HINTERGRUND
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Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein
die mikrabische Synthese von Phenylalanin und
insbesondere neue DNA-Sequenzen, welche Polypeptidanaloge der
E. coli Enzyms, Chorismatmutase/Prephenatdehydratase
codieren. Im Vergleich mit dem Enzym des wilden Typs,
sind die enzymatischen Aktivitäten der Analogen
resistenter gegenüber Endprodukthemmung
(feedbackinhibition) durch Phenylalanin. Die ein Analoges
codierenden DNA-Sequenzen sind deshalb nützlich als Ergänzung
des enzymatisch Notwendigen von Mikroorganismen, welche
in der Phenylalaninproduktion eingesetzt werden.
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Bei der mikrobischen Produktion von
L-Phenylalanin in E. coli sind zahlreiche metabolischen Enzyme
beteiligt. Unter den Bedeutendsten derselben ist ein
bifunktionales Enzym, Chorismatmutase/Prephenatdehydratase
(CMPD), welches sowohl an der Umsetzung von Chorismat zu
Prephenat als auch von Prephenat zu Phenylpyruvat
beteiligt ist. Es wurde festgestellt, dass CMPD das
Expressionsprodukt des E. coli pheA-Gens ist, der
Nukleotidsequenz, welche durch Hudson et al., J. Mol. Biol., 180,
1023-1051 (1984) berichtet wurde.
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Es wurde vorgeschlagen, dass CMPD enzymatisch
in einer dimeren Form wirke, welche zwei identische
Polypeptidprodukte der pheA Genexpression enthalte. Das Enzym
ist einer "feedback-inhibition" seiner Aktivitäten durch
das Endprodukt des metabolischen Wegs, L-Phenylalanin,
unterworfen. Wenn die Phenylalaninmengen zum Beispiel 1,0
mM erreichen, tritt eine dramatische Verlangsamung der
Prephenatdehydrataseaktivität auf, möglicherweise bedingt
durch die Teilnahme von Phenylalanin bei der reversiblen
Bildung von enzymatisch inaktiven CMPD
Polypeptidtetrameren. [Vergleiche z.B. Baldwin et al., Arch. Biochem.
Biophys., 211, 66-75 (1981).] Bei
Phenylalaninkonzentrationen von etwa 1,0 mM wird die
Prephenatdehydrataseaktivität um mindestens 90 % vermindert.
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Mit dem Aufkommen der rekombinanten
Technologien für das Klonieren und die Expression von Genen,
wurden Versuche unternommen, die endogene CMPD-Kapazität von
E. coli Wirtszellen, welche bei der
Phenylalaninproduktion verwendet werden, zu erhöhen [Forberg et al.,
J. Biotech., 7, 319-322 (1988); Choi et al., Biotechnol.
Lett., 8, 223-228 (1982); Hwang et al., Appl. Microbiol.
Biotechnol., 22, 108-113 (1985); Gil et al., Enzyme
Microb. Technol., 22, 370-372 (1985); Park et al., Chem.
Eng. Commun., 45, 185-196 (1986)].
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Ueber mutante E. coli Stämme wurde berichtet,
dass sie CMPD Enzym im wesentlichen frei von Phenylalanin
Endprodukthemmung (feedback inhibition) produzieren.
Vergleiche z.B. Tribe, Published Australien Application
No 72727/81.
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Backmann et al., U.S. Patent Nr. 4,753,883
beschreiben jene Transformation von Wirtszellen mit
"mutanten DNA-Sequenzen, welche für CMPD analoge
Polypeptide codieren, die gegenüber der Phenylalaninhemmung
weniger empfindlich sind, auf der Basis, dass "... das
katalytisch kritische Segment von E. coli CMPD innerhalb
dessen 337 N-terminalen Aminosäuren liege, dass die
Phenylalanin "feedback"-Empfindlichkeit auf einem einzelnen
Aminosäuretryptophan 338 beruhe, und dass die Löschung
der gesamten 49 C-terminalen Aminosäuren die katalytische
Aktivität nicht zerstöre, dass sie jedoch die Endprodukt
(feedback)-Empfindlichkeit im wesentlichen zerstöre".
Backmann et al. schlagen die Entwicklung von
Plasmidvektren vor, welche DNA-Sequenzen beinhalten, die CMPD Trp³³&sup8;
Deletionsanaloge codieren, sowie Substitutionsanaloge,
welche Trp³³&sup8; umfassen und die Verwendung solcher
Plasmidvektoren um mikrobische Wirte für die
Phenylalaninherstellung zu transformieren.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG
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Die vorliegende Erfindung stellt neue DNA-
Sequenzen bereit, welche für E. coli CMPD analoge
Polypeptide codieren, deren enzymatischen
Prephenatdehydratase- und/oder Chorismatmutase-Aktivitäten weniger
empfindlich gegenüber Hemmung durch die Gegenwart von
Phenylalanin sind, als das CMPD-Enzym des Wildtyps von E. coli.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner die Polypeptide
bereit, die durch diese Sequenzen codiert werden. DNA-
Sequenzen gemäss der vorliegenden Erfindung schliessen
jene ein, welche für Deletions-, Substitutions- und/ oder
Additionsanaloge codieren, welche die Reste 301 bis 315,
und vorzugsweise die Reste 304 bis 310, von E. coli CMPD
beeinflussen. Gegenwärtig bevorzugte Analoge codierende
Sequenzen bezeichnen die folgenden Polypeptide, worin und
für die in der Folge "des" eine Deletion oder das Fehlen
des Restes bezeichnet, mit dem es verbunden ist: [des-
Gln³&sup0;&sup7;, des-Ala³&sup0;&sup8;, des-Gly³&sup0;&sup9;, des-Ala³¹&sup0;]- CMPD;
[Leu³&sup0;&sup6;]CMPD; [des-Thr³&sup0;&sup4;, Lys³&sup0;&sup5;, des-Gln³&sup0;&sup6;]CMPD; und
[Cys³&sup0;&sup9;]CMPD Die Expressionsprodukte jeder dieser Analoge
codierenden DNA-Sequenzen zeigen sowohl
Prephenatdehydratase als auch Chorismatmutaseaktivität, aber eine
oder beide dieser enzymatischen Aktivitäten dieser
Produkte ist weniger empfindlich gegenüber Hemmung durch die
Gegenwart von Phenylalanin. Wegen seiner Resistenz
gegenüber Hemmung der Prephenatdehydrataseaktivität bei 100 mM
Konzentration Phenylalanin bevorzugt ist das
Expressionsprodukt der für [des-Thr³&sup0;&sup4;, Lys³&sup0;&sup5;, des-Gln³&sup0;&sup6;]CMPD
codierenden DNA-Sequenz. Bevorzugt wegen ihrer Resistenz
gegenüber Hemmung der Chorismatmutaseaktivität ist
[Cys³&sup0;&sup9;]CMPD.
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Ferner werden durch die vorliegende Erfindung
autonom replizierende Expressionsvektoren bereitgestellt,
welche DNA-Sequenzen gemäss der Erfindung enthalten, die
wirksam mit DNA-Kontrollsequenzen für die Expression
(Promotoren, Operatoren und ähnlichen) verbunden sind,
wodurch sie die Expression (Transkription und
Translation) der gewünschten CMPD-analogen Polypeptide in einer
ausgewählten Wirtszelle, z.B. in damit transformierter
E. coli erleichtern. Bevorzugte Expressionsvektoren
enthalten ein auswählbares Marker-Gen zur Verwendung für die
Bestätigung der Wirtszellentransformation und sie
schliessen einen Promotor ein, welcher DNA-Sequenzen zur
Expressionskontrolle aufweist, die zwischen EcoRI- und
HaeII-Stellen, wie in Beispiel 1 angegeben, modifiziert
und von jenen abgeleitet sind, die wirksam mit der
endogenen Expression des E. coli-Wildtyp-CMPD-Enzyms (z.B.
der Expressionskontrollsequenz des E. coli pheA-Gens)
verbunden sind.
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Während bevorzugte prototypische E. coli
CMPD-Analoge codierende DNA-Sequenzen der vorliegenden
Erfindung durch chemische Mutagenese entwickelt wurden,
die an einem Vektor ausgeführt wurden, welcher das pheA-
Gen des E. coli Wildtyps einschloss, ist es im Einklang
mit der vorliegenden Erfindung, hiernach die Bildung von
DNA-Sequenzen gemäss der Erfindung durch
In-vitro-Mutagenese (durchgeführt z.B. am pheA-Gen des Wildtyps) zu
bewirken, sowie durch die Herstellung mittels chemischer
Synthese eines Teils oder der ganzen für das
CMPD-Polypeptid codierenden Sequenz.
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Bei DNA-Sequenzen gemäss der Erfindung,
welche Deletionsanaloge von CMPD codieren, fehlen von einem
bis zu 15 Codone, welche Reste innerhalb des Bereichs
bezeichnen, der die Aminosäurereste der Positionen 301 bis
315 in der Aminosäursequenz des Wildtypenzyins überspannt.
Deletionen können kontinuierlich oder diskontinuierlich
sein und werden vorzugsweise in dem Bereich gemacht, der
die Basenpaare, welche für die Aminosäurereste 304 bis
310 codieren, überspannt. Substitutionsanaloge codierende
DNA-Sequenzen gemäss der Erfindung schliessen jene ein,
bei welchen von einem bis zu drei Basenpaaren innerhalb
von Codonen, welche einen oder mehrere Reste an den
Positionen 301 bis 315 (und vorzugsweise die Reste 304
bis 310) in der Aminosäuresequenz von CMPD spezifizieren,
in einer Weise geändert werden, die an der Stelle, an der
die Aenderung gemacht worden ist, die Expression einer
anderen Aminosäure, als jener erlaubt, welche beim
Wildtypenzym vorhanden ist. Additionsanaloge codierende DNA-
Sequenzen schliessen dementsprechend zusätzliche Codone
für zusätzliche Reste in den oben beschriebenen Bereichen
des Enzyms ein. Gegenwärtig bevorzugt sind jene
DNA-Sequenzen, welche deletionsanaloge Polypeptide,
substitutionsanaloge Polypeptide und Polypeptidanaloge
codieren, welche sowohl Deletionen als auch Substitutionen in
der Aminosäuresequenz von CMPD des Wildtyps umfassen. Es
liegt ebenfalls innerhalb der Absicht der Erfindung, dass
die oben angegebenen Modifikationen mit anderen bekannten
oder später entwickelten DNA-Sequenzmodifikationen
"kombiniert werden", welche die Expression von CMPD
Polypeptidanalogen erlauben, die erhöhte Chorismatmutase
und/oder Prephenatdehydrataseaktivität oder zusätzlich
verstärkte Phenylalanin "feedback inhibition"-Resistenz
zeigen.
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Die DNA-Sequenzen der Erfindung sind von
offensichtlicher Nützlichkeit für den Zweck, die
zelluläre Kapazität zu erhöhen, um die Synthese von
Phenylalanin zu bewirken, wenn sie in einem geeigneten E. coli
Wirt transformiert sind (mittels eines Vektors oder durch
die Verwendung von chromosomalen Insertionstechniken).
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Andere Aspekte und Vorteile der vorliegenden
Erfindung werden bei der Berücksichtigung der
ausführlichen Beschreibung und der bevorzugten Ausführungsformen
derselben klar.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
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Die Figur ist eine Restriktionskarte eines
Plasmids, pJN302, welche pheA DNA einschliesst.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
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Die folgenden, veranschaulichenden Beispiele
betreffen die Entwicklung gegenwärtig bevorzugter DNA-
Sequenzen der Erfindung. Insbesonders betrifft Beispiel 1
die Entwicklung von Analoge codierenden DNA-Sequenzen
mittels chemischer Mutation; Beispiel 2 liefert die
Resultate des Phenylalanin "feedback inhibition"-Screening;
und Beispiel 3 betrifft die Sequenzanalyse, durchgeführt
an in Beispiel 1 aufgefundener DNA-Sequenz.
BEISPIEL 1
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Chemische Mutagenese wurde am Plasmid pJN302
durchgeführt. Plasmid pJN302 besteht aus dem Vektor
pLG338, welcher einen EcoRI bis BamHI Insert trägt,
welcher das pheA-Gen von E. coli K12 enthält. Das pheA-Gen
wurde modifiziert um Regulierungssequenzen zu entfernen,
welche mit dem Promotor verbunden sind, und um eine
BamHI-Stelle, stromabwärts der codierenden Sequenz,
einzufügen. Das pheA-Gen codiert das CMPD des Wildtyps.
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Das pheA-Gen kann aus dem Chromosom von
E. coli K12 auf einem 6,3 kb EcoRI bis BamHI-Fragment,
wie sowohl in Edwards et al., PCT Veröffentlichung
Nr. WO/87/ 00202 (hier durch Referenz eingeschlossen) als
auch Hudson et al., J. Mol. Biol., 180, 1023-1051 (1984)
beschrieben, isoliert werden. Nach der Bestimmung der
Nukleotidsequenz des pheA-Gens und dessen benachbarten
Regionen kann eine BamHI-Restriktionsstelle direkt
unterhalb des Gens eingeführt werden, indem die Sequenz GGTGCC
mittels "in vitro" Mutagenese wie in Edwards et al., PCT
Publikation Nr. WO 87/00202 gezeigt, in GGATCC
umgewandelt werden. Diese Sequenz beginnt beim 7. Nukleotid,
welches auf das TGA Stop-Codon des pheA-Gens folgt, wie
nachfolgend angegeben.
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Der Promotorbereich des pheA-Gens kann
dereguliert werden, indem die Promotor- und
Attenuatorsequenzen durch einen synthetischen Promotor ersetzt werden,
welcher auf dem natürlichen Promotor basiert, dem jedoch
die Dyad-Symmetrie fehlt, welche die Pribnow-Sequenz
(-10) überlappt. Dieser Ersatz kann zwischen der EcoRI-
Stelle oberhalb des Gens und einer HaeII-Stelle innerhalb
des N-Terminus des natürlichen pheA-Gens gemacht werden.
Die Nucleotidsequenz des synthetischen Ersatzbereichs
kann sein:
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Die terminalen Restriktionsstellen sind
unterstrichen, sowie auch die -35 und -10 Bereiche des
Promotors und die Ribosomen-Bindungsstelle (S.D. gefolgt
durch das ATG Startcodon). Das pheA-Gen kann aus den
Konstruktionen, die in Edwards et al. beschrieben sind,
durch Spaltung mittels BamHI und EcoRI an der
stromaufwärts gelegenen EcoRI-Stelle und an der stromabwärts
gelegenen BamHI-Stelle isoliert werden, und EcoRI/BamHI
kann in mit EcoRI und BamHI gespaltenem pLG338 [Stocker
et al., Gene, 18, 335-341 (1982)] cloniert werden, um
pJN302 zu erzeugen, von dem eine Restriktionskarte in der
Figur veranschaulicht ist. pLG338 ist von vielen
Laboratorien
leicht erhältlich, einschliesslich dem
Laboratorium von Stoker et al.
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Etwa 2 ug an pJN302 DNA wurde in einer 200 ul
Reaktionsmischung mit 50 mM Natriumacetat pH 4,6, 88 mM
Natriumnitrit und 0,25 mM Spermin kombinert. Die
Reaktionsmischung wurde bei 30ºC inkubiert und eine 60 ul
Probe wurde nach 30 Minuten entnommen. Die Probe wurde in
30 ml an 1 M Tris bei pH 8 gegeben. Zu diesem wurden 4,5
ul an 4 M Natriumchlorid und 300 ul Ethanol gegeben. Die
DNA wurde dann bei -20ºC während 4 Stunden ausgefällt und
mittels Zentrifugation in einer Eppendorf-Microfuge
gewonnen. Eine weitere Probe von 70 ul wurde bei 60 Minuten
entnommen und zu dieser wurden 35 ul 1 M Tris, pH 8,
gegeben. Weitere 5,25 ul an 4 M Natriumchlorid und 350 ul
Ethanol wurden dann zugegeben. Die DNA wurde wie zuvor
ausgefällt und gewonnen. Die übriggebliebenen 70 ul an
Reaktionsmischung wurden nach insgesamt 90 Minuten
Inkubation entfernt und genau wie die 60 Minuten-Probe
behandelt.
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DNA-Pillen wurden in 10 ul Wasser
resuspendiert und 3 ul von jeder wurden verwendet, um geeignete
Zellen des Bakterienstamms HW1012 (pheA) zu
transformieren. Die Transformanten wurden auf LB-Platten, welche
40 ug/ml Kanamycin enthielten, isoliert. Schätzungsweise
200-400 Transformanten wurden pro Platte erhalten. Alle
Kolonien wurden in insgesamt 1,5 ml an L-Nährlösung
vereint. Die Zellen wurden gewaschen und in Kochsalzlösung
1:5 verdünnt. Anschliessend wurden Zellen ausgewählt,
welche in der Lage waren, auf Platten zu wachsen, welche
die toxischen Aminosäureanalogen β-2-Thienylalanin oder
3-Fluor-tyrosin enthielten. Insbesonders wurden 100 ul
Teilmengen an gewaschenen Zellen auf jedem der folgenden
Wachstumsmedien geplattet:
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1) M9 Minimalmedium, 0,5 % Glucose, 40 ug/ml
Kanamycin und 10 mM β-2-Thienylalanin (ein toxisches
Analoges von L-phenylalanin).
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2) M9 Minimalmedium, 0,5 % Glucose, 40 ug/ml
Kanamycin und 20 mM β-2-Thienylalanin.
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3) M9 Minimalmedium, 0,5 % Glucose, 40 ug/ml
Kanamycin und 1 mM 3-Fluortyrosin.
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Einige Tausend Kolonien wurden auf der Platte
erhalten, welche 10 mM β-2-Thienylalanin enthielt.
Mehrere wurden getestet und zeigten ein geringes Mass an
"feedback inhibition" (Endprodukthemmungs)-Resistenz.
Diese wurden nicht weiter untersucht. Zwanzig Kolonien
wurden auf der Platte erhalten, welche 3-Fluortyrosin
enthielt. Vier von diesen wurden untersucht und zeigten
auch geringe Niveaus an "feedback inhibition"-Resistenz.
Diese wurden nicht weiter untersucht. Vier Kolonien
wurden auf der Platte erhalten, welche 20 mM
β-2-Thienylalanin enthielt. Jede von diesen produzierte CMPD mit
sehr hohem Niveau an "feedback inhibition"-Resistenz
gegenüber L-Phenylalanin. Aus diesen wurde Plasmid-DNA
isoliert und verwendet, um frische geeignete Zellen von
HW1012 zu re-transformieren.
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Zellen, welche mit Plasmiden von jeder der
vier Kolonien re-transformiert worden waren, waren in der
Lage zu wachsen, wenn sie auf Platten mit M9
Minimalmedium, 0,5 Glucose, 40 ug/ml Kanamycin und 20 mM β-2-
Thienylalanin gestrichen wurden. Retransformanten
produzierten ausserdem CMPD mit "feedback
inhibition"-Resistenzniveaus gegenüber L-Phenylalanin, welche denjenigen
der Originalisolate entsprachen. Von jedem Retransformant
wurde dann Plasmid-DNA isoliert und charakterisiert, um
die Natur der Mutationen innerhalb des pheA-Gens
festzustellen. Die vier mutanten Plasmide wurden mit pJN305,
pJN306, pJN307 und pJN308 bezeichnet.
BEISPIEL 2
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Die Resistenz gegenüber Phenylalanin "feed-
back inhibition" wurde für die mutmasslichen
CMPD-Analogen, welche durch die vier mutagenisierten, von einem
Plasmid getragenen CMPD DNA-Sequenzen codiert werden,
analysiert und mit jener des Wildtyp CMPD-Produkts der
pheA-Genexpression wie folgt verglichen.
HERSTELLUNG VON ZELLEXTRAKTEN
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Um Enzym für den CMPD-Test zu isolieren,
wurde ein 25 ml Volumen von Zellen von HW1012, die entweder
pJN302, pJN305, pJN306, pJN307 oder pJN308 enthalten, in
L-Kulturlösung enthaltend 40 ug/ml Kanamycin zu einer
optischen Dichte (O.D.) von etwa 1,0 gezüchtet. Zellen
wurden mittels Zentrifugation gewonnen, in 10 ml 200 mM
Tris bei pH 8 gewaschen und in 1 ml 200 mM Tris pH 8
resuspendiert. Die Zellen wurden dann in einer
französischen Druckzelle (French pressure cell) lysiert. Das
Lysat wurde während 15 Minuten bei 14 k rpm zentrifugiert
und der Ueberstand für den Test zurückbehalten. Für den
PD-Test wurden 50 ul Ueberstand verwendet und für den CM-
Test 20 ul.
PD-Test-Verfahren
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Die PD-Aktivität wurde in 1,25 ml
Reaktionsmischungen enthaltend 27 mM Tris bei pH 8, 1 mM
Kaliumprephenat, 50 ul zu testendes Zellextrakt und
verschiedene Konzentrationen an L-Phenylalanin, wie in Tabelle 1
gezeigt, getestet. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe
des Prephenats gestartet. Die Reaktion wurde während 1
Minute bei 37ºC inkubiert, zu welchem Zeitpunkt eine 0,25
ml Probe entfernt und mit 0,75 ml 1 M NaOH vermischt
wurde. Die Absorption wurde dann bei 320 nm gegen Wasser als
Blindwert gemessen. Weitere Proben wurden bei 5 und 9
Mifluten entnommen und identisch behandelt.
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Das Mass der Absorptionszunahme bei 320 nm
wurde berechnet und für jedes Blindwertmass in
Abwesenheit von Extrakt korrigiert. Eine Einheit an PD-Aktivität
ist definiert als die Menge an Enzym, welches die
Umsetzung von 1,0 umol an Prephenat zu Phenylpyruvat in einer
Minute katalysiert unter Testbedingungen, die 17 500
M&supmin;¹cm&supmin;¹ als Extinktionskoeffizienten für Phenylpyruvat
verwenden.
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Die PD-Aktivität ist in Tabelle 1 in
Einheiten/ml Extrakt und als Prozentanteil der in
Abwesenheit von L-Phenylalanin bestimmten Aktivität dargestellt.
TABELLE 1
Prephenatdehydratase Aktivität in Einheiten/ml (% zurückbehalten)
Phe Konz. mM
Wild-Typ pJN302
pJN 305
pJN 306
pJN307
pJN308
CM Testverfahren
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CM-Aktivität wurde in 0,8 ml
Reaktionsmischungen enthaltend 1 mM Chorismat, 100 mM Tris bei pH
57,5, 0,5 mM EDTA, 0,01 % BSA, 20 ul zu testendes
Zellextrakt und variierende Konzentrationen an
L-Phenylalanin, wie in Tabelle 2 gezeigt, gemessen.
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Die Reaktionen wurden durch Zugabe des
Zellextrakts gestartet. Die Reaktionen wurden während 5
Minuten bei 37ºC inkubiert, worauf sie durch Zugabe von 0,1ml
4,5 M HCl beendet wurden. Die Reaktionen wurden während
weiteren 10 Minuten bei 37ºC inkubiert, um alles
Prephenat zu Phenylpyruvat umzuwandeln, an welchem Punkt 0,1 ml
12 M NaOH zugegeben und die Absorption bei 320 nm
gemessen wurde. Um die Substratabsorption zu korrigieren
wurden Blindwerte eingeschlossen, welchen nur das
Zellextrakt fehlte. Die Werte wurden auch für die CM-Aktivität
korrigiert, die durch die CM/Prephenatdehydrogenase des
Wirts bedingt war. Alle Tests wurden im Doppel ausgeführt
und die Mittelwerte werden gezeigt. Eine Einheit ist
definiert als die Menge an Enzym, welche die Umsetzung von
1,0 mM an Chorismat zu Prephenat in 1 Minute unter den
Testbedingungen katalysiert. Der Extinktionskoeffizient
entspricht demjenigen für den PD-Test.
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Die CM-Aktivität ist in Tabtelle 2 in
Einheiten/ml Extrakt und als Prozentanteil der in Abwesenheit
von L-Phenylalanin bestimmten Aktivität dargestellt.
TABELLE 2
Chlorismatmutase Aktivität in Einheiten/ml (% zurückbehalten)
Phe Konz. mM
Wild-Typ pJN302
pJN 305
pJN 306
pJN307
pJN308
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Die Tabellen 1 und 2 zeigen klar auf, dass
sowohl die Prephenatdehydratase (PD) als auch die
Chorismatmutase (CM)-Aktivitäten des Wildtypenzyms durch
L-Phenylalanin gehemmt werden, wobei die PD-Aktivität bei
geringen Konzentrationen (10 mM) fast vollständig gehemmt
wird und CM sogar bei hohen (100 mM) Konzentrationen
nicht um mehr als 30 % gehemmt wird. Dies ist im Einklang
mit Resultaten von Studien zur Phenylalaninproduktion
mittels mikrobischer Fermentation, welche wesentliche
Akkumulation des PD-Substrats Prephenat anzeigen, wenn
die Konzentration von L-Phenylalanin 50-100 mM erreicht,
ohne wesentliche Akkumulation des CM-Substrats,
Chorismat. Entsprechend war die Resistenz gegen Hemmung der CM-
Aktivität nicht so dramatisch, während die Resistenz
gegen Hemmung der PD-Aktivität für die CMPD analogen
Expressionsprodukte ziemlich ausgesprochen war. Es ist
jedoch interessant zu bemerken, dass geringe
Phenylalaninkonzentrationen (10 mM) unabhängig ein anständiges Mass
an Aktivierung der CM-Aktivität für die Analogen
bereitstellt - ein Resultat, welches zuvor für das Wildtypenzym
nicht berichtet worden war.
BEISPIEL 3
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Subklonanalyse der Plasmide pJN305, pJN306,
pJN307 und pJN308 zeigte, dass ein 221 Basenpaare langes
AlwNI/Ncol Restriktionsfragment (umfassend die Codone für
CMPD Reste 266 bis 337 des Wildtypenzyms), welches von
jedem der Plasmide erhalten wurde, das AlwNI bis NcoI-
Fragment von pJN302 ersetzen konnte und dass das
resultierende Plasmid die Expression der entsprechenden
gegenüber Hemmung durch Phenylalanin-resistenten
CMPD-Aktivität erlaubte. Die Gesamtsequenzierung von pJN305 zeigte
keine Mutationen ausserhalb des Bereichs, welcher CMPD-
Reste 301 bis 315 spezifiziert, auf.
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DNA-Sequenzanalyse von jedem der vier
AlwNI/NcoI-Fragmente, welche von diesen Fragmenten gewonnen
wurden, zeigt keine Aenderungen in der DNA-Sequenz
ausserhalb des Bereichs, welcher die Codone enthält, die die
CMPD-Reste 301 bis 315 spezifiziert. Tabelle 3 unten
zeigt die Nukleotid und davon abgeleitete
Aminosäuresequenz von pJN302 (Wildtyp) und jene von pJN305, pJN306,
pJN307, pJN308 in diesem Bereich.
TABELLE 3
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Der Wirtsstamm, welcher gegenwärtig bevorzugt
ist, weil er die besten Titer mit einem mutanten pheA-Gen
gemäss der vorliegenden Erfindung bereitstellt, ist der
Stamm bezeichnet als AG077, ein E. coli-Stamm, welcher
mit pJN307 transformiert ist.
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Aus der in Tabelle 3 bereitgestellten
Information ist es ersichtlich, dass jeder dieser ursprünglich
hergestellten CMPD-Analogen sich vom Wildtyp speziell in
nur einem kleinen Bereich umfassend die Reste 304-310
unterscheidet. Die DNAs der Plasmide pJN306 bzw. pJN308
spezifizieren die Substitutionsanalogen [Leu³&sup0;&sup6;]CMPD und
[Cys³&sup0;&sup9;]CMPD; Plasmid pJN305 spezifiziert das
Deletionsanaloge [des-Gln³&sup0;&sup7;, des-Ala³&sup0;&sup8;, des-Gly³&sup0;&sup9;, des-Ala³¹&sup0;]- CMPD
und Plasmid pJN307 spezifiziert die Kombination
Deletions- und Substitutionsanaloges [des-Thr³&sup0;&sup4;, Lys³&sup0;&sup5;,
des-Gln³&sup0;&sup6;]CMPD.
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Obschon chemische Mutation eines durch ein
Plasmid getragenen pheA-Gens das ursprüngliche Mittel
darstellte, um gewisse bevorzugte DNA-Sequenzen der
Erfindung zu erhalten, erlaubt die Information, die durch
das Sequenzieren spezifischer mutierter Klone der oben
genannten Beispiele, wie zuvor angegeben, leicht sowohl
die Duplizierung der mutierten Sequenzen (durch In vitro-
Mutagenese von pheA-Genkopien oder chemische Synthese des
ganzen oder eines Teils des pheA-Gens) und die
Entwicklung anderer Analoge codierender DNAs. Es ist
beispielsweise bemerkenswert, dass der DNA-Bereich, welcher die
Reste 301 bis 315 von CMPD spezifiziert, innerhalb von
221 Basenpaaren des Restriktionsfragments, welches durch
Verdauung des pheA-Gens mit AlwNI und NcoI Endonucleasen
erzeugt wird, enthalten ist. Dieses derart erhaltene
Fragment kann leicht so synthetisiert werden, dass es
einzigartige Restriktionsendonukleasen-Verdauungsstellen
einschliesst, die den Codonen, welche die CMPD-Reste 301
bis 315 spezifizieren, näher benachbart sind und das
synthetische Fragment könnte verwendet werden, um ein
AlwNI/NcoI-Fragment der natürlichen Sequenz im pheA-Gen
zu ersetzen. Danach kann leicht
"Kassetten"-Format-Mutagenese verwendet werden, in welcher kurze synthetische
DNA-Duplexe verwendet werden. Möglicherweise kann die
emporkommende Polymerasekettenreaktion ( PCR)-Technologie
verwendet werden, um gegenüber von Phenylalanin und
Phenylalaninderivaten endprodukthemmungs-resistente
Analoge codierende Sequenzen der Erfindung zu entwickeln.
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Es wird angenommen, dass dem Fachmann
zahlreiche Modifikationen und Variationen der wie oben unter
Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen beschriebenen
Erfindung klar werden. Deshalb sollten darauf nur solche
Beschränkungen auferlegt werden, wie sie in den
beiliegenden Ansprüchen auftreten.