JPH11225769A

JPH11225769A - 糖類変換酵素をコードするｄｎａ、それを含む組換えｄｎａ並びに形質転換体

Info

Publication number: JPH11225769A
Application number: JP10054433A
Authority: JP
Inventors: Toshiya Ota; 俊也太田; Masaaki Yamagishi; 政昭山岸; Kazuo Oishi; 一男大石; Kazuo Mochizuki; 一男望月; Atsushi Higashiya; 篤志東谷; Koichi Yoshinaga; 光一吉永
Original assignee: Shizuoka Prefecture
Current assignee: Shizuoka Prefecture
Priority date: 1998-02-19
Filing date: 1998-02-19
Publication date: 1999-08-24

Abstract

(57)【要約】【課題】マルトースをトレハロースに変換する組み換え
型酵素をコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含む組み換え
ＤＮＡ並びに形質転換体を提供すること。【解決手段】本発明により、マルトースをトレハロー
スに変換する活性を有する酵素またはポリペプチドをコ
ードするＤＮＡが提供される。またこれらのＤＮＡ断片
を含有する組み換えＤＮＡおよびこれらを含む形質転換
体も提供される。さらに、上記組み換えＤＮＡを使用す
るトレハロース合成酵素の製造方法、並びに当該トレハ
ロース合成酵素を使用するマルトースをトレハロースに
変換する方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、マルトースをトレ
ハロースに変換するトレハロース合成酵素活性又は該活
性と機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコード
するＤＮＡ、これらのＤＮＡを含む組み換えＤＮＡ、並
びにこれらの組み換えＤＮＡを含む形質転換体に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】トレハロースはグルコース２分子がα
（１、１）結合した非還元性の二糖類で、天然界では昆
虫、酵母、カビ、細菌、担子菌、紅藻、地衣類、植物等
に広く分布している。このトレハロースは、水分子が重
なった構造と類似しているため、生体内では生命に不可
欠な水の代わりとなり、細胞や蛋白質、核酸等を乾燥や
凍結から守る生体保護機能を有している。また、トレハ
ロースは分子中に還元性基を持たないので、アミノ酸類
の存在下で加熱しても褐変反応いわゆるメーラード反応
を起こすこさないので、着色や変質の心配がなく飲食物
を甘味付けできる利点がある。従って、トレハロース
は、医薬品、診断薬、ホルモン、受精卵、精子、生理活
性物質、酵素、微生物等の有用物質や食品、化粧品に用
いることができる。しかしながら、従来の方法では所望
量のトレハロースを入手するのが難しかった。

【０００３】従来から存在するトレハロースの製造法と
しては、酵母等の微生物から抽出する方法、微生物を用
いた発酵による方法、また酵素によりトレハロースを合
成する方法等が知られている。その中でも、特に酵素に
よりトレハロースを合成する方法が安価な大量生産法と
して注目されている。酵素法としてはラクトバチルスブ
レビス（Lactobacillusbrevis ）由来のマルトースフォ
スフォリラーゼ及びユーグレナグラチリス（Euglena gr
acilis）由来のトレハロースフォスフォリラーゼにより
マルトースから生成する方法（特開昭６３−６０９９８
号公報）、α−グルコース−１−リン酸及びグルコース
にトレハロースフォスフォリラーゼを作用させてトレハ
ロースを生成する方法（特開平６−１８９７７９号公
報）などが知られている。しかし、上記の酵素による合
成法においては、複数の微生物による複数の酵素が関与
しており、反応が非常に煩雑で、酵素の大量供給を行う
上でも問題があった。

【０００４】また、バイオテクノロジーレターＶＯＬ１
２、Ｎｏ．６４３１−４３２頁（１９９０年発行）や
ＢＦＥＶＯＬ８，Ｎｏ４，（１９９１年４月），２０
１−２０３頁などに報告されているような、でんぷんに
微生物が有する複数の酵素系を作用させてトレハロース
を生産する方法がある。また、マルトースを直接トレハ
ロースに変換する酵素としては、ピメロバクター（Pime
lobacter）sp.strainＲ４８由来の酵素、並びにサーマ
スアクアティリス（Thermus aquaticus)ＡＴＣＣ３３
９２３由来の酵素が既に知られている（蛋白質核酸酵素
Vol.42, No.6(1997) 、８３４〜８４１頁）。しかし
ながら、前者は反応至適温度２０℃、温度安定性３０℃
以下であり、後者は反応至適温度６５℃、温度安定性８
０℃以下であり、工業的に利用する場合にはエネルギー
効率や取り扱いが容易ではないという欠点を有すること
が予測された。すなわち、温度管理の容易な温度である
３７℃付で効率よく利用できるマルトースを直接トレハ
ロースに変換する酵素はこれまでに報告されていない。

【０００５】そこで、本発明者らがマルトースを直接ト
レハロースに変換する酵素につき以前に鋭意検索した結
果、シュードモナス属に属するある種の微生物が、マル
トースに作用してトレハロースを生成する新規な酵素を
産生することを見い出した（特願平９−９８７７９号明
細書を参照；この明細書の内容は全て引用により本明細
書中に取り込まれる）。この酵素を利用することによ
り、大量かつ安価に入手し得るマルトースを原料にして
トレハロースを製造することが可能になると考えられ、
これによりトレハロース合成に関する前記課題は解決さ
れることが期待される。

【０００６】しかしながら、この酵素を産生するシュー
ドモナス属に属する微生物は、酵素の産生能が充分でな
く、トレハロースを大規模に製造することを意図する場
合、微生物を大量に培養しなければならないという問題
がある。

【０００７】一方、近年の組換えＤＮＡ技術の進歩には
目覚ましいものがある。今日では、全アミノ酸配列が解
明されていない酵素であっても、これをコードする遺伝
子を単離し、その塩基配列を解明できれば、その酵素を
コードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを作製し、これを
細菌等の微生物や動植物の細胞に導入して得られる形質
転換体を培養することにより、比較的容易に所望量の酵
素を取得することが可能になっている。そこで、上記の
トレハロース合成酵素をコードする遺伝子を単離し、そ
の塩基配列を解明することにより、所望量のトレハロー
ス合成酵素を容易に得ることができるようになることが
期待される。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、トレハ
ロース合成酵素の生産菌であるシュードモナスｓｐ．
Ｆ１株に対して培養方法の検討による生産性の向上を試
みたが、本酵素を工業的に有利に実生産するためには、
更にその生産性を向上させることが必要であった。ま
た、近年、遺伝子工学の手法を用いて酵素の生産量を向
上せさることや、蛋白質工学的手法によって当該酵素の
遺伝子を改変して当該酵素の改良を行うことも可能とな
っている。そのためには当該酵素の遺伝子を単離するこ
とが必要であるが、シュードモナスｓｐ．Ｆ１株のト
レハロース合成酵素活性をコードする遺伝子は未だ単離
・同定されていなかった。

【０００９】従って、本発明の目的の一つは、トレハロ
ース合成酵素活性をコードするＤＮＡを提供することで
ある。本発明の別の目的は、上記ＤＮＡを含有する組み
換えベクター、発現ベクター並びに上記ベクターを保持
する形質転換体を提供することである。

【００１０】本発明のさらに別の目的は、本発明のＤＮ
Ａを含有する組み換えベクターを保持する形質転換体を
培養することによって、トレハロース合成酵素又は該酵
素活性と機能的に同等の活性を有するポリペプチドの製
造方法を提供することである。本発明のさらに別の目
的は、本発明のＤＮＡによってコードされるトレハロー
ス合成酵素または該酵素活性と機能的に同等の活性を有
するポリペプチドを使用する、マルトースからトレハロ
ースに酵素的に変換する方法を提供することである。本
発明のさらに別の目的は、本発明のＤＮＡ配列を有する
遺伝子の発現の調節のための配列を含むＤＮＡ断片を提
供することである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、発明者らは、シュードモナス属細菌の染色体ＤＮＡ
からトレハロース合成酵素活性をコードする遺伝子を含
むＤＮＡ断片を単離すべく、ハイブリダイゼーションク
ローニング法とＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を併
用することによってトレハロース合成酵素活性を有する
ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を単離することに
成功した。さらに、単離されたこのＤＮＡ断片を適当な
ベクターに連結して宿主微生物に導入したところ、得ら
れた形質転換体がトレハロース合成酵素を生産すること
が確認できた。

【００１２】さらにまた、上記のＤＮＡによりコードさ
れるトレハロース合成酵素活性を有するポリペプチドの
アミノ酸配列が、これまでに知られている他のサーマス
属由来の酵素のアミノ酸配列およびピメロバクター属由
来の酵素のアミノ酸配列とは異なる配列であることが明
らかになった。本発明は上記の知見に基づいて完成した
ものである。

【００１３】すなわち、本発明の一つの側面によれば、
トレハロース合成酵素活性又はその活性と機能的に同等
の活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが提供
される。本発明のＤＮＡがコードするポリペプチドは、
好ましくは、シュードモナス属由来のものである。本発
明のＤＮＡがコードするポリペプチドは、好ましくは３
７℃付近の温度において酵素として効率的に利用できる
ものである。本発明のＤＮＡは、例えば、配列表の配列
番号：１に記載したアミノ酸配列をコードする。本発明
のＤＮＡは、例えば、配列表の配列番号：２に記載した
ＤＮＡ配列を有する。

【００１４】本発明の別の側面によれば、配列表の配列
番号：１に記載したアミノ酸配列の一部を含むトレハロ
ース合成酵素活性を有するポリペプチド又はその活性と
機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコードする
ＤＮＡが提供される。本発明のさらに別の側面によれ
ば、配列表の配列番号：２に記載したＤＮＡ配列の一部
を含むＤＮＡであって、かつトレハロース合成酵素活性
を有するポリペプチド又はその活性と機能的に同等の活
性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが提供され
る。本発明のさらに別の側面によれば、配列表の配列番
号：１に記載したアミノ酸配列に対して、１個もしくは
複数のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入もしくは置換の
少なくとも１つがされてできるポリペプチドをコードす
るＤＮＡであって、上記ポリペプチドがトレハロース合
成酵素活性又はその活性と機能的に同等の活性を有して
いる、上記ＤＮＡが提供される。

【００１５】本発明のさらに別の側面によれば、上記し
たいずれかの本発明のＤＮＡとハイブリダイズすること
ができる、トレハロース合成酵素活性を有するポリペプ
チド又はその活性と機能的に同等の活性を有するポリペ
プチドをコードするＤＮＡが提供される。本発明のさら
に別の側面によれば、上記したいずれかの本発明のＤＮ
Ａとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするこ
とができる、トレハロース合成酵素活性を有するポリペ
プチド又はその活性と機能的に同等の活性を有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡが提供される。

【００１６】本発明のさらに別の側面によれば、配列表
の配列番号：２に記載のＤＮＡ配列と少なくとも７０％
以上、好ましくは少なくとも８０％以上、より好ましく
は少なくとも９０％以上の相同性を有するＤＮＡであっ
て、トレハロース合成酵素活性を有するポリペプチド又
はその活性と機能的に同等の活性を有するポリペプチド
をコードするＤＮＡが提供される。

【００１７】本発明のさらに別の側面によれば、上記し
たいずれかの本発明のＤＮＡを含む、組み換えＤＮＡが
提供される。本発明のさらに別の側面によれば、上記し
たいずれかの本発明のＤＮＡを含む、発現ベクターが提
供される。本発明の発現ベクターは、例えば宿主として
細菌、動物細胞または植物細胞の形質転換のために使用
することができるものである。

【００１８】本発明のさらに別の側面によれば、上記し
た本発明の発現ベクターを保持する形質転換体が提供さ
れる。本発明の形質転換体において、宿主は特に限定さ
れないが、特に好ましくは大腸菌である。

【００１９】本発明のさらに別の側面によれば、本発明
のＤＮＡと自律複製可能なベクターとを含む組み換えＤ
ＮＡを適宜宿主に導入することによって得られる形質転
換体を培養し、培養物から、トレハロース合成酵素又は
該酵素活性と機能的に同等の活性を有するポリペプチド
を回収することを含む、トレハロース合成酵素又は該酵
素活性と機能的に同等の活性を有するポリペプチドの製
造方法が提供される。

【００２０】本発明のさらに別の側面によれば、本発明
のＤＮＡによってコードされるトレハロース合成酵素ま
たは該酵素活性と機能的に同等の活性を有するポリペプ
チドをマルトースに作用させることによってトレハロー
スを生成させることを含む、マルトースをトレハロース
に酵素的に変換する方法が提供される。

【００２１】本発明のさらに別の側面によれば、配列表
の配列番号３に記載のＤＮＡ配列を有する遺伝子の発現
の調節のための配列を含むＤＮＡ断片が提供される。

【００２２】本発明によるトレハロース合成酵素遺伝子
の供与体となる微生物としては、例えばショウドモナス
属の１種、シュードモナスｓｐ．Ｆ１株を用いること
ができる。本菌株は、本発明者らがマルトースをトレハ
ロースに変換する活性を有するマルトースをトレハロー
スに変換する酵素を生産する菌株として静岡県静岡市の
土壌より分離したものであり、通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所に、平成７年１月３０日に受託番
号ＦＥＲＭＰ−１４７４７号として寄託されている。

【００２３】

【発明の実施の形態】本明細書において、トレハロース
合成酵素とは、マルトースに作用しα，α−１，４−結
合をα，α−１，１−結合に変換する分子内転移様の活
性あるいはその逆の活性を有する酵素のことを言う。ま
た、トレハロース合成酵素活性を有するポリペプチドと
は、トレハロース合成酵素活性を有することを条件にし
て、天然型のアミノ酸配列に対して一以上のアミノ酸の
欠失、置換、挿入、付加等を施すことによりアミノ酸配
列が改変されたポリペプチドを意味し、本発明の範囲内
には、天然型のトレハロース合成酵素のみならず、これ
らのアミノ酸配列が改変されたポリペプチドをも含まれ
ることが意図される。また、本明細書で使用される天然
型トレハロース合成酵素の例としては、例えばシュード
モナスｓｐ．Ｆ１由来のものが挙げられるが、本発明
においてはこれに限定されるものではなく、その他の種
のシュードモナスはもちろん、細菌類、酵母類、糸状菌
類、子嚢菌類、担子菌類等の微生物由来のもの、あるい
は植物、動物等の生物体由来のものも使用できる。

【００２４】本明細書において、機能的に同等の活性を
有するポリペプチドとは、以下のようなものを言う。一
般的に、天然に存在するタンパク質の中には、それをコ
ードする遺伝子の多形や変異の他に、生成後のタンパク
質の生体内および精製中の修飾反応などによって、その
アミノ酸配列中にアミノ酸残基の欠失、付加、挿入、置
換等の変異が起こりうるが、それにも関わらず変異を有
しないタンパク質と実質的に同等の生理、生物学的活性
を示すものが存在することが知られている。このように
構造的に差異があっても、その機能については実質的に
大きな相違が認められないものを、本明細書中において
は機能的に同等の活性を有するポリペプチドと称する。

【００２５】人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記
のような変異を導入した場合でも同様であり、この場合
はさらに多種多様の変異体を作製することが可能である
が、変異を有しないものと実質的に同等の生理活性を示
す限り、これらの変異体は機能的に同等の活性を有する
ポリペプチドと解釈される。

【００２６】さらに、遺伝子工学的にタンパク質の生産
を行う際には、融合タンパク質として発現させることが
しばしば行われる。例えば、目的のタンパク質の発現量
を増加させるために、目的のタンパク質のＮ末端に他の
タンパク質由来のＮ末端ペプチド鎖を付加したり、目的
タンパク質のＮ末端、あるいはＣ末端に適当なペプチド
鎖を付加して発現させ、この付加したペプチド鎖に親和
性を持つ担体を使用することにより、目的タンパク質の
精製を容易にすることなどが行われている。本発明は、
このような付加的な配列を含む融合タンパク質をコード
するＤＮＡをも包含することを意図する。

【００２７】また、遺伝子上でアミノ酸を指定するコド
ン（３つの塩基の組み合わせ）は、アミノ酸の種類ごと
に１〜６種類ずつが存在することが知られている。した
がって、アミノ酸配列をコードする遺伝子はそのアミノ
酸配列にもよるが、多数存在することができる。遺伝子
は自然界において決して安定に存在しているものではな
く、その核酸に変異が起こることはまれではない。遺伝
子上に起こった変異がコードされるアミノ酸配列には変
化を与えない場合（サイレント変異と呼ばれる）もあ
り、この場合には同じアミノ酸配列をコードする異なる
遺伝子が生じたといえる。したがって、ある特定のアミ
ノ酸配列をコードする遺伝子が単離されても、それを含
有する生物が継代されていくうちに同じアミノ酸配列を
コードする多種類の遺伝子ができていく可能性は否定で
きない。本発明は、このような他種類の遺伝子の全てを
包含することを意図する。

【００２８】さらに、同じアミノ酸配列をコードする多
種類の遺伝子を人為的に作製することは、種々の遺伝子
工学的手法を用いれば困難なことではない。例えば、遺
伝子工学的なタンパク質生産において、目的のタンパク
質をコードする本来の遺伝子上で使用されているコドン
が、使用している宿主中では使用頻度の低いものであっ
た場合、タンパク質の発現量が低いことがある。このよ
うな場合には、コードされているアミノ酸配列に変化を
与えることなく、コドンを宿主で繁用されているものに
人為的に変換することにより、目的のタンパク質の高発
現を図ることが行われている。このように特定のアミノ
酸配列をコードする遺伝子を、人為的に多種類作製する
ことが可能なことは言うまでもない。したがって、これ
らの人為的に作製された異なるポリヌクレオチドであっ
ても、本発明に開示されたアミノ酸配列がコードされて
いる限り、本発明に包含される。

【００２９】さらに、目的のタンパク質のアミノ酸配列
に１個もしくは複数個のアミノ酸残基を欠失、付加、挿
入、もしくは置換の少なくとも１つを行ったポリペプチ
ドも目的のタンパク質と機能的に同等の活性を有する場
合が少なくない。このようなポリペプチドをコードする
遺伝子も、天然由来の単離されたものであれ人為的に作
製されたものであれ、本発明に包含される。

【００３０】一般的に、あるポリペプチドと機能的に同
等の活性を有するポリペプチドとは、それらをコードす
る遺伝子が互いに相同性を有することが多い。したがっ
て、トレハロース合成酵素活性を有するポリペプチドを
コードする限りは、本発明のＤＮＡと適当な条件下でハ
イブリダイズすることができる、ポリペプチドをコード
するＤＮＡも本発明に包含される。ハイブリダイゼーシ
ョンの条件は、一般的なハイブリダイゼーションの条
件、例えば、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,
T. マニアティス (T. Maniatis)他著、コールドスプリ
ングハーバーラボラトリー社、1982年発行、などに記載
されている条件などを使用することができる。一般に、
より相同性の高いＤＮＡを単離するためには、よりスト
リンジェントな条件を使用してハイブリダイゼーション
を行えばよい。

【００３１】また一般的に、１アミノ酸をコードする３
塩基の組み合わせが複数存在するために塩基配列の変化
がアミノ酸配列の変化に現れない場合があること、また
塩基配列の変化によりアミノ酸配列が変化したとしても
そのアミノ酸の変化がポリペプチドの生理学的活性に実
質的に影響を生じないか、生じても僅かにすぎない場合
があること等の理由のために、ＤＮＡの塩基配列が若干
相違していてもコードされるポリペプチドの生理学的活
性においては実質的に有意な相違が生じないことがある
ことはよく知られている。従って、本発明は、コードさ
れるポリペプチドがトレハロース合成酵素活性を有する
限りは、本発明のＤＮＡ配列と一定以上の相同性、例え
ば少なくとも７０％以上、好ましくは少なくとも８０％
以上、より好ましくは少なくとも９０％以上の相同性を
有するＤＮＡ配列をも包含するものである。

【００３２】以上のように、本発明のＤＮＡには、配列
表の配列番号：１に記載したアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡ、あるいは配列表の配列番号：２に記載した塩基
配列を有するＤＮＡに加えて、上記ＤＮＡに対して欠
失、付加、挿入若しくは置換を施したＤＮＡ、上記ＤＮ
Ａと適当な条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、並びに
上記ＤＮＡと一定以上の相同性を有するＤＮＡが含まれ
るが、これらのＤＮＡは全てトレハロース合成酵素活性
あるいは該酵素活性と機能的に同等の活性を有すること
を特徴とするものであり、この酵素活性の有無を指標に
することにより当業者により容易に得ることができる。
なお、この酵素活性の測定法は当業者に公知であり、例
えば本明細書の下記実施例に記載した方法を使用でき
る。

【００３３】以下にシュードモナスｓｐ．Ｆ１株に由
来するトレハロース合成酵素遺伝子をクローニングし
て、塩基配列を解析し発現する例を挙げて、本発明を詳
細に説明する。

【００３４】供与菌株から染色体ＤＮＡを得る方法とし
ては、例えばマーマーの方法〔Ｍａｒｍｕｒ，Ｊ．，
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２０８（１９６１）〕や
斉藤と三浦の方法〔Ｓａｉｔｏ，Ｈ．ａｎｄＭｉｕｒ
ａ，Ｋ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ，７２，６１９（１９６３）〕等が挙げられるが、他
の類似な方法を用いることもできる。

【００３５】かくして得られた染色体ＤＮＡを好適な制
限酵素で切断することによって、トレハロース合成酵素
遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製することができるが、用
いる制限酵素の種類としては、当該遺伝子を分断しない
ものであれば、いかなるものでも使用できる。

【００３６】トレハロース合成酵素産生菌の培養は、好
気条件下で十分な炭素源、窒素源を有する培地で行うこ
とが好ましい。好適な方法に従って、シュードモナス
ｓｐ．Ｆ１を培養する。次に、その培養液から、例えば
ジャーナルオブファメンションアンドバイオエ
ンジニアリングＶＯＬ．８４，Ｎｏ．４，３５８−３
６０ページに記載の方法などで、シュードモナスｓ
ｐ．Ｆ１の産生したトレハロース合成酵素を単離精製す
る。

【００３７】次に、精製されたトレハロース合成酵素に
ついて、その部分アミノ酸配列に関する情報を得る。部
分アミノ酸配列を決定するには、例えば精製トレハロー
ス合成酵素を直接常法に従ってエドマン分解法によるア
ミノ酸配列分析（プロテインシーケンサＰＱＱＳ−１
０，島津製作所社製）に供することにより、トレハロー
ス合成酵素のＮ末端アミノ酸配列の１０〜３０残其を決
定する。あるいは、特異性の高い蛋白質加水分解酵素、
例えばステフィロコッカスアウラプロテアーゼ（Ｖ
８プロテアーゼ）やアクロモバクター(Achromobacter)
プロテアーゼＩ、Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニルク
ロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）−トリプシン等を作用さ
せて限定加水分解を行い、得られたペプチド断片を逆相
系ＨＰＬＣを用いて分離精製した後、精製ペプチド断片
についてアミノ酸配列分析を行ったり、あるいは、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ後にＰＶＤＦ膜にエレクトロブロッテイン
グを行うのが効果的である。

【００３８】こうして得られる部分アミノ酸配列の情報
をもとにトレハロース合成酵素遺伝子をクローニングす
る。そのためには、一般的に用いられるＰＣＲ法あるい
はハイブリダイゼーション法を利用する。クローニング
から形質転換の手順の一例は以下の通りである。

【００３９】ａ）Ｎ末端および内部アミノ酸配列の情報
をもとに、ＰＣＲ用のプローブとして合成オリゴヌクレ
オチドを設計する。ｂ）このプローブを用いてＰＣＲを行い、特異的に増幅
したＰＣＲ産物であるＤＮＡ断片を直接配列分析し、Ｎ
末端あるいは内部アミノ酸配列の一部をコードする塩基
配列を含むＰＣＲ産物を得る。

【００４０】ｃ）一方、シュードモナスｓｐ．Ｆ１の
ゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で完全消化し、アガロー
スゲル電気泳動で分離した後、常法に従いナイロン膜に
ブロッティングする。分離されたＤＮＡ断片と、ｂ）で
得られたＰＣＲ産物とのハイブリダイゼーションは、一
般的に用いられる条件で行う。例えば鮭精子ＤＮＡを含
むプレハイブリダイゼーション溶液中でナイロン膜をブ
ロッキングし、³²Ｐまたは蛍光色素、あるいは化学発光
試薬でラベルしたＰＣＲ産物を加えて一晩保温する。こ
のナイロン膜を洗浄した後、オートラジオグラフィーを
とってＰＣＲ産物オリゴヌクレオチドプローブとハイブ
リダイズするＤＮＡ断片を検出する。検出されたバンド
に相当するＤＮＡ断片をゲルから抽出、精製する。

【００４１】ｄ）こうして得られたＰＣＲ産物オリゴヌ
クレオチドプローブとハイブリダイズするＤＮＡ断片を
通常用いられる方法によってクローニングベクターに組
み込む。クローニングベクターとしては pUC18、pUC19
、pUC119、Bluescript II SK(+) 、Charomid DNA な
どが好適に使用できるが、特にこれらに限定されるもの
ではない。

【００４２】ｅ）次いで組換えクローニングベクターを
宿主に導入し、宿主を形質転換する。宿主の種類は特に
は限定されないが、例えば大腸菌を使用する場合、宿主
大腸菌としては形質転換能を有するものであれば野生
株、変異株の何れも使用できる。導入の方法は通常用い
られる方法であるコンピテントセルを用いる方法、例え
ばモレキュラークローニングラボラトリーマニュアル
(Molecular Cloning,A Laboratory Manual) [T.マニア
ティス (T. Maniatis)他著、コールドスプリングハーバ
ーラボラトリー社、1982年発行] 第 250頁に記載の方法
を用いることができる。また、Charomid DNAなどラム
ダーファージベクターとしての機能をもつものはインビ
トロパッケージングによる方法も用いることができる。

【００４３】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示す
が、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【００４４】実施例１：使用菌株、ベクターＤＮＡ、お
よび増菌用培地静岡県静岡市の土壌より採取されたシュードモナスｓ
ｐ．Ｆ１株（Pseudomonas sp. F1）を遺伝子供試菌株
として使用した。Ｆ１株は、大きさは０．７〜１．４μ
ｍの短桿菌で短鞭毛をもち運動性がある。ＯＦテストが
酸性、蛍光色素を生成、キノン−９、ＧＣ含量が６０．
２％でグラム陰性の細菌である。この菌株の増菌用培地
としては、少量の試験管・フラスコ培養の場合にはＬＢ
培地（ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナト
リウム５ｇを含むｐＨ7.0 の水溶液）を用いた。しか
し、酵素精製などで必要な大量の菌体の培養にはジャー
ハメンタで廃糖蜜・カツオエキスを成分とする安価な培
地を用いたが、通常この分野で使用される培地であれば
何れのものでもよく、炭素源としては、グルコース、ラ
クトース、マルトース、澱粉、粗糖、廃糖蜜等を単独又
は混合して用いることができる。窒素源としては、ペプ
トン、肉エキス、酵母エキス、コンスティーブリカー、
尿素等の有機窒素源のほか、硫酸、硝酸、リン酸等のア
ンモニウム塩などの無機窒素源を単独又は混合して用い
ることができる。無機塩としては、カリウム、ナトリウ
ム、カルシウム、マグネシウム、マンガン、鉄等の硫酸
塩、炭酸塩、硝酸塩、リン酸塩、をそれぞれ単独で又は
組み合わせて用いることが出来る。なお、培養温度は３
０℃で２４時間行なった。酵素を精製するためには菌体
をさらに４５℃で一昼夜置いた。

【００４５】遺伝子ライブラリー作製の際の宿主菌とし
て大腸菌ＤＨ５α株を、クローン化した遺伝子のサブク
ローニングの際の宿主菌として大腸菌ＪＭ１０９株を使
用した。これらの菌株はＬＢ培地を用いて増菌し、３７
℃で培養した。遺伝子ライブラリーの作製にはコスミド
系ベクターのcharomid9-36(Saito & Stark) を、サブク
ローニングあるいは塩基配列決定用にはｐＵＣ１８を使
用した。なお、charomid 9-36、ｐＵＣ１８を用いる場
合、アンピシリンを最終濃度１００μｇ／ｍｌになるよ
うに培地に添加した。

【００４６】実施例２：トレハロース合成酵素遺伝子の
クローニング（クローニング戦略の概念図を図１に示
す。なお、遺伝子供与株である、シュードモナスｓ
ｐ．Ｆ１株は、ＧＣ含量が高いため、目的の遺伝子を取
り出すことは極めて困難であることが予想されたため、
このように複数のクローニング戦略をたて、また塩基配
列分析する必要があった。さらに、安藤他編、遺伝子工
学、共立出版（株）、ｐ１０７（１９８７）に記載され
ているように大腸菌での発現は一般に低いとされており
困難が予想された。）（１）染色体ＤＮＡの抽出共試菌を５０ｍｌの培地の入ったフラスコを２４時間振
盪培養し、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心して菌体を
回収した。回収した菌（約０．５ｇ）を１．５ｍｌの遠
心チューブ１０本に移し、各々に菌体を８０μｌのリゾ
チーム液（５０ｍＭグルコース、２５ｍＭＴｒｉｓ、１
０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）と２５ｍｇ／ｍｌリゾチ
ーム２０μｌに懸濁し１０分間室温に置いた。次に２０
０μｌの１％ＳＤＳを加え氷温で３０秒放置した。７．
５ｍＭの酢酸アンモニウムを加え１５，０００ｒｐｍで
遠心し、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノー
ル沈殿し、ＲＮａｓｅ処理した。湿重量約２．５ｇの菌
体から約１０ｍｇのＤＮＡを抽出できた。

【００４７】（２）部分アミノ酸配列分析シュードモナスｓｐ．Ｆ１株から単離精製されたトレ
ハロース合成酵素をＶ８プロテアーゼで限定分解しＳＤ
Ｓ電気泳動後ＰＶＤＦ膜にセミドライブロットし、メン
ブレンを順次切り出し、気相式プロテインシケンサー、
島津ＰＱＱＳ−１０と和光純薬の専用試薬を用いてアミ
ノ酸配列を分析した。切り出したバンドの１１サンプル
を順次アミノ酸配列分析したところ、下記に示す配列が
主に分析できた。サンプル番号２（配列番号４）ＭＤＰＩＶＰＲＱＰＧＤＫＰＬＡサンプル番号３（配列番号５）ＬＶＱＭＳＲＭＡＡＡＨサンプル番号１１（配列番号６）ＡＮＱＭＫＡＭＴＦＰＨＮ

【００４８】（３）内部アミノ酸情報によるプライマー
設計とＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅トレハロース合成酵素のＮ末端と内部の部分アミノ酸配
列分析より推定される塩基配列とPseudomonas属におけ
る使用コドンを考慮して設計したオリゴヌクレオチドを
プライマーとして使用して、p.putidaの全ＤＮＡを鋳型
としてＰＣＲ法によりトレハロース合成酵素遺伝子を部
分的に増幅した。増幅物はアクリルアミドゲル電気泳動
により分離し、目的の領域を切り出しＴＥ緩衝液に抽出
し、フェノール／クロロフォルム抽出、エタノール沈殿
により精製した。用いたプライマーの配列は以下のとお
りである。 NF-7（配列番号７） 5'-GT(G/C)AA(A/G)TGG(T/C)TGGA(A/G)GA(T/C)CG(T/C)GC
(G/C)ATG-3' NF-9（配列番号８） 5'-AC(G/C)CAGCC(C/G)GATCC(G/C)(A/T)(G/C)(G/C)TATGT
(G/C)AAGTGG-3' NF-11 （配列番号９） 5'-TG(G/C)GC(G/C)GC(G/C)GCCATGCGGCTCATCTG(G/C)AC-
3'

【００４９】０．１μｇ／μｌ全ＤＮＡ１μｌと試薬
（各２ｍＭｄＮＴＰｓＭｉｘ５μｌ，１０×reaction b
uffer５μｌ，各プライマー１μｌ、水３７μｌ）及び
酵素（５Ｕ，タカラＴａｑ）を混合してＰＣＲ反応液を
調製した。サーマルサイクラーシステム２４００（パー
キンエルマー社）を用いて、ＰＣＲ反応を行った。９５
℃ ３０秒（変性）、５５℃ １分（アニーリング）、
７２℃ １分（伸長）を３０サイクル行うことによりＤ
ＮＡを増幅し、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行い、ＤＮＡのバンドを切り出して、ＴＥに抽出し、フ
ェノール／クロロホルム（１：１）で抽出し、エタノー
ル沈殿をした。精製したＤＮＡはＤＮＡシーケンサーに
より配列分析したところ、配列表の配列番号２の塩基配
列の１９番目〜４２２番目に対応する塩基配列であるこ
とが判明した。

【００５０】（４）サザンハイブリダイゼーションＡ．フィルターの処理全ゲノムＤＮＡを、制限酵素EcoRI,HindIII, PstI, Bam
HI,XhoI, ClaI, KpnIで完全消化し、０．７％アガロー
ス電気泳動を行った。泳動後、ゲルを臭化エチジウムで
染色し、泳動パターンを写真撮影した。ハイブリダイゼ
ーションに必要な部分だけを残し、他の部分は切り取っ
た。次に、ゲルの洗浄およびＤＮＡの変性を行うため
に、以下の操作を行った。

【００５１】２００ｍｌの０．２５Ｎの塩酸にゲルを浸
し、１０分間ゆるやかに振盪した（脱プリン化）。次い
で、塩酸を捨て、１００ｍｌの滅菌蒸留水を加え２分間
ゆるやかに振盪した。塩酸を中和するために、２００ｍ
ｌの１．５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．５Ｎ水酸化ナト
リウムの混合溶液でゲルを３０分間ゆるやかに振盪した
（アルカリ変性）。この溶液を捨て、１００ｍｌの滅菌
蒸留水を加えゆるやかに振盪した。次に１００ｍｌの１
Ｍのトリス／塩酸および１．５Ｍ塩化ナトリウム混合溶
液で１０分間ゆるやかに振盪した（中和）。

【００５２】ゲル中のＤＮＡをフィルターに転写するた
め、ブロッティング操作を行った(Southern ,1975)。ろ
紙、ゲル、転写メンブレン、ろ紙の順に下から積み上げ
て最下層のろ紙を２×ＳＳＣに浸し、セミドライブロテ
ィング装置を利用して１５０ｍＡで６０分間かけて、Ｄ
ＮＡを転写した。転写後、フィルターを２×ＳＳＣでゆ
るやかに振盪しながら洗浄した。ポリ容器にフィルター
と約５０ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液（５０％
フォルムアミド、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、１×デンハ
ーツ、１ｍＭＥＤＴＡ、５０μｇ／ｍｌさけ精子、２
５ｍＭＫＰＯ₄）を入れ、４２℃で２時間以上プレハイ
ブリダイゼーションを行った。

【００５３】Ｂ．プローブの調製ＤＮＡプローブの放射性同位元素による標識は、ＤＮＡ
ラベリングキット(TAKARA)を用いてランダムプライマー
法により次のように行った。プローブとして用いるＤＮ
Ａをアガロース電気泳動し、実施例２の（３）に示した
方法でＤＮＡを抽出、精製した。得られたＤＮＡ溶液３
μｌにランダムプライマー２μｌを加え、３分間９５℃
で熱変性後, 氷中で急冷した。１０×反応緩衝液とｄＮ
ＴＰ混合溶液をそれぞれ２．５μｌおよびＣＴＰP(α−
³²Ｐ、５０μＣｉ）を５μｌ加え、蒸留水で全量を２４
μｌにして反応溶液とした。この反応液にKlenow frag
ment酵素液を１μｌ加え、３７℃で１０分間ＤＮＡ鎖の
伸長反応を行った。反応後、６５℃で５分間放置して酵
素を失活させ、ハイブリダイゼーションに用いた。

【００５４】Ｃ．ハイブリダイゼーション上記Ａで処理したフィルターに上記Ｂで作製したＤＮＡ
プローブを５μｌ入れ、シールした。４２℃で６時間ゆ
っくりと振盪しながらハイブリダイゼーションを行っ
た。反応後、フィルターを２００ｍｌの洗浄液Ｉ（２×
ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）に浸し、５０℃で３０分間ゆ
っくりと振盪しながらフィルターを洗浄した。この操作
をもう一度繰り返し行った。次に、洗浄液ＩＩ（０．５
×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で１回および洗浄液ＩＩＩ
（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で２回ずつフィル
ターの洗浄を行った。洗浄後、フィルターをろ紙上に置
き、洗浄液を吸い取り、風乾した。このフィルターを一
晩オートラジオグラフィーをＢＡＳ２０００システム
（フジフイルム）で行い、専用の読みとり機で読み取っ
た。結果を図２に示す。EcoRI 断片では７〜９ｋｂｐ、
PstI 断片では２．２ｋｂｐにハイブリダイズしたが、
HindIII, BamHI,XhoI, ClaI, KpnI 断片では２０ｋｂｐ
より大きな領域であった。

【００５５】（５）染色体ＤＮＡの部分消化物のセルフ
ライゲーションによるＰＣＲ増幅（Inverse-ＰＣＲ）
（戦略の概念図を図３に示す）上記（４）の情報を基にして染色体ＤＮＡをEcoR１及び
Pst１で完全消化し、セルフライゲーションを行い、環
状のＤＮＡを作成した。この環状ＤＮＡをテンプレート
にし、上記（３）の部分配列より設計したオリゴヌクレ
オチドをプライマーとして、ＰＣＲによる遺伝子増幅を
試みた。ここで増幅したＤＮＡは精製し、ＤＮＡシーケ
ンサーによる配列分析に供した。

【００５６】（６）カセットプライマーとカセットを用
いるＰＣＲによるクローニングＡ．アガロースゲルからのＤＮＡの回収クローニングに適した分子サイズと思われたEcoR1 ＤＮ
Ａ断片（７から１０ｋｂ）は制限酵素による染色体ＤＮ
Ａ消化を至的条件各反応液で３７℃で３時間反応させ、
フェノール／クロロホルム（１：１）抽出し、エタノー
ル沈殿を行い、再度、ＴＥ３０μｌに溶解し、このうち
５μｌに電気泳動用ローディング緩衝液を２μｌ加え、
０．７％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、泳動
距離を測定した。電気泳動の際、ＤＮＡ分子サイズマー
カーとしてλファージＤＮＡをHind IIIで消化したもの
を用いた。このサイズマーカーと比較して約７から１０
ｋｂのＤＮＡ断片をサイズによる分画を行った。

【００５７】操作は、EcoRI ＤＮＡ断片（７から１０ｋ
ｂ）を含むアガロースゲルと一緒に切り出し、透析チュ
ーブに入れた。これにＴＥ４００μｌを入れ電気泳動を
行い、ＤＮＡをゲルから抽出した。このＤＮＡ溶液を回
収した後、フェノール／クロロホルム抽出を行った。上
清を別の微量遠心チューブに移した後、上清を除きＤＮ
Ａを７０％エタノールで洗浄後（以下リンスとする）、
真空乾燥した。得られたＤＮＡを２０μｌの滅菌蒸留水
に溶かした。この分画したＤＮＡも上記（５）の方法で
セルフライゲーションを行いＰＣＲのテンプレートに供
し、通常用いられる方法で塩基配列を決定した。

【００５８】Ｂ．カセットプライマーとカセットを用い
るＰＣＲ（Vectorette-PCR）（戦略の概念図を図３に示
す）続いて、EcoRI サイトに接続するオリゴＤＮＡカセット
をライゲーションしたＤＮＡを鋳型とし、カセットの配
列に相補的なプライマーと、既知の配列に相補的なプラ
イマーを用いて、一回目のＰＣＲを行った。次に、この
ＰＣＲ産物を鋳型に一回目より内側のプライマーを用い
て、２回目のＰＣＲを行った。なお、２ｋｂｐ以上の増
幅には、タカラのＬＡＰＣＲキットを用いた。（以下
の実験を（株）タカラのプロトコールに従って行っ
た。）増幅したＤＮＡ断片についてアガロースゲル電気泳動で
反応液を分析し、また、通常用いられる方法で塩基配列
の一部を分析し遺伝子の位置の特定に用いた。

【００５９】（７） Charomidベクターへの結合および
パッケージングサザンハイブリダイゼーションの結果より、PstIでの消
化では、構造遺伝子の全長が入らない可能性が高く、制
限酵素EcoRI で消化した場合約８kbとやや大きいものの
遺伝子すべてを含むものと思われた。そこで、制限酵素
EcoRI で消化した染色体ＤＮＡ０．１μｇをＢＡＰ（Ta
kara）で５’末端を脱リン酸化処理したベクターcharom
id9-36（ニッポンジーン社）の１μｇと混合し、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて１６℃で一晩反応させ連結した。
このＤＮＡ溶液をパッケージングキット（Stratagene社
Gigapack II packaging extract ）を用いてファージ
粒子にパッケージングした。E. coli ＤＨ５α株をＳＯ
Ｂ培地で３７℃にて一晩培養した。

【００６０】（８）遺伝子ライブラリーのクローン数の
測定 E. coli ＤＨ５α株をＳＯＢ培地で３７℃にて一晩培養
した。培養液を８，０００ｒｐｍで１５秒間遠心して集
菌し、上清を除いた後、菌体を０．４ｍｌの１０ｍＭの
ＭｇＣｌ2 に懸濁した。この懸濁液を４本の微量遠心チ
ューブに分注し、そのうちの一本にパッケージングした
ファージ粒子１０μｌを加え、十分混合し、１０μｌを
別の微量遠心チューブに加え１／１０に希釈した。同じ
希釈操作を３回繰返し、３７℃で１５分間感染させた。
感染後、１ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地を加え、３
７℃で３０分間培養した。この溶液を８，０００ｒｐｍ
で１５秒間遠心して集菌し、アンピシリン含有のＬＢ寒
天培地に塗抹し、３７℃にて一晩培養した。培養後、コ
ロニー数を測定し、遺伝子ライブラリーの濃度を算出し
た。

【００６１】（９）トレハロース合成酵素遺伝子クロー
ンのスクリーニングファージ感染させた大腸菌をＬＢ寒天培地で約１６時間
培養した。寒天培地にＨｙｂｏｎｄ−Ｎメンブレン（Am
ersham）を重ね１分後にはがした、あらかじめラップに
０．７５ｍｌの変性溶液を用意しておき、コロニーが付
着した面を上にしてメンブレンを溶液に７分間浸した。
次に、ラップ上に０．７５ｍｌの中和溶液を用意し、メ
ンブレンを３分間浸した。中和過程は再度繰り返した。
メンブレンを３０分以上乾燥後、濾紙ではさみアルミ箔
で包んだ。これを、８０℃で２時間加熱し、変性したＤ
ＮＡをメンブレンに固定した。

【００６２】ハイブリダイゼーションは、Gene Images
ラベリング・検出システム（Amersham）を使用し、この
プロトコールに従って行った。ハイブリダイゼーション
のプローブは、前述の（３）のＰＣＲ法と同様の方法で
増幅したＤＮＡ断片を用いた。

【００６３】（１０）ドット、サザンハイブリダイゼー
ションによるトレハロース合成酵素遺伝子のスクリーニ
ング上記（９）のコロニーハイブリダイゼーションの結果、
トレハロース合成酵素を含んでいると思われるものがあ
ったので、そのプラスミド２４種を回収し、ドットハイ
ブリダイゼーション並びにサザンハイブリダイゼーショ
ンを以下の操作により行った。なお、ハイブリダイゼー
ションは、Gene Images ラベリング・検出システム（Am
ersham社製）を使用し、このプロトコールに従って行っ
た。ハイブリダイゼーションのプローブは、前述のＰＣ
Ｒ法で増幅したＤＮＡ断片を用いた。

【００６４】Ａ．ドットハイブリダイゼーションファージを感染させた大腸菌から得られたプラスミドＤ
ＮＡを、９５℃で５分間加熱した後、氷中で急冷した。
サンプルを２μｌずつHybond-Nメンブレンにスポットし
風乾させた。このメンブレンを変性溶液に５分間浸した
後、中和溶液に１分間浸した。風乾したメンブレンを濾
紙にはさみ、アルミ箔で包んで８０℃で２時間加温する
ことにより変性されたＤＮＡをメンブレンに固定した。
このメンブレンを用いてハイブリダイゼーションを行っ
た。

【００６５】Ｂ．サザンハイブリダイゼーションドットハイブリダイゼーションによりトレハロース合成
酵素遺伝子を含むと予想されたクローンからプラスミド
を調製して、制限酵素EcoRI, SacI, SmaI, PstI, SphI
で消化し、０．５％アガロースゲル電気泳動で分析し
た。電気泳動後のゲルを変性溶液に３０分、その後中和
溶液に３０分浸し穏やかに振盪した。その後ゲル中のＤ
ＮＡ断片を吸引し Hybond-N メンブレンにトランスファ
ーした。メンブレンを３０分以上風乾し、８０℃で２時
間加温しＤＮＡをメンブレン上に固定させた。このメン
ブレンでハイブリダイゼーションを行い、目的のＤＮＡ
断片を同定した。

【００６６】上記のドットハイブリダイゼーション並び
にサザンハイブリダイゼーションの結果から、最も強い
シグナルが得られたクローンｐＦＣＥ３１を実験材料と
して使用することにした（図４を参照）。ｐＦＣＥ３１
は、インサート部分が約９ｋｂｐと相当長いので、この
ままではシークエンシングすることができない。そこ
で、制限酵素SacI, SmaI, PstI, SalI, SphI, EcoR1 で
消化し、サザンハイブリダイゼーションを行い、トレハ
ロース合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を同定した。Sa
cIで消化したものは約２．６ｋｂｐの断片に、SmaI, Ps
tI, SalI, SphIで消化したものは約２．３ｋｂｐ付近の
断片に、それぞれトレハロース合成酵素遺伝子を含むこ
とが分かった。

【００６７】（１１）プラスミドの調製コロニーハイブリダイゼーションの結果よりトレハロー
ス合成酵素遺伝子を含むと予想されたクローンからプラ
スミドを調製した。Boiling lysis 法（Tsusaki, K.,
他、Biochem. Biophys. Acta. Gene Struct.Expr. 129
0:1-3 (1996)）に従って、ファージ感染あるいは形質転
換した大腸菌からプラスミドＤＮＡを回収した。大腸菌
株は Escherichia coli ＤＨ５αを使用した。寒天培地
からコロニーを単離し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリ
ン１５μｌを加えたＬＢ培地２．５ｍｌに懸濁して３７
℃で約１６時間振盪培養した。培養した菌液１．５ｍｌ
をマイクロチューブに移し１２，０００ｒｐｍ（室温）
で１分間遠心し、菌を沈殿させ、ＳＴＥＴ２５０μｌに
懸濁した。これに１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム２０μｌ
を加えて、１分間沸騰水中で加熱した後に１２，０００
ｒｐｍ（室温）で１０分間遠心した。上清に３Ｍ酢酸ナ
トリウム（ｐＨ５．２）２５μｌとイソプロパノール２
５０μｌを加えて、十分に撹拌し、５分間室温で放置し
た。１２，０００ｒｐｍ（室温）で５分間遠心してＤＮ
Ａを沈殿させた。沈殿を８０％エタノールで洗浄した
後、エタノールを除去し、デシケーターで減圧乾燥し、
適量のＴＥ緩衝液に溶解した。これに１ｍｇ／ｍｌのＲ
Ｎａｓｅ（ＤＮａｓｅフリー）１μｌを加えて、３７℃
で３０分間保温し、混在するＲＮＡを消化した。フェノ
ール／クロロホルム（１：１）抽出した後、エタノール
沈殿によりＤＮＡを沈殿させ、適量のＴＥ緩衝液に再び
溶解した。このようにして調製したプラスミドＤＮＡを
ドット、サザンハイブリダイゼーション（上記（１０）
に記載）またはシークエンシングに使用した。

【００６８】実施例３：トレハロース合成酵素遺伝子の
塩基配列決定（１）サブクローンの作成目的のＤＮＡ断片を増幅して、その構造を分析するため
に、λクローンから調製したプラスミドを適当な制限酵
素で処理し、自己連結を防ぐためＢＡＰ（TaKaRa）また
はＣＩＰ（TaKaRa）により脱リン酸化したｐＵＣ１８ベ
クターにライゲーションした。即ち、トレハロース合成
酵素遺伝子を含むプラスミドｐＦＣＥ３１を、制限酵素
EcoR1, Sac1, Sma1, Pst1 で消化し、それぞれの断片を
シークエンシングするためにサブクローニングした（図
４を参照）。また、インサートの大きなサブクローンに
ついては、制限酵素Sal1, Sph1で消化してさらにサブク
ローニングを行ったほか、欠失変異体を作製してシーク
エンシングを行った。欠失変異体は、Kilo-Sequence用D
eletion kit（TaKaRa）を用い、このプロトコールに従
い作製した。また、下記に示すようにＮ末端上流からと
Ｃ末端下流の配列を基にしたプライマーを作製し、トレ
ハロース合成酵素の構造遺伝子を増幅し、シークエンシ
ングを行った。

【００６９】（２）トランスフォーメーションプラスミドを増幅するために大腸菌E.coliＤＨ５αにラ
イゲーションしたＤＮＡを導入した。この際、塩化カル
シウムによりコンピテント化した大腸菌を使用する方法
（Maniatis.T，他 Molecular Cloning 2nd., Cold Spr
ing Harbar Laboratory press(1989)）などを用いた。
導入後、３７℃で１時間振盪培養した大腸菌５０μｌに
次の組成の溶液（１００ｍＭＩＰＴＧ１０μｌ、５０
ｍｇ／ｍｌＸ−Ｇａｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、アンピシリ
ン１２５μｌ、０．６％ＳＯＢソフトアガー２．５ｍ
ｌ）を加えＳＯＢ寒天培地（１．５％寒天）に広げて３
７℃で約１６時間培養し、形質転換菌のコロニーを得
た。

【００７０】（３）ＰＣＲによるＤＮＡサンプルの調製Ｎ末端上流からとＣ末端下流の配列を基に下記のプライ
マーを作製し、トレハロース合成酵素の構造遺伝子を増
幅したところ、予想される２．５ｋｂｐが特異的に増幅
した。この増幅産物を、シーケンシングのサンプルに供
した。なお、プライマーの除去には、ファルマシア社の
カートリッジゲル濾過を用いた。プライマー（配列番号１０）： Xho-F1 5'-GGT CTC GAG ACG CAA AGA GGA CGC GAA ATG プライマー（配列番号１１）： Hind-R1 5'-CCG AAG CTT CAA TGT TGA CCC CCT GGC CCG ここで作製したＤＮＡは、pGEM-T Easy Vecteor Syste
m（Promrga社）を用いＴＡクローニングを行った。方法
は付属のマニュアルに従った。

【００７１】（４）塩基配列の決定Ａ．サンプルの調製アルカリ法にてプラスミドの少量抽出を、精製度を上げ
るため改変して行った。抽出ＤＮＡ沈殿物を乾燥後、５
０μｌのＴＥに溶解し、２μｌのＲＮａｓｅＡ酵素液を
加えて十分混合し、３７℃で３０分間反応させた。反応
後、２０％ポリエチレングリコール／２．５ＭのＮａＣ
ｌを０．６倍量加え、十分混合して氷中に１時間放置し
た。１５，０００ｒｐｍで１０分間４℃にて遠心し、Ｄ
ＮＡを回収した。ＤＮＡを乾燥後、４００μｌのＴＥに
再溶解した。さらにもう一度フェノール抽出し、エタノ
ール沈殿およびリンスを行い、３２μｌの滅菌蒸留水に
溶解した。これをシークエンス反応の試料とした。

【００７２】塩基配列の分析はパーキンエルマー社のア
プライドシステムＡＢＩ３７７、３１０または日立SQ-5
500オートシーケンサーを用い、各社のプロトコールに
従ってシークエンシングを行った。サンプルの調製は、
それぞれのシステムに応じて、ＡＢＩ３７７、３１０は
Dye terminater cyclesequencing kit（ハ゜ーキンエルマー
社）を用い、日立ではThermo Sequenase pre-mixed cyc
le sequencing kit(Amersham)を用いて調製した。

【００７３】（５）塩基配列の解析塩基配列およびアミノ酸配列の解析は遺伝情報処理ソフ
トGenetyx.ver8（ソフトウェアー開発株式会社）を用い
て行った。また、ＤＮＡのデータベース検索は国立遺伝
学研究所生命情報研究センターの日本ＤＮＡデータバン
ク（DDBJ）、農水省農業生物資源研究所の農水省ＤＮＡ
バンク（DISC）、及び東大医科研（Genome net）など
にインターネットで接続して調べた。

【００７４】 DDBJ http://www.ddbj.nig.ac.jp/ DISC http://www.dna.afffrc.go.jp/ Genome net http://www.genome.ad.jp/

【００７５】シークエンシングの結果、トレハロース合
成酵素遺伝子を含む３６１２ｂｐの配列（配列表の配列
番号２と配列番号３を参照）を決定することができた。
トレハロース合成酵素遺伝子は２０６４ｂｐから成り
（配列表の配列番号２に記載）、ＧＣ含量は、６３．１
％であった。この遺伝子は６８７のアミノ酸残基（配列
表の配列番号１に記載）を含むポリペプチドをコードし
ており、分子量は７５，０９８Ｄａであった。開始コド
ンＡＴＧの８塩基上流には、Shine-Dargaron配列（ＳＤ
配列）ＡＡＧＡＧＧが存在し、同じ１３０塩基上流に
は、−１０領域と推定されるＣＣＣＣＴＧＧＴＧＣ領域
および１５１塩基上流には−３５領域と推定されるＧＧ
ＣＴＡＧＴＴＧＡＡが存在した。アミノ酸組成は、親水
性アミノ酸２５．７６％、疎水性アミノ酸５２．８４％
および中性アミノ酸２１．４０％であった。全てのコド
ン使用に偏りが見られ、ＧＣＴ、ＧＴＡ、ＡＴＡ、ＡＧ
Ａ、ＡＣＧ、ＴＧＴ、ＴＴＡのコドン使用頻度は少な
く、ＴＴＡ、ＴＣＴは使用されていなかった。

【００７６】また、トレハロース合成酵素の塩基配列と
アミノ酸配列とをデータベースでホモロジー検索を行っ
たが、いずれも高い相同性を示す配列はなかった。しか
し、他のトレハロースに作用する酵素やα−アミラーゼ
ファミリー酵素との比較を行った結果、４つの非常に保
存された領域が存在することが判明した（図５）。

【００７７】また、トレハロース合成酵素遺伝子のＮ末
端の上流領域配列には、通常の原核生物に典型的なプロ
モーター配列は存在しなかったが、翻訳開始点の約１０
０ｂｐ上流に大腸菌のヒートショックプロモーターｄａ
ｎＫＰ２と類似した配列が存在した（図６を参照）。Ｆ
１株のトレハロース合成酵素発現が菌体培養後に４５℃
での一昼夜処理により活性発現が顕著になることから
も、Ｆ１株の性質と一致し、プロモーター配列として機
能していると考えられる。

【００７８】実施例４：トレハロース合成酵素を発現す
る発現プラスミドの構築次にトレハロース合成酵素を発現するプラスミドを構築
するために合成オリゴヌクレオチドプライマーをデザイ
ンし、次のＸｈｏ−Ｆ１とＨｉｎｄ−Ｒ１合成した。 Xho-F1:5'-GGTCTCGAGACGCAAAGAGGACGCGAAATG （配列番
号１２）〔配列番号１０と同じ〕 Hind-R1:5'-CCGAAGCTTCAATGTTGACCCCCTGGCCCG（配列番
号１３）〔配列番号１１と同じ〕

【００７９】これを、常法に従いＰＣＲによりトレハロ
ース合成酵素遺伝子を増幅し発現ベクターに組み込ん
だ。具体的には、染色体ＤＮＡまたは、Charomid ＤＮ
Ａもしくは、プラスミドＤＮＡを鋳型として、１０ｎｇ
程度を用い、１０μｌのＰＣＲ増幅用１０×緩衝液と２
０ｐｍｏｌの合成オリゴヌクレオチドプライマーXho-F
1、Hind-R1を各々１μｌ、２．５ユニットのＴａｑポリ
メラーゼ（Takara Taq、宝酒造社製）を入れ、脱イオ
ン蒸留水を加えて合計１０μｌとしＰＣＲ増幅反応に供
した。ＰＣＲ反応は、９５℃で１分間の変性、６０℃で
２分３０秒間のプライマーアニリング、７２℃で１分間
の合成反応のサイクルを３０サイクル行った。反応液の
１０μｌを０．７％アガロース電気泳動を行った後、エ
チジウムブロマイドでＤＮＡを染色し、予想される約２
５００ｂｐの増幅を確認した。ＰＣＲ反応液の残りをエ
タノール沈殿し、制限酵素Xho1、HindIIIにより消化
し、発現ベクターであるｐｌａｃＵＶ５．ＢＩＯ−ａの
Xho1、HindIIIサイトに挿入しｐＯＴ１からｐＯＴ１０
などを作製し、大腸菌ＤＨ５αを宿主として形質転換し
た。ジャーナルオブファメンションアンドバイ
オエンジニアリングＶＯＬ．８４，Ｎｏ．４，３５８
−３６０頁記載の方法などで測定して、最も高い活性を
示したトレハロース合成酵素の発現プラスミドをｐＯＴ
２と命名した。この発現プラスミドの制限酵素地図を図
７に示す。

【００８０】実施例５：トレハロース合成酵素の発現実施例４で得られた大腸菌 Escherichia coli ＤＨ５α
／ｐＯＴ２を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ
培地５ｍｌに接種して３７℃で振盪培養し、濁度が０．
Ｄ．６００＝０．５付近の段階で、終濃度１ｍＭのＩＰ
ＴＧを加え、３７℃で一晩振盪培養を行った。培養終了
後、培養液１ｍｌを遠心分離して菌体を集め、５０ｍＭ
リン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。次に、同
緩衝液０．５ｍｌに懸濁し、超音波処理により菌体を破
砕した。これを遠心分離して上清を回収し、大腸菌抽出
液とした。ジャーナルオブファメンションアンド
バイオエンジニアリングＶＯＬ．８４，Ｎｏ．４，
３５８−３６０頁記載の方法に準じて酵素の活性を測定
した。酵素の活性は次の方法により測定した活性値（単
位）で表示する。

【００８１】酵素活性の測定法は以下の通りである。菌
体０．０２ｇに最終濃度が１００ｍＭマルトース、１０
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、５ｍＭのＥＤＴＡ
になるように混合した反応液を作成し、３７℃で反応を
行った。反応終了後、反応液の一部を高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）により分析し、生成したトレハ
ロースを定量した。ＨＰＬＣの分析条件は以下のように
して行った。

【００８２】カラム：リクロソルブＮＨ２（メルク社製）溶媒：アセトニトリル：水＝８０：２０流速：１ｍｌ／分温度：４０℃ 検出器：示差屈折計なお、トレハロース合成酵素活性は３７℃、ｐＨ７．０
においてマルトースを基質とし１分間に１μｍｏｌのト
レハロースを生成する酵素力価を１Ｕ（ユニット）とし
た。

【００８３】トレハロース生成の程度は、基質とこの生
成物のピーク面積を対応するトレハロース標準品のピー
ク面積と比較することにより計算した。この溶液中トレ
ハロース合成酵素活性は２７．２Ｕ／ｍｌであることが
分かった。すなわち、元株であるシュードモナスｓ
ｐ．Ｆ１は０．２３Ｕ／ｍｌ程度であったので、本発明
の遺伝子を持つ大腸菌 Escherichia coli ＤＨ５α／ｐ
ＯＴ２が非常に高い酵素活性を示すことが実証された。

【００８４】

【発明の効果】本発明によりシュードモナスｓｐ．Ｆ
１由来のトレハロース合成酵素のアミノ酸配列及び塩基
配列が明らかとなり、これによりトレハロース合成酵素
活性を有するポリペプチド又はその活性と機能的に同等
の活性を有するポリペプチドの工業的に有利な遺伝子工
学的製造方法が提供される。

【００８５】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：６８７配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列の記載：配列番号１ Met Thr Gln Pro Asp Pro Ser Tyr Val Lys Trp Leu Glu Asp Arg 1 5 10 15 Ala Met Leu Lys Ala Ser Gln Ala Arg Ala Ser Leu Tyr Ser Gly 20 25 30 Gln Ser Arg Leu Trp Ser Ser Pro Thr Arg Ser Pro Ala Pro Pro 35 40 45 Arg His Arg Asn Cys Leu Gly Leu Val Asp Arg Val Pro Arg Arg 50 55 60 His His Arg Pro Ala Arg Leu Leu Arg Thr Trp Arg Pro Gly Ser 65 70 75 Arg Ser Thr Val Glu Thr Leu Ser Glu Ile Gly Ile Gln Gly Val 80 85 90 His Thr Gly Pro Ile Lys Leu Ser Gly Gly Ile Arg Gly Arg Glu 95 100 105 Leu Thr Pro Ser Val Asp Gly Asn Phe Asp Arg Ile Ser Phe Asp 110 115 120 Ile Asp Pro Leu Tyr Gly Ser Glu Gln Glu Leu Val Gln Met Ser 125 130 135 Arg Met Ala Ala Ala His Asn Ala Val Thr Ile Asp Asp Leu Ile 140 145 150 Pro Ser His Thr Gly Lys Gly Ala Asp Phe Arg Leu Ala Glu Met 155 160 165 Pro Thr Gly Pro Thr Arg Gly Cys Thr Thr Trp Ser Lys Ser Ala 170 175 180 Arg Arg Thr Gly Arg Cys Cys Leu Arg Cys Pro Pro Ala Ala Ile 185 190 195 Arg Ser Thr Cys Cys Gln Pro Ser Ala Thr Ser Ser Lys Pro Ala 200 205 210 Ile Thr Ser Ser Ala Ser Cys Asn Gly Val Ile Phe Phe Glu Pro 215 220 225 Gly Val Lys Glu Thr Asp Trp Ser Val Thr Pro Pro Ile Thr Gly 230 235 240 Val Asp Gly Lys Thr Arg Arg Trp Val Tyr Leu His Tyr Phe Lys 245 250 255 Asp Gly Gln Pro Ser Leu Asn Trp Leu Asp Pro Thr Phe Ala Ala 260 265 270 Gln Gln Met Ile Ile Gly Asp Ala Leu His Ala Leu Asp Cys Leu 275 280 285 Gly Ala Arg Gly Leu Arg Leu Asp Ala Asn Gly Phe Leu Gly Val 290 295 300 Glu Thr Arg Ala Ser Gly Thr Ala Trp Ser Glu Ser His Pro Leu 305 310 315 Ser Ile Val Gly Asn Gln Leu Ile Gly Gly Met Ile Arg Lys Ala 320 325 330 Gly Gly Phe Ser Phe Gln Glu Leu Asn Leu Thr Leu Asp Asp Ile 335 340 345 Ala Gln Met Ser Lys Gly Gly Ala Asp Leu Ser Tyr Asp Phe Ile 350 355 360 Thr Arg Pro Ala Tyr Gln His Ala Leu Leu Thr Gly Asp Thr Glu 365 370 375 Phe Leu Arg Leu Met Leu Lys Glu Met His Ala Phe Gly Ile Asp 380 385 390 Pro Ala Ser Leu Ile His Ala Leu Gln Asn His Asp Glu Leu Thr 395 400 405 Val Glu Leu Val His Phe Trp Thr Leu His Ala His Asp Met Tyr 410 415 420 Leu Tyr Lys Gly Gln Thr Leu Pro Gly Ser Ile Leu Arg Glu His 425 430 435 Ile Arg Glu Glu Ile Tyr Glu Arg Leu Ser Gly Glu His Ala Pro 440 445 450 Tyr Asn Leu Arg Phe Val Thr Asn Gly Ile Ala Cys Thr Thr Ala 455 460 465 Ser Leu Ile Ala Ala Ala Leu Gly Ile Arg Asp Leu Glu Gln Ile 470 475 480 Gly Ala Ala Glu Ile Glu Leu Ile Gln Lys Val His Leu Leu Leu 485 490 495 Val Met Tyr Asn Ala Met Gln Pro Gly Val Val Ala Leu Ser Gly 500 505 510 Trp Asp Leu Val Gly Ala Leu Pro Leu Pro Ala Glu Ala Val Ala 515 520 525 Gln Arg Met Leu Asp Gly Asp Thr Arg Trp Ile His Arg Gly Gly 530 535 540 Tyr Asp Leu Ala Gly Leu Ala Pro Gln Ala Glu Glu Ser Val Arg 545 550 555 Gly Met Pro Arg Ala Arg Ala Leu Tyr Gly Ser Leu Asp Ser Gln 560 565 570 Leu Glu Gln Gly Asp Ser Phe Ala Cys Lys Val Lys Lys Leu Leu 575 580 585 Ala Val Arg Gln Ala Tyr Gly Ile Ala Thr Ser Arg Gln Val Leu 590 595 600 Val Pro Glu Val Ser Ser Pro Gly Leu Leu Val Met Val His Glu 605 610 615 Leu Pro Ser Gly Arg Gly Ile Gln Ile Ser Ala Leu Asn Phe Gly 620 625 630 Gln Glu Val Ile Ala Glu Glu Leu Gln Leu Thr Gly Phe Thr Pro 635 640 645 Gly Pro Val Val Asp Met Ile Asn Glu Thr Val Glu Gly Asp Leu 650 655 660 Thr Glu Asp Gly Arg Leu Leu Val Asn Leu Asp Pro Tyr Glu Ala 665 670 675 Leu Cys Leu Arg Ile Val Asn Ser Ser Gly His Val 680 685

【００８６】配列番号：２配列の長さ：２０６４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ゲノミックＤＮＡ起源生物名：シュードモナスｓｐ．株名：Ｆ１配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１．．．２０６４特徴を決定した方法：Ｅ配列の記載：配列番号２ ATG ACC CAG CCC GAC CCG TCA TAT GTC AAA TGG CTC GAA GAC CGC GCC 48 ATG CTC AAG GCT TCC CAG GCG CGC GCC AGC CTG TAC TCA GGG CAG TCA 96 CGC CTG TGG AGC AGC CCT ACG CGA AGC CCA GCC CCG CCG CGC CAC CGA 144 AAT TGC CTC GGT CTG GTT GAC CGT GTA CCC CGA CGC CAT CAT CGC CCC 192 GCA AGA CTG CTC CGT ACT TGG CGC CCT GGC TCA CGA AGC ACT GTG GAA 240 ACG CTG TCG GAG ATC GGC ATC CAG GGG GTG CAC ACT GGC CCG ATC AAG 288 CTG TCC GGC GGT ATC CGT GGC CGC GAA CTC ACC CCC AGT GTG GAC GGT 336 AAC TTC GAC CGC ATC AGC TTC GAT ATC GAC CCG CTG TAC GGC AGC GAA 384 CAA GAG CTG GTC CAG ATG AGC CGC ATG GCC GCC GCA CAC AAC GCC GTT 432 ACC ATC GAC GAC CTG ATT CCC TCG CAC ACG GGC AAG GGC GCC GAC TTC 480 CGC TTG GCC GAG ATG CCC ACG GGC CCT ACC CGG GGC TGT ACC ACA TGG 528 TCG AAA TCC GCG AGG AGG ACT GGC CGC TGC TGC CTG AGG TGC CCG CCG 576 GCC GCG ATT CGG TCA ACC TGC TGC CAG CCC AGT GCG ACG AGC TCA AAG 624 CCC GCC ATT ACA TCG TCG GCC AGT TGC AAC GGG GTG ATC TTC TTC GAG 672 CCC GGT GTG AAG GAA ACC GAC TGG AGC GTC ACG CCG CCC ATC ACC GGT 720 GTC GAC GGC AAA ACC CGT CGC TGG GTT TAC CTG CAC TAT TTC AAG GAC 768 GGC CAA CCC TCA CTG AAC TGG CTA GAC CCG ACC TTC GCC GCC CAG CAA 816 ATG ATC ATT GGC GAT GCC TTG CAC GCC CTT GAC TGC CTG GGC GCG CGC 864 GGT CTG CGC CTG GAC GCC AAT GGC TTT CTG GGG GTG GAA ACG CGG GCC 912 AGC GGC ACC GCC TGG TCA GAA AGC CAC CCG CTG TCG ATC GTC GGC AAT 960 CAG TTG ATC GGC GGG ATG ATA CGC AAG GCG GGT GGC TTC AGC TTC CAG 1008 GAA CTG AAC CTG ACC CTG GAC GAC ATC GCG CAG ATG TCC AAA GGG GGG 1056 GCG GAC CTG TCC TAT GAC TTC ATC ACC CGA CCG GCC TAT CAG CAT GCG 1104 CTG CTG ACC GGT GAT ACC GAG TTC CTG CGC CTG ATG CTC AAG GAA ATG 1152 CAC GCC TTC GGC ATC GAC CCC GCC TCG CTG ATC CAT GCC CTG CAG AAC 1200 CAC GAC GAG CTG ACG GTG GAG CTG GTG CAT TTC TGG ACC CTG CAC GCC 1248 CAC GAC ATG TAC CTG TAC AAG GGC CAG ACC TTG CCA GGG AGT ATT TTG 1296 CGT GAG CAT ATC CGT GAA GAA ATC TAC GAA CGC CTC TCG GGC GAG CAC 1344 GCC CCC TAC AAC CTG CGC TTC GTC ACC AAT GGC ATT GCC TGC ACC ACG 1392 GCC AGC CTG ATC GCC GCA GCG TTG GGC ATC CGC GAC CTT GAG CAA ATC 1440 GGT GCG GCC GAA ATC GAG CTG ATT CAG AAA GTG CAT CTG CTG CTG GTC 1488 ATG TAC AAC GCC ATG CAG CCT GGG GTG GTC GCG CTG TCC GGC TGG GAC 1536 CTG GTC GGC GCC CTG CCC TTG CCC GCC GAA GCG GTC GCG CAG CGG ATG 1584 CTG GAT GGC GAT ACC CGC TGG ATT CAT CGA GGC GGT TAC GAC CTG GCC 1632 GGG CTC GCC CCA CAG GCG GAG GAG TCA GTG CGC GGA ATG CCG CGG GCT 1680 CGG GCA TTG TAT GGC AGC CTC GAC AGC CAG CTG GAA CAG GGT GAT TCG 1728 TTT GCC TGC AAA GTG AAG AAG CTG CTG GCC GTG CGG CAG GCC TAT GGC 1776 ATC GCC ACC AGC CGC CAG GTG CTG GTG CCT GAG GTC AGT AGC CCG GGG 1824 TTG CTG GTC ATG GTT CAT GAA CTG CCA TCC GGG CGC GGT ATC CAG ATC 1872 AGC GCA CTG AAC TTT GGC CAG GAA GTT ATT GCC GAG GAG TTG CAG TTG 1920 ACC GGG TTT ACG CCG GGG CCG GTC GTG GAC ATG ATC AAC GAA ACG GTC 1968 GAA GGG GAC CTG ACC GAA GAC GGG CGA TTG CTG GTG AAC CTG GAC CCG 2016 TAC GAG GCA CTG TGC CTG CGA ATC GTC AAC AGC AGT GGA CAT GTG TAA 2064

【００８７】配列番号：３配列の長さ：３６０７配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ゲノミックＤＮＡ起源生物名：シュードモナスｓｐ．株名：Ｆ１配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１９１．．．２２５５特徴を決定した方法：Ｅ配列の記載：配列番号３ ACCCGCTCCC ACAGTTAGTG CACCGGCCTT GAGGACAGTG GCTAGTTGAA TAAGCCACCG 60 CCCCTGGTGC GACGCGGTCA ATGTGGGAGC GGGTTTACCC GCGAAGAGGC CATCACAGGT 120 TTCAGCCGAA CGATCAGGCC ACAATGCCGT CATAACCTGA GCCGGTGCCG ACACGCAAAG 180 AGGACGCGAA ATG ACC CAG CCC GAC CCG TCA TAT GTC AAA TGG CTC GAA GAC 232 CGC GCC ATG CTC AAG GCT TCC CAG GCG CGC GCC AGC CTG TAC TCA GGG 280 CAG TCA CGC CTG TGG AGC AGC CCT ACG CGA AGC CCA GCC CCG CCG CGC 328 CAC CGA AAT TGC CTC GGT CTG GTT GAC CGT GTA CCC CGA CGC CAT CAT 376 CGC CCC GCA AGA CTG CTC CGT ACT TGG CGC CCT GGC TCA CGA AGC ACT 424 GTG GAA ACG CTG TCG GAG ATC GGC ATC CAG GGG GTG CAC ACT GGC CCG 472 ATC AAG CTG TCC GGC GGT ATC CGT GGC CGC GAA CTC ACC CCC AGT GTG 520 GAC GGT AAC TTC GAC CGC ATC AGC TTC GAT ATC GAC CCG CTG TAC GGC 568 AGC GAA CAA GAG CTG GTC CAG ATG AGC CGC ATG GCC GCC GCA CAC AAC 616 GCC GTT ACC ATC GAC GAC CTG ATT CCC TCG CAC ACG GGC AAG GGC GCC 664 GAC TTC CGC TTG GCC GAG ATG CCC ACG GGC CCT ACC CGG GGC TGT ACC 712 ACA TGG TCG AAA TCC GCG AGG AGG ACT GGC CGC TGC TGC CTG AGG TGC 760 CCG CCG GCC GCG ATT CGG TCA ACC TGC TGC CAG CCC AGT GCG ACG AGC 808 TCA AAG CCC GCC ATT ACA TCG TCG GCC AGT TGC AAC GGG GTG ATC TTC 856 TTC GAG CCC GGT GTG AAG GAA ACC GAC TGG AGC GTC ACG CCG CCC ATC 904 ACC GGT GTC GAC GGC AAA ACC CGT CGC TGG GTT TAC CTG CAC TAT TTC 952 AAG GAC GGC CAA CCC TCA CTG AAC TGG CTA GAC CCG ACC TTC GCC GCC 1000 CAG CAA ATG ATC ATT GGC GAT GCC TTG CAC GCC CTT GAC TGC CTG GGC 1048 GCG CGC GGT CTG CGC CTG GAC GCC AAT GGC TTT CTG GGG GTG GAA ACG 1096 CGG GCC AGC GGC ACC GCC TGG TCA GAA AGC CAC CCG CTG TCG ATC GTC 1144 GGC AAT CAG TTG ATC GGC GGG ATG ATA CGC AAG GCG GGT GGC TTC AGC 1192 TTC CAG GAA CTG AAC CTG ACC CTG GAC GAC ATC GCG CAG ATG TCC AAA 1240 GGG GGG GCG GAC CTG TCC TAT GAC TTC ATC ACC CGA CCG GCC TAT CAG 1288 CAT GCG CTG CTG ACC GGT GAT ACC GAG TTC CTG CGC CTG ATG CTC AAG 1336 GAA ATG CAC GCC TTC GGC ATC GAC CCC GCC TCG CTG ATC CAT GCC CTG 1384 CAG AAC CAC GAC GAG CTG ACG GTG GAG CTG GTG CAT TTC TGG ACC CTG 1432 CAC GCC CAC GAC ATG TAC CTG TAC AAG GGC CAG ACC TTG CCA GGG AGT 1480 ATT TTG CGT GAG CAT ATC CGT GAA GAA ATC TAC GAA CGC CTC TCG GGC 1528 GAG CAC GCC CCC TAC AAC CTG CGC TTC GTC ACC AAT GGC ATT GCC TGC 1576 ACC ACG GCC AGC CTG ATC GCC GCA GCG TTG GGC ATC CGC GAC CTT GAG 1624 CAA ATC GGT GCG GCC GAA ATC GAG CTG ATT CAG AAA GTG CAT CTG CTG 1672 CTG GTC ATG TAC AAC GCC ATG CAG CCT GGG GTG GTC GCG CTG TCC GGC 1720 TGG GAC CTG GTC GGC GCC CTG CCC TTG CCC GCC GAA GCG GTC GCG CAG 1768 CGG ATG CTG GAT GGC GAT ACC CGC TGG ATT CAT CGA GGC GGT TAC GAC 1816 CTG GCC GGG CTC GCC CCA CAG GCG GAG GAG TCA GTG CGC GGA ATG CCG 1864 CGG GCT CGG GCA TTG TAT GGC AGC CTC GAC AGC CAG CTG GAA CAG GGT 1912 GAT TCG TTT GCC TGC AAA GTG AAG AAG CTG CTG GCC GTG CGG CAG GCC 1960 TAT GGC ATC GCC ACC AGC CGC CAG GTG CTG GTG CCT GAG GTC AGT AGC 2008 CCG GGG TTG CTG GTC ATG GTT CAT GAA CTG CCA TCC GGG CGC GGT ATC 2056 CAG ATC AGC GCA CTG AAC TTT GGC CAG GAA GTT ATT GCC GAG GAG TTG 2104 CAG TTG ACC GGG TTT ACG CCG GGG CCG GTC GTG GAC ATG ATC AAC GAA 2152 ACG GTC GAA GGG GAC CTG ACC GAA GAC GGG CGA TTG CTG GTG AAC CTG 2200 GAC CCG TAC GAG GCA CTG TGC CTG CGA ATC GTC AAC AGC AGT GGA CAT 2248 GTG TAA ACGGCGCCGG GCCAGGGCAG TGCAGCAGAG GGGCAGGTCG GTCTTGCAAT 2304 TAGAGCGCTA CGGGCATAGC GTTCGGGAGA TTTCTTTTCC GTGCCCAGGA GCAACTCCAT 2364 GTACACCGGC ATCGTTCAGG CCGTCCGCCC TCTGCTTGAT GTGACCACCT ACCCGGGCCA 2424 CAACCAGTTC ACGATCGACC TCACCCCGGA ACTGCTCGAC GAATTGAAGA TCGGCGCCAG 2484 CGTCAGTGTC GAAGGCACCT GCCTGTCGGT CACCGAAATC GCCGGCACCC AAGTCAGGTT 2544 CGACGCCATG ACCGCCACGC TCGAACGCAC CAACCTACGC TTCTTCAAGG CGGGCCAGGG 2604 GGTCAACATT GAACGTTCGG CGAAAATGAA CGCCGAAGTC GGTGGCCACC TGATGGCCGG 2664 CCATATCGCC ACCACCGCCG AAATCGTCGA ACTGTCGATC AAGGAAACCG GCGCCTTCAT 2724 CAAGTTCCGC ATGCCCCCGG AATGGGGCAA GTACGTGTTC CCACGCGGTT TCATCGGGGT 2784 CAATGGCTGC AGCCTGACCG TCGCCGATGT CGACGACAAC GTCATCACCA TCAACCTGAT 2844 CCCGGAAACC CTGCGCCAGA CCACTTTTGC CAGCTACAAG GCCGGCGATC AGCTCAATAT 2904 CGAGGTCGAT CACCAGACCA TGGTGCTGGT TGATGTGGTA GAACGCACCA TCAAAGGCAC 2964 CCTGGCCCGC GAAAAACTGC TGCCCTGAGG CCTGGCCATG CTGCCCAACG CCCTTCCCGC 3024 GCGCACGGCC AGGCGGCTAC GCTGCATAGT GTTGCGTGGC CGTGTCGGCT TGGCCTGGTC 3084 GCTGGTTTGT CAGTGCTGGC TGGCATGACC GATGCCATCG GCCTGCTGGC GTTGGGCGAC 3144 TTCGTGTCGT TCATGAGTGG CAATACCACA CGCCTGGCCG TGGCCATCAG TGAGGCAGAC 3204 CTTGCGCTGG TGCTGCGCCT GAGTGGCGCG ATACTGGGCT TCGTCGCTGG CAATGCGCTG 3264 GGCGTGCTGC TGGCCCGTGG CTTGCGCCGC CGGGCCTGGC CCGTGTTGCT GATGGTTGCG 3324 GTACTGCTGG CGTTCGCAGC GGCGTGGCCG TTGGCGGCCA CCTTCCCGGC ATTGTTGGCC 3384 GCCACGCTGG CCATGGGCAT GATCAATGCC GTGGTTGAAC AGGTGAACGG CCTCCTATCG 3444 GCCTACTTAC GTCACCGGCG CCCTGTCCCG CTTCGGCCGT GGCCTGGGCC GTTGGCTGAT 3504 GGGCGAACGG CGCAACGGCT GGCGGGTGCA GCTGGTGCCC TGGGCCGGCA TGCTGCTGGG 3564 GGCCGCGTTG GGCGCCTGGT TGCAGCAGCG CCTGGGCCTG CAG 3607

【００８８】配列番号：４配列の長さ：１５配列の型：アミノ酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列の記載：配列番号４ Met Asp Pro Ile Val Pro Arg Gln Pro Gly Asp Lys Pro Leu Ala 5 10 15

【００８９】配列番号：５配列の長さ：１１配列の型：アミノ酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【００９０】配列番号：６配列の長さ：１２配列の型：アミノ酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【００９１】配列番号：７配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の記載：配列番号７ GTSAARTGGY TGGARGAYCG YGCSATG 27

【００９２】配列番号：８配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の記載：配列番号８ ACSCAGCCSG ATCCSWSSTA TGTSAAGTGG 30

【００９３】配列番号：９配列の長さ：２９配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の記載：配列番号９ TGSGCSGCSG CCATGCGGCT CATCTGSAC 29

【００９４】配列番号：１０配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の記載：配列番号１０ GGTCTCGAGA CGCAAAGAGG ACGCGAAATG 30

【００９５】配列番号：１１配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の記載：配列番号１１ CCGAAGCTTC AATGTTGACC CCCTGGCCCG 30

【００９６】配列番号：１２配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の記載：配列番号１２ GGTCTCGAGA CGCAAAGAGG ACGCGAAATG 30

【００９７】配列番号：１３配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の記載：配列番号１３ CCGAAGCTTC AATGTTGACC CCCTGGCCCG 30

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明によるクローニングとシーク
エンシングの戦略の概略図である。

【図２】図２は、サザンハイブリダイゼーションの結
果を示す図である。

【図３】図３は、inverse ＰＣＲとVectoretteＰＣＲ
の概念図である。

【図４】図４は、プラスミドｐＦＣＥ３１の制限酵素
地図とサブクローンの位置を示す。

【図５】図５は、トレハロース合成酵素と他の酵素と
の共通領域を示す表である。

【図６】図６は、細菌のヒートショックプロモーター
の構造を示す。

【図７】図７は、本発明による組換えＤＮＡであるｐ
ＯＴ２の制限酵素地図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者東谷篤志宮城県仙台市青葉区西花苑２−21−14 (72)発明者吉永光一静岡県焼津市坂本411−６

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】トレハロース合成酵素活性又はその活性
と機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコードす
るＤＮＡ。
【請求項２】ポリペプチドがシュードモナス属由来の
ものである請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項３】コードされるポリペプチドが３７℃付近
の温度において酵素として効率的に利用できることを特
徴とする、請求項１又は請求項２に記載にＤＮＡ。
【請求項４】配列表の配列番号：１に記載したアミノ
酸配列をコードすることを特徴とする請求項１から請求
項３のいずれか１項に記載のＤＮＡ。
【請求項５】配列表の配列番号：２に記載したＤＮＡ
配列を有することを特徴とする請求項４記載のＤＮＡ。
【請求項６】配列表の配列番号：１に記載したアミノ
酸配列の一部を含むトレハロース合成酵素活性を有する
ポリペプチド又はその活性と機能的に同等の活性を有す
るポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項７】配列表の配列番号：２に記載したＤＮＡ
配列の一部を含むＤＮＡであって、かつトレハロース合
成酵素活性を有するポリペプチド又はその活性と機能的
に同等の活性を有するポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ。
【請求項８】配列表の配列番号：１に記載したアミノ
酸配列に対して、１個もしくは複数のアミノ酸残基が欠
失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つがされて
できるポリペプチドをコードするＤＮＡであって、上記
ポリペプチドがトレハロース合成酵素活性又はその活性
と機能的に同等の活性を有している、上記ＤＮＡ。
【請求項９】請求項１から請求項８のいずれか１項記
載のＤＮＡとハイブリダイズすることができる、トレハ
ロース合成酵素活性を有するポリペプチド又はその活性
と機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコードす
るＤＮＡ。
【請求項１０】請求項１から請求項８のいずれか１項
記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズすることができる、トレハロース合成酵素活性を有
するポリペプチド又はその活性と機能的に同等の活性を
有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１１】配列表の配列番号：２に記載のＤＮＡ
配列と少なくとも７０％以上の相同性を有するＤＮＡで
あって、トレハロース合成酵素活性を有するポリペプチ
ド又はその活性と機能的に同等の活性を有するポリペプ
チドをコードするＤＮＡ。
【請求項１２】配列表の配列番号：２に記載のＤＮＡ
配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するＤＮＡで
あって、トレハロース合成酵素活性を有するポリペプチ
ド又はその活性と機能的に同等の活性を有するポリペプ
チドをコードする請求項１１に記載のＤＮＡ。
【請求項１３】配列表の配列番号：２に記載のＤＮＡ
配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するＤＮＡで
あって、トレハロース合成酵素活性を有するポリペプチ
ド又はその活性と機能的に同等の活性を有するポリペプ
チドをコードする請求項１１又は１２に記載のＤＮＡ。
【請求項１４】請求項１から請求項１３のいずれか１
項に記載のＤＮＡを含む、組み換えＤＮＡ。
【請求項１５】請求項１４に記載の組み換えＤＮＡを
含む、発現ベクター。
【請求項１６】宿主が細菌、動物細胞または植物細胞
である、請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項１７】請求項１５または請求項１６に記載の
発現ベクターを保持する形質転換体。
【請求項１８】宿主が大腸菌である請求項１７に記載
の形質転換体。
【請求項１９】請求項１から請求項１３に記載のＤＮ
Ａと自律複製可能なベクターとを含む組み換えＤＮＡを
適宜宿主に導入することによって得られる形質転換体を
培養し、培養物から、トレハロース合成酵素又は該酵素
活性と機能的に同等の活性を有するポリペプチドを回収
することを含む、トレハロース合成酵素又は該酵素活性
と機能的に同等の活性を有するポリペプチドの製造方
法。
【請求項２０】請求項１〜請求項１３に記載のＤＮＡ
によってコードされるトレハロース合成酵素または該酵
素活性と機能的に同等の活性を有するポリペプチドをマ
ルトースに作用させることによってトレハロースを生成
させることを含む、マルトースをトレハロースに酵素的
に変換する方法。
【請求項２１】配列表の配列番号３に記載のＤＮＡ配
列を有する遺伝子の発現の調節のための配列を含むＤＮ
Ａ断片。