PT2280070E - Métodos e composições para inibição mediada por iarn da expressão génica em mamíferos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA INIBIÇÃO MEDIADA POR IARN DA EXPRESSÃO GENICA EM MAMÍFEROS INTRODUÇÃO Campo da Invenção 0 campo da presente invenção é a iARN.

Antecedentes da Invenção 0 ARN de cadeia dupla induz silenciamento génico potente e especifico através de um processo referido como interferência de ARN (iARN) ou silenciamento génico pós-transcricional (PTGS) . A iARN é mediada pelo complexo de silenciamento induzido por ARN (RISC), uma nuclease multicomponente especifica de sequência que destrói ARNs mensageiros homólogos com o desencadeador do silenciamento. 0 RISC é conhecido por conter ARNs curtos (aproximadamente 22 nucleótidos) derivados a partir do desencadeador de ARN de cadeia dupla. 0 iARN tornou-se o método de eleição para investigações de perda de função em numerosos sistemas incluindo, C. elegans, Drosophila, fungos, plantas, e mesmo linhas celulares de mamíferos. Para silenciar especificamente um gene na maioria das linhas celulares de mamíferos, pequenos ARNs interferentes (siARN) são utilizados porque dsARNs grandes (> 3 0 pb) desencadeiam a resposta de interferão e causam silenciamento génico não especifico.

Até à data, os Solicitantes não estão cientes de qualquer relatório de aplicação bem-sucedida da tecnologia de iARN a organismos mamíferos não embrionários. A demonstração de que a iARN funciona em organismos de mamíferos não embrionários proporcionaria uma série de aplicações adicionais importantes para a tecnologia de iARN, incluindo tanto aplicações de investigação como terapêuticas, e é portanto de intenso interesse.

Literatura Relevante

Documento WO 01/68836. Veja-se também: Bernstein et al. , RNA (2001) 7: 1509-1521; Bernstein et al., Nature (2001) 409:363-366; Billy et al., Proc. Nat'l Acad. Sei USA (2001) 98:14428-33; Caplan et al., Proc. Nat'l Acad. Sei USA (2001) 98:9742-7; Carthew et al., Curr. Opin. Cell Biol (2001) 13: 244-8; Elbashir et al., Nature (2001) 411: 494-498; Hammond et al., Science (2001) 293:1146-50; Hammond et al., Nat. Ref. Genet. (2001) 2:110-119; Hammond et al.,

Nature (2000) 404:293-296; McCaffrrey et al., Nature (2002) : 418-38-39; e McCaffrey et al., Mol. Ther. (2002) 5:676-684; Paddison et al., Genes Dev. (2002) 16:948-958;

Paddison et al. , Proc. Nat'l Acad. Sei USA (2002) 99:1443- 48; Sui et al. , Proc. Nat'l Acad. Sei USA (2002) 99:5515- 20. Documentos de Patente U.S. de interesse incluem 5.985.847 e 5.922.687. Também é de interesse o documento WO/11092. Referências de interesse adicionais incluem: Acsadi et al., New Biol. (jan. de 1991) 3:71-81; Chang et al., J. Virol. (2001) 75:3469-3473; Hickman et al., Hum.

Gen. Ther. (1994) 5:1477-1483; Liu et al., Gene Ther. (1999) 6:1258-1266; Wolff et al., Science (1990) 247: 1465- 1468; e Zhang et al., Hum. Gene Ther. (1999) 10:1735-1737: e Zhang et al., Gene Ther. (1999) 7:1344-1349.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona uma composição farmacêutica para utilização num método de tratamento que compreende a administração da composição a um mamífero adulto para reduzir a expressão de uma sequência alvo no fígado do dito mamífero adulto, a composição que compreende um portador farmaceuticamente aceitável e: um agente de iARN selecionado a partir de siARN ou um shARN, em que o dito siARN ou shARN é específico para uma sequência alvo presente numa célula hepática do dito mamífero adulto e reduz a expressão da sequência alvo e em que o siARN ou shARN tem cerca de 15 a 30 nucleótidos de comprimento ou tem uma estrutura de dúplex com 15 a 29 pares de bases de comprimento; ou um vetor que compreende ADN que é transcrito in vivo para o dito shARN ou siARN. A administração pode ser através de um protocolo de administração hidrodinâmica.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 proporciona construções de expressão empregues nas experiências de iARN descritas abaixo. Figuras 2A a 2D: interferência de ARN em ratinhos adultos. Figura 2A)

Imagens representativas de luz emitida a partir ratinhos co-transfetados com o plasmídeo de luciferase pGL3-

Control e sem siARN (esquerda), siARN de luciferase (centro) ou siARN não relacionado (direita). Uma imagem pseudocolorida representando a intensidade da luz emitida (vermelho mais intenso e azul menos intenso) sobreposta numa imagem de referência em escala de cinzentos (para orientação) mostra que a iARN funciona em mamíferos adultos. Quarenta mg de siARNs de 21 mero hibridados (Dharmacon) foram coinjetados nos fígados de ratinhos com 2 pg de ADN pGL3-Control e 800 unidades de RNasin (Promega) em 1,8 ml de PBS em 5-7 segundos. Setenta e duas horas após a injeção original, os ratinhos foram anestesiados e foram-lhes dados 3 mg de luciferina por via intraperitoneal 15 minutos antes da obtenção de imagens. Figura 2B) Resumos dos dados de siARN. Os ratinhos que receberam o siARN de luciferase emitiram significativamente menos luz do que os controlos não tratados. Uma análise de ANOVA de uma via com um teste de Fisher post-hoc foi realizada. Os grupos de siARN não relacionados e não tratados foram estatisticamente semelhantes. Figura 2C) pShhl-Ffl (centro) mas não pShhl-Fflrev (direita) reduziu a expressão de luciferase em ratinhos em comparação com o controlo não tratado (esquerda) . 10 pg de pShhl-Ffl ou pShhl-rev foram coinjetados com 40 yg de pLuc-NS5B em 1,8 ml de PBS. Figura 2D) Quantificação dos dados de pShhl. Os animais foram tratados de acordo com as NIH Guidelines for Animal Care e Guidelines of Stanford University. A Figura 3 proporciona uma representação esquemática das construções empregues no ensaio de inibição de HCV antissentido de fosforamidato de morfolino realizado na Secção Experimental, abaixo. A Figura 4 fornece informação de fundo do mecanismo dos inibidores antissentido.

As Figuras 5A a 5F proporcionam resultados gráficos de um ensaio de inibição de HCV antissentido de fosforamidato de morfolino.

DEFINIÇÕES

Para conveniência, determinados termos empregues na memória descritiva, exemplos, e reivindicações anexas são recolhidos aqui.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual esteve ligada. Um tipo de vetor é um vetor integrado genómico, ou "vetor integrado", que pode tornar-se integrado no ADN cromossómico da célula hospedeira. Outro tipo de vetor é um vetor epissómico, isto é, um ácido nucleico capaz de replicação extra-cromossómica num hospedeiro apropriado, por exemplo, uma célula hospedeira eucariótica ou procariótica. Vetores capazes de direcionar a expressão de genes aos quais estão operativamente ligados são referidos, no presente documento, como "vetores de expressão". Na presente memória descritiva, "plasmídeo" e vetor" são utilizados indistintamente a menos que seja, de outro modo, evidente a partir do contexto.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "ácido nucleico" refere-se a polinucleótidos tais como ácido desoxirribonucleico (ADN), e, quando apropriado, ácido ribonucleico (ARN). Pretende-se que o termo inclua também, conforme aplicável à forma de realização a ser descrita, polinucleótidos de cadeia simples (tais como de sentido e antissentido) e de cadeia dupla.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "gene" ou "gene recombinante" refere-se a um ácido nucleico que compreende uma grelha de leitura aberta que codifica um polipéptido da presente invenção, incluindo tanto sequências de exão e (opcionalmente) intrão. Um "gene recombinante" refere-se a um ácido nucleico que codifica tais polipéptidos reguladores, que podem opcionalmente conter sequências de intrão que são derivadas a partir de ADN cromossómico. 0 termo "intrão" refere-se a uma sequência de ADN presente num dado gene que não é traduzida em proteínas e que é normalmente encontrada entre exões. Conforme utilizado no presente documento, o termo "transfeção" significa a introdução de um ácido nucleico, por exemplo, um vetor de expressão, numa célula recetora através de uma transferência génica mediada por ácido nucleico.

Uma "sequência codificante de proteína" ou uma sequência que "codifica" um polipéptido ou proteína particular, é uma sequência de ácidos nucleicos que é transcrita (no caso de ADN) e é traduzida (no caso de ARNm) num polipéptido in vitro ou in vivo quando colocada sob o controlo de sequências reguladoras apropriadas. Os limites da sequência codificante são determinados por um codão de iniciação no terminal 5' (amino) e um codão de terminação no terminal 3' (carboxi). Uma sequência codificante pode incluir, mas não está limitada a, ADNc a partir de um ARMm eucariótico ou procariótico, sequências de ADN a partir de um ADN procariótico ou eucariótico, e mesmo sequências de ADN sintético. Uma sequência de terminação da transcrição irá, normalmente, estar localizada a 3' em relação à sequência codificante.

Da mesma forma, "codifica", a menos que evidente a partir do contexto, destina-se a incluir sequências de ADN que codificam um polipéptido, tal como o termo é normalmente utilizado, bem como sequências de ADN que são transcritas em moléculas antissentido inibitórias. 0 termo "perda de função", na medida em que se refere a genes inibidos pelo método de iARN em causa, refere-se a uma diminuição no nível de expressão de um gene em comparação com o nível na ausência do agente de iARN. 0 termo "expressão" em relação a uma sequência génica refere-se à transcrição do gene e, conforme apropriado, tradução do transcrito de ARNm resultante numa proteína. Assim, como será evidente a partir do contexto, a expressão de uma sequência codificante de proteína resulta a partir da transcrição e tradução da sequência codificante. "Células", "células hospedeiras" ou "células hospedeiras recombinantes" são termos utilizados indistintamente no presente documento. Entende-se que tais termos se referem não apenas à célula em causa particular mas à descendência ou descendência potencial de uma tal célula. Dado que determinadas modificações podem ocorrer em gerações sucessoras devido à maturação ou influências ambientais, tal descendência pode, de facto, não ser idêntica à célula-mãe, mas encontra-se ainda incluída dentro do âmbito do termo conforme utilizado no presente documento.

Por "vírus recombinante" entende-se um vírus que foi geneticamente alterado, por exemplo, através da adição ou inserção de um ácido nucleico heterólogo na partícula.

Conforme utilizado no presente documento, os termos "transdução" e "transfeção" são reconhecidos na técnica e significam a introdução de um ácido nucleico, por exemplo, um vetor de expressão, numa célula recetora através de uma transferência génica mediada por ácido nucleico. "Transformação", conforme utilizado no presente documento, refere-se a um processo no qual o genótipo de uma célula é alterado como um resultado da absorção celular de ADN ou ARN exógeno, e, por exemplo, a célula transformada expressa uma construção de ARNds. "Transfeção transiente" refere-se a casos onde um ADN exógeno não se integra no genoma de uma célula transfetada, por exemplo, quando ADN epissómico é transcrito em ARNm e traduzido em proteína.

Uma célula foi "estavelmente transfetada" com uma construção de ácido nucleico quando a construção de ácido nucleico é capaz de ser herdada por células filhas.

Conforme utilizado no presente documento, uma "construção de gene repórter" constitui um ácido nucleico que inclui um "gene repórter" operativamente ligado a pelo menos uma sequência reguladora transcripcional. A transcrição dos genes repórter é controlada através destas sequências às quais estão ligados. A atividade de, pelo menos uma, destas sequências de controlo pode ser direta ou indiretamente regulada pela proteína recetora alvo. Sequências de controlo transcricionais são sequências promotoras. Um gene repórter destina-se a incluir uma construção de promotor-gene repórter que é heterologamente expressa numa célula.

Conforme utilizado no presente documento, "células transformadas" refere-se a células que foram espontaneamente convertidas num estado de crescimento não limitado, isto é, adquiriram a capacidade de crescer através de um número indefinido de divisões em cultura. As células transformadas podem ser caracterizadas por tais termos como neoplásico, anaplásico e/ou hiperplásico, em relação à sua perda de controlo de crescimento. Para propósitos da presente invenção, os termos "fenótipo transformado de células de mamífero malignas" e "fenótipo transformado" destinam-se a englobar, mas não se limitam a, qualquer dos seguintes atributos fenotípicos associados com a transformação celular de células de mamífero: imortalização, transformação morfológica ou de crescimento, e tumorigenicidade, conforme detetado pelo crescimento prolongado na cultura celular, crescimento em meios semissólidos, ou crescimento tumorigénico em animais imunocompetentes ou singénicos.

Conforme utilizado no presente documento, "proliferando" e "proliferação" referem-se a células que estão a passar por mitose.

Conforme utilizado no presente documento, "células imortalizadas" refere-se a células que foram alteradas através de meios químicos, genéticos, e/ou recombinantes de tal modo que as células possuem a capacidade de crescer através de um número indefinido de divisões em cultura. 0 "estado de crescimento" de uma célula refere-se à taxa de proliferação da célula e ao estado de diferenciação da célula. "Inibição da expressão génica" refere-se à ausência (ou diminuição observável) no nível de produto proteico e/ou de ARNm de um gene alvo. "Especificidade" refere-se à capacidade de inibir o gene alvo sem efeitos manifestos em outros genes da célula. As consequências da inibição podem ser confirmadas através do exame das propriedades externas da célula ou organismo (conforme apresentado abaixo nos exemplos) ou através de técnicas bioquímicas tais como hibridação em solução de ADN, proteção de nuclease, hibridação de Northern, transcrição reversa, monitorização da expressão génica com uma micromatriz, ligação de anticorpos, ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), Western blot, radioimunoensaio (RIA), outros imunoensaios, e análise celular ativada por fluorescência (FACS). Para a inibição mediada por ARN numa linha celular ou organismo completo, a expressão génica é convenientemente testada através da utilização de um repórter ou gene de resistência a fármacos cujo produto proteico é facilmente testado. Tais genes repórter incluem acetohidroácido sintase (AHAS), fosfatase alcalina (FA), beta galactosidase (LacZ), beta glucoronidase (GUS), cloranfenicol acetiltransferase (CAT), proteína fluorescente verde (GFP), peroxidase de rábano (HRP), luciferase (Luc), nopalina sintase (NOS), octopina sintase (OCS), e derivados dos mesmos, múltiplos marcadores selecionáveis estão disponíveis que conferem resistência à ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, canamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina e tetraciclina.

Dependendo do ensaio, a quantificação da quantidade de expressão génica permite a determinação de um grau de inibição que é maior do que 10%, 33%, 50%, 90%, 95% ou 99% em comparação com uma célula não tratada de acordo com a presente invenção. Doses mais baixas de agente ativo administradas e períodos de tempo mais longos após a administração do agente ativo podem resultar em inibição numa fração mais pequena de células (por exemplo, pelo menos 10%, 20%, 50%, 75%, 90%, ou 95% de células alvo) . A quantificação da expressão génica numa célula pode mostrar quantidades semelhantes de inibição ao nível da acumulação de ARNm alvo ou tradução de proteína alvo. Como um exemplo, a eficiência da inibição pode ser determinada avaliando a quantidade de produto génico na célula: ARNm pode ser detetado com uma sonda de hibridação tendo uma sequência de nucleótidos fora da região utilizada para o ARN de cadeia dupla inibitório, ou o polipéptido traduzido pode ser detetado com um anticorpo criado com a sequência polipeptídica dessa região.

DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO ESPECÍFICAS São descritos métodos e composições para modulação, por exemplo, redução, da expressão de sequências codificantes em mamíferos. Na presente invenção, uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de um siARN ou shARN ou um molde de transcrição dos mesmos, conforme descrito anteriormente, é para utilização num método de tratamento que compreende a administração da composição a um mamífero adulto, por exemplo, através de um protocolo de administração hidrodinâmico.

Antes da invenção em causa ser adicionalmente descrita, deve ser entendido que a invenção não está limitada às formas de realização particulares da invenção descritas abaixo, já que variações das formas de realização particulares podem ser feitas e ainda caem dentro do âmbito das reivindicações anexas. Também deve ser entendido que a terminologia empregue no presente documento é para o propósito de descrição de formas de realização particulares, e não se destina a ser limitante. Em vez disso, o âmbito da presente invenção será estabelecido pelas reivindicações anexas.

Na presente memória descritiva e nas reivindicações anexas, as formas singulares "uma", "um" e "o/a" incluem os respetivos plurais a não ser que o contexto claramente dite o contrário. A não ser que definido o contrário, todos os termos técnicos e científicos utilizados no presente documento possuem o mesmo significado como habitualmente entendido por um perito na especialidade à qual esta invenção pertence.

Quando um intervalo de valores é proporcionado, entende-se que cada valor interveniente, até à décima da unidade do limite inferior a menos que o contexto claramente indique o contrário, entre o limite superior e inferior desse intervalo, e qualquer outro valor mencionado ou interveniente nesse limite indicado, está englobado na presente invenção. Os limites superior e inferior destes intervalos mais pequenos podem, independentemente, ser incluídos nos limites mais pequenos, e estão também englobados na presente invenção, sujeitos a qualquer limite especificamente excluído no intervalo indicado. Quando o intervalo indicado inclui um ou ambos os limites, intervalos que excluam um ou ambos daqueles limites incluídos estão também incluídos na invenção.

A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos utilizados no presente documento possuem o mesmo significado como habitualmente entendido por um perito na especialidade à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos, dispositivos e materiais semelhantes ou equivalente àqueles descritos no presente documento podem ser utilizados na prática ou testagem da invenção, até à extensão de que caem dentro das reivindicações, métodos, dispositivos e materiais representativos são agora descritos. iARN EM MAMÍFEROS NÃO EMBRIONÁRIOS

Conforme resumido acima, a invenção em causa proporciona composições para utilização na realização de iARN em mamíferos não embrionários, especificamente mamíferos adultos. Na descrição adicional deste aspeto da invenção em causa, os métodos em causa de iARN são primeiramente descritos em maior detalhe, seguidos por uma revisão de várias aplicações representativas nas quais a invenção em causa encontra utilidade bem como kits que encontram utilizada na prática da invenção em causa.

MÉTODOS

Conforme indicado acima, um aspeto da invenção em causa proporciona composições para utilização em método de empregar iARN para reduzir a expressão de um gene ou genes alvo num hospedeiro mamífero não embrionário. Por reduzir a expressão entende-se que o nível de expressão de um gene ou sequência codificante alvo é reduzido ou inibido em pelo menos 2 vezes, normalmente em pelo menos 5 vezes, por exemplo, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes ou mais, em comparação com um controlo. Em determinadas formas de realização, a expressão do gene alvo é reduzida até uma extensão que a expressão do gene/sequência codificante alvo é eficazmente inibida. Por modular a expressão de um gene alvo entende-se alterar, por exemplo, redução, a transcrição/tradução de uma sequência codificante, por exemplo, ADN genómico, ARNm etc., num polipéptido, por exemplo, proteína, produto. A invenção em causa proporciona composições para utilização em método de modulação da expressão de um gene alvo num organismo mamífero não embrionário, mais especificamente um mamífero adulto. Por organismo mamífero não embrionário entende-se um organismo mamífero que não é um embrião, isto é, encontra-se num estado de desenvolvimento que é posterior no tempo do que o estádio embrionário de desenvolvimento, por exemplo, um feto, ou um organismo hospedeiro num estádio pós-natal de desenvolvimento, por exemplo, juvenil, adulto, etc.

Na prática dos métodos em causa, uma quantidade eficaz de um agente de iARN é administrada a um organismo hospedeiro para modular a expressão de um gene alvo de uma forma desejável, por exemplo, para alcançar a redução desejada na expressão génica de uma célula alvo.

Por agente de iARN entende-se um agente que modula a expressão de um gene alvo através de um mecanismo de interferência de ARN. Os agentes de iARN empregues na invenção em causa são pequenas moléculas de ácido ribonucleico (também referidas no presente documento como ácidos ribonucleicos interferentes) , isto é, oligorribonucleótidos, que estão presentes em estruturas dúplex, por exemplo, dois oligorribonucleótidos distintos hibridam um com o outro ou um único ribonucleótido que assume uma formação de hairpin pequena para produzir uma estrutura dúplex. Por oligorribonucleótido entende-se um ácido ribonucleico que não excede cerca de 100 nt de comprimento, e tipicamente não excede cerca de 75 nt de comprimento, quando o comprimento de determinadas formas de realização é menor do que cerca de 70 nt. Nalgumas formas de realização, Quando o agente de ARN é uma estrutura dúplex de dois ácidos ribonucleicos distintos hibridados um com o outro, por exemplo, um siARN (tal como um d-siARN conforme descrito no pedido copendente com número de série 60/377.704), o comprimento da estrutura dúplex é desde cerca de 15 a 29 pb, onde comprimentos entre cerca de 20 e 29 pbs, por exemplo, 21 pb, 22 pb, são de interesse particular em determinadas formas de realização. Quando o agente de ARN é uma estrutura dúplex de um único ácido ribonucleico que está presente numa formação de hairpin, isto é, um shARN, o comprimento da porção hibridada do hairpin é tipicamente o mesmo que o propocionado acima para o tipo de agente de siARN ou mais comprida em 4-8 nucleótidos até à medida em que isto cabe no âmbito das reivindicações. O peso dos agentes de iARN desta forma de realização varia, tipicamente, desde cerca de 5.000 daltons até cerca de 35.000 daltons, e em muitas formas de realização é pelo menos cerca de 10.000 daltons e menos do que cerca de 27.500 daltons, frequentemente, menos do que cerca de 25.000 daltons.

Em determinadas formas de realização, em vez do agente de iARN ser um ácido ribonucleico interferente, por exemplo, um siARN ou shARN conforme descrito acima, o agente de iARN pode codificar um ácido ribonucleico interferente, por exemplo, um shARN, conforme descrito anteriormente. Por outras palavras, o agente de iARN pode ser um molde transcricional do ácido ribonucleico interferente. Nestas formas de realização, o molde transcricional é um ADN que codifica o ácido ribonucleico interferente, presente num vetor, onde uma variedade de vetores diferentes é conhecida na técnica, por exemplo, um vetor plasmidico, um vetor viral, etc. O agente de iARN pode ser administrado ao hospedeiro mamífero não embrionário utilizando qualquer protocolo conveniente, onde o protocolo empregue é tipicamente um protocolo de administração de um ácido nucleico, onde um número de tais protocolos diferentes é conhecido na técnica. A seguinte discussão proporciona uma revisão dos protocolos de administração de ácidos nucleicos representativos que podem ser empregues. Os ácidos nucleicos podem ser introduzidos nos tecidos ou células hospedeiras através de uma série de vias, incluindo infeção virai, microinjeção, ou fusão de vesículas. A injeção a jato pode ser utilizada para a administração intramuscular, conforme descrito por Furth et ai. (1992), Anal Biochem 205:365-368. Os ácidos nucleicos podem ser revestidos em micropartícuias de ouro, e distribuídos por via intradérmica através de um dispositivo de bombardeamento de partículas, ou "biobalística" conforme descrito na literatura (veja-se, por exemplo, Tang et al. (1992), Nature 356:152-154), onde microprojéteis de ouro são revestidos com o ADN, e depois bombardeados nas células da pele. Os vetores de expressão podem ser utilizados para introduzir os ácidos nucleicos numa célula. Tais vetores têm geralmente sítios de restrição convenientes localizados perto da sequência promotora para proporcionar a inserção de sequências de ácidos nucleicos. As cassetes de transcrição podem ser preparadas compreendendo uma região de iniciação da transcrição, o gene alvo ou fragmento do mesmo, e uma região de terminação transcricional. As cassetes de transcrição podem ser introduzidas numa variedade de vetores, por exemplo, plasmídeo; retrovirus, por exemplo, lentivírus; adenovirus; e semelhantes, onde os vetores são capazes de ser transientemente ou estavelmente mantidos nas células, normalmente durante um período de pelo menos cerca de um dia, mais normalmente durante um período de cerca de vários dias até várias semanas.

Por exemplo, o agente de iARN pode ser alimentado diretamente a, injetado, no organimo hospedeiro que contém o gene alvo. O agente pode ser diretamente introduzido na célula (ou seja, intracelularmente); ou introduzido extracelularmente numa cavidade, espaço intersticial, na circulação de um organismo, introduzido oralmente, etc. Métodos para a introdução oral incluem mistura direta de ARN com o alimento do organismo. Métodos físicos de introdução de ácidos nucleicos incluem injeção diretamente na célula ou injeção extracelular no organismo de uma solução de ARN. 0 agente pode ser introduzido numa quantidade que permite a distribuição de pelo menos uma cópia por célula. Doses mais elevadas (por exemplo, pelo menos 5, 10, 100, 500 ou 1000 cópias por célula) do agente podem produzir uma inibição mais eficaz; doses mais baixas podem também ser úteis para aplicações específicas.

Em determinadas formas de realização, um protocolo de administração de ácidos nucleicos hidrodinâmica é empregue. Quando o agente é um ácido ribonucleico, o protocolo de administração de ácidos ribonucleicos hidrodinâmica descrito em detalhe abaixo é de interesse particular. Quando o agente é um ácido desoxirribonucleico, os protocolos de administração hidrodinâmica de ácidos desoxirribonucleicos descritos em Chang et al., J. Virol. (2001) 75:3469-3473; Liu et al., Gene Ther. (1999) 6:1258-1266; Wolff et al., Science (1990) 247: 1465-1468; Zhang et al., Hum. Gene Ther. (1999) 10:1735-1737: e Zhang et al., Gene Ther. (1999) 7:1344-1349; são de interesse.

Protocolos de distribuição de ácidos nucleicos adicionais de interesse incluem, mas não estão limitados a: àqueles descritos nos documentos de Patente U.S. de interesse 5.985.847 e 5.922.687 (as divulgações dos quais são incorporadas no presente documento como referência); documento WO/11092; Acsadi et al., New Biol. (1991) 3:71-81; Hickman et al., Hum. Gen. Ther. (1994) 5:1477-1483; e Wolff et al., Science (1990) 247: 1465-1468; etc.

Dependendo da natureza do agente de iARN, o(s) agente(s) ativo(s) pode(m) ser administrado(s) ao hospedeiro utilizando quaisquer meios convenientes capazes de resultar na modulação desejada da expressão génica alvo. Assim, o agente pode ser incorporado numa variedade de formulações para administração terapêutica. Mais particularmente, os agentes da presente invenção podem ser formulados em composições farmacêuticas através da combinação com portadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis, e podem ser formulados em preparações nas formas sólida, semi-sólida, líquida ou gasosa, tais como comprimidos, cápsulas, pós, grânulos, pomadas, soluções, supositórios, injeções, inalantes e aerossóis. Como tal, a administração dos agentes pode ser alcançada de várias formas, incluindo administração oral, bucal, retal, parentérica, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, intratraqueal, etc..

Em formas farmacêuticas, os agentes podem ser administrados sozinhos ou numa associação apropriada, bem como em combinação, com outros compostos farmaceuticamente ativos. Os seguintes métodos e excipientes são meramente exemplares e não são de modo algum limitativos.

Para as preparações orais, os agentes podem ser utilizados sozinhos ou em combinação com aditivos apropriados para fabricar comprimidos, pós, grânulos ou cápsulas, por exemplo, com aditivos convencionais, tais como lactose, manitol, amido de milho ou amido de batata; com ligantes, tais como celulose cristalina, derivativos da celulose, acácia, amido de milho ou gelatinas; com desintegrantes, tais como amido de milho, amido de batata ou carboximetilcelulose sódica; com lubrificantes, tais como talco ou estearato de magnésio; e se desejado, com diluentes, agentes de tamponamento, agentes humectantes, conservantes e aromatizantes.

Os agentes podem ser formulados em preparações para injeção através da sua dissolução, suspensão ou emulsificação num solvente aquoso ou não aquoso, tal como óleo vegetal ou outros óleos, glicéridos ácidos alifáticos sintéticos, ésteres de ácidos alifáticos superiores ou propilenoglicol; e se desejado, com aditivos convencionais tais como solubilizantes, agentes isotónicos, agentes de suspensão, agentes emulsificantes, estabilizantes e conservantes.

Os agentes podem ser utilizados em formulação de aerossóis para serem administrados através de inalação. Os compostos da presente invenção podem ser formulados em propulsores aceitáveis pressurizados tais como diclorodifluorometano, propano, azoto e semelhantes.

Além disso, os agentes podem ser feitos em supositórios através de mistura com uma variedade de bases tais como bases emulsificantes ou bases solúveis em água. Os compostos da presente invenção podem ser administrados retalmente através de um supositório. 0 supositório pode incluir veículos tais como manteiga de cacau, carboceras e polietilenoglicóis, que derretem à temperatura corporal, mas estão solidificados à temperatura ambiente.

Formas farmacêuticas unitárias para administração oral ou retal tais como xaropes, elixires, e suspensões podem ser proporcionadas em que cada unidade de dosagem, por exemplo, colher de chá, colher de sopa, comprimido ou supositório, contém uma quantidade predeterminada da composição que contém um ou mais inibidores. De forma semelhante, formas farmacêuticas unitárias para injeção ou administração intravenosa podem compreender o(s) inibidor(es) numa composição como uma solução em água estéril, solução salina normal ou outro portador farmaceuticamente aceitável. 0 termo "forma farmacêutica unitária", conforme utilizado no presente documento, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para sujeitos humanos e animais, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de compostos da presente invenção calculados numa quantidade suficiente para produzir o efeito desejado em associação com um diluente, portador ou veiculo farmaceuticamente aceitável. As especificações para as novas formas farmacêuticas unitárias da presente invenção dependem do composto particular empregue e do efeito a ser alcançado, e da farmacodinâmica associada com cada composto no hospedeiro.

Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como veículos, adjuvantes, portadores ou diluentes, estão prontamente disponíveis ao público. Além disso, substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes de ajuste do pH e agentes de tamponamento, agentes de ajuste da tonicidade, estabilizantes, agentes humectantes e semelhantes estão prontamente disponíveis ao público. Aqueles peritos na especialidade irão apreciar prontamente que os níveis de dose podem variar como uma função do composto específico, da natureza do veículo de distribuição, e semelhantes. Dosagens preferidas para um dado composto são prontamente determináveis pelos peritos na especialidade através de uma variedade de meios. A administração de uma quantidade eficaz de um agente de iARN a um hospedeiro mamífero não embrionário de acordo com os resultados descritos acima numa modulação da expressão de gene(s) alvo, por exemplo, uma redução da expressão de gene(s) alvo, conforme descrito anteriormente.

Os métodos descritos acima funcionam em qualquer mamífero, onde mamíferos representativos de interesse incluem, mas não estão limitados a: ungulados ou animais com cascos, por exemplo, gado, cabras, porcos, ovelhas, etc.; roedores, por exemplo, hámsters, ratinhos, ratos, etc.; lagomorfos, por exemplo, coelhos; primatas por exemplo, macacos, babuínos, seres humanos, etc.; e semelhantes.

Os métodos descritos anteriormente encontram utilidade numa variedade de aplicações diferentes, tipos respresentativos das quais são agora descritas em maior detalhe abaixo.

UTILIDADE

Os métodos descritos no presente documento encontram utilidade numa variedade de aplicações diferentes, onde aplicações representativas incluem ambas aplicações académicas/de investigação e aplicações terapêuticas. Cada um destes tipos de aplicações representativas é descrito em detalhe mais completo abaixo. A presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica para utilização num método de tratamento.

Aplicação Académica/de Investigação

Os métodos descritos no presente documento encontram utilidade numa variedade de aplicações académicas e de investigação, nas quais se deseja modular a expressão de um ou mais genes alvo (sequências codificantes) num hospedeiro mamífero, por exemplo, para determinar a função de um gene/sequência alvo num hospedeiro mamífero. Os métodos encontram utilidade particular em ensaios do tipo de "perda de função", onde se empregam os métodos em causa para reduzir ou diminuir ou inibir a expressão de um ou mais genes/sequências codificantes de interesse num hospedeiro mamífero.

Como tal, uma utilidade representativa é como um método de identificação da função génica num mamífero não embrionário, onde o agente de iARN é administrado a um mamífero de modo a inibir a atividade de um gene alvo de função previamente desconhecida. Em vez do isolamento laborioso e moroso de mutantes através do rastreio genético tradicional, a genómica funcional utilizando os métodos em causa determina a função de genes não caracterizados através da administração de um agente de iARN para redução da quantidade e/ou alterar o momento da atividade génica alvo. Tais métodos podem ser utilizados na determinação de alvos potenciais para agentes farmacêuticos, compreensão de eventos normais e patológicos associados com o desenvolvimento, determinação de vias de sinalização responsáveis pelo desenvolvimento/envelhecimento pós-natal, e semelhantes. 0 aumento de velocidade da aquisição de informação de sequências de nucleótidos a partir fontes genómicas e de genes expressos, incluindo sequências totais para genomas mamíferos, podem ser acopladas com a utilização dos métodos para determinar a função génica num organismo mamífero vivo. A preferência de diferentes organismos para utilizar codões particulares, a pesquisa de bases de dados de sequências para produtos génicos relacionados, a correlação do mapa de ligações de atributos genéticos com o mapa físico a partir do qual as sequências de nucleótidos são derivadas, e métodos de inteligência artificial podem ser utilizados para definir supostas grelhas de leitura a partir das sequências de nucleótidos adquiridas em tais projetos de sequenciação.

Um simples ensaio representativo inibe a expressão génica de acordo com a sequência parcial disponível a partir de uma etiqueta de sequência expressa (EST). Alterações funcionais no crescimento, desenvolvimento, metabolismo, e resistência à doença, ou outros processos biológicos seriam indicativas do papel normal do produto génico das ESTs. A função do gene alvo pode ser avaliada a partir dos efeitos que tem no mamífero quando a atividade génica é inibida.

Se uma característica de um organismo é determinada como estando geneticamente ligada a um polimorfismo através de análise de RFLP ou QTL, a presente invenção pode ser utilizada para ganhar compreensão no que diz respeito a se o polimorfismo genético pode ser diretamente responsável pela característica. Por exemplo, um fragmento que define o polimorfismo genético ou sequências na vizinhança de um tal polimorfismo genético pode ser empregue para produzir um agente de iARN, agente o qual pode ser depois administrado ao mamífero, e pode ser determinado se uma alteração na característica está correlacionada com a inibição. Os métodos descritos no presente documento são úteis para permitir a inibição de genes essenciais. Tais genes podem ser necessários para a viabilidade dos organismos em apenas estádios particulares de desenvolvimento ou compartimentos celulares. 0 equivalente funcional de mutações condicionais pode ser produzido inibindo a atividade do gene alvo quando ou onde não é necessário para a viabilidade. 0 método permite a adição de um agente de iARN em momentos específicos do desenvolvimento e localizações no organismo sem introdução de mutações permanentes no genoma alvo.

Em situações onde o splicing alternativo produz uma família de transcritos que são distinguíveis através da utilização de exões característicos, os presentes métodos podem direcionar a inibição através dos exões apropriados para inibir especificamente ou para distinguir entre as funções de membros da família. Por exemplo, uma hormona que continha um domínio transmembranar alternativamente submetido a splicing pode ser expressa em ambas as formas ligada à membrana e secretada. Em vez de isolar uma mutação sem sentido que termina a translação antes do domínio transmembranar, as consequências funcionais de ter apenas hormona secretada podem ser determinadas de acordo com a invenção através do direcionamento do exão que contém o domínio transmembranar e inibindo assim a expressão de hormona ligada à membrana.

Aplicações Terapêuticas A presente invenção encontra utilidade numa variedade de aplicações terapêuticas nas quais é desejável modular, por exemplo, um ou mais genes alvo num mamífero, conforme descrito anteriormente. Em tais métodos, uma quantidade eficaz de um agente ativo de iARN é administrada ao mamífero hospedeiro. Por quantidade eficaz entende-se uma dosagem suficiente para modular a expressão do(s) gene(s) alvo, conforme desejado. Conforme indicado acima, em muitas formas de realização deste tipo de aplicação, os métodos em causa são empregues para reduzir/inibir a expressão de um ou mais genes alvo no hospedeiro de modo a alcançar um resultado terapêutico desejado.

Dependendo da natureza da condição a ser tratada, o gene alvo pode ser um gene derivado a partir da célula, um gene endógeno, um gene patologicamente mutado, por exemplo, um gene causador de cancro, um transgene, ou um gene de um agente patogénico que está presente na célula depois da infeção da mesma. Dependendo do gene alvo particular e da dose de agente de iARN administrada, o procedimento pode propocional a perda completa ou parcial de função do gene alvo. Doses mais baixas de material injetado e períodos de tempo mais longos após a administração do agente de iARN podem resultar na inibição numa fração mais pequena de células.

Os métodos em causa encontram utilidade no tratamento de uma variedade de condições diferentes nas quais a modulação da expressão de genes alvo num hospedeiro mamífero é desejada. Por tratamento entende-se que pelo menos uma melhoria dos sintomas associados com a condição que afeta o hospedeiro é alcançada, onde melhoria é utilizada num sentido lato para referir-se a, pelo menos, uma redução na magnitude de um parâmetro, por exemplo, sintoma, associado com a condição a ser tratada. Como tal, tratamento também inclui situações onde a condição patológica, ou pelo menos um sintoma associado com a mesma, são completamente inibidos, por exemplo, prevenidos de acontecer, ou travados, por exemplo, terminados, de modo que o hospedeiro já não sofre da condição, ou pelo menos dos sintomas que caracterizam a condição.

Uma variedade de hospedeiros é tratável de acordo com os métodos em causa. Geralmente tais hospedeiros são "mamíferos", onde estes termos são utilizados amplamente para descrever organismos que estão dentro da classe

Mammalia, incluindo as ordens carnivora (por exemplo, cães e gatos), rodentia (por exemplo, ratinhos, porquinhos-da-índia, e ratos), e primatas (por exemplo, seres humanos, chimpanzés, e macacos). Em muitas formas de realização, os hospedeiros serão seres humanos. A presente invenção não está limitada à modulação da expressão de qualquer tipo específico de gene ou sequência codificante alvo. Classes representativas de genes alvo de interesse incluem mas não estão limitadas a: genes de desenvolvimento (por exemplo, moléculas de adesão, inibidores da ciclina quinase, citocinas/linfocinas e os seus recetores, fatores de crescimento/diferenciação e os seus recetores, neurotransmissores e os seus recetores); oncogenes (por exemplo, ABLI, BCLI, BCL2, BCL6, CBFA2, CBL, CSFIR, ERBA, ERBB, EBRB2, ETSI, ETS1, ETV 6, FOR, FOS, FYN, HCR, HRAS, JUN, KRAS, LCK, LYN, MDM2, MLL, MYB, MYC, MYCLI, MYCN, NRAS, PIM 1, PML, RET, SRC, TALI, TCL3, e YES); genes supressores de tumores (por exemplo, APC, BRCA 1, BRCA2, MADH4, MCC, NF 1, NF2, RB 1, TP53, e WTI); e enzimas (por exemplo, ACC sintases e oxidases, ACP desaturases e hidroxilases, ADP-glucose piroforilases, ATPases, álcool desidrogenases, amilases, amiloglucosidases, catalases, celulases, chalcona sintases, quitinases, ciclooxigenases, descarboxilases, dextrinases, ADN e ARN polimerases, galactosidases, glucanases, glucose oxidases, sintases de amido ligadas a grânulos, GTPases, helicases, hemicelulases, integrases, inulinases, invertases, isomerases, cinases, lactases, Upases, lipoxigenases, lisozimas, nopalina sintases, octopina sintases, pectinesterases, peroxidases, fosfatases, fosfolipases, fosforilases, fitases, sintases reguladoras do crescimento vegetal, poligalacturonases, proteinases e peptidases, pulanases, recombinases, transcriptases reversas, RUBISCOs, topoisomerases, e xilanases); quimiocinas (por exemplo, CXCR4, CCR5), o componente de ARN da telomerase, fator de crescimento endotelial vascular-(VEGF), recetor de VEGF, fatores de necrose tumoral e fator nuclear kappa B, fatores de transcrição, moléculas de adesão celular, fator de crescimento semelhante a insulina, membros da família do fator beta transformante do crescimento, recetores da superfície celular, proteínas de ligação a ARN (por exemplo, pequenos ARNs nucleolares, fatores de transporte de ARN), fatores de tradução, transcriptase reversa de telomerase); etc..

KITS

Também são descritos no presente documento reagentes e kits dos mesmos para praticar um ou mais dos métodos referidos acima. Os reagentes e kits dos mesmos podem variar grandemente. Tipicamente, os kits incluem, pelo menos, um agente de iARN conforme descrito acima.

Em adição aos componentes acima, os kits incluirão adicionalmente instruções para praticar os métodos em causa. Estas instruções podem estar presentes nos kits numa variedade de formas, uma ou mais das quais podem estar presentes nos kits. Uma forma na qual estas instruções podem estar presentes é como informação impressa num meio ou substrato adequado, por exemplo, um pedaço ou pedaços de papel nos quais a informação é impressa, na embalagem do kit, num folheto informativo, etc. Ainda outro meio seria um meio legível por computador, por exemplo, disquete, CD, etc., no qual a informação pode ser gravada. Ainda outro meio que pode estar presente é um endereço de website que pode ser utilizado através da internet para aceder à informação num local retirado. Quaisquer meios convenientes podem estar presentes nos kits.

ADMINISTRAÇÃO HIDRODINÂMICA DE ARN NU

Também são descritos no presente documento métodos e composições para a introdução in vivo de um ácido nucleico nu, por exemplo, ácido ribonucleico, desoxirribonucleico ou ácidos nucleicos quimicamente modificados (incluindo, mas não limitados a, morfolino, ácidos nucleicos peptídicos, metilfosfonato, fosforotioato ou oligonucleótidos de 2'-ometilo), na célula alvo de um organismo vascularizado, por exemplo, um mamífero. Estes métodos são convenientemente referidos como métodos "hidrodinâmicos".

Numa forma de realização dos métodos descritos, uma formulação aquosa de um ácido nucleico nu e um inibidor de ARNase é administrado no sistema vascular do organismo. Em muitas formas de realização, a formulação aquosa também inclui um ácido ribonucleico competidor, por exemplo, um ácido ribonucleico não poliadenilado e não capeado. Ainda noutras formas de realização, a coadministração de ADN capaz de ser transcrito na molécula de ARN com agentes moduladores candidatos é realizada sem um inibidor da ARNase ou ácido ribinucleico competidor, onde o agente modulador e o ADN podem ou não ser distribuídos como uma composição única. Os métodos descritos encontram utilidade numa variedade de aplicações diferentes, incluindo tanto aplicações de investigação como terapêuticas, e são particularmente adequados para utilização na distribuição in vivo de um ácido ribonucleico a uma célula hepática, por exemplo, para distribuição de ácidos nucleicos in vivo direcionada ao fígado.

Na descrição adicional deste aspeto da invenção em causa, os métodos descritos serão primeiramente descritos seguidos por uma descrição de aplicações representativas nas quais os métodos descritos encontram utilidade e kits para utilização na prática dos métodos em causa.

MÉTODOS

Conforme resumido acima, é descrito no presente documento um método para a introdução in vivo de um ácido nucleico, por exemplo, um ácido ribonucleico, numa célula alvo presente num organismo multicelular vascularizado. Através de introdução in vivo entende-se que, nos métodos em causa, a célula alvo na qual o ácido nucleico é introduzido é uma que está presente num organimo mult icelular, isto é, não é uma célula que está separada de, por exemplo, removida, do organismo multicelular. Como tal, os métodos descritos são distintos dos protocolos de transferência de ácidos nucleicos in vitro, nos quais um ácido nucleico é introduzido numa célula ou células separadas do organismo multicelular a partir do qual originaram, por exemplo, encontram-se em cultura. Por outras palavras, os métodos descritos não são métodos de transferência de ácidos nucleicos in vitro.

Por introdução do ácido nucleico entende-se que o ácido nucleico, por exemplo, ácido desoxirribonucleico (ADN) ou ácido ribonucleico (ARN) ou um análogo de ácido nucleico que não ocorre naturalmente, é inserido no citoplasma de uma célula alvo. Por outras palavras, o ácido nucleico é movido a partir do exterior da célula alvo para o interior da célula alvo através da membrana celular.

Por organismo multicelular vascularizado entende-se um organismo multicelular que inclui um sistema vascular. Organismos multicelulares de interesse incluem plantas e animais, onde os animais são de interesse particular, particularmente animais vertebrados que têm um sistema vascular composto por um sistema de veias e artérias através do qual o sangue flui, por exemplo, em resposta ao batimento de um coração. Animais de interesse são mamíferos em muitas formas de realização. Mamíferos de interesse incluem; roedores, por exemplo, ratinhos, ratos; animais de pecuária, por exemplo, porcos, cavalos, vacas, etc., animais de estimação, por exemplo, cães, gatos; e primatas, por exemplo, seres humanos. Em determinadas formas de realização, o organismo multicelular é um ser humano. Noutras formas de realização, o organimos multicelular é um mamífero não humano, por exemplo, um roedor, tal como um ratinho, rato, etc.

Conforme mencionado acima, os métodos descritos são, no sentido mais lato, adequados para a introdução de ácidos nucleicos na célula alvo de um hospedeiro. 0 termo "ácido nucleico" conforme utilizado no presente documento é um polímero composto de nucleótidos, por exemplo, desoxirribonucleótidos ou ribonucleótidos, ou compostos produzidos sinteticamente (por exemplo, PNA conforme descrito no documento de Patente U.S. 5.948.902 e referências citadas no mesmo) que podem hibridar com ácidos nucleicos de ocorrência natural de uma forma específica de sequência análoga àquela de dois ácidos nucleicos de ocorrência natural. Os termos "ácido ribonucleico" e "ARN" conforme utilizados no presente documento significam um polímero composto de ribonucleótidos. Os termos "ácido desoxirribonucleico" e "ADN" conforme utilizados no presente documento significam um polímero composto de desorribonucleótidos.

Os métodos descritos são particularmente adequados para utilização na distribuição de um ácido ribonucleico numa célula alvo de um organismo multicelular. Como tal, os métodos serão agora adicionalmente descritos em termos da distribuição de ácidos ribonucleicos. Contudo, os seguintes protocolos são também adequados para utilização na distribuição de outros ácidos nucleicos, por exemplo, ADNs (tais como ADN plasmídico), etc.

Na prática dos métodos descritos, uma composição aquosa do ácido ribonucleico no qual o ácido ribonucleico está presente como um ácido ribonucleico nu é administrada ao sistema vascular do organismo multicelular ou hospedeiro. Em muitas formas de realização, a composição ou formulação aquosa de ARN nu é administrada à veia do hospedeiro, ou seja, a formulação de ARN nu é administrada por via intravenosa. Em determinadas formas de realização, a formulação de ARN nu é administrada por via intravenosa ao hospedeiro através de uma injeção de alta pressão. Por injeção de alta pressão entende-se que a formulação aquosa é introduzida por via intravenosa a uma pressão elevada, onde a pressão elevada é geralmente pelo menos cerca de 20, normalmente pelo menos cerca de 30 mmHg. Em muitas formas de realização, a pressão elevada varia desde cerca de 10 a 50 mmHg, onde 40 a 50 mmHg são normalmente preferidos. Métodos de administração de formulações aquosas sob alta pressão, tais como aqueles descritos acima, são descritos nas referências listadas na secção de literatura relevante, supra.

Conforme mencionado acima, o ARN ou ADN que será introduzido na célula alvo através dos métodos descritos está presente na formulação aquosa como ARN nu. Por "nu" entende-se que o ARN está isento de qualquer veiculo de distribuição que pode atuar para facilitar a entrada na célula alvo. Por exemplo, os ARNs ou ADNs nus distribuídos nos métodos em causa são isentos de qualquer material que promove a transfeção, tal como formulações lipossomais, lipidos com carga ou agentes de precipitação, por exemplo, não estão complexados com materiais coloidais (incluindo preparações lipossómicas). Adicionalmente, os ARNs nus não estão contidos num vetor que poderia causar a integração do ARN no genoma da célula alvo, ou seja, estão isentos de sequências ou partículas virais que carregam informação genética.

Os ARNs nus que podem ser distribuídos podem variar amplamente em comprimento, dependendo da sua finalidade, por exemplo, da proteína que codificam, etc. Geralmente, os ARNs nus terão pelo menos 10 nt de comprimento, normalmente pelo menos cerca de 30 nt de comprimento e mais normalmente pelo menos cerca de 35 nt de comprimento, onde os ARNs nus podem ter 20.000 nt de comprimento ou mais, mas geralmente não excederão cerca de 10.000 nt de comprimento e normalmente não excederão cerca de 6.000 nt de comprimento. Em determinadas formas de realização onde o ARN nu é um agente de iARN de acordo com a invenção, conforme descrito anteriormente, o comprimento do ARN varia desde cerca de 15 até 30 nt, incluindo 15 a 25 nt, tais como 20 a 25 nt, por exemplo, 21 ou 22 nt.

Os ARNs nus que podem ser introduzidos numa célula alvo de acordo com os métodos descritos podem ou não codificar uma proteína, ou seja, podem ou não ser capazes de serem traduzidos numa proteína após a introdução na célula alvo. Nessas formas de realização onde o ARN nu é capaz de ser traduzido numa proteína após introdução na célula alvo, o ARN nu pode ou não ser capeado, pode incluir um domínio IRES, etc. No entanto, em muitos protocolos particulares desta forma de realização, o ARN nu é capeado. Além disso, o ARN nestas formas de realização inclui geralmente pelo menos um sinal de poliadenilação, e em muitas formas de realização é poliadenilado, onde a cauda de poliA, quando estiver presente, varia, normalmente, em comprimento desde cerca de 10 a 300, normalmente desde 30 a 50. Uma descrição adicional dos ARNs nus é proporcionada abaixo.

Conforme mencionado acima, uma formulação aquosa do ARN nu é administrada ao hospedeiro por via intravascular, normalmente intravenosa. Nas formulações aquosas empregues nos métodos descritos, uma quantidade eficaz do ARN nu é combinada com um veículo de distribuição aquoso. Por quantidade eficaz entende-se uma quantidade que é suficiente para proporcionar a quantidade desejada de transferência para a célula alvo, por exemplo, para proporcionar o resultado desejado, tal como uma quantidade desejada de expressão proteica. Em muitas formas de realização, a quantidade de ARN presente na formulação aquosa é pelo menos cerca de 5 microgramas, normalmente pelo menos cerca de 10 microgramas e mais normalmente pelo menos cerca de 20 microgramas, onde a quantidade pode ser tão grande como 10 miligramas ou mais, mas geralmente não excede cerca de 1 miligrama e normalmente não excede cerca de 200 microgramas.

Veículos de distribuição aquosos de interesse incluem: água, solução salina e meios tamponados. Veículos específicos de interesse incluem: solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, lactato de Ringer, solução salina tamponada com fosfato, etc. Os veículos de distribuição aquosos podem incluir adicionalmente conservantes e outros aditivos, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes, reabastecedores de nutrientes, reabastecedores de eletrólitos, catiões divalentes, tais como magnésio, cálcio e manganês, etc. De interesse particular em muitas formas de realização é a utilização de soluções salinas tamponadas que são pseudofisiológicas.

Uma característica de determinadas formas de realização dos métodos descritos é que o ARN nu é introduzido no sistema vascular do organismo multicelular em combinação com um inibidor da ARNase. Por inibidor da ARNase entende-se um composto ou agente que pleo menos reduz a atividade de, se não inativa completamente, uma atividade de ARNase no organismo multicelular. Em muitas formas de realização, o inibidor de ARNase é um inibidor de proteína de ARNase, onde o inibidor de ARNase placentária humana é de particular interesse. O inibidor da ARNase de proteínas pode ser purificado a partir de uma fonte natural ou produzida sinteticamente, por exemplo, através de técnicas recombinantes. O inibidor da ARNase placentária humana pode ser obtido a partir de uma variedade de fontes diferentes sob uma variedade de nomes comerciais diferentes, onde fontes representativas incluem: Promega, Inc., Strategene, Inc., Fisher Scientific, Inc., e semelhantes.

Enquanto o inibidor de ARNase pode, em determinadas formas de realização, ser administrado ao hospedeiro numa composição separada da composição de ARN nu aquosa, em muitas formas de realização o inibidor de ARNase está presente na composição de ARN nu aquosa. A quantidade de inibidor de ARNase que está presente na composição aquosa é suficiente para proporcionar a absorção desejada do ARN nu. Quando o inibidor de ARNase é um inibidor de proteína, a concentração do inibidor na composição aquosa que é introduzida no organismo multicelular durante a prática dos métodos em causa pode variar desde cerca de 4 até 4.000 unidades, normalmente desde cerca de 400 a 4.000 unidades e mais normalmente desde cerca de 400 a 1.500 unidades.

Em determinadas formas de realização, o ARN nu e inibidor de ARNase são administrados em conjunto com um ARN competidor. Por ARN competidor entende-se um ARN que é capaz de servir como um inibidor competitivo da atividade de ARNase. Em muitas formas de realização, o ARN competidor é não capeado e não poliadenilado. Por não capeado entende-se que o ARN competidor carece da estrutura de capeamento encontrada na extremidade 5' de ARN mensageiro eucariótico, ou seja, carece de um 7 metilo G em 5'. Por não poliadenilado entende-se que o ARN competidor carece de uma cauda de poliA ou domínio de poliadenilação na sua extremidade 3' , tal como é encontrado no ARN mensageiro eurcariótico. O comprimento do ARN competidor pode variar, mas é geralmente pelo menos cerca de 70 nt, normalmente pelo menos cerca de 200 nt e mais normalmente pelo menos cerca de 1.500 nt, onde o comprimento pode ser tão grande como 10.000 nt ou mais, mas geralmente não excede cerca de 3.500 nt e normalmente não excede cerca de 1.500 nt. A concentração de ARN competidor na composição aquosa é suficiente para proporcionar a proteção desejada do ARN nu (por exemplo, através de competição pela ligação a ARNase), e em muitas formas de realização varia desde cerca de 10 pg/ml até 10 mg/ml, normalmente desde cerca de 20 a 200 pg/ml e mais normalmente desde cerca de 40 até 150 pg/ml.

Os métodos descritos resultam numa transferência altamente eficiente do ARN administrado para o citoplasma da(s) célula(s) alvo. Os métodos descritos são particularmente adequados para transferir ARN para o citoplasma de células hepáticas ou esplénicas e células não parenquimatosas no fígado. Como tal, em muitas formas de realização os métodos descritos são métodos in vivo de alcançar uma transferência de altos níveis de ácido nucleico, por exemplo, ARN, para dentro de células hepáticas ou tecidos do fígado. 0 ácido nucleico que é introduzido na célula alvo através dos métodos descritos tem uma vida curta uma vez dentro da célula alvo. Dependendo da natureza particular do ácido nucleico, a semivida do ácido nucleico a seguir à introdução através dos métodos em causa varia, geralmente, entre cerca de 30 seg até 10 dias, normalmente desde cerca de 1 min até 24 h e mais normalmente desce cerca de 5 min até 10 h. Como tal, onde o ácido nucleico é um ARN que codifica um a proteína de interesse, a expressão proteica após a introdução através do meio em causa é transiente, durando, tipicamente, um período de tempo que varia desde cerca de 1 min até 3 dias, nornalmente desde cerca de 5 min até 24 h. Como tal, em muitas formas de realização dos métodos descritos, os métodos são métodos de proporcionar a expressão proteica transiente a partir de um transgene, onde a expressão proteica é igual à vida do ARN. No entanto, a proteína expressa pode ter uma vida mais longa, dependendo da natureza da proteína particular.

UTILIDADE

Os métodos descritos encontram utilidade numa variedade de diferentes aplicações nas quais a transferência in vivo eficiente de um ácido nucleico nu para uma célula alvo é desejada. Aplicações nas quais os métodos descritos encontram utilidade incluem ambas aplicações terapêuticas e de investigação. As aplicações terapêuticas de interesse incluem aplicação de terapêutica génica, aplicações vacinais, e semelhantes. Aplicações de investigação de interesse incluem a produção de modelos animais para condições particulares, por exemplo, infeções virais de ARN, a observação da expressão génica em fenótipos para elucidar a função génica, etc. Outras aplicações nas quais o método descrito encontra utilidade incluem o desenvolvimento de terapêuticas de antissentido, ribozima e quimeraplastia (ou seja, a reparação de genes através de quimeras de ARN/ADN (veja-se por exemplo, Yoon et ai., Proc Natl Acad Sei USA (1996) 93(5) :2071-6; Cole-Strauss et al., Science (1996) 273 (5280) :1386-9; e Zhu et al.r Proc Natl Acad Sei USA (1999) 96(15):8768-73), bem como terapêuticas de ARN interferente (ARN cuja presença na célula impede a tradução de ARNs semelhantes, (Veja-se, por exemplo, Wianny et al. Nat Cell Biol (2000) 2(2) :70-5; e SiQun et al., Nature (1998) 391: 806 - 811).

Um tipo de aplicação na qual os métodos descritos encontram utilidade é na síntese de polipéptidos, por exemplo, proteínas, de interesse de uma célula alvo, particularmente na expressão transiente de um polipéptido. Em tais aplicações, um ácido nucleico que codifica o polipéptido de interesse em combinação com componentes de expressão necessários e/ou desejados, por exemplo, estruturas de capeamento a 5', domínios IRES, sinais ou caudas de poliA, etc., é introduzido na célula alvo através da administração in vivo ao organismo multicelular no qual a célula alvo reside, onde a célula alvo é para servir como um hospedeiro de expressão para expressão do polipéptido. Por exemplo, onde o ácido nucleico nu administrado pelos métodos em causa é ARN, o ARN é um ARN que é capaz de ser traduzido no citoplasma da célula alvo na proteína codificada pela sequência contida no ARN. O ARN pode ser capeado ou não capeado, onde quando é não capeado inclui, geralmente uma sequência IRES. Adicionalmente, o ARN inclui também, geralmente, uma cauda de poliA, onde o comprimento da cauda de poliA varia, tipicamente, desde cerca de 10 até 300, normalmente desde cerca de 30 a 50 nt. A seguir à administração in vivo e subsequente introdução na célula alvo, o organismo multicelular, e a célula hospedeira direcionada presente no mesmo, é depois mantida sob condições suficientes para expressão da proteína codificada pelo ARN transferido. A proteína expressa é depois colhida, e purificada onde desejado, utilizando qualquer protocolo conveniente.

Como tal, os métodos descritos proporcionam um meio para, pelo menos, potenciar a quantidade de uma proteína de interesse num organismo multicelular. O termo "pelo menos potenciar" inclui situações inde os métodos são empregues para aumentar a quantidade de uma proteína num organismo multicelular onde uma determinada quantidade inicial de proteína está presente antes da prática dos métodos. O termo "pelo menos potenciar" também inclui aquelas situações nas quais o organismo multicelular inclui substancialmente nenhuma da proteína antes da prática dos métodos. Como os métodos encontram utilidade em pelo menos potenciar a quantidade de uma proteína presente num organismo multicelular, eles encontram utilidade numa variedade de diferentes aplicações, incluindo aplicações de preparação farmacêutica e aplicações terapêuticas, onde as últimas são descritas em maior detalhe abaixo.

Aplicações terapêuticas nas quais os métodos descritos encontram utilidade incluem aplicações de terapêutica génica nas quais os métodos descritos são utilizados para potenciar o nível de uma proteína terapêutica no organismo hospedeiro e aplicações de vacinação, nas quais os métodos descritos são utilizados para vacinar o hospedeiro (ou desenvolver vacinas para distribuição através de outros métodos). Como são diferentes dos protocolos de expressão baseados em ADN, os protocolos de expressão baseados em ARN em causa não são complicados pela necessidade de um promotor, potenciador, repressor e outros elementos reguladores frequentemente associados com genes eucarióticos. Os métodos descritos podem ser utilizados para distribuir uma ampla variedade de ácidos nucleicos terapêuticos os quais, após a entrada na célula hospedeira, proporcionam o nível de proteína potenciado necessário no hospedeiro. Ácidos nucleicos terapêuticos de interesse incluem ácidos nucleicos que substituem genes defeituosos na célula hospedeira alvo, tais como aqueles responsáveis por condições de doença baseadas em defeitos genéticos, através da codificação de produtos que se supõe que são proporcionados ao hospedeiro por estes genes defeituosos; ácidos nucleicos que têm utilidade terapêutica no tratamento de cancro; e semelhantes. Produtos representativos envolvidos em condições de doença de genes defeituosos cujo nível pode ser potenciado através da prática dos métodos em causa incluem, mas não estão limitados a: fator VIII; fator IX, β-globina, recetor de proteína de baixa densidade, adenosina desaminase, fosforilase de nucleósidos de purina, esfingomielinase, glucocerebrosidase, regulador transmembranar de fibrose quística, α-antitripsina, CD-18, ornitina transcarbamilase, arginosuccinato sintetase, fenilalanina hidroxilase, a-cetoácido desidrogenase de cadeia ramificada, fumarilacetoacetato hidrolase, glucose 6-fosfatase, a-L-fucosidase, β-glucuronidase, α-L-iduronidase, galactose 1-fosfate uridiltransferase, e semelhantes. Ácidos nucleicos terapêuticos contra o cancro que podem ser distribuídos através dos métodos descritos incluem: ácidos nucleicos que potenciam a atividade antitumoral de linfócitos através da codificação de fatores apropriados, ácidos nucleicos cujo produto de expressão potência a imunogenicidade de células tumorais, ácidos nucleicos codificantes de supressor de tumor, ácidos nucleicos codificantes de toxinas, ácidos nucleicos codificantes de fator de suicídio, ácidos nucleicos codificantes de produtos de resistência a múltiplos fármacos, ribozimas, ribozimas de ADN, quimeras de ARN/ADN, ARN interferente e sequências antissentido, e semelhantes .

Uma caracteristica importante dos métodos descritos, conforme descrito acima, é que os métodos descritos podem ser utilizados para aplicações de terapêutica génica in vivo. Por aplicações de terapêutica génica in vivo entende-se que a célula ou células alvo nas quais a expressão do gene terapêutico é desejada não são removidas do hospedeiro antes da prática dos métodos descritos. Em contraste, as composições de ácidos nucleicos nus são administradas diretamente ao organismo multicelular e depois tomadas pelas células alvo, a seguir ao que ocorre a expressão do produto codificado.

Conforme mencionado acima, outra aplicação terapêutica na qual os métodos descritos encontram utilidade é na vacinação de um hospedeiro (bem como no desenvolvimento de uma vacina para ser distribuída por outros métodos). Nestes métodos, o ácido nucleico nu, por exemplo, ARN, que é administrado ao hospedeiro através dos métodos descritos codifica um imunogénio desejado que, após a entrada do ARN na célula alvo, é expresso e secretado para estimular a resposta imunitária desejada. Métodos de vacinação nos quais ácidos nucleicos nus são empregues e nos quais os métodos descritos de distribuição de ácidos nucleicos nus encontram utilidade são adicionalmente descritos no documento WO 90/11092.

Conforme mencionado acima, os métodos descritos também encontram utilidade em várias aplicações de investigação. Uma aplicação de investigação na qual o método descrito encontra utilidade é na produção de modelos animais de infeção virai de ARN, onde os vírus de ARN de interesse incluem: VHC, VIH, gripe A, Hepatite A, poliovirus, enterovirus, rinovírus, aftovírus e semelhantes. Para produzir tais modelos animais, são primeiramente fornecidas construções que incluem um ou mais elementos reguladores a partir dos virus de ARN de interesse operativamente ligados a um domínio repórter, por exemplo, um domínio que codifica um produto detetável (tal como luciferase, uma proteína fluorescente, etc.); etc. Alternativamente, construções de ADN que podem ser transcritas in vivo em tais construções de ARN podem ser empregues. Estas construções são depois administradas a um hospedeiro, por exemplo, um ratinho, de acordo com os métodos descritos para produzir um modelo animal de uma infeção pelo vírus de ARN correspondente. Como tal, também são proporcionados modelos animais de vírus de ARN produzidos pelos métodos descritos. Um protocolo representativo para a produção de um modelo animal de vírus de ARN é proporcionado na secção experimental abaixo.

Os métodos também encontram utilidade na distribuição de agentes terapêuticos e/ou de investigação de iARN, incluindo siARN e, shARN de acordo com a invenção, conforme descrito mais completamente acima e na secção experimental, abaixo.

Também são descritos métodos de rastreio de agentes candidatos de rastreio moduladores, por exemplo, potenciadores ou inibidores, utilizando tais modelos animais. Uma variedade de tipos diferentes de agentes candidatos pode ser rastreada de acordo com os métodos descritos. Agentes candidatos englobam numerosas classes químicas, embora, tipicamente, sejam moléculas orgânicas, preferivelmente, compostos de moléculas orgânicas pequenas tendo uma massa molecular de mais de 50 e menos do que cerca de 2.500 daltons. Agentes candidatos compreendem grupos funcionais necessários para interação estrutural com proteínas, particularmente ligação de hidrogénio, e, tipicamente, incluem pelo menos um grupo amina, carbonilo, hidroxilo ou carboxilo, preferivelmente pelo menos dois dos grupos químicos funcionais. Os agentes candidatos compreendem, frequentemente, estruturas de carbono cíclico ou heterocíclicas e/ou estruturas aromáticas ou poliaromáticas substituídas com um ou mais dos grupos funcionais acima. Agentes candidatos também são encontrados entre biomoléculas incluindo péptidos, sacarídeos, ácidos gordos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estruturais ou combinações dos mesmos.

De particular interesse em determinadas formas de realização são ácidos nucleicos antissentido. 0 reagente antissentido podem ser oligonucleótidos antissentido (ODN), particularmente ODN sintéticos tendo modificações químicas de ácidos nucleicos nativos, ou construções de ácidos nucleicos que expressam tais moléculas antissentido como ARN. A sequêcia antissentido é complementar ao ARNm do gene alvo, e inibe a expressão dos produtos génicos alvo. As moléculas antissentido inibem a expressão génica através de vários mecanismos, por exemplo, através da redução da quantidade de ARNm disponível para tradução, através da ativação de ARNase H, ou impedimento estérico. Uma ou uma combinação de moléculas antissentido podem ser administradas, onde uma combinação pode compreender múltiplas sequências diferentes.

As moléculas antissentido podem ser produzidas através da expressão de toda ou parte da sequência génica alvo num vetor apropriado, onde a iniciação transcricional é orientada de modo que a cadeia antissentido é produzida como uma molécula de ARN. Alternativamente, a molécula antissentido é um oligonucleótido sintético. Oligonucleótidos antissentido irão geralmente ter pelo menos cerca de 7, normalmente pelo menos cerca de 12, mais normalmente pelo menos cerca de 16 nucleótidos de comprimento, e não mais do que cerca de 500, normalmente não mais do que cerca de 50, mais normalmente não mais do que cerca de 35 nucleótidos de comprimento, onde o comprimento é governado pela eficiência da inibição, especificidade, incluindo a ausência de reatividade cruzada, e semelhantes. Verificou-se que oligonucleótidos curtos, de cerca de 7 a 8 bases de comprimento, podem ser inibidores fortes e seletivos da expressão génica (veja-se Wagner et al. (1996), Nature Biotechnol. 14:840-844).

Uma região ou regiões especificas da sequência de ARNm de cadeia de sentido endógena é escolhida para ser complementada pela sequência de antissentido. A seleção de uma sequência especifica para o oligonucleótido pode utilizar um método empírico, onde várias sequências candidatas são avaliadas quanto à inibição da expressão do gene alvo num modelo in vitro ou de modelo animal. Uma combinação de sequências pode também ser utilizada, onde várias regiões da sequência de ARNm são selecionadas quanto à complementariedade antissentido.

Os oligonucleótidos antissentido podem ser quimicamente sintetizados através de métodos conhecidos na técnica (veja-se Wagner et al. (1993), supra, e Milligan et al., supra.) Oligonucleótidos preferidos são quimicamente modificados da estrutura de fosfodiéster nativa, de modo a aumentar a sua estabilidade intracelular e afinidade de ligação. Um número de tais modificações foi descrito na literatura, que alteram a química da cadeia principal, açúcares ou bases heterocíclicas.

Entre as alterações úteis na química da estrutura principal são ligações de fosforodiamidato, metilfosfonatos fosforotioatos; fosforoditioatos, onde ambos os oxigénios que não são de ponte são substituídos com enxofre; fosforoamiditos; fosfotriésteres de alquilo e boranofosfatos. Derivados de fosfato aquirais incluem 3'-0-5'-S-fosforotioato, 3'-S-5'-O-fosforotioato, 3'-CH2-5'-0-fosfonato e 3'-NH-5'-O-fosforoamidato. Ácidos nucleicos peptídicos substituem toda a cadeia principal de fosfodiéster de ribose com uma ligação peptídica.

Modificações de açúcar são também utilizadas para potenciar a estabilidade e afinidade. Um exemplo é a substituição do açúcar ribose com um morfolino. 0 anómero-α de desoxirribose pode ser utilizado, onde a base é invertida em relação ao anómero-β natural. 0 2'-OH do açúcar ribose pode ser alterado para formar açúcares de 2,-0-metilo ou 2'-0-alilo, que proporciona resistência à degradação sem comprometer a afinidade. A modificação das bases heterocíclicas deve manter o adequado emparelhamento de bases. Algumas substituições úteis incluem desoxiuridina para desoxitimidina; 5-metil-2'-desoxicitidina e 5-bromo-2'-desoxicitidina para desoxicitidina. 5- propinil-2'-desoxiuridina e 5-propinil-2'-desoxicitidina demonstraram aumentar a afinidade e atividade biológica quando substituídas por desoxitimidina e desoxicitidina, respetivamente.

Agentes candidatos são obtidos a partir de uma ampla variedade de fontes incluindo bibliotecas de compostos sintéticos ou naturais. Por exemplo, numerosos meios estão disponíveis para síntese aleatória e direcionada de uma ampla variedade de compostos orgânicos e biomoléculas, incluindo expressão de oligonucleótidos e oligopéptidos randomizados. Alternativamente, bibliotecas de compostos naturais sob a forma de extratos de bactérias, fúngicos, plantas e animais estão disponíveis ou são prontamente produzidas. Adicionalmente, bibliotecas e compostos produzidos natural ou sinteticamente são prontamente modificados através de meios químicos, físicos e bioquímicos convencionais, e podem ser utilizados para produzir bibliotecas combinatórias. Agentes farmacológicos conhecidos podem ser submetidos a modificações químicas aleatórias ou direcionadas, tais como acilação, alquilação, esterificação, amidificação, etc. para produzir análogos estruturais.

Em tais ensaios de rastreio, a construção de ácido nucleico (por exemplo, a construção de ADN ou ARN descrita acima) e o agente candidato são administrados ao animal hospedeiro, o efeito do agente candidato na atividade da construção é observado, e o efeito observado é relacionado com a atividade moduladora do composto candidato. 0 agente candidato e construção de ácido nucleico pode ser administrado ao hospedeiro de acordo com os métodos em causa ao mesmo tempo ou em momentos diferentes, onde em determinadas formas de realização preferidas os dois componentes são administrados ao hospedeiro simultaneamente, por exemplo, sob a forma de uma única composição fluida. Ensaios de rastreio representativos são proporcionados na secção experimental abaixo.

Outra aplicação de investigação na gual os métodos descritos encontram utilidade é na elucidação da função génica. Em tais métodos, ARN tendo uma seguência génica particular é introduzido através dos métodos descritos e o efeito do gene no fenótipo do organismo é observado. Benefícios da utilização dos métodos descritos para aplicações de investigação da função génica incluem a capacidade de expressar os genes sem preocupação por elementos reguladores genéticos. Outras aplicações de investigação nas quais os métodos descritos encontram utilidade incluem, mas não estão limitados a: ao estudo da eficácia antissentido e de ribozima; ao estudo do metabolismo do ARN e semelhantes.

KITS

Também são descritos kits para utilização na prática dos métodos de distribuição de ácidos nucleicos in vivo a uma célula alvo, por exemplo, células hepáticas. Os kits incluem, geralmente, um ácido nucleico nu que se deseja que seja introduzido na célula alvo e um inibidor da ARNase. Os kits podem conter adicionalmente um veículo de distribuição aquoso, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato, etc. Além disso, os kits podem incluir um ARN competidor, conforme descrito acima. Nos kits descritos, os componentes acima podem ser combinados numa composição aquosa única para distribuição ao hospedeiro ou separada como composições diferentes ou dispares, por exemplo, em recipientes separados. Opcionalmente, o kit pode incluir adicionalmente um meio de distribuição vascular para distribuir a composição aquosa ao hospedeiro, por exemplo, uma seringa, etc., onde o meio de distribuição pode ou não estar pré-carregado com a composição aquosa. Em casos onde o gene repórter é transcrito in vivo a partir de um ADN, o inibidor de ARNase e ARN competidor não são necessários.

Em adição aos componentes acima, os kits descritos incluirão adicionalmente instruções para praticar os métodos em causa. Estas instruções podem estar presentes nos kits descritos numa variedade de formas, uma ou mais das quais podem estar presentes nos kits. Uma forma na qual estas instruções podem estar presentes é como informação impressa num meio ou substrato adequado; por exemplo, um pedaço ou pedaços de papel nos quais a informação é impressa, na embalagem do kit, num folheto informativo, etc. Ainda outro meio seria um meio legível por computador, por exemplo, disquete, CD, etc., no qual a informação pode ser gravada. Ainda outro meio que pode estar presente é um endereço de website que pode ser utilizado através da internet para aceder à informação num local retirado. Quaisquer meios convenientes podem estar presentes nos kits. Os seguintes exemplos são oferecidos por meio de ilustração e não por meio de limitação.

EXPERIMENTAL I. iARN em Mamíferos A. Foram coadministrados 2 microgramas de plasmideo que expressa um ARNm de luciferase (pCMVGL3) misturado com 1,8 ml de PBS, 1200 unidades de RNasin e 40 microgramas de ARN competidor juntamente com as seguintes formulações: 1) (Grupo 1 sem ARN) 1,8 ml de PBS como um controlo não tratado; 2) (Grupo 2 ARN antissentido) 1,8 ml de PBS misturados com 20 microgramas de quimera de ARN/ADN de 21 mero de orientação antissentido com a sequência 5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT-3' (SEQ ID NO:01) (resíduos de desoxitimidilato estão indicados como dT, os nucleótidos restantes são ribonucleótidos); ou 3) (Grupo 3 iARN) 1,8 ml de PBS misturado com 20 microgramas de 21 mero antissentido descrito acima hibridado com 20 microgramas do seu complemento de sentido (com sequência 5'-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3'') (SEQ ID NO:02).

Os oligonucleótidos foram fosforilados utilizando adenosina trifosfato e cinase de polinucleótido T4. Cada formulação (1-3) foi testada através de injeção de alta pressão na veia da cauda em ratinhos Balb/c fêmeas de 5 semanas de idade. Às 5, 72 e 96 horas após a injeção, luz emitida como um resultado da expressão de luciferase foi medida conforme discutido acima. Os resultados desta experiência estão resumidos no quadro abaixo. Números expressos como unidades de luz relativas.

Os resultados acima demonstram que a iARN (grupo 3) causou a destruição de ARN de luciferase no fígado de um mamífero adulto. Esta destruição resultou numa diminuição da luz emitida como um resultado da atividade da luciferase em comparação com animais que não receberam ARN ou oligonucleótido de antissentido apenas. Para o conhecimento dos inventores, esta é a primeira demonstração de que a iARN é eficaz num mamífero adulto. Este método proporciona um sistema modelo para estudar o mecanismo através do qual a iARN funciona num mamífero. Também é útil para o desenvolvimento e otimização de terapêuticas baseadas em iARN. Além disso, não é necessário coadministrar o plasmídeo de expressão com o agente de modulação. Também se pode distribuir um agente de modulação direcionando um gene endógeno. B. Aqui, foi testada a capacidade de iARN para suprimir a expressão génica em mamíferos adultos. Verificou-se que ARNs interferentes pequenos sintéticos (siARNs) são inibidores potentes da expressão génica in vivo. Além disso, ARNs de hairpin pequeno (shARN) são igualmente eficazes. De forma notável, estes agentes de iARN podem ser distribuídos como ARNs sintéticos ou transcritos in vivo a partir de construções de expressão de ADN. Estes estudos indicam que iARN pode ser desenvolvida como uma ferramenta terapêutica e demonstram que pode ser empregue com estratégias de terapêutica génica convencionais. I. siARNs

Modificaram-se os métodos de transfeção hidronidâmica J. Chang, L. J. Sigal, A. Lerro, J. Taylor, J Virol 75, 3469-73. (2001)) para permitir uma distribuição eficiente de ARNs nus. Um siARN derivado a partir de luciferase de pirilampo ou um siARN não relacionado foram coinjetados com um plasmídeo de expressão de luciferase (descrição da construção na Figura 1) . A expressão da luciferase foi monitorizada em animais vivos utilizando obtenção de imagens de corpo inteiro quantitativa a seguir à injeção de um substrato de luciferase (4) e foi dependente da quantidade de plasmídeo repórter injetado e do tempo após a transfeção (dados não mostrados). Os animais representativos são mostrados na Figura 2A. A quantificação destes resultados é mostrada na Figura 2B.

Em cada experiência, medições séricas de um plasmídeo coinjetado que codifica antitripsina a-1 humana (hAAT) (S. R. Yant, et al., Nat Genet 25, 35-41. (2000)) serviram como um controlo integral para normalizar a eficiência da transfeção e para monitorizar inibição translacional não específica. Os níveis séricos médios de hAAT às 74 horas foram semelhantes em cada grupo de animais.

Os resultados dos inventores indicam inibição mediada por siARN específica da expressão de luciferase em ratinhos adultos (0,0115); siARNs não relacionados não tiveram efeito (0,864). Em 11 experiências independentes, os siARNs de luciferase reduziram a expressão da luciferase (luz emitida) numa média de 81% ( + /- 2,2%) .

2. shRNA ARNs de pequeno hairpin (shARNs) direcionados a luciferase de pirilampo de luciferase de renilla foram sintetizados pela polimerase T7 em transcrição run-off in vitro. A co-transfeção destes ARNs transcritos in vitro com ADN pGL3-Control resultou na expressão de luciferase de pirilamo reduzida em cultura (Paddison et al, Genes Dev. 16(8):948-58 (2002)). De modo a testar se estes ARNs de hairpin foram funcionais em ratinhos, transfetaram-se hidrodinamicamente 40 pg de shARN de luciferase transcrito in vitro (ou como um controlo, shARN de renilla) , 2 pg de ADN pGL3-Control, 2 pg pThAAT, 800 unidades de RNasin e 1,8 ml de PBS em ratinhos. A luz emitida a partir dos ratinhos 72 horas após receber os shARNs de luciferase de pirilampo foi reduzida numa média de 95% (+/- 1,4%) em comparação com o controlo não tratado. A luz emitida a partir de ratinho que receberam o shARN de renilla foi reduzia apenas ligeiramente. Surpreendentemente, a co-transfeção do ADN molde de transcrição de T7 com um plasmídeo expressando a proteína polimerase T7 não levou a qualquer redução na atividade do repórter de luciferase em cultura ou nos ratinhos (dados não mostrados).

Sequência de shARN de luciferase de pirilampo (desde 5' a 3' ) GGUCGAAGUACUCAGCGUAAGUGAUGUCCACUUAAGUGGGUGUUGUUUGUG UUGGGUGUUUUGGUU {SEQ ID NO:11)

Sequência de shARN de luciferase de renilla (desde 5' a 3' ) GGGAUGGACGAUGGCCUUGAUCUUGUUUACCGUCACACCCACCACUGGGAG AUACAAGAUCAAGGCCAUCGUCUUCCU (SEQ ID NO:12)

Os resultados anteriores demonstram que hairpins curtos transcritos in vitro também reduziram a expressão da luciferase in vivo. 3. Conclusão

Os dados anteriores demonstram que a iARN pode regular negativamente a expressão génica em ratinhos adultos. C. 0 Vírus da Hepatite C (VHC) é um vírus de ARN que infeta 1 de 40 pessoas em todo o mundo e é a causa subjacente mais comum para o transplante hepático no mundo ocidental. Para determinar se a iARN poderia ser direcionada contra um agente patogénico humano, vários siARNs foram testados quanto à sua capacidade para direcionar ARNs de VHC no fígado de ratinhos. Foi utilizada uma estratégia repórter na qual as sequências de VHC foram fundidas com ARN de luciferase e a iARN foi monitorizada através de co-transfeção in vivo. Os siARNs direcionados ao sítio interno de entrada no ribossoma e região de codificação da proteína do núcleo do VHC não foram capazes de inibir a expressão da luciferase. Em contraste, siARNs direcionados à região NS5B de um ARN de fusão de luciferase-proteína NS5B de VHC quimérico reduziu a expressão da luciferase em 75% ( + /- 6,8%) .

Estes resultados indicaram a utilidade da utilização de iARN terapeuticamente para direcionar agentes patogénicos humanos importantes. D. A partir destes dados, é claro que os siARNs são funcionais em ratinhos. shARNs funcionais, que são igualmente eficazes na indução da supressão génica, podem ser expressos in vivo a partir de moldes de ADN utilizando promotores de ARN polimerase III (Paddison et ai., submetido). A expressão de um shARN cognato (pShhl-Ffl) induziu até 98% (+/- 0,6% de supressão da expressão da luciferase, com uma supressão média de 92,8% ( + /- 3,39%) em três experiências independentes (Figuras 2C e 2D) . Um vetor de expressão de shARN vazio não teve qualquer efeito (dados não mostrados) . Além disso, a inversão da orientação do inserto de shARN (pShhl-Ffl rev) suprimiu o silenciamento, devido à terminação alterada pela ARN polimerase III e consequente produção de um shARN inadequadamente estruturado (Paddison et ai., submetido). Estes dados indicam que shARNs codificados por plasmideos podem induzir uma resposta de iARN especifica e potente em ratinhos adultos. Além disso, demonstra que este método de distribuição de iARN pode ser ajustado para tirar partido do progresso significativo que foi feito no desenvolvimento de vetores de transferência génica.

Estratégias de terapêutica génica existentes dependem grandemente da expressão ectópica de proteína exógenas para alcançar um resultado terapêutico. Desde a sua descoberta, a iARN manteve a promessa de complementar estas abordagens de ganho de função proprocionando um meio para silenciar genes relacionados com doenças. Considerados em conjunto, os resultados dos inventores indicam que a iARN pode ser induzida em mamíferos adultos utilizando construções de ADN para direcionar a expressão de ARNs de hairpin pequenos. Estes estudos demostram que a presente invenção proporciona sistemas de distribuição virais e não virais para aplicação de iARN terapêutica a uma ampla gama de doenças. II. Distribuição hidrodinâmica de ARN nu A. Introdução A menos que indicado o contrário, em todas as experiências os ARNs e ADNs foram adicionados à quantidade indicada de RNasin e levados a um volume final de PBS igual a 1,4-1,8 mililitros. Esta solução foi injetada na veia da cauda de ratinhos em 4-5 segundos. Todos os ARNs utilizados nestes estudos foram sintetizados utilizando um kit mMessage Machine e purificados utilizando um kit RNeasy (ambos de Qiagen Inc.). Contudo, não deverá ser necessário purificar o ARN e existem outros métodos de purificação que deverão também funcionar. 0 RNasin utilizado em todas as experiências aqui listadas foi RNasin purificado nativo a partir de placenta humana a menos que indicado o contrário (adquirido a partir de Promega Inc.). Para as amostras de luciferase, no momento indicado, os ratinhos foram administrados com uma injeção intraperitoneal de luciferina (1,5 microgramas/grama de peso corporal) e a luz emitida a partir do ratinho foi medida. 0 fundo é de ~ 2 x 102 unidades de luz relativas. Amostras de fator IX humano foram analisadas utilizando um imunoensaio enzimático. B. Distribuição hidrodinâmica de ARN nu ARNs codificando a proteína da luciferase foram injetados em ratinhos vivos: 1) sem inibidor de ARNase; ou 2) com inibidor de ARNase (chamado RNasin).

Todas as amostras de ARN contiveram um ARN não poliadenilado e não capeado (ARN competidor) que foi incluído como um inibidor competitivo da atividade de ARNase. 0 ARN total em casa amostra foi ajustado até um total de 80 microgramas com ARN competidor. Como um controlo negativo (descrito abaixo) também foram injetados ADNs expressando a proteína da luciferase sob o controlo de um promotor procariótico. Às 3 e 6 horas os ratinhos foram administrados com uma injeção intraperitoneal de luciferina (o substrato para a enzima luciferase) e a luz emitida a partir do ratinho foi medida.

Os resultados estão resumidos no Quadro 1

Os resultados anteriores mostram que: • ARN injetado é transfetado no fígado de ratinhos vivos. • ARN poliadenilado capeado com uma cauda de poli A (ARN poli A) é traduzido nos fígados dos ratinhos porque o ARN poliadenilado capeado fornece um forte sinal de luciferase

• ARN capeado com um sinal de poli A (ARN de sinal de poli A) é traduzido nos fígados de ratinhos mas fornece um sinal, mas é cerca de 100 vezes inferior do que aquele observado com o ARN que tem uma cauda de poli A

Os ARNs utilizados em todas as experiências aqui descritas foram transcritos a partir de um promotor bacteriano num plasmídeo de ADN. Este promotor não deverá funcionar eficientemente em células de mamífero. O molde de ADN foi removido após a transcrição utilizando uma ADNase, no entanto, existe sempre a preocupação de que o sinal observado poderia ser o resultado de uma contaminação com ADN. Para controlar isto, uma quantidade de ADN molde equivalente àquele utilizado na transcrição foi injetada.

Se o sinal se deve a uma contaminação com ADN então esta amostra deveria fornecer um sinal. Contudo, não é observado qualquer sinal a partir do controlo de ADN.

Também se verificou que a adição de inibidor da ARNase (chamado RNasin) protege o ARN da degradação por nucleases séricas, aumentando assim o sinal observado, porque a adição de RNasin aumentou o sinal em 20 vezes na dose utilizada. A partir do anterior, foram tiradas as seguintes conclusões. A distribuição hidrodinâmica de ADN nu resulta numa transferência de nível elevado de ARN para os fígados de ratinhos vivos. Além disso, o ARN poliadenilado e capeado funciona melhor do que ARN com um sinal de poliadenilação mas sem cauda de poli A, embora ambos os ARNs tenham fornecido um sinal. A adição de um inibidor da ARNase protegeu o ARN da degradação, resultando num maior sinal de luciferase. Finalmente, o sinal observado com o ARN injetado não se deve à contaminação com ADN. C. Refinamento do sistema ARNs que codificam a proteína da luciferase foram injetados em ratinhos vivos com 1) doses altas ou baixas de RNasin nativo ou recombinante ou 2) após o tratamento com ARNase TI que deveria destruir o ARN e abolir o sinal (controlo negativo). Todas as amostras de ARN também contiveram um ARN competidor não poliadenilado e não capeado de modo que a quantidade total de ARN injetado foi de 80 microgramas. ADNs de controlo que expressam a proteína de luciferase sob o controlo de um promotor procariótico foram também injetados nas reações de controlo indicadas. Às 3 e 6 horas os ratinhos foram administrados com uma injeção intraperitoneal de luciferina e a luz emitida a partir do ratinho foi medida. Esta experiência é, em grande parte, para verificar os resultados da primeira experiência e para testar que parâmetros são importantes. No ponto de tempo de seis horas, um ratinho que tinha sido injetado com ARN foi sacrificado e os seus orgãos foram removidos para determinar quais deles expressavam luciferase.

Os resultados estão resumidos no Quadro 2

Os resultados anteriores demonstram que: • A dose de RNasin altera o nível de expressão observado porque doses crescentes de RNasin conduziram a níveis aumentados de atividade de luciferase. • Ambos RNasin nativo e recombinante protegeram o ARN. • Quando o ARN é destruído com ARNase, o sinal é abolido, demonstrando que o ARN é responsável pelo sinal (controlo negativo). • Quando a quantidade de ADN molde equivalente àquele utilizado na transcrição é injetada sem tratamento de ADNase, não é observado qualquer sinal, demonstrando que o sinal não se deve à contaminação com ADN. • 0 fígado é o único local de expressão de luciferase. A partir do anterior, foram tiradas as seguintes conclusões. A dose de RNasin afeta o nível de expressão. Ambos os RNasin recombinante e nativo protegem o ARN injetado. Não foi observado qualquer sinal quando ADN molde foi injetado ou quando o ARN foi destruído com ARNase, demonstrando que o sinal não é resultado de contaminação com ADN. Finalmente, o fígado é o único local de expressão de luciferase. D. ARN competido potência a atividade. A atividade da luciferase a partir de 20 microgramas de ARN de luciferase poliadenilado e capeado foi medida. Quatro condições foram testadas em experiências semelhantes àquelas descritas nas experiências 1 e 2: 1) 400 unidades de RNasin + ARN competidor; 2) 40 unidades de RNasin sem ARN competidor; 3) 800 unidades de RNasin sem ARN competidor; 4) 1200 unidades de RNasin sem ARN competidor. Às 3, 6 e 9 horas os ratinhos foram administrados com uma injeção intraperitoneal de luciferina e a luz emitida a partir do ratinho foi medida.

Os resultados estão resumidos no Quadro 3

Os resultados anteriores demonstram que: • A dose de RNasin altera a atividade de luciferase porque doses crescente de RNasin conduzem a uma atividade de luciferase aumentada. A dose mais elevada (1200 unidades de RNasin) forneceu a atividade mais elevada em todos os tempos testados. • A adição de ARN competidor potenciou a atividade de luciferase medida, porque a presença do ARN competidor portenciou a atividade de luciferase. Este efeito foi sinérgico com o efeito protetor do RNasin. A partir dos resultados anteriores, foram tiradas as seguintes conclusões. A adição de ARN competidor aumenta o sinal de luciferase. Além disso, doses crescentes de RNasin conduzem a níveis crescentes de atividade de luciferase. E. Tradução independente do capeamento de luciferase utilizando um sitio interno de entrada no ribossoma.

Nos Eucariotas, a tradução de ARNs em proteínas ocorre através de dois mecanismos diferentes chamados tradução dependente do capeamento e tradução independente do capeamento. A tradução independente do capeamento requer uma região não traduzida 5' chamada um sítio interno de entrada no ribossoma (IRES). Vários vírus de ARN, tais como o vírus da hepatite C (VHC), vírus da poliomielite e hepatite A utilizam sequências de IRES para levar a cabo tradução independente do capeamento. Os inventores desenvolveram originalmente o método de transfeção de ARN aqui descrito com a ideia de que poderia ser utilizado para fabricar um sistema de modelo de pequenos animais para estudar as terapêuticas anti-VHC. A transfeção com ARNs de IRES também poderia ser utilizada para estudos de mutagénese desenhados para investigar elementos de sequência necessários para a função de IRES eficiente. 1. Descrição da Experiência e Resultados: 0 ARN de VHCluc tem o IRES de VHC na extremidade 5' e o gene da luciferase seguido por uma cauda de poli A. 40 microgramas de VHCluc + 40 microgramas de ARN competidor + 20 microlitros de RNasin foram injetados na veia da cauda dos ratinhos. Às 3 e 6 horas os ratinhos foram administrados com uma injeção intraperitoneal de luciferina e a luz emitida a partir do ratinho foi medida. Resultado: O IRES de VHC foi capaz de conduzir a tradução da fusão de ARN e luciferase de VHC injetada. A quantificação dos resultados está resumida no Quadro 4.

F. Concentrações séricas mensuráveis de proteína de fator IX humano (HFIX) podem ser produzidas e secretadas após injeção de ARN de HFIX. A proteína de fator IX humano é uma proteína de coagulação sanguínea que não é produzida por alguns pacientes com hemofilia. Os níveis desta proteína no soro podem ser facilmente medidos utilizando um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). Os inventores escolheram expressar esta proteína por duas razões: 1) hFIX é uma proteína terapeuticamente relevante. Embora a expressão transiente de hFIX não seja clinicamente relevante, seria desejável expressar de forma transiente alguns outros tipos de proteínas terapêuticas que não requerem expressão crónica. 2) hFIX é uma proteína humana e é, por isso, capaz de desencadear uma resposta imunitária em ratinhos.

Uma aplicação da injeção de ARN é no desenvolvimento e testagem de vacinas. Uma resposta imunitária a hFIX após injeção de ARN de hFIX demonstraria a prova do princípio de utilizar ARN como uma vacina. 1. Descrição da Experiência e Resultados: 40 microgramas de ARN de hFIX capeado e poliadenilado + 40 microgramas de ARN competidor + 800 unidades de RNasin foram injetados através da veia da cauda num ratinho. Resultado: 40 nanogramas/mililitro de soro foram detetados por ELISA às 6 horas. Esta quantidade de hFIX encontra-se dentro do intervalo significativo do ensaio de ELISA.

G. Distribuição Hidrodinâmica de ARNs genómicos de VHC para criar um modelo de ratinho de VHC

Dois grupos de 6 ratinhos foram injetados com: 1) 50 microgramas de ARN genómico de comprimento completo de VHC capeado chamado 90 FL VHC (que também contém algum ARN não capeado) + 40 microgramas de ARN de hFIX capeado e poliadenilado + 400 unidades de RNasin; ou 2) um ARN genómico de VHC não infecioso de comprimento completo que tem uma mutação no gene da replicase que o torna cataliticamente inativo (chamado 101 FL VHC) + 40 microgramas de ARN de hFIX poliadenilado e capeado + 400 unidades de RNasin.

Os moldes de transcrição para fazer os ARNs de VHC foram obtidos a partir de Charles Rice and Washington University. Seis horas após a injeção os ratinhos foram sangrados e os níveis de hFIX são medidos para normalizar quanto à eficiência da injeção. Espera-se que os ARNs de VHC injetados se degradem rapidamente. Qualquer ARN detetado depois de alguns dias é provavelmente ARN recém-sintetizado durante a replicação virai. Um método de PCR em tempo real quantitativo foi desenvolvido para medir os níveis de ARN de VHC nos fígados destes ratinhos. Se ocorrer a replicação do vírus, então os níveis de ARN de VHC nos ratinhos injetados com 90 FL VHC serão maiores que os níveis em ratinhos injetados com 101 FL VHC quando medidos semanas após a injeção. Um ensaio histológico também está a ser desenvolvido de modo a testar quanto à síntese de proteínas de VHC. Três resultados positivos direfentes são possíveis 1) O ARN entra no fígado mas não é traduzido e não se replica 2) o ARN entra no fígado e é traduzido mas não se replica 3) o ARN entra no fígado, é traduzido e replica-se. Todos os três resultados são sistemas modelo úteis. Se 1, 2 ou 3 ocorre então este sistema poderia ser utilizado para testar ribozimas dirigidas contra ARNs de VHC (veja-se a experiência 9 abaixo) . Se 2 ou 3 ocorre então, este sistema poderia ser utilizado para testar quanto a inibidores da tradução, replicação e infeção de VHC. A injeção deste ARN não resultou num ciclo de replicação virai para o VHC. Contudo, outro grupo foi utilizado num método semelhante para iniciar um ciclo de replicação de hepatite delta. Veja-se Chang J, Sigal LJ, Lerro A, Taylor J., J Virol.75(7) :3469-73 (2001) . H. Clivagem in vivo de ARNs de VHC por ribozimas ADNzimas direcionadas ao IRES de VHC foram sintetizadas quimicamente. Os inventores injetaram hidrodinamicamente estas ribozimas em ratinhos e avaliaram a sua capacidade para diminuir os níveis de ARNS de VHC injetados no fígado. Cinco nanomoles de ADNzima direcionada ao IRES foram coinjetados com 20 pg de um ARN constituído pelo IRES de VHC seguido pela sequência codificante de luciferase de pirilampo seguida por 30 adenosinas. A sequência da ADNzima foi 5'- GAGGTTTAGGAGGCTAGCTACAACGATCGTGCTCA-3' (SEQ ID NO:013).

Ratinhos que recebram a ADNzima em combinação com o ARN alvo emitiram 95% menos de luz às 6 horas do que ratinhos que receberam o ARN alvo sozinho. Conclusão: Foi demonstrado que esta ADNzima pode inibir a tradução a partir do IRES de VHC, presumivelmente através da clivagem da sequência de ARN de IRES. Ribozimas sintéticas foram também testadas utilizando uma metodologia análoga e verificou-se serem ineficazes. 1. Esta experiência é para realizar um curso de tempo da expressão de luciferase depois de uma única injeção de ARN capeado e poliadenilado. Se a seguinte condição for cumprida, então pode-se utilizar um ajuste de declínio exponencial de primeira ordem (descrito na Equação 1) dos dados para calcular a taxa de degradação da proteína expressa. De modo a estes dados serem ajustados a um simples declínio exponencial de primeira ordem, a semivida do ARNm deve ser significativamente menor do que a semivida da proteína (pelo menos 5-10 vezes menor). Se esta condição não for cumprida, então uma relação matemática mais complicada, que tem em conta a semivida do ARNm, pode ser utilizada. Outra solução para este problema é diminuir a semivida do ARNm tornando-o não capeado ou omitindo o ARN competidor.

Se se definir a quantidade de proteína num dado momento (ou o sinal da proteína) como A, a quantidade de proteína (ou sinal) no primeiro ponto do tempo como Ao, a constante da taxa de declínio como k e o tempo após a primeira medição como t, a equação seria da forma: A=Ao exp ('kí) (Equação 1) 1. Descrição da experiência:

Quatro grupos de 6 ratinhos foram injetados com 20 microgramas de ARN de luciferase poliadenilado e capeado + 60 microgramas de ARN competidor não capeado + 800 unidade de RNasin. Às 3, 6, 9 ou 24 horas, os ratinhos foram administrados com uma injeção intraperitoneal de luciferina (1,5 microgramas/grama de peso corporal) e a luz emitida a partir do ratinho foi medida.

Foi realizado um gráfico das unidades de luz em relação ao tempo e a curva resultante foi ajustada à

Equação 1. Esta análise fornece uma constante da taxa de degradação aparente de 0,2 97 horas-1. O método mais comum para medição da semivida de uma proteína é o seguinte. Numa abordagem, a proteína é purificada e, algumas vezes, marcada (por exemplo com iodo radioativo). A proteína purificada é injetada em diferentes momentos, o animal é amostrado e a quantidade de proteína restante num qualquer dado momento é traçada em relação ao tempo e a curva é ajustada a uma equação tal como a Equação 1. A vantagem do método dos inventores é que não requer a síntese in vitro ou purificação da proteína. J. Os inventores construíram ARNs que contêm regiões reguladoras do ARN de VHC controlando a tradução de uma proteína chamada luciferase (referida aqui como ARN de VHC luc). Também construíram plasmídeos de expressão de ADN que expressam ARNs semelhantes uma vez que entram nas células (referidos aqui como ADN de VHC luc) . Veja-se a Figura 3 para diagramas destas construções.

Quando tanto os ARNs de VHC luc ou os ADNs de VHC luc são transfetados em ratinhos, eles vão para o fígado e ARNs de VHC luc ou ARNs transcritos a partir dos ADNs de VHC luc são traduzidos em proteína luciferase. Em vários momentos, o substrato da proteína luciferase, a luciferina, é injetado nos ratinhos. A enzima luciferase consome a luciferina e produz luz no processo. A quantidade de luz emitida a partir dos ratinhos é proporcional à quantidade de proteína luciferase presente no momento da amostragem.

Os inventores sintetizaram oligonucleótidos curtos sintéticos de um tipo conhecido como oligos morfolino. Misturaram-se 1 nanomol de um oligo morfolino com 10 microgramas de ARN de VHC luc ou 1 micrograma de ADN de VHC luc. O oligo morfolino foi fabricado por Gene Tools, LLC em Corvallis, Oregon e tem a sequência 5'-TCTTTGAGGTTTAGGATTCGT-GCTC-3' (SEQ ID NO:14). Esta mistura é depois adicionada a 1,8 mililitros de tampão e injetada sob alta pressão nas veias da cauda de ratinhos conforme descrito no pedido anterior dos inventores. Como um controlo, misturas que não contêm o inibidor são injetadas em outros ratinhos. Na presença de inibidor, a luz emitida é reduzida em mais do que 90%. Conclui-se a partir deste descobrimento que a tradução do ARN injetado ou tradução do ARN produzido a partir do ADN injetado é impedida pelo inibidor através de um mecanismo antissentido. No caso do ARN injetado pôde-se apenas seguir esta inibição durante cerca de 24 horas, devido à estabilidade limitada do ARN nas células No caso do ADN injetado, foi possível monitorizar a tradução durante cerca de 8 dias. A inibição da tradução durou todo o período de tempo durante o qual foi possível medir a tradução neste sistema. K.

Experiência A

Grupo de controlo: ARNs que contêm o IRES de VHC e uma sequência repórter de luciferase são injetados em ratinhos e brilham quando este ARN é traduzido na proteína da luciferase Grupo de teste:

Coinjeção de ARN com inibidor. Ambos vão para as mesmas células. A inibição é expressa como atividade (brilho) em comparação como grupo de controlo.

Experiência B

Igual à experiência A exceto que foi injetado ADN que codifica o ARN alvo juntamente com o inibidor. 0 ADN vai para o núcleo dos hepatócitos do ratinho e é transcrito para dar o ARN alvo. Este ARN vai para o citoplasma das células onde interage com o inibidor.

As construções empregues nestas experiências são proporcionadas na Figura 4. Os resultados destas experiências com antissentido e inibidores de ADNzima são proporcionados nas Figuras 5A a 5F. 0 protocolo de rastreio acima no qual o inibidor e ARN/ADN são coadministrados oferece vantagens importantes em termos de permitir a separação de problemas de administração de fármacos de problemas de eficiência de fármacos. É evidente a partir dos resultados e discussão acima que a invenção em causa proporciona uma via viável de utilização de agente de iARN em organismos mamíferos não embrionários, onde os métodos e composições em causa podem ser empregues numa variedade de aplicações terapêuticas diferentes. Adicionalmente, o presente pedido proporciona

um método melhorado de transferência de um ácido nucleico para uma célula alvo. Especificamente, o presente pedido proporciona um método in vivo altamente eficiente para a transferência de ácidos nucleicos nus que não emprega vetores virais e que, portanto, proporciona muitas vantagens em relação a métodos da técnica anterior de transferência de ácidos nucleicos. Como tal, a invenção em causa e outra matéria descrita no presente documento representa uma contribuição significativa para a técnica. LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University

<120> MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA INIBIÇÃO MEDIADA POR IARN DA EXPRESSÃO GENICA EM MAMÍFEROS

<130> STAN-180WO <150> 60/307.411 <151> 23-07-2001 <150> 60/360.664 <151> 27-02-2002 <160> 14 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0

<210> 1 <211> 21 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleótido <4 0 0> 1 ucgaaguacu cagcguaagu u21

<210> 2 <211> 21 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleótido <400> 2 cuuacgcuga guacuucgau u 21

<210> 3 <211> 21 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleótido <400> 3 cuuacgcuga guacuucgau u21

<210> 4 <211> 21 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleótido <4Ο0> 4 uugaaugcga cucaugaagc u21

<210> 5 <211> 21 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleótido <400> 5 agcuucauaa ggcgcaugcu u 21

<210> 6 <211> 21 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleótido <400> 6 uuucgaagua uuccgcguac g 21

<210> 7 <211> 23 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleótido <400> 7 cugugagauc uacggagccu guu 23

<210> 8 <211> 23 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleótido <400> 8 uugacacucu agaugccucg gac 23

<210> 9 <211> 33 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleótido <400> 9 ggauuccaau ucagcgggag ccaccugaug aag 33

<210> 10 <211> 36 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleótido <4 0 0> 10 uaaccuaagg uugagucgcu cucggugggc uaguuc 36 <210> 11

<211> 66 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleótido <4 0 0> 11 ggucgaagua cucagcguaa gugaugucca cuuaaguggg uguuguuugu guuggguguu 60 uugguu 66

<210> 12 <211> 78 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleótido <4 0 0> 12 gggauggacg auggccuuga ucuuguuuac cgucacaccc accacuggga gauacaagau 60 caaggccauc gucuuccu 78

<210> 13 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleótido <4 0 0> 13 gaggtttagg aggctagcta caacgatcgt gctca 35

<210> 14 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleótido <4 0 0> 14 tctttgaggt ttaggattcg tgctc 25

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • WO 0168836 A [0005] • US 5985847 A [0005] [0043] • US 5922687 A [0005] [0043] • WO 11092 A [0005] [0043] • US 60377704 B [0038] • US 5948902 A [0077] • WO 9011092 A [0095] • US 60307411 B [0158] • US 60360664 B [0158]

Documentos de não patente citados na descrição • BERNSTEIN et al. RN A, 2001, vol. 7, 1509-1521 [0005] • BERNSTEIN et al. Nature, 2001, vol. 409, 363-366 [0005] • BILLY et al. Proc. Nat'l Acad. Sei USA, 2001, vol. 98, 14428-33 [0005] • CAPLAN et al. Proc. Nat'l Acad. Sei USA, 2001, vol. 98, 9742-7 [0005] • CARTHEW et al. Curr. Opin. Cell Biol, 2001, vol. 13, 244-8 [0005] • ELBASHIR et al. Nature, 2001, vol. 411, 494-498 [0005] • HAMMOND et al. Science, 2001, vol. 293, 1146-50 [0005] • HAMMOND et al. Nat. Ref. Genet., 2001, vol. 2, 110-119 [0005] • HAMMOND et al. Nature, 2000, vol. 404, 293-296 [0005] • MCCAFFRREY et al. Nature, 2002, vol. 418, 38-39 [0005] • MCCAFFREY et al. Mol. Ther., 2002, vol. 5, 676-684 [0005] • PADDISON et al. Genes Dev., 2002, vol. 16, 948-958 [0005] • PADDISON et al. Proc. Nat'1 Acad. Sci USA, 2002, vol. 99, 1443-48 [0005] • SUI et al. Proc. Nat'1 Acad. Sci USA, 2002, vol. 99, 5515-20 [0005] • ACSADI et al. New Biol., January 2001, vol. 3, 71-81 [0005] • CHANG et al. J. Virol., 2001, vol. 75, 3469-3473 [0005] [0042] • HICKMAN et al. Hum. Gen. Ther., 1994, vol. 5, 1477-1483 [0005] [0043] • LIU et al. Gene Ther., 1999, vol. 6, 1258-1266 [0005] [0042] • WOLFF et al. Science, 1990, vol. 247, 1465-1468 [0005] [0042] [0043] • ZHANG et al. Hum. Gene Ther., 1999, vol. 10, 1735-1737 [0005] [0042] • ZHANG et al. Gene Ther., 1999, vol. 7, 1344-1349 [0005] [0042] • FURTH et al. Anal Biochem, 1992, vol. 205, 365-368 [0040] • TANG et al. Nature, 1992, vol. 356, 152-154 [0040] • ACSADI et al. New Biol., 1991, vol. 3, 71-81 [0043] • YOON et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, vol. 93 (5), 2071-6 [0090] • COLE-STRAUSS et al. Science, 1996, vol. 273 (5280), 1386-9 [0090] • ZHU et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, vol. 96 (15), 8768-73 [0090] • WIANNY et al. Nat Cell Biol, 2000, vol. 2 (2), 70-5 [0090] • SIQUN et al. Nature, 1998, vol. 391, 806-811 [0090] • WAGNER et al. Nature Biotechnol., 1996, vol. 14, 840-844 [0100] • J. CHANG ; L. J. SIGAL ; A. LERRO ; J. TAYLOR. J Virol, 2001, vol. 75, 3469-73 [0111] • PADDISON et al. Genes Dev., 2002, vol. 16 (8), 948-58 [0114] • CHANG J ; SIGAL LJ ; LERRO A ; TAYLOR J. J Virol., 2001, vol. 75 (7), 3469-73 [0142]

Lisboa, 7 de Setembro de 2015

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição farmacêutica para utilização num método de tratamento que compreende a administração da composição a um mamífero adulto para reduzir a expressão de uma sequência alvo no fígado do dito mamífero adulto, a composição que compreende um portador farmaceuticamente aceitável e: um agente de iARN selecionado a partir de siARN ou um shARN, em que o dito siARN ou shARN é específico para uma sequência alvo presente numa célula hepática do dito mamífero adulto e reduz a expressão da sequência alvo e em que o siARN ou shARN tem cerca de 15 a 30 nucleótidos de comprimento ou tem uma estrutura de dúplex com 15 a 29 pares de bases de comprimento; ou um vetor que compreende ADN que é transcrito in vivo para o dito shARN ou siARN.
2. 2. A composição para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o dito agente de iARN é um vetor que compreende ADN que é transcrito in vivo para o dito siARN ou shARN.
3. 3. A composição para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o dito agente de iARN é um siRNA ou shRNA.
4. 4. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, para utilização no tratamento de infeção virai no fígado do dito mamífero adulto em que a sequência alvo está presente no fígado após a infeção virai do mesmo.
5. 5. A composição para utilização de acordo com a reivindicação 4, em que a infeção virai é uma infeção virai d e ARN.
6. 6. A composição para utilização de acordo com a reivindicação 4, em que a infeção viral é uma infeção viral por hepatite.
7. 7. A composição para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o dito agente de iARN é para administração ao dito mamífero adulto em conjunto com um inibidor da ARNase.
8. 8. A composição para utilização da reivindicação 4, em que a sequência alvo presente na célula hepática no dito mamífero adulto após a infeção virai do mesmo é uma sequência de ARN virai genómico.
9. 9. A composição para utilização da reivindicação 4, em que a sequência alvo presente na célula hepática no mamífero adulto após a infeção do mesmo é um transcrito codificado por um vírus de ARN.
10. 10. A composição para utilização da reivindicação 1, em que a sequência génica alvo é endógena. Lisboa, 7 de Setembro de 2015