberación no dirigidos. Los lípidos preferidos para formar micropartículas que portan hem son 1,2-dioleoiloxi-3-(trimetilamonio)propano (DOTAP) y dioleil-fosfatidil-etanolamina (DOPE). La producción y uso de micropartículas que portan hem se describen en la solicitud PCT WO 95/27480 de Innovir.
El ácido nucleico también puede estar encapsulado en o revistiendo los liposomas catiónicos que pueden ser inyectados intravenosamente en un mamífero. Este sistema puede ser utilizado para introducir ADN en las células de múltiples tejidos de ratones adultos, incluyendo el endotelio y la médula ósea, donde residen las células hematopoyéticas (ver, por ejemplo, Zhu y col., Science, 261:209-211 (1.993)).
Los liposomas que contienen o bien moléculas de SEGS o bien ADN que codifica estas moléculas, pueden ser administrados sistémicamente, por ejemplo mediante administración intravenosa o intraperitoneal, en una cantidad eficaz para la liberación de las moléculas de SEGS anti-hepatitis en células elegidas como diana. Entre otras posibles rutas se incluyen la transdérmica o la oral, cuando se utilizan junto con micropartículas apropiadas. Generalmente, la cantidad total de ácido nucleico asociado a liposomas administrada a un individuo será menor que la cantidad del ácido nucleico no asociado que se debe administrar para el mismo efecto deseado o pretendido.
Otro sistema de liberación útil es un complejo de la SEGS con una porfirina catiónica, que protege así como dirige la SEGS a los hepatocitos después de la inyección. El sistema es extremadamente útil, puesto que los dos componentes principales son una porfirina que tiene una carga neta global positiva, y la SEGS que va a ser liberada, que tiene una carga neta global negativa. La porfirina se une a la SEGS que va a ser liberada y dirige selectivamente el compuesto a las células que se unen preferentemente a la porfirina.
Las composiciones que incluyen los diversos polímeros tales como los polímeros de ácido poliláctico y ácido poliglicólico, polietileno, y poliortoésteres y las moléculas de SEGS anti-hepatitis, o el ADN que codifica tales moléculas, pueden ser liberadas localmente en las células apropiadas utilizando un catéter o una jeringa. Entre otros medio de liberación de tales composiciones localmente en las células se incluyen las bombas de infusión (por ejemplo, de Alza Corporation, Palo Alto, California) o la incorporación de las composiciones en implante poliméricos (ver, por ejemplo, Johnson y Lloyd-Jones, eds. Drugs Delivery Systems (Chichester, Inglaterra; Ellis Horwood Ltd., 1.987), que pueden efectuar una liberación sostenida de las composiciones de SEGS anti-hepatitis terapéuticas en el área inmediata al implante.
Las SEGS también pueden ser aplicadas tópicamente, por ejemplo para el tratamiento de la psoriasis o las alteraciones oftálmicas, en un portador tópico adecuado tal como una pomada, un ungüento, una solución salina tamponada, u otro portador tópico u oftálmico farmacéuticamente aceptable.
Los siguientes ejemplos se presentan con fines ilustrativos y como pauta adicional.
Ejemplos Ejemplo 1 Síntesis de Oligonucleótidos, plásmidos y Reacciones de Transcripción para la Construcción y Análisis de Moléculas de SEGS
Oligonucleótidos: Se prepararon oligorribonucleótidos (ARN) según el método de Ogilvie y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5764-5768 (1.988), empleando 3'-CE-fosforamiditas de 5'-dimetoxitritil-2'-metilsilil-ribonucléosidos (Biosearch, MA, o ChemGenes Corp., MA). Los 2'-O-metil-oligorribonucleótidos (2'-O-metil-ARN) fueron sintetizados utilizando protocolos de síntesis de ARN, y las amiditas fueron adquiridas o bien de Biosearch o bien de Glen Research. Las síntesis fueron realizadas en un sintetizador de ADN/ARN Millipore 8909 Experdite. Se utilizaron vidrios de poro controlado (CPG) como matriz del soporte sólido. El tiempo de acoplamiento fue de aproximadamente 13 minutos. Para las síntesis de los análogos que contenían conexiones fosforotioato, la oxidación fue reemplazada por sulfuración que se llevó a cabo utilizando un reactivo de Beaucage durante 10 a 15 minutos. El rendimiento medio del acoplamiento, analizado mediante medición del tritilo, era del 96 al 98%.
La escisión del soporte, la base y la desprotección del fosfato, y la eliminación del grupo 2'-O-TBDMS se realizaron como describen Scaringe y col., Nucleic Acids Research, 18:5433-5441 (1.990). Los oligonucleótidos brutos en solución de TBAF fueron sometidos a eliminación de las sales en una columna Sephadex G-25 antes de la purificación electroforética normalizada utilizando geles de poliacrilamida/urea 7 M al 15-20%. Las bandas producto fueron visualizadas mediante sombreado UV, corte, y eluidas de la matriz del gel. Los oligómeros eluidos fueron finalmente sometidos a separación de las sales en un cartucho Sep-Pak C_{18} y cuantificados mediante medida de la DO_{260}. La homogeneidad de los análogos purificados fue verificada mediante marcaje del extremo 5' o HPLC analítica. Estos pueden ser caracterizados adicionalmente mediante análisis de la composición de bases, como describen Seela y Kaiser, Nucleic Acids Res., 15:3113-3129 (1.987), y el contenido de las conexiones tioato cuantificado mediante 
\hbox{RMN-P ^{31} .}
Las modificaciones terminales del extremo 3' se realizaron comenzando la síntesis a partir de un soporte de CPG modificado conteniendo un grupo amino.
Análisis de Escisión por ARNasa P: Las reacciones de escisión se llevaron a cabo generalmente según el procedimiento descrito por Yuan y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:8006-8010, (1.992). Brevemente, se realizaron reacciones con el sustrato pequeño hasta un volumen total de 31 \mu en Tris-HCl 50 mM pH 7,4, MgCl_{2} 10 mM, KCl 25 mM, EDTA 0,1 mM, con una concentración de SEGS de 200-400 nM, y una concentración de moléculas diana de 50 mM o menos. Las reacciones fueron incubadas a 37ºC durante 1 hora. Tras la incubación, la solución de reacción se mezcló con tampón de carga (formamida al 98%, EDTA 10 mM, azul bromofenol al 0,025%). El sustrato escindido fue separado del no escindido mediante electroforesis en un gel de acrilamida al 15% conteniendo urea 7 M. Las bandas fueron cuantificadas en un Molecular Dynamics Phosphorimager.
Las bandas correspondientes al sustrato de ARN y los dos productos de la escisión resultantes fueron contados a partir del gen seco utilizando un analizador de gel Betascope (Betagen).
La ARNasa P purificada mediante cromatografía en Sepharose DEAE y centrifugación en gradiente de densidad de glicerol como describen Bartkiewicz y col., Genes Dev. 3:488-499 (1.989).
Para someter a ensayo la escisión con moléculas de ARN diana más largas generadas mediante transcripción, se utilizaron diferentes condiciones de reacción. Las reacciones en un volumen total de 10 \mul contenían Tris-HCl 40 mM (pH 7,4), MgCl_{2} 10 mM, espermidina 1 mM, ditiotreitol 10 mM, 0,05 \mug/\mul de seralbúmina bovina libre de nucleasa, Triton-X100 al 0,01% (v/v), 0,8 Unidades/\mul de RNASIN, ATP 0,2 mM, GTP 0,2 mM, UTP 0,2 mM, CTP 0,2 mM, 0,1 \muCi/\mul de [\alpha^{32}P] CTP, m^{7}G(5')pppG 2 mM, 0,06 \mug/\mul de ARN de levadura, KCl 25 mM, 3 Unidades de ARN polimerasa de T7, SEGS 250 nM, 1 \mul de ARNasa P humana y 3 ng/\mul de plásmido linealizado. Las reacciones fueron iniciadas mediante la adición de plásmido linealizado e incubadas durante 30 minutos a 37ºC. Las reacciones fueron terminadas mediante la adición de 10 \mul de formamidina al 80%, EDTA al 10%, azul bromofenol al 0,1%. Después de calentar durante 2 minutos a 90ºC, las muestras fueron sometidas a electroforesis durante 2 horas a 48 watios en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 5%. Tras secar a vacío durante 1 hora a 60ºC, el gel fue analizado mediante formación de imágenes con fósforo.
El porcentaje de sustrato de ARN restante en cualquier análisis fue trazado como una función de la concentración de SEGS y la eficacia catalítica fue expresada como k_{cat}/K_{m} (donde k_{cat} es la constante de velocidad de la escisión y K_{m} es la constante de Michaelis), la constante de velocidad de segundo orden para la reacción de SEGS y sustrato libre. Siguiendo los métodos de Heidenreich y Eckstein (J. Biol. Chem., 267: 1904-1909 (1.992), la eficacia de la reacción de escisión, k_{cat}/K_{m}), fue determinada utilizando la fórmula
-ln \ F/t = (k_{cat}/Km) \ [C]
donde F es la fracción de sustrato de ARN que queda, t es el tiempo de reacción, y [C] es la concentración de SEGS.
Análisis de Estabilidad de Suero de Ternera Fetal: La resistencia a la nucleasa de las moléculas de SEGS modificadas pueden ser sometida a ensayo en un Análisis de Suero de Ternera Fetal (FCS). Shaw y col., Nucleic Acids Res. 19:747-750 (1.991) informaron que la FCS al 10%, cuando es inactivada con calor, imita bastante próximamente el suero humano. Las condiciones del análisis son muy similares a las descritas previamente por Hoke y col., Nucleic Acids Res. 19:5743-5748 (1.991). Brevemente, un análogo de SEGS que va a ser sometido a ensayo es marcado en el extremo 5' con polinucleótido quinasa de T4 y ATP [\gamma-S^{35}] (este procedimiento puede generar oligonucleótidos radiomarcados que son resistentes a la desfosforilación). La SEGS marcada es purificada después mediante extracción en fenol/cloroformo, seguido de filtración en una columna giratoria de Sephadex G-25. La SEGS purificada se mezcla con SEGS fría y suero de ternera fetal (FCS) inactivado con calor de manera que la concentración final de SEGS sea de aproximadamente 5 \muM. Los análogos de SEGS se tratan a lo largo de un período de 24 horas. Se retiran alícuotas de la mezcla de reacción en diferentes momentos puntuales, se mezclan con colorante de carga 2X, se inactivan con calor a 90ºC durante 3 minutos, después se almacenan a -20ºC. Los resultados se analizan sobre geles de poliacrilamida al 12%/urea 7 M.
Ejemplo 2 Actividad de moléculas de SEGS para promover la escisión por ARNasa P
Constructos de SEGS Modelados sobre ARNt: Las actividades de SEGS y las moléculas de ARNt diana modelo que tienen diversas secuencias y estructuras modeladas sobre secuencias de ARNt fueron sometidas a ensayo. Las actividades fueron medidas en términos del porcentaje de sustrato escindido en una hora, como se describe en el Ejemplo 1. Se realizó una comparación entre una SEGS con secuencias del lazo T anexadas sobre el brazo de reconocimiento T (SEGS 3; SEC ID NUM. 1; ver la Figura 2) y una SEGS sin ninguna secuencia anexa (SEGS 7; nucleótidos 4-15 de la SEC ID NUM 1; ver la Figura 5). Esto se realizó, en parte, para someter a ensayo si las secuencias del lazo T distintas de la unidad UNR afectan a la promoción de la escisión de una SEGS mediada por la ARNasa P. Las moléculas de SEGS utilizadas se muestran en la Figura 5. Las SEGS de 15 nucleótidos tiene anexada una secuencia del lazo T y la SEGS de 12 nucleótidos no. Las actividades de estas dos SEGS al promover la escisión de un sustrato modelo (T 10, también mostrado en las Figuras 2 y 5) se enumeran en las filas uno y dos de la Tabla 1. Está claro que los nucleótidos anexados no tienen un efecto significativo sobre la actividad de escisión. La primera columna de la Tabla 1 muestra la secuencia de la región rotada y, en el caso de estos ejemplos, una corta secuencia cola formada por cinco o seis nucleótidos de adenina. Esto se indica por medio de (A) para aquellas dianas que tienen seis nucleótidos de adenina y por medio de (A)* para aquellas dianas que tienen cinco nucleótidos de adenina.
TABLA 1 Actividad de Escisión de Diferentes Secuencias de la Región Rotada
1
Efecto de la Secuencia en la Región Rotada y en el Sitio de Escisión sobre la Actividad de la SEGS: Se diseñaron diferentes modelos de moléculas de ARN diana modelo que diferían solamente en la secuencia de la región rotada. Los sustratos tienen la misma secuencia de nucleótidos que el ARN diana T10 (SEC ID NUM. 2) excepto por la región rotada (nucleótidos 33-36 de la SEC ID NUM. 2). La secuencia de la región rotada para cada sustrato se enumera en la Tabla 1. La actividad fue analizada utilizando la EGS 3 (SEC ID NUM. 1) o EGS 7 (nucleótidos 4 a 15 de la SEC ID NUM. 1). Los análisis fueron realizados como se ha descrito antes con ARN diana 50 nM, SEGS 400 nM, y 3 \mul de ARNasa P. La actividad de estas SEGS se muestra en las filas 2-7 y 9-18 de la Tabla 1. Casi todas las variantes son escindidas activamente hasta un grado significativo. En estos ejemplo, unas secuencias concretas son menos favorables que otras, tales como GAAA y AUCU. Estos resultados confirman que se pueden diseñar SEGS para secuencias diana que tienen una amplia gama de secuencias 3' de la segunda región diana.
El nucleótido del extremo 3' del brazo de reconocimiento A (que está implicado en el par de bases adyacente al sitio de escisión) de SEGS EGS 3 fue cambiado de un nucleótido de citidina a un nucleótido de guanina. La secuencia de ARN diana fue cambiada igualmente. La actividad de la SEGS resultante (EGS 6) se muestra en la fila ocho de la Tabla 1. Esta actividad (escisión del 45%), todavía más baja que la SEGS con un nucleótido de citidina (fila dos de la Tabla 1), aún es significativa. Esto indica que si bien es preferible un nucleótido de citidina en el extremo 3' del brazo de reconocimiento A, éste no es necesario. Aunque las secuencias de la región rotada y del extremo 3' variantes afectaban a la actividad de la SEGS, todas tenían una actividad medible y útil.
Efecto de las Modificaciones Químicas sobre la Actividad de las SEGS: Los 2'-O-metil-oligorribonucleótidos tienen numerosos rasgos favorables como elección lógica a modificar. La síntesis de estos análogos es muy similar a la síntesis del ADN. Tienen una afinidad de unión mucho mejor a la diana de ARN que los análogos de ADN y los dúplex resultantes tienen una estructura entre la del dúplex de ARN-ADN (forma A) y la del dúplex de ADN-ADN (forma B). Además, han demostrado ser bastante resistentes a la degradación por nucleasas específicas tanto para ARN como para ADN. Los 2'-O-metil-oligorribonucleótidos SEGS fueron modelados sobre la EGS 7 (nucleótido 4-15 de la SEC ID NUM. 1). Las actividades de esta SEGS modificada químicamente con dos sustratos se muestran en las filas 19 y 20 de la Tabla 1. estas actividades, si bien inferiores a las actividades obtenidas con SEGS no modificadas (comparar con las filas uno y tres de la Tabla 1), todavía son significativas. Esto indica que una SEGS puede tener todos sus nucleótidos químicamente modificados y conservar aún una actividad significativa.
Efecto de la Longitud de los Brazos de Reconocimiento y la Región Protuberancia sobre la Actividad de SEGS: Para calibrar los efectos de la longitud de los brazos de reconocimiento y la región protuberancia, se construyeron diversas SEGS y ARN diana modelo que tenían diferentes combinaciones de longitudes para estas regiones. Los sustratos fueron construidos tomando como modelo el ARN T10 diana. Las moléculas de SEGS fueron construidas tomando como modelo la EGS 7. Los análisis fueron realizados como se ha descrito antes con ARN diana 33 nM, SEGS 333 nM, y 3 \mul de ARNasa P. Las combinaciones de longitudes sometidas a ensayo, y la actividad observada, se muestran en la Tabla 2. Las longitudes de partida para las cuales se realizaron cambios fueron un tallo A de 7 pares de bases, un tallo T de 5 pares de bases, y una región protuberancia de 9 nucleótidos. Esta combinación tiene una elevada actividad (ver la fila uno de la Tabla 2).
TABLA 2 Actividad de Escisión de Diferentes Constructos
2
El primer grupo de filas de la Tabla 2 (filas uno a cuatro) muestra los resultados con longitudes del tallo A de 7, 8, 9, y 10 pares de bases. Todos son activos, aunque la SEGS con 10 nucleótidos en el brazo de reconocimiento A es menos activa. Esto indica que un brazo de reconocimiento de 7, 8, ó 9 nucleótidos es preferible. El segundo grupo de filas de la Tabla 2 (filas cinco a siete) muestra los resultados con longitudes del tallo T de 6 y 7 pares de bases. La fila siete combina un tallo A de 8 pares de bases con un tallo T de 6 pares de bases. Todos son activos, aunque la SEGS con 7 nucleótidos en el brazo de reconocimiento T es menos activa. Esto indica que un brazo de reconocimiento T de 5 ó 6 nucleótidos es preferible. El tercer grupo de filas de la Tabla 2 (filas ocho a once) muestra los resultados con longitudes de la región protuberancia de 7 a 15 nucleótidos. Todos estos constructos son muy activos. Esto indica que la longitud de la región protuberancia no es un determinante significativo de la actividad de la SEGS. En su totalidad, estos resultados indican que un brazo de reconocimiento A de 7 nucleótidos y un brazo de reconocimiento T de 5 nucleótidos son muy preferidos. Si bien estos cambios afectan a la actividad de la SEGS, la mayor parte de los cambios tienen efectos pequeños y todas las SEGS tenían una actividad medible y útil.
Comparación de la Actividad de la SEGS y la Actividad de los sustratos de la ARNasa P: Las actividades de escisión de sustratos de ARNasa P mínimos que formaban estructuras similares a los complejos de SEGS/ARN diana fueron comparadas con la actividad de las moléculas de SEGS. Los sustratos de la ARNasa P son moléculas de un sólo nucleótido que contienen tanto el sitio de escisión de la ARNasa P como una secuencia guía. A diferencia de los complejos de SEGS/ARN diana, el sustrato de la ARNasa P tiene un lazo T intacto. Las figuras 12 y 13 muestran un sustrato de ARNasa P mínimo y un complejo de SEGS/ARN diana, respectivamente. Ambos fueron construidos tomando como modelo la secuencia del ARNt^{Tyr}. En los análisis de actividad de la ARNasa P como se describe en el Ejemplo 1 el sustrato de la ARNasa P era escindido en un 99% en una hora y la SEGS promovía la escisión del 95% del ARN diana.
Los sustratos de ARNasa P y los pares de SEGS/ARN diana también fueron construidos tomando como modelo secuencias de HBV. Las Figuras 3 y 6 muestran ejemplos de tales pares de SEGS/ARN diana y un sustrato de ARNasa P, respectivamente. En los análisis de actividad de la ARNasa P como se describe en el Ejemplo 1, el sustrato de la ARNasa P era escindido en un 80% en una hora y la SEGS promovía la escisión del 65% del ARN diana. Estos resultados muestran que los complejos de SEGS/ARN diana conservan una fracción significativa de la actividad presente en los sustratos de ARNasa P que contienen un lazo T, incluso en el caso de SEGS construidas tomando como modelo secuencias arbitrarias.
Ejemplo 3 Construcción y Actividad de Moléculas de SEGS que Promueven la Escisión por ARNasa P de ARN de HbsAg
Se diseñaron moléculas de SEGS para promover la escisión por ARNasa P en el ARN que codificaba HBsAg. En presencia de la diana, las moléculas de SEGS formaban una estructura similar al tallo A y el tallo T del ARNt que lograba una escisión por la ARNasa P.
Constructos de SEGS Dirigidos a HBsAg: Se diseñaron secuencias de SEGS HBV B (SEC ID NUM. 6), HBV C (SEC ID NUM. 8), HBV F1 (SEC ID NUM. 10), HBV H (SEC ID NUM. 12), y HBV H1 (SEC ID NUM. 14) para dirigirlas a las regiones de ARN que codificaban el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg). Las regiones fueron elegidas como se ha descrito antes identificando la localización de las unidades UNR en el ARN que codificaba HBsAg. Como se muestra en la Figura 7, la secuencia de uno de los brazos de reconocimiento (el brazo de reconocimiento A; nucleótidos 6-13 de la SEC ID NUM. 6) de la SEGS HBV B es complementaria a ocho nucleótidos de la secuencia que codifica HBsAg (nucleótidos 13-20 de la SEC ID NUM. 7; nucleótidos 387-394 del transcrito de HBV de 2,1 kb). La secuencia del otro brazo de reconocimiento (el brazo de reconocimiento T; nucleótidos 1-5 de la SEC ID NUM. 6) de la SEGS HBV B es complementaria a cinco nucleótidos de la secuencia que codifica HBsAg (nucleótidos 30-34 de la SEC ID NUM. 7; nucleótidos 404-408 del transcrito de HBV de 2,1 kb). Así, la secuencia diana contiene dos regiones (la primera y la segunda regiones diana) complementarias a los dos brazos de reconocimiento de la SEGS que está separadas por 9 nucleótidos no emparejados (la región protuberancia).
Moléculas de SEGS que contienen 2'-O-metilo: Se prepararon moléculas de SEGS que se dirigen a HBV que contienen 2'-O-metilnucleótidos. Estos oligonucleótidos fueron preparados en un sintetizador oligonucleotídico automatizado como se ha descrito antes excepto que los reactivos nucleotídicos contenían un grupo 2'-O-metilo. El rendimiento de acoplamiento medio, analizado por medio de la medida del tritilo, estaba en el intervalo del 96 al 98%. Una vez completada la desprotección, los oligonucleótidoscompletamente desprotegidos fueron purificados mediante electroforesis en gel desnaturalizante y su pureza fue evaluada mediante marcaje del extremo 5', HPLC analítica, análisis de la composición de bases y RMN-P^{31}.
Escisión de ARN Diana Grande Promovida por SEGS: Se analizaron las SEGS específicas para las secuencias de ARN de HBV utilizando los análisis de escisión con ARNasa P descritos en el Ejemplo 1 para determinar la eficacia de la reacción de escisión. Para esto, el plásmido pAYW2.1, que contenía la secuencia que codifica el ARN de 2,1 kb de la cepa AYW de HBV, fue linealizado mediante digestión con Not I, y después transcrito mediante ARN polimerasa de T7 en presencia de CTP[\alpha^{32}]. Los transcritos marcados fueron incubados durante 30 minutos a 37ºC con ARNasa P en presencia de diversas moléculas de SEGS. Los productos de reacción fueron sometidos a electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante, y analizados mediante formación de imágenes con fósforo. Cada una de las SEGS específicas para el ARN de HBV descritas antes producía una banda de escisión visible sobre la imagen del gel. Esto indica que las SEGS diseñadas para secuencias diana arbitrarias en grandes moléculas de ARN diana natural son funcionales.
Ejemplo 4 Eficacia In Vivo de las Secuencias Guía Externas Cortas
En este ejemplo se demuestra que, cuando se administra in vivo, una secuencia guía externa corta es funcional y tiene efectos medibles significativos sobre los marcadores de un ARN diana. En este estudio se utilizó la SEGS HBV B. Esta SEGS inducía la escisión del ARNm de HBsAg de HBV en presencia de ARNasa P purificada (ver el 
\hbox{Ejemplo
3).}
Para la administración in vivo, se utilizó la SEGS HBV B sola (libre) o formando complejos iónicamente con una porfirina. Específicamente formaron complejos con la SEGS y o bien tetra-meso (n-metil 4 piridil) porfirina (TMP) o bien meso tetra (trimetil anilinio) porfirina (TMA o anilinio).
La EGS formando complejos o libre fue inyectada en ratones transgénicos que expresaban las partículas virales de HBV completamente ensambladas (Guidotti y col., J. Virol. 69:6158-6169 (1.995)). Estos ratones soportan la replicación de HBV en el hígado y producen todos los marcadores de la replicación viral. Se inyectaron 5 mg/Kg de peso corporal de la SEGS HBV B a través de la vena de la cola del ratón cada día durante 5 días. Los animales fueron sacrificados el sexto día y se analizaron los siguientes marcadores de la replicación viral.
A.
\hskip0,3cm
El nivel de ADN en los viriones de HBV presentes en la sangre del animal fue determinado mediante un análisis de hibridación puntual (Guidotti y col.). El nivel de ADN viral en sangre es un índice directo del título viral.
B.
\hskip0,3cm
El ADN viral en el hígado fue determinado mediante análisis de transferencia Southern normalizado. Este es un índice directo de la replicación del virus en el hígado.
C.
\hskip0,3cm
El nivel de partículas núcleo virales en las secciones de tejido hepático fue determinado mediante inmunocitoquímica. La transcripción inversa del ARN de HBV, que es una parte integrante del proceso de replicación del virus, tiene ligar en las partículas núcleo. Por tanto una reducción de las partículas núcleo es otro índice del aumento de replicación del virus.
D.
\hskip0,3cm
Se midió la alanina aminotransferasa (ALT) en suero para descartar cualquier posibilidad de toxicidad debida a la administración del fármaco. La lesión en el hígado causa una elevación de ALT en suero.
Los resultados de estas medidas (Tabla 3) demuestran que las moléculas de SEGS tienen un efecto de reducción de la replicación de HBV in vivo como se observa mediante la reducción del ADN viral en sangre, los intermedios replicativos de ADN viral y las partículas núcleo en el hígado. Obsérvese especialmente que los marcadores de HBV se reducían tanto si la SEGS formaba complejo con un portador de porfirina como si no. Esto indica que la actividad in vivo de una SEGS no requiere un modo de liberación concreto ni especializado. Obsérvese también que la ALT en suero permanece estable con todos los tratamientos indicando que no se causa una lesión significativa en el hígado mediante la administración de SEGS. Se había demostrado previamente que la administración de TMP solo durante 10 días a 5 mg/kg de peso corporal en ratones similares a través de la vena de la cola no tenía efecto sobre la replicación de HBV confirmando de ese modo que el efecto antiviral observado no se debe a TMP.
TABLA 3
3
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: Innovir Laboratories, Inc.
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Secuencias Guía Externas Cortas
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 15
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Patrea L. Pabst
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 2800 One Atlantic Center
\hskip4,2cm
1201 West Peachtree Street 
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Atlanta
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Georgia
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 30309-3450
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE CON EL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO MEDIO: Disco Flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC Compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release #1.0, Versión #1,25
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIORES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 08/615.961
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 14 de Marzo de 1.996
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Pabst, Patrea L.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 31.284
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: ILI115
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (404) 873-8794
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (404) 873-8795
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NÚM:1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NÚM: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAUCCUUCCC CCACC 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NÚM:2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 43 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NÚM: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCACGGAAUU CGGUGGGGCC AGCUCCUGAA GGUUCGAAAA AAA 
\hfill
43 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NÚM:3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NÚM: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAUCCACUGC ACUAG 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NÚM:4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 43 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NÚM: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGCUCAGUUU ACUAGUGCCA UUUGUUCAGU GGUUUCGAAAA 
\hfill
43 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NÚM:5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 51 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NÚM: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGCUCAGUUU ACUAGUGCCA UUUGUUUCAGU GGUUCGAAUC CACUGCACUA G 
\hfill
51 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NÚM:6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NÚM: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAGGAAACGC CGC 
\hfill
13 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NÚM:7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NÚM: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CUGGAUGUGU CUGCGGCGUU UUAUCAUCUU CCUCUUCAUC CUGCUGCUAU 
\hfill
50 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NÚM:8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NÚM: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGUUUGGGGA UAC 
\hfill
13 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NÚM:9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 56 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NÚM: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGGAACCUCU AUGUAUCCCU CCUGUUUGGCUG UACCAAACCU UCGGACGGAA AUUGCA 
\hfill
56 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NÚM:10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NÚM: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCACUGAUGG CAC 
\hfill
13 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NÚM:11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NÚM: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CUCAGUUUAC UAGUGCCAUU UGUUCAGUGG UUCGUAGGGC UUUCCC 
\hfill
46 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NÚM:12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NÚM: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGAAGGUCC GGC 
\hfill
13 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NÚM:13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NÚM: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCCUUCUCAU CUGCCGGACC GUGUGCACUU CGCUUUACCU CUGCACGU 
\hfill
48 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NÚM:14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NÚM: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGAAGACGG UCC 
\hfill
13 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NÚM:15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 51 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NÚM: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCACGGAAUU CGGUGGGGCC AGCUCCUGAA GGUUCGAAUC CUUCCCCCCAC C 
\hfill
51

Claims (31)

1. Una molécula oligonucleotídica que comprende
una secuencia de reconocimiento complementaria a las regiones de una secuencia diana de una moléculas de ARN viral diana, donde la secuencia de reconocimiento comprende una primera porción de unión y una segunda porción de unión, y la secuencia diana comprende, en orden 5' a 3', una primera región diana, una región protuberancia, y una segunda región diana,
donde la primera porción de unión es complementaria a la primera región diana y tiene una longitud de siete a nueve nucleótidos, la segunda región de unión es complementaria a la segunda región diana y tiene una longitud de cinco a siete nucleótidos, y la segunda porción de unión está localizada 5' y adyacente con respecto a la primera porción de unión del oligonucleótido, y cuando se une a la molécula de ARN diana la primera porción de unión y la primera región diana forman una estructura similar al tallo A del ARNt de la estructura de oligonucleótido-ARN diana, la segunda porción de unión y la segunda región diana forman una estructura similar al tallo T de un ARNt en las estructura de oligonucleótido-ARN diana y
donde el oligonucléotido promueve la escisión de la molécula de ARN diana mediada por ARNasa P eucariótica.
2. El oligonucleótido de la reivindicación 1, donde la región protuberancia tiene de 1 a 30 nucleótidos de longitud.
3. El oligonucleótido de la reivindicación 1, donde la secuencia diana comprende adicionalmente una región rotada donde la región rotada tiene una secuencia NUNR, donde N es cualquier nucleótido, R es cualquier nucleótido de purina, y U es cualquier nucleótido de uridina.
4. El oligonucleótido de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de bases nucleotídicas seleccionada del grupo formado por la SEC ID NUM. 3, la SEC ID NUM. 6, la SEC ID NUM. 8, la SEC ID NUM. 10, la SEC ID NUM. 12, la SEC ID NUM. 14.
5. El oligonucleótido de la reivindicación 1, donde la molécula de ARN diana es una molécula de ARN de hepati-
tis B.
6. El oligonucleótido de la reivindicación 1, donde uno o más grupos hidroxilo de los ribonucleótidos están reemplazados por un grupo químico seleccionado del grupo formado por hidrógeno, un grupo -O-alquilo, un grupo O-alquilo, un grupo amino, y flúor.
7. El oligonucleótido de la reivindicación 1, donde uno o más de los grupos conectores fosfato está reemplazados por un grupo conector seleccionado del grupo formado por fosfonato de metilo y fosforotioato.
8. El oligonucleótido de la reivindicación 1, donde el hidroxilo 3' del oligonucleótido es reemplazado por un grupo químico seleccionado del grupo formado por -OPO(O)OCH_{2}CH(OH)-CH_{2}NH_{2}, -OPO(S)OCH_{2}CH(OH)CH_{2}NH_{2}, y nucleótido -3'-timina.
9. Una composición para promover la escisión de una molécula de ARN diana donde la composición comprende el oligonucleótido de la reivindicación 1 en un sistema de liberación farmacéuticamente aceptable.
10. La composición de la reivindicación 9, donde el sistema de liberación farmacéuticamente aceptable se selecciona del grupo formado por liposomas, virosomas, microesferas y microcápsulas.
11. El oligonucleótido de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente una secuencia de ARN que se une a un ligando donde el oligonucleótido promueve la escisión de la molécula de ARN diana por la ARNasa sólo cuando está unida al ligando.
12. El oligonucleótido de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente una secuencia de ARN que se une a un ligando donde el oligonucleótido promueve la escisión de la molécula de ARN diana por la ARNasa sólo cuando no está unida al ligando.
13. El uso de un oligonucleótido según la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para escindir una molécula de ARN viral diana en un paciente infectado con el virus donde la ARNasa P, la molécula de ARN diana y el oligonucleótido se ponen en contacto en condiciones que promueven la escisión mediada por la ARNasa P.
14. El uso de la reivindicación 13, donde el oligonucleótido está en un sistema de liberación farmacéuticamente aceptable.
15. El uso de la reivindicación 14, donde el sistema de liberación farmacéuticamente aceptable se selecciona del grupo formado por liposomas, virosomas, microesferas y microcápsulas.
16. El uso de la reivindicación 14, donde la molécula de ARN viral es una molécula de ARN de hepatitis B.
17. El uso de un vector de expresión diseñado que codifica un oligonucleótido según la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para inhibir un virus en un paciente.
18. El uso de la reivindicación 17, donde el vector de expresión diseñado está en un sistema de liberación farmacéuticamente aceptable.
19. El uso de la reivindicación 18, donde el sistema de liberación farmacéuticamente aceptable se selecciona del grupo formado por liposomas, virosomas, microesferas y microcápsulas.
20. El uso de la reivindicación 19, donde el sistema de liberación farmacéuticamente aceptable es un liposoma.
21. El uso de la reivindicación 17, donde el vector es un vector viral seleccionado del grupo formado por vectores retrovirales, vectores virales adeno-asociados y vectores virales de Epstein-Barr.
22. Un vector de expresión diseñado que codifica un oligonucleótido según la reivindicación 1.
23. Una composición que promueve la escisión de una molécula de ARN de hepatitis B, donde la composición comprende el vector de expresión diseñado de la reivindicación 22 en un sistema de liberación farmacéuticamente aceptable.
24. La composición de la reivindicación 23, donde el sistema de liberación farmacéuticamente aceptable se selecciona del grupo formado por liposomas, virosomas, microesferas y microcápsulas.
25. Un método ex vivo para escindir una molécula de ARN diana que comprende
poner en contacto, en condiciones que promueven la escisión mediada por ARNasa P, ARNasa P, la molécula de ARN diana, y un oligonucleótido según la reivindicación 1.
26. Un método ex vivo para inhibir un virus que comprende administrar a las células de un paciente un vector de expresión diseñado que codifica un oligonucleótido según la reivindicación 1.
27. El método de la reivindicación 26, donde el vector es un vector viral seleccionado del grupo formado por vectores retrovirales, vectores virales adeno-asociados y vectores virales de Epstein-Barr.
28. El uso de una molécula oligonucleotídica en la fabricación de un medicamento para que se una y promueva la escisión de una molécula de ARN viral diana mediada por ARNasa P en un paciente infectado con el virus;
donde la molécula oligonucleotídica comprende una secuencia de reconocimiento complementaria a las regiones de una secuencia elegida como diana de la molécula de ARN diana, donde la secuencia de reconocimiento comprende una primera porción de unión y una segunda porción de unión, y la secuencia elegida como diana comprende, en orden 5' a 3', una primera región diana, una región protuberancia, y una segunda región diana:
donde la primera porción de unión es complementaria a la primera región diana, la segunda porción de unión es complementaria a la segunda región diana, y la segunda porción de unión está localizada 5' y adyacente con respecto a la primera porción de unión del oligonucleótido, y cuando se unen a la molécula de ARN diana la primera porción de unión y la primera región diana forman una estructura similar al tallo A del ARNt, la segunda porción de unión y la segunda región diana forman una estructura similar al tallo T de un ARNt.
29. El uso ex vivo de una molécula oligonucleotídica en la fabricación de un medicamento para que se una y promueva la escisión de una molécula de ARN diana mediada por ARNasa P en un paciente infectado con el virus;
donde la molécula oligonucleotídica comprende una secuencia de reconocimiento complementaria a las regiones de una secuencia elegida como diana de la molécula de ARN diana, donde la secuencia de reconocimiento comprende una primera porción de unión y una segunda porción de unión, y la secuencia elegida como diana comprende, en orden 5' a 3', una primera región diana, una región protuberancia, y una segunda región diana;
donde la primera porción de unión es complementaria a la primera región diana, la segunda porción de unión es complementaria a la segunda región diana, y la segunda porción de unión está localizada 5' y adyacente con respecto a la primera porción de unión del oligonucleótido, y cuando se unen a la molécula de ARN diana la primera porción de unión y la primera región diana forman una estructura similar al tallo A del ARNt, la segunda porción de unión y la segunda región diana forman una estructura similar al tallo T de un ARNt.
30. Un método para elaborar un oligonucleótido que se une a y promueve la escisión de una molécula de ARN diana mediada por ARNasa P eucariótica, comprendiendo el método
(a) seleccionar una secuencia diana de una molécula de ARN diana; y
(b) sintetizar una molécula de oligonucleótido que comprende
una secuencia de reconocimiento complementaria a las regiones de la secuencia elegida como diana de la molécula de ARN diana, donde la secuencia de reconocimiento comprende una primera porción de unión y una segunda porción de unión, y la secuencia diana comprende, en orden 5' a 3', una primera región diana, una región protuberancia, y una segunda región diana,
donde la primera porción de unión es complementaria a la primera región diana, y la segunda porción de unión es complementaria a la segunda región diana, y la segunda porción de unión está localizada 5' y adyacente con respecto a la primera porción de unión del oligonucleótido, y cuando se unen a la molécula de ARN diana la primera porción de unión y la primera región diana forman una estructura similar al tallo A del ARNt, la segunda porción de unión y la segunda región diana forman una estructura similar al tallo T de un ARNt.
31. Un método según la reivindicación 30, donde la molécula de ARN diana es una molécula de ARN viral.
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