CN1705751A - 具有修饰c端的反馈抗性高丝氨酸转琥珀酰酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高丝氨酸转琥珀酰酶，其与野生型高丝氨酸转琥珀酰酶相比有对L－甲硫氨酸或SAM的降低的敏感性，后者包含一段含有TyrGlnXaaThrPro亚序列的氨基酸序列，所述亚序列的Thr位于所述氨基酸序列的第285位和第310位之间，且第1位对应于起始甲硫氨酸。本发明的高丝氨酸转琥珀酰酶的特征在于与野生型酶相比，至少修饰了2个氨基酸，所述修饰发生在所述亚序列的Thr或C端。

Description

具有修饰C端的反馈抗性高丝氨酸转琥珀酰酶
本发明涉及具有反馈抗性的高丝氨酸转琥珀酰酶，含有这些酶的微生物菌株及其用于制备L-甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸的用途。
甲硫氨酸是人类和许多动物的必需氨基酸。特别是，其被制备用于饲料市场及作为消旋物被添加到动物饲料中。它由丙烯醛和甲硫醇经过3-(甲硫基)丙醛化学合成，该3-(甲硫基)丙醛用氰化氢、氨和二氧化碳经过乙内酰脲转变成D，L-甲硫氨酸。消旋物可用酶解析。
S-腺苷甲硫氨酸(SAM)是代谢中最重要的甲基供体，在医药领域，用于治疗抑郁、肝病和关节炎。已经被描述用于制备SAM的方法，特别包括在前体L-甲硫氨酸存在的情况下培养酵母(Schlenk F.和DePalma R.E.，J.Bilo.Chem.1037-1050(1957)，Shiozaki S.等人，Agric.Biol.Chem.53，3269-3274(1989))及在自溶后层析纯化。
甲硫氨酸的微生物合成，在大肠杆菌中研究得尤其深入(Greene，R.C.，在Neidhardt F.C.，大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌中甲硫氨酸的生物合成，细胞与分子生物学，第二版，ASM出版社，华盛顿市(1996)542-560页及其中所含的文献)。甲硫氨酸的微生物合成由许多酶催化的反应组成并被严格控制。合成的第一步，从天冬氨酸到高丝氨酸，与合成苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸同时进行。合成的第一步对甲硫氨酸的合成是特异性的，它是从琥珀酰基-CoA和高丝氨酸生成O-琥珀酰基高丝氨酸，并除去辅酶A。该反应由高丝氨酸琥珀酰基转移酶(高丝氨酸O-转琥珀酰酶，MetA，EC 2.3.1.46)所催化。SAM用L-甲硫氨酸和ATP一步合成。
高丝氨酸转琥珀酰酶的活性在L-甲硫氨酸和/或SAM存在的情况下被抑制(Lee L.-W.等人，J.Biol.Chem.241，5479-5480(1966))。该终产物抑制一方面防止细菌中过度耗能合成甲硫氨酸和SAM，另一方面还同时阻碍以工业规模用微生物生产这两种物质。编码高丝氨酸转琥珀酰酶的基因由930个碱基对组成(包括终止密码子)，而由该基因编码的蛋白质由309个氨基酸组成。高丝氨酸转琥珀酰酶的结构迄今还未被阐明，因此也还不能鉴定参与终产物抑制的氨基酸。
增加代谢终产物合成的已知方法是使用其活性不再被其代谢途径的终产物所抑制的经修饰的酶(反馈抗性突变体)。因此，例如3-去氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶反馈抗性突变体已经被制备用于增加L-色氨酸和L-苯丙氨酸的合成(EP0745671A2)，及分枝酸变位酶/预苯酸脱水酶的反馈抗性突变体已经被制成用于增加苯丙氨酸的产生(US5120837)。
大肠杆菌高丝氨酸转琥珀酰酶最近通过突变编码它的DNA序列被修饰，使得生成蛋白质的活性在L-甲硫氨酸或SAM存在的情况下较不易被抑制(JP2000139471A；DE10247437(相同申请人的申请))。涉及的突变是点突变，在每种情况下一个氨基酸被另一个氨基酸置换(JP2000139471A：第27位的精氨酸用半胱氨酸置换，第296位的异亮氨酸用丝氨酸置换及第298位的脯氨酸用亮氨酸置换；DE10247437：第101位的天冬氨酸或第294位的酪氨酸用另一个天然氨基酸置换)。与野生型酶相比，改变的高丝氨酸转琥珀酰酶在抑制剂L-甲硫氨酸和/或SAM存在的情况下显示出改良的活性。含有这些被改变的蛋白质的细菌菌株显示增加了L-甲硫氨酸的生产。
期望获得尽可能多的高丝氨酸转琥珀酰酶变异体，它们在活性程度上及可被L-甲硫氨酸和/或SAM抑制的程度上不同，因为L-甲硫氨酸和SAM的微生物生物合成在过程和调节上非常复杂，而且还以多种不同的方式把细胞中多种其他代谢途径连结起来。因此不可能事先预测可以获得怎样的能影响微生物菌株生长、平衡其生命代谢过程及L-甲硫氨酸和SAM生产的变异体。
本发明的目的是提供广泛的高丝氨酸转琥珀酰酶(MetA蛋白质)的新的变异体，在与野生型(WT)酶比较下显示出对L-甲硫氨酸和SAM的反馈抗性被提高。
本发明的目的通过高丝氨酸转琥珀酰酶实现，与高丝氨酸转琥珀酰酶野生型酶相比显示出对L-甲硫氨酸和SAM的敏感性降低，而野生型酶有一段氨基酸序列，包括成分序列TyrGlnXaaThrPro，这个成分序列的Thr位于氨基酸序列的第285位至310位间，且第1位为起始甲硫氨酸，其特征在于与野生型酶相比，所述高丝氨酸转琥珀酰酶显示至少2个氨基酸的改变，而这个改变位于该成分序列中的Thr或其C-端。
大肠杆菌MetA蛋白中，保守的Thr在成分序列TyrGlnXaaThrPro中是第297位(见SEQ ID NO：2)。Xaa表示任何任意的天然氨基酸。
所述改变优选改变至少5个氨基酸，特别优选改变至少10个氨基酸。改变可以是缺失或插入。
因此目前仅揭示了具有反馈抗性的高丝氨酸转琥珀酰酶，其中与野生型相比，改变基于单一氨基酸的取代(JP2000139471A)。因为蛋白质的折叠是非常复杂的过程，并且酶活性直接依赖于蛋白质的空间结构，所以蛋白质的相对大的改变在许多情况中都造成活性丧失。然而，令人惊奇的发现是与本发明一致的在MetA羧基端部分的多重改变导致L-甲硫氨酸和SAM发挥反馈抑制能力的降低。
本发明的高丝氨酸转琥珀酰酶对抑制剂SAM和/或L-甲硫氨酸呈现抗性，其优于野生型酶。优选呈现对甲硫氨酸和/或SAM的高丝氨酸转琥珀酰酶抗性至少是野生型酶的2倍。特别优选本发明的高丝氨酸转琥珀酰酶对甲硫氨酸和/或SAM的抗性是野生型酶的10倍，特别优选抗性被增加50倍。
特别优选地，本发明高丝氨酸转琥珀酰酶的蛋白质序列含有表1所列突变之一。
本发明的高丝氨酸转琥珀酰酶可例如通过表达编码本发明的高丝氨酸转琥珀酰酶DNA序列而获得。
本发明因此还涉及编码本发明的高丝氨酸转琥珀酰酶的DNA序列。
这样的DNA序列可以通过突变MetA基因的一或多个密码子的至少一个碱基而获得，其特征是改变的碱基位于成分序列TyrGlnXaaThrPro中以苏氨酸Thr密码子起始的3’区，而在此序列中Thr位于第285位和310位之间。在大肠杆菌MetA蛋白质中，成分序列的Thr位于第297位(见SEQ ID NO：2)。
本发明的DNA序列以下称为具有反馈抗性的MetA等位基因。在本发明说明书中，在使用BESTFIT算法(GCG Wisconsin Package，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wisconsin)的分析中，那些与大肠杆菌WT metA基因有超过50％的序列相同性的基因也被理解成是metA等位基因。以完全相同的方式，与大肠杆菌野生型高丝氨酸转琥珀酰酶有超过50％的序列相同性(BESTFIT算法，GCGWisconsin Package，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wisconsin)并拥有高丝氨酸转琥珀酰酶活性的蛋白质也被称为高丝氨酸转琥珀酰酶。
本发明的MetA等位基因的DNA序列优选含有表1所列的突变之一。
本发明的metA等位基因例如可以用下述的原料通过非特异性诱变或定向诱变来制备。上述DNA区城内的非特异性突变可以通过例如化学试剂(例如1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍，甲磺酸乙酯及类似物)和/或通过物理方法和/或通过在规定条件下进行的聚合酶链式反应和/或通过在突变株(例如XL1red)中扩增DNA制得。在DNA片段内的特定位置导入突变的方法是已知的。另一种生成具有反馈抗性的metA等位基因的可能性在于组合不同的反馈抗性诱导突变以得到具有新特性的多重突变体。
优选用野生型metA基因的DNA作为诱变原料。要被突变的metA基因可以被染色体编码或在染色体外被编码。上述的诱变方法用以修饰DNA序列的一个或多个核苷酸，使得由其所编码的蛋白质拥有本发明的多重突变。
已经被描述的技术可用以在任意metA基因中的所述DNA区域导入一个或多个突变。这些突变导致所编码的高丝氨酸转琥珀酰酶拥有了导致对SAM和/或L-甲硫氨酸具反馈抗性的氨基酸序列。
在如所述地进行诱变后，拥有期望表型的突变体被选择，例如通过测定突变的高丝氨酸转琥珀酰酶对L-甲硫氨酸和/或SAM的敏感性程度而进行选择。
本发明还涉及含有反馈抗性的metA等位基因的微生物。这些微生物菌株的特征在于它们具有至少由具有反馈抗性的metA等位基因去调节(deregulated)的L-甲硫氨酸代谢或SAM代谢。因为此代谢在所有微生物中由相同的途径(其本身是已知的)进行，并且用于产生本发明的菌株的技术为本领域技术人员所熟知，例如，从标准教科书得知，并可用于所有的微生物，因此本发明的菌株可用任意的微生物制备。优选及合适的是用细菌生产本发明的菌株。革兰氏阴性菌，特别是大肠杆菌，特别适合。
本发明还进一步涉及通过培养本发明的微生物制备的L-甲硫氨酸或SAM，还涉及本发明的微生物用于制备含有甲硫氨酸(如含甲硫氨酸多肽)或在微生物代谢中衍生自L-甲硫氨酸或SAM(如多胺类、硫辛酸、生物素或醌类)的产物。此外，较野生型产生更大量SAM的本发明的微生物可用于制备通过从SAM转移甲基形成的产物。
为表达经修饰的高丝氨酸转琥珀酰酶，具有反馈抗性的metA等位基因经常规方法转化到宿主菌株中。
在L-甲硫氨酸或SAM存在的情况下能使酶活性被测定的任何方法，都可用于测定高丝氨酸转琥珀酰酶对L-甲硫氨酸和/或SAM的敏感性。例如，高丝氨酸转琥珀酰酶活性可由以下Kredich和Tomkins所述用于测定丝氨酸乙酰基转移酶活性的方法测定(Kredich N.M.和Tomlins G.M.，J.Biol.Chem.241，4955-4965(1966))。在含有高丝氨酸和琥珀酰基-CoA的分析样品中测量酶活性。反应由加入酶开始并用分光光度计根据由琥珀酰基-辅酶A中硫酯键的裂解所致的在232nm处消光的降低来监测。上述试验适合高丝氨酸转琥珀酰酶对甲硫氨酸的敏感性的测定。高丝氨酸转琥珀酰酶活性的抑制在不同浓度的L-甲硫氨酸存在的情况下，在反应混合液中检测。不同高丝氨酸转琥珀酰酶的催化活性在有或无L-甲硫氨酸的情况下测定，而这些数据被用以计算抑制常数Ki，它描述了活性仅为在无抑制剂的情况下可测定活性的50％的抑制剂浓度。
为测定不同高丝氨酸转琥珀酰酶活性对SAM的敏感性，有可能例如，进行如Lee L.W.等人，J.Biol.Chem.241，5479-5480(1966)所述的活性试验。在该方法中，酶萃取物与高丝氨酸和琥珀酰基-CoA一起培养。在不同的时间，一部份试验分析样品通过将其加入到乙醇、水和5，5’-二硫双(2-硝基苯甲酸)的混合液中被终止。吸收在412nm处用分光光度计测定。上述试验，适合例如用于测定高丝氨酸转琥珀酰酶对SAM敏感性。高丝氨酸转琥珀酰酶活性的抑制在不同浓度的SAM存在的情况下在反应混合液中测试。不同的高丝氨酸转琥珀酰酶的催化活性在有或无SAM的情况下测定，抑制常数Ki则用这些数据计算。
优选的是通常对L-甲硫氨酸和/或SAM具有降低敏感性又拥有未改变的催化活性的高丝氨酸转琥珀酰酶。为其它目的，L-甲硫氨酸和/或SAM的敏感性和催化活性同时被降低也是我们所期望的。
具有反馈抗性的metA等位基因可在位于metA基因上游的自身启动子的控制下表达，或使用本领域技术人员所熟知的其它合适的启动子系统。因此，对应的基因可在这样的启动子的控制下以一个或多个拷贝存在于宿主生物的染色体上或载体上，优选质粒。本发明因此还涉及质粒，其特征是其中含有本发明的具有反馈抗性的metA等位基因及启动子。
对于克隆，可使用已含有遗传元件(例如组成型或调节型启动子、终止子)的载体，这些元件使编码高丝氨酸转琥珀酰酶的基因能以可连续表达或以受控制的可诱导的方式表达。此外，在表达载体上还有其它调节元件如核糖体结合位点和终止序列，以及编码选择标记和/或报道基因的序列。这些选择标记的表达促进转化体的鉴定。合适的选择标记为例如编码对氨苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素和其它抗生素的抗性的基因。若本发明的metA等位基因要在染色体外复制时，则质粒载体优选含有复制起点。尤其优选质粒载体如大肠杆菌载体pACYC184、pUC18，pBR322和pSC101及其衍生物。合适的可诱导的启动子的实例为lac、tac、trc、lambda PL、ara和tet启动子或自其衍生的序列。优选GAPDH启动子的组成型表达。在本发明的一个优选实施例中，编码高丝氨酸转琥珀酰酶的基因在衍生自pACYC184的质粒中的GAPDH启动子的控制下。将基因整合入染色体的策略是现有技术。
合适宿主菌株用含有编码对L-甲硫氨酸不敏感和/或对SAM不敏感的高丝氨酸转琥珀酰酶的转录单元的载体转化。含有对L-甲硫氨酸敏感和/或对SAM敏感的蛋白质的菌株，例如细菌，被用作宿主菌株。
优选使用的宿主菌株为大肠杆菌野生型菌株或其中内源metA基因失活的菌株，如大肠杆菌菌株DL41，CGSC菌株收藏号7177。这些菌株用本发明的metA基因互补。附加的措施可用以增加本发明的菌株生产L-甲硫氨酸或SAM的能力。例如，为此目的，可使用其中不再表达编码甲硫氨酸代谢基因抑制子的metJ基因的菌株(JP2000139471A)。再者，可通过组合本发明的突变株和其它突变而生成改良的和更加优越的高丝氨酸转琥珀酰酶，所述的其它突变例如为DE10247437或JP2000139471A中所述的氨基酸取代。
优选通过培养本发明的微生物菌株来产生L-甲硫氨酸或SAM。为此目的，微生物菌株，例如，在发酵罐中在合适的碳源和合适的能源以及其它添加剂的营养培养基中培养为佳。
在发酵期间形成的物质，如L-甲硫氨酸或SAM，之后可被纯化。
以下实施例用以进一步说明本发明。所有采用的分子生物学方法，如聚合酶链反应，DNA的分离和纯化，用限制酶、Klenow片段和连接酶修饰DNA，转化等是采用本领域技术人员所熟知的方式，文献中的所描述的方式或以各厂商所建议的方式实施。
实施例1：
通过改变metA结构基因的羧基端部分生成具反馈抗性的高丝氨酸转琥珀酰酶
质粒pKP413GAP含有在GAPDH启动子控制下的大肠杆菌野生型metA基因及以编号DSM15221保藏于不伦瑞克的德国微生物保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)，作为起始质粒。采用pKP413GAP作为底物，进行反向聚合酶链反应，与本领域技术人员已知的法则一致地使用Vent聚合酶(新英格兰生物实验室)。具有序列5’-CTATTTGTTAGTGAATAATAGTACTGAGCTCTGG-3’(SEQ IDNo.3)的5’-磷酸化寡核苷酸metAdel1和具有序列5’-CTGGTGGATATATGAGATCTGGTAGACGTAATAG-3’(SEQ IDNo.4)的metAdel2作为引物。约4.3kb大小的产物依照厂商说明书内容电泳分离和纯化，使用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen)。其后，使用T4DNA连接酶依照厂商的说明书内容进行分子内连接。大肠杆菌DH5α的细胞使用CaCl2法以本领域技术人员已知的方式转化。转化混合物涂布在LB-四环素琼脂板上(10克蛋白胨/升，5克酵母提取物/升，10克NaCl/升，15克琼脂/升，15毫克四环素/升)，然后在37℃下培养过夜。在使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)进行了质粒分离后，通过限制分析鉴定想要的转化体。Esp3I至ScaI裂解部位间的区域被测序和分离，并插入已以相同酶处理的pKP413GAP质粒中。生成的质粒pBaBmetAdel含有大肠杆菌metA结构基因，在GAPDH启动子控制下及与野生型比较拥有在3’端的改变，参阅表1。由此基因所编码蛋白质的经改变的氨基酸序列同样示于表1。
通过类似于上述的方法，使用具有序列5’-TGGTGGATATATGAGATCTGGTAGACGTAATAG-3’(SEQ IDNo.5)的寡核苷酸metAext1和具有序列5’-CTATTTGTTAGTGAATAATAGTACTGAGCTCTGG-3’(SEQ IDNo.3)的metAdel1的聚合酶链反应用以生成质粒pBaBmetAext。
使用具有序列5’-TGGTGGATATATGAGATCTGGTAGACGTAATAG-3’(SEQ IDNo.5)的寡核苷酸metAext1和具有序列5’-GTATTTGTTAGTGAATAATAGTACTGAGCTCTGG-3’(SEQ IDNo.6)的metAext2的聚合酶链反应用以生成质粒pBaBmetAex2。
MetA结构基因与野生型比较下的改变见表1。
表1：起始质粒(AP)以及含有具经改变羧基端的metA变异物的质粒
  质粒   在metA结构基因中自889向前的碱基   在MetA蛋白质中自297向前的氨基酸
  pKP413GAP(SP)   ACGCCATACGATCTACGGCACATGAATCCAACGCTGGATTAA(自bp889至930的SEQ ID No.1序列的片段)   ThrProTyrAspLeuArgHisMetAsnProThrLeuAsp(自氨基酸297至309的SEQ ID No.2序列的片段)
  pBaBmetAdel   TCATATATCCACCAGCTATTTGTTAGTGAATAA(SEQ ID No.7)   SerTyrIleHisGlnLeuPheValSerGlu(SEQ ID No.8)
  pBaBmetAect   TCATATATCCACCACTATTTGTTAGTGAATAATAGTACTGAGCTCTGGATGCATACGCGTTTAATTAAGCGGCCGCACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCG(SEQ ID No.9)   SerTyrIleHisHisTyrLeuLeuValAsnAsnSerThrGluLeuTrpMetHisThrArgLeuIleLysArgProHisCysAspGluTroGlnGlyGlyAla(SEQ ID No.10)
  pBaBmetAext2   TCATATATCCACCAGTATTTGTTAGTGAATAATAGTACTGAGCTCTGGATGCATACGCGTTTAATTAAGCGGCCGCACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCG(SEQ ID No.11)   SerTyrIleHisGlnTyrLeuLeuValAsnAsnSerThrGluLeuTrpMetHisThrArgLeuIleLysArgProHisCysAspGluTrpGlnGlyGlyAla(SEQ ID No.12)
实施例2：
高丝氨酸转琥珀酰酶突变体的活性及对L-甲硫氨酸的反馈抗性
不同高丝氨酸转琥珀酰酶的活性及L-甲硫氨酸对活性的影响通过酶试验测定，使用已产生个别蛋白质的细胞提取物。为此目的，编码改变的高丝氨酸转琥珀酰酶的相应质粒使用本领域技术人员已知的方法通过转化导入大肠杆菌菌株W3110(ATCC 27325)中。转化混合物涂布在LB-四环素琼脂板上(10克蛋白胨/升，5克酵母提取物/升，5克NaCl/升，15克琼脂/升及15毫克四环素/升)及在37℃下培养过夜。生成的转化体在SM1培养基上生长(1升培养基：CaCl2×2H2O，0.0147克，MgSO4×7H2O，0.3克，Na2MOO4×2H2O，0.15毫克，H3BO3，2.5毫克，CoCl2×6H2O，0.7毫克，CuSO4×5H2O，0.25毫克，MnCl2×4H2O，1.6毫克，ZnSO4×7H2O，0.3毫克，KH2PO4，3.0克，K2HPO4，12.0克，(NH4)2SO4，5克，NaCl，0.6克，FeSO4×7H2O，0.002克，Na3-柠檬酸×2H2O，1克，葡萄糖，5克，蛋白胨，1克，酵母提取物，0.5克)，在600nm下约0.8的吸收值时离心，在50mMTris pH7.5中清洗及再离心。细胞重悬于50mM Tris/Cl，pH7.5，2mM二硫苏糖醇，0.5mM苯甲基磺酰氯中及在法式压滤器(French press)中破裂。用进一步离心的上清液作为试验的酶提取物。酶活性在含有50mM Tris/Cl，pH7.6，1mM高丝氨酸和0.1mM琥珀酰基-COA的混合液中用光度计测定，由反应中形成的辅酶A在232nm的消光降低定量，依循由Kredich和Tomkins所述测定丝氨酸乙酰基转移酶的方法(Kredich N.M.和Tomkins G.M.，J.Biol.Chem.241，4955-4965(1966))。测定加入的L-甲硫氨酸对活性的影响，并定量可抑制性为Ki值。测定的Ki为L-甲硫氨酸的浓度，在此浓度下高丝氨酸转琥珀酰酶的活性仅为在无L-甲硫氨酸的情况下活性的50％。
所有高丝氨酸转琥珀酰酶突变体，与野生型比较下，展现对L-甲硫氨酸反馈抗性的升高。表2简要列出结果。
表2：野生型酶和高丝氨酸转琥珀酰酶突变体的活性及对L-甲硫氨酸的反馈抗性
  质粒   活性(单位/毫克)   在1mM L-甲硫氨酸存在下的活性(％)*   L-甲硫氨酸Ki(mM)
  pKP413GAP   0.155   2   0.05
  pBaBmetAdel   0.042   95   16
  pBaBmetAext   0.011   91   10
  pBaBmetAext2   0.045   90   5
*在无L-甲硫氨酸存在的情况下活性相当100％。
实施例3：
高丝氨酸转琥珀酰酶对SAM的反馈抗性
SAM对不同高丝氨酸转琥珀酰酶活性的影响以在不同浓度的SAM(Cl盐，Sigma)存在下定量活性的方式测定。细胞提取物的生长及制备依实施例2所述。活性试验如Lee L.W.等人，J.Biol.Chem.241，5479-5480(1966)中所述的方法进行，以酶提取物与50mM磷酸钾缓冲液，pH7.5，3mM丝氨酸和0.3mM琥珀酰基-CoA培养。许多次后，100微升体积的试验混合物在各种情况由加400微升乙醇，400微升水和100微升10mM 5，5’-二硫双(2-硝基苯甲酸)而终止。生成混合物在室温下孵育5分钟后，在412nm以分光光度计测定吸收。在蛋白质浓度测定后，酶活性用消光系数计算。Ki为SAM抑制活性能力的测定值。
表3：高丝氨酸转琥珀酰酶突变体的活性及对SAM的反馈抗性
  质粒   活性(单位/毫克)  在1mM SAM存在下的活性(％)*   SAM Ki(mM)
  pKP413GAP   0.62   0.5   0.2
  pBaBmetAdel   0.25   95   9
  pBaBmetAext   0.082   75   4
  pBaBmetAext2   0.173   99   16
*在无SAM存在的情况下活性相当100％。
                              序列表
<110>电化学工业有限公司(国际)
<120>具有修饰C端的反馈抗性高丝氨酸转琥珀酰酶
<130>Co10221
<140>
<141>
<160>12
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>930
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<220>
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<400>1
atg ccg att cgt gtg ccg gac gag cta ccc gcc gtc aat ttc ttg cgt    48
Met Pro Ile Arg Val Pro Asp Glu Leu Pro Ala Val Asn Phe Leu Arg
  1               5                  10                  15
gaa gaa aac gtc ttt gtg atg aca act tct cgt gcg tct ggt cag gaa    96
Glu Glu Asn Val Phe Val Met Thr Thr Ser Arg Ala Ser Gly Gln Glu
             20                  25                  30
att cgt cca ctt aag gtt ctg atc ctt aac ctg atg ccg aag aag att    144
Ile Arg Pro Leu Lys Val Leu Ile Leu Asn Leu Met Pro Lys Lys Ile
         35                  40                  45
gaa act gaa aat cag ttt ctg cgc ctg ctt tca aac tca cct ttg cag    192
Glu Thr Glu Asn Gln Phe Leu Arg Leu Leu Ser Asn Ser Pro Leu Gln
     50                  55                  60
gtc gat att cag ctg ttg cgc atc gat tcc cgt gaa tcg cgc aac acg    240
Val Asp Ile Gln Leu Leu Arg Ile Asp Ser Arg Glu Ser Arg Asn Thr
 65                  70                  75                  80
ccc gca gag cat ctg aac aac ttc tac tgt aac ttt gaa gat att cag    288
Pro Ala Glu His Leu Asn Asn Phe Tyr Cys Asn Phe Glu Asp Ile Gln
                 85                  90                  95
gat cag aac ttt gac ggt ttg att gta act ggt gcg ccg ctg ggc ctg    336
Asp Gln Asn Phe Asp Gly Leu Ile Val Thr Gly Ala Pro Leu Gly Leu
            100                 105                 110
gtg gag ttt aat gat gtc gct tac tgg ccg cag atc aaa cag gtg ctg    384
Val Glu Phe Asn Asp Val Ala Tyr Trp Pro Gln Ile Lys Gln Val Leu
        115                 120                 125
gag tgg tcg aaa gat cac gtc acc tcg acg ctg ttt gtc tgc tgg gcg    432
Glu Trp Ser Lys Asp His Val Thr Ser Thr Leu Phe Val Cys Trp Ala
    130                 135                 140
gta cag gcc gcg ctc aat atc ctc tac ggc att cct aag caa act cgc    480
Val Gln Ala Ala Leu Asn Ile Leu Tyr Gly Ile Pro Lys Gln Thr Arg
145                 150                 155                 160
acc gaa aaa ctc tct ggc gtt tac gag cat cat att ctc cat cct cat    528
Thr Glu Lys Leu Ser Gly Val Tyr Glu His His Ile Leu His Pro His
                165                 170                 175
gcg ctt ctg acg cgt ggc ttt gat gat tca ttc ctg gca ccg cat tcg    576
Ala Leu Leu Thr Arg Gly Phe Asp Asp Ser Phe Leu Ala Pro His Ser
            180                 185                 190
cgc tat gct gac ttt ccg gca gcg ttg att cgt gat tac acc gat ctg    624
Arg Tyr Ala Asp Phe Pro Ala Ala Leu Ile Arg Asp Tyr Thr Asp Leu
        195                 200                 205
gaa att ctg gca gag acg gaa gaa ggg gat gca tat ctg ttt gcc agt    672
Glu Ile Leu Ala Glu Thr Glu Glu Gly Asp Ala Tyr Leu Phe Ala Ser
    210                 215                 220
aaa gat aag cgc att gcc ttt gtg acg ggc cat ccc gaa tat gat gcg    720
Lys Asp Lys Arg Ile Ala Phe Val Thr Gly His Pro Glu Tyr Asp Ala
225                 230                 235                 240
caa acg ctg gcg cag gaa ttt ttc cgc gat gtg gaa gcc gga cta gac    768
Gln Thr Leu Ala Gln Glu Phe Phe Arg Asp Val Glu Ala Gly Leu Asp
                245                 250                 255
ccg gat gta ccg tat aac tat ttc ccg cac aat gat ccg caa aat aca    816
Pro Asp Val Pro Tyr Asn Tyr Phe Pro His Asn Asp Pro Gln Asn Thr
            260                 265                 270
ccg cga gcg agc tgg cgt agt cac ggt aat tta ctg ttt acc aac tgg    864
Pro Arg Ala Ser Trp Arg Ser His Gly Asn Leu Leu Phe Thr Asn Trp
        275                 280                 285
ctc aac tat tac gtc tac cag atc acg cca tac gat cta cgg cac atg    912
Leu Asn Tyr Tyr Val Tyr Gln Ile Thr Pro Tyr Asp Leu Arg His Met
    290                 295                 300
aat cca acg ctg gat taa                                            930
Asn Pro Thr Leu Asp
305                 310
<210>2
<211>309
<212>PRT
<213>Escherichia coli
<400>2
Met Pro Ile Arg Val Pro Asp Glu Leu Pro Ala Val Asn Phe Leu Arg
  1               5                  10                  15
Glu Glu Asn Val Phe Val Met Thr Thr Ser Arg Ala Ser Gly Gln Glu
             20                  25                  30
Ile Arg Pro Leu Lys Val Leu Ile Leu Asn Leu Met Pro Lys Lys Ile
         35                  40                  45
Glu Thr Glu Asn Gln Phe Leu Arg Leu Leu Ser Asn Ser Pro Leu Gln
     50                  55                  60
Val Asp Ile Gln Leu Leu Arg Ile Asp Ser Arg Glu Ser Arg Asn Thr
 65                  70                  75                  80
Pro Ala Glu His Leu Asn Asn Phe Tyr Cys Asn Phe Glu Asp Ile Gln
                 85                  90                  95
Asp Gln Asn Phe Asp Gly Leu Ile Val Thr Gly Ala Pro Leu Gly Leu
            100                 105                 110
Val Glu Phe Asn Asp Val Ala Tyr Trp Pro Gln Ile Lys Gln Val Leu
        115                 120                 125
Glu Trp Ser Lys Asp His Val Thr Ser Thr Leu Phe Val Cys Trp Ala
    130                 135                 140
Val Gln Ala Ala Leu Asn Ile Leu Tyr Gly Ile Pro Lys Gln Thr Arg
145                 150                 155                 160
Thr Glu Lys Leu Ser Gly Val Tyr Glu His His Ile Leu His Pro His
                165                 170                 175
Ala Leu Leu Thr Arg Gly Phe Asp Asp Ser Phe Leu Ala Pro His Ser
            180                 185                 190
Arg Tyr Ala Asp Phe Pro Ala Ala Leu Ile Arg Asp Tyr Thr Asp Leu
        195                 200                 205
Glu Ile Leu Ala Glu Thr Glu Glu Gly Asp Ala Tyr Leu Phe Ala Ser
    210                 215                 220
Lys Asp Lys Arg Ile Ala Phe Val Thr Gly His Pro Glu Tyr Asp Ala
225                 230                 235                 240
Gln Thr Leu Ala Gln Glu Phe Phe Arg Asp Val Glu Ala Gly Leu Asp
                245                 250                 255
Pro Asp Val Pro Tyr Asn Tyr Phe Pro His Asn Asp Pro Gln Asn Thr
            260                 265                 270
Pro Arg Ala Ser Trp Arg Ser His Gly Asn Leu Leu Phe Thr Asn Trp
        275                 280                 285
Leu Asn Tyr Tyr Val Tyr Gln Ile Thr Pro Tyr Asp Leu Arg His Met
    290                 295                 300
Asn Pro Thr Leu Asp
305
<210>3
<211>34
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：
     Oligonucleotide metAdel1
<400>3
ctatttgtta gtgaataata gtactgagct ctgg                              34
<210>4
<211>34
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：
     Oligonucleotide metAdel2
<400>4
ctggtggata tatgagatct ggtagacgta atag                              34
<210>5
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：
     Oligonucleotide metAext1
<400>5
tggtggatat atgagatctg gtagacgtaa tag                               33
<210>6
<211>34
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：
     Oligonucleotide metAext2
<400>6
gtatttgtta gtgaataata gtactgagct ctgg                              34
<210>7
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Partial Gene
     Sequence
<400>7
tcatatatcc accagctatt tgttagtgaa taa                               33
<210>8
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Partial
     Protein Sequence
<400>8
Ser Tyr Ile His Gln Leu Phe Val Ser Glu
  1               5                  10
<210>9
<211>102
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Partial Gene
     Sequence
<400>9
tcatatatcc accactattt gttagtgaat aatagtactg agctctggat gcatacgcgt    60
ttaattaagc ggccgcactg cgatgagtgg cagggcgggg cg                       102
<210>10
<211>34
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Partial
     Protein Sequence
<400>10
Ser Tyr Ile His His Tyr Leu Leu Val Asn Asn Ser Thr Glu Leu Trp
  1               5                  10                  15
Met His Thr Arg Leu Ile Lys Arg Pro His Cys Asp Glu Trp Gln Gly
             20                  25                  30
Gly Ala
<210>11
<211>102
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Partial Gene
     Sequence
<400>11
tcatatatcc accagtattt gttagtgaat aatagtactg agctctggat gcatacgcgt  60
ttaattaagc ggccgcactg cgatgagtgg cagggcgggg cg                     102
<210>12
<211>34
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Partial
     Protein Sequence
<400>12
Ser Tyr Ile His Gln Tyr Leu Leu Val Asn Asn Ser Thr Glu Leu Trp
  1               5                  10                  15
Met His Thr Arg Leu Ile Lys Arg Pro His Cys Asp Glu Trp Gln Gly
             20                  25                  30
Gly Ala

Claims (9)

1、一种高丝氨酸转琥珀酰酶，其与高丝氨酸转琥珀酰酶野生型酶相比，呈现出对L-甲硫氨酸或SAM的降低的敏感性，而野生型酶拥有包括成分序列TyrGlnXaaThrPro的一段氨基酸序列，该成分序列的Thr位于氨基酸序列的第285位和310位之间，且第1位为起始甲硫氨酸，其特征在于与野生型酶相比呈现至少2个氨基酸的改变，而且此改变位于该成分序列的Thr或其C-端。
2、如权利要求1的高丝氨酸转琥珀酰酶，其特征在于其呈现至少5个氨基酸、优选至少10个氨基酸的改变。
3、如权利要求1或2的高丝氨酸转琥珀酰酶，其特征在于与野生型酶相比，其呈现出对抑制剂SAM和/或L-甲硫氨酸的抗性增加至少2倍(增加的Ki)。
4、如权利要求1-3任一项的高丝氨酸转琥珀酰酶，其特征在于其含有表1所列突变之一。
5、一种metA等位基因，其编码如权利要求1-4中任一项的高丝氨酸转琥珀酰酶。
6、一种质粒，其特征在于含有与启动子一起的如权利要求5的metA等位基因。
7、一种微生物菌株，其特征在于其含有如权利要求5的具有反馈抗性的metA等位基因。
8、如权利要求7的微生物菌株，其特征在于其是革兰氏阴性菌株，优选为大肠杆菌。
9、一种通过培养如权利要求7或8的微生物菌株来制备L-甲硫氨酸或SAM的方法。
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