ES2441791T3 - Moléculas de ARN de interferencia pequeñas modificadas y métodos de uso - Google Patents

Abstract

Un ARN de doble cadena modificado (ARNdc) o ARN corto de interferencia (ARNsi) que interactúa con una secuencia diana de ribonucleótido de virus de hepatitis C (VHC), virus de hepatitis A, virus de hepatitis B, virus de hepatitis D o virus de hepatitis E, donde dicho ARNdc o ARNsi se une al colesterol, en conjunto con un fármaco reductor de colesterol que es una estatina, resina, gemfibrozilo o clofibrato, para su uso en un método terapéutico para inactivar el virus.

Description

Moléculas de ARN de interferencia pequeñas modificadas y métodos de uso

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere al campo de detección de ácido nucleico y al fenómeno de ARN silenciador

o ARN de interferencia (ARNi). ARN silenciador constituye un fenómeno en el que las moléculas de ARN no codificadoras median supresión de gen específico en un organismo. Por naturaleza, el fenómeno protege al genoma de un organismo de ácidos nucleicos invasores externos tales como transposones, transgenes y genes virales.

La introducción de ARN de doble cadena (ARNdc) en una célula desencadena al ARN silenciador, que después degrada en mARN endógeno correspondiente al ARNdc. Las secuencias de ARN silenciador implican una conversión de ARNdc en ARNs de interferencia cortos (ARNsis) que dirigen ribonucleasas a las dianas de mARN (Baulcombe et al., 2001). Una enzima llamada Dicer procesa el ARNdc a ARNsis, que tienen una longitud de 20-25 nucleótidos. Los ARNsis se montan en complejos que contienen endorribonucleasa conocidos como complejos silenciadores inducidos por ARN (RISCs). Posteriormente, los ARNsis guían a los RISCs a moléculas complementarias de ARN, donde los RISCs se parten y destruyen mARN diana. Cantidades pequeñas de ARNdc pueden silenciar una gran cantidad de mARN diana debido a un componente de amplificación de ARN silenciador (Fire et al., Nature, 391:806-811) (1998)).

La primera evidencia de que ARNdc produce un gen silenciador eficiente a través de ARNi vino de estudios sobre el nematodo Caenorhabditis elegans (Fire et al., Nature, 391:806-811 (1998) y Patente de Estados Unidos Nº 6.506.559). Estudios posteriores sobre la mosca de la fruta Drosophila melanogaster demostraron que ARNi es un mecanismo multi-etapa (Elbashir et al., Genes Dev., 15(2): 188-200 (2001)).

Aunque ARNdc puede medir interferencia mediada por gen en células mamíferas (Wianny, F. y Zernicka-Goetz, M., Nature Cell Bio. 2:70-75 (2000) Svoboda, P. et al., Development 17:4147-4156 (2000)), el uso de ARNi en células somáticas mamíferas a menudo está limitado por una activación de proteína quinasa dependiente de ARN (PKR), que inactiva el factor de traslación eIF2a, causa una supresión generalizada de síntesis de proteína y a menudo causa apoptosis (Gil, J. y Esteban, M., Apoptosis 5:107-114 (2000)).

Recientemente, ARNsi de aproximadamente 21 o 22 pares base de longitud, correspondiente a secuencias dirigidas de ARN o ADN, mostró afectar a la expresión de las secuencias dirigidas de células mamíferas (Elbashir, S.M., et al., Nature 411:494-498 (2001)). Sin embargo, no está claro que todas las secuencias de ARN o ADN de un genoma de célula de mamífero sean susceptibles a ARNsi. Tampoco es seguro que todos los tipos de célula mamífera posean la maquinaria necesaria para efectuar supresión específica de gen usando ARNsi. Además, ARNsi es de uso limitado por al menos dos razones: (a) la naturaleza temporal del efecto de supresión visto en céulas donde se ha administrado ARNsi, y (b) la necesidad de síntesis química de ARNsis antes de su uso (Tuschl, T., Nature Biotech, 20: 446-448 (2002)). También, ya que ARNsis son inestables in vivo, su efectividad a largo plazo es limitada.

Una invención que se dirige a estos retos mejorará la utilidad de ARNi para tratar enfermedad humana en el nivel de actividad de ácido nucleico. En particular, tal invención hará que ARNi sea una terapia más práctica para infecciones virales, tales como infecciones con VHC. Las terapias actuales para tales infecciones virales son muy limitadas, y tienden a tener bajos índices de respuesta.

WO2004/011647 desvela moléculas de ARNsi dirigidas a VHC

US2004/192626 desvela moléculas de ARNsi dirigidas a VHB.

US2003/206887 desvela moléculas de ARNsi dirigidas a VHB y VHC.

Resumen de la invención

La invención proporciona un método para la entrega de ARNsi a hepatocitos en un animal para fines terapéuticos, incluyendo la inactivación de un virus en un animal. El método comprende la administración de un fármaco que reduce el colesterol a un animal en conjunto con la administración de un ARNdc o ARNsi que se modifica para comprender además un colesterol como un ligando de enlace con el receptor (colesterol-ARNsi). El fármaco que reduce el colesterol puede administrarse antes de, en el mismo momento, o después de la administración del ARNsi etiquetado con colesterol. En una realización preferente, el fármaco que reduce el colesterol es una estatina.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 representa la secuencia y estructura secundaria de 5’ UTR del genoma de VHC. También proporciona secuencias específicas de ARNsi para inducir ARNi hacia VHC en células hepáticas.

La Fig. 2 proporciona secuencias para varios ARNsis específicos de VHC que son útiles para inducir ARNi hacia VHC en células hepáticas. Cada ARNsi específico de VHC se identifica mediante la designación proporcionada en la primera columna.

La Fig. 3 muestra la secuencia nucleótida del coronavirus SARS.

La Fig. 4 es una representación esquemática de los marcos abiertos de lectura del coronavirus SARS.

La Fig. 5 representa un replicón de VHC subgenómico contenido en la línea celular de hepatoma Huh 7, que se usó para comprobar la eficacia de ARNsi en células humanas de hígado.

La Fig. 6 representa la respuesta de dosis de actividad del luciferasa normalizada en células Huh-7 que contienen el replicón de VHC subgenómico (línea 5-2), a las que se les administró diferentes concentraciones de ARNsi5. La actividad de luciferasa, que se midió el día 1, 2 y 3 después de la transfección, cayó con dosis crecientes de ARNsi. El ensayo de luciferasa se realizó usando un sistema de ensayo de Luciferasa disponible en Promega Corp. (Madison, WI), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La Fig. 7 representa la especificidad de secuencia de ARNsi5 para inducir ARNi dirigido por VHC en células de hígado Huh-7.

La Fig. 8 demuestra que ARNsi5 es no tóxico para células Huh-7. Los niveles de ATPasa se analizaron usando un kit de ensayo de ATPasa disponible en Promega Corp. (Madison, WI), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La Fig. 9 representa los efectos de ARNsi5 en la réplica de VHC en células 21-5 (células Huh-7 que contienen VHC de longitud completa), como lo mide el ensayo de ARN. Los niveles de ARN se analizaron usando el kit de ARN TaqMan™ (F. Hoffman La-Roche, Suiza), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los valores se normalizan.

La Fig. 10 demuestra que ARNsi5 no afecta a la viabilidad de células Huh 5-2. Específicamente, ARNm que codifica GAPDH, una enzima esencial para glicolisis se midió en células Huh 5-2 transfectadas con ARNsi5 o ARNsi específico de GAPDH. El gráfico demuestra que ARNsi5 no afectó a los niveles de ARN de GAPDH. GAPDH se midió usando un kit de ARN TaqMan™ (F. Hoffman La-Roche, Suiza), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los valores se normalizan.

La Fig. 11 representa una respuesta de dosis de actividad de luciferasa normalizada en células Huh 7 que contienen un replicón de VHC subgenómico (línea 5-2) a las que se administraron diferentes concentraciones de 2’fluoro-ARNsi (2’-F-GL2), que dirige el gen de luciferasa de la mosca de la fruta. La actividad de luciferasa, que se midió 2 días después de la transfección, cayó con dosis crecientes de ARNsi. El ensayo de luciferasa se realizó usando un kit de Luciferasa Firefly (Promega Corp., Madison, WI), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La Fig. 12 demuestra una inhibición de actividad de luciferasa en células 5-2 usando el ARNsi Col-GL2 en ausencia de liposomas.

La Fig. 13 demuestra una autoradiografía de duplicaciones de ARNsi etiquetado con 5’ separadas por PAGE, y muestra la estabilidad de ARN 2’-fluoro-modificado (2’-F-GL2) incubado en suero humano hasta 10 días. Las duplicaciones de ARNsi se sometieron a incubación con suero humano y se analizaron por 20% PAGE. La composición de las calles es la siguiente: Calle 1, 11 y 21: ARNsi etiquetado con 32P-extremo solo; Calles, 2-10, 1220 y 22-25: ARNsi incubado con suero humano. Calles 2 y 12, 1 min.; Calles 3 y 13, 5 min.; Calles 4 y 14, 15 min.; Calles 5 y 15, 30 min.; Calles 6 y 16, 1 hora; Calles 7 y 17, 2 horas; Calles 8 y 18, 4 horas; Calles 9 y 19, 8 horas; Calles 10 y 20, 24 horas; Calles 22, 24 horas; Calles 23, 48 horas; Calles 24, 120 horas; Calles 25, 240 horas de incubación, respectivamente.

La Fig. 14 demuestra el uso de Dicer humano recombinante para convertir ARNdc fluorizado en 2’F-ARNsi. La composición de las calles es la siguiente: Calle 1: marcador de tamaño, λ\HindIII+φX174\HaeIII; Calle 2: ribo/ribo homodúplex ARN; Calle 3: ribo/2’-F heterodúplex ARN; Calle 4: 2’-F/ribo heterodúplex ARN; Calle 6: marcador de tamaño, escalera 10bp ADN; Calle 7: ribo/ribo homodúplex ARNsi; Calle 8: ribo/2’-F heterodúplex ARNsi; Calle 9: 2’F/ribo heterodúplex ARNsi; Calle 10: 2’-F/2’-F homodúplex ARNsi.

La Fig. 15 muestra una respuesta de dosis de actividad de luciferasa normalizada en células Huh-7 que contienen el replicón de VHC subgenómico (línea 5-2) para ARNsis específicos de VHC. La actividad de luciferasa cayó con dosis crecientes de cada ARNsi.

La Fig. 16 muestra que el colesterol muestra una respuesta de dosis de actividad de luciferasa normalizada en células Huh-7 que contiene el replicón de VHC subgenómico (línea 5-2) para ARNsi GL2 modificado con colesterol.

La Fig. 17 demuestra la mayor estabilidad vista con un ARNsi que se ha modificado para incluir pirimidina 2-Fluoro que sustituyen todas la pirimidinas (2-F-ARNsi) y pirimidinas 2-Fluoro que sustituyen todas la pirimidinas y también una secuencia de dos deoxinucleótidos bases “TT” añadidas a los extremos 30 de la molécula en lugar de los salientes de ribonucleótido “UU” presentes en 2-F-ARNsi (2’-F-ARNsi 3’-X).

La Fig. 18 muestra que la estabilidad de ARNsi puede aumentar dramáticamente por la fluorización en 2’azúcar.

La Fig. 19 muestra la evaluación de ARNsi in vivo.

La Fig. 20 muestra que el inhibidor de proteasa de molécula pequeña BILN-2061 es eficaz en ratones quiméricos por inyección de baja presión IV.

La Fig. 21 muestra 2’-F-ARNsi conjugado dado por inyección de baja presión IV es prácticamente infectivo en ratones quiméricos.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona moléculas ARNdc que tienen aproximadamente de 10 a 30 nucleótidos de longitud, y que median la interferencia de ARN en células dianas. Preferentemente, las moléculas inventivas están químicamente modificadas para conferir una mayor estabilidad frente a la degradación de nucleasa, pero mantienen la habilidad para enlazarse a ácidos nucleicos dianas.

Como se usa en el presente documento, “ARN de interferencia” (ARNi) se refiere a supresión específico de secuencia o de gen de expresión de gen (síntesis de proteína) que está mediada por ARNi, sin la supresión generalizada de la síntesis de proteína. Mientras la invención no se limita a una teoría o modo de acción particular, ARNi puede implicar la degradación de ARN mensajero (ARNm) por un complejo silenciador inducido por ARN (RISC), previniendo la traslación del ARNm trascrito. Alternativamente, puede implicar la metilación de ADN genómico, que desvía la transcripción de un gen. La supresión de la expresión de gen causada por ARNi puede ser temporal o puede ser más estable, incluso permanente.

“Supresión de gen”, “supresión dirigida”, “supresión específica de secuencia”, “ARNi dirigido” y “ARNi específico de secuencia” se usan intercambiablemente en el presente documento. Además, la supresión específica de secuencia, como se usa en el presente documento, se determina analizando por separado niveles de la proteína dirigida para la supresión en células que contienen el ARNsi (células experimentales) y en células que no contienen el ARNsi idéntico (células de control), comparando después los dos valores. Las células experimentales y de control deberían derivase de la misma fuente y el mismo material. También, las células de control y experimentales usadas en la determinación del nivel o cantidad de supresión de gen deberían analizarse bajo condiciones similares, si no idénticas.

ARN es un polímero de ribonucleótidos, conteniendo cada uno la ribosa de azúcar en asociación con un grupo fosfato y una base de nitrógeno (típicamente, adenina, guanina, citosina o uracil). Como su primo, ADN, ARN puede formar enlaces complementarios de hidrógeno. Por lo tanto, ARN puede ser de doble cadena (ARNdc), de única cadena (ARNuc) o de doble cadena con un saliente de única cadena. Los tipos comunes de ARN incluyen ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt), ARN ribosomal (ARNr), ARN corto de interferencia (ARNci), micro ARN (miARN) y ARN de horquilla corta (ARNhc), jugando cada uno un papel específico en células biológicas. Como se usa en el presente documento, el término “ARN” incluye todos estos.

“ARN corto de interferencia” (ARNsi) se refiere a moléculas de ARN de doble cadena de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud que son nombradas por su habilidad para interferir específicamente con la expresión de proteína. Preferentemente, las moléculas de ARNsi tienen 12-28 nucleótidos de longitud, más preferentemente 15-25 nucleótidos de longitud, aún más preferentemente 19-23 nucleótidos de longitud y más preferentemente 21-23 nucleótidos de longitud. Por lo tanto, las moléculas ARNsi tienen12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 34, 25, 26, 27, 28 o 29 nucleótidos de longitud.

La longitud de la cadena designa la longitud de una molécula de ARNsi. Por ejemplo, un ARNsi que se describe como de 21 ribonucleótidos de longitud (un 21-mer) podría comprender dos cadenas opuestas de ARN que se templan juntas para 19 emparejamientos de bases contiguos. Los dos ribonucleótidos restantes en cada cadena formarían un “saliente”. Cuando un ARNsi contiene dos cadenas de diferentes longitudes, la más larga de las cadenas designa la longitud de ARNsi. Por ejemplo, un ARNdc que contiene una cadena que tiene 21 nucleótidos de longitud y una segunda cadena que tiene 20 nucleótidos de longitud, constituye un 21-mer.

ARNsi que comprenden un saliente son deseables. El saliente puede estar en el extremo 5’ o 3’ de una cadena. Preferentemente, está en el extremo 3’ de la cadena de ARN. La longitud de un saliente puede variar, pero preferentemente tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 bases, y más preferentemente tiene 2 nucleótidos de longitud. Preferentemente, el ARNsi de la presente invención comprende un saliente en 3’ de aproximadamente 2 a 4 bases. Más preferentemente, el saliente 3’ tiene 2 ribonucleótidos de longitud. Incluso más preferentemente, los 2 ribonucleótidos que comprenden el extremo 3’ son uridina (U).

ARNsi de la presente invención están diseñados para interactuar con una secuencia ribonucleótido diana, lo que significa que complementan una secuencia diana de manera suficiente como para enlazarse con la secuencia diana. La secuencia diana de ribonucleótido es de virus de hepatitis C (VHC), virus de hepatitis A, virus de hepatitis B, virus de hepatitis D y virus de hepatitis E.

El virus de hepatitis C (VHC) es un virus diana altamente preferente. La Figura 1 y Figura 2 desvelan las secuencias de ácido nucleico para varias moléculas de ARNsi específicas de VHC. Entres las mostradas, ARNsi5, ARNsiC1, ARNsiC2, ARNsi5B1, ARNsi5B2 y ARNsi5B4 han demostrado una actividad particularmente buena, y por lo tanto son muy preferentes. ARNsis al menos 80%, 90% o 95% idénticas a estas altamente preferentes también constituyen parte de la invención.

La molécula de ARN puede comprender una secuencia de ribonucleótido al menos 80% idéntica a la secuencia de ribonucleótido de un virus diana. Preferentemente, la molécula ARNsi es al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de ribonucleótido del virus diana. La diana puede ser el genoma viral entero, una transcripción primaria, un marco abierto de lectura, o una parte de estos. Más preferentemente, un ARNsi será 100% idéntico a la secuencia de nucleótido de un virus diana. Sin embargo, las moléculas de ARNsi con inserciones, eliminaciones o mutaciones de un único punto en relación con una diana también pueden ser efectivas. Las herramientas para ayudar al diseño de ARNsi están fácilmente disponibles para el público, por ejemplo, una herramienta de diseño de ARNsi basada en ordenador está disponible en internet en www.dharmacon.com.

A modo de ejemplo, un polinucleótido que tiene una secuencia nucleótida al menos 95% “idéntica” a la secuencia nucleótida de referencia significa que la secuencia de polinucleótido puede incluir hasta cinco mutaciones de punto por 100 nucleótidos de la secuencia nucleótida de referencia, o una mutación de 1 punto por 20 nucleótidos. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tiene una secuencia nucleótida al menos 95% idéntica a una secuencia nucleótida de referencia, hasta 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia pueden eliminarse o sustituirse por otro nucleótido, o un número de nucleótidos hasta 5% de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia pueden insertarse en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones de terminal 5’ o 3’ de la secuencia nucleótida de referencia o en cualquier sitio entre estas posiciones de terminal, intercaladas individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos en la secuencia de referencia.

Como un asunto práctico, si una molécula de ácido nucleico particular es al menos 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de ribonucleótido de un agente diana o virus puede determinarse convencionalmente usando programas de ordenador conocidos tales como el programa Bestfit (Paquete Wisconsin Sequence Analysis, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, Madison, WI). Bestfit usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)) para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se usa Bestfit o cualquier otro programa de alineación de secuencia para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente invención, los parámetros se fijan, por supuesto, de tal manera que el porcentaje de identidad se calcule sobre la longitud completa de la secuencia de ribonucleótido de referencia y que se permitan espacios en homología hasta 5% del número total de ribonucleótidos en la secuencia de referencia.

La presente invención también incluye moléculas ARNsi que se han modificado químicamente para conferir una mayor estabilidad frente a la degradación de nucleasa, pero mantienen la habilidad para enlazarse con los ácidos nucleicos dianas que pueden estar presentes en células. En el caso en el que un ARN es específico de virus, ARNsis modificados son capaces de enlazarse con ARNs o ADNs específicos del virus, inactivando de esta manera el virus.

Un ARNsi modificado de la presente invención comprende un ribonucleótido modificado, y es resistente a la degradación enzimática, tal como degradación RNasa, mientras mantiene la habilidad para inhibir la réplica viral en una célula que contiene las secuencias de ARN o ADN dianas virales específicas. El ARNsi puede modificarse en cualquier posición de la molécula siempre y cuando el ARNsi modificado se enlace con una secuencia diana y sea resistente a la degradación enzimática. Las modificaciones en el ARNsi pueden ser en la base del nucleótido, es decir, la purina o la pirimidina, la ribosa o el fosfato. Preferentemente, la modificación ocurre en la posición 2’ de al menos una ribosa en un ARNsi.

Más específicamente, el ARNsi se modifica en al menos una pirimidina, al menos una purina o una combinación de las mismas. Sin embargo, generalmente todas las pirimidinas (citosina o uracil), o todas las purinas (adenosina o guanina) o una combinación de todas las pirimidina y todas las purinas del ARNsi se modifican. Más preferentemente, las pirimidinas se modifican, y estar pirimidinas son citosina, un derivado de citosina, uracil, un derivado de uracil o una combinación de los mismos. Los ribonucleótidos en una o ambas cadenas del ARNsi pueden modificarse.

Los ribonucleótidos que contienen bases de pirimidina encontrados en ARN (citidina y uridina) pueden modificarse químicamente añadiendo cualquier molécula que inhiba degradación de ARN o ruptura de la base, la ribosa o los fosfatos. Como se ha analizado previamente, la posición 2’ de ribosa es un sitio preferente para la modificación. ARNsis 2’ modificados tienen una vida media más largo del suero y son resistentes a la degradación, en relación con ARNsis no modificados o ARNs de única cadena, tal como antisentido o ribozima. Los ribonucleótidos de pirimidina 2’ modificados pueden formarse mediante un número de métodos diferentes conocidos en la técnica.

Una modificación química preferente es la adición de una molécula del grupo químico haluro a un ribonucleótido de ARNsi. Entre los haluros, flúor es una molécula preferente. Además, del fluoro-, otras fracciones químicas tales como metil-, metoxietil- y propil- pueden añadirse como modificaciones. La modificación más preferente, sin embargo, es la modificación fluoro-, tal como una modificación 2’-fluoro o una modificación 2’,2fluoro.

De este modo, en una realización preferente de la invención, ARNsi se modifica con la adición de una

molécula de flúor al carbono 2’ de un ribonucleótido de pirimidina. El ARNsi puede fluorizarse completamente o

parcialmente. Por ejemplo, solamente los ribonucleótidos de citosina pueden fluorizarse. Alternativamente, solamente los ribonucleótidos de uracil pueden fluorizarse. En una realización preferente, tanto uracil como citosina están fluorizados. Solamente una cadena, bien sentido o antisentido, de ARNsi puede fluorizase. Incluso la

fluorización parcial 2’ de ARNsi da protección contra la degradación nucleolítica. De manera importante, ARNsi 2’

fluorizado es no tóxico para las células, un resultado inesperado dado que la química del flúor es normalmente tóxica para organismos vivientes.

Además, ARNsis modificados de la presente invención pueden contener modificaciones químicas que inhiben polimerasas virales de ARN. Por ejemplo, ARNsis pueden comprender uno o más nucleósidos que inhiben polimerasas ARN dependientes de ARN viral. Ejemplos de tales nucleósidos y otras modificaciones químicas existen en WO 02/057425, WO 02/057287, WO 02/18404, WO 02/100415, WO 02/32920, WO 01/90121, Patente de Estados Unidos Nº 6.063.628 y solicitud publicada de Estados Unidos Nº 2002/0019363.

ARNsi puede prepararse en un número de maneras, tal como mediante síntesis química, transcripción de polimerasa T7, o tratando ARN largo de doble cadena (ARNdc) preparado mediante uno de los dos métodos previos con enzima Dicer. La enzima Dicer crea poblaciones mezcladas de ARNdc de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 pares base de longitud de ARNdc que tiene un tamaño de aproximadamente 500 pares base a aproximadamente 1000 pares base. Inesperadamente, Dicer pueden efectivamente partir cadenas modificadas de ARNdc, tal como ARNdc 2’-fluoro modificado. Antes del desarrollo de este método, se prensó previamente que Dicer no sería capaz de partir ARNsi modificado. El método de Dicer de preparar ARNsis puede realizarse usando un Kit de Generación Dicer ARNsi disponible en Gene Therapy Systems (San Diego, CA).

En los métodos para hacer ARNsi, un fragmento de ARNdc puede prepararse mediante síntesis química o traslación in vitro. En una realización, el ARNsi modificado e un ARNsi 2’ modificado en el que la modificación es en la posición 2’ de al menos un ribonucleótido de dicho ARNsi. La modificación se selecciona del grupo consistente en modificación fluoro-, metil-, metoxietil- y propil-. Preferentemente la modificación fluoro-es un modificación 2’-fluoro o una modificación 2’,2’-fluoro. Se modifican las pirimidinas, las purinas o una combinación de las mismas del ARNsi. Más preferentemente, se modifican las pirimidinas, tales como citosina, un derivado de citosina, uracil, un derivado de uracil o una combinación de los mismos. Una o dos cadenas de ARNsi pueden contener uno o más ribonucleótidos modificados.

La invención proporciona además un método para inactivar un agente o virus diana en un paciente mediante la administración al paciente de un ARNdc en una cantidad efectiva para inactivar el agente o virus dirigido. Preferentemente el ARNdc se modifica como se ha descrito anteriormente. La interferencia de ARN hacia un segmento de ADN dirigido en una célula puede conseguirse administrando una molécula de ARN de doble cadena a las células, donde la secuencia de la molécula de ARN de doble cadena corresponde a la secuencia de ribonucleótido del segmento de ADN dirigido. Preferentemente, el ARNdc usado para inducir ARNi dirigido es ARNsi.

Como se usa en el presente documento “segmento de ADN dirigido” se usa para querer decir una secuencia de ADN que codifica, por completo o en parte, un ARNm para una proteína dirigida, incluyendo intrones y exones, donde se desea supresión. El segmento de ADN también puede querer decir una secuencia de ADN que normalmente regula la expresión de la proteína dirigida, incluyendo pero sin limitar al promotor y proteína dirigida.

Además, el segmento de ADN puede o no puede ser una parte del genoma de la célula o puede ser extracromosomal, tal como ADN de plásmido.

La presente invención está particularmente dirigida a un método para inactivar un virus en un paciente mediante la administración al paciente de un ARNsi, preferentemente un ARNsi modificado, en una cantidad efectiva para inactivar el virus. El ARNsi tiene preferentemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 ribonucleótidos de longitud, más preferentemente 12-28 ribonucleótidos, más preferentemente 15-25 ribonucleótidos, incluso más preferentemente 19-23 ribonucleótidos y lo más preferentemente 21-13 ribonucleótidos.

También, el método para inactivar un virus utiliza preferentemente un ARNsi que está modificado en la

posición 2’ de al menos un ribonucleótido de dicho ARNsi. El ARNsi puede modificarse con grupos químicos

seleccionados del grupo consistente en fluoro-, metil-, metoxietil- y propil-. La modificación fluoro- es la más preferente, y una modificación 2’-fluoro o 2’-2’-fluoro es útil en el método. La modificación puede ser en una pirimidina, una purina o una combinación de las mismas del ARNsi. Más preferentemente se modifican las pirimidinas, tales como citosina, un derivado de citosina, uracil, un derivado de uracil o una combinación de los mismos. En una realización, una cadena del ARNsi contiene al menos un ribonucleótido modificado, mientras en otra realización, ambas cadenas del ARNsi contienen un ribonucleótido modificado.

ARNsis útiles en los métodos del tratamiento también se modifican por la unión de colesterol al ARNsi. Tales ligandos son útiles para dirigir la entrega de ARNsi a un virus diana en hepatocitos.

El colesterol se une al extremo 5’-o extremo 3’- de una molécula de ARNsi. El colesterol puede unirse a uno o más extremos de ARNsi, incluyendo cualquier combinación de los extremos 5’-y 3’-. De este modo, cuando el colesterol se une solamente a los extremos de una molécula de ARNsi, las moléculas de colesterol pueden unirse en cualquier sitio entre 1 y 4.

El resultante colesterol-ARNsi se entrega a hepatocitos en el hígado, proporcionando de este modo medios para entregar ARNsi a su localización dirigida.

En un aspecto, el método utiliza un ARNsi preparado (a) identificando una secuencia diana de ribonucleótido en un genoma de virus para designar una ARN de interferencia pequeño (ARNsi) y (b) produciendo un ARNsi que se ha modificado para contener al menos un ribonucleótido modificado. Preferentemente, el ARNsi comprende una molécula de ARN de doble cadena con una primera secuencia de cadena de ribonucleótido correspondiente a una secuencia de ribonucleótido correspondiente a una secuencia diana de ribonucleótido en el virus, y una segunda cadena que comprende una secuencia de ribonucleótido complementaria a la secuencia diana de ribonucleótido. La primera y segunda cadena deberían separar cadenas complementarias que se hibridizan entre sí para formar una molécula de ARN de doble cadena. Además, una o ambas cadenas deberían comprender al menso un ribonucleótido modificado.

En realizaciones preferentes de la invención, el ARNsi dirige una secuencia de ribonucleótido en el genoma de virus de hepatitis C. La secuencia diana de ribonucleótido comprende una secuencia conservada de ribonucleótido necesaria para la réplica de VHC, y la secuencia conservada de ribonucleótido se selecciona del grupo consistente en 5-región no trasladada (5’-UTR), región 3’-no trasladada (3’-UTR), núcleo y NS3 helicasa. Las moléculas de ARNsi muy preferentes comprenden una secuencia al menos 80% idéntica a aquellas de ARNsi5, ARNsiC1, ARNsiC2, ARNsi5B1, ARNsi5B3 o ARNsi5B4. Los ARNsis pueden estar modificados o no modificados como se ha descrito anteriormente.

Los métodos para inhibir la réplica de VHC en células positivas para VHC no deberían ser tóxicos para las células, o causar apoptosis en las células tratadas. Preferentemente, la inhibición de réplica de VHC está específicamente diseñada para afectar solamente a la réplica de VHC en las células, de manera que no afecte al crecimiento normal, división o metabolismo. Las células en las que VHC ha demostrado replicar incluyen, aunque no se limitan a, células hepáticas, linfocitos de célula B y linfocitos de célula T. preferentemente, un método para inhibir la réplica de VHC se realiza en células hepáticas.

De acuerdo con la invención, “células hepáticas” pueden ser de cualquier fuente animal. Además, las células hepáticas pueden estar en cultivo celular, o parte de un tejido, o un órgano, en parte o por completo. La expresión células hepáticas pretende incluir cualquier célula que contenga una célula de hígado normal, anormal o enferma. Ejemplos de células hepáticas incluyen, aunque no se limitan a, célula Kupffer, hepatocitos y células que comprenden un carcinoma hepatocelular. “Célula hepática” no pretende incluir células que forman estructuras diferenciadas dentro del hígado, tales como célula endoteliales que forran vasos sanguíneos. Un tejido u órgano que contiene las células hepáticas pueden estar dentro de un sujeto o pueden someterse a biopsia o extraerse del animal. Además, el tejido puede estar “fresco” porque el tejido se habría extraído recientemente de un sujeto, sin ninguna etapa de conservación entre la escisión y los métodos de la invención actual. Antes de la aplicación de los métodos de la invención actual, el tejido también podría haberse conservado mediante técnicas estándares de preparación de tejido incluyendo, aunque sin limitar, congelación, congelación rápida, envoltura con parafina y fijación de tejido. Además, el tejido también puede ser un xenoinjerto o un isoinjerto o en otro animal huésped. Como se usan en el presente documento, los términos animal y sujeto se usan intercambiablemente.

De acuerdo con la invención, “virus de hepatitis C” o “VHC”, toma su significado ordinario en la técnica como el de la fecha de la invención. El virus de hepatitis C es un virus ARN de la familia Flaviviridae. Por ejemplo como se usa en el presente documento, VHC incluye, aunque no se limita a genotipos 1-11 (usando el sistema más común de genotipos), con estos genotipos rompiéndose en sub-tipos, algunos de los cuales incluyen, aunque no se limitan a 1a, 1b, 1c, 2a, 2b, 2c, 3a, 3b, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 5a, 6a, 7a, 7b, 8a, 8b, 9a, 10a y 11a. Además, aislados de individuos consisten en poblaciones heterogéneas aún muy relacionadas de genomas virales, algunas veces referidos como quasiespecies.

ARNsi puede administrarse a un paciente mediante inyección intravenosa, inyección subcutánea, entrega oral, entrega de liposoma o entrega intranasal. El ARNsi puede después acumulase en un órgano diana del paciente.

El término paciente, como se usa en el presente documento, se refiere a un animal, preferentemente un mamífero. Más preferentemente el paciente puede ser un primate, incluyendo no humanos y humanos. Los términos sujeto y paciente se usan intercambiablemente en el presente documento.

Los tratamientos concebidos por la invención actual pueden usarse para sujetos con una infección viral preexistente, o para sujetos predispuestos a una infección. Además, los métodos de la invención actual pueden usarse para corregir o compensar anormalidades celulares o fisiológicas implicadas al conferir susceptibilidad a infecciones virales en pacientes y/o para aliviar síntomas de una infección viral en pacientes o como una medida preventiva en pacientes.

El método para tratar un paciente que tiene una infección viral implica la administración de composiciones a un sujeto. Como se usa en el presente documento, la composición puede querer decir un compuesto puro, agente o sustancia o una mezcla de dos o más compuestos, agentes o sustancias. Como se usa en el presente documento, los términos agentes, sustancia o compuesto pretenden querer decir una proteína, ácido nucleico, carbohidrato, lípido, polímero o molécula pequeñas, tal como un fármaco.

En una realización de la invención actual, la composición administrada al sujeto es una composición farmacéutica. Además, la composición farmacéutica puede administrarse oralmente, nasalmente, parentalmente, intrasistémicamente, intraperitonealmente, tópicamente (como por gotas o parche transdérmico), bucalmente, o como un espray oral o nasal. La entrega intranasal de un virus que causa enfermedades de las vías respiratorias altas, tales como coronavirus o el metapneumovirus, sería un modo de entrega particularmente ventajoso. El término “parenteral”, como se usa en el presente documento, se refiere a modos de administración que incluyen inyección intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal, subcutánea e intraarticular e infusión. Las composiciones farmacéuticas como las contempladas por la invención actual pueden incluir un transportador farmacéuticamente aceptable.

“Transportador farmacéuticamente aceptable” incluyen, aunque no se limita a, un sólido, semi-sólido o relleno líquido no tóxico, diluyente, material encapsulador o auxiliar de formulación de cualquier tipo, tales como liposomas.

Una composición farmacéuticamente aceptable de la presente invención para inyección parenteral puede comprender soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones estériles farmacéuticamente aceptables acuosas

o no acuosas así como polvos estériles para la reconstitución en soluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes de su uso. Ejemplos de transportadores, diluyentes, disolventes o vehículos acuosos o no acuosos adecuados incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, glicol de propileno, glicol de polietileno y similares), carboximetilcelulosa y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales (tal como aceite de oliva), y éteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de materiales de revestimiento tales como lecitina, por el mantenimiento del tamaño requerido de partícula en el caso de dispersiones, y por el uso de surfactantes.

Las composiciones de la presente invención también pueden contener adyuvantes tales como, aunque sin limitar a, conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de microorganismos puede asegurarse mediante la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifungales, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos tales como azúcares, cloruro sódico y similares. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede provocarse con la inclusión de agentes que retrasan la absorción tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

En algunos casos, para prolongar el efecto de los fármacos, es deseable reducir la velocidad de la absorción de inyección subcutánea o intramuscular. Esto puede llevarse a cabo con el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con poca solubilidad en agua. El índice de absorción del fármaco depende después de su índice de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de una forma de fármaco administrado parenteralmente se lleva a cabo disolviendo o suspendiendo el fármaco en un vehículo de aceite.

Las formas de depósito inyectable se hacen formando matrices microencapsuladas del fármaco en polímeros biodegradables tales como poliláctido-poliglicólido. Dependiendo de la proporción del fármaco con el polímero y la naturaleza del polímero particular empleado, el índice de liberación del fármaco puede controlarse. Ejemplos de polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones inyectables con depósito también se preparan atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con tejidos corporales.

Las formulaciones inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro retenedor de bacterias, o incorporando agentes esterilizadores en forma de composiciones estériles sólidas que pueden disolverse o dispersarse en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de su uso.

Las formas sólidas de dosis para administración oral incluyen, aunque no se limitan a, cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos y gránulos. En tales formas sólidas de dosis, los compuestos activos se mezclan con al menos un excipiente o transportador farmacéuticamente aceptable tal como citrato sódico o fosfato de dicalcio y/o a) rellenos o sustancias para preservar tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, y ácido silícico, b) aglutinantes tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y acacia, c) humectantes tales como glicerol, d) agentes desintegrantes como agar-agar, carbonato cálcico, almidón de patata

o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y carbonato sódico, e) agentes retardantes de la solución como parafina, f) aceleradores de absorción como compuestos de amonio cuaternario, g) agentes humectantes como, por ejemplo, alcohol de acetilo y monoestearato de glicerol, h) absorbentes como caolín y arcilla bentonita e i) lubricantes como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, glicoles de polietileno sólidos, sulfato de lauril de sodio y mezclas de los mismos. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, la forma de dosis también puede comprender agentes amortiguadores.

Las composiciones sólidas de un tipo similar también pueden emplearse como rellenos en cápsulas de gelatina rellenas blandas y duras usando excipientes tales como lactosa o azúcar de leche así como glicoles de polietileno de alto peso molecular y similares.

Las formas sólidas de dosis de comprimidos, cápsulas, píldoras y gránulos pueden prepararse con revestimientos carcasas tale como revestimientos entéricos y otros revestimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. Pueden opcionalmente contener agentes oscurecedores y también pueden ser de una composición que liberan el ingrediente o ingredientes activos solamente, o preferentemente, en una cierta parte del tracto intestinal, opcionalmente, de una manera retardada. Ejemplos de composiciones de incrustación que pueden usarse incluyen sustancias poliméricas y ceras.

Los compuestos activos también pueden estar en forma micro-encapsulada, si es apropiado, con uno o más excipientes de los anteriormente mencionados.

Las formas líquidas de dosis para administración oral incluyen, aunque no se limitan a, emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los compuestos activos, las formas líquidas de dosis pueden contener diluyentes inertes comúnmente usados en la técnica tales como, por ejemplo, agua y otros disolventes, agentes solubilizadores y emulsionantes tales como alcohol de etilo, alcohol de isopropilo, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol de bencilo, benzoato de bencilo, glicol de propileno, 1,3-glicol de butileno, dimetilformamida, aceites (en particular de aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, castor y de sésamo), glicerol, alcohol de tetrahidrofurfuril, glicoles de polietileno y ésteres de ácido graso y mezclas de los mismos.

Además de diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y suspensores, agentes endulzantes, saborizantes y aromatizantes.

Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes suspensores como, por ejemplo, alcoholes de isoestearilo etoxilados, sorbitol de polioxietileno y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, y mezclas de los mismos.

Alternativamente, la composición puede presurizarse y contener un gas comprimido, tal como nitrógeno o propulsor de gas licuado. El medio propulsor licuado y de hecho la composición total es preferentemente tal que los ingredientes activos no se disuelven en la misma hasta ninguna extensión sustancial. La composición presurizada puede también contener un agentes activo de superficie. El agente activo de superficie puede ser un agente activo de superficie no-iónica líquido o sólido o puede ser un agentes activo de superficie aniónica sólido. Es preferentes usar el agente activo de superficie aniónica sólido en forma de un a sal de sodio.

Las composiciones de la presente invención pueden administrarse en forma de liposomas. Como se conoce en la técnica, los liposomas se derivan generalmente de fosfolípidos u otras sustancias lípidas. Los liposomas estar formados por cristales líquidos hidratados mono o multi-lamelares que se dispersan en un medio acuoso. Puede usarse cualquier líquido no tóxico, fisiológicamente aceptable y metabolizable capaz de formar liposomas. Las presentes composiciones en forma de liposoma pueden contener, además de los compuestos de la invención, estabilizantes, conservadores, excipientes, y similares. Los lípidos preferentes son los fosfolípidos y las fosfatidilcolinas (lecitinas), tanto naturales como sintéticas. Los métodos para formar liposomas son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Prescott, Ed., Meth. Cell Biol. 14:33 et seq (1976)).

Un experto en la técnica apreciará que las cantidades efectivas de los agentes de la invención pueden determinarse empíricamente y pueden emplearse en forma pura o, donde existan tales formas, en forma de sal, éster o profármaco farmacéuticamente aceptable. Una cantidad “terapéuticamente efectiva” de las composiciones inventivas pueden determinarse mediante la prevención o mejora de condiciónese o síntomas adversos de enfermedades, lesiones o trastornos a ser tratados. Los agentes pueden administrase a un sujeto, que necesite el tratamiento de infección viral, como composiciones farmacéuticas en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Se entenderá que, cuando se administra a un paciente humano, el médico que atienda decidirá el uso total diario de los agentes o composición de la presente invención dentro del alcance del criterio médico sensato. El nivel de dosis específico terapéuticamente efectivo para un paciente particular dependerá de una variedad de factores: el tipo y grado de la respuesta celular y fisiológica a conseguir; actividad del agentes o composición específicos empleados; los agentes o composición específicos empleados; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el momento de administración, ruta de administración, e índice de excreción del agentes; la duración del tratamiento; fármacos usados en combinación o coincidentes con el agente específico; y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. Por ejemplo, es bien conocido por los expertos en la técnica comenzar con dosis de los agentes a niveles inferiores a los requeridos para conseguir el efecto terapéutico deseado y gradualmente aumentar las dosis hasta que se consiga el efecto deseado.

La dosificación también puede disponerse en una manera específica para el paciente para proporcionar una concentración predeterminada de los agentes en la sangre, como los determinan las técnicas aceptadas y la rutina en la técnica. De este modo, la dosificación para el paciente puede ajustarse para conseguir niveles regulares de sangre en curso, como lo mide HPLC, en el orden de desde 50 a 1000 ng/ml.

Varias medicaciones pueden reducir los niveles de colesterol en sangre. Estas medicaciones o fármacos incluyen, por ejemplo, estatinas, resinas y ácido nicotínico (niacina), gemfibrozilo y clofibrato. Clofibrato (Atromid-S) eleva los niveles de colesterol HDL y reduce los niveles de triglicérido. Gemfibrozilo (Lopid) reduce las grasas en sangre y eleva los niveles de colesterol HDL.

El ácido nicotínico trabaja en el hígado y se usa para reducir los triglicéridos y el colesterol LDL, y elevar el colesterol HDL (“bueno”). Las resinas promueven la mayor eliminación de colesterol. Las medicaciones en esta clase incluyen: Colestiramina (Questran, Prevalite, Lo-Cholest); Colestipol (Colestid); y Colesevelam (WelChol).

Los fármacos de estatina son muy efectivos para reducir los niveles de colesterol LDL (“malo”), tienen pocos efectos secundarios inmediatos a corto plazo y son un fármaco preferente reductor de colesterol para su uso en los métodos de la presente invención. Las estatinas incluyen: Atorvastatina (Lipitor); Fluvastatina (Lescol); Lovastatina (Mevacor); Pravastatina (Pravachol); Calcio de Rosuvastatina (Crestor); y Simvastatina (Zocor). (Véase también “Reducción del colesterol con fármacos de estatina, riesgo de apoplejía y mortalidad total. Un resumen de ensayos aleatorizados”; Herbert PR, Gaziano JM, Chan KS, Hennekens, CH. JAMA (1997) Nov. 26; 278(20):1660-1.

HMG-CoA (3-hidroxi-3-metilglutaril-conenzima A) reductasa (HMGR) cataliza la etapa cometida en la biosíntesis de colesterol. Las estatinas son inhibidoras de HMGR con valores constantes de inhibición en el rango nanomolar que efectivamente reducen los niveles de colesterol en suero y se pre-escriben comúnmente en el tratamiento de hipercolesterolemia. Los fármacos de estatina aumentan la expresión de receptores de LDL sobre la superficie de hepatocitos del hígado. Como consecuencia del aumento en la expresión del receptor LDL, el nivel de colesterol se reduce en plasma. De este modo, al administrar un fármaco reductor de colesterol, el nivel de colesterol conflictivo en plasma se reduce y el nivel de receptores de LDL para enlazar con colesterol-ARNsi en el hígado aumentan. La invención proporciona de este modo un método para la mayor ingesta de ARNsi etiquetado con colesterol donde el ARNsi se administra en conjunto con un fármaco reductor de colesterol que aumenta la expresión del receptor LDL por lo que el nivel de colesterol conflictivo en el suero se reduce, permitiendo una ingesta más eficiente de ARNsi etiquetado con colesterol por hepatocitos. El fármaco reductor de colesterol puede administrarse antes, con o después de la administración del colesterol-ARNsi.

EJEMPLOS

Los ejemplos demuestran que ARNsi, incluyendo ARNsi modificado, puede inhibir de manera efectiva la réplica viral en células mamíferas. Además, los ejemplos muestran que los ARNsis inventivos promueven la degradación de ARN de VHC en céulas del hígado humano y establecen que los hepatocitos poseen los componentes funcionales necesarios ARNsi modificado inducido silenciador. Los ejemplos también demuestran que la tecnología de ARNsi puede usarse como una terapia para inhibir la réplica de VHC en células huéspedes. Los inventores, al presentar los siguientes ejemplos, no pretenden limitar el alcance de la invención reivindicada.

EJEMPLO 1

Para analizar si ARNsi dirigido al genoma de VHC confiere inmunidad intracelular contra este patógeno humano, se usó un sistema de cultivo celular de VHC recientemente desarrollado en la línea celular del hepatoma humano, Huh-7. Una de las líneas celulares, 5-2 alberga ARN de VHC subgenómico replicante autónomamente (Bartenschlager, J. Virol, 2001). El replicón subgenómico lleva el gen de luciferasa de luciérnaga, permitiendo un ensayo de función del reportero como una medida de réplica de ARN VHC (Fig. 5). Debido a las mutaciones adaptivas del cultivo celular introducidas en el genoma (Bart), estas células 5-2 replican ARN de VHC en niveles de hasta 5 x 104 virus partícula/célula.

Usando la transcripción T7, se hicieron varias duplicaciones de 21-bps ARNsi contra diferentes regiones de 5’-UTR del genoma de VHC (Fig. 5). En resumen, se generaron 2 moléculas oligo de ADN de doble cadena que comprendían el promotor T7 y 5’-UTr de VHC orientado a la dirección sentido o dirección antisentido. Cada ADN oligo se transcribió después in vitro para producir ARN (+) y (-) y después se trató con ADNasa I para retirar la plantilla de ADN. Las dos cadenas de ARN se dejaron templar a 37 ºC durante la noche, generando ARNdc. Después de tratar el ARNdc con ARNasa T1 para retirar especies de ARNss que no reaccionaron, el ARNdc se purificó para transfección.

Se diseñaron varias otras duplicaciones de ARNsi, incluyendo GL2 y GL3, que se dirigieron contra los genes de luciferasa de la mosca de la fruta y pensamiento del mar, respectivamente. Usando técnicas estándares de transfección, los ARNsis se transfectaron a células 5-2 y se midió la actividad de luciferasa para determinar el efecto de ARNsis en réplica de VHC. La actividad de luciferasa se midió 48 horas después de la transfección. En células donde se transfectó ARNsi5, hubo una actividad reducida de luciferasa de hasta el 85%, en una manera sensible a la dosis (Fig. 6). La inhibición de actividad de luciferasa no se vio en células que se transfectaron con ARNsi (SIN) irrelevante. La secuencia de SIN se tomó de promotor de transcripción de virus sindbis (Fig. 1).

EJEMPLO 2

La especificidad de secuencia de la respuesta de ARNsi5 se analizó además usando duplicaciones adicionales de ARNsi, GL2 y GL3. La Figura 1 muestra que GL2 y Gl2 difieren entre sí por 3 nucleótidos. La actividad de luciferasa se redujo un 90% en células transfectadas con ARNsi5 o GL2, pero no se vio una reducción significativa en células transfectadas con GL3 (Fig. 7). En ensayo de luciferasa se realizó usando un sistema de ensayo de luciferasa disponible en Promega Corp. (Madison, WI), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

EJEMPLO 3

Ya fuera ARNsi5 tóxico o no también se analizó para células transfectadas. La toxicidad se midió usando un ensayo de actividad de ATPasa. La Figura 8 muestra que la reducción inducida por ARNsi5 en réplica de VHC, como se ve en la Figura 6, no fue debido a la toxicidad celular que se atribuyó a ARNi específico de no secuencia. Los niveles de ATPasa se analizaron usando un kit de ensayo de ATPasa de Promega (Madison, WI) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

EJEMPLO 4

El replicón de VHC de longitud completa puede poseer la habilidad para adaptar y suprimir ARNi, replicando de este modo en lugar de la presencia de ARNsi, como lo documenta Li, H, Science 296:1319-1321 (2002). Para determinar los efectos de ARNsi5 en la réplica de ARN VHC de longitud completa en células Huh-7, de la línea celular 21-5, que alberga el replicón de VHC seleccionable de longitud completa, se trataron con ARNsi5. Los niveles de ARN VHC se midieron mediante PCR cuantitativo usando TaqMan™ (F. Hoffman La-Roche, Suiza). Los resultados como los vistos en la Figura 9 muestra que el silenciamiento dirigido a ARNsi redujo la producción de ARN viral en estado estacionario, incluso en el escenario de un mutante de VHC adaptado, donde la réplica de ARN fue muy alta. Los resultados de ambos replicones de VHC subgenómicos y de longitud completa sugieren que ninguna de las proteínas de VHC puede suprimir la interferencia de ARN.

EJEMPLO 5

Ya fuera ARNsi5 tóxico o no también se analizó para células transfectadas. Específicamente, ARNm que codificaba GAPDH, una enzima esencial en glicolisis, se midió en células Huh 5-2 transfectadas con ARNsi5, o ARNsi específico hacia la secuencia GAPDH. La Figura 10 demuestra que ARNsi5 no afectó a los niveles de ARN de GAPDH. GAPDH se midió usando un kit de ARN TaqMan™ (F. Hoffman La-Roche, Suiza) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

EJEMPLO 6

Para analizar la efectividad de ARNsi5 en la inhibición de la habilidad de VHC para replicar en un hígado infectado, partes del hígado infectado por VHC se sometieron a xenoinjerto en ratones inmunodeficientes combinados severos transgénicos (SCID) de acuerdo con métodos bien conocidos para el técnico cualificado.

En resumen, una vez que el hígado infectado por VHC suplanta el hígado de un ratón, ARNsi5 encapsulado en liposoma, o liposomas de control se administran mediante inyección intravenosa a los ratones a través de la vena de la cola, u otra vena accesible. A los ratones se les suministra dosis una vez al día durante 3-10 días.

Al final del régimen de dosis los ratones se sacrifican y la sangre se recoge y los hígados se extraen. El hígado se divide en partes de tal manera que una parte se congela usando nitrógeno líquido, una parte se fija a la incrustación de parafina y una parte se fija para seccionar en portaobjetos.

Usando la parcela apropiada, ARN de VHC se cuantifica usando el kit de ensayo de ARN TaqMan™ previamente utilizado en el presente documento para determinar los niveles de ARN de VHC en las células del hígado. Además, los títulos de anticuerpo anti-VHC pueden medirse en las muestras de sangre recogida, junto con los niveles de suero ALT.

EJEMPLO 7

Para evaluara la eficacia de ARNsi5 en la inhibición de la habilidad de VHC para infectar un hígado sano, partes de hígado humano normal se sometieron a xenoinjerto en ratones inmunodeficientes combinados severos transgénicos (SCID) de acuerdo con métodos bien conocidos para el técnico cualificado.

En resumen, una vez que el hígado sano suplanta el hígado de un ratón, ARNsi5 encapsulado en liposoma,

o liposomas de control se administran mediante inyección intravenosa a los ratones a través de la vena de la cola, u otra vena accesible. A los ratones se les suministra dosis una vez al día durante 3-10 días. Después del régimen de pre-dosis, VHC activo se inyecta después intravenosamente, o a través de inyección hepática, en los ratones.

Aproximadamente a las 6, 12, 18, 24 horas, y periódicamente hasta aproximadamente 5 días después de que los ratones hayan sido infectados con VHC, los ratones se sacrifican y la sangre se recoge y los hígados se extraen. El hígado se divide en partes de tal manera que una parte se congela usando nitrógeno líquido, una parte se fija a la incrustación de parafina y una parte se fija para seccionar en portaobjetos.

Usando la parcela apropiada, ARN de VHC se cuantifica usando el kit de ensayo de ARN TaqMan™ previamente utilizado en el presente documento para determinar los niveles de ARN de VHC en las células del hígado. Además, los títulos de anticuerpo anti-VHC pueden medirse en las muestras de sangre recogida, junto con los niveles de suero ALT.

EJEMPLO 8

ARNsi modificado puede prepararse mediante síntesis química. En una realización cada C y U dentro de un duplicado ARNsi, por ejemplo, GL2, puede sustituirse por 2’-F-U y 2’F-C. Para producir ARNsi con salientes en el extremo 3’ que comprenden 2’-F-U y 2’F-C, puede usarse un soporte universal. Partiendo selectivamente el oligo del soporte, un médico puede asegurar que los residuos de los salientes comprenden nucleótidos modificados. Alternativamente, los nucleótidos que comprenden el saliente del extremo 3’ puede ser dTdT no modificado.

Los oligonucleótidos de ARN 2’-F pueden sintetizarse en un sintetizador Applied Biosystems 8909 o 8905 ADN/ARN usando el protocolo estándar de química de ARN de fosforamidita beta-cianoetilo de 1 µmol. Los monómeros y columnas de ARN fosforamidita de Pac-A, 2’-F-Ac-C, iPr-Pac-G, 2’-F-7, y U-ANN CPG pueden obtenerse en Glen Research (Sterling, VA). (Véanse catálogos números 1’-3000-05, 10-3415-02, 10-3021-05, 103430-02 y 20-3430-41E, respectivamente). El reagente sulfurizante de la investigación de Glen (catálogo números 40-4036-10) puede usarse como un antioxidante para obtener un único eje central de fosforotioato entre el 3’ CPG y una base posterior. Para conseguir el enlace, la etapa de oxidación del protocolo estándar de ARN 1 µmol se sustituyó por el protocolo estándar de tioato 1 µmol. Colesteril-TEG fosforamidita (Glen Research, catálogo número 10-1975-90) y colesteril-TEG CPG (Glen Research, catálogo número 20-2975-41E) pueden incorporarse a los extremos 5’ y 3’ de uno o más oligorribonucleótidos. Después de la síntesis, los 2’-F ARNs se parten y desprotegen con 1:1 hidróxido de amonio/metilamina, y los grupos silil se retiran con trihidroflururo de trietilamina usando protocolos estándares. Véase, por ejemplo, http://www.glenres.com/productfiles/technical/tb_rnadeprotection-pdf. Los oligorribonucleótidos se desalan después en columnas Sephadex G25 (Pharmacia NAP 25, catálogo número 1708252-02) con agua esterilizada y se purifican usando protocolos estándares de electroforesis de gel. Los ARNsis modificados también pueden obtenerse de vendedores comerciales tales como Dharmacon (Lafayette, CO).

Alternativamente, ARNsi modificado puede prepararse mediante transcripción usando el Kit de

Transcripción Durascribe™ T7 comprado en Epicentre Technologies (Madison, WI).

Los ARNsis modificados (ARNdc) hechos mediante estos métodos contienen fosfodiéster unido a oligonucleótidos. Los métodos estándares para hacer ARNs de única cadena modificados, tales como moléculas antisentido, son útiles para hacer ARNsis modificados, ya que ARNs de única cadena modificados pueden templarse juntos para formar ARNs de doble cadena. Tales métodos estándares incluyen, aunque no se limitan a, aquellos descritos en Chiang et al., J. Biol. Chem. 266, 18162-18171 (1991); Baker et al., J. Biol. Chem. 272, 11994-12000 (1997); Kawasaki et al., J. Med. Chem. 36, 831-841 (1993); Monia et al., J. Biol. Chem. 268, 14514-14522 (1993).

EJEMPLO 9

Para analizar si ARNsi dirigido al genoma de VHC confiere inmunidad intracelular contra este patógeno humano, se usó un sistema de cultivo celular de VHC recientemente desarrollado en línea celular de hepatoma humano, Huh-7. Una de estas líneas celulares, 5-2, alberga ARN de VHC subgenómico replicante autónomamente (Bartenschlager, J. Virol, 2001). El replicón subgenómico lleva el gen de luciferasa de luciérnaga, permitiendo un ensayo de función del reportero como una medida de réplica de ARN de VHC. Debido a las mutaciones adaptivas del cultivo celular introducidas en el genoma, las células 5-2 replican ARN de VHC en niveles de hasta 5 x 104 virus partícula/célula.

Usando la transcripción T7, se hicieron varias duplicaciones de 21-bps ARNsi contra diferentes regiones de 5’-UTR del genoma de VHC. En resumen, se generaron 2 moléculas oligo de ADN de doble cadena que comprendían el promotor T7 y 5’-UTr de VHC orientado a la dirección sentido o dirección antisentido. Cada ADN oligo se transcribió después in vitro para producir ARN (+) y (-) y después se trató con ADNasa I para retirar la plantilla de ADN. Las dos cadenas de ARN se dejaron templar a 37 ºC durante la noche, generando ARNdc. Después de tratar el ARNdc con ARNasa T1 para retirar especies de ARNss que no reaccionaron, el ARNdc se purificó para transfección.

Más abajo se proporcionan dos ARNsis modificados ejemplares:

Cada C y U en ARNsi GL2, dirigido contra el gen de luciferasa de la mosca de la fruta, se sustituyó por 2’-F-U y 2’F-C. Los ARNsis modificados se transfectaron a células 5-2 usando técnicas estándares de transfección de liposomas. Específicamente, los ARNsis modificados se incubaron durante 4 horas a 37 ºC en una suspensión celular de 250 µl que contenía 0,5 µl de Oligofectamina (Invitrogen, Carlsbad, CA), durante 20 horas en medio de cultivo que contenía 375 µl, y durante 24 horas a 37 ºC en medio fresco sin complejo liposoma-ARNsi. La actividad de luciferasa se midió 48 horas después de la transfección para determinar el efecto de los ARNsis modificados en la réplica de VHC.

La Figura 11 muestra que GL2 redujo la actividad de luciferasa en concentraciones crecientes. La actividad de luciferasa se redujo un 90% en células transfectadas con 2’-F-GL2, pero no se vio una reducción significativa en células transfectadas de imitación o con un control (2’-F-GFP = proteína verde fluorescente). En ensayo de luciferasa se realizó usando un sistema de ensayo de Luciferasa disponible en Promega Corp. (Madison, WI), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

El ARNsi Col-GL2 comprende un grupo colesteril en uno de los extremos 5’. Las células 5-2 se incubaron con varias concentraciones de Col-Gl2 en ausencia de liposomas. Las células se cosecharon 48 horas después y se analizaron para la actividad de luciferasa. La Figura 12 muestra que Col-GL2 inhibió la actividad del gen de luciferasa en una manera dependiente de dosis. InvA se refiere a col-GL2 en secuencia invertida.

EJEMPLO 10

Para comprobar la estabilidad de ARNsi 2’ químicamente modificado en comparación con ARNsi no modificado (ARNsi), se realizó el siguiente experimento. Se añadieron cuatro nanogramos de ARNsi a un volumen de 20 µl de 80% suero humano de un donante sano. La mezcla se incuba a 37 ºC durante varios momentos que oscilan entre 1 minuto y 10 días. Los resultados se representan en calles 2-10 de la Figura 13. Se realiza el mismo proceso para ARNsi modificado con 2’-flúor (2’-F ARNsi) también y los resultados se muestran en las calles 11-20 y 22-25 de la Figura 3. Cuando el proceso de incubación se acaba, las mezclas se colocan en hielo y después inmediatamente se separan por PAGE junto con un control 32P-ARNsi (Véase calles 1, 11 y 21 de la Figura 13). Los datos muestran que ARNsi modificado 2’ es estable durante un periodo de 10 días en comparación con ARNsi no modificado.

EJEMPLO 11

Para demostrar la producción de ARNsi modificado de ARNdc largo, se incubaron cinco nanogramos de ARNdc fluorizado de 1000-bp de longitud (Figura 14, panel (A)) se incubaron durante la noche con 15 unidades de Dicer humano a 37 ºC. Los ARNsis troceados se purificaron usando una columna Sephadex G-25 y se sometieron a electroforesis en 20% PAGE (Figura 14, panel (B)). La Figura 4 muestra que el dicer humano recombinante convierte de manera efectiva ARNdc-fluorizado en 2’F-ARNsi.

EJEMPLO 12

Para analizar más si ARNsi dirigido al genoma de VHC confiere inmunidad intracelular contra este patógeno humano, se empleó el ensayo descrito en el Ejemplo 1 para analizar ARNsiC1, ARNsiC2, ARNsi5B1, ARNsi5B2 y ARNsi5B4, mostrándose cada uno de ellos en la Figura 2. Cada ARNsi se analizó en concentraciones de 1 nM, 10nM y 100 nM. Como se muestra en la Figura 15, cada uno de los ARNsis inhibió de manera significativa la actividad de luciferasa en una manera dependiente de dosis. ARNsiC2 mostró una particular efectividad.

EJEMPLO 13

Como un seguimiento a los experimentos presentados en el Ejemplo 9, se realizaron ensayos para demostrar que la modificación de colesterol, y no la modificación de flúor se dirigió moléculas de ARNsi a células del hígado Huh-7. Las células Huh-7 se incubaron con varias concentraciones de dos tipos de ARNsis Col-GL2: uno que tenía la modificación 2’-flúor y el otro que carecía de tal modificación. Los resultados, mostrados en la Figura 16 demuestran que la entrega de molécula de ARNsi modificadas con colesterol a células del hígado se debe al colesterol, y no a otras modificaciones.

EJEMPLO 14

ARNsi se modificó para incluir pirimidinas 2-Flúor en lugar de todas la pirimidinas (2’-F-ARNsi). Este 2’-F-ARNsi se modificó además para incluir una secuencia “TT” de deoxinucleótidos de dos bases añadida a los extremos 3’ de la molécula en lugar de los salientes “UU” de ribonucleótido presentes en 2-F-ARNsi (2’-F-ARNsi 3’-X). La Figura 17 demuestra que la modificación adicional del ARNsi 2’ fluorizado para incluir una terminal 3’’’dTdT’’ dio como resultado un aumento significativo en la estabilidad del ARNsi en suero humano.

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un ARN de doble cadena modificado (ARNdc) o ARN corto de interferencia (ARNsi) que interactúa con una secuencia diana de ribonucleótido de virus de hepatitis C (VHC), virus de hepatitis A, virus de hepatitis B, virus de hepatitis D o virus de hepatitis E, donde dicho ARNdc o ARNsi se une al colesterol, en conjunto con un fármaco reductor de colesterol que es una estatina, resina, gemfibrozilo o clofibrato, para su uso en un método terapéutico para inactivar el virus.

2. 2.

   El ARN modificado y fármaco reductor de colesterol de la reivindicación 1, donde dicho ARNdc modificado o

   ARNsi modificado e 2’ modificado.

3. 3.

   El ARN modificado y fármaco reductor de colesterol de la reivindicación 1, donde dicha modificación se selecciona del grupo consistente en modificación fluoro-, metil-, metoxietil- y propil-.

4. 4.

   El ARN modificado y fármaco reductor de colesterol de la reivindicación 1, donde dicha modificación fluoro-es una modificación 2’-fluoro- o una modificación 2’,2’-fluoro.

5. 5.

   El ARN modificado y fármaco reductor de colesterol de la reivindicación 1, donde al menos una pirimidina de dicho ARNdc o ARNsi se modifica, y dicha pirimidina es citosina, un derivado de citosina, uracil o un derivado de uracil.

6. 6.

   El ARN modificado y fármaco reductor de colesterol de la reivindicación 1, donde dicho ARNdc o ARNsi

   comprende una secuencia “TT” de deoxinucleótido de dos bases en su extremo 3’.
7. 7. El ARN modificado y fármaco reductor de colesterol de la reivindicación 1, donde dicho ARNsi se prepara:

   (a)

   identificando una secuencia diana de nucleótido en un genoma de virus para diseñar un ARN corto de interferencia (ARNsi), y

   (b)

   producir un ARNsi que se ha modificado para contener al menso un nucleótido modificado.

8. 8.

   El ARN modificado y fármaco reductor de colesterol de la reivindicación 7, donde dicha secuencia diana de nucleótido se selecciona del grupo consistente en región no trasladada 5’ (5’-UTR), región no trasladada 3’ (3’-UTR), núcleo y helicasa NS3 de VHC.

9. 9.

   El ARN modificado y fármaco reductor de colesterol de la reivindicación 8, donde dicho ARNsi es ARNsi5, como se representa en la figura 1, o ARNsiC1, ARNsiC2, ARNsi5B1, ARNsi5B2 o ARNsi5B4, como se representa en la figura 2.

10. 10.

    El ARN modificado y fármaco reductor de colesterol de la reivindicación 1, donde dicho ARNsi consiste en aproximadamente de 10 a aproximadamente 30 ribonucleótidos.

11. 11.

    El ARN modificado y fármaco reductor de colesterol de la reivindicación 10, donde dicho ARNsi modificado es un ARNsi modificado 2’.

12. 12.

    El ARN modificado y fármaco reductor de colesterol de la reivindicación 11, donde dicha modificación se selecciona del grupo consistente en modificación fluoro-, metil-, metoxietil- y propil-.

13. 13.

    El ARN modificado y fármaco reductor de colesterol de la reivindicación 12, donde dicha modificación fluoro- es una modificación 2’-fluoro- o una modificación 2’,2’-fluoro.

14. 14.

    El ARN modificado y fármaco reductor de colesterol de la reivindicación 13, donde al menos una pirimidina de dicho ARNsi se modifica, y dicha pirimidina es citosina, un derivado de citosina, uracil o un derivado de uracil.

15. 15.

    El ARN modificado y fármaco reductor de colesterol de la reivindicación 10, donde dicho ARNsi comprende una

    secuencia “TT” de deoxinucleótido de dos bases en su extremo 3’.
16. 16. El ARN modificado y fármaco reductor de colesterol de la reivindicación 10, donde ambas cadenas de dicho ARNsi contienen al menos un nucleótido modificado.