PL161997B1 - bialka S i PreS2 PL PL - Google Patents

Abstract

1 . Sposób wzmozonego wytwarzania antygenowych czastek HBV zawierajacych za- sadniczo bialka S i PreS2, znamienny tym, ze transformuje sie drozdze metylotroficzne co najmniej jedna kaseta ekspresyjna zawierajaca gen struktury S, funkcjonalnie polaczony z regionem regulatorowym i terminacyjna sekwencja 3’, oraz co najmniej jedna kaseta ekspre- syjna zawierajaca gen struktury PreS2, funkcjonalnie polaczony z regionem regulatorowym i terminacyjna sekwencja 3’, a nastepnie prowadzi sie hodowle powstalego transformowane- go szczepu drozdzy w warunkach odpowiednich do wytworzenia czastek HBV. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wzmożonego wytwarzania antygenowych cząstek HBV zawierających zasadniczo białka S i PreSżWirus hepatitis B(HBV) powoduje zarówno ostre, jak i przewlekłe choroby i stanowi problem zdrowotny o zasięgu światowym. Hepatitis B ma postać przewlekłego upośledzającego zakażenia, które może doprowadzić do postępującego, ciężkiego uszkodzenia wątroby, pierwotnego raka i śmierci. W większości przypadków dochodzi do całkowitego wyzdrowienia pacjentów z zakażeniem HBV. Jednak znaczna część populacji zakażonej HBV staje się chronicznymi nosicielami wirusa z możliwością przenoszenia choroby na innych.

Ostatnie postępy w technice rekombinowania DNA dostarczyły wielu użytecznych metod wyjaśniania struktury genetycznej HBV, jak i środków do wytwarzania szczepionek przeciw HBV. Wiadomo obecnie, że genom HBV zawiera w przybliżeniu 3,2 kb częściowo dwuniciowego DNA z kowalencyjnie przyłączoną polimerazą DNA zamknięte w 27 nm nukleokapsydzie. Nukleokapsyd jest otoczony osłonką lipoproteinową, składającą się z lipidów komórkowych i antygenów powierzchniowych wirusa hepatitis B(HBsAg), a całość zwana jest wirionem i ma 42 nm średnicy.

Odkryto również, że osłonka wirusowa składa się z trzech różnych, jakkolwiek pokrewnych białek powierzchniowych. Te białka określane są na ogół symbolami S, PreS2 i PreSi. Każdy wirion zawiera 300 - 400 cząsteczek białka S i 40 - 80 cząsteczek białka PreS2 i PreSi.

Białko S składa się z 226 aminokwasów i jest głównym składnikiem normalnej lipoproteinowej osłonki wirusowej. Białko S ma około 24 - 25 kilodaltonów (kDa) i może być określane symbolami P24 lub P25. Białko S może być glikozylowane do glikoproteiny o 27- 28 kDa określanej symbolami GP27 lub GP28.

Drugim białkiem HBsAg jest antygen powierzchniowy PreS2 zwany również pośrednim polipeptydem HBsAg. PreS2 składa się z 281 aminokwasów i jest utworzony przez dodanie 55 aminokwasów do N- końca białka S. Białko PreS2 ma około 31 kDa i może być oznaczane symbolem P31. Białko PreS2 występuje również w dwu postaciach glikozylowanych, o 33 i 36 kDa, zwanych odpowiednio GP33 i GP36. Uważa się, że ten antygen pobudza dodatkową odpowiedź antygenową u osób, które nie odpowiadają na S lub odpowiadają słabo na S.

Trzecim białkiem HBsAg jest antygen powierzchniowy PreSi, zwany również późnym polipeptydem HBsAg. PreSi składa się z 389 - 400 aminokwasów, zależnie od antygenowego podtypu HBV. Sekwencja unikalna dla PreSi składa się ze 108 - 119 aminokwasów, które są dodane do N-końca całkowitego białka PreS2. Białko PreSi ma około 43 KDa i może być także zwane P43. PreSi istnieje również w postaci glikozylowanej o 46 kDa, zwanej glikoproteiną GP46.

W toku zakażenia HBV kompletny nukleokapsyd wirusowy jest otoczony osłonką lipoproteinową tworząc cząstki o długości 42 nm. Podczas zakażenia HBV tworzone są też puste 22 nm cząstki składające się głównie z białek S i PreS2, oraz pewnej ilości białek PreSi. Kompletne nukleokapsydy wirusowe są zakaźne, zaś puste 22 nm cząstki są niezakaźne. Tym niemniej, puste cząstki pobudzają odpowiedź immunologiczną wystarczającą do nadania odporności i można ich użyć do wytwarzania szczepionek przeciw HBV.

Szczepionki przeciw hepatitis B, wytwarzane z udziałem cząstek 22 nm, wytwarzano w przeszłości z osocza ludzi nosicieli HBV. Wadą tego rozwiązania jest to, że 22 nm cząstki otrzymane z osocza ludzkiego muszą być dokładnie oczyszczane w celu usunięcia zakaźnych cząstek HBV, jak również wszystkich patogenów pochodzących z osocza. Oprócz tego, wytwarzanie szczepionki przeciw hepatitis B było w znacznym stopniu ograniczone z powodu ograniczonej dostępności osocza ludzkiego.

Przy zastosowaniu biotechnologii rekombinowania DNA możliwe było doprowadzenie do ekspresji białka S hepatitis z 22 nm cząstki np. w transformowanych liniach komórkowych ssaków i Saccharomyces cerevisiae. Stosowane obecnie układy komórkowe ssaków są kosztowne w użyciu, a układy Saccharomyces dają stosunkowo niewielką wydajność białka S.

Wysiłki w celu wyprodukowania antygenowego i potencjalnie bardziej skutecznego w charakterze szczepionki białka PreS2 okazały się niezwykle uciążliwe. Stwierdzono, że białko PreS2 jest bardzo podatne na proteolizę w układach rekombinowanych. Proteoliza daje dwa mniejsze fragmenty białkowe, które nie zachowują antygenowości PreS2. Oprócz tego bardzo trudno było przeprowadzić ekspresję białka PreS2 w układach rekombinowanych. Poziom ekspresji PreS2 odpowiada w przybliżeniu 0,1 poziomu ekspresji białka S wytworzonego w tych samych układach rekombinowanych.

Tak więc byłoby znaczącym wkładem w tej dziedzinie techniki opracowanie sposobu wytwarzania antygenowych cząstek HBV zawierających białko S i białko PreS2 HBV. W tych cząstkach główne białko S byłoby połączone z potencjalnie silniej antygenowym białkiem PreS2 w postaci bardziej skutecznej w charakterze szczepionki.

Celem wynalazku jest więc zapewnienie sposobu wzmożonego wytwarzania antygenowych cząstek HBV składających się zasadniczo z białka S i białka PreS2 HBV.

Wynalazek zapewnia także nowe wektory zawierające sekwencje DNA kodujące białko S i białko PreS2 z HBv, jak również nowe drożdże metylotroficzne transformowane wektorem lub wektorami zdolnymi do wzmożonego wytwarzania cząstek HBV składających się z białka S i nie glikozylowanego białka PreS2.

Sposób wzmożonego wytwarzania antygenowych cząstek HBV według wynalazku polega na tym, że transformuje się drożdże metylotroficzne co najmniej jedną zgodną z gospodarzem kasetą ekspresyjną zawierającą gen struktury białka S i co najmniej jedną zgodną z wektorem kasetą ekspresyjną zawierającą gen struktury białka PreS2 i prowadzi się hodowlę powstałych transformantów w warunkach odpowiednich do doprowadzenia do wytwarzania tych cząstek.

Fig. 1 przedstawia plazmid pA0801, który jest plazmidem pochodzącym od pBR322, bez miejsca EcoRI w pozycji 1, i który ma miejsce Bglll w miejscu PvuII pBR322, zawierając fragment BglII/XhoI o 700 kb sekwencji terminacyjnej 3Ά0Χ1 z pBSAGI5I (NRRL nr 18021).

Fig. 2 przedstawia plazmid pA0802, który jest pochodną plazmidu pA0801, zawierającą kasetę ekspresyjną promotor-gen-terminator z plazmidu pBSAGI5I (NRRL nr 18021), włączoną w miejscu Ciał plazmidu pA0801.

Fig. 3 przedstawia plazmid pA0803, który pochodzi z pA0802, z którego usunięto sekwencję kodującą HBdAg przez trawienie Stul- EcoRI i który ma miejsce EcoRI włączone w tym samym miejscu.

Fig. 4 przedstawia plazmid pA0811, który otrzymano z plazmidu pA0803 przez trawienie pA0803 BamHI i wprowadzenie fragmentu o 2,0 kb zawierającego gen ARG4 Saccharomyces.

Fig. 5A przedstawia schemat konstrukcji plazmidów pA0801 i pA0802.

Fig. 5B przedstawia schemat konstrukcji plazmidów pA0803 i pA0811.

Fig. 6 przedstawia HBV zawierający gen PreS2 HBV serotypu adw. Plazmid AM6 jest pochodną genomu HBV przedstawionego na fig. 6, przy czym plazmid pBR322 strawiony BamHI jest wprowadzony w miejscu BamHI w pozycji 26. Miejsca restrykcyjne w AM6 (HBV) to:

Ava I	1461
Barn HI	1398
BamHI	26
BglH	1982
Bgin	2403
BglH	2427
Bst E Π	2819
Dra I	829
Dra I	2180
Hae Π	1435
Hinc Π	215
Hinc Π	959
Hinc Π	1680
Hinc Π	2584
Hinc Π	3115
Hpa Π	1303
Hpa Π	1568
Hpa Π	2328

161 997

Pstl 21

Stu I 965

Stul 1110

Stu I 1697

Xba I 245

Fig. 7 przedstawia plazmid pYM4, który pochodzi z plazmidu pBR322, zawierający gen HIS4 Pichia pastoris wprowadzony w miejscu BamHI. Nawiasy kwadratowe wskazują, że miejsce było zniszczone. Gen HIS4 jest zdeponowany jako pYJ30 (NRRL B-15890).

Fig. 8 przedstawia plazmid ρΥΜΙΟ. PYM10 jest pochodną pYJ30 (NRRL B-15890) ze zniszczonym miejscem BamHI w pozycji 2959. Nawiasy kwadratowe w figurze wskazują zniszczone miejsce restrykcyjne.

Fig. 9 przedstawia plazmid pA0804, który zawiera liniowy wektor integracyjny specyficzny względem miejsca, we fragmencie od BglII do BgUI (zgodnie z ruchem wskazówek zegara). Gen struktury można wprowadzić w unikalne miejsce EcoRI tego plazmidu.

Gen struktury PreS2 jest dobrze znany a jego sekwencję ustalił Lo (Characteristics of PreS2 Region of Hepatitis B Virus, Biochemical and Biophysical Research Communications, 135,382 /1986/). Liczni badacze klonowali ten gen struktury i doprowadzili do jego ekspresji, np. Lo i Valenzuela (Synthesis and Assembly in Yeast of Hepatitis B Surface Antigen Particles Containing the Polyałbumin Receptor, Biotechnology, 3, 317 /1985/). Tak więc, gen struktury można syntetyzować lub ponownie wyodrębnić. Uznaje się również, że dla praktycznej realizacji sposobu według wynalazku można użyć każdego serotypu PreS2.

Gen struktury S jest również dobrze znany, a jego sekwencję ustalił Lo (jak wyżej). Gen struktury można nabyć w handlu, syntetyzować lub ponownie wyodrębnić. Uznaje się również, że dla praktycznej realizacji sposobu według wynalazku można użyć każdego serotypu S.

Gen struktury PreS2 serotypu adw używany w sposobie według wynalazku otrzymano z plazmidu AM6. Plazmid AM6 jest pochodną genomu HBV przedstawionego na fig. 6, podczas gdy plazmid pBR322 jest wprowadzony w miejscu BamHI w pozycji 26. Sekwencję nukleotydów tego genu struktury PreS2 przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 1

10 20 30 40

G A A TT CA T GC AGTGGAACTCCACTGCCTTCCACCAAACTC

Start PreS50 60 70 00

TGCAGGAT CCCAGAGT C AGGGGT CT G TAT CT T CCT GT TGG

100 110 120

T GGCTCCAGT T C AGGAACAG T A A A C CC T GC 1 CCG A AT AT T

130 140 150 160

GCCT CTC AC AT CT CGTC A AT T T CCGCG AGG AC T G GGG ACC

170 172 180 190 200

CT GT G ACGA AC A T GGAG A ACA T C A C A T C A G G ΔT 1 C C T AGG

210 220 230 240

ACCCCTGCT CGT GT TAC AGGCGGGGT T T T T CT T GT T GACA

250 260 270 280

AGAATCCTC AC A AT ACCGC AG AGT C T AC AC T CGT GGT GG A

290 300 310 320

CT TC T CT CA A T T T T CT AGGGGGAT C T CCCGT GT G TC TT GG

330 340 350 360

CCAAA AT T CGCAGT CCCCAACCT CC A AT CAT T C AC C A ACC

c.d. tabeli 1

370 380 390 400

TCCTGTCC T CCAATTTG3C C TGGTTATCG C TGGATG TG T C

410 420 430 440

TGCGGCGT T TTATCATATT C CTCTTCATC C TGCTGC TA T G

450 460 460 480

CCTCATCTTCTTATTGGTTCTTCTGGATTATCAAGGTATG

490 500 510 520

T TGCCCGTT TGT CCTCT AAT TCCAGGAT CA AC A AC A ACC A

530 540 550 560

GTACGGGACCATGCAAAACCTGCACGACTCCTGCTCAAGG

570 580 590 600

CAACTCTATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACG

610 620 630 640

G ATGGAA A T TGCACCTGT AT TCCCATCCCACCGT CC TGGG

650 660 670 680

CTTTCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTT

690 700 710 720

CTCT TGGCTCAGT T T ACT AGTGCC AT T TGTTCAGT GGT TC

730 740 750 760

GTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTT T C A G C T A TA T G G A

770 780 790 800

T GAT GT GGT A T T GGGGGCCAAGTCTGTAC AGCAT CGTGAG

810 820 830 840

T CCC T T T A TACCGC TGT TACCAAT T T TC T T T TG TCTCT GG

850 852

GTATACATTTAA kodon stop

Plazmidy używane w sposobie według wynalazku można hodować w każdym odpowiednim gospodarzu E. coli, takim jak MC 1061.

Z plazmidu AM6 odzyskano dwa segmenty genów struktury PreS2, a sekwencję nukleotydów dla pierwszych 13 aminokwasów z N-końca syntetyzowano in vitro. Syntezę sekwencji nukleotydów stosowanych w sposobie według wynalazku można przeprowadzić chemicznie albo enzymatycznie, np. metodami znanymi w chemii trójestrów kwasu fosforowego, fosforanów lub cyjanoetylofosforamidyny.

Region kodujący C-koniec obejmujący 75% genu struktury PreS2 otrzymano z plazmidu AM6 przez trawienie plazmidu Dral. Trawienie Dral przeprowadza się z użyciem dostępnej w handlu endonukleazy Dral (wszystkich endonukleaz używano według wskazówek wytwórców). Następnie ekstrahowano fragmenty Dral fenolem i wytrącano etanolem.

Oktamerowy linker Stul (AAGGCCTT) otrzymano następnie zgodnie ze znanymi technikami syntezy DNA i ligowano z fragmentami Dral, stosując ligazę DNA T4 w ligowaniu tępych końców. Ligowanie zakończono ekstrakcją fenolem i potem wytrącaniem etanolem. Pozostałe fragmenty trawiono następnie endonukleazą Stul w celu usunięcia multimerów Stul.

Fragmenty z linkerami Stul trawiono następnie Xbal. Powstały fragment StuL/XbaI o około 600 kb, zawierający region genu struktury PreS2 kodujący C-koniec, wyodrębniono za pomocą elektroforezy w żelu.

Ten fragment o 600 kb ligowano następnie przy użyciu ligazy T4 do materiału o 5,7 kb, powstałego w wyniku trawienia Xbal/Stu plazmidu pYM4 (fig. 2), który wyodrębniono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.

Mieszaniny po ligacji użyto następnie bezpośrednio do transformowania kompletnych komórek E. coli (MC 1061), które hodowano potem w obecności ampicyliny.

Kolonie transformowane z dobrym wynikiem wyselekcjonowano i wyekstrahowano plazmidowy DNA metodą Bimboima i Doly’ego (Nucleic Acids Research, 7, 1513 (1979)).

Wyekstrahowany plazmidowy DNA trawiono Stul, wyekstrahowano fenolem i wytrącono etanolem. Otrzymano linkery EcoRI i ligowano do fragmentów Stul. Nadmiar linkerów usunięto przez trawienie EcoRI. Te fragmenty z linkerami EcoRI trawiono następnie Xbal i poddano elektroforezie w celu wyodrębnienia fragmentów zawierających C-końcową część genu struktury PreS2.

Mieszaninę po strawieniu XbaI-EcoRI poddano ligacji do pUC18 przeciętnego Xbal-EcoRI. Mieszaniną ligacyjną transformowano kompetentne komórki E. coli (MC 1061), które hodowano następnie w obecności ampicyliny. Transformowane komórki zawierające C- końcową część genu struktury PreS2 wyselekcjonowano stosując analizę polegającą na częściowym trawieniu przy zastosowaniu Ciał i Xbal. Plazmid wyselekcjonowany tym sposobem oznaczono pHS2-B.

Środkową część genu PreS2 odzyskano przez trawienie plazmidu AM6 Xbal i BamHI. Pożądany fragment o 250 kb wyodrębniono za pomocą elektroforezy w żelu. Fragment XbaI/BamHI o 250 kb ligowano następnie do pUC18 strawionego Xbal i BamHI i użyto go do transformowania E. coli MC 1061. Hodowle, które rosły w obecności ampicyliny analizowano przez odzyskanie plazmidowego DNA i trawienie go BamHI. Te plazmidy, które zawierały liniowy fragment o 2,7 kb w elektroforezie, uważano za mający pożądany fragment o 250 kb. Wyodrębniono jedną transformowaną kolonię zawierającą fragment o 250 kb i poddano hodowli w dużej skali. Z kolonii, która została strawiona E. coli i BamHI wyodrębniono plazmidowy DNA i oczyszczono. Pasmo wektora wyodrębniono za pomocą elektroforezy. Następnie wektor ligowano z następującym dwuniciowym oligonukleotydem, poddanym działaniu kinazy:

Pstl BamHI

5' AATTCAATCCGTCTGCAG 3' 'GTTAGGCAGACGTCCTAG 5'

Mieszaniny reakcyjnej po ligacji użyto do transformowania E. coli MC1061 i kolonie z prawidłowym insertem wyselekcjonowano pod względem oporności na ampicylinę. Ten plazmid oznaczono pPS2.

N-koniec regionu kodującego PreS2 otrzymano jako syntetyczny oligonukleotyd o następującej sekwencji:

Hnlll Pstl

5' AGCTTGAATTCATGCAGTGGAACTCCACTGCCTTCCACCAAACTCTGCA 3'

ACTTAAGTACGTCACCTTGAGGTGACGGAAGGTGGTTTGAG 5'

Tę sekwencje klonowano do pUC 18 strawionego HindUI i Pstl. Pożądane transformanty scharakteryzowano na zasadzie obecności fragmentu o około 75 kb po strawieniu EcoRI i elektroforezie. Plazmidy wyselekcjonowane tą metodą oznaczono pTBO-2A.

Środkową część genu dołączono w wyniku trawienia pTBO-2A Pstl i Xbal. Insert był fragmentem Pstl-Xbal o 250 kb z pPS2. Transformanty scharakteryzowano na zasadzie obecności fragmentu EcoRI o ponad 300 kb, jak i fragmentu XbaIZHndIłI o 290 kb. Prawidłowy izolat nazwano pTBO-3. Całkowity gen PreS2 uzyskano za pomocą wprowadzenia fragmentu HindIII/XbaI z pTBO-3 do pHS2B strawionego XbaI/HindIIL Oporne na ampicylinę transformanty scharakteryzowano na zasadzie obecności fragmentu EcoRI o 825 kb. Konstrukcje tę nazwano pTBO4.

Hodowlę E. coli szczepu wyszczególnionego powyżej można przeprowadzić w każdy odpowiedni sposób. Ogólne metody hodowli E. coli są już znane w tej dziedzinie techniki i dowolna z adaptacji tych metod do specyficznych wymagań szczepów używanych w sposobie według wynalazku leży w możliwościach fachowców.

Odzyskiwanie plazmidowego DNA z E. coli można przeprowadzić różnymi metodami w zależności od jego wielkości w stanie zagęszczonym, jak i zamkniętej przestrzennej postaci superheliksu. Na przykład, po zbiorze komórki-gospodarza można osadzić przez odwirowanie, a następnie ponownie zawiesić i poddać lizie. Lizat trzeba odwirować w celu usunięcia komórkowego debris i zatrzymać supematant zawierający DNA. Można przeprowadzić ekstrakcje fenolem w celu usunięcia z DNa większości innych zanieczyszczeń. Na DNA ekstrahowany fenolem można dalej działać stosując wirowanie w gradiencie gęstości, albo sączenie żelowe w celu oddzielenia plazmidowego DNA od bakteryjnego DNA. Techniki oddzielania są dobrze znane w tej dziedzinie techniki.

Trawienie plazmidu nukleazami można przeprowadzić przez wybranie odpowiednich endonukleaz, które przetną wyselekcjonowany plazmid w taki sposób, żeby ułatwić odzyskanie genu struktury PreS2. Użyte endonukleazy będą zależeć od plazmidu, z którego gen struktury PreS2 ma być wycięty. Na przykład, gen struktury PreS2 zawarty w plazmidzie AM6 można odzyskać jak to opisano w przykładzie I.

Elektroforezę DNA w żelu można przeprowadzić stosując liczne techniki znane w tej dziedzinie, np. opisane przez P.G. Sealy’a i E.M. Southema w Gel Electrophoresis of Nucleic Acids - A Practical Approach, (wyd. D. Rickwood i B.D. Haraes), str. 39 (1982). Elucję można również przeprowadzić stosując liczne techniki właściwe dla użytego żelu, takie jak elektroelucja, dyfuzja, rozpuszczenie żelu (żele agarozowe) lub fizyczne wyciskanie żelu (żele agarozowe). Uznano też, że elucja może nie być konieczna w przypadku niektórych żelów, takich jak wysokiej jakości agaroza o niskiej temperaturze topnienia.

Gdy fragment (lub fragmenty) zawierający gen struktury PreS2 zostanie wyodrębniony, mogą być konieczne dodatkowe zabiegi przed wprowadzeniem go do wektora. Te zabiegi mogą obejmować, chociaż nie tylko, dodanie linkerów lub doprowadzenie do tego, aby końce fragmentu były tępe.

W jednym z wariantów realizacji sposobu według wynalazku gen S skonstruowano z genu PreS2 na drodze mutagenezy M13. Mutagenezy M13 użyto do delecji pierwszych 165 kb (kodujących pierwsze 55 aminokwasów genu struktury PreS2) z doprowadzeniem do insercji miejsca EcoRI bezpośrednio 5' wobec kodonu start (ATG) genu struktury S. Techniki mutagenezy M13 są dobrze znane fachowcom. Jedną z reprezentatywnych technik, której można użyć, jest technika Zollera i Smitha (Methods in Enzymology, 100, 468 (1983)). Wektory M13 i odczynniki niezbędne do mutagenezy są dostępne w handlu, (np. New England Biolabks).

Mutagenezę, jak opisano powyżej, zaczęto od wprowadzenia genu struktury PreS2 do dwuniciowej replikatywnej postaci kolistej, czyli RF, wektora M13 (wybrano ml3mpl8 z powodu łatwości jego użycia, chociaż można było użyć innych wektorów M13). Gen struktury PreS2 w plazmidzie pTBO4 można namnażać w E. coli MC1061, oraz wyodrębnić plazmidowy DNA metodą Bimboima i Doly’ego (jak wyżej). Następnie plazmid pTBO4 strawiono EcoRI. Fragment EcoRI o około 825 kb zawierający gen struktury PreS2 wyodrębniono za pomocą elektroforezy w żelu. Następnie wprowadzono ten fragment do miejsca EcoRI w ml3mpl8. Mieszaniny po ligacji użyto następnie do transformacji kompetentnych komórek bakteryjnych, takich jak JM101 lub JM 103. Transformanty selekcjonowano na podstawie reakcji barwnej, która wskazywała, że pożądany fragment miał przerwany gen β-galaktozydazy i mógł tworzyć łysinki jasne zamiast niebieskich na płytkach indykatorowych. Orientacje insercji można ustalić przez sekwencjonowanie, trawienie endonukleazami i elektroforezę w żelu, lubjakąkolwiek inną odpowiednią techniką. Wyodrębniono i użyto do pierwszej mutagenezy jeden klon, w którym inicjator metioniny został włączony tuż przy uniwersalnym primerze M13.

Następnie zsyntetyzowano in vitro krótki oligonukleotyd o następującej sekwencji nukleotydów:

CGGGT-ACCGA-GCTCG-AATTC-ATGGA-GAACA-TCACA-TCAGG

Syntetyczne sekwencje używane w sposobie według wynalazku można wytwarzać albo enzymatycznie, albo chemicznie. Odpowiednie środki obejmują, chociaż nie są do nich ograniczone, metody chemiczne zwane w chemii trójestrów kwasu fosforowego, fosforynów lub cyjanoetylofosforamidynu.

Otrzymano jednoniciową postać M13 z wprowadzonym genem struktury. Syntetyczny oligonukleotyd, który jest częściowo komplementarny z regionem flankującym 5’ genu PreS2 i końcem 5’ regionu kodującego S, połączono następnie z jednoniciowym wektorem M13 zawierającym gen struktury PreS2. Stosując częściowo komplementarny oligonukleotyd syntetyczny jako primer, prowadzi się syntezę DNA in vitro z fragmentem Klenowa i trójfosforanami oligonukleotydów w temperaturze 4°C. Następnie wydłuża się częściowo komplementarny oligonukleotyd syntetyczny dookoła kolistej matrycy M13. Mieszaniny reakcyjnej użyto do transformowania kompetentnych komórek JMlOl lub JM103. Transformanty poddano skriningowi przez przeniesienie łysinek na nitrocelulozę i przeprowadzenie hybrydyzacji z promieniotwórczo znakowanym oligonukleotydem tak, że mutantowe nici hybrydyzowały, a oryginalna matryca nie hybrydyzowała. Następnie użyto tych mutantów do otrzymania matrycy, którą zastosowano do transformowania JM 1(03. Transformanty poddano ponownie skriningowi, jak poprzednio. Postacie pozytywne z drugiego skriningu poddano sekwencjonowaniu i zidentyfikowano łysinki o prawidłowej sekwencji. Dwuniciową replikatywną postać tych kolonii strawiono następnie EcoRI i wyodrębniono fragment o 678 parach zasad, zawierający gen struktury

S. Sekwencję tę przedstawiono w tabeli 2.

		Tabela	2
170	172	180		190 200
T T C	A T G G A	G A A C A T C	ACA	TCAGGATTCCTAGG
	Start S
210		220		230 240

ACCCCTGCT CG TG T T AC AGGCGGGG T T T T TC T TG T T G ACA

250 260 270 2Θ0

A G A A T CC TC AC A A T ACCG C AG AG TC TAGACT CG T AGTGG A

290 300 310 320

C T TC TC TCA A T T T TC Γ AGGGGG A T C T CCCG TG TGTCT T GG

330 340 350 360

C C A A A A T T C G C 4 G T C C C C AA C C T C C A A T C A C T C A C C A A C C

370 330 390 400

TCC TG T CC T CCAA T T T G TCC TG G T T ATCGC TGG AT G T GTC

410 420 430 440

T G C G G C G T TT T A T C A T 4 11 C C 1 C T Γ C A Γ C C T G C T G C TA T G

450 460 470 480

CC TCA TC TTC T TA T TG G T TC T T C Γ GGA I T A T C AAGGT A TG

490 500 510 520

T T G CC CG T T T G T C C T C Γ A 41 I C C AG G AT C AAC A AC A ACC A

c.d. tabeli 2

530 540 550 560

GTACGGGACCAT GCAAAACCTGCACGACTCCTGCTCAAGG

570 580 590 600

CAACTCTATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACG

610 620 630 640

GA TGGAA AT T GCACC TG TA T TCCC A TCCCA TCGT CC TGGG

650 660 670 680

CTTTCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGT C C G T T T

690 700 710 720

C TC T TGGCT C AG T T T ACT AG TGCC A T T TGT TC AGTGGT TC

G

T

A

G

G

G

C

T

730 T T C C

C

C

C A

C

T

740 G T T

T

G

G

C

T

T

T

750 C A G C

C

A

T

A

T

760 G G A

T

G

A

T

G

T

G

G

770 T A T T

G

G

G G

G

c

780 C AA

G

T

C

T

G

T

A

790 C A G C

A

T

C

G

T

800 GAG

T

C

C

C

T

T

T

A

810 T A C C

G

C

T G

T

T

320 AC C

A

A

T

T

T

T

C

830 T T T T

G

T

C

T

C

840 T G G

G

T

A

T

A

C

A

T

850 852 T T A A kodon i

stop

Po wyodrębnieniu genów struktury S i PreS2, geny te wprowadza się do odpowiedniego dla drożdży metylotroficznych wektora, takiego jak plazmid lub liniowy wektor integracyjny specyficzny względem miejsca. Korzystnymi wektorami w sposobie według wynalazku są wektory zgodne z rodzajem Pichia, a najkorzystniejszymi zgodnie z Pichia pastoris.

Plazmidy od dawna stanowią jeden z podstawowych elementów stosowanych w technologii rekombinowania DNA. Plazmidy to kolisty pozachromosomalny, dwuniciowy DNA występujący w drobnoustrojach. Stwierdzono, że plazmidy występują w komórce w kopii pojedynczej lub w licznych kopiach. W plazmidowym DNA jest zawarta informacja niezbędna dla reprodukcji plazmidu, to jest zawarty jest początek replikacji dla replikacji w bakteriach. W informacji zakodowanej w plazmidzie może także być zawarty jeden lub więcej niżjeden środek do fenotypowego selekcjonowania plazmidu w transformowanych komórkach. Markery fenotypowe lub selekcyjne, takie jak geny oporności na antybiotyki lub geny, które kompensują błędy w szlakach biochemicznych gospodarza pozwalają na rozpoznanie, selekcję i utrzymywanie klonów komórek- gospodarzy, które zostały transformowane.

W celu doprowadzenia do ekspresji genu struktury PreSk w drożdżach metylotroficznych, gen musi być funkcjonalnie połączony z regionem regulatorowym 5' i terminacyjną sekwencją 3’, co tworzy kasetę ekspresyjną, która będzie wprowadzona do gospodarza za pośrednictwem wektora. W celu objaśnienia zostają w niniejszym opisie zdefiniowane następujące terminy.

Funkcjonalnie połączony - odnosi się do zestawienia, w którym komponenty są tak ułożone, że pełnią swoją funkcję.

Region regulatorowy - sekwencje DNA, które odpowiadają na różne bodźce i wpływają na stopień transkrypcji mRNA.

Terminacyjna sekwencja 3’ - sekwencje 3’ do kodonu stop, których funkcją jest stabilizowanie mRNA, takie jak sekwencje, które wywołują poliadenylację.

Zgodnie z gospodarzem - odnosi się do sekwencji DNA, które pełnią swą normalną funkcję w gospodarzach, takich jak regiony regulatorowe i terminacyjne sekwencje 3’ pochodzące z gospodarzy.

Korzystne w sposobie według wynalazku są wektory integracyjne, takie jak liniowy, integracyjny wektor Cregga, specyficzny względem miejsca, jak to opisano w EP-A-0 226 752. Wektory takie obejmują wspomnianą uporządkowaną sekwencję co najmniej 1/ pierwszego fragmentu DNA nadającego się do wprowadzania, 2/ genu markerowego nadającego się do selekcji, oraz 3/ drugiego fragmentu DNA nadającego się do wprowadzania.

Fragmenty DNA nadające się do wprowadzania składają się, każdy z około 200 nukleotydów i mają sekwencje nukleotydów homologiczne z częścią genomowego DNA gospodarza. Różne komponenty liniowego wektora integracyjnego specyficznego względem miejsca są uporządkowane pod względem kolejności, tworząc liniowy fragment DNA, taki jak kaseta ekspresyjna i gen markerowy nadający się do selekcji, umieszczony między końcem 3’ pierwszego fragmentu DNA nadającego się do wprowadzania i końcem 5’ drugiego fragmentu DNA nadającego się do wprowadzania. Pierwszy i drugi fragment DNA nadający się do wprowadzania są zorientowane względem siebie wzajemnie w uporządkowanym pod względem kolejności fragmencie liniowym tak, jak są one zorientowane w genomie macierzystym.

Sekwencje nukleotydów, użyteczne w pierwszym i drugim fragmencie DNA nadającym się do wprowadzania, są sekwencjami nukleotydów homologicznymi z oddzielnymi częściami natywnego miejsca genomowego, w którym ma zachodzić modyfikacja genomu. Tak więc np., jeżeli modyfikacja genomu ma zajść w miejscu genu oksydazy alkoholowej, zastosowane pierwszy i drugi fragment DNA nadające się do wprowadzania będą fragmentami o sekwencjach homologicznych z oddzielnymi częściami miejsca genu oksydazy alkoholowej. Aby zaszła modyfikacja genomu według wynalazku, dwa nadające się do wprowadzania fragmenty DNA muszą być zorientowane względem siebie we fragmencie liniowym w tej samej względnej orientacji, w jakiej istnieją one w genomie macierzystym. Przykładami sekwencji nukleotydów, których można użyć jako pierwszego i drugiego fragmentu DNA nadającego się do wprowadzania, są sekwencje nukleotydów, takie jak genu oksydazy alkoholowej (ΑΟΧ1), genu syntezy dihydroksyacetonowej (DHAS1), genu p40 i genu HIS4. Gen ΑΟΧ1, gen DHAS1, gen p40 i gen HIS4 opisane są w EP-A-O-183 071.

Pierwszy fragment DNA nadający się do wprowadzania może zawierać funkcjonalny region regulatorowy, który może obejmować region regulatorowy użytkowany w kasecie ekspresyjnej. Zastosowanie pierwszego fragmentu DNA nadającego się do wprowadzania jako regionu regulatorowego do kasety ekspresyjnej jest korzystnym sposobem realizacji wynalazku. Fig. 4 przedstawia diagram wektora z zastosowaniem pierwszego fragmentu DNA nadającego się do wprowadzania jako regionu regulatorowego do kasety ekspresyjnej.

Ewentualnie, jak to pokazano na fig. 9, miejsce (lub miejsca) wprowadzania i terminacyjna sekwencja 3’ mogą być umieszczone bezpośrednio 3’ w stosunku do pierwszego fragmentu DNA nadającego się do wprowadzania. To ukształtowanie liniowego wektora integracyjnego specyficznego względem miejsca daje dodatkową korzyść w postaci zapewnienia gotowego miejsca do wprowadzania genu struktury bez niezbędności dodania zgodnej terminacyjnej sekwencji 3’.

Niezbędne jest również włączenie co najmniej jednego genu markerowego nadającego się do selekcji do DNA stosowanego do transformowania szczepu-gospodarza. Ułatwia to selekcję i wyodrębnienie tych organizmów, które włączyły transformujący DNA. Gen markerowy nadaje transformowanemu organizmowi cechę fenotypową, której on nie miał, np. przywrócenie zdolności do wytwarzania specyficznego aminokwasu, gdy nie transformowany szczep-gospodarz wykazuje błąd w szlaku biosyntetycznym specyficznego aminokwasu, bądź nadaje oporność na antybiotyki, itp.

Przykładowymi genami markerowymi nadającymi się do selekcji są gen HIS4 i gen ARG4 z Pichia pastoris i Saccharomyces cerevisiae, gen inwertazy (SUC2) z Saccharomyces cerevisiae lub gen fosfotransferazy neomycynowej z przemieszczalnych elementów Tn601 i Tn903 E. coli.

Fachowcy zrozumieją, że do wektorów używanych w praktycznym zastosowaniu wynalazku można również wprowadzić dodatkowe sekwencje DNA, takie jak DNA plazmidu

161 997 bakteryjnego, DNA bakteriofaga itp. Te sekwencje umożliwiają amplifikację i utrzymywanie się wspomnianych wektorów w gospodarzach bakteryjnych.

Jeżeli pierwszy fragment DNA nadający się do wprowadzania nie zawiera regionu regulatorowego, odpowiedni region regulatorowy trzeba będzie wprowadzić funkcjonalnie łącząc z genem struktury, w celu uzyskania funkcjonalnej kasety ekspresyjnej. Podobnie, jeśli nie zapewnia się terminacyjnej sekwencji 3' przy miejscu wprowadzania w celu skompletowania kasety ekspresyjnej, terminacyjna sekwencja 3' powinna być funkcjonalnie połączona z genem struktury, który ma się wprowadzić.

Fachowcy są świadomi istnienia licznych regionów regulatorowych, które zostały scharakteryzowane i można ich użyć wobec drożdży metylotroficznych. Przykładowe regiony regulatorowe obejmują, chociaż nie są do nich ograniczone, drożdżowe regiony regulatorowe, takie jak regiony regulatorowe wyodrębnione z Saccharomyces cerevisiae fosfatazy kwaśnej, galaktokinazy, dehydrogenazy alkoholowej, cytochromu c, czynnika α-kojarzącego i dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej, regiony regulatorowe oksydazy pierwszorzędowych alkoholi (Α0Χ1), syntazy dihydroksyacetonowej (DHAS1), p40 i region regulatorowy HIS4 pochodzący z Pichia pastoris, itp. Korzystnymi regionami regulatorowymi stosowanymi w sposobie według wynalazku są te, które charakteryzują się swoją zdolnością do odpowiedzi na podłoża zawierające metanol, to jest takie jak Α0Χ1, DHAS1, p40 i ujawnione w EP-A-0 183 071. Najkorzystniejszym regionem regulatorowym jest region regulatorowy ΑΟΧ1.

Terminacyjną sekwencję 3' można stosować w kasecie ekspresyjnej, albo może ona być częścią wektora, jak to przedyskutowano powyżej. Terminacyjne sekwencje 3’ mogą wykazywać funkcję ograniczania, poliadenylowania i/lub stabilizowania informacyjnego RNA kodowanego przez gen struktury, gdy są funkcjonalnie połączone z genem struktury. Przykłady źródeł terminacyjnych sekwencji 3’ to Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha i Pichia. Korzystne są te pochodzące z Pichia pastoris, takie jak terminacyjne sekwencje 3’ genu ΑΟΧ1, genu p40 i genu HIS4, a szczególnie korzystna jest terminacyjna sekwencja 3’ genu ΑΟΧ1.

Do wektorów używanych w sposobie według wynalazku można również wprowadzić dodatkowe sekwencje DNA, takie jak DNA plazmidu bakteryjnego, DNA bakteriofaga itp. Te sekwencje umożliwiają amplifikację i utrzymywanie się wspomnianych wektorów w gospodarzach bakteryjnych.

Innymi odpowiednimi wektorami mogą być wektory integracyjne, które mogą zawierać uporządkowaną sekwencję co najmniej 1/ fragmentu DNA nadającego się do wprowadzania, 2/ genu markerowego nadającego się do selekcji, 3/ kasety ekspresyjnej, oraz ewentualnie 4/ innego fragmentu DNA nadającego się do wprowadzania. Komponenty wektora integracyjnego są równoważne wobec fragmentów liniowego wektora integracyjnego specyficznego względem miejsca, z tym wyjątkiem, że wymagają one tylko jednego fragmentu DNA nadającego się do wprowadzania, tym niemniej uważa się, że wektory integracyjne integrują pełny wektor na drodze rekombinacji homologicznej. Korzystne są koliste wektory integracyjne, takie jak przedstawiono na fig. 4. W praktycznym zastosowaniu wynalazku jest dogodne użycie liniowych wektorów transformacyjnych, takich jak fragmenty Bglll konstrukcji przedstawionej na fig. 4 i koliste postacie wektora integracyjnego z fig. 4.

Wprowadzania genu struktury S lub PreS2 do odpowiednich wektorów można dokonać dowolną odpowiednią techniką z przecięciem wybranego wektora w odpowiednim miejscu (miejscach) i otrzymaniem w wyniku obecności w wektorze co najmniej jednej funkcjonalnej kasety ekspresyjnej zawierającej gen struktury S lub PreS2Ligowanie genu struktury S lub PreS2 można przeprowadzić dowolną odpowiednią techniką ligacji, taką jak stosowanie ligazy DNA T4.

Początkową selekcję, namnażanie i ewentualną amplifikację mieszaniny ligacyjnej genu struktury S lub PreS2 i wektora korzystnie prowadzi się przez transformację mieszaniną gospodarza bakteryjnego, takiego jak E. coli. Odpowiednie dla E. coli techniki transformacyjne są dobrze znane w tej dziedzinie. Markery selekcyjne i bakteryjne początki replikacji niezbędne do utrzymywania się wektora w gospodarzu bakteryjnym są dobrze znane.

Wyodrębnianie i/lub oczyszczanie żądanego plazmidu zawierającego gen struktury S lub PreS2 w układzie ekspresyjnym można przeprowadzić dowolnymi środkami odpowiednimi dla oddzielenia plazmidowego DNA od DNA gospodarza.

Podobnie, wektory utworzone na drodze ligacji można badać, korzystnie po namnażaniu, w celu zweryfikowania obecności genu S lub PreS2 i jego funkcjonalnego połączenia z regionem regulatorowym i terminacyjną sekwencją 3'. Można to przeprowadzić różnymi technikami obejmującymi, chociaż nie tylko, trawienie endonukleazami. elektroforezę w żelu lub trawienie endonukleamami-hydrydyzację Southema.

W sposobie według wynalazku komórka gospodarza musi być transformowana co najmniej dwiema różnymi, zgodnymi kasetami ekspresyjnymi. Istnieje szereg metod, którymi można te dwie różne kasety ekspresyjne wprowadzić do gospodarza, takie jak umieszczenie dwu funkcjonalnych kaset ekspresyjnych w wektorze (wirusowym, plazmidowym lub liniowym wektorze integracyjnym specyficznym względem miejsca) i transformowanie gospodarza tymi wektorami. Inna metoda transformowania gospodarza co najmniej dwiema różnymi kasetami ekspresyjnymi (S i PreS2) polegałaby na transformowaniu gospodarza dwoma różnymi wektorami, jednym zawierającym kasetę ekspresyjną S i drugim zawierającym kasetę ekspresyjną PreS2. Transformacji dwoma różnymi wektorami (podwójnej transformacji) można dokonać przez jednoczesną transformację (obydwa wektory obecne w jednym przypadku zastosowania do transformacji) albo stopniowo (gospodarz transformowany jednym wektorem, a potem druga transformacja innym wektorem tych transformowanych komórek-gospodarzy). Obecnie korzystną metodą transformacji jest podwójna transformacja stopniowa.

Transformację gospodarzy drożdżowych plazmidami lub wektorami liniowymi można przeprowadzić odpowiednimi technikami transformacyjnymi obejmującymi, chociaż nie tylko, techniki wskazane przez Hinnena i in., Proc. Natl. Acad. Sci., 75, 1929 (1978); Ito i in., J. Bacteriol., 153, 163 (1983); Cregg i in., Mol. Celi Biol., 5, 3376 (1985), lub Sreekrishna i in., Gene, 59, 115 (1987). Korzystną w praktycznym zastosowaniu wynalazku jest technika transformacyjna Cregga. Zgodnie z jednym z wariantów sposobu według wynalazku korzystne jest użycie nadmiaru wektorów liniowych i selekcja różnych insercji na drodze hybrydyzacji Southema.

Gospodarzem drożdżowym do transformacji mogą być dowolne odpowiednie drożdże metylotroficzne. Obejmują one, chociaż nie tylko, drożdże zdolne do wzrostu na metanolu wybrane z rodzajów Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis i Rhodotorula. Listę specyficznych gatunków, przykładowych dla tej klasy drożdży, można znaleźć w pracy C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982). Obecnie korzystne są drożdże metylotroficzne z rodzaju Pichia, takie jak auksotroficzne Pichia pastoris GS 115 (NRRL Y-15851) lub PPF1 (NRRL-Y-18017). Auksotroficzne drożdże metylotroficzne są także korzystne w praktycznym zastosowaniu wynalazku z powodu łatwości ich selekcji. Ustalono, że szczepy drożdży metylotroficznych typu dzikiego można zastosować z równym powodzeniem, jeżeli wybierze się odpowiedni transformujący gen markerowy, tak jak w przypadku użycia SUC2 do transformacji Pichia pastoris, do szczepu zdolnego do wzrostu na sacharozie, lub zastosuje się marker oporności na antybiotyki, taki jak G418R

W praktycznym zastosowaniu wynalazku korzystne jest obecnie użycie dwóch markerów nadających się do selekcji w kombinacji, w celu wyselekcjonowania stabilnej transformacji S i PreS2 u gospodarza. Tak więc, w praktycznym zastosowaniu wynalazku korzystne jest użycie kombinacji gospodarza i wektorów, które zagwarantują, że gdy użyje się dwóch różnych markerów nadających się do selekcji w dwóch różnych wektorach, każdy marker można niezależnie selekcjonować. Jedną z takich kombinacji gospodarza i wektorów byłoby użycie PPF1 (HIS4, ARG4) z wektorami pA0804 (marker HIS4) i pA0811 (marker ARG4). Inną możliwą kombinacją byłoby użycie auksotrofu z błędem pod względem jednego tylko szlaku metabolicznego z genem komplementarnym do danego błędu i genu oporności na antybiotyki lub genu, który tworzy nowy fenotyp, np. SUC2.

Komórki transformowanych drożdży metylotroficznych można selekcjonować stosując odpowiednie techniki, obejmujące, chociaż nie tylko, hodowlę auksotroficznych komórek po transformacji w nieobecności wymaganego produktu biochemicznego (zależnie od auksotroficzności komórek), a potem selekcję przez wykrycie nowego fenotypu (methanol slow) albo

161 997 hodowlę w obecności antybiotyku toksycznego dla drożdży, jeśli nie ma genu oporności zawartego w transformancie.

Wyodrębnione komórki transformowanych drożdży metylotroficznych hoduje się stosując odpowiednie techniki fermentacji, takie jak fermentacja w kolbach wstrząsanych, fermentacja w warunkach wysokiej gęstości lub techniki ujawnione przez Cregga i in. w High-Level Expression and Efficient Assembly of Hepatitis B Surface Antigen in the Methylotrophic Yeast, Pichia Pastoris, Bio/Technology, 5, 479 (1987).

Ekspresję można prowadzić metodami odpowiadającymi zastosowanym regionom regulatorowym. Korzystnie, gdy stosuje się regiony regulatorowe odpowiadające na metanol, indukcję ekspresji można prowadzić za pomocą ekspozycji transformowanych komórek w podłożach odżywczych na alkohol odpowiadający zastosowaniu regionowi regulatorowemu.

Cząstki antygenowe można odzyskać w surowej postaci przez podanie lizie transformowanych komórek, które indukowano przez wystarczający okres czasu, stosując zwykłe techniki, takie jak mielenie z udziałem kuleczek, a następnie odwirowanie wystarczające do usunięcia komórkowego debris. Fachowcy są świadomi istnienia licznych dostępnych metod ekstrakcji białka heterologicznego z jednokomórkowego organizm u-gospodarza, który można poddać ogólnym technikom ekstrakcji oprócz, albo w celu dalszego oczyszczania. Korzystna metoda oczyszczania w praktycznym zastosowaniu wynalazku obejmuje prowadzenie lizy transformowanych komórek w obecności zbuforowanych związków kaotropowych, wytrącanie lipidów i stanowiących zanieczyszczenia białek z supematantu otrzymanego po lizie, diafiltrację supernatantu, poddawanie frakcji zatrzymanej działaniu krzemionki, wymywanie stanowiących zanieczyszczenia białek, dla ich oddzielenia od zaabsorbowanego na krzemionce antygenu powierzchniowego hepatitis B, z użyciem buforu o pH 6-8, elucję antygenu z krzemionki z użyciem zbuforowanego eluentu (pH 9,5-11) zawierającego 0,5-8 m mocznika, poddawanie frakcji zawierających antygen filtracji żelowej, a następnie poddawanie zawierających antygen chromatografii anionowymiennej.

Następujące przykłady podano w celu dalszego zilustrowania praktycznego zastosowania wynalazku. Poniżej przedstawiono ogólne informacje mające związek z przykładami.

Szczepy

Drożdżowym szczepem-gospodarzem użytym w tych przykładach był Pichia pastoris GS115 (HIS4) NRRL Y-15851. Stosowano także Pichia pastoris PPF1 (ARG4 HIS4) NRR1 Y-18017,

E. coli MC1061 NRRL 18016 i

E. coli JM 103 Δ (lac pro) thi rpsL (strA) SupE and A sbcB hsdR.

Podłoża

YPD, 1 litr

Bulion LB, 1 litr

Bufor TE

Roztwór PEG

Roztwór A

Roztwór B

20g ekstraktu drożdżowego 20g peptonu 20g glukozy

5,0g ekstraktu drożdżowego (Difco)

10,Og tryptonu (Difco)

5,0g NaCl 1,0 mM EDTA w 0,01 M (pH 7,4) buforze Tris. 20% glikol polietylenowy 3350 10 nM CaCh mM Tris-HCl (pH 7,4)

- wyjałowić przez sączenie 0,2 M Tris-HCl (pH 7,5)

0,1 M MgCh 0,5 M NaCl

0,01 M ditiotreitol (DTT)

0,2 M Tris-HCl (pH 7,5)

0,1 M MgCh 0,1 M DTT

161 997

20Χ SSPE 4,4g NaOH

7,4g Na₂EDTA 27,6g NaHjPOa H₂O 21 Og NaCI

- doprowadzić pH do wartości

7,5-8,0 przy użyciu NaOH - uzupełnić woda do objętości 1 litra

10Χ bufor do przenoszenia 5,0g NaCI

96,8g Trizma Ba.se

9,74g glicyny uzupełnić woda do objętości 1 litra Przykład I. Konstrukcja wektora pTB04

Plazmid AM6 jest pochodną genomu HBV przedstawionego na fig. 6, podczas gdy plazmid pBR322 jest wprowadzony w miejscu BamHI w pozycji 26.

Wektor pTBO4 zawiera gen kodujący 281 aminokwasów antygenu powierzchniowego hepatitis B w postaci PreS₂. Gen konstruuje się z trzech segmentów: C-końcowe 75% genu struktury, N-końcowy linker kodujący 13 aminokwasów i pozostała część środkowa. Plazmid AM6 zawierający gen PreS₂ serotypu adw jest źródłem C-końcowej części i części środkowej genu PreS₂ używanego w sposobie według wynalazku. Sekwencję ujawnili Valenzuela i in., w ICN-UCLA Symposis on Animal Virus Genetics, 57-70 (1980), z następującą modyfikacją:

sekwencja natywna ATG-CAG-TGG-AAT-TCC sekwencja zmutowana ATG-CAG-TGG-AAC-TCC

A. C-końcowa część PreS2 (Wszystkie enzymy restrykcyjne otrzymano z Boehnnger Mannheim i używano ich według wskazówek wytwórcy).

C-końcową część wyodrębnia się z plazmidu AM6 (fig. 1) przez trawienie Dral, która przecina genom HBV w dwóch miejscach, z których jedno znajduje się w kodonie ostatniego aminokwasu antygenu powierzchniowego. Końce defosforyluje się działając fosfatazą alkaliczną z jelita cielęcia w mieszaninie reakcyjnej o objętości 30 μΐ (1 jednostka enzymu w temperaturze 37°C w ciągu godziny w 50 mM Tris-HCI, pH 9,0, 1 mM MgCh, 100 μΜ ZnCh, 1 mM spermidynie). Całkowitą mieszaninę po trawieniu ekstrahuje się fenolem i wytrąca etanolem (Maniatis i in.). Oktamerowy linker Stul (AAGGCCTT) syntetyzuje się za pomocą syntetyzera DNA Model 380A z Applied Biosystems stosując chemię cyjanoetylofosforamidytową. 1 μg linkerów Stul rozpuszcza się w wodzie destylowanej. Pobiera się 10 ng próbkę i znakuje fosforanem w mieszaninie o objętości całkowitej 50 μΐ zawierającej 70 mM Tris-Cl, pH 7,6,10 mM MgCl2,5 mM dwutriotreitolu, 1 mM ATP i 10 jednostek kinazy polinukleotydowej, w ciągu 30 minut w temperaturze 37°C. Linkery ogrzewa się do temperatury 90°C w celu zakończenia reakcji enzymatycznej i powoli oziębia do temperatury pokojowej w celu ułatwienia tworzenia się dwuniciowego DNA. Linkery Stul dodaje się do powyższej mieszaniny po trawieniu DrI i liguje przy użyciu ligazy T4. Reakcja zachodzi w mieszaninie reakcyjnej o objętości 10 μΐ zawierającej 6,6 M tris-Cl, pH 7,6,5 mM MgCh, 5 mM dwutiotreitolu, 1 mM ATP i 1 jednostkę Weissa ligazy T4, w ciągu godziny, w temperaturze 23°C. Reakcję ligowania kończy się ekstrakcją fenolem, a następnie wytrąceniem etanolem. Następnie przeprowadza się trawienie restrukcyjne Stul, stosując > 50 jednostek enzymu przez noc w celu usunięcia multimerów linkera Stul. Kombinacja trawienia Dral i działania linkerami Stul przywraca translacyjny kodon stop usunięty przez trawienie Dral.

Fragmenty Dral z linkerami Stul trawi się Xbal, co daje żądany fragment Stul/Xbal około 600 parach zasad. Wyodrębnia się go z 0,8% preparatywnego żelu agarozowego. Fragment ten zawiera C-końcowych 75% genu i klonuje się go do wektora pYM4 (fig. 2). który został strawiony Xbal i Stul i zdefosforylowany jak wyżej (pYM4 można otrzymać z plazmidu pYM30 przez strawienie go Ciał i ponowne ligowanie końców, pYM30 jest dostępny w E. coli jako gospodarzu zdeponowanym w Northern Regional Research Center, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, numer rejestracyjny NRRL B-15890). Fragment restrykcyjny pYM4 o 5,7 kb wyodrębnia się z 0,8% preparatywnego żelu agarozowego. Wektor pYM4 stosuje się wyłącznie z powodu jego dogodnych miejsc restrykcyjnych. 50 ng wektora i 500 ng insertu liguje się w temperaturze 23°C w ciągu godziny w 50 mM Tris-HCI (pH 7,4), 10 mM

MgCh, 10 mM ditiotreitolu, 1 mM spermidynie, 1 mM ATP z 1 jednostką Weissa ligazy T4 w objętości 10 μΐ. Mieszaniny reakcyjnej po ligacji używa się bezpośrednio do transformowania kompetentnych komórek E. coli MC1061 z nadaniem oporności na ampicylinę. E. coli szczep MC1061 jest dostępna w Northern Regional Research Center, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, numer rejestracyjny NRRL-18016. MC1061 ma następujący genotyp: F(-), ara D139 Δ (lacIPOZY) Χ74 gik gal U hsr ham (+) rpsLA (araABOIC leu) 7697. MCI061 nadaje się kompetencję do transformacji w następujący sposób. 50 ml hodowli E. coli MC1061 ze środkowej fazy logarytmicznej zbiera się przez odwirowanie w wirówce Damon IEC DPR600 przy 3000 obr/min w ciągu 5 minut w temperaturze 4°C i przemywa 10 mM NaCl. Hodowlę zawiesza się ponownie w 25 ml 50 mM CaCh na 30 minut w temperaturze 0°C. Komórki odwirowuje się jak wyżej i zawiesza ponownie w 2 ml 50 mM CaCh- W celu transformacji mieszaninę reakcyjną po ligacji dodaje się do 100 μΐ zawiesiny kompetentnych komórek i inkubuje w temperaturze 0°C na lodzie w ciągu 15 minut, poddaje wstrząsowi cieplnemu w temperaturze 37°C w ciągu 5 minut i inkubuje w temperaturze 23°Ć w ciągu 5 minut. Komórki nanosi się bezpośrednio na płytki z agarem Lb zawierającym ampicylinę w stężeniu 50 μg/ml. Płytki inkubuje się w temperaturze 37°C w ciągu 10 - 16 godzin. Zbiera się powstałe kolonie i charakteryzuje na drodze trawienia restrykcyjnego. Komórki hoduje się w 5 ml bulionu L zawierającego ampicylinę w stężeniu 50 pg/ml w ciągu 5 godzin w temperaturze 37°C i otrzymuje DNA metodą Bimboima i Doly’ego (Nucleic Acids Research, 7, 1513 /1979/). Minipreparaty trawi się BamHl i Xbal. Uznaje się, że hodowle które dały w wyniku fragmentacji fragment XbaI/BamHI o 1,5 kb zawierają insert. Preparat DNA z jednej hodowli oczyszcza się jak wyżej, a następnie doprowadza do tworzenia pasm w gradiencie chlorek cezu-bromek etydyny. Ten klon nazwany został pHSl.

Plazmid pHSl trawi się Stul, defosforyluje jak wyżej, ekstrahuje fenolem i wytrąca etanolem. Linkery EcoRI (GGAATTCC) zsyntetyzowane jak wyżej, fosforyluje się, doprowadza do samołączenia i liguje do tego DNA z tępymi końcami. Nadmiar linkerów usuwa się przez całonocne trawienie EcoRI i trawi potem DNA Xbal, a następnie ekstrahuje fenolem i wytrąca etanolem. Dublet zawierający fragment XbaI-EcoRI o 600 parach zasad (o który chodzi) i fragment wektora o 582 parach zasad (XbaI-EcoRI) wyodrębnia się za pomocą preparatywnej elektroforezy w 1,0% żelu. 500 ng tych fragmentów liguje się do 50 ng pUC18, strawionego XbaI-EcoRI i defosforylowanego, jak opisano powyżej, i używa do transformowania MC1061 z nadaniem oporności na ampicylinę. Mieszanin po trawieniu restrykcyjnym minipreparatów DNA używa się do określenia, który z dwóch fragmentów był klonowany. Niepożądany fragment ma miejsce Ciał takie, że podwójne trawienie ClałTXbal dałoby fragmenty o około 560 kb i 2400 kb, podczas gdy prawidłowy fragment daje liniowy fragment o 3 kb po trawieniu Ciał. Kandydujące próbki trawi się EcoRI i Xbał z uzyskaniem fragmentów o 600 kb i 2400 kb. Jeden z tych klonów został po oczyszczeniu na dużą skalę nazwany pHS2-B. Zawiera on miejsce EcoRI po ostatnim kodonie w C-końcowym regionie całkowitego genu PreS2.

B. Pośrednia część genu PreS2.

Pośrednią część genu PreS2 klonuje się jak następuje. Plazmid AM6 trawi się Xbał i BamHl i fragment o 250 kb wyodrębnia się z preparatywnego 0,8% żelu agarozowego. 50 ng tego fragmentu liguje się jak opisano powyżej z 50 ng pUC18 strawionego Xbal i BamHl i defosforylowanego. Mieszaniny reakcyjnej po ligacji używa się do transformowania E. coli szczep MC1061 z nadaniem oporności na ampicylinę jak wyżej. Minipreparaty trawi się BamHl i wybiera te, które zawierają liniowy fragment o 2,7 kb. Jeden z izolatów hoduje się na dużą skalę, po czym DNA wyodrębnia się i oczyszcza jak opisano. Klon ten nazywa się pPSl. Przecina się go EcoRI i BamHl, a pasmo wektora wyodrębnia się i oczyszcza za pomocą preparatywnej elektroforezy w 0,8% żelu agarozowym. Do tego wektora liguje się następujący, poddany działaniu kinazy dwuniciowy oligonukleotyd zsyntetyzowany jak powyżej:

EcoRI Pstl BamHl 5 'AArTCAATCCGTCTGCAG 3'

3' GTTAGGCAGACGTCCTAG 5'

161 997

Mieszaniny reakcyjnej po ligowaniu używa się do transformowania E. coli MC1061 z nadaniem oporności na ampicylinę. Minipreparaty charakteryzuje się przez trawienie Pstl. Wybiera się jeden klon zawierający fragment Pstl o 250 parach zasad, przeprowadza preparatykę DNA na dużą skalę i wyodrębnia plazmid pPS2.

C. N-końcowa część genu PreS2.

N-końcowy region zawierający linker E. coli i sekwencje kodujące pierwsze trzynaście aminokwasów wytwarza się z syntetycznego oligonukleotydu zawierającego następującą sekwencję, zsyntetyzowanego jak wyżej:

Hindlll EcoRI Pstl ' AGCTTGAATTCATGCAGTGGAACTCCACTGCCTTCCACCAAACTCTGCA 3'

3' ACTTAAGTACGTCACCTTGAGGTGACGGAAGGTGGTTTGAG 5'

Ten fragment zawiera końce Hindll i Pstl, jak również sekwencję EcoRI poprzedzającą ATG. Tę sekwencję klonuje się do pUC18, strawionego Hindlll i Pstl i defosforylowanego, przez ligowanie dziesięciokrotnego nadmiaru oligonukleotydu do wektora i charakteryzuje się transformanty pod względem obecności małego miejsca EcoRI (około 75kb). Klon ten nazwano pTBO-2A.

Środkową część genu dodaje się przez strawienie wektora pTBO-2A z użyciem Pstl i Xbal. Insert jest fragmentem Pst-Xba o 250 kb z pPS2. Transformanty charakteryzuje się pod względem obecności fragmentu EcoRJ o ponad 300 parach zasad, jak również fragmentu Xbal/Hindm o 290 parach zasad. Prawidłowy izolat nazwano pTBO- 3. Do całkowitego'genu PreS2 dochodzi się przez wprowadzenie fragmentu HindIH/Xbal z pTBO-3 do pHS2B strawionego XbaI/HindIH. Transformanty opome na ampicylinę charakteryzuje się jak wyżej na podstawie obecności fragmentu EcoRI o 825 parach zasad. Konstrukcję tę nazwano pTBO4.

Przykład Π. Konstrukcja wektora pTBO5A

Wektor zawierający gen kodujący PreS2 konstruuje się z wektorów pA0804 i pTBO4 (przykłady odpowiednio I i V). 2 gg pA0804 trawi się EcoRI jak uprzednio i poddaje działaniu fosfatazy alkalicznej w mieszaninie reakcyjnej o objętości 30 μΐ (1 jednostka enzymu w ciągu godziny w temperaturze 37°C w 50 mM Tris-Cl, pH 9,0, 1 mM MgCb, 100 μΜ ZnCh,-l mM spermidynie). pTB04 poddaje się trawieniu EcoRI i uwalnia fragment o 825 parach zasad kodujący gen PreS2. Ten fragment oczyszcza się stosując preparatywną elektroforezę w żelu agarozowym z użyciem 0,8% agarozy. 500 ng fragmentu i 50 ng pA0804 liguje się stosując sposoby opisane w przykładzie I. Powstałego wektora używa się do transformowania MC1061 z nadaniem oporności na ampicylinę stosując sposób opisany w przykładzie I. DNA wyodrębnia się metodą Bcmboima i Doly'ego /Nucleic Acids Research, 7, 1513 (1979)/ i charakteryzuje przez trawienie Pstl. Klon zawierający fragment Pstl o około 2,1 kb określa się jako zawierający insert w prawidłowej orientacji i oznacza pTB05A.

Przykład ΙΠ. Konstrukcja matrycy pTB047.

pg dwuniciowego DNA ml3ml8 (z przykładu I) trawi się EcoRI i defosforyluje działaniem fosfatazy alkalicznej z jelita cielęcia w mieszaninie reakcyjnej o objętości 30 μΐ (1 jednostka enzymu w temperaturze 37°C w ciągu godziny w 50 mM Tris-HCl, pH 9,0, 1 mM MgCb, 100 μΜ ZnCb, 1 mM spermidynie). Fragment EcoRI o 825 parach zasad zawierający gen PreS2 wyodrębnia się z pTB04 (patrz przykład I) przez trawienie EcoRI, a następnie wyodrębnia z 0,8% preparatywnego żelu agarozowego. 50 ng wektora ml3ml8 i 500 ng insertu EcoRI liguje się z użyciem ligazy DNA T4. Reakcja zachodzi w objętości 10 μΐ przy zawartości

6,6 M Tris-HCl, pH 7,6, 5 mM MgCb, 5 mM dwutiotreitolu, 1 mM ATP i 1 jednostki Weissa ligazy T4, w ciągu 1 godziny i w temperaturze 23°C.

Następnie mieszaniny reakcyjnej używa się do transformowania komórek E. coli JM103, którym nadano kompetencję w następujący sposób. 50 ml hodowli E. coli JM103 ze środkowej fazy logarytmicznej zbiera się drogą odwirowania w wirówce klinicznej Damon IEC DPR600 przy 3000 obr/min w ciągu 5 minut w temperaturze 4°C i przemywa 10 mM NaCl. Hodowlę zawiesza się ponownie, w 25 ml 50 mM CaCb, na 30 minut w temperaturze 0°C. Komórki odwirowuje się jak wyżej i zawiesza ponownie w 2 ml 50 mM CaCb.

161 997

W celu transformacji, mieszaninę reakcyjną po ligacji dodaje się do 100 μΐ zawiesiny kompetentnych komórek i inkubuje w temperaturze 0°C na lodzie w ciągu 5 minut, poddaje wstrząsowi cieplnemu w temperaturze 37°C w ciągu 5 minut i inkubuje w temperaturze 23°C w ciągu 5 minut. Następnie komórki nanosi się na miękki agar zawierający IPTG i X-gal i rozprowadza na podłożach LB oraz inkubuje w temperaturze 37°C przez noc. Płytki poddaje się screeningowi pod względem jasnych łysinek.

W celu ustalenia, które łysinki mają insert w prawidłowej orientacji, otrzymuje się dwuniciowy DNA i przeprowadza oddzielne trawienie EcoRI i Xbal. Stwierdzono, że jedna zawierała inicjatorową metioninę insertu tuż przy uniwersalnym primerze M13 i mogłaby następnie tworzyć matrycę zawierającą antysensowną nić insertu. Oznaczono ją pTB047.

Przykład IV. Konstrukcja pTBO-6 i pHB6.

Sekwencje DNA kodującą HBsAg w postaci 226-aminokwasowej (postać S) tworzy się przez delecję 165 par zasad kodujących pierwsze 55 aminokwasów PreS2. Dokonuje się tego przez poddanie matrycy pTB047 (z przykładu ΙΠ) mutagenezie delecyjnej kierowanej przez primer M13, stosując następujący primer oligonukleotydowy:

EcoRI

5' CGGGTACCGAGCTCGAAΤTCATGGAGAACATCACATCAGG 3'

Zsyntetyzowano go za pomocą syntetyzera DNA Model 380A z Applied Biosystems, jak w chemii cyjanoetylofosforamidynu. Mutagenezę przeprowadza się następująco.

Minipreparatykę w dużej skali przeprowadza się wykorzystując dodatnie łysinki, inkubowane w ciągu około 7 godzin w 2 ml podłoży LB. 25 ml podłoży LB inokuluje się 250 μΐ świeżo wyhodowanych komórek JM 103. Hodowlę prowadzi się w ciągu godziny i inokuluje ją 100 μΐ 7-godzinnej hodowli łysinek. Następnie prowadzi się hodowlę przez noc. Hodowlę odwirowuje się dwukrotnie przy 10 000 obr/min w ciągu 10 minut, stosując wirnik SS34 Sorvall RC-5B, w celu sklarowania supematantu. Do hodowli dodaje się 35 ml 20% PEG/2,5 M NaCl i inkubuje się ją w ciągu 5 godzin w temperaturze 4°C. Następnie hodowlę odwirowuje się jak powyżej w ciągu 10 minut. Supematant odrzuca się, a osad zawiesza w 2 ml buforu ΊΈ. Następnie osad ekstrahuje się raz fenolem (zrównoważonym TE), raz mieszaniną fenol/chloroform, dwukrotnie CHCb i raz eterem. Dodaje się 8M LiCl do stężenia końcowego 0,8 M. Dodaje się 3 objętości etanolu i pozostawia roztwór na noc w temperaturze 20°C w celu precypitacji obecnego DNA. Następnie odwirowuje się roztwór przy 10 000 obr/min w ciągu 10 minut jak uprzednio opisano i przemywa 70% etanolem. Osad zawiesza się ponownie w 150 μΐ 10 mM Tris-HCl, pH 7,4.

pmol rekombinowanej matrycy Μ13 miesza się z 20 pmolami primera oligonukleotydowego i 1 μΐ roztworu A. Dodaje się wodę destylowaną do końcowej objętości 10 μΐ . Próbkę inkubuje się w temperaturze 65°C w ciągu 5 minut, a następnie obniża się temperaturę do 37°C na 30 minut.

Do próbki dodaje się:

Roztwór B 1 μΐ mM dATP 1 μΐ mM dCTP 1 μΐ mM dGTP 1 μΐ mM dTTP 1 μΐ

Fragment KJenowa w stężeniu 5 jednostek? μΐ

JeL

Wodę destylowaną

20μ1 i całość inkubuje się w temperaturze 15°C w ciągu co najmniej 4-6 godzin.

Następnie próbkę rozcieńcza się wodą destylowaną w stosunku 1:40. 5 μΐ używa się do transformowania 6 kompetentnych komórek JM 103 w 6 probówkach (200 μΐ w każdej). Transformowane komórki JM 103 przenosi się na płytki pokryte warstwą podłoży LB w miękkim agarze. Następnie dodatnie łysinki poddaje się skriningowi metodą hybrydyzacji na filtrach.

161 997

Sonda hybrydyzacyjna komplementarna z primerem oligonukleotydowym została zsyntetyzowana jak wyżej. 15 pmoli tej sondy inkubuje się w temperaturze 65°C w ciągu 10 minut w objętości całkowitej 25 μΐ. Dodaje się 3 μΐ 10 X buforu dla kinazy (Maniatis i in.), 1μΐ 10 mM ATP i 1 μΐ kinazy polinukleotydowej w stężeniu 100 jednostek/ μΐ. Próbkę inkubuje się w ciągu godziny w temperaturze 37°C i przepuszcza przez kolumnę z Sephadex G-50. Zbiera się pierwszy pik z kolumny.

Filtry nitrocelulozowe przygotowuje się do hybrydyzacji z powyższą sondą przez umieszczenie i zorientowanie filtrów na płytkach transformacyjnych w ciągu 5-10 minut. Następnie filtry zabiera się z płytek i nanosi na roztwór denaturujący (1,5 M NaCl, 0,5 N NaOH) na 3 minuty, ze stroną odwrotną na wierzchu roztworu. Filtry zanurza się w roztworze denaturującym na 5 minut, a następnie przenosi do roztworu zobojętniającego (1 M Tris-HCl, pH 8, 1,5 M NaCl) na 5 minut. Zobojętnione filtry przenosi się następnie do 2X SSC (IX SSC jest to 150 mM NaCl, 15 mM cytrynian sodowy) na 5 minut Filtry suszy się na powietrzu i wygrzewa w ciągu godziny w temperaturze 80°C pod zmniejszonym ciśnieniem. Filtry poddaje się hybrydyzacji wstępnej w ciągu godziny w temperaturze 65°C w zamkniętym woreczku z tworzywa sztucznego, zawierającym 5 ml buforu do hybrydyzacji, 10Χ roztworu Denhardta (IX roztwór Denhardta stanowi 0,02% Ficollu, 0,02% poliwinylopirolidonu i 0,02% bydlęcej albuminy surowiczej), 0,5% SDS i 5X SSPE. Bufor zastępuje się świeżym buforem do hybrydyzacji w ilości 5 ml na filtr. Promieniotwórczy oligonukieotyd komplementarny otrzymany uprzednio inkubuje się w temperaturze 65°C w ciągu 5 minut, a następnie do świeżego buforu do hybrydyzacji, w którym znajduje się filtr dodaje się sondę w ilości wystarczającej do 1.10⁶ impulsów na minutę/ml. Hybrydyzację prowadzi się w temperaturze o 5° niższej od obliczonej temperatury topnienia sondy, w ciągu 4 godzin.

Następnie przemywa się filtry trzykrotnie, każdorazowo po 10 minut, za pomocą 6X SSC w temperaturze pokojowej. Ostatecznie przemywa się filtry raz 6X SSC w temperaturze hybrydyzacji. Umieszcza się je na bibule Whatman 3 MM do osuszenia, a następnie eksponuje na błonie fotograficznej (z oznaczeniem w celu orientacji) przez noc. Każdorazowo pobiera się trzy dodatnie łysinki i oddzielnie prowadzi hodowlę w 2 ml buforu LB w temperaturze 33°C w ciągu 5 godzin.

Minipreparatykę matrycy przeprowadza się z każdej z tych dodatnich łysinek. 1 ml hodowli z łysinki przenosi się do probówki Eppendorfa i wiruje w ciągu 5 minut w wirówce Eppendorfa Model 5414. Odzyskuje się 800 μΐ supematantu i dodaje do tego 200 μΐ 20% PEG/2,5 M NaCl. Następnie inkubuje się supematant w temperaturze pokojowej w ciągu 10 minut i wiruje w ciągu 10 minut w wirówce Eppendorfa. Supematant odsysa się i osad ponownie rozpuszcza w 200 μΐ TE (10 mM Tris, pH 7,4; 1 mM EDTA). Rozpuszczony osad ekstrahuje się następnie mieszaniną fenol/chloroform i z górnej fazy wodnej wytrąca się matrycę DNA przez dodanie roztworu LiCl do osiągnięcia stężenia LiCl 0,8 M. Dodaje się 2,5 - 3 objętości etanolu i próbkę poddaje wytrącaniu na suchym lodzie w ciągu 5 minut. Osad odwirowuje się w ciągu 10 minutjak opisano powyżej. Objętość końcową doprowadza się za pomocą TE do 150 μΐ .

200 μΐ kompetentnych komórek JM 103 transformuje się odzyskanym DNA. Do transformacji używa się 1 μΐ rozcieńczenia 1:10 wyodrębnionego fagowego DNA. Mieszaninę po transformacji nanosi się na płytki i poddaje skriningowi oligonukleotydami jak to opisano uprzednio.

Minipreparatykę na dużą skalę przeprowadza się wykorzystując dodatnie łysinki inkubowane w ciągu około 7 godzin w 2 ml podłoży LB, 25 ml podłoży LB inokuluje się 250 μΐ świeżo wyhodowanych komórek JM 103. Hodowlę prowadzi się w ciągu godziny i inokuluje się ją stosując 100 μΐ 7-godzinnej hodowli łysinek. Następnie prowadzi się hodowlę przez noc, a potem odwirowuje dwukrotnie przy 10 000 obr/min w ciągu 10 minut w Sorvall RC-5B z wirnikiem SS34 w celu sklarowania supematantu. Do hodowli dodaje się 3,5 ml 20% PEG/2,5 M NaCl i inkubuje w ciągu 5 godzin w temperaturze 4°C. Następnie odwirowuje się ją ponownie, jak wyżej, w ciągu 10 minut. Supematant odrzuca się i osad rozpuszcza ponownie w 2 ml buforu TE. Następnie osad ekstrahuje się fenolem, równoważy TE, ekstrahuje mieszaniną fenol/chloroform raz, ekstrahuje dwukrotnie CHCb i raz eterem. Dodaje się 8 M LiCl do końcowego stężenia 0,8 M. Dodaje się 3 objętości etanolu i roztwór pozostawia na noc w celu wytrącenia obecnego w nim DNA. Roztwór wiruje się w ciągu 10 minut przy 10 000 obr/min, jak opisano uprzednio i przemywa 70% etanolem. Osad rozpuszcza się ponownie w 150 μΐ buforu Tris (pH 7,4).

Dodatnie kolonie hybrydyzuje się (stosując hybrydyzację kolonii według Grunsteina i Hognessa, PNAS, 72, 3961 /1975/), i sekwencjonuje stosując dwudezoksy-sekwencjonowanie w celu znalezienia konstrukcji M13 z prawidłową mutacją. Odzyskuje się RF DNA stosując metodę lizy alkaliami (Maniatis i in.). Wyodrębnia się fragment EcoRI o 678 parach zasad w preparatywnym 0,8% żelu agarozowym i subklonuje do, odpowiednio, pA0804 i pA0811 (odpowiednio przykład V i VI). Komórki E.coli MC1061 transformuje się jednym albo drugim z tych dwóch wektorów, jak to opisano w przykładzie I. Transformanty o prawidłowej orientacji identyfikuje się stosując trawienie Xbal minipreparatów DNA (również jak opisano w przykładzie I). Jeden z transformantów pochodzących z pA0804 nazwano pTB06, a transformant pochodzący z pA0811 nazwano pHB6.

PrzykładV. Konstrukcja pA0803 i pA0804.

pA0804 jest wektorem zdolnym do przerwania specyficznie względem miejsca, locus ΑΟΧ1 P. pastoris. Zawiera on promotor ΑΟΧ1 i terminator transkrypcyjny rozdzielone unikalnym miejscem klonowania EcoRI, gen HIS4 Pichia typu dzikiego, genomowy segment DNA z końca 3' locus ΑΟΧ1 w dół w stosunku do terminatora transkrypcyjnego oraz sekwencje niezbędne do selekcji i replikacji w gospodarzu bakteryjnym. Komponenty są tak uporządkowane, że trawienie restrykcyjne wektora uwalnia fragment DNA zawierający kasetę ekspresyjną i marker nadający się do selekcji, których końce są homologiczne z ciągłą częścią genomu w locus ΑΟΧ1 i mogą być stabilnie wprowadzone do chromosomu podczas transformacji.

pA0804 jest pochodną ekspresyjnego plazmidu antygenu powierzchniowego hepatitis B, pBSAGI51 (NRRL 18021). Konstruuje się go jako plazmid na bazie pBR322 z następującymi modyfikacjami. pBR322 trawi się EcoRI, z następującą po tym ekstrakcją fenolem i precypitacją etanolem. Następnie końce wypełnia się z użyciem polimerazy Klenowa. 2 gg pBR322 strawionego EcoRI inkubuje się w temperaturze pokojowej w ciągu 15 minut w mieszaninie reakcyjnej o objętości 25 μΐ, zawierającej 50 mM Tris-Cl, pH 7,2,10 mM MgSO> 100 μΜ dwutiotreitol, bydlęcą albuminę surowiczą w stężeniu 50 μg/ml, 100 μΜ dATP, μΜ dTTP i 1 jednostkę polimerazy Klenowa. Po ekstrakcji fenolem i wytrąceniu etanolem liguje się DNA w celu ponownego zamknięcia plazmidu i mieszaniny reakcyjnej po ligacji używa się do transformowania E. coli MC1061. Transformanty poddaje się skriningowi pod względem nieobecności miejsca EcoRI, jak również obecności miejsc diagnostycznych, takich jak Pstl, PvuII i Sali. Plazmid ten nazwano pBR322-RI.

Plazmid ten modyfikuje się później w celu włączenia miejsca Bgin i miejsca PvuH. Plazmid ten trawi się PVuII i dodaje fosforylowane linkery BglH (GAGATCTC) w łączeniu tępych końców. Nadmiar linkerów usuwa się przez całonocne trawienie BglH i plazmid zamyka się ponownie z użyciem ligazy DNA T4. Mieszaniny reakcyjnej po ligowaniu używa się do transformowania E. coli MC1061 z nadaniem oporności na ampicylinę. Transformanty charakteryzuje się przez trawienie restrykcyjne BglH w celu wykazania obecności miejsca BglH i trawienie SaUZBg lll wykazujące, że miejsce Bgin jest w poprzednim miejscu PvuII. Plazmid ten jest oznaczony pBR322 BglII-RI.

pA0804 i pA0811 wytwarza się za pomocą zebrania fragmentów DNA z pBSAGI5I i zmontowania ich w pBR322 BgUI-RI. Docelowy segment 3' z locus ΑΟΧ1 usuwa się z pBSAGI5I jako fragment Bgin/XhoL o 700 parach zasad, którego 50 ng liguje się z 5 ng macierzystego plazmidu, który został strawiony Sali i Bgin. Mieszaniny reakcyjnej po ligacji używa się do transformowania E. coli MC1061 z nadaniem oporności na ampicylinę. Transformanty charakteryzuje się trawieniem BamHI/BglH minipreparatu DNA, jak to opisano w przykładzie I tak, że obserwuje się fragment o około 900 parach zasad. Jeden taki transformant został wybrany z oczyszczeniem DNA na dużą skalę. Plazmid ten nazwano pA0801.

Plazmid pBSAGI5I trawi się Ciał i wyodrębnia fragment zawierający kasetę ekspresyjną promotor-gen-terminator. 2 μg pA0801 trawi się Ciał i poddaje działaniu fosfatazy alkalicznej w mieszaninie reakcyjnej o objętości 30 μΐ (1 jednostka enzymu w temperaturze 37°C w ciągu godziny w 50 mM Tris HC1 pH 9,0, 1 mM MgCk, 100 μΜ ZnCh, 1 mM sperymidynie). 50 ng fragmentu Ciał liguje się z 5 ng wektora pA0801 i mieszaniny reakcyjnej po ligacji używa się do transformowania E. coli MC1061 z nadaniem oporności na ampicylinę. Kolonie charakteryzuje się przez trawienie Bgin aby upewnić się, że fragment został włączony i jest w

161 997 prawidłowej orientacji, uzyskując spektrum fragmentów o 2.3 i 2.7 kilopary zasad. Ten pojedynczy transformant nazwano pA0802.

Plazmid pA0802 trawi się w unikalnym miejscu Stul przy końcu 3' genu antygenu powierzchniowego hepatitis B. Linkery EcoRI fosforyluje się. łączy i liguje z plazmidem strawionym Stul. Nadmiar linkerów usuwa się przez całonocne trawienie EcoRI, które prowadzi też do przecięcia genu struktury HBsAg przy końcu 5'. a więc usunięcia genu. Po ponownym ligowaniu promotor i terminator transkrypcyjny łączy się unikalnym miejscem klonowania EcoRI. Transformanty oporne na ampicylinę ponownie charakteryzuje się przez trawienie Bglll i transformanty z prawidłowym spektrum (2,3 i 2.1 kb) identyfikuje się (nazwano je pA0803).

Plazmid pA0803 trawi się BamHI i fragment Bglll o 2,7 kb pYMIO (fig. 8) wyodrębnia się za pomocą preparatywnej elektroforezy w żelu agarozowym oraz liguje z defosforylowanym pA0803 strawionym BamHI. pYMIO jest pochodną pYJ3O (NRRL B-15890) ze zniszczonym miejscem BamHI w pozycji 2959. Transformanty charakteryzuje się na zasadzie obecności miejsca Xbal, uzyskując fragment o 7,4 kb i spektrum Bg 1II o 2.3 i 5,1 kb. Plazmid ten nazwano pA0804.

Przykład VI. Konstrukcja pA0811.

Konstruuje się także drugi plazmid, zawierający gen ARG4 Saccharomyces zamiast genu HIS4 Pichia. Jednym z możliwych źródeł genu aRG4 jest fragment HpaJ o 2,0 kb otrzymany z pYM25, plazmidu w E. coli jako gospodarzu. NRRL B-18015. Ten szczep jest dostępny w Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois.

Fragment oczyszcza się w preparatywnym 0,8% żelu agarozowym. 500 ng fragmentu liguje się z 50 ng pA0803 strawionego BamHI, wypełnionego (przykład V). Mieszaniny reakcyjnej po ligacji używa się do transformowania E. coli MC 1061 z nadaniem oporności na ampicylinę. Transformanty charakteryzuje się przez strawienie Bglll, a prawidłową wielkość insertu weryfikuje za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Plazmid ten został nazwany pA0811.

Przykład VII. Minipreparatyka drożdżowego DNA.

10⁴ komórek/ml hoduje się w 5 ml YPD w temperaturze 30°C przez noc, a następnie osadza z zastosowaniem klinicznej wirówki Damon IEC DPR600 przy 3000 obr/min w ciągu 5 minut. Osad zawiesza się w 0,5 ml 1 M sorbitu, 0,1 ml 0,5 M EDTA (pH 7,5) i próbkę przenosi do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej. Dodaje się 0,02 ml Zymolyase 60000 (Miles Laboratories) w stężeniu 2,5 mg/ml i inkubuje próbkę w temperaturze 37°C w ciągu 60 minut. Komórki osadza się stosując mikrowirówkę w ciągu 1 minuty przy dużej szybkości i ponownie zawiesza w 0,5 ml 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 20 mM EDTA. Dodaje się 0,05 ml 10% SDS, próbkę miesza i inkubuje w temperaturze 65°C w ciągu 30 minut. Dodaje się 0,2 ml 5 M octanu potasowego i próbkę inkubuje na lodzie w ciągu 60 minut. Próbkę ponownie odwirowuje się w mikrowirówce z wysoką prędkością obrotową w ciągu 5 minut.

Supematant przenosi się do świeżej 1,5 ml probówki mikrowirówkowej i dodaje w temperaturze pokojowej 1 objętość izopropanolu. Próbkę miesza się i dopuszcza do osadzenia w temperaturze pokojowej w ciągu 5 minut, a następnie odwirowuje bardzo krótko (10 sekund) w mikrowirówce przy dużej prędkości. Supematant zlewa się i osad suszy na powietrzu. Po ponownym zawieszeniu osadu w 0,3 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 i 1 mM EDTA dodaje się 15 μΐ roztworu RNazy z trzustki w stężeniu 1 mg/ml i próbkę inkubuje się w temperaturze 37° w ciągu 30 minut. Dodaje się 0,03 ml 3 M octanu sodowego, próbkę miesza i dodaje 0,2 ml izopropanolu. Próbkę odwirowuje się w mikrowirówce przy dużej szybkości w celu osadzenia DNA. Następnie zlewa się supematant, osad osusza i zawiesza ponownie w 0,1 - 0,3 ml 10 mM Tris-Cl (pH 7,4) i 1 mM EDTA. Przed zastosowaniem DNA w mieszaninie do trawienia restrykcyjnego może okazać się niezbędne odwirowanie roztworu w ciągu 15 minut w mikrowirówce przy dużej szybkości w celu usunięcia jakiegokolwiek nierozpuszczalnego materiału, który może hamować trawienie.

Przykład VIII. Doprowadzenie do rozwoju szczepów z mieszanymi cząstkami.

Dwa szczepy z mieszanymi cząstkami zawierające kasety ekspresyjne kodujące antygen powierzchniowy hepatitis B w postaci S (P24) i PreS2 (P31) konstruuje się w następujący sposób. Pichia pastoris PPFl (arg4 his4) transformuje się 1 pg nie przeciętego pHB6 z zastosowaniem

161 997 techniki transformacji sferoplastów opisanej przez Cregga i in. w Bio/Technology, 5, 479, (1987). pHB6 jest subklonem pA0811 zawierającym gen S, opisanym w przykładach IV i VI. Transformanty wykazujące prototroficzność względem argininy regeneruje się na podłożach minimalnych zawierających histydynę i poddaje skriningowi pod względem miejsca integracji.

DNA z tych transformantów i z Pichia pastoris typu dzikiego otrzymuje się jak to opisano w przykładzie VII, trawi EcoRI i poddaje elektroforezie w 0,8% agarozie. Z udziałem tych DNA przeprowadza się blotting metodą Southema (Maniatis i in., 1983) i poddaje filtry hybrydyzacji z sondą specyficzną względem ΑΟΧ1 (pPG4,O, NRRL nr 15868) lub sondą specyficzną wobec HIS4 (pYM4). pYM4 został opisany w przykładzie I.

Miejsce integracji ustala się przez porównanie spektrum hybrydyzacji danego transformanta ze szczepem typu dzikiego. Każda zmiana w wymiarze pasma typu dzikiego jest oznaką integracji w tym locus. Transformant, w którym integracja zachodzi przy końcu 5' locus ΑΟΧ1, w dalszym ciągu zawierający gen ΑΟΧ 1 typu dzikiego, jak i mutację HIS4, został nazwany PPFl/pHB6.

Ten szczep transformuje się pTB05A przeciętym BglH (z przykładu Π), jak to opisano powyżej. Transformanty wykazujące prototroficzność względem histydyny regeneruje się na minimalnych podłożach i poddaje skriningowi pod względem fenotypu methanol slow (Mut-), który wykazuje integrację w locus ΑΟΧ 1. Skrining pod względem tego fenotypu przeprowadza się w następujący sposób.

Transformanty łączy się przez zdrapanie powierzchni płytki w obecności jałowej wody destylowanej i poddaje sonifikacji przy niskiej mocy wyjściowej w ciągu 15 sekund. Następnie rozcieńcza się je do A<oo = 0,1 i nanosi przy rozcieńczeniach 10’³ i 10'⁴ na płytki z podłożem minimalnym zawierającym glicerynę jako źródło węgla i inkubuje w temperaturze 30°C w ciągu 2-3 dni. Następnie wykonuje się płytki-repliki z podłożem minimalnym, do którego dodano 100 μΐ metanolu w fazie gazowej. Po 24-godzinnej inkubacji w temperaturze 30°C staje się oczywiste, że 10-20% transformantów rośnie wolniej niż reszta w obecności metanolu. Dziesięć z tych wolniej rosnących kolonii wybiera się następnie do dalszej analizy. Pobiera się je z płytek z podłożem minimalnym zawierającym glicerynę, prowadzi hodowlę w kolbach wstrząsanych jak opisano w przykładzie IX i bada pod względem aktywności podobnej do aktywności 22 nm cząsteczek, jak to opisano w przykładzie XI. Transformanty charakteryzuje się jak opisano powyżej dla pHB6. Jeden z powstałych szczepów nazwano PPFl/pTB012-l i wykazywał on ekspresję jednej kopii obydwu białek P24 i P31.

Zidentyfikowano inny szczep, który zintegrował dwie kopie kasety ekspresyjnej PreS₂. Nazwano go PPFl/pTB012-2 i wykazywał on ekspresję dwóch kopii genu PreS₂ i jednej kopii genu S.

Poziom ekspresji cząstek przedstawiono w tabeli 3.

Tabela 3

Szczep	Kaseta	Białka	Poziom ekspresji cząstek (AUSIRA™)
PPFI/pTBO 12-1	1 PrcS;	P31	około 150-200 pg cząstek/ml lizatu
PPFI/pTBO 12-2	1 S 2 PreS;	P 24 P 31	około 150-200 pg cząstek/ml lizatu
	1 S	P24

Dodatkowo, analiza SDS/PAGE i barwienie srebrowe częściowo oczyszczonych preparatów białek wskazywały na obecność tak P24, jak i P31.

161 997

Przykład IX. Badanie ekspresji z zastosowaniem kolby wstrząsanej.

Przed fermentacja wszystkie szczepy hoduje się w kolbach wstrząsanych, jak następuje, do osiągnięcia poziomu ekspresji. W znany sposób transformanty osadza się w 2-5% glicerynie zawierającej 0,67% Yeast Nitrogen Base i hoduje przez noc w temperaturze 30°C do środkowejpóźnej fazy logarytmicznej. Następnie komórki osadza się przez odwirowanie stosując kliniczną wirówkę Damon IEC DPR600 przy 3000 obr/min w ciągu 5 minut. Osad przemywa się dwukrotnie wodą destylowaną, następnie posiewa się nim przy gęstości 0,5 jednostki Aćoc/ml 0,67% YNB zawierające 1% metanol i prowadzi hodowlę w ciągu 4-6 dni w temperaturze 30°C przy umiarkowanym wstrząsaniu. Próbki (50 jednostek Aóoo) pobiera się w różnych odstępach czasu, przechowuje w temperaturze -20°C. Następnie otrzymuje się z tych próbek ekstrakty białkowe do użycia w teście AUSRIA™ (patrz przykład XI) i blottingu metodą Western (Towbin i in., PNAS, 76, 4350 /1979/). Stosuje się przeciwciało serii nr 702 106 z Calbiochem w rozcieńczeniu 1:1000. Próbki komórek (100 jednostek Aćoo) przenosi się do 13 x 100 mm probówek do hodowli ze szkła borokrzemianowego i przemywa dwukrotnie przez odwirowanie w wirówce Sorvall Model RC-5B przy 12000 obr/min, w temperaturze 4°C z 20 objętościami buforu do lizy (0,5 M NaCl, 0,1% wag/obj Triton Χ-100, IM fluorek fenylometylosulfonylu i 10 mM fosforan sodowy, pH 7,5). Próbki komórek zawiesza się ponownie z 0,5g 0,5 mm kuleczek szklanych przemytych kwasem i 0,35 ml buforu do lizy i miesza przez 8 okresów czasu z jednominutowymi przerwami przy maksymalnej szybkości stosując mikser wirowy. Między tymi okresami czasu mieszaninę chłodzi się na lodzie w ciągu co najmniej 1 minuty. Po zakończeniu lizy pobiera się roztwór rozbitych komórek, przemywa kuleczki szklane 0,35 ml buforu do lizy, łączy te dwa roztwory i odwirowuje stosując wirówkę Sorvall RC-5B przy 13000 obr/min, w temperaturze 4°C, w celu usunięcia komórkowego debris. Następnie próbki białkowe bada się w teście AUSRIA™ i blottingu metodą Western. Stężenia białka oznacza się metodą Lowry po wytrąceniu TCA.

Przykład X. Fermentacyjne badanie ekspresji.

Fermentację przeprowadza się jak następuje. 500 ml YEAST Nitrogen Base (YNB) + 2% gliceryny w kolbie Fembacha inokuluje się korzystając z hodowli posiewowej lub hodowli na płytce z podłożem minimalnym z hodowlą. Płytki można utrzymywać stosując pasażowanie co miesiąc bez wykrywalnego zdegenerowania się szczepu. Po jednym dniu wstrząsania przy 200 obr/min w temperaturze 30°C inokulum stosuje się do posiania 7,5 litra podłoża minimalnego (tabela 4) zawierającego 480 g gliceryny, 40 mg biotyny i 40 ml roztworu soli śladowych (tabela

5). Fermentor utrzymuje się w temperaturze 30°C, pH 5,5 przy wzroście hodowli jako procesie okresowym do wyczerpania gliceryny (w ciągu około 24 godzin). pH reguluje się dodawaniem gazowego amoniaku. Wyczerpanie się gliceryny zauważa się jako ostry spadek wywiązania się CO2 i ostre wzniesienie się dotyczące rozpuszczonego tlenu (lub zmniejszenie się szybkości pobierania tlenu). Zasilanie metanolem zaczyna się przy 18 ml/godzinę do doprowadzenia poziomu w fermentorze do około 0,5% CH3OH i utrzymuje się na tym poziomie. Natężenie dopływu reguluje się w oparciu o bieżącą szybkość zużycia metanolu. 20 ml porcje soli śladowych dodaje się w około 2-niowych odstępach, aby utrzymać szybkość zużycia metanolu. Poziom HBsAg wzrasta przez około 7-8 dni zasilania metanolem.

Tabela 4

Skład podłoża/7,5 litra

Dość	Składnik
480 g	gliceryna
40 mg	biotyna
134 ml	H3PO4 (85%)
5,8 g	CaSO4 2H2O
92 g	H2SO4
75 g	MgSO4 7H2O
21 g	KOH

Tabela 5

Roztwór soli ślazowych IMi

Składnik	Ilość
Siarczan miedziowy · 5H2O	0,06
Jodek potasowy	0,08
Siarczan manganu- H2O	0,30
Molifcdlenian sodowy	0,20
Kwas borowy	0,02
Siarczan cynkowy- H2O	2,00
Chlorek żelazowy- H2O	4,8
Kwas siarkowy	5,00ml/litr

P r z y k ł a d XI. Protokół AUSRIA™RIA.

TM

Zestawu AbbotAUSRIA ‘ używa się do pomiaru ilości HBsAg wytworzonego w układzie produkcyjnym Pichia. Przeciwciało wchodzące w skład zestawu wiąże się z cząstkami HBsAg, ale nie z monomerami HBsAg. Wszystkie rozcieńczenia robi się w 1,0% BSA, 0,02% azydku sodowym, w roztworze soli buforowanym fosforanami (pH 7,4). Sposób postępowania jest zasadniczo taki, jak wyszczególniony w instrukcjach do zestawu. Krzywą standardową przygotowuje się według danych z tabeli 6.

T abela 6

Nr probówki	ng w teście	Bufor (μΐ)	Kontrola dodatnia(pl)
1-4	bez NSB	bez	200 tylko bufor
5-6	0,1	195	5
7-8	0,2	190	10
9-10	0,5	175	25
11-12	1,0	150	50
13-14	2,0	100	100
15-16	3,0	50	150
17-18	4,0	bez	200

Dołki płytki do mikromiareczkowania są oznakowane następująco:

	AA	BB	CC	DD
1	1	2	3	4
2	5	6	7	8
3	9	10	11	12
4	13	14	15	16
5	17	18	19	20 itd.

Najpierw do każdego dołka dodaje się kuleczki, następnie bufor, a na końcu standard (kontrola dodatnia), albo rozcieńczoną próbkę. Nieznane próbki rozcieńcza się do otrzymania sygnału w zakresie krzywej standardowej. Wyniki oznaczania stężenia próbki w mg/ml typowo dzieli się przez 0,02 w celu otrzymania żądanego rozcieńczenia. Zazwyczaj do dołka zawierającego 100 μΐ buforu dodaje się 100 μΐ próbki. Dołki przykrywa się i płytką ostrożnie postukuje się o blat stołu laboratoryjnego. Następnie płytki inkubuje się przez noc w temperaturze pokojowej aby osiągnąć maksymalną skuteczność wiązania. Następnego dnia rano każdy dołek płucze się cztery razy wodą dejonizowaną stosując układ Pentawash dostarczany przez Abbott Labs. Do każdego dołka dodaje się μΐ Ζ ¹²⁵J] -przeciwciała przeciw HBS, płytką ostrożnie postukuje się i inkubuje w łaźni wodnej o temperaturze 45°C w ciągu godziny. Kuleczki przemywa się jak uprzednio i poddaje zliczaniu. Stężenie próbek nieznanych określa się na podstawie krzywej standardowej.

161 997

161 997

FIG. 9

ΆΟΧΙ

In, EcoR I ⁷ /³ '^flOX1 •2,4Okb pBR322 \

(BamH I/Bg| II)

HIS4 (BamH I/Bgl II) (Sal I/Xho I)

3Ά0Χ1

Bgl II

Pst I

161 997

FIG. θ [Cl a I (23)]

Hind II1 (—213) (6819) Pvu 1 (6693) Pst I

Ρνυ II (5150)

Ava I (4509)

Nru ¹ (4056) (3735)

Eco RV (-369) [Bam/Bg l]

Xba 1 (-757)

Κρπ I (-834)

Bst X I (-1309)

Κρπ 1 (-1759) Sal I 0—1809)

Stu I (-2059)

HIS4

Bam HI (-2959)]

Ρνυ II (—3159) [Bam/Bg ^|]

FIG. 7

Cla I (23)

Hmd III (29)

Eco RV (185) [Bam/Bg l]

Xba I H-575)

Κρη I H-650)

Bst X I (—1125)

Κρη I f—1575) Sal I (-1625) (66351 Ρνυ (6509) Pst I

Eco RI

— Stu I (—1875) pYM4 7.06 kb

161 997

FIG. 6

161 997

PRZEPROWADZIĆ W POSTAĆ. LINIOWA DZIAŁANIEM Stu I DODAĆ LINKER EcoR I. TRAWIĆ Z UŻYCIEM EcoR I DOPROWADZIĆ DO PONOWNEGO ZAMKNIĘCIA

MIEJSCA

DODAĆ FRAGMENT Hpa I ZAWIERAJĄCY &EN ARG 4 S C DO WYPEŁNIONEGO BamH I

-3ΌΧΧ1 Ρνυ II Hmd III Cla I H i nd III (BamH Ι/Hpa I)

1000

EcoR I <7206

Ά0Χ1

Hmd III

Pet I

5000

4000

Bgl II

Bgl II (BamH Ι/Hpa I)

3000 (Sal I/Xho I)

3Ά0Χ1

161 997

FRAGMENT Bo I II/Xho I Z P8SA6I5I 00 PLAZMIDU ,r pBR322-Bgl II MINUS EcoR I

161 997

FIG. 4

161 997

FIG. 3

3C00

FIG. 2

161 997

FIG. 1

2000

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 10 000 zł

Claims (18)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wzmożonego wytwarzania antygenowych cząstek HBV zawierających zasadniczo białka S i PreS2, znamienny tym, że transformuje się drożdże metylotroficzne co najmniej jedną kasetą ekspresyjną zawierającą gen struktury S, funkcjonalnie połączony z regionem regulatorowym i terminacyjną sekwencją 3', oraz co najmniej jedną kasetą ekspresyjną zawierającą gen struktury PreS2, funkcjonalnie połączony z regionem regulatorowym i terminacyjną sekwencją 3', a następnie prowadzi się hodowlę powstałego transformowanego szczepu drożdży w warunkach odpowiednich do wytworzenia cząstek HBV.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że transformację prowadzi się z udziałem co najmniej jednego wektora, takiego jak plazmid lub liniowy wektor integracyjny specyficzny względem miejsca.
3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się wektory integracyjne.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się pierwszy wektor integracyjny specyficzny względem miejsca, zawierający w kolejności a/ pierwszy fragment DNA nadający się do wprowadzenia, b/ gen markerowy i co najmniej jedną kasetę ekspresyjną zawierającą gen struktury PreS2, funkcjonalnie połączony z regionem regulatorowym i terminacyjną sekwencją 3' oraz c/ drugi fragment DNA nadający się do wprowadzania, przy czym kolejność występowania genu markerowego i kasety w składniku b/ może być wymienna, oraz drugi wektor integracyjny zawierający w kolejności a/ co najmniej jeden fragment DNA nadający się do wprowadzania, b/ gen markerowy oraz co najmniej jedną kasetę ekspresyjną zawierającą gen struktury S, funkcjonalnie połączony z regionem regulatorowym i terminacyjną sekwencją 3', przy czym kolejność występowania genu markerowego i kasety w składniku b/ może być wymienna.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się fragment DNA nadający się do wprowadzania, otrzymany z sekwencji DNA genu wyodrębnionego z Pichia pastoris, takiego jak ΑΟΧ1, p40, DHAS lub HIS4.
6. 6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się co najmniej jedną kasetę ekspresyjną obejmującą region regulatorowy, taki jak region regulatorowy Α0Χ1, p40 lub DHAS wyodrębniony z Pichia pastoris, lub region regulatorowy fosfatazy kwaśnej, gałaktokinazy, dehydrogenazy alkoholowej, cytochromu c, czynnika α-kojarzącego lub dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej wyodrębnionych z Saccharomyces cerevisiae, funkcjonalnie połączony z genem struktury PreS2, funkcjonalnie połączonym z terminacyjną sekwencją 3' z Pichia pastoris, takąjak sekwencja terminacyjną 3' wyodrębniona z genu ΑΟΧ1, genu p40, genu DHAS lub genu HIS4.
7. 7. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się co najmniej jedną kasetę ekspresyjną obejmującą region regulatorowy, taki jak region regulatorowy Α0Χ1, p40 lub DHAS wyodrębniony z Pichia pastoris lub region regulatorowy fosfatazy kwaśnej, galaktokinazy, dehydrogenazy alkoholowej, cytochromu c, czynnika α-kojarzącego lub dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej wyodrębnionych z Saccharomyces cerevisiae, funkcjonalnie połączony z genem struktury S, funkcjonalnie połączonym z terminacyjną sekwencją 3' z Pichia pastoris, taką jak terminacyjną sekwencja 3' wyodrębniona z genu ΑΟΧ 1, genu p40, genu DHAS lub genu HIS4.
8. 8. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że jako gen markerowy stosuje się gen HIS4 lub ARG4 wyodrębniony z Pichia pastoris, gen SUC2 wyodrębniony z Saccharomyces cerevisiae lub gen neomycynowy z Tn903 lub TnóOl.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że stosuje się różne geny markerowe, wybrane niezależnie.
10. 10. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się wektor zawierający gen struktury PreSż obejmujący pierwszy fragment DNA nadający się do wprowadzania, stanowiący około 1 kb regionu regulatorowego 5' ΑΟΧ1 wyodrębnionego z Pichia pastoris, funkcjonalnie połączony z genem struktury PreS2, funkcjonalnie połączonym z terminacyjną sekwencją 3' ΑΟΧ1 wyodrębnionego z Pichia pastoris, ligowaną z genem markerowym stanowiącym gen HIS4 wyodrębniony z Pichia pastoris, ligowanym z drugim fragmentem DNA nadającym się do wprowadzania, stanowiącym około 0,65 kb terminacyjnej sekwencji 3’ ΑΟΧ1.
11. 11. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się wektor zawierający gen struktury S obejmujący fragment DNA nadający się do wprowadzania, stanowiący około 1 kb regionu regulatorowego 5’ ΑΟΧ1 wyodrębnionego z Pichia pastoris, funkcjonalnie połączony z genem struktury S, funkcjonalnie połączonym z terminacyjną sekwencją 3’ ΑΟΧ1 wyodrębnionego z Pichia pastoris, ligowaną z genem markerowym stanowiącym gen ARG4 wyodrębniony z Saccharomyces cerevisiae, ligowany z fragmentem DNA nadającym się do wprowadzania, stanowiącym około 0,65 kb terminacyjnej sekwencji 3’ ΑΟΧ1.
12. 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako drożdże metylotroficzne stosuje się Pichia pastoris.
13. 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że stosuje się Pichia pastoris szczep PPF1.
14. 14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że PPF1 transformuje się co najmniej jednym liniowym wektorem integracyjnym specyficznym względem miejsca obejmującym kolejno a/ pierwszy fragment DNA nadającego się do wprowadzenia, b/ gen markerowy i co najmniej jedną zgodną z Pichia kasetą ekspresyjną zawierającą gen struktury PreS2, funkcjonalnie połączony z c/terminacyjną sekwencją 3’, taką jak wyodrębniona z genu ΑΟΧ1, genu p40, genu DHAS lub genu HlS4 wyodrębnionych z Pichia pastoris, i d/ drugi fragment DNA nadającego się do wprowadzania, przy czym kolejność występowania genu markerowego i kasety w składniku b/ może być wymienna, oraz co najmniej jednym wektorem integracyjnym, obejmującym kolejno a/ co najmniej jeden fragment dNa nadający się do wprowadzania, b/ gen markerowy i co najmniej jedną zgodną z Pichia kasetę ekspresyjną, zawierającą gen struktury S, funkcjonalnie połączony z c/terminacyjną sekwencją 3’, takąjak wyodrębniona z genu ΑΟΧ1, genu p40, genu DHAS lub genu HIS4 wyodrębnionych z Pichia pastoris, przy czym kolejność występowania genu markerowego i kasety w składniku b/ może być wymienna.
15. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że stosuje się liniowy gen struktury PreS2 obejmujący pierwszy fragment DNA nadający się do wprowadzania, stanowiący około 1 kb regionu regulatorowego 5’ ΑΟΧ1 wyodrębnionego z Pichia pastoris, funkcjonalnie połączony z genem struktury PreS2, funkcjonalnie połączonym z terminacyjną sekwencją 3’ ΑΟΧ1 wyodrębnionego z Pichia pastoris, ligowaną z genem markerowym stanowiącym gen HIS4 wyodrębniony z Pichia pastoris, ligowany z drugim fragmentem DNA nadającym się do wprowadzania, stanowiącym około 0,65 kb terminacyjnej sekwencji 3’ ΑΟΧ1.
16. 16. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że stosuje się wektor integracyjny zawierający gen struktury S, obejmujący pierwszy fragment DNA nadający się do wprowadzania, stanowiący około 1 kb regionu regulatorowego 5’ ΑΟΧ1 wyodrębnionego z Pichia pastoris, funkcjonalnie połączony z genem struktury S, funkcjonalnie połączonym z terminacyjną sekwencją 3’ ΑΟΧ1 wyodrębnionego z Pichia pastoris, ligowaną z genem markerowym, stanowiącym gen ARG4 wyodrębniony z Saccharomyces cerevisiae, ligowanym z drugim fragmentem DNA nadającym się do wprowadzania, stanowiącym około 0,65 kb terminacyjnej sekwencji 3’ ΑΟΧ1.
17. 17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę Pichia pastoris PPFl/pTB012-l.
18. 18. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę Pichia pastoris PPFl/pTB012-2.