JP6247355B2 - 哺乳類における遺伝子発現のRNAiによる阻害に関する方法および組成物 - Google Patents
哺乳類における遺伝子発現のRNAiによる阻害に関する方法および組成物 Download PDFInfo
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
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Description
米国法第35章119(e)項に従って、本出願は、その開示が参照として本明細書に組み入れられる、2001年7月23日に提出された米国特許仮出願第60/307,411号および2002年2月27日に提出された米国特許仮出願第60/360,664号の提出日に対する優先権を主張する。
本発明の分野はRNAiである。
二本鎖RNAは、RNA干渉(RNAi)または転写後遺伝子沈黙化(PTGS)と呼ばれるプロセスを通して強力かつ特異的な遺伝子沈黙化を誘導する。RNAiは、沈黙化誘因物質と相同なメッセンジャーRNAを破壊する配列特異的多成分ヌクレアーゼであるRNA誘導沈黙化複合体(RISC)によって媒介される。RISCは、二本鎖RNA誘因物質に由来する短いRNA(約22ヌクレオチド)を含むことが知られている。
国際公開公報第01/68836号(特許文献1)。同様に、Bernsteinら、RNA(2001)7:1509〜1521(非特許文献1);Bernsteinら、Nature (2001)409:363〜366(非特許文献2);Billyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2001)98:14428〜33(非特許文献3);Caplanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2001)98:9742〜7(非特許文献4);Carthewら、Curr. Opin. Cell Biol.(2001)13:244〜8(非特許文献5);Elbashirら、Nature(2001)411:494〜498(非特許文献6);Hammondら、Science(2001)293:1146〜50(非特許文献7);Hammondら、Nat. Ref. Genet.(2001)2:110〜119(非特許文献8);Hammondら、Nature(2000)404:293〜296(非特許文献9);McCaffrreyら、Nature(2002)418:38〜39(非特許文献10);およびMaCaffreyら、Mol. Ther.(2002)5:676〜684(非特許文献11);Paddisonら、Genes Dev.(2002)16:948〜958(非特許文献12);Paddisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2002)99:1443〜48(非特許文献13);Suiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2002)99:5515〜20(非特許文献14)も参照されたい。
便宜上、明細書、実施例、および添付の請求の範囲において用いる特定の用語をここに集める。
哺乳類においてコード配列の発現を調節する(例えば減少させる)方法および組成物を提供する。本発明の方法において、RNAi物質、例えば干渉リボ核酸(siRNAまたはshRNAのような)またはその転写鋳型、例えばshRNAをコードするDNAの有効量を胚以外の哺乳類に、例えば流体力学プロトコールによって投与する。同様に、本発明の方法において用いられるRNAi物質薬学的調製物も提供される。本発明の方法および組成物は、学術的および治療的応用を含む、多様な異なる応用における用途を見出す。
先に要約したように、本発明は、胚以外の哺乳類においてRNAiを行う方法を提供する。本発明のこの局面をさらに記述するために、胚以外の哺乳類におけるRNAiの本方法を最初により詳細に説明してから、本発明が用いられる様々な代表的な応用のみならず、本発明の実践において用いられるキットについて論評する。
上記のように、本発明の一つの局面は、胚以外の哺乳類宿主において標的遺伝子または複数の遺伝子の発現を調節するためにRNAiを用いる方法を提供する。多くの態様において、本発明は、胚以外の哺乳類宿主生物において一つまたは複数の標的遺伝子の発現を減少させる方法を提供する。発現を減少させるとは、標的遺伝子またはコード配列の発現レベルが、対照と比較して少なくとも約2倍、通常少なくとも約5倍、例えば10倍、15倍、20倍、50倍、100倍またはそれ以上減少するかまたは阻害されることを意味する。特定の態様において、標的遺伝子の発現は、標的遺伝子/コード配列の発現が有効に阻害される程度に減少する。標的遺伝子の発現を調節することは、コード配列、例えばゲノムDNA、mRNA等のポリペプチド、例えばタンパク質産物への転写/翻訳を変化させる、例えば減少させることを意味する。
本発明の方法は、多様な異なる応用において用いられ、代表的な応用には学術的/研究応用および治療応用の双方が含まれる。これらのタイプの代表的な応用のそれぞれを下記により詳しく説明する。
本発明の方法は、例えば哺乳類宿主における標的遺伝子/コード配列の機能を決定するために、哺乳類宿主において一つまたは複数の標的遺伝子(コード配列)の発現を調節することが望まれる多様な異なるタイプの学術的、研究応用における用途を見出す。本発明の方法は、哺乳類宿主において一つまたは複数の標的遺伝子/コード配列の発現を低下、減少、または阻害するために本発明の方法を用いる、「機能喪失」型のアッセイ法において特別な用途を見出す。
本発明の方法はまた、例えば哺乳類全体またはその一部、例えば組織、臓器等において一つまたは複数の標的遺伝子を調節することが望まれる多様な治療応用における用途を見出す。そのような方法において、RNAi活性物質の有効量を宿主哺乳類に投与する。有効量とは、標的遺伝子(複数)の発現を望ましく調節するために十分な用量を意味する。上記のように、このタイプの応用の多くの態様において、本発明の方法は、所望の治療転帰を得るために、宿主において一つまたは複数の標的遺伝子の発現を減少/阻害するために用いられる。
);腫瘍抑制遺伝子(例えば、APC、BRCA1、BRCA2、MADH4、MCC、NF1、NF2、RB1、TP53、およびWTI);ならびに酵素(例えば、ACCシンターゼおよびオキシダーゼ、ACPデサチュラーゼおよびヒドロキシラーゼ、ADP-グルコースピロホスホリラーゼ、ATPアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、およびアミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、カルコンシンターゼ、キチナーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、DNAおよびRNAポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、顆粒結合デンプンシンターゼ、GTPアーゼ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、インテグラーゼ、イヌリナーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、UPアーゼ、リポキシゲナーゼ、ライソザイム、ノパリンシンターゼ、オクトピンシンターゼ、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、フィターゼ、植物生長調節シンターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテナーゼ、およびペプチダーゼ、プラナーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、RUBISCO、トポイソメラーゼ、およびキシラナーゼ);ケモカイン(例えば、CXCR4、CCR5)、テロメラーゼのRNA成分、血管内皮増殖因子(VEGF)、VEGF受容体、腫瘍壊死因子、核因子κB、転写因子、細胞接着分子、インスリン様増殖因子、形質転換成長因子βファミリーメンバー、細胞表面受容体、RNA結合タンパク質(例えば、小さい核小体RNA、RNA輸送因子、翻訳因子、テロメラーゼ逆転写酵素)等。
上記の方法の一つまたは複数を実践するための試薬およびそのキットも同様に提供される。本発明の試薬およびそのキットは、大きく変化してもよい。典型的に、キットは少なくとも上記のようにRNAi物質を含む。
本発明によって、裸の核酸、例えばリボ核酸、デオキシリボ核酸、または化学改変された核酸(モルフォリノ、ペプチド核酸、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、または2'-Oメチルオリゴヌクレオチドを含むがこれらに限定されない)を脈管を有する(vascularized)生物、例えば哺乳類の標的細胞にインビボで導入するための方法および組成物が提供される。本発明のこれらの方法は、便宜上「流体力学」法と呼ぶ。
先に要約したように、本発明の方法は脈管を有する多細胞生物に存在する標的細胞に、核酸、例えばリボ核酸をインビボで導入する方法を提供する。インビボ導入とは、本発明において、核酸が導入される標的細胞が、多細胞生物に存在する細胞であること、すなわち多細胞生物から分離された、例えば除去された細胞ではないことを意味する。そのため、本発明の方法は、細胞が由来する多細胞生物から分離された、例えば培養された細胞または複数の細胞に核酸が導入される、インビトロ核酸移入プロトコールとは異なる。言い換えれば、本発明の方法はインビトロ核酸移入法ではない。
本発明の方法は、標的細胞への裸の核酸の効率的なインビボ移入が望まれる、多様な異なる応用における用途を見出す。本発明の方法が用いられる応用には、治療的および研究応用の双方が含まれる。関心対象の治療応用には、遺伝子治療応用、ワクチン接種応用等が含まれる。関心対象の研究応用には、特定の病態、例えばRNAウイルス感染症の動物モデルの作製、遺伝子機能を解明するために表現型に関する遺伝子発現を観察すること等が含まれる。本発明の方法が用いられる他の応用には、アンチセンス、リボザイムおよびキメラ形成(chimeraplasty)(すなわち、RNA/DNAキメラによる遺伝子の修復)(例えば、Yoonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1996)93(5):2071〜6;Cole-Straussら、Science(1996)273(5280):1386〜9;およびZhuら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1999)96(15):8768〜73を参照されたい)治療法のみならず、干渉RNA(細胞に存在することにより類似のRNAの翻訳を防止するRNA)(例えば、Wiannyら、Nat. Cell Biol.(2000)2(2):70〜5;およびSiQunら、Nature(1998)391:806〜811を参照されたい)治療法の開発が含まれる。
標的細胞、例えば肝細胞にインビボで核酸を輸送する本発明の方法を実践するために用いられるキットも、本発明によって提供される。本発明のキットには一般的に、標的細胞に導入されることが望まれる裸の核酸およびRNアーゼ阻害剤とが含まれる。本発明のキットはさらに、水性輸送媒体、例えば緩衝生理食塩液等をさらに含んでもよい。さらに、キットは上記のような競合RNAを含んでもよい。本発明のキットにおいて、上記の成分は宿主に輸送するために単一の水性組成物に配合してもよく、または異なるもしくは個別の組成物として、例えば異なる容器において個別であってもよい。選択的に、キットは、宿主に水性組成物を輸送するための血管内輸送手段、例えばシリンジ等をさらに含んでもよく、輸送手段は水性組成物を予め充填してもしなくてもよい。レポーター遺伝子がインビボでDNAから転写される場合、RNアーゼ阻害剤および競合RNAは必要でない。
1.哺乳類におけるRNAi
A.本発明者らは、ルシフェラーゼmRNAを発現するプラスミド(pCMVGL3)2 μgを、以下の処方に沿って、PBS 1.8 ml、RNasin 1200単位、および競合RNA 40 μgと共に混合して同時輸送した:
1)(1群、RNAなし)無処置対照としてPBS 1.8 ml;
2)(2群、アンチセンスRNA):配列
(デオキシチミジレート残基をdTで示し、残りのヌクレオチドはリボヌクレオチドである)を有するアンチセンス方向の21量体RNA/DNAキメラ20 μgと混合したPBS 1.8 ml;または
3)(3群、RNAi)配列
を有するそのセンス相補鎖20 μgにアニーリングした上記のアンチセンス21量体20 μgと混合したPBS 1.8 ml。
本発明者らは、裸のRNAの効率的な輸送を行うために、既存の流体力学トランスフェクション法(J. Chang、L.J. Sigal、A. Lerro、J. Taylor、J. Virol. 75:3469〜73(2001))を改変した。ホタルのルシフェラーゼに由来するsiRNAまたは無関係なsiRNAのいずれかを、ルシフェラーゼ発現プラスミド(図1に構築物の説明)と共に同時注射した。ルシフェラーゼ発現を、生きている動物において、ルシフェラーゼ基質(4)の注射後の定量的全身造影を用いてモニターしたところ、注射したレポータープラスミドの量およびトランスフェクション後の時間に依存的であった(データは示していない)。代表的な動物を図2Aに示す。これらの結果の定量を図2Bに示す。
ホタルのルシフェラーゼまたはウミシイタケのルシフェラーゼを標的とする短いヘアピンRNA(shRNA)を、T7ポリメラーゼインビトロランオフ(runoff)転写によって合成した。これらのインビトロで転写されたRNAをpGL3-対照DNAと共に同時トランスフェクトすると、培養におけるホタルのルシフェラーゼ発現が減少した(Paddisonら、Genes Dev. 16(8):948〜58(2002))。これらのヘアピンRNAがマウスにおいて機能的であるか否かを試験するために、本発明者らは、インビトロで転写されたルシフェラーゼshRNA(または対照としてウミシイタケのshRNA)40 μg、pGL3-対照DNA 2 μg、pThAAT 2 μg、RNasin 800単位およびPBS 1.8 mlをマウスに流体力学的にトランスフェクトした。ホタルのルシフェラーゼshRNAを投与した72時間後にマウスから放出された光は、無処置対照と比較して平均で95%(±1.4%)減少した。ウミシイタケのshRNAを投与したマウスから放出された光はごくわずかに減少したに過ぎなかった。意外にも、T7転写鋳型DNAとT7タンパク質を発現するプラスミドとの同時トランスフェクションによって、培養またはマウスにおけるルシフェラーゼレポーター活性の如何なる減少も起こらなかった(データは示していない)。
上記のデータは、成体マウスにおける遺伝子発現を下方調節できることを証明している。
A.緒言
特に明記していない限り、全ての実験において、RNAおよびDNAをRNasinの表記の量に加えて、PBSの最終容積を1.4〜1.8 mlとした。この溶液をマウスの尾静脈に4〜5秒間注射した。これらの実験において用いたRNAは全て、mMessage Machineキットを用いて合成して、RNeasyキット(いずれもキアゲン社(Qiagen Inc.)製)を用いて精製した。しかし、RNAを精製する必要はなく、同様に役立つはずである他の精製法が存在する。本明細書に一覧で示した全ての実験において用いたRNasinは、特に明記していなければヒト胎盤から精製した天然のRNasin(プロメガ社(Promega Inc.)から購入)であった。ルシフェラーゼ試料に関しては、表記の時間において、マウスにルシフェリン(1.5 μg/g体重)を腹腔内投与して、マウスから放出された光を測定した。バックグラウンドは〜2×102相対光単位である。ヒト第IX因子試料は酵素結合免疫アッセイ法を用いて分析した。
ルシフェラーゼタンパク質をコードするRNAを以下と共に、生きているマウスに注射した:
1)RNアーゼ阻害剤なし;または
2)RNアーゼ阻害剤(RNasinと呼ぶ)。
・注射したRNAは生きているマウスの肝臓にトランスフェクトされた。
・ポリA尾部(ポリA RNA)を有するキャップ化ポリアデニル化RNAは、キャップ化されたポリアデニル化RNAが強いルシフェラーゼシグナルを生じることから、マウス肝臓において翻訳されている。
・ポリAシグナルを有するキャップ化RNA(ポリAシグナルRNA)は、マウス肝臓において翻訳されるが、シグナルはポリA尾部を有するRNAについて認められたシグナルより約100倍低い。
本明細書において記述された全ての実験において用いたRNAは、DNAプラスミドの細菌プロモーターから転写された。このプロモーターは、哺乳類細胞において効率的に機能しないはずである。DNA鋳型はDNアーゼを用いて転写後に除去したが、認められたシグナルがDNAの混入の結果となりうる懸念が常にある。これを制御するために、転写において用いた物と同等の鋳型DNAの量を注射した。シグナルがDNAの混入によるものであれば、この試料はシグナルを生じるはずである。しかし、DNA対照からはシグナルが認められない。
ルシフェラーゼタンパク質をコードするRNAを、1)高用量もしくは低用量の天然もしくは組み換え型RNasinと共に、または2)RNAを破壊してシグナルを消失させるはずであるRNアーゼT1の処置(陰性対照)後に、生きているマウスに注射した。RNA試料は全て、注射されたRNAの全量が80 μgとなるように非キャップ化非ポリアデニル化競合RNAを含んだ。原核細胞プロモーターの制御下でルシフェラーゼタンパク質を発現する対照DNAも同様に、表記の対照反応において注射した。3時間および6時間目に、マウスにルシフェリンの腹腔内注射を行い、マウスから放出された光を測定した。この実験は主に、第一の実験の結果を確認するためであり、どのパラメータが重要であるかを試験するためのものである。6時間の時点で、RNAを注射したマウス1匹を屠殺して、臓器を摘出し、どの臓器がルシフェラーゼを発現するかを調べた。
・RNasinの用量を増加させるとルシフェラーゼ活性レベルが増加することから、RNasinの投与は認められる発現レベルを変化させる。
・天然および組み換え型RNasinはいずれもRNAを保護する。
・RNAがRNアーゼによって破壊されるとシグナルは消失し、RNAがシグナルに関与していることを示す(陰性対照)。
・転写に用いたものと同等の鋳型DNAの量をDNアーゼ処置を行わずに注射すると、シグナルを認めず、シグナルはDNA混入によるものではないことを証明する。
・肝臓が唯一のルシフェラーゼ発現部位である。
キャップ化されかつポリアデニル化されたルシフェラーゼRNA 20 μgのルシフェラーゼ活性を測定した。四つの条件を実験1および2に記載の条件と類似の実験において調べた。
1)RNasin 400単位+競合RNA;
2)競合RNAを含まないRNasin 40単位;
3)競合RNAを含まないRNasin 800単位;
4)競合RNAを含まないRNasin 1200単位。
3時間、6時間および9時間に、マウスにルシフェリンの腹腔内注射を行い、マウスから放出された光を測定した。
・RNasinの用量を増加するとルシフェラーゼ活性が増加したことから、RNasinはルシフェラーゼ活性を変化させる。最高用量(RNasin 1200単位)は調べた全ての時間において最高の活性を示した。
・競合RNAの存在によってルシフェラーゼ活性が増強されたことから、競合RNAを添加すると測定されたルシフェラーゼ活性が増強した。この作用は、RNasinの保護作用と相乗的であった。
真核細胞において、RNAのタンパク質への翻訳は、キャップ依存的およびキャップ非依存的翻訳と呼ばれる二つの異なる機構によって起こる。キャップ非依存的翻訳は、内部リボソーム進入部位(IRES)と呼ばれる5'非翻訳領域を必要とする。C型肝炎ウイルス(HCV)、ポリオウイルスおよびA型肝炎ウイルスのようないくつかのRNAウイルスは、キャップ非依存的翻訳を行うためにIRES配列を利用する。本発明者らは当初、抗HCV治療を研究するための小動物モデル系を作製するために用いることができるであろうと考えて、本明細書に記述したRNAトランスフェクション法を開発した。IRES RNAのトランスフェクションも同様に、効率的なIRES機能にとって必要な配列要素を調べるために設計された変異誘発試験のために用いることができるであろう。
RNA HCVlucは、5'末端にHCV IRES、およびルシフェラーゼ遺伝子の後にポリA尾部を有する。HCVluc 40 μg+競合RNA 40 μg+RNasin 20 μlをマウスの尾静脈に注射した。3時間および6時間後、マウスにルシフェリンを腹腔内注射して、マウスから放出される光を測定した。結果:HCV IRESは、注射したHCVルシフェラーゼRNA融合体の翻訳を促進することができた。結果の定量を表4に要約する。
ヒト第IXタンパク質は、血友病の患者では産生されない血液凝固タンパク質である。血清中のこのタンパク質レベルは、酵素結合イムノアッセイ(ELISA)によって容易に測定することができる。本発明者らは、二つの理由からこのタンパク質を発現させることを選択した:
1)hFIXは治療関連タンパク質である。hFIXの一過性の発現は臨床的に重要ではないが、慢性的な発現を必要としない他のいくつかのタイプの治療タンパク質を一過性に発現させることが望ましいであろう。
2)hFIXはヒトタンパク質であり、したがってマウスにおいて免疫応答を誘発することができる。
キャップ化され、かつポリアデニル化されたhFIX RNA 40 μg+競合RNA 40 μg+RNasin 800単位をマウス1匹の尾静脈に注射した。結果:40 ng/ml血清がELISAによって6時間目に検出された。この量のhFIXは、ELISAアッセイ法の有意な範囲内である。
1群6匹のマウス2群に以下を注射した:
1)90 FL HCVと呼ばれる(何らかの非キャップ化RNAを同様に含む)キャップ化HCVの完全長ゲノムRNA 50 μg+キャップ化されかつポリアデニル化されたhFIX RNA 40 μg+RNasin 400単位;または
2)触媒的に不活性にするレプリカーゼ遺伝子に変異を有する完全長の非感染性HCVゲノムRNA(101 FL HCVと呼ばれる)+キャップ化およびポリアデニル化hFIX RNA 40 μg+RNasin 400単位。
HCVのIRESを標的とするDNAザイムは化学合成されている。本発明者らはこれらのリボザイムを流体力学的にマウスに注射して、それらが肝臓において注射したHCV RNAレベルを減少させることができるか否かを評価した。IRESを標的とするDNAザイム5 nmolを、HCV IRESの後にホタルのルシフェラーゼコード配列、その後にアデノシン30個が続く配列からなるRNA 20 μgと同時注射した。DNAザイムの配列は、
であった。標的RNAと共にDNAザイムを投与したマウスは、6時間で標的RNAのみを投与したマウスより95%少ない光を放出した。結論:本発明者らは、このDNAザイムがHCV IRESからの翻訳を、おそらくIRES RNA配列を切断することによって、阻害しうることを証明した。合成リボザイムを同様に類似の方法論を用いて試験したところ、無効であることが判明した。
A=A0 exp(-kt) (等式1)
1群6匹のマウス4群に、キャップ化したポリアデニル化ルシフェラーゼRNA 20 μg+非キャップ化競合RNA 60 μg+RNasin 800単位を注射した。3時間、6時間、9時間または24時間で、マウスにルシフェリンを腹腔内投与(1.5μg/g体重)してマウスから放出された光を測定した。
を有する。次に混合物に緩衝液1.8 mlを加えて、本発明者らのこれまでの出願に記述されるようにマウスの尾静脈に高圧下で注射する。対照として、阻害剤を含まない混合物を他のマウスに注射する。阻害剤の存在下では、放出光は90%以上減少する。本発明者らは、この知見から、注射したRNAの翻訳または注射したDNAから産生されたRNAの翻訳が、アンチセンス機構によって阻害剤によって阻害されると結論する。RNAを注射した場合、細胞におけるRNAの安定性が限られているために、本発明者らはこの阻害を約24時間追跡できたに過ぎなかった。DNAを注射した場合、本発明者らは、翻訳を約8日間モニターすることができる。翻訳の阻害は、本発明者らがこの系において翻訳を測定することができる全ての期間持続した。
実験A
対照群:HCV IRESおよびルシフェラーゼレポーター配列を含むRNAをマウスに注射し、それらは、このRNAがルシフェラーゼタンパク質に翻訳されると発光する。
標的RNAをコードするDNAを阻害剤と共に注射したことを除いては実験Aと同じ。DNAはマウス肝細胞の核に移動して、転写されて標的RNAを生じる。このRNAは細胞の細胞質に移動してそこで阻害剤と相互作用する。
Claims (14)
- 以下を含む、胚以外の哺乳類の標的細胞において、インビボで、コード配列の発現を減少させる方法を実践する際に使用するためのキット:
(a)胚以外の哺乳類への非経口投与のために薬学的に許容される輸送媒体において、標的細胞中のコード配列に特異的である小さい干渉リボ核酸(siRNA)を含む薬学的調製物であって、該siRNAはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、長さが19-30塩基対の二本鎖構造を形成するようにアニーリングしている、
前記薬学的調製物;および
(b)前記方法を実践するための説明書。 - 脈管を有する胚以外の哺乳類の標的細胞において、インビボで、コード配列の発現を減少させるための薬学的組成物の製造における、核酸の使用であって、
該核酸が、
(i) 標的細胞中のコード配列に特異的で、
(ii)センス鎖とアンチセンス鎖を含み、長さが19-30塩基対の二本鎖構造を形成するようにアニーリングしており、
(iii) 該脈管を有する胚以外の哺乳類に非経口投与するのに適しており、かつ、
(iv) 該核酸が、裸の核酸としての該siRNAおよび任意でRNアーゼ阻害剤を含む水性製剤中に存在している、
小さい干渉リボ核酸(siRNA)である、前記使用。 - 脈管を有する胚以外の哺乳類の標的細胞において、インビボで、コード配列の発現を減少させるための薬学的組成物の製造における、裸のリボ核酸の使用であって、
裸のリボ核酸が、前記胚以外の哺乳類への非経口投与に適しており、そして、
(i) 標的細胞中のコード配列に特異的であり、かつ、
(ii)センス鎖とアンチセンス鎖を含み、長さが19-30塩基対の二本鎖構造を形成するようにアニーリングしている、
小さい干渉リボ核酸(siRNA)である、前記使用。 - 前記投与が、静脈内投与である、請求項2〜3のいずれかの使用。
- 前記siRNAが、流体力学投与プロトコールを用いて投与される、請求項2〜3のいずれかの使用。
- 標的細胞が肝細胞である、請求項2〜3のいずれかの使用。
- 前記胚以外の哺乳類が成体である、請求項2〜3のいずれかの使用。
- 前記二本鎖構造が、19-21塩基対の長さを有する、請求項2〜3のいずれかの使用。
- 前記siRNAが、センス鎖とアンチセンス鎖を含み、それぞれが、長さが19塩基対の二本鎖構造を形成するようにアニーリングした、長さが21ヌクレオチドである、または、それぞれが、長さが21塩基対の二本鎖構造を形成するようにアニーリングした、長さが23ヌクレオチドである、請求項2〜3のいずれかの使用。
- 前記コード配列が、前記標的細胞にとって内因性である、請求項2〜3のいずれかの使用。
- 前記コード配列が、ウイルスの配列である、請求項2〜3のいずれかの使用。
- 前記ウイルスが肝炎ウイルスである、請求項11記載の使用。
- 前記二本鎖構造が、19-21塩基対の長さを有する、請求項1記載のキット。
- 前記siRNAが、センス鎖とアンチセンス鎖を含み、それぞれが、長さが19塩基対の二本鎖構造を形成するようにアニーリングした、長さが21ヌクレオチドである、または、それぞれが、長さが21塩基対の二本鎖構造を形成するようにアニーリングした、長さが23ヌクレオチドである、請求項1記載のキット。
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