CN102282162B - 用于增强dna修复的物质和组合物及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了预防或治疗动物DNA损伤相关状态的方法，包括给药一种干扰CUL4A泛素连接酶活性的物质。本发明还提供了一种干扰CUL4A活性的物质及包括该干扰物质和载体的组合物。本发明所述的物质优选增强动物核苷酸切除修复活性。本发明还提供了反向或正向调控CUL4A表达和/或活性的物质的识别方法。

Description

用于增强DNA修复的物质和组合物及使用方法
相关申请的交叉引用
本专利申请要求2008年4月29日提交的美国临时专利申请号61/048,868的优先权，并在此全文参考并入。
电子提交材料的参考并入
在此一同提交的计算机可读形式的核苷酸/氨基酸序列表在此全文参考并入，其标识如下：One45，799ByteASCII(Text)filenamed“704595_ST25.txt，”，创建于2009年4月27日。
技术背景
细胞持续暴露在某些因素下，如会导致DNA损伤的细胞内活性组份和环境物质。DNA修复通路(DNArepairpathways)可以将DNA损伤潜在的致突变结果降至最低，该方法主要有三种特征形式：碱基切除修复(BER)，错配修复(MMR)和核苷酸切除修复(NER)(Woodetal.，Science，291：1284-1289(2001))。DNA损伤修复的缺陷是癌和许多遗传性疾病，如着色性干皮病，科凯恩氏综合症和毛细血管扩张共济失调症的致病原因。
在紫外光(UV)照射或化学诱变剂下暴露会导致损伤DNA的积累，进而导致突变形成癌症。真核细胞通过导入NER通路应对UV照射，其识别并去除损伤的DNA，并且通过激活DNA损伤检验点来停止细胞的周期进程，从而为NER作用赢得时间。NER是主要的DNA修复通路，细胞通过该通路去除UV照射和化学诱变剂造成的螺旋扭曲的DNA损伤(Friedbergetal.，DNARepairandMutagenesis，2ndEdition，ASMPress，Washington，D.C.(2006))。
NER是一个多步骤过程，其使用超过30种蛋白用于实施DNA损伤的识别步骤，切除损伤的5’和3’端来去除损伤的DNA，将DNA聚合酶填入缺口中，并通过DNA连接酶活性将新合成的DNA连接至母体DNA上(见Friedbergetal.，DNARepairandMutagenesis，2ndEdition，ASMPress，Washington，D.C.(2006)；Sancar，Annu.Rev.Biochem.，65：43-81(1996))。NER是由两种不同DNA链特异性通路组成：去除RNA聚合酶II转录的DNA链上的损害的转录偶联修复通路(TCR)，修复表达基因非转录链上损伤和非活性染色质上损伤的全面性基因组修复途径(GGR)(参见综述Hanawalt，Oncogene，21：8949-8956(2002))。NER过程已经被广泛的研究，进行切除和修复反应所必须的成份已经通过使用重组蛋白和损伤DNA模板的体外重建确定了(Aboussekhraetal.，Cell，80：859-868(1995)；Araujoetal.，GenesDev.，14：349-359(2000)；Muetal.，J.Biol.Chem.，271：8285-8294(1996)；Muetal.，J.Biol.Chem.，270：2415-2418(1995))。
涉及DNA损伤识别的GGR通路的NER要素包括XPA-RPA、XPC-HR23B和由DDB1(p127)和DDB2(p48)亚基组成的损伤特异性DNA粘合蛋白异二聚体。这些DNA损伤传感器中，异二聚体DDB1-DDB2对UV诱导的环丁烷嘧啶二聚体(CPDs)和6-4光生产物(6-4PPs)的亲合力最强(指定的UV-DDB活性)(Battyetal.，J.Mol.Biol.，300：275-290(2000))。E组着色性干皮病基因(XP-E)案例的病因是DDB2突变。其特征为损伤DNAGGR介导切除的缺陷和皮肤癌的诱因(WittschiebenandWood，DNARepair(Amst)，2：1065-1069(2003))。在UV照射后，DDB1和DDB2马上聚集到损伤的DNA上，之后被CUL4A泛素连接酶泛素化并降解(Chenetal.，Mol.Cell，22：489-499(2006)；Fitchetal.，DNARepair(Amst)，2：819-826(2003)；Groismanetal.，Cell，113：357-367(2003)；Rapic-Otrinetal.，NucleicAcidsRes.，30：2588-2598(2002))。CUL4A也是正常生长条件下DDB2更新的原因(Chen等，J.Biol.Chem.，276：48175-48182(2001)；Nag等，Mol.CellBiol.，21：6738-6747(2001))，其导致UV-DDB活性总体下降(Chenetal.，J.Biol.Chem.，276：48175-48182(2001))。
CUL4A泛素连接酶作为一种多聚体复合物发生作用，其中CUL4A的C末端与环脂蛋白Rbx1/ROC1/Hrt1(Rbx1)作用，从而招募E2泛素结合酶。CUL4A的N末端与DDB1作用。DDB1进而作为接合蛋白与DDB1、CUL4A相关要素(DCAFs)结合，起到特定受体底物的作用(Angersetal.，Nature，443：590-593(2006)；Heetal.，GenesDev.，20：2949-2954(2006)；Higaetal.，NatCellBiol.，8：1277-1283(2006)；Jinetal.，Mol.Cell，23：709-721(2006)；LeeandZhou，Mol.Cell，26：775-780(2007))。CUL4B，CUL4家族另一成员在序列上与CUL4A有着广泛的同源性，并具有一些相同的冗余功能，包括维持细胞生长和介导某些CUL4目标的泛素(mediatingtheubiquitinationofcertainCUL4Atargets)(Higaetal.，Nat.CellBiol.，5：1008-1015(2003)；Huetal.，Nat.CellBiol.，6：1003-1009(2004))。含有泛素连接酶复合物的CUL4B具有一些特殊的特征，例如降解性类固醇激素受体的能力(Ohtakeetal.，Nature，446：562-566(2007))。另外，CUL4B突变已经被确定为导致X连接的智力缺陷的基因组缺陷(Tarpeyetal.，Am.J.Hum.Genet.，80：345-352(2007)；Zouetal.，Am.J.Hum.Genet.，80：561-566(2007))。
至今为止，大多数以DNA修复通路为目标的癌症治疗使用阻止癌症细胞DNA修复的物质从而增强化学治疗和放射治疗的DNA损伤效力(KelleyandFishel.AnticancerAgentsMed.Chem.，8(4)：417-25(2008))。
虽然含有T4核酸内切酶V的组合物已经被研究作为治疗皮肤癌的潜在药物，但是通过提高或加快DNA修复来降低DNA损伤引起的后果进而预防或治疗疾病的研究相对较少(CafardiandElmets.ExpertOpin.Biol.Ther.，8(6)：829-38(2008))。
因此，用于增强细胞和动物内DNA修复的组合物和方法是需要的。本发明提供了这种组合物和方法，其可以用于预防和治疗与DNA损伤相关的疾病。
发明简介
本发明提供了一种预防或治疗动物体内DNA损伤相关状态的方法，该方法包括对需要的动物给药有效剂量的能够干扰CUL4A活性的物质，从而预防或治疗动物体内DNA损伤相关的状态。
本发明还提供了一种预防或治疗动物体内DNA损伤相关状态的方法，该方法包括对需要的动物给药有效剂量的能够干扰CUL4A活性的物质，其中干扰CUL4A活性的物质提高核苷酸切除修复活性，进而预防或治疗动物体内DNA损伤相关的状态。
本发明还提供了一种干扰动物体内CUL4A活性的物质及含有该物质和载体的组合物。该物质可以增强动物内核苷酸切除修复的活性。
本发明进一步提供了一种识别具有调节CUL4A泛素连接酶活性的物质的方法，该方法包括(a)将CUL4A多肽，与损伤DNA结合蛋白1(DDB1)多肽和测试物质在易于形成CUL4A-DDB1复合物条件下组合，(b)检测(a)条件下形成的CUL4A-DDB1的量，和(c)比较测试物质存在时(b)中检测到的生成的CUL4A-DDB1复合物的量与测试物质不存在时生成的CUL4A-DDB1复合物的量，此差别可反映测试物质调节CUL4A泛素连接酶活性的能力。该被识别的调节剂可以是干扰CUL4A泛素连接酶活性的物质。
附图说明
图1A为鼠科动物Cul4a基因组位点靶向作用于LoxP框之前和之后的一系列图表。图1B为野生型和两侧装接上loxP位点的杂合(f/+)胚胎干细胞内的Cul4a位点一系列DNA印迹比较(southernblots)。图1C为野生型(+/+)，纯合子的两侧装接上loxP位点的(f/f)和杂合子的(f/+)小鼠的PCR扩增的尾部DNA(顶端)，和野生型的和重组的(无效)Cul4a等位基因(底部)的一系列琼脂糖凝胶。图1D为野生型(+/+)和敲除型(-/-)小鼠器官和胚胎纤维原细胞中CUL4A、CUL4A(Δ)和β-肌动蛋白水平的一系列蛋白质印迹。图1E为Rbx1和CUL4A或CUL4A(Δ)之间作用的一系列蛋白质印迹。
图2A为Li等描述的Cul4a敲除等位基因的图表(Mol.CellBiol.，22：4997-5005(2002))，其显示了去除的Pcid2部分。图2B为实时定量RT-PCR评估的，空慢病毒(空载体)，慢病毒编码的短发夹RNA靶向的Pcid2(sh-Pcid2-1，sh-Pcid2-2)或打乱的(scrambled)sh-Pcid2感染的野生型MEFs中Pcid2mRNA表达的柱状图。图2C反映了如图2B处理的MEFs的生长。
图3A为FACS确定的，慢病毒编码的GFP和短发夹(sh)-4b或混杂(scm)-4b感染的对照组(f/f-4a)和Cul4a敲除(ko-4a)MEFs在所示时间点的百分比柱状图。图3B反映了由显微视野对BrdU+细胞计数确定的，BrdU掺入如图3A所示的MEFs的情况。
图4A为反映对照组(f/f)和Cul4a敲除(-/-)皮肤组中CUL4A，DDB2，p21和β-肌动蛋白水平的一系列蛋白质印迹。图4B为反映所示慢病毒处理的MEFs中CUL4B、CUL4A、DDB2、p21、XPC和β-肌动蛋白水平的一系列蛋白质印迹。图4C包括反映脉冲跟踪分析获得的DDB2水平的自动射线照片和DDB2更新定量线图。图4D包括反映脉冲跟踪分析获得的p21水平的自动射线照片和p21更新定量线图。图4E反映所示慢病毒处理的，UV照射的HCT116细胞的染色质提取物中XPC、泛素化XPC(XPC～Ubn)、CUL4A和组蛋白3(H3)水平的蛋白质印迹。
图5A-C包括Cul4af/f(1)、Cul4bk/d(2)、Cul4a-/-(3)和Cul4a-/-；Cul4bk/d(4)MEFs中通过实时定量RT-PCR测定的，Ddb2(A)、p21(B)和Xpc(C)水平定量柱状图和通过蛋白质印迹测定的，DDB2(A)、p21(B)和XPC(C)蛋白水平定量柱状图，其中柱号对应于图4B中的道号。
图6为反映所示质粒转染的293T细胞免疫沉淀反应中p21和CUL4A-DDB1泛素连接酶复合物成份间作用的一系列蛋白质印迹。
图7A为对照(Cul4af/f)和敲除(Cul4a-/-)MEFs中UV-DDB活性的电泳淌度移动分析图片。标记“B”表示DDB-DNA复合物。图7B为反映所示慢病毒处理的MEFs中UV诱导的环丁烷嘧啶二聚体(CPDs)和6-4光生产物(6-4PPs)修复的一系列线图。图7C为反映UV照射后所示基因型同步MEFs中DNA合成的线图。图7D为反映所示基因型MEFs中UV诱导的CPDs修复的线图。图7E包括UV照射后所示基因型MEFs中微核子图片和微核子定量图表。
图8为反映UV照射或未照射的基因型MEFs中，通过流动血细胞计数测定的DNA含量的一系列柱状图。
图9A为慢性UV暴露后对照(Cul4af/f)和皮肤特定的Cul4a敲除组(Cul4af/f；K14-CreERTAM)小鼠中扁平细胞癌(SCC)发作的卡普兰-迈耶曲线。图9B为带有SCC小鼠的图片。图9C和图9D为苏木精和四溴萤光素染色的SCC部分的图片。图9E和9F为基底表皮标记物p63和DAPI免疫染色的SCC部分的图片。图9C和9D所示的形态测量和图9E和9F所示的p63免疫染色图案显示肿瘤为典型的SCC。
图10A和10B图表描述了CUL4A在确立DNA修复和肿瘤抑制临界点中可能存在的作用。CUL4A通过分别靶向降解DDB2和p21来协调抑制NER和G1/SDNA损伤检验点通路。去除细胞中的CUL4A提升了NER能力和G1/SDNA损伤检验点反应至超过野生型细胞可到达的临界点。
图11为反映控制腺病毒或腺病毒编码的显形负相(dominantnegative)(DN)CUL4A片段感染的HCT116细胞中UV诱导的CPDs修复的线图。
图12为DDB1-CUL4A作用界面的连续剖面图，其中显示了与CUL4A直接接触的DDB1-BPBβ-螺旋推进区域(β-propellerregion)(即A400，I402，L404，V443，E537，W561，I587和R589)上的8个残基。
图13为识别能够调节CUL4A和DDB1之间作用的物质的屏幕(ALPHASCREENTM平台，来自PerkinElmer)示意图。
图14为用于识别CUL4A和DDB1作用调节肽的噬菌体展示文库筛选示意图。
发明的详细描述
本发明是基于，至少部分基于DDB1-CUL4A泛素连接酶复合物是疾病预防和调节的重要的靶细胞的发现。
本发明提供了一种预防或治疗动物体内DNA损伤相关状态的方法，该方法包括对需要的动物给药有效剂量的能够干扰CUL4A活性的物质，从而预防或治疗动物体内DNA损伤相关的状态。
本发明使用的术语“预防或治疗”，“治疗”，“处理”和“治疗性处理”表示药品治疗，预防疾病性治疗或预防性治疗。“预防性治疗”的例子如预防或减少得目标疾病的可能性(即癌症或其它增生性疾病)或相关的状态。需要处理的对象包括那些已经获病或状态的动物和那些倾向于患上需要预防的疾病或状态的动物。本发明使用的术语“治疗”和“治疗性处理”也描述了对动物的管理和照料，用于对抗疾病或相关状态，并且包括一组合物给药用于缓解症状、副作用或该疾病或状态的其它并发症。所述动物可以是任何动物，但是优选哺乳动物。在本发明的某一实施例中，哺乳动物为小鼠或其它实验哺乳动物。在另一是实施例中，哺乳动物为人类。
术语“DNA损伤”为本领域普通技术人员所熟知，指相比DNA分子天然状态的任何改变。DNA损伤的例子包括但不限于碱基对错配，DNA碱基自发的化学变化(如互变异构移位和去氨基)，碱基的缺失(即去嘌呤和去嘧啶)，氧自由基和离子化照射诱导的损伤(如C-5＝C-6双键的进攻和DNA链的断裂造成的胸腺嘧啶损伤)，UV照射诱导的损伤(如环丁烷嘧啶二聚体和嘧啶-嘧啶酮(6-4)光生产物)和化学诱导损伤(如烷基化和链内或链间的交联)(FriedbergandSiede，DNARepairandMutagenesis，ASMPress，Washington，D.C.(1995))。
术语“与DNA损伤相关的状态”或“与DNA损伤相关的疾病”指以DNA损伤为致病或作用因素的任何状态或疾病。在某一实施例中，与DNA损伤相关的状态为癌症。癌症可以源于人类或其它哺乳动物体内一般发现的肿瘤或者由于在如实验哺乳动物中接种产生的肿瘤。众所周知，肿瘤包括源于不受控制和生长的细胞分裂的不正常组织块，其也被特有的称之为“赘生物”。在人类和其它动物状态中有多种类型的癌症。本发明的所述方法的应用不限于任何一种特定类型或种类的癌症。所述发明方法能够用于肿瘤细胞和相关的底物细胞，实体肿瘤和软组织相关的肿瘤，如人体内软组织恶性毒瘤。肿瘤或癌症可以位于皮肤(如黑素瘤)，口腔，咽，呼吸系统，消化系统，骨头，关节(如癌症骨转移)，软组织，胸部，生殖系统，泌尿系统，眼，眼眶，大脑(如神经胶质瘤)，中枢神经系统或者内分泌系统(如甲状腺)，并不一定是原发瘤或癌症。与口腔相关的组织包括但不限于舌和口组织。癌症可以发生在消化系统组织中，包括例如食道、胃、小肠、大肠、直肠、肛门、肝、胆囊和胰腺。呼吸系统癌症可以影响喉、肺和支气管并且包括例如非小细胞肺癌。癌症可以发生在组成男性和女性的生殖系统的子宫颈、子宫体、卵巢阴户、阴道、前列腺、睾丸和阴茎，和组成泌尿系统的膀胱、肾脏、肾骨盆和输尿管。肿瘤或癌症也可以位于头部和/或颈部(如喉部癌和副甲状腺癌)。肿瘤或癌症也可以位于造血系统或淋巴系统中，包括例如淋巴瘤(如霍奇金疾病和非霍奇金淋巴瘤)，多发性骨髓瘤或白血病(如急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病和类似疾病)。优选的，肿瘤或癌症位于皮肤、口腔、咽喉、肺或肝。最优选的，肿瘤或癌症位于皮肤。
在本发明的另一实施例中，DNA损伤相关状态为人类遗传性疾病或人类遗传性疾病的实验动物模型。可以根据本发明提供的方法处理的人类遗传性疾病的例子包括但不限于着色性干皮病、科凯恩氏综合症、毛发低硫营养不良、范可尼综合征贫血、共济失调毛细管扩张症(Louis-Bar综合征)和布卢姆综合症。优选的，人类遗传疾病为着色性干皮病。
在本发明的另一实施例中，DNA相关状态为衰老。衰老包括动物(如人类)自然衰老过程和带有一个或多个调节衰老过程的，可遗传突变的基因动物(如人类)发生的加速衰老。动物衰老过程的主要原因是具有反应活性的氧类影响细胞DNA，导致肉体损伤。众所周知，具有反应活性的氧类会引起无数的DNA损伤如碱基修饰，单链或双链DNA断裂和链内交联(Hasty等，Science，299：1355-1359(2003))。相应的，本发明提供了增强动物DNA修复活性进而预防和治疗衰老的方法和组合物。
在本发明的另一实施例中，DNA相关状态为长时间(prolonged)暴露在UV照射下。如上所述，UV照射诱导DNA中的环丁烷嘧啶二聚体和嘧啶-嘧啶酮(6-4)光生产物已是总所周知。UV照射产生的其它类型的DNA损伤包括但不限于涉及嘌呤的复合物损伤(如8，8-腺嘌呤脱氢二聚物)，嘧啶水合物(如5，6-二氢-6-羟基-胞核嘧啶)，胸腺嘧啶乙二醇和链断裂(FriedbergandSiede，DNARepairandMutagenesis，ASMPress，Washington，D.C.(1995))。相应的，本发明也提供了增强动物DNA修复活性进而预防和治疗长时间暴露在UV照射下的相关状态的方法和组合物。
在本发明的另一个实施例中，DNA损伤相关状态为暴露在化学致癌物下。如上所述，化学致癌物会引起多种DNA损伤，包括但不限于烷基化，链内或链间交联和加合物的形成。本领域普通技术人员知道许多常用的化学致癌物并且熟悉含有所给化学物致癌性信息的数据库(如加利福尼亚大学伯克利分校的致癌物力量计划和美国健康与公共事业部的国家毒物项目)。另外，本领域普通技术人员知道评估所给化学物的致癌性的方法(如艾姆斯氏试验)。相应的，本发明也提供了增强动物体内DNA修复活性进而预防和治疗长时间暴露在化学致癌物下相关状态的方法和组合物。在某一实施例中，所述化学致癌物是香烟。在另一实施中，所述化学致癌物是黄曲霉毒素。
本发明也包括用于增强接受化学疗法和放射治疗的动物体内的DNA修复活性的组合物和方法。虽然化学疗法和放射治疗的主要目的是为了诱导癌细胞中DNA损伤进而抑制生长或使细胞死亡，但同时也需要增强化学疗法和放射治疗动物体内非癌细胞的DNA修复。本领域普通技术人员了解诱导DNA损伤的用于化学疗法的化学物质。所述化学物质的例子包括但不限于铂衍生物(如顺铂、卡波铂和奥沙利铂)，氮芥子气(如二氯甲基二乙胺、环磷酰胺和苯丁酸氮芥)和亚硝基脲(如亚硝基脲氮芥、环己亚硝脲和乙基亚硝基脲)。
“有效量”或“有效治疗量”指缓解(在某种程度上，由熟练的医生判断)动物体内疾病或状态的一种或多种症状。另外，“有效量”或“有效治疗量”指部分或完全回复与疾病或状态相关或引起该疾病的生理或生化参数至正常所需要的量。本领域普通临床医生可以确定组合物的有效治疗量用于在给药时治疗或预防特定疾病状态或病症。有效治疗量所指的组合物的具体量取决于许多因素，如活性物质的具体活性，使用的传递设备，物质的物理特性，给药的目的和出于对病人许多具体的考虑。确定组合物的有效量或有效治疗量是本领域常规方法，属于普通临床医生技术范围内。
“给药”或“被给药”指将物质传递到需要的动物中。给药方法可以是局部、口服、鼻内、非肠道、肠、直肠或眼部给药。在本发明的优选实施例中，物质通过局部给药。
本发明提供了干扰CUL4A活性的物质。本发明所述术语“物质”，“化合物”和“治疗剂”指化合物，化合物的混合物、生物大分子或生物材料如细菌、植物、真菌或动物细胞(特别是哺乳动物)或疑似具有治疗性质的组织制备的提取物。物质、化合物或治疗剂可以纯化，充分纯化或部分纯化。
在某一实施例中，所述物质为小分子化合物。本发明使用的术语“小分子”指非生物物质或分子量小于约1,000g/mol的化合物。
在另一实施例中，所述物质为多聚核苷酸。本发明使用的术语“多聚核苷酸”和“核苷酸”是指任何长度的核苷酸的多聚形，是核糖核苷酸(RNA)或是脱氧核糖核苷酸(DNA)。这些术语指分子的一级结构，并因此包括双链或单链DNA和双链或单链RNA。该术语包括核苷酸类似物和修饰的多聚核苷酸如但不限于甲基化的和/或加帽的多聚核苷酸制备的RNA或DNA的类似物等同物和类似物。合适的核苷酸在本领域是公知的并在如美国专利和本申请参考文献中有描述。
本申请使用的术语“核苷酸”指杂环碱基、糖和一个或多个磷酸基团组成的多聚核苷酸单体。天然产生的碱基(鸟嘌呤，(G)，腺嘌呤，(A)，胞核嘧啶，(C)，胸腺嘧啶，(T)和尿嘧啶(U))是嘌呤或嘧啶典型的衍生物。应理解天然或非天然产生的碱基衍生物都包括在其中。天然产生的糖为戊糖(五个碳的糖)去氧核糖(其形成DNA)或核糖(其形成RNA)。应理解天然或非天然产生的糖衍生物也包括在内。核苷酸通常通过磷酸键连接从而形成核苷酸或多聚核苷酸，另外许多其它连接方法在本技术领域也是公知(如硫代磷酸酯，硼烷磷酸酯或类似连接)。制备多聚核苷酸的方法是本领域普通技术人员熟知的(SambrookandRussell，MolecularCloning：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork(2001))。
多聚核苷酸可以是任何抑制核苷酸分子，包括但不限于小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、反义低聚核苷酸、适体或核酶。在优选实施例中，多聚核苷酸是siRNA或shRNA分子。
“小干扰RNA”或者“短干扰RNA”或者“siRNA”或者“短发夹RNA”或者“shRNA”是与目标核苷酸序列，如Cul4amRNA互补的双链RNA分子，并且能够介导特定靶向的核苷酸降解。双链RNA分子是通过第一RNA部分和第二RNA部分间互补配对形成的。每一部分的长度总体小于30个核苷酸(如29，28，27，26，25，24，23，22，21，20，19，18，17，16，15，14，13，12，11或10个核苷酸)。在某些实施例中，siRNA或shRNA中每一个部分的长度在19至25个核苷酸。在一些siRNA分子中，RNA分子互补的第一和第二部分是发夹结构的“干”，从而产生shRNA分子。所述两部分可以通过连接序列连接，其可以形成发夹结构中的弯曲部分。连接序列的长度可以不同。在某些实施例中，连接序列的长度可以为5，6，7，8，9，10，11，12或13个核苷酸。代表性的连接序列为5’-TTCAGAAGG-3’，同时任何数量的序列可以用于连接第一和第二部分。第一和第二部分是互补的但是可以不完全对称，因为发夹结构可以含有3’或5’悬垂的核苷酸(如a1，2，3，4或5核苷酸悬垂)。
siRNAs或shRNAs的设计已建有标准(见如Elbashiretal.，Nature，411：494-8(2001)；Amarzguiouietal.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，316(4)：1050-8(2004)；Reynoldsetal.，Nat.Biotech.，22(3)：326-30(2004)；Brummelkampetal.，Science，296：550-553(2002))。使用合适的程序将siRNA或shRNA和基因数据库如基因库(GenBank)或Ensembl中的核苷酸序列比对，检测任何候选siRNA或shRNA的序列与其它核苷酸序列交叉反应的可能性。通常会生成并筛选许多siRNAs或shRNAs从而比较他们的效力。
本发明的siRNA或shRNA可以通过任何方法生成，其中包括但不限于体外转录，在宿主细胞中重组生产或化学合成。在某一实施例中，siRNA或shRNA是通过使用重组酶如T7RNA聚合酶体外转录DNA寡聚核苷酸模板生成的。在另一实施例中，siRNA或shRNA在培养细胞中重组制备，细胞可以是原核的或是真核的。制备siRNA或shRNA的方法是本领域普通技术人员熟知的(见例如Elbashiretal.，Nature，411：494-8(2001)；Brummelkampetal.，Science，296：550-553(2002)；andLeeetal.，Nat.Biotech.，20：500-5(2002))。
在此使用的“适体”或“核苷酸配体”或“核苷酸抗体”指非天然生成的，对目标(如CUL4A)具有理想作用的核苷酸。理想的作用包括但不限于与目标连接，解除反应的改变目标，与目标以修饰/改变目标或目标功能活性的方式反应，如在自杀性抑制剂中那样共价连接目标，和促进目标和另一个分子的反应。在优选实施例中，理想的作用为对含有CUL4A的复合物特定的亲合力，其中适体，核苷酸配体或核苷酸抗体连接机理主要是沃森/克里克碱基配对或三螺旋连接(triplehelixbinding)。
适体包括在核苷酸候选混合物中识别出来的核苷酸，其中所述核苷酸是所给目标(如CUL4A)的配体。该方法包括(a)使候选混合物与目标接触，其中相对于候选混合物，与目标亲合力增加的核苷酸可以从候选混合物中的剩余物中分离出来；(b)将亲合力增加的核苷酸从候选混合物的剩余物中分离出来；和(c)放大亲合力增加的核苷酸从而生产富含配体的核苷酸混合物，由此可以确定目标化合物的核苷酸配体。这种确定候选适体的方法被称为指数富集的配体系统演变(SELEX)，是本领域所熟知的(见美国专利5,270,163和5,475,096)。
“反义低聚核苷酸”指带有与特定核苷酸序列互补序列的低聚核苷酸(即“传感”目标序列)并且能够与目标序列杂交(如Cul4amRNA)。本发明的反义低聚核苷酸可以包括DNA，RNA或其混合物。反义低聚核苷酸的序列可以与目标序列100％互补或者接近互补(如75％或更多，85％或更多，95％或更多)。本发明的反义低聚核苷酸可以通过核酸内切酶的作用阻碍或抑制目标mRNA的翻译或抑制目标基因的转录从而产生降低目标mRNA水平的作用。本发明的反义低聚核苷酸可以包括带有上述修饰的碱基、糖和/或磷酸基团的核苷酸。制备反义低聚核苷酸的方法是本领域公知技术(见如CrookeandBennett，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.，36：107-129(1996)和美国专利6,107,094)。
“核酶”指能够催化化学反应的RNA分子，如以核苷酸碱基特定序列的方式重复剪切其它独立核苷酸(即具有核酸内切酶活性)。这种具有核酸内切酶活性的核酶可能与特定目标基因(如Cul4a)在该核酶的底物结合区有互补性，并且具有在目标中准确剪切RNA或DNA的酶活性。也就是具有核酸内切酶活性的核酶能够在分子间或分子内剪切RNA或DNA，以此减除目标RNA或DNA分子的活性。这种互补功能使核酶与目标RNA或DNA充分杂交从而产生剪切。本发明的核酶与目标RNA或DNA的互补性可以是50％或更多，75％或更多，90％或更多，95％或更多。优选的，互补性为100％。本发明的核酶可以包括带有上述修饰的碱基、糖和/或磷酸基团核苷酸。制备核酶的方法在本领域是公知技术(见如美国专利4,987,071和6,617,438；RobertsonandJoyce，Nature，344：467-468(1990))。
术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”指氨基酸残基的聚合体。蛋白质、多肽或肽可以是全长的或是片段。术语“片段”指大小在四个氨基酸残基至比全部氨基酸序列少一个氨基酸残基的范围内的全长蛋白的较短的部分。在本发明的某一实施例中，片段指蛋白质结构域的全部氨基酸序列(如CUL4A的N末端α-螺旋区域或者DDB1的BPBβ-螺旋推进结构域)。蛋白质、多肽、肽及其片段可以通过化学合成或重组DNA技术，使用本领域公知的方法制备(Benoiton，ChemistryofPeptideSynthesis，CRCPress，BocaRaton，Florida(2006)；SambrookandRussell，MolecularCloning：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork(2001))。
在本发明某一实施例中，干扰CUL4A活性的物质是多肽或肽。在某些实施例中，多肽或肽包括氨基酸线性聚合物。在其它实施例中，多肽或肽包括氨基酸的环状聚合物，其中聚合链的氨基和羧基末端通过肽键互相连接。多肽或肽可以是任何长度。多肽或肽的长度可以是2个氨基酸或更多，6个氨基酸或更多，10个氨基酸或更多，或20个氨基酸或更多。或者或另外，多肽或肽的长度可以是200个氨基酸或更少，100个氨基酸或更少，50个氨基酸或更少，40个氨基酸或更少。因此，多肽或肽可以具有以上任何两个端值连接后的长度。例如，多肽或肽的长度为2-200氨基酸，6-100氨基酸或10-40氨基酸。在本发明的某些实施例中，多肽或肽是从噬菌体展示文库获得的。合适的噬菌体展示文库包括但不限于CX10C/p8+8文库，NNS20/p8+8文库和基于knottin结构支架的文库。筛选噬菌体展示文库的方法是本领域普通技术人员熟知的(见如Barbasetal.，PhageDisplay：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork(2001))。
物质可以是多肽类似物。在此使用的关于多肽的术语“类似物”包括带有与在此例举的多肽序列基本相同的氨基酸残基序列的任何多肽。该多肽序列中的一个或多个残基被功能类似的残基保守取代并展现出了在此所述的母体多肽序列的活性。保守取代的例子包括使用非极性残基取代非极性残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸；用精氨酸取代赖氨酸且反之亦然从而维持正电荷；用天冬氨酸取代谷氨酸且反之亦然从而维持负电荷；用苏氨酸取代丝氨酸从而维持自由的-OH；用天冬酰胺酸取代谷氨酰胺从而维持自由的-NH2。
物质可以是多肽的化学衍生物。此处使用的术语“化学衍生物”指带有通过侧基团功能化反应化学衍生的一个或多个残基的多肽对象。除了侧基团衍生外，化学衍生物可以带有一个或多个骨架修饰，包括α-氨基取代如N-甲基、N-乙基、N-丙基和类似基团，和α-羰基取代如硫酯、硫代酰胺、胍及类似基团。这种衍生化的分子包括例如自由氨基被衍生化从而形成胺盐酸盐，p-甲苯磺酰基、卞酯基、t-丁氧基羰基、氯乙酰基或甲酸基。自由的羧基可以衍生为盐、甲基和乙酯或其它类型的酯或酰肼。自由的羟基可以衍生为O-酰基或O-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可以衍生为N-苯甲基组氨酸。化学衍生物还包括那些含有二十个标准氨基酸的一个或多个天然产生的氨基酸衍生物的肽。例如：4-羟基脯氨酸可以被取代为脯氨酸；5-羟基赖氨酸可以被取代为赖氨酸；3-甲基组氨酸可以被取代为组氨酸；高丝氨酸可以被取代为丝氨酸；鸟氨酸可以被取代为赖氨酸。本发明的多肽也可以包括任何相比本申请列举的多肽序列，具有一个或多个增加和/或删除或残基的多肽，只要能够维持必需的活性。
物质可以是本申请所述的多聚核苷酸和多肽序列的同源物。本申请所述术语“同源物”和“同源的”指带有与相应多聚核苷酸或多肽序列至少约80％同源性的多聚核苷酸或多肽，优选的带有与相应多聚核苷酸或多肽序列至少约90％同源性，更优选的带有与相应多聚核苷酸或多肽序列至少约95％同源性，更优选的带有与相应多聚核苷酸或多肽序列至少约99％同源性。“相应多聚核苷酸或多肽”表示与相应多聚核苷酸或多肽序列比对的那些序列，其中比对的区域长度是至少约10个残基(即核苷酸或氨基酸)，至少约15个残基，至少约20个残基，至少约30个残基，至少约40个残基，至少约50个残基或至少约100个残基。在生物技术领域中有多种公知的序列比对方法(见如Rosenberg，BMCBioinformatics6：278(2005)；Altschuletal.，FEBSJ.272(20)：5101-5109(2005))。
所述物质可以是拟肽。术语“拟肽”指能够模仿或对抗作为其设计基础的母体多肽或片段的功能的多肽缺失一个或多个结构元素的物质。例如，拟肽可以含有非天然产生的氨基酸或缺乏肽键。母体多肽最初可以确定为感兴趣的蛋白上的连接序列或者可以是天然产生的多肽。确定拟肽的分析可以包括作为阳性对照的母体多肽用于在筛选文库时，如拟肽文库时进行比较。拟肽文库是记载可能具有与母体多肽相似生物活性的化合物文库。制备拟肽的方法是本领域普通技术人员熟知的(Kazmierski，PeptidomimeticsProtocols，HumanaPress，NewJersey(1998)；Kempf，MethodsEnzymol.，241：334-354(1994)；Hruby，Biopolymers，33：1073-82(1993)；Wileyetal.，Med.Res.Rev.，13：327-384(1993)；Claeson，BloodCoagul.Fibrinolysis，5：411-436(1994))。
所述物质可以是多糖或是磷脂。
术语“干扰活性”指物质抑制目标分子表达和/或活性的能力。抑制表达可以是在mRNA或蛋白质水平，且可以是由于合成减少，降解增加或是两者皆有。抑制活性指目标分子的生物化学或生物功能。抑制程度可以是部分的(如10％或更多，25％或更多，50％或更多或75％或更多)，基本完全的(如85％或更多，90％或更多或95％或更多)或完全的(如98％或更多或99％或更多)。
CUL4A是一种起多聚体复合物成份作用的泛素连接酶，其中CUL4A的C末端与环蛋白Rbx1/ROC1/Hrt1(之后用Rbx1表示)相互作用从而招募E2泛素连接酶，且CUL4A的N末端与DDB1相互作用。DDB1进而作为适体结合DDB1、CUL4A相关因素(DCAFs)，其起到底物受体作用(Angersetal.，Nature，443：590-593(2006)；Heetal.，GenesDev.，20：2949-2954(2006)；Higaetal.，NatCellBiol.，8：1277-1283(2006)；Jinetal.，Mol.Cell，23：709-721(2006)；LeeandZhou，Mol.Cell，26：775-780(2007))。通过含有CUL4A的复合物泛素化的底物包括c-Jun，DDB2，XPC和p21(Lietal.，Cell，124：105-117(2006)；Nishitanietal.，J.Biol.Chem.，283：29045-52(2008))。
本申请使用的术语“干扰CUL4A活性”指物质抑制CUL4A表达和/或生物化学或生物功能的能力。CUL4A的生物化学功能例子包括但不限于结合DDB1，结合Rbx1和具有泛素连接酶活性(如泛素化和不稳定化p21，泛素化和不稳定化DDB2和泛素化和不稳定化XPC)。在某一实施例中，干扰CUL4A活性的物质会干扰CUL4A与损伤DNA结合蛋白1(DDB1)的结合。优选的，物质干扰CUL4AN末端α-螺旋区域与DDB1的BPBβ-螺旋推进结构域间的作用。干扰CUL4A与DDB1连接的物质可以与CUL4A和/或DDB1直接作用或者通过与含有CUL4A-DDB1的复合物的另一成份连接产生间接作用。
在某一实施例中，干扰CUL4A活性的物质竞争性地抑制动物体内内生长的CUL4A与DDB1的结合。该竞争性抑制剂可以是含有CUL4A片段的多肽或拟肽。优选的，CUL4A片段包括CUL4AN末端区域(如SEQIDNO：7或SEQIDNO：18)或其具有与CUL4AN末端区域相似功能的类似物、同源物、衍生物或片段(如SEQIDNO：7orSEQIDNO：18)。
CUL4A的生物功能的例子包括但不限于调节细胞增殖，细胞残存(cellsurvival)，DNA修复和基因完整性(genomicintegrity)(LeeandZhou.Mol.Cell，26：775-780(2007))。在优选实施例中，干扰CUL4A活性的物质增加DNA修复活性。在特定优选实施例中，干扰CUL4A活性的物质增加核苷酸切除修复活性从而预防或治疗动物体内DNA损伤相关状态。
无论物质是干扰CUL4A的表达还是干扰CUL4A的生物化学或生物功能，抑制程度可以是部分的(如10％或更多，25％或更多，50％或更多，或75％或更多)，基本完全的(如85％或更多，90％或更多，或95％或更多)，或完全的(如98％或更多，或99％或更多)。
本发明也提供了含有(a)干扰CUL4A活性的物质和(b)载体的组合物。该组合物通常为液体，但也可以是固体或液体和固体成份的组合。理想载体为生理可接受的(如可药用的、药理可接受的或可用于化妆品的)载体(如赋形剂或稀释液)。任何合适的生理可接受的载体都可用于本发明中，且该载体是本领域公知的。载体的选择至少部分取决于目标组织和/或细胞的位置，和组合物特定的给药方法。
组合物可以进一步包括其他合适的成份，特别是用于增加组合物和/或其最终用途的稳定性。相应的，本发明组合物具有多种合适的剂型。以下剂型和方法仅仅用于举例并不是用于限定。
因为含有核苷酸分子的组合物相对尺寸大，易被内切酶降解且核苷酸分子带负电荷，其需要辅助成份用于促进或加强细胞内的传递。合适成份的例子包括但不限于脂质体、阳离子聚合物和纳米粒子。选择性的，核苷酸分子的5’或3’端可以连接富含精氨酸的肽、胆固醇或者脂肪酸用于促进或加强细胞内的传递。合适的成份和共轭物是本领域内普通技术人员熟知的(见如美国专利6,617,438和7,402,574；Whiteheadetal.，Nat.Rev.DrugDisc.，8：129-138(2009))。
适于肠胃外给药的剂型包括水性和非水性、等渗消毒注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂等渗于目标受体血液的溶质，和含有悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性或非水性消毒悬浮液。制剂可以置于单元剂量或多剂量封装的容器中，如针剂和小瓶，可以存储在冷干(冻干的)环境中，使用之前只要求加入消毒的液体赋形剂如水，用于注射。临时注射溶液和悬浮液可是由消毒粉末、颗粒和之前描述的药片种类制备。非肠道给药制剂可以配制为肿瘤外给药，静脉注射、腹膜内注射、眼内注射、皮下注射和类似制剂。
使用本领域公知的，适于口服给药剂量的可药用的载体配制适于肠道给药的组合物。该载体使药物组合物可以配制为药片、药丸、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、悬浮液和类似制剂用于病人的摄取。口服的药物制剂可以通过将活性化合物与固体赋形剂结合，选择性的研磨获得的混合物，并在需要时加入合适的辅助剂，之后处理该颗粒混合物从而获得药片或糖衣丸核。合适的赋形剂有碳水化合物或蛋白质填充物如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；谷物中的淀粉、小麦、大米、马铃薯或其它植物；纤维素如甲基纤维素、羟基丙基甲基-纤维素或羧基甲基纤维素钠；和橡胶，包括阿拉伯树胶和黄氏胶；和蛋白质，如明胶和胶原质。如果需要，可以加入崩解制剂或增溶剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、褐藻酸或其盐，如藻酸钠。提供的糖衣丸核带有合适的糖衣，如浓缩的糖溶液，其也可以含有阿拉伯树胶、云母、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶液或溶剂混合物。药片或糖衣丸糖衣中可以加入染料或色素用于确认产品或有效化合物量，即剂量特征化。
适合肛门或直肠给药的制剂可以通过将活性物质与多种基质(base)如乳化基质或水溶性基质混合来制备栓剂。适于阴道给药的制剂可以是含有活性成份和本领域公知的合适载体的阴道栓剂、棉塞、乳剂、凝胶、软膏、泡沫或喷雾制剂。
适于眼部给药的制剂可以通过将活性物质与含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使制剂等渗压于目标对象的眼部组织的溶质的多种水性和非水性，等渗压消毒注射溶液和含有悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性消毒悬浮液混合制备成注射剂、滴剂、喷雾剂或薄膜。
在本发明一优选实施例中，干扰CUL4A活性的物质单独或与其他合适的成份组合制备成吸入给药的气雾剂。本发明的物质优选为以分离形式(finelydividedform)与表面活性剂和推进剂的共同提供。本发明化合物通常的质量百分含量可以为约0.01％至约20％，优选为约1％至约10％。表面活性剂必须是无毒的，且优选为可溶于推进剂中。典型的表面活性剂为含有6至22个碳原子的脂肪酸酯或脂肪酸偏酯，如带有脂肪族多羟基醇或其环状酐的己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、胆甾酸(olestericacid)和油酸。可以使用混合酯，如混合的或天然的甘油酯。表面活性剂可以是组合物质量的约0.1％至约20％，优选为约0.25％至约5％。组合物的平衡是普通推进的。需要时也可以包括载体，如用于鼻内传递的卵磷脂。气雾剂可以置于可接受的加压推进剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮或类似物。他们也可以配制为药品用于无压力制备，如在喷雾器或雾化器中。该喷雾制剂可以用于如黏膜喷雾，也可以特定优选的用于预防或治疗呼吸系统或空腔和咽部癌症。
在特定优选实施例中，制剂为含有干扰CUL4A活性物质和化妆品可用载体的防晒组合物。通常防晒组合物是水包油或油包水乳液，其中油相包括一种或多种防晒化合物、增溶剂、硅树脂乳化剂、润肤剂和其它化妆品可接受的皮肤调节剂。水相主要为水，但是通常包括辅助成份如保湿剂(如戊二醇和丙三醇)，防腐剂和增稠剂。辅助成份如香味剂、染料和提取物可以在制备后加入相或乳液中。相似的，本发明干扰CUL4A活性的物质可以在制备后根据该物质的生理化学特征加入到油相、水相或乳液中。
术语“防晒化合物”指能够隔离波长为280nm-320nm(即UV-B)和/或320nm-400nm的紫外线(即UV-A)照射的化合物。防晒化合物可以是一个或多个能吸收UV照射的有机化学制品，一个或多个反射、分散或吸收UV照射或其组合的无机化学制品。合适的防晒化合物例子包括但不限于磺异苯酮、二羟苯宗、氨基苯甲酸甲酯、4-氨基苯甲酸(PABA)、戊基二甲基PABA、辛基二甲基PABA、丙三基PABA、对-甲氧基肉桂酸-2-乙氧基乙酯、二乙醇氨对-甲氧基肉桂酸酯、对-甲氧基肉桂酸乙基己酯、二没食子酰三油酸酯、4-二(羟基丙基)氨基苯甲酸乙酯、2-氰基-3，3-二苯基丙烯酸-2-乙基己酯、水杨酸-2-乙基己酯、原膜散酯、三乙醇胺水杨酸盐、2-苯基并咪唑-5-磺酸、红矿脂、二氧化钛、氧化锌及其组合物。
防晒组合物可以适应性的采用乳液、油、凝胶、固体棒状、喷雾和泡沫的形式。防晒组合物及制备方法是本领域普通技术人员公知的，并在如美国专利5,587,150、5,770,183和6,033,649中有描述。
本发明也包括一种预防或治疗动物体内DNA损伤相关状态的方法，该方法包括对需要的动物给药有效剂量的含有干扰CUL4A活性的物质和可用于化妆品的载体的防晒组合物，进而预防或治疗动物体内DNA损伤相关状态。在某一实施例中，本发明的防晒组合物在UV照射前给药。理想的，防晒组合物在UV照射前10分钟或更长，20分钟或更长、30分钟或更长，或60分钟或更长前给药用于预防或减弱DNA损伤。在另一实施例中，防晒组合物在UV照射中给药用于预防或减弱DNA损伤或增强DNA修复。在另一实施例中，防晒组合物在动物UV照射后给药。理想的，防晒组合物在UV照射30分钟或更短，1个小时或更短，4个小时或更短，12个小时或更短，或24个小时或更短后给药用于增强DNA修复。
本发明也提供了一种对需要的动物进行干扰CUL4A活性的物质和化疗制剂共同给药的方法。“共同给药”表示化疗制剂和干扰CUL4A活性的物质的给药时间足够近以至于干扰CUL4A活性的物质能够增强化疗制剂的效果。在这点上，干扰CUL4A活性的物质可以和化疗制剂同时给药。
任何类型的化疗制剂都可以和干扰CUL4A活性的物质共同给药，包括但不限于抗微管剂、抗代谢物剂、抗有丝分裂剂、DNA损害剂、促凋亡剂、诱导分化剂、抗生素、荷尔蒙及其任何组合物。合适的化疗制剂包括但不限于酪氨酸激酶抑制剂(金雀异黄酮)、生物活性剂(TNF或tTF)、放射性核(131I、90Y、111In、211At、32P和其他已知的治疗放射性核)，阿霉素、安莎类抗生素、天冬酰胺酶、博来霉素、白消安、顺铂、卡波铂、卡氯芥、卡培他滨、瘤可宁、阿糖胞苷、环磷酰胺、喜树碱、氮烯唑胺、更生霉素、道诺霉素、右丙亚胺、多西他奇、阿霉素、依托泊苷、埃博霉素、氟尿核苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺、巯基嘌呤、美法仑、甲氨蝶呤、雷帕霉素(西罗莫司)和衍生物，丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、亚硝基脲、紫杉醇、帕米磷酸盐、喷司他丁、普卡霉素、甲基苄肼、利妥昔单抗、链脲霉素、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、噻替派、紫杉烷、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、紫杉醇、考布他汀、盘皮海绵内酯(discodermolides)、反铂、抗血管内皮生长因子化合物(抗VEGFs)、抗外皮生长因子受体化合物(抗EGFRs)、5氟尿嘧啶及类似物。一剂量的一种或多种化疗制剂可以根据本发明方法给药。本发明方法使用的化疗制剂的类型和数量将依据特定肿瘤类型的标准化疗方案确定。换句话说，在使用单个化疗制剂常规治疗特定癌症时，也可以使用化疗制剂的组合物治疗另一种癌症。化疗制剂的给药量足以治疗癌症(如化疗制剂的癌症有效治疗量)。在给药时，熟悉本领域技术的临床医生可以确定组合物的有效治疗量用于治疗或预防特定疾病状态或病症。
本发明也提供一种识别调节CUL4A泛素连接酶活性的物质的方法，该方法包括(a)在适于形成CUL4A-DDB1的条件下混合CUL4A多肽、DDB1多肽和测试物质，(b)检测(a)条件下形成的CUL4A-DDB1复合物的量，和(c)比较测试物质存在时(b)中检测的CUL4A-DDB1复合物的量和没有测试物质时(b)中检测的CUL4A-DDB1复合物的量，由此差别反映测试物质调节CUL4A泛素连接酶活性的能力。
用本发明方法识别的具有CUL4A泛素连接酶活性的调节剂可以是阳性调节剂，即增加CUL4A泛素连接酶活性的物质。调节剂可以增加CUL4A泛素连接酶活性至相比无调节剂时泛素连接酶活性的约1.5倍或更多，约2倍或更多，约3倍或更多，约4倍或更多，约5倍或更多，约10倍或更多，约15倍或更多，约20倍或更多。
CUL4A的调节剂可以是阴性调节剂，即降低、抑制或干扰CUL4A泛素连接酶活性的物质。相应的，本发明提供了识别干扰CUL4A泛素连接酶活性的物质的方法，该方法包括(a)在适于形成CUL4A-DDB1复合物的条件下混合CUL4A多肽、DDB1多肽和测试物质，(b)检测(a)条件下形成的CUL4A-DDB1复合物的量，和(c)比较测试物质存在时(b)中检测的CUL4A-DDB1复合物的量和没有测试物质时(b)中检测的CUL4A-DDB1复合物的量，由测试物质存在时CUL4A-DDB1复合物形成的量的减少反映测试物质干扰CUL4A泛素连接酶活性的能力。
理想的，干扰CUL4A活性的物质抑制泛素连接酶的活性，使其相比没有干扰物质存在时降低至少25％(如25％或更多，35％或更多，或45％或更多)。优选的，干扰CUL4A活性的物质抑制泛素连接酶的活性，使其相比没有干扰物质存在时降低至少50％(如50％或更多，60％或更多，或70％或更多)。最优选的，干扰CUL4A活性的物质抑制泛素连接酶的活性，使其相比没有干扰物质存在时降低至少75％(如75％或更多，85％或更多，或95％或更多)。
筛选能够调节蛋白质-蛋白质相互作用的物质的方法是本领域普通技术人员公知的。例如，测试物质可以通过传统的本领域公知的分析如酶联免疫吸附试验(ELISA)，酶联免疫斑点(ELISPOT分析)，放射性免疫测定或BIOCORE分析针对调节CUL4A-DDB1复合物的能力进行筛选，从而可以确定测试物质存在和不存在时的亲合力。优选的，筛选作为高通量筛选的一部分是在多孔板上进行的。实施例中更加详细的描述了合适的筛选分析方法。
CUL4A多肽可以是全长的CUL4A多肽(如SEQIDNO：1)或全长CUL4A多肽的片段。全长CUL4A的片段长度可以是75个氨基酸或更多，100个氨基酸或更多，125个氨基酸或更多，或150个氨基酸或更多。可选的或另外，全长CUL4A多肽的片段长度为750个氨基酸或更少，600个氨基酸或更少，450个氨基酸或更少，或300个氨基酸或更少。因此，全长CUL4A的片段长度可以是上述端值中任何两个连接的长度。例如，全长CUL4A的片段长度可以是75-750氨基酸，150-450氨基酸或125-300氨基酸。理想的，全长CUL4A的片段包括CUL4A整个N末端α-螺旋区域(如SEQIDNO：7)和/或保留与DDB1多肽结合的能力。全长CUL4A多肽片段的另一个例子包括CUL4A整个N末端α-螺旋区域，并与含有包括SEQIDNO：5或SEQIDNO：6片段的DDB1多肽结合。
DDB1多肽可以是全长DDB1多肽(如SEQIDNO：3)或是全长DDB1多肽的片段。全长DDB1多肽片段的长度可以是150个氨基酸或更多，200个氨基酸或更多、250个氨基酸或更多或300个氨基酸或更多。可选的或另外，全长DDB1多肽的片段长度可以是800个氨基酸或更少，600个氨基酸或更少或400个氨基酸或更少。因此，全长DDB1多肽的片段长度可以是以上端值任意两点连接的长度。例如全长DDB1多肽的片段长度可以是150-800个氨基酸，200-600个氨基酸或250-400个氨基酸。理想的，全长DDB1多肽的片段包括DDB1的BPBβ-螺旋推进结构域(如SEQIDNO：8)和/或保留与CUL4A多肽结合的能力。优选的，全长DDB1多肽的片段包括氨基酸残基A400、I402、L404、V443、E537、W561、I587和R589，这些氨基酸残基被确定与CUL4A形成直接接触(Angersetal.，Nature，443：590-593(2006)；Lietal.，Cell，124：105-117(2006))(图12)。
CUL4A多肽和/或DDB1多肽可以与处理序列或识别序列如蛋白纯化标记连接。合适的蛋白纯化标记例子包括但不限于GST或FLAG和聚组氨酸。优选的，蛋白纯化标记为GST或FLAG。最优选的，CUL4A多肽和DDB1多肽的蛋白纯化标记是不同的。
在识别调节CUL4A泛素连接酶活性的物质的方法的优选实施例中，CUL4A多肽和DDB1多肽被不同分子标记，且标记的CUL4A多肽或标记的DDB1多肽被固定在激光可激发的供体珠上，同时不固定在供体珠上的CUL4A多肽或标记的DDB1多肽被固定在含有能够在纯态氧存在时化学发光的二甲基噻吩衍生物的受体珠上。实施例对该实例作了更详细的描述。
调节CUL4A泛素连接酶活性的测试物质可以是任何合适的物质。例如，调节CUL4A泛素连接酶活性的测试物质可以是小分子(如来自化学文库的小分子)或是肽(如噬菌体表面展示的，如在噬菌体展示文库中的)。
以下实施例是对本发明的进一步说明，不应理解为限制范围。
实施例1
本实施例证明了Cul4敲除(Cul4-/-)小鼠的生成且将其显型与之前公开的Cul4a敲除小鼠比较。
为了生成两侧装接上loxP位点的Cul4a等位基因，通过Cul4acDNA探针筛选129个基因组文库(英杰)。五条BAC克隆被识别，且克隆#297L07被用于产生最终目标构建子。目标载体通过将LoxP位和pSV-FLP-Cre新霉素抗性表达框置于外显子17的上游1.1kb处和将另一个LoxP位置于外显子19下游300bps处。5’和3’同源手臂分别为3kb和5kb，且是通过BAC克隆的EXL长范围PCR(Stratagene)生成的。在电穿孔和G418筛选后，通过DNA印迹法识别同源重组的ES克隆。通过BamHI消化ES细胞基因组DNA，和通过DNA印迹与紧接5’同源臂上游的(immediatelyupstream)探针杂交评估5’端的同源重组。野生型等位基因产生一11kb条带，尽管目标等位基因由于pSV-FLP-Cre载体内额外的BamHI位点产生一7.3kb条带。通过SacI和PacI的消化和紧接3’同源臂下游的探针的杂交确定3’端的同源重组。野生型等位基因相比目标等位基因中的7kb条带显示9kb条带。同源重组后的两个阳性克隆(#379和#395)通过胚泡注射生成嵌合小鼠。
通过两侧装接上loxP位点的Cul4a小鼠和E2A-Cre转基因品系配种，种系诱导删除外显子17至19生成删除的Cul4a等位基因(Laksoetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，93：5860-5865(1996))。通过DNA印迹法和PCR确定目标基因座的传递(transmission)。所有突变的动物都与C57BL/6J回交杂种12代。
通过使用CelLyticTMMT哺乳动物组织消散/提取剂(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)从Cul4a-/-、Cul4af/f或野生型同窝出生的仔畜的组织中提取蛋白质分析蛋白质表达。用CUL4A抗体(C-19，圣克鲁斯生物技术，圣塔克鲁斯市，加拿大)和β-肌动蛋白对组织和MEF提取物进行免疫印迹(西格玛，圣路易斯，MO)。
用于基因打靶的短发夹(sh)RNAs如下：鼠科动物(murine)sh-Cul4b为5’-GTAGTAACGAGAGAGAAGACT-3’(SEQIDNO：9)；鼠科动物sh-Pcid2-1为5’-GGCAAAGCACGAGACGTTCTT-3’(SEQIDNO：10)；鼠科动物sh-Pcid2-2为5’-GATGAAATGTTTGCAGCTCATT-3’(SEQIDNO：11)；鼠科动物sh-p21为5’-GAGAACGGTGGAACTTTGACTT-3’(SEQIDNO：12)；打乱的sh-Cul4b为5’-GTCGCAGCAATAAATACGGCT-3’(SEQIDNO：13)；和人类sh-Cul4a为5’-GAAGCTGGTCATCAAGAAC-3’(SEQIDNO：14)。shRNAs被亚克隆至FUGW慢病毒载体中且在U6启动子下表达(SuiandShi，MethodsMol.Biol.，309：205-218(2005))。生成的重组慢病毒被用于感染MEFs或HCT116细胞。
通过两次保守PCR反应和使用以下PCR引物克隆至pCDNA3载体生成CUL4A(Δ)突变体(删除残基585-727)：上游PCR引物为5’-GCGATATCCGCGGACGAGGGCCCTCG-3’(SEQIDNO：15)；第一下游引物为5’-CATATAGTCTCTGTCTATAAGTGACTCAATCCTTTTTTTCAAATCTCCAGGCTCCTTAAAGTCCGCCTTCAGC-3’(SEQIDNO：16)，第二下游引物为5’-GCTCTAGATCATGCCACGTAGTGGTACTGATTTGGACTGTCTTTGTCTCGTTCCATATAGTCTCTGTCTATAAG-3’(SEQIDNO：17)。通过MYC标记的CUL4A或CUL4A突变体(去除残基585-727)(CUL4A(Δ))瞬时转染的293T细胞的免疫沉淀反应评估CUL4A与Rbx1间的作用。MYC标记的CUL4A或CUL4A突变体是由PCR和克隆到pCDNA3-MYC载体生成的，其中带有或不带有FLAG标记的Rbx1共转染。用抗-MYC进行免疫沉淀，用抗-MYC(Ab-1)和商业获得的抗-FLAG(M2)抗体进行之后的蛋白质印迹。
为了研究CUL4A在DNA修复和肿瘤发生中所起的生理作用，通过Cre/lox方案生成条件性Cul4a敲除小鼠。外显子17-19横跨重要的卡琳同源结构和类泛素化(neddylation)位点，在胚胎干(ES)细胞中通过同源重组在两侧装接上loxP位点(图1A)。DNA印迹确认了目标Cul4a基因座存在于两侧装接上loxP位点的杂合(f/+)胚胎干细胞中(图1B)。PCR分析确认了鼠尾DNA中的野生型、两侧装接上loxP位点的、和重组Cul4a等位基因(图1C)。纯合子Cul4af/f小鼠是健康的且表型上与野生型同窝仔畜不同。随后通过Cul4af/f小鼠与E2A-Cre转基因小鼠杂交繁殖生成Cul4a-/-小鼠(Laksoetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，93：5860-5865(1996))。免疫印迹法已经确认了多种组织和MEFs中没有全长CUL4A蛋白质(图1D)。可以检测到C末端截短的CUL4A(指定的CUL4A(Δ))，但是相比于野生型CUL4A，其水平已经大大降低(8％)，且不能与Rbx1作用来招募E2泛素连接酶(图1E)。
本实施例所述的Cul4a-/-小鼠是可发育的，在其寿命中没有明显的发育异常。该结果与公开的Cul4a外显子1删除株的胚胎期致死完全不同(Lietal.，Mol.CellBiol.，22：4997-5005(2002))。但是，Li等的外显子1目标构建子也消除了位于Cul4a外显子1附近互补链上的Pcid2基因的表达。Pcid2编码带有PCI结构域的蛋白质，其保存在26S蛋白酶，COP9信号转导体和翻译起始因子3复合物的必要亚基中(HofmannandBucher，TrendsBiochem.Sci.，23：204-205(1998))。Li等的外显子1目标等位基因删除了第一Pcid2外显子上游529个碱基对区域，留下仅ATG翻译起始密码子上游的4个碱基对(图2A)。原代小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)中慢性短发夹(sh)RNA引起的Pcid2表达沉默导致了发育能力迅速消失(图2B)。与此相反，Cul4a-/-MEFs中没有发现生长停滞或细胞死亡(图3A)。因此，Li等观察到的胚胎致死表型可能是由于临近Cul4a的互补链上的必要Pcid2基因偶然的删除引起的。
在哺乳动物中，两条Cul4基因(即Cul4aandCul4b)通常是共同表达且装配成结构相似的泛素连接酶。因此CUL4B可以补充CUL4A的缺失，从而保证Cul4a-/-小鼠的存活。相应的，Cul4a-/-MEFs中Cul4b的沉默导致BrdU掺入的急剧下降和细胞发育能力的丧失(图3A和3B)。这与之前观察的Ddb1-/-MEFs相符合(Cangetal.，Cell，127：929-940(2006))并且与两种CUL4蛋白必须去活性来去除CUL4泛素连接酶活性的事实相一致(Higaetal.，Nat.CellBiol.，5：1008-1015(2003)；Huetal.，Nat.CellBiol.，6：1003-1009(2004))。
本实施例证明了Cul4敲除(Cul4-/-)小鼠的生成，其中Pcid2基因座未修饰。
实施例2
本实施例证明了DDB2、p21和XPC在Cul4a缺陷细胞中稳定性增强。
从胚胎日(E)13.5野生型或Cul4a敲除胚胎中分离MEFs。将鼠Cul4b和Pcid2和打乱的对照shRNAs亚克隆到FUGW慢病毒载体中且在如实施例1所述的U6启动子下表达。生成重组shCul4b和shPcid2慢病毒用于感染原代Cul4af/f和Cul4a-/-MEF细胞。将含有shRNA的FUGW慢病毒加入Cul4af/f和Cul4a-/-MEFs，每12小时一次至36个小时。在感染48小时后收获细胞。使用CUL4A(C-19，圣克鲁斯生物技术)，CUL-4B，DDB2(细胞信号技术，丹弗斯，MA)，p21(圣克鲁斯生物技术)，XPC，组蛋白H3和β-肌动蛋白(西格玛，圣路易斯市，MO)抗体对MEF提取物进行蛋白质免疫印迹。
脉冲追踪分析Cul4a-/-和Cul4af/fMEFs确定DDB2的半衰期，并使用感光成像扫描仪进行定量。通过追踪Cul4a-/-和Cul4af/fMEFs中的环己酰胺(CHX)来分析p21的半衰期，并通过检测免疫印迹信号定量，其以对数标度绘制时间的函数。
MYC标记的CUL4A，HA标记的DDB1，GST标记的CDT2和FLAG标记的p21瞬时转染或未瞬时转染的293T细胞的免疫沉淀反应评估p21与CUL4A-DDB1复合物成份的相互作用。之后用图6所述的合适的抗体进行免疫沉淀反应和的蛋白质印迹。
UV照射后确定HCT116细胞中XPC的泛素化。用慢病毒shCul4a或对照FUGW感染HCT116细胞48小时，UV照射10J/m2且在UV后0小时、0.5小时、1小时和2小时收获。制备染色质结合的提取物并进行免疫印迹。
在Cul4a-/-小鼠(图4A)和Cul4a-/-MEFs(图4B)的上皮中观察到了更高的稳定的DDB2蛋白质水平。根据脉冲追踪分析，E13.5Cul4a-/-胚胎衍生的原代MEFs中DDB2的半衰期延长了(图4C)。为了确定CUL4A和CUL4B在DDB2降解中的相对作用，生成针对小鼠Cul4b的慢病毒并用于感染原代Cul4af/f和Cul4a-/-MEFs的早期传代(P3)。shCul4b有效降低了超过93％的小鼠CUL4B，而对DDB2水平的影响很小(图4B，图5A)。相反的，Cul4a敲除或Cul4a和Cul4b的消除导致DDB2蛋白质3至4.5倍的上调，而对mRNA无该效果(图4B，图5A)。作为对Cul4a敲除或Cul4b沉默的回应，DDB2mRNA水平维持不变甚至微微下降(图5A)。
CUL4A的删除(图4D)增加了p21的半衰期，导致p21蛋白质在Cul4a-/-外皮(图4A，图5B)和原代MEFs中积累(图4B)。而mRNA没有积累。RNAi引起的Cul4b沉默的影响很小，突出了CUL4A不仅在控制DDB2和XPC稳定性中的主要作用也突出了其在控制p21(图4B)稳定性中的主要作用。当同时去除Cul4aandCul4b活性导致p21进一步积累时，p21的降解可以与去活化的Cul4a或Cul4b降解单独比较(图3A和3B)，这是由于带有敲低Cul4b的Cul4a-/-MEFs快速生长停滞了。同样的，共免疫沉淀反应将p21物质上置于CUL4A-DDB1复合物中(图6)。
XPC是GGRDNA损伤识别步骤速率的限制因素，同时也是CUL4A-DDB1-DDB2E3连接酶的直接泛素化目标(Friedbergetal.，DNARepairandMutagenesis，2ndEditionASMPress，Washington，D.C.(2006)；Sugasawaetal.，Cell，121：387-400(2005))。有趣的是，在正常条件下，删除Cul4a后，XPC蛋白质在原代MEF细胞中的稳定水平增加4.4倍，mRNA却没有，而Cul4b的敲低对XPC积累影响很小(图4B，对比道1-3，图5C)。因此，Cul4a-/-MEFs不仅积累DDB2，而且积累速率限制性XPCDNA损伤传感物(DNAdamagesensor)，用于识别损伤和GGR。
UV照射后，DDB1-DDB2复合物马上识别损伤的DNA并通过与XPC直接结合帮助招募XPC-HHR23B复合物至DNA损伤位点(Fitchetal.，J.Biol.Chem.，278：46906-46910(2003))。之后CUL4A-DDB1-DDB2E3连接酶将XPC的DNA泛素化，随后去泛素化，而不是进行蛋白酶依赖性降解(Sugasawaetal.，Cell，121：387-400(2005))。XPC的泛素化对GG-NER的生理作用还未确定。因此，评估了CUL4A去除对XPC结合染色质和UV照射泛素修饰的影响。由于可利用的XPC抗体不能检测MEFs中泛素化的小鼠XPC，因此用慢病毒shRNA耗尽人类HCT116细胞中的CUL4A。如图4E所示，随着慢病毒shRNA使CUL4A沉默，XPC与染色质的结合增加了，这与Cul4a缺失时可获得的更高XPC水平一致(图4B)。另外，CUL4A的耗尽导致了XPC泛素化显著抑制UV后染色质(图4E)。共同性的，这些结果证明了正常条件下CUL4A在控制XPC水平中具体的作用和XPC泛素化在回应UV照射时对染色质的具体作用。另外，CUL4A主要负责控制DDB2和XPC的泛素化，而CUL4B在这些过程中的作用，如果有的话也是很少的。
本实施例的三个结果反映了Cul4a缺陷细胞中DDB2、p21和XPC的稳定性增强了。
实施例3
本实施例证明了Cul4a缺陷细胞中UV损伤的DNA的结合(UV-DDB)和全面性基因组修复(GGR)活性增强。
在针对UV-DDB活性的损伤DNA结合分析中，5000J/m2UV照射的32P标记的DNA探针与2μg整个细胞的提取物培养。通过电泳迁移率变化分析评估结合(Chenetal.，J.Biol.Chem.，276：48175-48182(2001))。
使用之前所述的，在原代Cul4a-/-(ko-4ascm-4b)、Cul4bk/d(f/f-4ash-4b)和对照Cul4af/f(f/f-4ascm-4b)MEFs(图7B，ko，敲除；k/d，敲低；scm，打乱的)中进行的方法进行CPD和6-4PP去除的GGRELISA分析。简单的说，指数增长的MEF细胞在10J/m2UV-C(254nm)下照射且立刻收获(0小时)或允许其在如图7B所示时间内修复。分离基因组并通过液闪计数法和烟酸己可碱染色DNA的荧光检测技术对其定量。将变性的基因组DNA固定在精蛋白硫酸盐涂层的96孔板的每一个孔内，并随后用6-4PPs(64M-2，1∶5000)或CPDs(1∶5000)，抗小鼠IgG(H+L)(1∶2000，Zymed)的生物素-F(ab′)2片段和过氧化物酶-连霉亲和素(1∶10,000，Zymed)特异性单克隆抗体在37℃培养30分钟。使用PBS-吐温和0.1M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液洗涤并与底物溶液(0.1M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液，0.1mg/mL四甲基联苯氨【TMB】，0.03％H2O2)在室温下培养30分钟。在每个孔中加入50μl1MH3PO4来停止酶反应。使用酶标仪(分子设备)确定A450。
通过血清饥饿72小时同步G0/G1中的原代MEFs，在放入含培养基血清后3小时进行UV照射(10J/m2)，在多个所示时间点收获MEFs用于[3H]-胸苷掺入法(图7C)(GitigandKoff，MethodsMol.Biol.，142：109-123(2000))或流动血细胞计数法(图8)来分析细胞周期的进行。10J/m2UV照射MEFs，培养48小时，4％仲甲醛固定并进行4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色来进行微核检测。
UV损伤的DNA的识别受到可利用DDB2细胞池的限制(Fitchetal.，DNARepair(Amst)，2：819-826(2003)；TangandChu，DNARepair(Amst)，1：601-616(2002))。如使用抗-CPD和抗-6-4PP抗体(图7B)的ELISAGGR分析所检测的，相比Cul4af/fMEFs，DDB2在Cul4a-/-MEFs中的积累导致了UV-DDB活性的增加(图7A；“B”表示DDB-DNA复合物)，和针对CPDs和6-4PPs的GGR活性大约20％的增强，这最常见的通过NER修复的损害。与此相反，没有发现shRNA耗尽对GGR效率的影响(图7B)。这些结果证明去除CUL4A能有效提升GGR能力至超过野生型细胞可达到的临界点。
为了确定p21转译后在MEFs中的稳定性是否证明了实施例2执行了p21依赖性DNA损伤检验点，通过[3H]-胸苷掺入检测G0/G1同步原代Cul4a-/-和UV后野生型MEFs进入S期的动力学。野生型MEFs在UV照射后12小时开始离开G1并掺入[3H]-胸苷，且主要部分在16-20小时进入S期(图7C)。然而，Cul4a-/-MEFsUV照射后进入S期耽误了4-6小时。为了确认p21是造成Cul4a-/-MEFs中耽误进入S期的主要下游目标，通过杂交Cul4a-/-和p21-/-小鼠生成Cul4a-/-；p21-/-MEFs。当然，p21的去除有效消除了CUL4A缺失相关的，延长的G1停滞(arrest)，且导致了加速进入S期。18％的Cul4a-/-；p21-/-MEFs在UV照射后8小时进入S期，类似于p21-/-MEFs中看到的(图7C)。流动血细胞计数法分析进一步确认了相比野生型MEFs，Cul4a-/-MEFs进入S阶段至少延迟了6小时，而去除p21有效的消除了Cul4a-/-MEFs中的G1模块(图8)。因此，p21在Cul4a-/-细胞中的稳定性执行了DNA损伤反应性模块G1从而防止过早进入S期，且给NER机器分配额外的时间来确定和去除DNA光损伤。
通过慢病毒shRNA去除或敲低Cul4a-/-中的p21基因导致了在CPD去除中NER活性相对于Cul4a-/-MEFs降低8-11％，突出了p21在UV诱导光损伤去除中的上调益处(图7D)。值得注意的是，在单个生理UV剂量(10J/m2)24小时后，p21引发的GGR增强适中时，就会有效的扩大重复UV进攻，使用更高UV剂量或者延长照射。在UV照射后，其维持基因组完整能力的增强进一步突出了在Cul4a-/-MEFs中延长G1停滞的优势，因为Cul4a-/-MEFs的微核比UV照射诱导的野生型MEFs少40％(图7E)。p21的删除消除了Cul4a-/-MEFs防止染色体在有丝分裂期间分异混乱的能力。因此，p21在Cul4a-/-细胞中的稳定性是造成执行DNA损伤反应性模块G1和UV照射后细胞周期延迟进入S期的主要原因。
该实施例的结果证明了Cul4a缺陷细胞相比野生型细胞具有增强的UV损伤DNA结合(UV-DDB)和全面性基因修复(GGR)活性。
实施例4
该实施例证明了皮肤特定的Cul4a敲除小鼠对UVB诱导的皮肤癌的抵抗性。
Cul4af/f小鼠与K14-CreERTAM(Vasioukhin，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，96：8551-8556(1999))小鼠繁殖用于生成可诱导的皮肤特定的Cul4a敲除小鼠。使用八至十二周大的同窝生的小鼠，刮去其背部皮肤每周一次用于UV照射实验。在UVB照射前，刮去Cul4af/f；K14-CreERTAM小鼠的背部皮肤并在局部使用他莫昔芬/DMSO溶液来诱导去除Cul4a的等位基因。作为对照，野生型同窝生小鼠也接受他莫昔芬/DMSO处理(20mg/天，持续5天)。照射单个小鼠直至出现皮肤肿瘤或最长照射至48周，对应所有野生型CUL4A小鼠出现皮肤肿瘤的那周。在三个独立的实验中，使用一组四个UVB灯(TL20W/01311NB飞利浦灯，国家生物公司)照射共十三只CUL4A敲除小鼠和十九只野生型同窝生小鼠，最初剂量为2,500J/m2每天，之后逐渐增加至最大剂量3,500J/m2每天。通过UVX电子辐射计(型号UVX-31)测量UVB的通量。至少每周检查一次小鼠的健康和肿瘤生长情况。如果小鼠病的过重或外部肿瘤直径超过1.5cm，则牺牲小鼠。使用log-rank实验测定统计显著性。为了进一步分析，皮肤肿瘤被固定在室温下10％福尔马林中过夜，石蜡灌封的且横截面为10μm厚。通过传统方法进行H&E染色。对于免疫组织化学，用NEO-CLEARTM二甲苯替代品(65351-85，EMDChemicals，NJ)去除皮肤肿瘤部分的石蜡，并在95C沸腾10分钟，用TRILOGYTM(CMX832，CellMarque，CA)找回抗原。在模块化后(afterblocking)，用原代抗体melan-A(A103)(sc-20032，圣克鲁斯生物技术)和p63(A4A)(sc-8431，圣克鲁斯生物技术)在4C过夜培养截面，之后用第二抗体和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染色。
为了评估NER同时上调的生理影响和CUL4A消除对G1/SDNA损伤检验点的影响，将皮肤特定的他莫昔芬可诱导的Cul4a敲除小鼠和Cul4af/f对照动物的UV-诱导皮肤癌发生倾向性进行比较。通过他莫昔芬局部给药首先去除Cul4af/f；K14-CreERTAM小鼠背部皮肤刮过部分的Cul4a，接着每天进行UV-B照射。Cul4af/f对照小鼠在UV-B处理后27周开始出现肿瘤。在48周前，所有的Cul4af/f小鼠背部被刮过的皮肤区域都出现了肿瘤(图9A)。组织学和免疫组织化学分析确认了对照Cul4af/f小鼠的肿瘤大多数是由表皮衍生出来的扁平细胞癌(图9B-F)。引人注意的是Cul4af/f；K14-CreERTAM小鼠中只有一只保持SCC自由(图9A)。也出现了非-SCC肿瘤(如纺锤体细胞瘤)且如预料的，在Cul4af/f和Cul4af/f；K14-CreERTAM组中观察到了类似的事情，因为K14-CreERTAM在这些细胞类型中不表达。SCCs肿瘤与非SCC肿瘤开始的巨大差别显示肿瘤抵抗与CUL4A缺失间特定的联系。值得注意的是Cul4af/f和Cul4af/f；K14-CreERTAM皮肤显示了相似的细胞凋亡指数，进而表明了对SCC的抵抗性不可能是因为皮肤特定的Cul4a敲除动物中增加的细胞死亡倾向性。
不与任何特定理论结合，图10为一假设模型，其根据实施例1-4所述结果显示了CUL4A在调节NER和肿瘤发生中的作用。CUL4A分别通过DDB2和p21目标降解调节性抑制NER和G1/SDNA损伤检验点通路。因此细胞中删除CUL4A提升NER能力和G1/SDNA损伤检验点反应至超过野生型细胞可达到的临界点。NER能力的提升和G1/SDNA损伤检验点反应有助于增强对Cul4a敲除小鼠肿瘤生长的抵抗性，所述增强是相比对照小鼠而言。
本实施例结果反映了去除CUL4A能更好的防治UV照射引起的皮肤癌。
实施例5
本实施例证明了显性负相(DN)CUL4能增强生物体外NER。
用控制腺病毒或含有DN-CUL4(SEQIDNO：18)编码基因的腺病毒感染HCT116细胞。之后用10J/m2UV-C照射细胞。在0小时、4小时、8小时和24小时收集基因组DNA，并如实施例3所述，用探针查明CPD损伤。之后计算NER活性的速率作为CPD修复与时间的函数。
相比对照细胞，UV照射的HCT116细胞中CPD修复发生的更早且在DN-CUL4表达细胞中更加完全(图11)。
本实施例结果确认了显性负相(DN)CUL4能增强生物体外NER。
实施例6
该假想实施例描述了高通量筛选(HTS)分析用于识别调节(如抑制)CUL4A与DDB1结合的物质。
X射线晶体学研究揭示了DDB1-CUL4A连接的分子细节(Angersetal.，Nature，443：590-593(2006)；Lietal.，Cell，124：105-117(2006))。DDB1-BPBβ-螺旋推进区域内的八个残基(A400，I402，L404，V443，E537，W561，I587和R589)被确认与CUL4A形成直接接触(图12)。DDB1和CUL4A都含有介导其它E3成份和辅助调节剂合成的蛋白质-蛋白质作用的多个模块区域。为了指导CUL4A-DDB1结合界面抑制剂的筛选，使用每一个结合对象的最少的结构域建立结合分析。另外，为了增强选择性，优化分析参数，最初的筛选将集中在DDB1BPB(之后为“DDB1(BPB)”)(SEQIDNO：8)和不包括CUL4A最N末端区域的N末端α-螺旋区域间(之后“CUL4A(NTD-N)”)(SEQIDNO：7)的结合位点。需要注意的是科林机器高度准确有序的合成E3复合物成份以至于该底物将直接指向E2结合酶来接受泛素。虽然CUL4A最N末端形成DDB1(BPB)第二结合位点，但是DDB1(BPB)和CUL4A的α-螺旋区域间的结合中断将会使被招募的底物定向变异，这已经由DDB1(BPB)的W561A变异证明了。其去除了结合并有效的去除了E3的活性，虽然第二结合位点是完整的。
图13显示了基于微珠的非放射性扩增荧光近均相分析的设计。该设计可以读出CUL4A(NTD-N)-DDB1(BPB)相互作用。该分析通常涉及设计用于与结合对象分别连接的供体珠和受体珠。激光激发后，“供体”珠中的光敏剂将周围的氧气转化为更强的激发单线态。单线态氧分子交叉扩散，从而与“受体”珠中的二甲基噻吩衍生物反应在370nm化学发光。因为发射光实际为更高的能量(更短的波长)，其进一步活跃同一珠中的荧光团。该荧光团之后在520-620nm发射光。这种层叠的化学反应仅仅在结合对象相互作用引发供体珠和受体珠间距离很接近时发生(～200nm)。如果二者对象间作用很弱或被抑制剂中断，供体珠产生的单线态会快速衰退至基态，因为他们遭遇受体珠的可能性更小。
为了使用ALPHASCREENTM系统(PerkinElmer)，使用与抗GST抗体连接的供体珠来捕获GST-CUL4A(NTD-N)，且FLAG标记连接的受体珠被用于固定FLAG-DDB1(BPB)。根据EnVisionTM多标记微孔板检测仪平台(PerkinElmer)的记录，CUL4A(NTD-N)与DDB1(BPB)的结合将会诱导供体珠向受体珠靠近，导致680nm激发时520nm产生冷光信号。使用384孔微板对GST-CUL4A(NTD-N)和FLAG-DDB1(BPB)的ALPHASCREENTM结合分析三次。引起信号强度超过50％抑制的化合物被确定为“选中”。
CUL4A(NTD-N)-DDB1(BPB)结合分析中检测的参数包括亲合力、结合特异性和载体(即DMSO)敏感性。
通过将定量的GST-CUL4A(NTD-N)(50nM为起始浓度)和浓度不断增加的FLAG-DDB1(BPB)复合物(2-200nM)混合，并在室温下培养2小时来确定CUL4A(NTD-N)和DDB1(BPB)间的亲合力。最终反应量为25μL，其中含有每种蛋白质各5μL和5μLALPHASCREENTM缓冲液。混合后，室温培养所述板，摇晃2小时，之后加入5μLALPHASCREENTMGST结合供体珠和5μLFLAG结合受体珠(20ng/mL)。读取前在室温下平衡该混合物1小时。每一个数据点都会进行三次。通过GraphPadPrism软件分析结合数据，并确定表观Kd。
为了证明CUL4A(NTD-N)-DDB1(BPB)结合的特异性，使用未标记的CUL4A(NTD-N)和DDB1(BPB)进行竞争分析。当未标记的CUL4A(NTD-N)或DDB1(BPB)的浓度增加抑制GST-CUL4A(NTD-N)和FLAG-DDB1(BPB)结合时，可以确定IC50。阴性对照为FLAG-DDB1(BPB-W561A)突变体，其能够结合CUL4A(Lietal.，Cell，124：105-17(2006))。
有效的HTS分析要求蛋白质目标在DMSO浓度很强时保持完全的生物活性，溶剂被用于溶解小分子文库。为了测试ALPHASCREENTM形式中GST-CUL4A(NTD-N)和FLAG-DDB1(BPB)对DMSO的敏感度，加入结合混合物中的DMSO的浓度(0-20％)逐渐增加从而确定保持有效作用的最高浓度。
这个为ALPHASCREENTM格式而进行的亲合纯化的重组CUL4A(NTD-N)与DDB1(BPB)间结合分析着重于用于分析的主要蛋白质-蛋白质界面。该方法会降低发现影响全长的CUL4A或DDB1其它变构结合位点的可能性。该DDB1可以改变三级结构，导致DDB1-CUL4A结合的有效分离。因此，另一方法采用了全长CUL4A(如SEQIDNO：1)和DDB1(如SEQIDNO：3)作为在ALPHASCREENTM分析形式中的结合对象，使用全长DDB1和N末端FLAG标记的全长CUL4A(通过CUL4A和Rbx1共表达制备和pGEX-4T-1衍生的双顺反子pCool载体来提高表达和CUL4A的折叠/溶解性(Lietal.，Cell，124：105-17(2006)))。在另一个方法中，CUL4A片段(如SEQIDNO：5orSEQIDNO：6)和DDB1或DDB1(BPB)在ALPHASCREENTM分析中作为结合对象使用。该分析可以识别额外的，改变E3连接酶活性必需的DDB1-CUL4A准确合成的选中。
实施例7
该假想实施例描述了定量HTS分析，用于识别中断DDB1-CUL4A相互作用和泛素连接酶活性的小分子。
由于DDB1(BPB-W561A)中单点突变就足以中断DDB1-CUL4A结合(Lietal.，Cell，124：105-17(2006))，所以，以DDB1-CUL4A界面关键点或诱导变构性构造变化的次级位点(secondarysite)为目标的小分子才有可能有效瓦解DDB1-CUL4A作用模块且消除泛素连接酶的功能。
通过实施例6所述的分析方法对文库化合物进行大量的高通量筛选从而识别能够中断DDB1(BPB)-CUL4A(NTD-N)作用的化合物。结合反应中的每一个成份均被滴定，从而使每一个成份的最终浓度都接近线性反应范围的顶端值。结合对象最佳的加入顺序可以根据以下内容确定。首先，将GST-CUL4A(NTD-N)与化合物培养，之后在记录结果前加入FLAG-DDB1(BPB)。筛选是在配备有四分体吸液管(quadrantpipetting)和板堆积单元(platestackerunit)(Beckman)的BiomekFX液体处理工作站上进行的。DDB1(BPB)-CUL4A(NTD-N)ALPHASCREENTM分析是在384孔微板上进行的。每个板都带有352特殊化合物。柱子1和柱子24含有阳性对照(GST-CUL4A(NTD-N)和FLAG-DDB1(BPB))和阴性对照(GST-CUL4A(NTD-N)和FLAG-DDB1(BPB-W561A))。化合物在最佳的DMSO浓度中稀释并以1μL试样量分至板孔中。这使化合物在10μL结合反应中的最终浓度为10mM，其在GST-CUL4A(NTD-N)和FLAG-DDB1(BPB)处于结合分析最佳浓度和加入次序时加入。加入供体珠和受体珠并培养1小时，使用ENVISIONTM多板读取器(PerkinElmer)读取ALPHASCREENTM信号。每一块板的阳性和阴性对照孔的Z’得分必须都是0.5或更大(Zhangetal.，J.Biomol.Screen，4：67-73(1999))。在使用ActivityBase软件包(IDBSsoftware，Emeryville，CA)分析数据时自动计算每一块板的Z’因素(用于质量分析)。在两次独立试验中，引起发光信号降低50％的化合物被分类为选中并由之后二级筛选确定。
进行多次二级筛选和确定性分析从而去除错误的阳性和非特异性抑制物。去除之前所示的在多个分析中找到多个目标的斯隆凯特林HTS核心数据库记录的被确定为“非特异性”的化合物。使用一系列2倍HTS形式的化合物稀释物和选中化合物检测选中的IC50可以追击到那些仅展现剂量依赖性抑制的化合物。选中被分为结构相关的化合物组用于识别这些选中和“非选中”(即无抑制)共同的架构并用来自化学文库数据库的相关结构检查结构活性关系(SAR)。SAR分析起过滤作用，用于确定选中，并确定这些抑制剂的核心结构特征。抑制的可逆性通过分离蛋白质复合物和测试化合物的混合物确定。如果抑制是可逆的，其去除抑制剂并恢复信号至对照水平(controllevel)。通过传统的DDB1体外泛素化分析进一步测试选中化合物抑制的真实性。另外，带有和不带有选中化合物的降低分析(pull-downassays)作为一个独立的分析进行从而确定DDB1(BPB)-CUL4A(NTD-N)作用的波动。满足所有设定标准的击中化合物将被进一步追踪。任何不可逆性抑制DDB1(BPB)-CUL4A(NTD-N)结合的具体的化合物可以被进一步追踪，因为使用最长的抗细菌和抗癌药物属于这一类(青霉素和5-FU)。
第二轮筛选出的具有有效IC50值的化合物将被选择测试其是否干扰DDB1-CUL4A泛素连接酶活性和体内NER活性。在测试选中化合物体内活性之前，所有候选化合物的细胞渗透性将通过平行人工膜渗透能力分析(PAMPA)确定。其使用脂填充膜确定潜在药物化合物的被动的，跨细胞的渗透性质(Kansyetal.，J.Med.Chem.，41：1007-10(1998))。PAMPA分析(微孔)相对简单，便宜且直接，却可以产生相比传统细胞分析，如使用Caco-2细胞分析的结果(Kansyetal.，J.Med.Chem.，41：1007-10(1998))。细胞渗透性好的化合物将在之后在细胞系中检测。皮肤渗透性差的有效的领先化合物(potentleads)可以通过修饰变得更具有亲脂性从而提高膜渗透性，同时注意避免影响溶解度。
建立原代Cul4Afl/fl和DDB1fl/flMEF细胞(Cangetal.，Cell，127：929-40(2006))和人类HCT116克隆癌细胞作为模型细胞系来测试抑制剂对DDB2降解的影响并检测对NER活性的影响。用测试化合物或载体处理细胞4小时，之后收获并溶解用于DDB2、DDB1、CUL4A和β-肌动蛋白(对照)抗体的免疫印迹。通过上述实施例3所述的ELISA分析进一步评估选择性提高DDB2表达量的化合物修复UV诱导的CPDs和6，4-PPs的能力。作为对化合物特异性的控制，原代Cul4Afl/fl和DDB1fl/flMEF细胞将被重组腺病毒表达的Cre重组酶感染，从而在加入选中化合物前去除内生的Cul4a或DDB1，进而确定抑制作用是否真正依赖DDB1-CUL4A泛素连接酶。带有针对人类CUL4A或DDB1的shRNAs的重组慢病毒也可以用于评估化合物在人类HCT116细胞中的特异性。
根据本实施例所述的方法，领导型小分子抑制剂可以与CUL4A或DDB1共结晶，从而确定抑制的分子基础，并在上述UV皮肤癌小鼠模型系统中测试，进而评估其在防治皮肤癌生成中的效力，并进一步开发这些合成抑制剂作为预防和治疗人类恶性肿瘤的抗癌药物。
实施例8
该假想实施例展示了识别调节(如抑制)CUL4A泛素连接酶活性的物质的创造性方法的另一实施例，其中，该方法适于识别肽抑制剂。
与DDB1(BPB)或CUL4A(NTD-N)作用的肽抑制剂可以通过图14所示方案对噬菌体展示文库进行筛选来识别。简单地说，将FLAG-DDB1(BPB)或GST-CUL4A(NTD-N)固定在FLAG或GST抗体涂层的96孔ELISA板上，并在每个孔中用10μL噬菌文库培养。在大量洗涤后，连接的噬菌体会被胰蛋白酶化的或低pH甘氨酸洗涤缓冲液洗涤，并在E.coli中感染从而扩增、排序和第二轮和第三轮筛选(panning)富集获得强亲合力的肽。选择的肽是通过肽合成器(蛋白质技术有限公司)合成的，用HPLC纯化并通过实施例6和7所述的CUL4A(NTD-N)-DDB1(BPB)ALPHASCREENTM分析评价其在阻碍(blocking)结合界面和抑制体外DDB1泛素化上的效力。展示对结合或E3连接酶活性至少50％的抑制的肽，针对DDB2泛素化和降解的抑制以及增强对抗UV诱导DNA的CPDs或者6，4-PPs的NER活性，在Cul4Afl/fl和DDB1fl/flMEF细胞或人类HCT116细胞中对其进行体外评价。为了提高膜渗透性，合成肽可以与HIV-TAT膜转换信号序列连接(Nagaharaetal.，Nat.Med.，4：1449-52(1998))。识别出的肽抑制剂对抗细胞肽酶的稳定性可以通过使用逆向-inverso肽技术和与母体肽聚集顺序相反的D-氨基酸合成优化的肽来提高。这种逆向-inverso肽位于其侧链的，方向与原结构相似，但是对体内肽酶剪切有抵抗性(Angersetal.，Nature，443：590-3(2006)；VanRegenmortelandMuller，Curr.Opin.Biotechnol.，9：377-82(1998))。
噬菌体展示肽文库的例子包括但不限于CX10C/p8+8文库，NNS20/p8+8文库和基于knottin结构支架的文库。其如表1所示。
名称 CX10C-1 CX10C-2 NNS20-1 NNS20-2 Knottin-1 Knottin-2
载体 pC89s pC89s pC89s pC89s pC89s pC89s
类型 p8+8 p8+8 p8+8 p8+8 p8+8 p8+8
显示形式 环状 环状 线型 线型 已有结构 已有结构
复制/病毒体 ～200 ～200 ～200 ～200 ～200 ～200
差异 5.4x108 1.9x109 8.8x108 7.04x108 1x108 0.5x109
滴定(cfu/ml) 1.35x1013 4.05x1013 1x1014 1x1014 3.4x1012 1x1012
两个CX10C/p8+8噬菌体展示肽文库包含了2.44x109受约束的半胱氨酸，10个氨基酸长度的序列。两个NNS20/p8+8文库含有1.58x109线性20个氨基酸长度的序列。除了以环状或线性形式存在的肽，也可以有已确定的蛋白质构架中展示的肽。相应的，也可以筛选基于knottin结构支架的噬菌体展示文库。Knottins是功能不同但结构相关的蛋白质，长度通常少于40个残基。所有的Knottins具有相同的结构支架，其包括小三链反平行页和二硫键框架。
所有本申请引用的参考文献包括出版物，专利申请和专利作为参考并入，并与每一篇参考文献单独，明确表示作为参考并入所表示程度相同且载于本申请规定的全部。
在描述本发明内容中使用的术语“一”和“这”及类似指示应该理解为既包括单数也包括多数，特别对于以下权利要求所述内容，除非在本申请中明确表示其它意义或者与内容明显矛盾的。术语“包括”，“具有”和“含有”应当理解为开放性术语(即表示“包括但不限于”)，除非另有说明。本申请所述的值的范围仅仅作为单独表示落于该范围内每一个单独的值的速记方法，就如在本申请中单独引用一样。本申请描述的所有方法可以以任何合适的顺序实施除非在本申请中有另外说明或者与内容明显矛盾。本申请任何及全部实施例或举例性语句(如“比如”)仅为了对本发明做更好的说明，并不是限制本发明的范围，除非另有声明。说明书中的语句不应理解为指出任何未在权力要求书中要求元素作为实施本发明所必需的。
本申请所述的本发明优选实施例包括发明人所知的本发明的最好实施方式。对于阅读了上述内容的本领域普通技术人员，优选实施例的变化是显而易见的。发明人预料熟练的技术人员会采用该适当变化，且发明人并非意指本发明完全根据本申请具体方式实施。相应的，本发明包括法律允许的本申请权利要求所述主题的所有改变和等同物。另外，上述元素的任何可能变化的组合都在本发明范围内除非本申请另有说明或者与内容明显矛盾。

Claims (17)

1.一种干扰CUL4A与损伤DNA结合蛋白1(DDB1)结合的物质，其中所述物质是SEQIDNO:7所示多肽或者SEQIDNO:18所示多肽。
2.如权利要求1所述物质，其中，所述物质竞争性抑制内生CUL4A与DDB1的结合。
3.含有权利要求1所述物质和其载体的组合物。
4.如权利要求3所述组合物，其中，所述载体是可药用或可用于化妆品的载体。
5.如权利要求4所述组合物，其中，所述可用于化妆品的载体进一步包括选自由下列组成的组群的光防护量的防晒化合物：磺异苯酮，二羟苯宗，氨基苯甲酸甲酯，4-氨基苯甲酸(PABA)，戊基二甲基PABA，辛基二甲基PABA，丙三基PABA，对-甲氧基肉桂酸-2-乙氧基乙酯，二乙醇氨对-甲氧基肉桂酸酯，对-甲氧基肉桂酸乙基己酯，二没食子酰三油酸酯，4-二(羟基丙基)氨基苯甲酸乙酯，2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸-2-乙基己酯，水杨酸-2-乙基己酯，原膜散酯，三乙醇胺水杨酸盐，2-苯基并咪唑-5-磺酸，红矿脂，二氧化钛，氧化锌及其组合物。
6.干扰CUL4A与损伤DNA结合蛋白1(DDB1)结合的物质用于制备预防或治疗动物体内DNA损伤相关状态的药物中的应用，其中，所述物质选自下组：SEQIDNO:7所示多肽，SEQIDNO:18所示多肽，所述药物对动物给药从而预防或治疗动物体内DNA损伤相关状态。
7.如权利要求6所述的用途，其中，所述动物受到化疗制剂的处理。
8.如权利要求7所述的用途，其中，所述化疗制剂选自由以下制剂组成的组群：抗微管剂，抗代谢剂，抗有丝分裂剂，DNA损伤剂，促凋亡剂，诱导分化剂，抗生素和荷尔蒙。
9.如权利要求6所述的用途，其中，DNA损伤相关状态选自由下列组成的组群：衰老，长时间暴露在紫外照射下，暴露在化学致癌物下，癌症，着色性干皮病，科凯恩氏综合症，毛细血管扩张共济失调症。
10.如权利要求7所述的用途，其中，所述DNA损伤相关状态为癌症，且所述癌症选自由以下癌症组成的组群：皮肤癌，肺癌，喉癌和肝癌。
11.如权利要求6所述的用途，其中，所述药物是通过口服给药，鼻内给药，肠胃外给药，肠道给药，直肠给药或眼部给药。
12.如权利要求6所述的用途，其中，所述药物是通过局部给药。
13.如权利要求6所述的用途，其中，所述药物是防晒组合物。
14.如权利要求13所述的用途，其中，所述防晒组合物包括：
(a)干扰CUL4A活性的物质，
(b)选自由以下物质组成的组群的光防护量的防晒化合物：磺异苯酮，二羟苯宗，氨基苯甲酸甲酯，4-氨基苯甲酸(PABA)，戊基二甲基PABA，辛基二甲基PABA，丙三基PABA，对-甲氧基肉桂酸-2-乙氧基乙酯，二乙醇氨对-甲氧基肉桂酸酯，对-甲氧基肉桂酸乙基己酯，二没食子酰三油酸酯，4-二(羟基丙基)氨基苯甲酸乙酯，2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸-2-乙基己酯，水杨酸-2-乙基己酯，原膜散酯，三乙醇胺水杨酸盐，2-苯基并咪唑-5-磺酸，红矿脂，二氧化钛，氧化锌及其组合物，和
(c)可用于化妆品的载体。
15.如权利要求6所述的用途，其中，所述物质是在动物暴露在紫外照射前，照射时或照射后给药的。
16.如权利要求6所述的用途，其中，所述动物是哺乳动物。
17.如权利要求16所述的用途，其中，所述哺乳动物是人。
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