JP2012105686A - 改変型の小さい干渉rna分子および使用方法 - Google Patents
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Abstract
(a)当該ウイルスを不活化するのに有効な量の改変型二本鎖RNA・(dsRNA)または改変型短鎖干渉RNA・(siRNA)を当該患者に投与する工程;および
(b)コレステロール低下薬を当該患者に投与する工程;
を包含する、方法、を提供すること。
【解決手段】 患者において肝炎を引き起こすウイルスを不活化するための方法であって、
(a)当該ウイルスを不活化するのに有効な量の改変型二本鎖RNA・(dsRNA)または改変型短鎖干渉RNA・(siRNA)を当該患者に投与する工程;および
(b)コレステロール低下薬を当該患者に投与する工程;
を包含する、方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、核酸検出分野およびRNAサイレンシング現象(すなわち、RNA干渉(RNAi))分野に関する。RNAサイレンシングは、非コードRNA分子が生物内の特定の遺伝子抑制を媒介する現象から構成される。事実上、この現象は、トランスポゾン、導入遺伝子、およびウイルス遺伝子などの外来の侵入核酸から生物のゲノムを保護する。
第1の実施形態では、本発明は、dsRNA中の1つ以上のピリミジンが2’フッ素を含むように改変された標的細胞中でRNA干渉を媒介する二本鎖(dsRNA)分子を提供する。
(a)siRNAを設計するためにHCVゲノム中の標的ヌクレオチド配列を同定する工程、および
(b)2’フッ素を含むように改変されたsiRNA中に少なくとも1つのピリミジンを含むsiRNAを生成する工程、
を包含する、方法を提供する。
(a)siRNAを設計するためにHCVゲノム中の標的ヌクレオチド配列を同定する工程、および
(b)siRNA中のピリミジンすべてが2’フッ素を含むように改変されているsiRNAを生成する工程、
を包含する、方法を提供する。
(a)siRNAを設計するためにHCVゲノム中の標的ヌクレオチド配列を同定する工程、および
(b)siRNA中のピリミジンすべてが2’フッ素を含むように改変され、かつ2’フッ素siRNAが、dsRNAまたはsiRNAの3’末端に2塩基デオキシヌクレオチド「TT」配列を含むようにさらに改変されているsiRNAを生成する工程、
を包含する、方法を提供する。
・本発明はさらに、以下を提供し得る:
・(項目1)
患者において肝炎を引き起こすウイルスを不活化するための方法であって、
(a)当該ウイルスを不活化するのに有効な量の改変型二本鎖RNA・(dsRNA)または改変型短鎖干渉RNA・(siRNA)を当該患者に投与する工程;および
(b)コレステロール低下薬を当該患者に投与する工程;
を包含する、方法。
・(項目2)
上記ウイルスが、C型肝炎ウイルス・(HCV)、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、またはE型肝炎ウイルスである、項目1に記載の方法。
・(項目3)
上記ウイルスがHCVである、項目1に記載の方法。
・(項目4)
上記コレステロール低下薬が、スタチン、レジン、ニコチン酸、ゲムフィブロジル、またはクロフィブレートである、項目1に記載の方法。
・(項目5)
上記コレステロール低下薬がスタチンである、項目1に記載の方法。
・(項目6)
上記改変型dsRNAまたは改変型siRNAが2’改変されている、項目1に記載の方法。
・(項目7)
上記改変が、フルオロ改変、メチル改変、メトキシエチル改変、およびプロピル改変からなる群より選択される、項目1に記載の方法。
・(項目8)
上記フルオロ改変が2’−フルオロ改変または2’,2’−フルオロ改変である、項目7に記載の方法。
・(項目9)
上記dsRNAまたはsiRNAの少なくとも1つのピリミジンが改変されており、当該ピリミジンは、シトシン、シトシンの誘導体、ウラシル、またはウラシルの誘導体である、項目8に記載の方法。
・(項目10)
上記dsRNAまたはsiRNA中のピリミジンすべてが改変されている、項目9に記載の方法。
・(項目11)
上記dsRNAまたはsiRNAが、その3’末端に2塩基デオキシヌクレオチド「TT」配列を含む、項目1に記載の方法。
・(項目12)
上記dsRNAまたはsiRNAがコレステロールに連結されている、項目1に記載の方法。
・(項目13)
上記siRNAが、
(a)短鎖干渉RNA・(siRNA)を設計するためにウイルスゲノム中の標的ヌクレオチド配列を同定する工程、および
(b)少なくとも1つの改変型ヌクレオチドを含むように改変されたsiRNAを生成する工程、
によって調製される、項目1に記載の方法。
・(項目14)
上記siRNAが、
(a)短鎖干渉RNA・(siRNA)を設計するためにHCVゲノム中の標的ヌクレオチド配列を同定する工程、および
(b)少なくとも1つの改変型ヌクレオチドを含むように改変されたsiRNAを生成する工程、
によって調製される、項目3に記載の方法。
・(項目15)
上記標的ヌクレオチド配列が、5’非翻訳領域・(5’−UTR)、3’非翻訳領域・(3’−UTR)、コア、およびNS3ヘリカーゼからなる群より選択される、項目14に記載の方法。
・(項目16)
上記siRNAが、siRNA5、siRNAC1、siRNAC2、siRNA5B1、siRNA5B2、またはsiRNA5B4である、項目15に記載の方法。
・(項目17)
上記siRNAが、約10個〜約30個のリボヌクレオチドからなる、項目1に記載の方法。
・(項目18)
上記siRNAが、約19個〜約23個のリボヌクレオチドからなる、項目17に記載の方法。
・(項目19)
上記改変型siRNAが2’改変型siRNAである、項目18に記載の方法。
・(項目20)
上記改変が、フルオロ改変、メチル改変、メトキシエチル改変、およびプロピル改変からなる群より選択される、項目19に記載の方法。
・(項目21)
上記フルオロ改変が、2’−フルオロ改変または2’,2’−フルオロ改変である、項目20に記載の方法。
・(項目22)
上記siRNAの少なくとも1つのピリミジンが改変されており、当該ピリミジンは、シトシン、シトシンの誘導体、ウラシル、またはウラシルの誘導体である、項目21に記載の方法。
・(項目23)
上記siRNA中のピリミジンすべてが改変されている、項目22に記載の方法。
・(項目24)
上記siRNAが、その3’末端に2塩基デオキシヌクレオチド「TT」配列を含む、項目18に記載の方法。
・(項目25)
上記siRNAの両方の鎖が、少なくとも1つの改変型ヌクレオチドを含む、項目18に記載の方法。
・(項目26)
改変型リボヌクレオチドを含むsiRNA分子であって、当該siRNAは、
(a)その3’末端に2塩基デオキシヌクレオチド「TT」配列を含み、
(b)RNアーゼに対して耐性であり、
(c)ウイルス複製を阻害し得る、
siRNA分子。
・(項目27)
上記siRNA分子が2’改変されている、項目26に記載のsiRNA分子。
・(項目28)
上記2’改変が、フルオロ改変、メチル改変、メトキシエチル改変、およびプロピル改変からなる群より選択される、項目27に記載のsiRNA分子。
・(項目29)
上記フルオロ改変が、2’−フルオロ改変または2’,2’−フルオロ改変である、項目28に記載のsiRNA分子。
・(項目30)
上記siRNAの少なくとも1つのピリミジンが改変されており、当該ピリミジンは、シトシン、シトシンの誘導体、ウラシル、またはウラシルの誘導体である、項目29に記載のsiRNA分子。
・(項目31)
上記siRNA中のピリミジンすべてが改変されている、項目30に記載のsiRNA分子。
・(項目32)
上記siRNAの両方の鎖が、少なくとも1つの改変型ヌクレオチドを含む、項目26に記載のsiRNA分子。
・(項目33)
上記siRNAが、約10個〜約30個のリボヌクレオチドからなる、項目26に記載のsiRNA分子。
・(項目34)
上記siRNAが、約19個〜約23個のリボヌクレオチドからなる、項目33に記載のsiRNA分子。
・(項目35)
HCVの複製を阻害する、項目26に記載のsiRNA分子。
・(項目36)
siRNA5、siRNAC1、siRNAC2、siRNA5B1、siRNA5B2、またはsiRNA5B4のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列を含む、項目35に記載のsiRNA分子。
・(項目37)
少なくとも1つのレセプター結合リガンドに連結されている、項目35に記載のsiRNA分子。
・(項目38)
上記レセプター結合リガンドが、上記siRNA分子の5’末端または3’末端に結合されている、項目37に記載のsiRNA分子。
・(項目39)
上記レセプター結合リガンドが上記siRNA分子の複数の末端に結合されている、項目38に記載のsiRNA分子。
・(項目40)
上記レセプター結合リガンドが、コレステロール、HBV表面抗原、および低密度リポタンパク質からなる群より選択される、項目37に記載のsiRNA分子。
・(項目41)
上記レセプター結合リガンドがコレステロールである、項目40に記載のsiRNA分子。
・(項目42)
少なくとも1つのリボヌクレオチドの2’位改変をさらに含み、当該少なくとも1つのリボヌクレオチドの2’位改変によって上記siRNAが分解に対して耐性になる、項目37に記載のsiRNA分子。
・(項目43)
上記少なくとも1つのリボヌクレオチドの2’位改変が、2’−フルオロ改変または2’,2’−フルオロ改変である、項目42に記載のsiRNA分子。
本発明は、約10〜約30ヌクレオチド長であり、かつ標的細胞中でのRNA干渉を媒介するdsRNA分子を提供する。好ましくは、本発明の分子は、ヌクレアーゼ分解に対する安定性が増加するが、標的核酸への結合能力が保持されるように化学改変されている。
本明細書中で使用される、「RNA干渉」(RNAi)は、タンパク質合成全体を抑制することなくsiRNAによって媒介される遺伝子発現(タンパク質合成)の配列特異的抑制または遺伝子特異的抑制をいう。本発明は特定の理論または作用様式に制限されないが、RNAiはRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)による伝令RNA(mRNA)の分解、それによる転写mRNAの翻訳の防止に関与し得る。あるいは、遺伝子転写を切り替えるゲノムDNAのメチル化に関与し得る。RNAiによる遺伝子発現の抑制は、一過性であり得るか、より安定であり得るか、不変であり得る。
HCVゲノムに対するsiRNAがこのヒト病原体に対する細胞内免疫を付与するかどうかを試験するために、ヒト肝細胞癌細胞株Huh−7において最近開発されたHCV細胞培養系を使用した。細胞株の1つ(5−2)は、自律複製サブゲノムHCV RNAを保有する(Bartenschlager,J.Virol,2001)。サブゲノムレプリコンは、HCV RNA複製の基準としてレポーター機能アッセイが可能なホタルルシフェラーゼ遺伝子を保有する(図5)。ゲノムに移入した細胞培養適応変異(Bart)のために、これらの5−2細胞は、5×104ウイルス粒子/細胞までのレベルでHCV RNAを複製する。
siRNA応答の配列特異性を、さらなるsiRNA二重鎖(GL2およびGL3)を使用してさらに試験した。図1は、GL2およびGL3の3−ヌクレオチドが相互に異なることを示す。ルシフェラーゼ活性は、siRNA5またはGL2でトランスフェクトした細胞で90%減少したが、GL3でトランスフェクトした細胞では有意な減少は認められなかった(図7)。Promega Corp.(Madison,WI)から市販されているルシフェラーゼアッセイシステムを製造者の説明書にしたがって使用してルシフェラーゼアッセイを行った。
siRNA5がトランスフェクトした細胞で有毒であるかどうかも試験した。ATPアーゼ活性アッセイを使用して毒性を測定した。図8は、図6で認められるHCV複製のsiRNA5誘導減少が非配列特異的RNAiの細胞毒性によらないことを示す。Promega(Madison,WI)のATPアーゼアッセイキットを製造者の説明書にしたがって使用してATPアーゼレベルをアッセイした。
Li,H,Science 296:1319−1321(2002)で報告されているように、全長HCVレプリコンは、siRNAの存在にもかかわらずRNAiに適応して抑制し、それにより複製する能力を有し得る。選択可能な全長HCVレプリコンを保有する21−5細胞株由来のHuh−7細胞における全長HCV RNAの複製に対するsiRNA5の効果を決定するために、siRNA5で処置した。HCV RNAのレベルを、TaqMan(商標)(F.Hoffman La−Roche,Switzerland)を使用した定量的PCRによって測定した。図9で認められる結果は、siRNA誘導サイレンシングが、RNA複製が非常に高い適応HCV変異形においてでさえも定常状態のウイルスRNA生成を減少させることを示す。両サブゲノムおよび全長のHCVレプリコンを用いた結果により、HCVタンパク質はRNA干渉を抑制することができないことが示唆される。
siRNAがトランスフェクトした細胞に有毒であるかどうかも試験した。詳細には、siRNA5(すなわち、GAPDH配列に特異的なsiRNA)でトランスフェクトしたHuh5−2細胞中のGAPDH(解糖に不可欠な酵素)をコードするmRNAを測定した。図10は、siRNA5がGAPDHのRNAレベルに影響を与えなかったことを証明する。TaqMan(商標)RNAキット(F.Hoffman La−Roche,Switzerland)を製造者の説明書にしたがって使用してGAPDHを測定した。
感染した肝臓内でHCVが複製する能力の阻害に対するsiRNA5の有効性を試験するために、当業者に周知の方法にしたがって、HCV感染ヒト肝臓の一部を、トランスジェニック重症複合型免疫不全症(SCID)マウスに異種移植する。
HCVが健康な肝臓に感染する能力の阻害に対するsiRNA5の有効性を試験するために、当業者に周知の方法にしたがって、正常なヒト肝臓の一部を、トランスジェニック重症複合型免疫不全症(SCID)マウスに異種移植する。
化学合成によって改変型siRNAを調製し得る。1つの実施形態では、siRNA二重鎖(例えば、GL2)内の各CおよびUを、2’−F−Uおよび2’F−Cと置換し得る。2’−F−Uおよび2’F−Cを含む3’末端突出部を有するsiRNAを生成するために、一般的な支持体を使用し得る。支持体からのオリゴの選択的切断により、実施者は、突出部残基が改変型ヌクレオチドを確実に含ませることができる。あるいは、3’末端突出部を含むヌクレオチドは、未改変dTdTであり得る。
HCVゲノムに対するsiRNAがこのヒト病原体に対する細胞内免疫を付与するかどうかを試験するために、最近開発されたヒト肝細胞癌細胞株Huh−7におけるHCV細胞培養系を使用した。細胞株の1つ(5−2)は、自律複製サブゲノムHCV RNAを保有する(Bartenschlager,J.Virol,2001)。サブゲノムレプリコンは、HCV RNA複製の基準としてレポーター機能アッセイが可能なホタルルシフェラーゼ遺伝子を保有する。ゲノムに移入した細胞培養適応変異のために、5−2細胞は、5×104ウイルス粒子/細胞までのレベルでHCV RNAを複製する。
ショウジョウバエルシフェラーゼ遺伝子に対するsiRNA GL2内の各CおよびUを、2’−F−Uおよび2’F−Cに置換した。標準的なリポソームトランスフェクション技術を使用して、改変型siRNAを5−2にトランスフェクトした。詳細には、改変型siRNAを、0.5μlのオリゴフェクタミン(Invitrogen,Carlsbad,CA)を含む250μlの細胞懸濁液中にて37℃で4時間、培養培地を含む375μl血清中で20時間、リポソーム−siRNA複合体を含まない新鮮な培地中にて37℃で24時間インキュベートした。トランスフェクションから48時間後にルシフェラーゼ活性を測定して、HCV複製に対する改変型siRNAの効果を決定した。
未改変型siRNA(siRNA)と比較した2’化学改変型siRNAの安定性を試験するために、以下の実験を行う。4ngのsiRNAを、20μLの健康なドナー由来の80%ヒト血清に添加する。この混合物を、37℃にて1分から10日間までの種々の期間インキュベートする。結果を、図13のレーン2〜10に示す。2’フッ素改変型siRNA(2’−FsiRNA)のために同一プロセスを行い、結果を、図3のレーン12〜20および22〜25に示す。インキュベーションプロセスの終了時に、混合物を氷上に置き、その直後に32P−siRNAコントロールと共にPAGEによって分離する(図13のレーン1、11、および21を参照のこと)。データは、2’改変型siRNAが未改変型siRNAと比較して10日間にわたって安定であることを示す。
長いdsRNAからの改変型siRNAの生成を証明するために、5μgの1000bp長フッ素化dsRNA(図14、パネル(A))を、15単位のヒトダイサーと共に37度で一晩インキュベートした。得られたダイサーで切断されたsiRNAを、SephadexG−25カラムを使用して精製し、20%PAGEで電気泳動を行った(図14、パネル(B))。図4は、組換えヒトダイサーがフッ素化dsRNAを2’F−siRNAに有効に変換することを示す。
HCVゲノムに対するsiRNAがこのヒト病原体に対する細胞内免疫を付与するかどうかをさらに試験するために、実施例1に記載のアッセイを使用して、siRNAC1、siRNAC2、siRNA5B1、siRNA5B2、およびsiRNA5B4を試験し、図2にそれぞれ示す。各siRNAを、1nM、10nM、および100nMの濃度で試験した。図15に示すように、各siRNAは、用量依存性様式でルシフェラーゼ活性を有意に阻害した。siRNAC2は特に有効であった。
実施例9で報告した実験の追跡としてアッセイを行い、コレステロール改変によってsiRNA分子がHuh−7肝臓細胞に指向したが、フルオロ改変ではそうではなかったことが証明された。Huh−7細胞を、以下の種々の濃度の2種のChol−GL2siRNAとインキュベートした:一方は2’−フルオロ改変を行い、他方はこのような改変を欠いた。図16に示した結果は、肝臓細胞へのコレステロール改変型siRNA分子の送達がコレステロールに起因し、他の改変に起因しないことを証明している。
siRNAを、全ピリミジンの代わりに2−フルオロピリミジンを含むように改変した(2’−F−siRNA)。この2’−F−siRNAを、2−F−siRNA中に存在するリボヌクレオチド「UU」突出部の代わりに分子の3’末端に2塩基デオキシヌクレオチド「TT」配列を含むようにさらに改変した(2’−F−siRNA3’−X)。図17は、3’’’dTdT’’末端を含めるような2’フッ素化siRNAのさらなる改変によってヒト血清中のsiRNAの安定性が有意に増加したことを証明している。
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