JPS63209591A - チオバチルス属菌のための組換えプラスミド、水銀耐性ベクタ−プラスミドおよびそれらの作製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野］ 本発明はチオバチルス属での遺伝子操作を行なう際に必
要な組換えプラスミド、該プラスミドに由来する断片と
水銀耐性遺伝子とを組込んだことを特徴とする水銀耐性
シャトル・ベクタープラスミド及びそれらの作製方法に
関するものである。

［従来技術］ チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｅｉ　ｌ　１ｕｓ）属菌は
、硫化鉱床付近に良く見出され、鉱石の生物的リーチン
グ（Ｂａｃｔｅｒｉａ　ｌｅａｅｈｌｎｇ）などに利用
されている。我国での稼動例は少ないが、アメリカにお
いては全席銅量の１０％以上がこのバクテリア・リーチ
ングによるものといわれる。

又、この細菌の特性であるＦｅ２＋からＦｅ３＋への酸
化能力を利用して鉱山廃水の処理、湿式製錬での中間工
程における脱鉄処理、Ｈ２Ｓガスなどの還元性ガスの処
理等の実稼動プラントが我国各地で運転されており、チ
オバチルス属菌は工業的には大変有用な菌であるといえ
る。

しかしながら本発明で用いるチオバチルス属菌は、チオ
バチルスやフェロオキシダンスであり、独立栄養細菌（
Ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ）という特
殊な分類に属し、その生育速度は、他の従属栄養細菌（
ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ）の好
気性菌と比較して極めて遅く、そのため利用用途は制約
をうけることも多い。

又、他の微生物利用技術が行なってきたように、ランダ
ム・スクリーニングによって高い生育速度をもつ菌を検
索しようとする試みも、大きな成果を得たという報告は
少ない。

上記のようなチオバチルス・フェロオキシダンスを利用
する際の障害を打開する手段として遺伝子操作法の導入
が考えられるが、操作を行なうためのクローニング・ベ
クターについては特開昭６０−９１．９８８号「チオバ
チルスフェロオキシダンスのための選択的シャトルクロ
ーニングベクターの製造方法」および特開昭６０−１０
２１８９号「砒素耐性ベクターの作製法」に記載するロ
ウリンゲス（Ｒａｗｌｉｎｇｓ）らによるベクターが公
知である。

チオバチルスフェロオキシダンスははｐ＋ｉ＝２．０付
近という特殊な環境で生育する性質を有する為、一般に
大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｔ）等に用いられるセレクション
・マーカーとしての種々の抗生物質は安定性を欠く。か
（してチオバチルス・フェロオキシダンスのための６効
なセレクション争マーカーが望まれていた。

抗生物質の安定性等についてはＰｈｙｌｌｉｓ。

Ａ、Ｗ、　Ｍａｒｔ４ｎ　ｅｔ　ａｔ、　Ｅｕｒ、Ｊ、
　Ａｐｐｌ、　Ｍ！ｃｒｏｂｉｏｌ。

Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｆ　（１９８３）　１８　：　３９
２−３９５およびＰ、　Ｖｉｓｃａ　ｅｔ　ａｌ、　　
”Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　ａｎｄ　ＡｐｐｌｉｅｄＢ
ｉｏｈｙｄｒｏ　Ｍｅｔａｌｌｕｇｙ”、　ＥＩＳＥＶ
ＩＥＲｐ、４２９〜４４２等に記載されるように、通常
より安定を欠く事実が示されている。

ところで上記Ｒａｗ　ｌ　ｉ　ｎｇｓらの発明において
は、Ａｓがセレクション・マーカーとして使用されうる
と思われるが、前出のｐ、　ＶｉＳＣａらの研究によれ
ば、Ａｓは、チオバチルス・フェロオキシダンス培地中
におイテ、Ａｓ（ｍ）およびＡｓ　　（Ｖ）（亜砒酸お
よび砒酸）の形で存在し、これらの生長阻害濃度は、Ａ
ｓ　　（ＩＩＩ）で１６μＭ、　Ａｓ　　（Ｖ）で３２
ｒｎ　Ｍであると報告されている（Ｒａｗｌｉｎｇｓら
の発明によれば２０倍程度という）。

なおＡｓ　　（ＩＩＩ）は、チオバチルス・フェロオキ
シダンス培地中でも徐々に酸化されてＡｓ　　（Ｖ）と
なり、菌体に対する阻害度がおちてゆき、またＡｓ（Ｎ
７）を培地中に菌を阻害出来るほど添加すれば酸化によ
って生ずるＦｅ””１反応し、ＦｅＡｓＯ４（砒酸鉄）
として沈殿してしまうため、厳密にはセレクション・マ
ーカーとはなりにくい欠点を有していた。

［発明が解決しようとする問題点］ （ＭＩ　Ｃは、Ｈｇ　ＣΩ２で０．１〜０．２　ｕ　ｇ
／ｍｌ）をセレクション・マーカーとして利用すること
とし、 ■　チオバチルス・プラスミドを大腸菌中でも効率よく
クローンできる新しい組換えプラスミドの開発によって
、遺伝子操作を行なう際に、チオバチルス・フェロオキ
シダンスの増殖の遅さ、プラスミドの収量の悪さを改良
しようとするものである。

■　■のプラスミドに対して水銀耐性を組換左により付
与したシャトル・クローニング・ベクターの開発を目的
とした。

［問題点を解決するための手段〕 即ち、本発明の目的は、 ■　チオバチルス属菌プラスミドの複製開始点と大腸菌
ベクタープラスミドの複製開始点を含むことを特徴とす
るチオバチルス属菌のための組換えプラスミド； ■　チオバチルス属菌より、チオバチルス属プラスミド
の複製開始点を含むプラスミドを取出した後精製する第
１工程、このプラスミドと大腸菌ベクタープラスミドを
同一の制限酵素で各々切断する第２工程、次いで前記大
腸菌ベクタープラスミド中にチオバチルス属菌プラスミ
ドを組み込む第３工程、次いで、得られた組換えプラス
ミドを大腸菌内でクローニングする第４工程からなるこ
とを特徴とするチオバチルス属菌のための組換えプラス
ミドの作製法； ■　水銀耐性遺伝子を含むプラスミドから取り出した水
銀耐性遺伝子部位を含む領域を組み込まれたことを特徴
とする大腸菌プラスミド；■　チオバチルス（Ｔｈ１ｏ
ｂａｅｉ　ｌ　Ｉｕｓ）属菌プラスミドの複製開始点と
大腸菌（Ｅ、　ｅｏｌｉ）ベクタープラスミドの複製開
始点とを含み、水銀耐性マーカー遺伝子が組み込まれて
いることを特徴とする水銀耐性シャトル−ベクタープラ
スミド；および （■　チオバチルス属菌より、チオバチルス属菌プラス
ミドの複製開始点を含むプラスミドを取り出した後精製
する第１工程、このプラスミドと大腸菌ベクタープラス
ミドを同一の制限酵素で、各々切断する第２工程、次い
で前記大腸菌ベクタープラスミド中にチオバチルス属菌
プラスミドを組み込む第３工程、得られた組換えプラス
ミドを大腸菌内でクローニングする第４王程、水銀耐性
遺伝子を含むプラスミドから水銀耐性遺伝子部位を含む
領域を取り出し、大腸菌ベクタープラスミドに組み込ん
で組換えベクタープラスミドを作製する第５王程、 第４工程で得られた組換えプラスミドと第５工程で得ら
れた組換えベクターノブラスミドとを同一の制限酵素を
用いて開裂し、前者のプラスミドからチオバチルス属菌
由来の断片を切り出し、該断片を後者のベクタープラス
ミドに組み込む第６工程、および ここで得られた組換えプラスミドを大腸菌内でクローニ
ングする第７玉程からなることを特徴とする水銀耐性ベ
クタープラスミドの作製法を提供することにある。

現在、チオバチルス・フェロオキシダンスの遺伝子工学
的研究は数少な（、その為、プラスミドの構造および機
能もはっきりとしたものはほとんどなく、且つ形質転換
に成功したという報告は本発明前らの知る限り［ｌ′界
にない。

その為、本発明においては、チオバチルス・フェロオキ
シダンス・プラスミドの複製開始点を得る目的のみで、
土壌中の菌体より、プラスミド保Ｈの菌株を検索するこ
とから始め、同和鉱業小板鉱山（秋田県）および橿原鉱
山（岡山県）より、４種の保有菌株を検索できた。

そのうち２種の菌株を用いることとし、それらの名称を
Ｙ５−９菌株（微工研菌寄第９１５７号）、Ｂ−１２菌
株（微工研菌寄第９１５６号）とした。

Ｙ５−９菌株は４．７ｋｂのプラスミド（以下ｐＴｓＹ
９１という（第２図））１本Ｂ−１２菌株は、５、ｌｋ
ｂのプラスミド（以下ｐ　Ｔ　Ｓ　Ｂ　１２１という（
第３図））、８．９ｋｂのプラスミド（以下ｐＴＳＢ１
２２という（第４図））、１３ｋｂのプラスミド、他に
これらより大きい部位に４本のプラスミド計７本を何し
ていることを確認した。

次いでこれらのプラスミドより複製開始点を得ること、
また制限酵素切断地図の確認その他操作−１−チオバチ
ルス・フェロオキシダンスからプラスミドを得ていたの
では大量のサンプルを得られないことから、実施例１の
如く、大腸菌においてチオバチルスψフェロオキシダン
スのプラスミドをクローニングすることを試みた。

前述のようにチオバチルス・フェロオキシダンスの遺伝
子研究はまだわずかであり、機能はもとより複製開始点
の位置についてもほとんどわかっていないため、クロー
ニングはチオバチルスφフェロオキシダンス・プラスミ
ドの制限酵素切断部位がなるべく対称位置にある２種の
制限酵素によって行なった。

大腸菌にクローニングするベクターとしては、ｐ　Ｂ　
Ｒ３２２（第５図）を用い、第１図に示すようにｐＢＲ
３２２とｐＴｓＹ９１をｐｓｔＸで切断して結合−ｐＴ
Ｙ　１０１ ｐＢＲ３２２とｐＴｓＹ９１をＥｃｏＲＶで切断して結
合→ｐＴＹ　１０２ ｐＢＲ３２２とｐＴｓＢ１２１をｐｓｔ　Ｉで切断して
結合−ｐＴＢ２１１ ｐＢＲ３２２とｐＴｓＢ１２１を５ａｌＩで切断して結
合→ｐＴＢ２１２ ｐＢＲ３２２とｐＴｓＢ１２２をＳａｌ　Ｉで切断して
結合→ｐＴＢ２２１ の５種の組換えプラスミドを得、チオバチルス・フェロ
オキシダンス・プラスミドを大腸菌内で生産させること
に成功したものである。この場合、実施例２の如く、大
腸菌宿主としてＨＢ　１０１菌沫およびＬＥ３９２菌株
を使用した。

次に水銀耐性遺伝ｒ・であるが、これはＨｇ２＋−Ｈｇ
　Ｏ↑の反応にかかわる水銀還元酵素を発現せしめるＴ
ｎ５０１由来のｍｅｒＲであり、数々の研究者により詳
細な研究がなされている。

今回使用したｍｅｒＲを含むプラスミドは、シュードモ
ナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　ｐ　Ａ　Ｏ２５菌株
のｐ　Ｍ　Ｅ　２８５であり、その詳細はＹｏｓｈｉｆ
ｕＩＩＩｉ　Ｉｔｏ。

ｅｔ　ａｌ、　Ｇ！ＥＮＥ、　３６．　ｐ２７〜３Ｂ　
（１９８５）に明らかにされている。ｐＭＥ２８５の制
限酵素切断地図は第６図に示した。

」二足ｐ　Ｍ　Ｅ　２８５のｍｅｒＲを含む部分は、３
．５ｋｂ程度であるため、まずＣ１ａＩ　−Ｈｉｎｄ　
ＩＩＩ部分を切除してｍｅ　ｒ”を含む領域をｐＢＲ３
２２のＣＩａＩ　−Ｈｉｎｄ　ｍ切断部位にクローニン
グすることを実施例３に示すように試みた。大腸菌菌株
ＨＢ　１０１の形質転換の後、発現したクローンは、途
中にｐ　Ｍ　Ｅ　２８５のＣｌａＩ　−Ｈｌｎｄ　ｍの
ｍ　ｅ　ｒ　Ｒを含まないもう１つの小部位をかみこん
で水銀耐性が発現したためこれをｐＭ６０７として使用
した。

この新しいプラスミドｐＭ６０７を更に小さくする操作
のために、片方のＨｆｉｎｄｍ部位をクレノーフラグメ
ント（Ｋｌｅｎｏｗ　ｆｒａｇａ＋ｅｎｔ）でつぶして
、ｐＭ６０８なるプラスミドを得た。更に、もう一方の
Ｈｌｎｄ　ｍ　−ＡｖａＩ間の除去を行ない、９Ｍ６０
９（第７図））なるプラスミドを得、これを水銀耐性遺
伝子ベクターとして使用した。

次いで、実施例４に示す如く、前述のチオバチルスやフ
ェロオキシダンス・プラスミドの大腸菌クローンから制
限酵素によりチオバチルス・フェロオキシダンス由来断
片を切り出し、同一の制限酵素で９Ｍ６０９を切断し、
そこにチオバチルス・フェロオキシダンス由来断片を連
結（ｌ　ｉｇａｔ　１ｏｎ）し、目的とする新規組換え
プラスミドであるｐＭＴ’Ｙ７１０　　（第８図）　、
ｐＭＴＹ７１１　　（第９図）　、ｐＭＴＢ８２０　　
（第１０図）を作製した。すなわち以下に列挙するとお
りである。

９Ｍ６０９とｐＴＹ　１０１をｐｓｔ　　Ｉで切断して
連結−ｐＭ’ｒＹ７１０ ９Ｍ６０９とｐＴＹ１０２をＥｅｏｌ？Ｖで切断して連
結−ｐＭＴＹ７１１ ９Ｍ６０９とｐＴＢ２１１をｐｓｔ　　Ｉで切断して連
結−９Ｍ１’Ｂ８２０ ［作　　用］ 本発明の新し、い組換えプラスミドは、大腸菌とチオバ
チルス・フェロオキシダンスとの両投製開始点を含み、
チオバチルス・フェロオキシダンスでも大腸菌（Ｅ、　
ｃｏｌｔ）においても発現でき、」二足水銀耐性遺伝子
をも含む組換えプラスミドは、チオバチルス・フェロオ
キシダンスへの組換え時において水銀耐性をセレクショ
ン・マーカーとして使用できる全く新規なチオバチルス
属菌用のシャトル７クローニング／ベクター〆プラスミ
ドである。

［実　施　例］ 以下、実施例をもとに詳細に説明する。

実施例　１ チオバチルス帝フェロオキシダンスをシルバーマン（Ｓ
ｉ　Ｉｖｅｒｍａｎ）らの９に培地（（ＮＨ４）　２５
０４３ｇ、、に２ＨＰＯ４０，５ｇ。

Ｍｇ５０　　・７　Ｈ２００，５ｇ　−Ｋ　Ｃ１０゜ｌ
　ｇ。

Ｃａ　　（Ｎｏ３）　２０．０１ｇ、Ｆｅ　Ｓｏ４’１
７Ｈ２０４４，２２ｇ、　ｐｌ！２．０　　（Ｈ２ＳＯ
４で調節））９ｆｌに接種し、２０間３０℃で培養した
ものを遠心で集め、０．１　Ｎ　　Ｈ２ＳＯ４で菌を洗
浄し、次いでＴＥＳ溶液（ｐＨ７，８、Ｔｒｉｓ　−Ｈ
Ｃ＆！　２０ｍＭ５Ｎａ　Ｃ１１００ｍＭ、ＥＤＴＡ５
ｒｎＭ）で洗浄した後、菌に凍結融解を２度施こした。

該チオバチルス・フェロオキシダンス菌の中からプラス
ミドを回収するには、ＭＯｌｅ（ＬＪｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ　（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｅ、　Ｐ、　Ｆｒ
１ｔｓｃｈ。

Ｊ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ
１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

１９８２）などに示されるアルカリ性（ＡＩｋａｌｌｎ
ｅ）ＳＤＳ法を改良した以下の手順により回収した。

まず湿量的１ｇの菌体ペレットに、１０ｍｇ／ｍ！リゾ
チームを含む溶液Ｉ　（５０ｒｎＭグルコース、２５　
ｍ　Ｍｌ−リス（Ｔｒ４ｓ）　　−ＨＣ（！　　（ｉ）
ｌＩ＝　８．０）ｌＯｍ　ＭＥＤＴＡ）４ｍｌを加え、
室温で５分処理し、次いで、溶液ＩＩ（０，２Ｎ　　Ｎ
ａ　ＯＨ，１９６ＳＤＳ）８ｍｌを加え、４℃で５分処
理し、溶液ｍ　（５Ｍ酢酸カリウム６０ｍ１．氷酢酸１
１．５ｍｌ、　Ｈ２Ｏ２８，５ｍｌ、ｐＨ＝５．２）を
６ｍｌ加え、４℃で５分処理した後、１５．００Ｏｒ、
ｐ、ｍ　、４℃、１０分の遠心分離を行ない」二清を取
出した。

−Ｌ清は、フェノール処理による脱タンパクを施こした
後、イソプロパツールで核酸部分を沈殿させ、遠心して
集め、凍結乾燥させた。

更に、これを塩化セシウムによる密度勾配遠心（２０８
Ｃ，５５，００Ｏｒ、ｐ、ｍ　、　１６時間）をかけ、
プラスして前記Ｙ５−９菌株からｐＴｓＹ９１プラスミ
ド、Ｂ−１２菌株からｐＴｓＢ１２１プラスミド、ｐ　
Ｔ　Ｓ　Ｂ　１２２プラスミドを回収した。

実施例　２ 実施例１で得られたｐ　Ｔ　Ｓ　Ｙ９１　（４，７ｋｂ
）プラスミドの約１μｇのＤＮＡを制限酵素ＥｅｏＲＶ
で切断した（３７℃、１時間）。これによりｐ’ｒｓｙ
９１は１本の線状のＤＮＡとなる。

次に、Ｅ、　ｃｏｌｔのプラスミドｐＢＲ３２２（Ｓｕ
ｔｅ１１ｆｆ’ｅ、　Ｊ、　Ｇ、　Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉ
ｒ＋ｇ　ＩｌａｒｂｏｒＳｙｍｐｏｓｉｕｍ、　Ｖｏｌ
　４３．７７〜９０　（１９７９））を同様にＥｅｏＲ
Ｖで切断した。ｐＢＲ３２２のＥｅｏＲＶ部位は、ｐＢ
Ｒ３２２がもつ２種の耐性、アンピシリン及びテトラサ
イクリン耐性のうち、テトラサイクリン耐性遺伝子の途
中に位置するため、ここ性を消失させることができる。

ｐＢＲ３２２をＥｅｏＲＶ部位で切断シタフラグメント
を緩衝液（５０ｍＭ、Ｔｒｌｓ　−ＨＣｌ）（ｐＨ＝９
．０）、ｉｍＭ　　λ４ｇ　ＣＩ！　　、　０．１　ｍ
ＭＺｎＣΩ　、１ｍＭスペルミジン）のもとに、大腸＋
’ｆｆ１Ｃ７５由来のアルカリ性ホスファターゼによっ
て処理しく６５℃、１時間）、切断末端のリン酸基を取
り除くことにより、後の操作で自己連結をしないように
した。

その後、ｐ　Ｔ　Ｓ　Ｙ９１とｐＢＲ３２２の両Ｅｅｏ
Ｒ■切断フラグメントを混合し、緩衝液（５０ｒｎＭＴ
　ｒｉｓ　−ＨＣ１（ｐＨ＝　７．６）、１０ｍＭ　　
Ｍｇ　ＣＩ２．１０ｍＭジチオスレイトール）のもとに
Ｔ４−ＤＮＡ−リガーゼを作用させ１６℃、−昼夜のイ
ンキュベーションでｐＢＲ３２２にｐ　Ｔ　Ｓ　Ｙ９１
をはさみ込んだ（ライゲーション）。

次いで得られたプラスミドは大腸ｍ　ＨＢ　ｔｏｔ菌株
の能力細胞に導入し、アンピシリン５０μｇ　／　ｒｎ
ｌを含む寒天平板培地に塗布し、３７℃でインキュベー
ションして発現させた。

（この場合能力細胞の調製は以下のように行った。

大腸菌Ｉ（ＢＬＯＩ　　（ＬＥ３９２の場合も含む）菌
株を、ＬＢ培地（トリプトン１％、イーストエキストラ
クト０，５％、Ｎａ　ＣΩ１％、ｐＨ＝７．５）に接種
、培養したカルチャー５０μｇを０，１％グルコースを
含むＬＢ培地５ｍｌに再接種し、３７℃、２時間培養し
て、６　Ｘ　１０７ｅｅｌ　Ｉ／　ｍｌ程度に増殖した
ところでとりだし、０℃に３０分放置した。次いで、こ
れを２．７０Ｏｒ、ｐ、ｍで４℃、５分遠心分離して集
菌し２．５ｍｌの５０ｍＭ　　Ｃａ　ＣΩ２を加え、菌
体を懸濁させ、０℃にて１時間放置した。その後、１．
７０Ｏｒ、ｐ、ｎ＋で４℃、５分遠心集菌１２．５００
μ、Ｑの５０ｍＭＣａＣΩ２・１０％ｈ／ｖ）グリセリ
ンを加え、静かにＭ、　Ｑさせて能力細胞を得た。

これを１００μＮ分注し１００μｉＦの２５ｒｎＭＭｇ
　ＣＮ　　、ｌＯｒｎＭＣａ　ＣＤ　２液を加え、さら
に導入を希望するＤＮＡ溶液を加え０℃、２０分放置、
室温で１０分放置後、０．１％グルコースを含むＬＢ培
地を１ｍｌ加え、３７℃で１時間インキュベートする。

これをＬＢ寒天平板培地に塗布してコロニーを発生させ
た。） このようにしてアンピシリンプレート上に現われたコロ
ニーをテトラサイクリン１２．５μｇ　／　ｍｌを含む
平板培地に移して、ネガティブセレクションを行ない、
ｐＢＲ３２２の自己連結したものを除き、テトラサイク
リン耐性をもたないコロニーのみを解析し、大腸菌プラ
スミドｐＢＲ３２２のＥｃｏＲ■部位に、チオバチルス
・フェロオキシダンス争プラスミドｐＴｓＹ９１を挿入
した新規なプラスミドｐＴＹ１０２を得た。

同様な方法によりｐ　’ｒ　ｙ　ｔｏｉプラスミド、ｐ
　Ｔ　Ｂ　２１１プラスミド、ｐ　Ｔ　Ｂ　２１２プラ
スミドを得た。

実施例　３ ｐＭＥ２８５のｐＢＲ３２２への連結とｐＭ６０９の作
製 第１および６図に示されるｐ　Ｍ　Ｅ　２８５は、シュ
ードモナス（ＰｓｅｕｄｏＩＩＩｏｎａｓ）　ｐ　Ａ　
Ｏ２５菌株を増殖させ、ハムフレイス（Ｉｌａｍｐｈｒ
ｅｙｓ）らの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ
、　Ａｅｔａ３８３．４５７−４６３．　（１９７５）
）に従って、プラスミドであるｐＭＥ２８５を分離・精
製した。

ｐ　Ｍ　Ｅ　２８５は第６図に示されるような位置に、
水銀耐性を有するため、図の最り部に位置するＣＩａＩ
と左下のＨｌｎｄ■間を切断し、ｐＢＲ３２２のＣＩａ
Ｉ　−Ｈｉｎｄ　ｍ部位にこれを導入した。

ｐＭＥ２８５は、ＣｌａＩ　−Ｈｉｎｄ　ｍでも切断す
ることが出来、０．７％アガロースゲル電気泳動におい
ても約６．６ｋｂ　、　３．６ｋｂ　、　０．４ｋｂの
３つのフラグメントに分離したことを確認した。

ｐＢＲ３２２は、ＣｌａＩ　−Ｈｌｎｄ　ｍの２箇所の
切断で４．３５７ｋｂと、　００６ｋｂの２つに分離さ
れることがわかっているが、小さい方のフラグメントは
電気泳動で確認できないため、そのままｐ　Ｍ　Ｅ　２
８５と混合して実施例１と同様の方法で連結した。

連結したＤＮＡは、大腸菌ＨＢ　１０１の能力細胞に導
入し、ＨｇＣｇ２１０μｇ　／　ｍｌを含む寒天平板培
地に塗布し、水銀耐性遺伝子が導入されたコロニーのみ
を選択した。得られたコロニーを増殖させ、これからプ
ラスミドを分離し、電気泳動してみたところ予想された
ものより大きかった。更に、種々の制限酵素で切断して
電気泳動し、解析したが、ｐＢＲ３２２の０．００６ｋ
ｂがうまく分離せず、両端がＨ１ｎｄｍ部位となってい
る部位にｐ　Ｍ　Ｅ　２８５の３つのフラグメントのう
ちの６．６ｋｂと０．４ｋｂが互いにＣｌａｌ部位同志
で連結し、両端がＨｉｎｄｍ部位となったものが挿入さ
れ、結局１１．４ｋｂの新しいプラスミドができたこと
が分った。これをｐＭ６０７（第１図に示す）とした。

このｐＭ６０７ブラスミドは水銀耐性をクローンできる
ため、これを用いて操作を行った。

更に該ｐＭ６０７を小さくし、使い易いベクターとする
ために、２論所にあるＨｆｎｄｍ部位のうちの１箇所を
失くすことを目的として、ＨｉｎｄｌｌＩによる切断反
応を途中で止め、片方だけ切れているＤＮＡアガロース
ゲル泳動によって分離回収し、緩衝液（３０ｍＭ　　Ｔ
ｒｉｓ　−ＨＣｌ２　　（ｐｌｔ＝７．５）、４ｍＭ　
ＭｇｃΩ　、１ｍＭジチオスレイトール）のちとに０．
１　ｍＭのｄＴＡＰ、ｄＴＴＰ。

ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰを加え、更にクレノーフラグメンｈ
　（Ｋｌｅｎｏｗ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ）により、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩの切断末端を平滑末端とし、その後、連結を行
ない、Ｈｉｎｄｍ部位が片方なくなったＤＮＡを得て、
これを９Ｍ６０８とした。

第１図に示される９Ｍ６０８のＨｉｎｄＩ［Ｉ切断部位
から水銀耐性の手前のＡｖａｌまでを除去する目的で、
ＡｖａＩ部分切断とＨｉｎｄｌｌＴの切断を行ない、次
いでＨｉｎｄｌｌＩ、Ａｖａ１両末端を先述のクレノー
フラグメントを使って埋めた後、連結を行なうことによ
り、８．８ｋｂのｐＭ６０９を得た。

実施例　４ チオバチルスプラスミドとｐＭ６０９の結合実施例２で
得られたｐＴＹｌｏｌ　　（８，９ｋｂ）の精製品を制
限酵素ｐＳＴＩで切断する。該ｐＴＹ１０１はｐＳＴＩ
切断箇所を２箇所もっているため４．４ｋｂと４．７ｋ
ｂの２つのフラグメントとなる。この場合、４．４ｋｂ
は、大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２のフラグメントであ
り、４．７ｋｂはチオバチルス・フェロオキシダンスｐ
ＴｓＹ９１のフラグメントであり、これをアガロースゲ
ル電気泳動によって分離した。ｐＴｓＹ９１由来のフラ
グメントはゲルから切り出し、透析膜の中に、泳動用緩
衝液と共に入れ、電流を流し、ＤＮＡをゲルからとり出
し、フェノール処理、エタノール沈殿を経て、再度精製
品とした。

ベクターとなるｐＭ８０９はｐｓＴＩで切断後、実施例
２に示されるアルカリ性ホスファターゼ処理を施こし、
前述のｐＴｓＹ９１由来の精製品フラグメントを混合し
、連結を行なった。

得られたプラスミドは、大腸菌ＬＥ３９２の能力細胞に
導入し、ＨｇＣΩ２１０μｇ　／　ｍｌを含む寒天平板
培地に塗布し、発現したものを選びとった。

これらの操作により第８図に示すｐＭＴＹ７１０を得た
。

同様に他のプラスミドｐＭＴＹ７１１．ｐＭＴＢ８２０
も制限酵素の切断部位が異なるのみで、同様の操作を経
て得た。ｐＭＴＹ７１１を第９図に、ｐＭＴＢ８２０を
第１０図に示した。

「発明の効果」 本発明の組換えプラスミド又は水銀耐性シャトルベクタ
ー争プラスミドを用いることにより■　チオバチルス・
フェロオキシダンスのプラスミドの増殖を早め、プラス
ミドの収量をｌ−げることかできその解ｊ１１や利用が
し易くなる。；■　宿主である大腸菌ＨＢ　１０１はそ
のままでは水銀に対する耐性は、ＭＩＣで２〜５μｇ　
／　ｍｌであるのに対し、ｐＭ６０７〜６０９で形質転
換した組換え菌体は、２０μｇ／ｍ！（水銀無負荷）５
０μｇ／ｍｌ（水銀負荷培養）より大きい耐性を白。

するという効果を得た。

■　水銀体制シャトルベクターはチオバチルスφフェロ
オキシダンス及び大腸菌の複製開始点を含み、水銀耐性
というチオバチルス・フェロオキシダンスに有効な選択
マーカーを打しているので、チオバチルス・フェロオキ
シダンスに遺伝子操作で他の形質を導入する場合、ｆｒ
効なシャトルベクターとなりうる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明ベクタープラスミド作製のフローシー
ト図であり、第２図ないし第１０図は各々下記のプラス
ミドの制限酵素切断地図である：第２図−チオバチルス
・フェロオキシダンスＹ５−９菌株プラスミドｐＴｓＹ
９１ 第３図−チオバチルス・フェロオキシダンスＢ−１２菌
株プラスミドｐ　Ｔ　Ｓ　Ｂ　１２１第４図−同Ｂ−１
２菌株プラスミドｐＴｓＢ１２２第５図−大腸菌のベク
タープラスミドｐＢＲ第６図−シュードモナスｐＡＯ２
５菌株ｐＭＥ第７図−水銀耐性プラスミドｐＭ６０９第
８図−水銀耐性シャ１−ルベクタープラスミドであるｐ
ＭＴＹ７１０ 第９図−に記シャトルベクタープラスミドｐＭＴＹ７１
１ 第１０図−上記シャトルベクタープラスミドｐＭＴＢ８
２、

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌
   プラスミドの複製開始点と大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベク
   タープラスミドの複製開始点とを含むことを特徴とする
   チオバチルス属菌のための組換えプラスミド。
2. （２）チオバチルス属菌より、チオバチルス属菌プラス
   ミドの複製開始点を含むプラスミドを取り出した後精製
   する第１工程、このプラスミドと大腸菌ベクタープラス
   ミドを同一の制限酵素で各々切断する第２工程、次いで
   前記大腸菌ベクタープラスミド中にチオバチルス属菌プ
   ラスミドを組み込む第３工程、次いで、得られた組換え
   プラスミドを大腸菌内でクローニングする第４工程から
   なることを特徴とするチオバチルス属菌のための組換え
   プラスミドの作製法。
3. （３）水銀耐性遺伝子を含むプラスミドから取り出した
   水銀耐性遺伝子部位を含む領域を組み込まれたことを特
   徴とする大腸菌プラスミド。
4. （４）水銀耐性遺伝子はＴｎ５０１由来のｍｅｒ＾Ｒ遺
   伝子を含むプラスミドｐＭＥ２８５から得られ、大腸菌
   プラスミドはｐＢＲ３２２（４．４ｋｂ）である特許請
   求の範囲第３項のプラスミド。
5. （５）チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌
   プラスミドの複製開始点と大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベク
   タープラスミドの複製開始点とを含み、水銀耐性マーカ
   ー遺伝子が組み込まれていることを特徴とする水銀耐性
   シャトルベクタープラスミド。
6. （６）チオバチルス属菌より、チオバチルス属菌プラス
   ミドの複製開始点を含むプラスミドを取り出した後精製
   する第１工程、このプラスミドと大腸菌ベクタープラス
   ミドを同一の制限酵素で、各々切断する第２工程、次い
   で前記大腸菌ベクタープラスミド中にチオバチルス属菌
   プラスミドを組み込む第３工程、得られた組換えプラス
   ミドを大腸菌内でクローニングする第４工程、 水銀耐性遺伝子を含むプラスミドから水銀耐性遺伝子部
   位を含む領域を取り出し、大腸菌ベクタープラスミドに
   組み込んで組換えベクタープラスミドを作製する第５工
   程、 第４工程で得られた組換えプラスミドと第５工程で得ら
   れた組換えベクタープラスミドとを同一の制限酵素を用
   いて開裂し、前者のプラスミドからチオバチルス属菌由
   来の断片を切り出し、該断片を後者のベクタープラスミ
   ドに組み込む第６工程、および ここで得られた組換えプラスミドを大腸菌内でクローニ
   ングする第７工程からなることを特徴とする水銀耐性シ
   ャトルベクタープラスミドの作製法。