CN1200150A

CN1200150A - L－氨基酸的制备方法

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Publication number: CN1200150A
Application number: CN96197716A
Authority: CN
Inventors: 岸野浩子; 泉井正子; 小野由纪子; 伊藤久生; 仓桥修
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1995-08-30
Filing date: 1996-08-27
Publication date: 1998-11-25
Anticipated expiration: 2016-08-27
Also published as: DK0877090T3; JP4032441B2; DE69635493D1; EP0877090A4; EP0877090A1; PL325155A1; SK282611B6; WO1997008333A1; HUP9901198A2; EP0877090B1; CN1077139C; HUP9901198A3; DE69635493T2; JPH09121872A; SK23598A3; US6319696B1; HU224895B1; PL183472B1

Abstract

制备L－氨基酸的方法,包括在培养基中培养具有产生L－氨基酸,尤其是,L－苯丙氨酸,L－色氨酸,L－酪氨酸,L－苏氨酸或L－异亮氨酸的能力和具有增强的磷酸烯醇式丙酮酸生产力的微生物,并回收在培养基中产生和积累的氨基酸。

Description

L-氨基酸的制备方法

技术领域

本发明涉及制备L-氨基酸的制备方法。尤其是，本发明涉及的是需求急剧增长的氨基酸的制备方法，诸如那些用作增甜剂天冬苯丙二肽酯的原料(L-苯丙氨酸)、饲料添加剂(L-色氨酸，L-苏氨酸)、以及药品原料如输注液(L-色氨酸，L-苯丙氨酸，L-酪氨酸，L-苏氨酸和L-异亮氨酸)。

背景技术

已知很多利用微生物制备氨基酸的方法。

例如，L-苯丙氨酸的制备方法，包括那些利用大肠杆菌重组体的，公开于特公平2-4276号，特表平4-501813号，特公开5-244956号，和国际公开WO87/00202的方法。

另外L-苯丙氨酸或L-酪氨酸的制备方法，包括那些利用棒状杆菌属的突变株的，公开在特开昭61-128897号，和利用棒状杆菌的重组体，公布在特开昭60-34197号、61-260892号、和61-124375号上的方法。

L-色氨酸的制备方法已有报导，包括那些利用了大肠杆菌重组体的，公开在特开昭57-71397号和美国专利4371614号，那些利用了枯草芽孢杆菌突变株的，公开于特公昭53-39517号和62-34399号，那些利用了枯草芽孢杆菌重组体的，公布于特开昭61-104790号、特公开1-67179号，那些利用短杆菌属突变株的，公开于特开昭57-174096号，和那些利用短杆菌属重组体的，公开于特开昭62-51980号。

已报道的L-苏氨酸的制备方法，包括那些利用大肠杆菌属的突变株的，公开于特公开5-304969号，那些利用大肠杆菌重组体的，公开于特公平1-29559号，特公开2-109985号和特开昭56-15696号，以及特表平3-501682号。另外，报导了那些利用棒状杆菌属的突变株的公开于特开昭62-23996号，和那些利用棒状杆菌属的重组体的，公开于特开昭61-195695号。

L-异亮氨酸的制备方法已有报导，包括利用大肠杆菌的，公开于特公开5-130882号，那些利用大肠杆菌重组体的，公开于特公平第2-458号。另外，还报导了利用棒状杆菌属突变株的，公开于特公开第3-62395号，和那些利用棒状杆菌属重组体的，公开在特公平5-47196号。

上述用在氨基酸制备方法中的微生物的培养主要基于在各种氨基酸的共同路径和个别氨基酸的固有路径催化反应中的酶促作用，或者基于最终产物等调控作用的回避(反馈抑制和抑制)。特别是，那些用于培育的，包括例如，赋予微生物营养需求性，赋于微生物药物抗性，关于生物合成系统酶基因的扩增以及基于重组DNA技术以调控脱敏为目的突变的导入。

在芳环氨基酸生物合成共同路径中负责第一步反应的酶是3-脱氧-D-阿拉伯糖基-庚糖醛酸-7-磷酸酯(DAHP)合成酶(DS)。大肠杆菌的DS包括三种类型的同工酶，这三种同工酶分别由名为aroF、aroG和aroH的基因编码，并且分别受L-酪氨酸、L-苯丙氨酸和L-色氨酸反馈抑制。关于这些基因，已知一种芳环氨基酸增产的技术，它以将一个基因组合和一个色氨酸操纵子导入大肠杆菌为基础，这个基因组合编码起源于含有高酶活性的aroF和aroG的脱敏感型酶(酶基本上不受反馈抑制)，这个色氨酸操纵子含有一个编码在L-色氨酸生物合成固有系统的脱敏感型邻氨基苯甲酸合成酶(AS)的基因。

磷酸烯醇丙酮酸(以后出现用“PEP”表示)和D-赤藓糖4-磷酸(E4P)在DAHP合成反应中作底物。PEP也在L-天冬氨酸，L-苏氨酸，L-异亮氨酸等的生物合成中作为前体。上述底物从一个碳源供给诸如葡萄糖通过糖酵解途径和戊糖磷酸途径。然而，至今也不知道能够供给上述底物从而提高氨基酸产量的氨基酸生产株的培育。

磷酸烯醇丙酮酸合成酶(以后出现用“PPS”表示)广泛存在于微生物中。在糖元异生作用中从丙酮酸供给PEP。这种酶起了重要作用。大肠杆菌是大肠杆菌属的细菌，用来进行克隆编码pps的基因(pps)，基因核苷酸序列的测定和酶的功能分析。另外，据报道接近理论产率的值制备DAHP，DAHP的生产是通过在脱氢奎尼酸合成酶缺陷株中pps基因和转酮醇酶基因的同步扩增方式实现的(Patnaik，R.等，《应用环境微生物学)》60卷，11期，3903-3908(1994))。然而，尚未知道pps基因扩增增加芳环氨基酸和其它氨基酸的产量。

发明内容

本发明的主题是提供一种以芳环氨基酸为代表的廉价而高产地制备各式各样氨基酸的方法。

本发明人发现增加具有L-氨基酸生产能力的微生物细胞产生磷酸烯醇丙酮酸的能力，就能提高L-氨基酸的产量，从而，完成了本发明。

即，本发明涉及生产氨基酸的方法，包括：在培养基中培养有产生L-氨基酸能力的微生物、在培养基中生产和积累L-氨基酸，以及收集L-氨基酸的步骤，其中：

提高了微生物产生磷酸烯醇丙酮酸的能力。

优选地由上述生产方法制备的氨基酸包括L-色氨酸，L-苯丙氨酸，L-酪氨酸，L-苏氨酸和L-异亮氨酸。

具有产生L-氨基酸能力的微生物以大肠杆菌属的细菌和棒形细菌为例。棒形细菌这儿指的是包括从前分类到短杆菌属而目前统一到棒状杆菌属中的细菌。(《国际系统细菌学杂志》，41期，225页(1991))。而且，棒形细菌在这儿指属于短杆菌属而与棒状杆菌属非常靠近的细菌。

增强微生物产生磷酸烯醇丙酮酸能力的方法，例如，增强微生物细胞中PPS的活性。增强微生物细胞中PPS的活性的方法，例如，一个方法就是增加微生物细胞中pps基因的表达量，也可以是将编码具有高特异活性的pps的基因导入到细胞中。

尤其是，增加在微生物细胞中pps基因的表达量的方法包括，例如，增加微生物细胞中pps基因拷贝数目的方法，也可是增加pps基因启动子的转录活性的方法。

以下，将详细说明本发明。

本发明优选地使用的微生物没有特别地限制，它包括，例如，属于大肠杆菌属，短杆菌属，棒状杆菌属、芽孢杆菌属、沙雷氏菌属和假单孢菌属的微生物，前提是微生物获得含有一个质粒的复制起点的DNA片段，pps基因在微生物中起作用，pps基因的拷贝数能在微生物中增加，并且微生物有产生L-氨基酸的能力(例如，对L-苯丙氨酸来说，通过赋予它们对，例如，L-苯丙氨酸类似物的抗性而获得L-苯丙氨酯的生产能力)。它们当中，那些优选地使用的细菌是属于大肠杆菌属的和棒形细菌的细菌。

特别是，那些优选地用于L-色氨酸的细菌包括，例如，大肠杆菌AGX17(pGX44)[NRRLB-12263]和AGX6(pGX50)aroP[NRRLB-12264](见美国专利4371614号)，和黄色短杆菌AJ11667(见特开昭第57-174096号)。

优选地用于L-苯丙氨酸的细菌包括，例如，大肠杆菌AJ12604(FERM BP-3579)(见欧洲专利公开第488424号)，和乳发酵短杆菌AJ12637(FERMBP-4160)(见法国专利公开第2686898号)。

优选地用于L-酪氨酸的细菌包括，例如，谷氨酸棒杆菌AJ11655(FERMP-5836)(见特公平第2-651 7号)和乳发酵短杆菌AJ-12081(FERM P-7249)(见特开昭第60-70093)。

优选地用于L-苏氨酸的细菌包括，例如，大肠杆菌VKPM B-3996(RIA 1867)(见美国专利公开第5175107号)和嗜乙酰棒杆菌AJ12318(FERM BP-1172)(见美国专利公开第5188949号)。

优选地用于L-异亮氨酸的细菌包括，例如，大肠杆菌KX141(VKPM B-4781)(见欧洲专利公开第519113号)，和黄色短杆菌AJ12149(FERM BP-759)(见美国专利第4656135号)。

上述增强微生物产生PEP能力的方法包括在微生物细胞中增强PPS的活性。

增强PPS活性的方法包括pps基因在微生物细胞中表达量的增加。一种增强PPS活性的方法是修饰pps基因以产生高活性的pps。

增加pps基因在微生物细胞中表达量的方法包括在微生物中pps基因拷贝数的增加，为了增加pps基因拷贝数，必须获得含有相同基因的DNA片段。pps基因在大肠杆菌属细菌大肠杆菌中克隆，它的核苷酸序列已测定(《分子和普通遗传学》231，332(1992))。根据上述文献公开的方法，含有相同基因DNA片段的制品就可获得。期望的DNA片段可通利用合成DNA探针基础上的DNA杂交方法获得，合成DNA探针根据上述核苷酸序列制备，或基于利用合成DNA引物的PCR(聚合酶链式反应)方法获得，合成DNA引物根据相同的核苷酸序列制备。pps基因拷贝数可通过连接在靶微生物中含有pps基因的DNA片段和导入获得的重组DNA片段到相同的微生中获得，含有pps基因的DNA片段在可自主复制的载体DNA上。

用PCR方法克隆来自大肠杆菌属细菌的pps基因的DNA引物可依据一定基础被适当制备，例如，大肠杆菌已知序列(《分子和普通遗传学》231，332(1992))。尤其是，两个引物(序列号1)。

5′-CCCGTCGACGGATCCAGTTTCATCTCTTG-3′(SEQ ID NO：1)，和

5′-CCCGTCGACGATCATGCGCTTATGTCGTG-3′(SEQ ID N0：2)，

是较合适的，这两个引物使扩增含有pps基因的约3.3kb区域成为可能。这些引物使扩增两末端均有SalI切割末端的pps基因成为可能。当限制性内切酶酶切末端导入到PCR产物的末端时，扩增的DNA片段就可被相应的限制性内切酶方便地克隆，并且该DNA片段可方便地转移到其他的载体DNA上。DNA的引物是能合成的，例如，利用亚磷酰胺方法，用Applied Biosystems生产的DNA合成仪380B型(见《四面体通讯》，22，1859(1981))。运用PCR反应，例如，利用由宝酒造株式会社生产的DNA热循环仪PJ2000型和根据供应商指定的方法利用Taq DNA聚合酶生产。

含有pps基因的DNA片段也可从大肠杆菌属之外的微生物中获得。获得DNA片段的方法包括基于合成DNA探针的利用，合成DNA探针根据上述文献公开的核苷酸序列制备(《分子和普通遗传学》231，332，(1992))，或基于利用合成DNA引物的PCR方法，合成DNA引物可根据相同的核苷酸序列制备。用于杂交方法的DNA探针也能通过基于已知序列与用于PCR方法的DNA引物相同的方法适当制备。据认为基因核苷酸序列的不同依赖于各自的微生物。因此，有希望制备合成DNA，其与每种微生物pps保守部分配对。

当按PCR方法扩增的pps基因导入到大肠杆菌属的细菌中之后，接着在大肠杆菌属的细菌中它与能自主复制的载体DNA连接，因此获得的重组DNA就被导入到了大肠杆菌属细菌的细胞中。

当获得的含有pps基因的DNA片段被导入到大肠杆菌属之外的微生物中时，在微生物细胞中，DNA片段与能自主复制的载体DNA连接而将DNA片段导入到其中，因此获得的重组DNA被导入到细胞中。

在本发明中优选地使用质粒载体DNA。当被导入基因的微生物是大肠杆菌时，那些适宜使用的载体DNA包括，例如，pTWV228、pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399，和RSF1010。另外，包括噬菌体DNA的载体也可利用。为了获得pps的有效表达，也优选地使用在微生物中起作用的启动子，如lac，trp和P_L。为了增加pps基因的拷贝数，也优选地按基于利用转座子(Berg，D.E.和Berg.C.M.，生物技术，1，417(1983))，Mu噬菌体(特公开第2-109985号)，或同源重组(分子遗传学实验，冷泉港实验室(1972))的方法将含有pps基因的DNA掺入到染色体中。

至于本发明使用的载体DNA，当基因导入的微生物是棒形细菌，那些适宜使用的载体DNA包括，例如，在棒形细菌中能自主复制的质粒载体，如pAM330(见特公平第1-11280号)和pHM1519(见特开昭第58-77895号)。

大肠杆菌可由重组载体转化，重组载体通过将本发明的DNA序列插入到上述的载体中而获得。通过运用例如常用于大肠杆菌转化的方法来实现，诸如用氯化钙处理细胞增加DNA通透性的方法(Mandel，M.和Higa A.，分子生物学杂志，53，159(1997))。

转化芽孢杆菌属的细菌的方法包括在细胞能掺入DNA的特殊生长期进行掺入的方法(Duncan，C.H.等报道了枯草芽孢杆菌)。另外，DNA通过形成作为DNA受体的原生质体或原生质球就能掺入到细菌细胞中，这样的DNA受体易于掺入质粒DNA。这些方法在枯草芽孢杆菌、放线菌和酵母中已知(Chang，S.等，《分子和普通遗传学》168，111(1979)；Bibb等，《自然》，274，398(1978)；Hinnen，A.等，《美国国立科学院院刊》，75，1929(1978))。

电穿孔的方法也在广泛范围的微生物细胞有效，这种方法通过借助高压电脉冲瞬间形成穿过细胞壁的孔，因此DNA能掺入(Hanahan，D.等，大肠杆菌和其他细菌的质粒转化，《酶学方法》204，63(1991))。另外，对棒形细菌基于电穿孔方法的转化方法在特公平第2-207791号公开。

为了从有导入pps基因可能性的候选载体中，选择实际导入pps基因的载体，例如，可以用PPS缺陷株做补充性测试。PPS缺陷株不能在只有丙酮酸做唯一碳源的基本培养基中生长。因此，能在这种培养基中生长的转化子就被选出。大肠杆菌的PPS缺陷株包括AT2572-1菌株(见细菌学杂志，96，2185(1968))，AT2572-1菌株可从大肠杆菌遗传储藏中心获得(株号：CGSC5242，邮政信箱6666，美国，康涅狄格，纽黑文06511-7444，耶鲁大学生物系奥斯博恩怀念实验室)。

为了从有可能增加PPS活性的候选菌株选择实际能增强PPS活性的菌株，例如，可找到一种方法，它已用公知的方法证实能增加PPS酶活性(Cooper，R.A.和H.L.Kornberg，《酶学方法》，13，309(1969))。

本发明优选地使用的微生物包括那些初始有产生L-氨基酸能力，通过增强产生PEP能力获得的微生物，和那些通过增强产生PEP能力之后而另外增加了产生L-氨基酸能力而获得的微生物。另外，就初始有L-氨基酸产生能力微生物来说，L-氨基酸生产能力在某些情况下仍能进一步提高，通过增加在相应氨基酸生物合成固有路径负责的酶基因来实现，或通过导入编码脱敏感型(抑制脱敏感型)酶的操纵子或基因来实现，否则的话该酶应受反馈抑制。

举例说明上述的基因或操纵子：

那些用于L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的，包括，例如，脱敏感型“分枝酸变位酶-预苯酸脱水酶(CM-PDT)基因(见特公开5-23694号、特开昭62-130693号)和脱敏感型DS(3-脱氧-D-阿拉伯糖基-庚糖醛酸-7-磷酸合成酶)基因(见特公开第5-236947号和特开昭第61-124375号)。”

那些用于L-色氨酸的，包括，例如，含有编码脱敏感型邻氨基苯甲酸合成酶基因的色氨酸操纵子(见特开昭第57-71397号和第62-244381号，以及美国专利第4371614号)。

那些用于L-苏氨酸的，包括，例如，苏氨酸操纵子，它含有编码对L-苏氨酸反馈抑制已脱敏的天冬氨酸激酶的基因(特公平1-29559号)，还含有编码高丝氨酸脱氢酶的基因(特开昭60-012995号)以及编码高丝氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶的基因(特开昭61-195695号)。

那些用于L-异亮氨酸的，包括，例如，上述的苏氨酸操纵子和编码对L-苏氨酸反馈抑制脱敏感的苏氨酸脱氨酶的基因(特公平第2-458号)。

至于芳环氨基酸(L-苯丙氨酸，L-色氨酸和L-酪氨酸)，期望产量还能，除pps之外，通过增强转酮醇酶(TK)的生产能力来进一步提高。这种增强微生物TK生产能力的方法包括微生物细胞中TK活性的增强。增强的TK活性方法包括微生物细胞内转酮醇酶基因(tkt)表达量的增加。方法之一是增强TK的活性包括对tkt基因修饰以生产有高活性的TK。

增加在微生物细胞中tkt基因表达量的方法包括增加微生物细胞中tkt基因的拷贝数。为了增加tkt基因的拷贝数，必须获得含有相同基因的DNA片段。tkt基因在大肠杆菌属的大肠杆菌中已被克隆，它的核苷酸序列已被测定(生物化学生物物理学报，1216，307(1993))。因此，含有相同基因的DNA片段制品按上述文献公开的方法得到。期望的DNA片段能够获得是利用基于使用合成DNA探针的杂交方法，合成DNA探针根据上述核苷酸序列制备，或利用基于使用合成DNA引物的PCR(聚合酶链反应)的方法，合成DNA引物根据相同核苷酸序列制备。转酮醇酶基因拷贝数可通过连接在靶微生物中含有tkt基因的DNA片段和导入获得的重组DNA片段到相同的微生物中而实现，含有tkt基因的DNA片段在可自主复制的载体DNA上。

用PCR方法克隆来自大肠杆菌属细菌的转酮醇酶基因的DNA引物可依据一定基础适当制备，例如，大肠杆菌已知序列(生物化学生物物理学报；1216，307(1993))。尤其是，两个引物

5′-AGAGGATCCAGAGATTTCTGAAGC-3′(SEQ ID NO：3)，和

5′-TCTGGATCCGCAAACGGACATTATCA-3′(SEQ ID NO：4)是较合适的，这两引物使扩增含有tkt基因的约2.2kb区域成为可能。这些引物使扩增两个末端均有BamHI切割末端的tkt基因成为可能。当限制性内切酶酶切末端导入到PCR产物的末端时，扩增的DNA片段就用相应的限制性内切酶方便地克隆，并且该DNA片段可方便地转移到其他的载体DNA上。DNA的引物是能合成的，例如，根据亚磷酰胺方法，用Applied Biosystems生产的DNA合成仪380B型合成(见《四面体通讯》22，1859(1981))。运用PCR反应，例如，根据供应商指出的方法，用宝酒造株式会社生产的DNA热循环仪PJ2000型和用Taq DNA聚合酶合成。

含有tkt基因的DNA片段也可从大肠杆菌属细菌之外的微生物获得。获得DNA片段的方法包括基于利用合成DNA探针的杂交方法，合成DNA探针根据上述文献公开的核苷酸序列制备(生物化学生物物理学报，1216，367(1993))，或基于利用合成DNA引物的PCR方法，合成DNA引物根据相同核苷酸序列制备。用于杂交方法的DNA探针也能基于已知序列通过与用于PCR方法的DNA引物相同的方法适当制备。人们认为基因核苷酸序列的不同依赖于各自的微生物。因此，有希望制备合成的DNA，其与每种微生物TK保守部分配对。

当上述不同的基因导入到微生物中，每种基因可存在于宿主的染色体上，或它可存在于同一质粒上，其方式与在pps基因中相同，即，不同的基因可存在于不同的质粒中。

生产目的氨基酸可通过，培养由带有pps的重组DNA转化的微生物，重组DNA根据上述方法获得，在培养液中产生和积累目的氨基酸，以及收集目的氨基酸。

培养用的培养基通常是含有碳源，氮源，无机离子和任选的其它有机成份的普通培养基。

可做碳源使用的包括，例如，糖诸如葡萄糖，乳糖，半乳糖，果糖，蔗糖和淀粉水解物；醇类诸如甘油和山梨醇；有机酸如延胡索酸、柠檬酸和琥珀酸。

可做氮源使用的包括，例如，无机铵盐如硫酸铵、氨化铵和磷酸铵；有机氮如大豆水解物，氨气和氨水。

期望做有机微量营养源使用的，要求物质含有合适的量，如维生素B1和维生素B6，如有必要，还可以是酵母提取物等。

另外，如有必要，加入少量的磷酸钾，硫酸镁，铁离子和锰离子。

培养微生物要在合适的条件下进行。特别是，优选培养在有氧条件下进行16-72小时，培养温度控制在30℃-45℃，pH控制在5-7。有可能用于pH调节的目的，例如，无机或有机酸性或碱性物质，也可是氨气。

从发酵液中收集L-氨基酸可采用已知的如普通离子交换树脂法、沉淀法和其他方法的组合方法。

附图简述图1 构建质粒pHSGSK的方法图2 构建质粒pdGM1的方法图3 构建质粒pMWGMA2的方法图4 构建质粒pMWD5的方法

实现发明的最佳方法

本发明将在下面根据实例进一步详细说明。

实施例1：制备大肠杆菌pps基因

按齐藤和三浦的方法，从来源于大肠杆菌K-12的W3110株提取染色体DNA(生物化学生理物理学报，72，619(1963))。另一方面，基于已知pps基因的核苷酸序列，按PCR方法，合成用于扩增染色体DNA的pps基因的寡聚核苷酸引物。(《分子和普通遗传学》231，332(1992))。(1)5′-CCCGTCGACGGATCCAGTTTCATCTCTTG-3′(SEQ ID NO：1)(2)5′-CCCGTCGACGATCATGCGCTTATGTCGTG-3′(SEQ ID NO：2)

上面提及的引物含有分别与位于pps基因的上游和下游位置的序列同源或互补的序列，它们含有SalI识别序列使PCR产品较易克隆。

按Erlich的方法，用上述的染色体DNA和引物进行PCR反应(PCR技术，Stockton出版社(1989))。一个循环反应条件包括93℃热变性1分钟，55℃退火1.5分钟，72℃聚合酶反应3分钟，循环反应重复30次。

用PCR方法得到3.3kbp的DNA片段用限制性内切酶SalI消化，然后用DNA连接酶连接到质粒载体pTWV228(氨苄青霉素抗性(Ap^r)，由宝酒选株式会社生产)的SalI位点上。大肠杆菌PPS缺陷株(见细菌学杂志96，2185(1968)，从大肠杆菌遗传储藏中心得到(地址见前面))用连接反应混合物转化。转化体涂敷到有氨苄青霉素的平板上选择生长，能在用丙酮酸做碳源的基本培养基上生长的抗氨苄青霉素菌株就被选出。从该菌株提取质粒DNA，得到的质粒命名为pTWV-pps。

对上述插有DNA片段的pTWV-pps限制性内切酶酶切图谱分析，和对转化体的PPS活性测量，对照分析和测量的结果，证实DNA片段含有pps基因。

实施例2制备L-苯丙氨酸<1>产L-苯丙氨酸细菌的创制

含有L-苯丙氨酸生物合成固有系统的脱敏感型分枝酸变位酶-预苯酸脱水酶(CM-PDT)基因的DNA片段插入到质粒载体pACYC184(Cm^r)，的BamHI，HindIII切割位点从而获得质粒pACMAB(抗氯霉素(Cm^r)，见特公开第5-236974号)。质粒pACMAB用SalI消化。用DNA连接酶将获得的DNA片段与用SalI从pTWV-pps切割下来的pps基因片段连接，得到pACMAB-pps(8.9)kb。

另一方面，含有脱敏感型DS(3-脱氧-D-阿拉伯糖基-庚糖醛酸-7-磷酸合成酶)基因(aroG4)的DNA片段被插入到质粒载体pBR322的EcoRI，HindIII切割位点从而获得质粒pBR-aroG4(Ap^r，见特公平第5-236947)，质粒pBR-aroG4转化大肠杆菌W3110(tyrA)菌株。pACMAB-pps导入到获得的重组体菌株以选出呈抗氨苄青霉素和抗氯霉素的重组体，从而获得W3110(tyrA)/pACMAB-pps，pBR-aroG4。

由pBR-aroG4和pACMAB转化的大肠杆菌tyrA缺陷株W3110(tyrA)(命名为AJ12604)于1991年1月28日由通商产业省工业技术院国立生命科学和人体技术研究所(邮编305，日本茨城县筑波市东1丁目1番3号)保藏，登记号为FERMP-11975，1991年9月26日，基于布达佩斯条约转移到国际保藏，登记号为FERM BP-3579。根据通常的方法，可从该菌株获得pBR-aroG4和pACMAB。<2>L-苯丙氨酸产力评估

按上述方法得到的大肠杆菌W3110(tyrA)/pACMAB-pps，pBR-aorG4在用来产生L-苯丙氨酸的培基中37℃培养40小时(培养基含葡萄糖20g，磷酸氢二钠29.4g、磷酸二氢钾6g，氯化钠1g、氯化铵2g，柠檬酸钠1g，谷氨酸钠0.4g，七水硫酸镁3g、氯化钙0.23g，维生素B12mg、L-酪氨酸100mg，混于1升水中，pH为7.0)。W3110(tyrA)/pACMAB，pBR-aroG4株也按上述方法培养。用高效液相色谱定量测定培养基中L-苯丙氨酸的含量。结果见表1。

表1

菌株 L-苯丙氨酸产量(g/L)W3110(tyrA)/pACMAB，pBR-aroG4 3.8W3110(tyrA)/pACMAB-pps，pBR-aroG4 4.1

实施例3：制备L-色氨酸

<1>产色氨酸细菌的创制

含有脱敏感型基因(aroG4)和抗卡那霉素基因的DNA片段插入通过把质粒pACYC177XhoI位点改变的EcoRI位点而得到的质粒pACYC177E中，从而获得质粒pACKG4(抗氨苄青霉素和拉卡那霉素(Ap^r，Km^r)6.4kb，见特公开第5-236947号)，将其用HindIII部分消化和用DNA聚合酶Klenow片段平滑末端化。同时，实施例1中获得的含有pps基因的长3.3kbp的SalI片段用上述方法平滑末端化。大肠杆菌PPS缺陷株用连接反应溶液转化以便选择呈现Ap^r、Km^r和pps⁺的转化体。这种质粒就从转化体中提取，命名为pACKG4-pps(9.4kb)。

从细菌株，即，有L-苯丙氨酸和L-酪氨酸缺陷型大肠杆菌AGX17(pGX44)株(宿主AGX17株本身是L-苯丙氨酸，L-酪氨酸和L-色氨酸缺陷型)缺失质粒pAX44从而获得AGX17。另一方面，pGX50从含有运载色氨酸操纵子的质粒的大肠杆菌K-12的AGX6(pGX50)(aroP)株中提取pGX50(由美国专利第4371614号描述，从1981年1月31日保藏在农业研究机构保藏中心(NRRL)登记号，NRRL-B-12264(美国伊利诺斯61604 Peoria北方大学街1815号))，并将它导入AGX17株，用Ap^r和Trp⁺作标记选出转化子。pACKG4-pps进一步导入到转化体中，用Ap^r和Km^r为标记选出转化子，转化子命名为AGX17/pGX50，pACKG4-pps。

另一方面，用Ap^r、Trp⁺和Km^r为指标，将pGX50和pACKG4导入AGX17，从而获得AGX17/pGX50，pACKG4。

<2>L-色氨酸产力评估

用制备L-色氨酸的培养基在31℃培养AGX17/pGX50，pACKG4-pps48小时(培养基含葡萄糖40g、硫酸铵16g、磷酸二氢钾1g，七水硫酸镁1g，七水硫酸亚铁0.01g，四水氯化锰0.01g，酵母提取物2g，碳酸钙40g，L-苯丙氨酸100mg和L-酪氨酸100mg，混于1升水中，pH7.0)。AGX17/pGX 50，pACKG4用上述同样方法培养，用高效液相色谱仪定量测定培养基中L-色氨酸含量。结果见表2

表2

细菌株 L-色氨酸产量(g/L)AGX17/pGX50，pACKG4 2.1AGX17/pGX50，pACKG4-pps 2.5

实施例4：制备L-苏氨酸

<1>产L-苏氨酸细菌的创制

实施例1中得到pTWV-pps导入到产生L-苏氨酸的菌株，大肠杆菌VKPMB-3996株(美国专利第5175107描述，从1987年11月19日由全苏抗生素科学中心(VNIIA)保藏在登记号RIA1867下(俄罗斯，莫斯科113105，Nagatinskaya大街3-a))。根据Sm^r和Ap^r选出转化体获得B3996/pTWV-pps。VKPMB-3996含有质粒pVIC40(抗链霉素(Sm^r))，质粒含有苏氨酸操纵子，操纵子有一个编码天冬氨酸激酶的基因，其中L-苏氨酸的反馈抑制被脱敏。

<2>L-苏氨酸产力评估

B-3996菌株和B-3996/pTWV-pps，在生产L-苏氨酸的培养基37℃培养24小时(培养基含葡萄糖40g，磷酸铵16g、磷酸二氢钾1g，七水硫酸亚铁0.01g，七水硫酸镁1g，四水氯化锰0.01g，酵母提取物2g，碳酸钙40g混合于1升水，pH7.0)。培养基中L-苏氨酸的含量用高效液相色谱定量测定，结果见表3。

表3

菌株 L-苏氨酸产量(g/L)

B-3996 14.5

B-3996/pTWV-pps 15.5

实施例5制备L-异亮氨酸

<1>产L-异亮氨酸菌的创制

(1)含有苏氨酸操纵子和pps基因的质粒构建

质粒pVIC40含有苏氨酸操纵子，操纵子有一个编码对L-苏氨酸反馈抑制脱敏感的天冬氨酸激酶的基因(美国专利第5175107号描述)，该质粒pVIC40用BamHI消化，所获得片段用Klenow片段平滑末端化。同时，实施例1中获得的含有pps基因的长3.3kbp SalI片段用上述同样方法平滑末端化，且与上述pVIC40连接。连接反应液用来转化大肠杆菌PPS缺陷株以选择有Sm^r和pps⁺的重组体。从重组体中选出的重组质粒，命名为pVIC40-pps(17.9kb)。(2)含有ilv GMEDA操纵子质粒的构建

染色体DNA由大肠杆菌MI162株提取，用限制性内切酶HindIII消化。已证明含有ilvGM基因的HindIII-HindIII DNA片段长约4.9kb。因此，长度接近4.9kb的HindIII-HindIII DNA片段与由用于HindIII消化质粒载体pBR322(购于宝酒造株式会社)得到的DNA片段连接。

获得的DNA连接反应混合物导入到羟乙酸合成酶缺陷株大肠杆菌MI262(CGSC5769)。增加了羟乙酸合成酶缺陷特征的转化株就可选出。菌株中质粒是隔离的。质粒结构分析结果，含有ilvGM基因和ilvE基因5′末端一部分的长4.8kb DNA片端已插入pBR322的HindIII位点，所得质粒命名为pBRGM7。

根据《基因》97，21(1991)、《美国国立科学院院刊》78，922(1981)和《细菌学杂志》149，294(1982)报导的ilvGM基因核苷酸序列合成在序列表中SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的合成寡核苷酸序列。含有启动子，衰减子和ilvGM基因核苷酸序列的ilvGM基因编码区的序列与编码区的氨基酸序列在SEQ ID NO：5中描述。这两个寡核苷酸序列做引物，用MI162菌株染色体DNA做模板，用PCR方法扩增DNA。还用来扩增的DNA片段有一个序列是序列表中SEQ ID NO：5中25位至952位核苷酸。这个片段命名为“片段(A)”。

序列表中SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9描述的合成寡核苷酸序列，根据《基因》97，21(1991)，《美国国家科学院院刊》78，922(1981)和《细菌学杂志》149，294(1982)报道核苷酸序列，用上述同样方法合成。用这两个寡核苷酸作引物，MZ162株染色体DNA做模板，用PCR方法扩增DNA。被扩增的DNA片段含有序列表中SEQ ID NO：5描述的从1561位到2421位的核苷酸的序列。这个片段命名为“片段(B)”。

用SmaI消化片段(A)得到大片段连接到用SmaI消化过的载体pUC18(宝酒造株式会社)得到的DNA片段上来制备质粒pUCA。用KpnI消化片段B得到的大片段连接到用HincI和KpnI消化pHSG399(宝酒造株式会社)得到的大片段上来制备质粒pHSGB。

质粒pUCA用KpnI消化，消化末端用DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)平滑末端化，然后用PstI消化，最终分离含片段(A)的DNA片段。质粒pHSGB用HindIII消化，消化末端用DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)平头末端化，接着用pstI消化，最终分离含有片段(B)的DNA片段。这两个片段相互连接从而制备到了pHSGSK质粒。

SmaI-KpnI片段由pHSGSK运载且来源于片段(A)和(B)，命名为“片段(C)”。片段“C”相当于一个由用SmaI和KpnI消化含有ilvGM基因的长4.8kb的HindIII-HindIII片段的片段，含有启动子，SD序列和ilvG基因上游区，但缺少由先导序列到衰减子区长约0.2kb的序列，上述构建pHSGSK的方法小结在图1中。

用SmaI和KpnI消化质粒pHSGSK得到片段(C)。用SmaI和KpnI消化质粒pBRGM7得到大的DNA片段。这两个片端连接在一起。获得的质粒命名为pUGM1。长4.6kb HindIII-HindIII片段含有ilvGM基因，它由pdGM1运载，并缺少必须的衰减作用区。在本实施例和附图中，缺少必须的衰减作用的ilvGM基因表示为“ΔattGM”。上述构建pdGM1的方法小结在图2中。

特公开2-458号描述的质粒pDRIA4在大肠杆菌属的细菌中自主复制。质粒pDRIA4通过在短杆菌属的细菌能自主复制穿梭载体pDR1120与BamHI-BamHI片段连接而制备。BamHI-BamHI片段含有编码起源于大肠杆菌K-12苏氨酸脱氨酶的基因ilvA和ilvD基因3′末端侧的一部分。在特公开2-458号中描述BamHI-BamHI片段长2.3kb。然而，目前，BamHI-BamHI片段长2.75kb。质粒pDRIA4存在于黄色短杆菌AJ12358(FERMP-9764)或黄色短杆菌AJ12359(FERMP-9765)的染色体DNA之外。可按常规方法从这些菌株中制备质粒pDRIA4。

含编码苏氨酸脱氨酶的ilvA基因的HindIII-BamHI片段制备自质粒pDRIA4的2.75kb的BamHI-BamHI片段，其中苏氨酸脱氨酶基本上对L-异亮氨酸的抑制脱敏感。HindIII-BamHI连接到用HindIII和BamHI消化载体pMW119(由日本基因生产)得到的DNA片段上，从而制备的质粒命名为pMWA1。

将用HindIII消化质粒pMWA1获得的DNA片段与用HindIII消化质粒pdGM1获得含有ilvGM基因的DNA片段连接。在质粒中的ilvGM基因的转录路径与ilvA基因转录路径相同，这样的质粒通过分析存在于质粒中限制性内切酶识别位点的位置而选出。得到的质粒命名为pMWGMA2。pMWGMA2含有没有衰减子的ilvGM基因，ilvE基因5′-末端侧的一部分和ilvD基因3′-末端侧的一部分。上述pMWGMA2构建的过程在图3中小结。

用SalI和PstI消化制得的大肠杆菌MI162株的染色体DNA来制备DNA的混合物。同时，用SalI和PstI消化载体pUC19(宝酒造株式会社)制备DNA片段。DNA片段混合物与消化pUC19得的DNA片段连接从而获得DNA混合物。该DNA混合物导入到转氨酶B缺陷AB2070株中(细菌学杂志，109，703(1972)，来自大肠杆菌遗传贮藏中心，CGSC2070)以选出恢复分枝氨基酸缺陷型的转化的菌株。当从这菌株制备质粒时，将用SalI和PstI消化质粒pUC19获得的DNA片段与含有ilvE基因SalI-PstI DNA片段连接。这个质粒命名pUCE1。pUCE1包括ilvM基因3′-末端侧的一部分，ilvE基因和ilvD基因5′-末端侧的一部分。

pMWGMA2由HindIII部分消化以制备DNA片段混合物，同时，用HindIII消化pUCE1来制备含有ilvE基因的一部分和ilvD基因5′-末端侧的一部分长1.7kb的HindIII-HindIII DNA片段。两者彼此连接获得的DNA混合物用于转化二羟酸脱水酶(ilvD基因产物)-缺陷株，即，AB1280株。从转化的菌株中选出分支氨基酸缺陷消失的转化株。当从所获得的转化株制备质粒时，将由只在ΔattGM和ilvA之间的HindIII位点消化pMWGMA2而得到的DNA片段与1.7kb的HindIII-HindIII DNA片段连接，该1.7kb片段采自pUCE1并含有ilvE基因的一部分和ilvD基因的一部分，其中ilvGMEDA操纵子被再生的质粒命名为pMWD5。上述pMWD5的构建过程小结在图4中。

上述质粒pMWD5(Ap^r)是基于载体pMW119的利用，其中载体pMW119带有其中对衰减作用必须的区域已被去除的ilvGMEDA操纵子。(3)产L-异亮氨酸菌的创制

pVIC40-pps被导入大肠杆菌VNIIGenetika TDH-6(TDH-6对应的宿主细菌是通过上述大肠杆菌VKPMB-3996株缺失质粒PVIC40得到的)以用Sm^r作指示选出转化体。另外，pMWD5被导入以获得显示Sm^r和Ap^r的转化体TDH-6/pVIC40-pps，pMWD5。pVIC40和pMWD5导入上述的TDH-6，用Sm^r和Ap^r作指示得到TDH-6/pVIC40，pMWD5。<2>L-异亮氨酸产力评估

TDH-6/pVIC40-pps，用生产L-异亮氨酸的培养基37℃培养24小时(培养基含有：葡萄糖40g，硫酸胺16g，硫酸二氢钾1g，七水硫酸镁1g，七水硫酸亚铁0.01g，四水氯化锰0.01g，酵母提取物2g，和碳酸钙40g混于1升水中，pH7.0)TDH-6/pVIC40，pMWD5按上述方法条件培养。培养基中含的L-异亮氨酸用高效液色谱定量测定。结果见表4。

表4

菌株 L-异亮氨基酸产量(g/L)

TDH-6/pVIC40，pMWD5 10.0TDH-6/pVIC40.pps，pMWD5 11.5

产业应用性

根据本发明，可能生产高产量的，以芳环氨基酸为代表的各种氨基酸，尤其是L-苯丙氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸，L-苏氨酸和L-异亮氨酸。通过将这些L-氨基酸高产力的微生物应用于本发明，这些L-氨基酸的生产力能进一步被增强。

序列表(1)总信息

(i)申请人：AJINOMOTO CO.，LTD.

(ii)发明标题：L-氨基酸的制备方法

(iii)序列数：9

(iv)通信地址：

(A)地址：

(B)街道：

(C)城市：

(E)国家：

(F)邮编：

(v)计算机可读形式：

(A)媒体类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：Fast SEQ Version 1.5

(vi)当前申请数据：

(A)申请号：

(B)申请日期：

(C)分类：

(viii)代理人/事务所信息：

(A)姓名：

(B)注册号：

(ix)电信信息：

(A)电话：

(B)电报：(2)SEQ ID NO：1的信息

(i)序列特征

(A)长度：29个碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)说明：/desc＝“合成DNA”

(iii)假设：否

(iv)反义：否

(xi)序列说明：SEQ ID NO：1CCCGTCGACG GATCCAGTTT CATCTCTTG 29

(2)SEQ ID NO：2的信息

(i)序列特征

(A)长度：29个残基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)说明：/desc＝“合成DNA”

(iii)假设：否

(iv)反义：是

(xi)序列说明：SEQ ID NO：2CCCGTCGACG ATCATGCGCT TATGTCGTG 29

(2)SEQ ID NO：3的信息

(i)序列特征

(A)长度：24个残基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)说明：/desc＝“合成DNA”

(iii)假设：否

(iv)反义：是

(xi)序列说明：SEQ ID NO：3AGAGGATCCA GAGATTTCTG AAGC 24

(2)SEQ ID NO：4的信息

(i)序列特征

(A)长度：26个残基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)说明：/desc＝“合成DNA”

(iii)假设：否

(iv)反义：是

(xi)序列说明：SEQ ID NO：4TCTGGATCCG CAAACGGACA TTATCA 26

(2)SEQ ID NO：5的信息

(i)序列特征

(A)长度：2841个残基

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假设：否

(iv)反义：否

(vi)起源：(A)生物体：大肠杆菌

(B)株：MI162

(ix)特点：A：名称/键：CDS

(B)位置：957…1055

(ix)特点：(A)名称/键：CDS

(B)位置：1081…1104

(ix)特点：(A)名称/键：CDS

(B)位置：1195…2841

(ix)特点：(A)名称/键：切割位点(SmaI)

(B)位置：52…57

(ix)特征：(A)名称/键：切割位点(KpnI)

(xi)序列说明：SEQ ID NO：5CTCGCTTTCC TTGTTCCTGA CCGATAACAT CACTGAGATC ATGTTGTAGC GCCCGGGATA 60CTGCATCAGT TGGTTTCGGG CGTTCGAGAG CGTGCTTACC TTCCAGAAAC GCACAGACAG 120CTTGCAGATG ATCGGCTATC AGGCATCCTT CACCGTTAAT TAGCCCCACT TCATCTTCGT 180TATCTTTCGC GACGATAATT TTTCTGCCCG ACTTAATAGC TTCAGTTGCA CTGGAGATTG 240CGCCGGGAAC GCCACGCAGA GCGCCTGTAA GCGCCAGTTC TCCGACTAAT TCATATTCAT 300CTAACTTATT GGCTGTAAGC TGTTCTGAGG CCGCCAGCAA CGCAATGGCG ATAGGTAAAT 360CATATCGTCC CCCTTCTTTT GGCAGATCAG CTGGAGCCAG GTTGATGGTG ATTTTTTTCG 420CCGGATATTC ATATCCGCTA TTGATAATGG CGCTGCGCAC GCGATCGCGA GCTTCTTTTA 480CCGTTGTTTC TGGTAAGCCC ACCATCGTTA AGCCGGGTAG ACCTTTACTG ATATGTACCT 540CAACAGTGAT CGGGGGCGCA TTTACTCCCA GGGCTGCGCG GGTATGAACA ATTGACAGTG 600ACATAAGCCC TCCTTGAGTC ACCATTATGT GCATAAGATA TCGCTGCTGT AGCCCGCTAA 660TTCGTGAATT TTAGTGGCTC ATTCCTGTTT ATTTGTGCAA GTGAAGTTGA GTTGTTCTGG 720CGGTGGAATG ATGCTCGCAA AAATGCAGCG GACAAAGGAT GAACTACGAG GAAGGGAACA 780ACATTCATAC TGAAATTGAA TTTTTTTCAC TCACTATTTT ATTTTTAAAA AACAACAATT 840TATATTGAAA TTATTAAACG CATCATAAAA ATCGGCCAAA AAATATCTTG TACTATTTAC 900AAAACCTATG GTAACTCTTT AGGCATTCCT TCGAACAAGA TGCAAGAAAA GACAAA 956ATG ACA GCC CTT CTA CGA GTG ATT AGC CTG GTC GTG ATT AGC GTG GTG 1004Met Thr Ala Leu Leu Arg Val Ile Ser Leu Val Val Ile Ser Val Val1 5 10 15GTG ATT ATT ATC CCA CCG TGC GGG GCT GCA CTT GGA CGA GGA AAG GCT 1052Val Ile Ile Ile Pro Pro Cys Gly Ala Ala Leu Gly Arg Gly Lys Ala

20 25 30TAGAGATCAA GCCTTAACGA ACTAAGACCC CCGCACCGAA AGGTCCGGGG GTTTTTTTTG 1112ACCTTAAAAA CATAACCGAG GAGCAGACAA TGAATAACAG CACAAAATTC TGTTTCTCAA 1172GATTCAGGAC GGGGAACTAA CT ATG AAT GGC GCA CAG TGG GTG GTA CAT GCG 1224

Met Asn Gly Ala Gln Trp Val Val His Ala

1 5 10TTG CGG GCA CAG GGT GTG AAC ACC GTT TTC GGT TAT CCG GGT GGC GCA 1272Leu Arg Ala Gln Gly Val Asn Thr Val Phe Gly Tyr Pro Gly Gly Ala

15 20 25ATT ATG CCG GTT TAC GAT GCA TTG TAT GAC GGC GGC GTG GAG CAC TTG 1320Ile Met Pro Val Tyr Asp Ala Leu Tyr Asp Gly Gly Val Glu His Leu

30 35 40CTA TGC CGA CAT GAG CAG GGT GCG GCA ATG GCG GCT ATC GGT TAT GCT 1368Leu Cys Arg His Glu Gln Gly Ala Ala Met Ala Ala Ile Gly Tyr Ala

45 50 55CGT GCT ACC GGC AAA ACT GGC GTA TGT ATC GCC ACG TCT GGT CCG GGC 1416Arg Ala Thr Gly Lys Thr Gly Val Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly

60 65 70GCA ACC AAC CTG ATA ACC GGG CTT GCG GAC GCA CTG TTA GAT TCC ATC 1464Ala Thr Asn Leu Ile Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser Ile75 80 85 90CCT GTT GTT GCC ATC ACC GGT CAA GTG TCC GCA CCG TTT ATC GGC ACT 1512Pro Val Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Ser Ala Pro Phe Ile Gly Thr

95 100 105GAC GCA TTT CAG GAA GTG GAT GTC CTG GGA TTG TCG TTA GCC TGT ACC 1560Asp Ala Phe Gln Glu Val Asp Val Leu Gly Leu Ssr Leu Ala Cys Thr

110 115 120AAG CAT AGC TTT CTG GTG CAG TCG CTG GAA GAG TTG CCG CGC ATC ATG 1608Lys His Ser Phe Leu Val Gln Ser Leu Glu Glu Leu Pro Arg Ile Met

125 130 135GCT GAA GCA TTC GAC GTT GCC TGC TCA GGT CGT CCT GGT CCG GTT CTG 1656Ala Glu Ala Phe Asp Val Ala Cys Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu

140 145 150GTC GAT ATC CCA AAA GAT ATC CAG TTA GCC AGC GGT GAC CTG GAA CCG 1704Val Asp Ile Pro Lys Asp Ile Gln Leu Ala Ser Gly Asp Leu Glu Pro155 160 165 170TGG TTC ACC ACC GTT GAA AAC GAA GTG ACT TTC CCA CAT GCC GAA GTT 1752Trp Phe Thr Thr Val Glu Asn Glu Val Thr Phe pro His Ala Glu Val

175 180 185GAG CAA GCG CGC CAG ATG CTG GCA AAA GCG CAA AAA CCG ATG CTG TAC 1800Glu Gln Ala Arg Gln Met Leu Ala Lys Ala Gln Lys Pro Met Leu Tyr

190 195 200GTT GGC GGT GGC GTG GGT ATG GCG CAG GCA GTT CCG GCT TTG CGT GAA 1848Val Gly Gly Gly Val Gly Met Ala Gln Ala Val Pro Ala Leu Arg Glu

205 210 215TTT CTC GCT GCC ACA AAA ATG CCT GCC ACC TGT ACG CTG AAA GGG CTG 1896Phe Leu Ala Ala Thr Lys Met Pro Ala Thr Cys Thr Leu Lys Gly Leu

220 225 230GGC GCA GTA GAA GCA GAT TAT CCG TAC TAT CTG GGC ATG CTG GGG ATG 1944Gly Ala Val Glu Ala Asp Tyr Pro Tyr Tyr Leu Gly Met Leu Gly Met235 240 245 250CAC GGC ACC AAA GCG GCA AAC TTC GCG GTG CAG GAG TGT GAC CTG CTG 1992His Gly Thr Lys Ala Ala Asn Phe Ala Val Gln Glu Cys Asp Leu Leu

255 260 265ATC GCC GTG GGC GCA CGT TTT GAT GAC CGG GTG ACC GGC AAA CTG AAC 2040Ile Ala Val Gly Ala Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Asn

270 275 280ACC TTC GCG CCA CAC GCC AGT GTT ATC CAT ATG GAT ATC GAC CCG GCA 2088Thr Phe Ala Pro His Ala Ser Val Ile His Met Asp Ile Asp Pro Ala

285 290 295GAA ATG AAC AAG CTG CGT CAG GCA CAT GTG GCA TTA CAA GGT GAT TTA 2136Glu Met Asn Lys Leu Arg Gln Ala His Val Ala Leu Gln Gly Asp Leu

300 305 310AAT GCT CTG TTA CCA GCA TTA CAG CAG CCG TTA AAT CAA TGT GAC TGG 2184Asn Ala Leu Leu Pro Ala Leu Gln Gln Pro Leu Asn Gln Cys Asp Trp315 320 325 330CAG CAA CAC TGC GCG CAG CTG CGT GAT GAA CAT TCC TGG CGT TAC GAC 2232Gln Gln His Cys Ala Gln Leu Arg Asp Glu His Ser Trp Arg Tyr Asp

335 340 345CAT CCC GGT GAC GCT ATC TAC GCG CCG TTG TTG TTA AAA CAA CTG TCG 2280His Pro Gly Asp Ala Ile Tyr Ala Pro Leu Leu Leu Lys Gln Leu Ser

350 355 360GAT CGT AAA CCT GCG GAT TGC GTC GTG ACC ACA GAT GTG GGG CAG CAC 2328Asp Arg Lys Pro Ala Asp Cys Val Val Thr Thr Asp Val Gly Gln His

365 370 375CAG ATG TGG GCT GCG CAG CAC ATC GCC CAC ACT CGC CCG GAA AAT TTC 2376Gln Met Trp Ala Ala Gln His Ile Ala His Thr Arg Pro Glu Asn Phe

380 385 390ATC ACC TCC AGC GGT TTA GGT ACC ATG GGT TTT GGT TTA CCG GCG GCG 2424Ile Thr Ser Ser Gly Leu Gly Thr Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala395 400 405 410GTT GGC GCA CAA GTC GCG CGA CCG AAC GAT ACC GTT GTC TGT ATC TCC 2472Val Gly Ala Gln Val Ala Arg Pro Asn Asp Thr Val Val Cys Ile Ser

415 420 425GGT GAC GGC TCT TTC ATG ATG AAT GTG CAA GAG CTG GGC ACC GTA AAA 2520Gly Asp Gly Ser Phe Met Met Asn Val Gln Glu Leu Gly Thr Val Lys

430 435 440CGC AAG CAG TTA CCG TTG AAA ATC GTC TTA CTC GAT AAC CAA CGG TTA 2568Arg Lys Gln Leu Pro Leu Lys Ile Val Leu Leu Asp Asn Gln Arg Leu

445 450 455GGG ATG GTT CGA CAA TGG CAG CAA CTG TTT TTT CAG GAA CGA TAC AGC 2616Gly Met Val Arg Gln Trp Gln Gln Leu Phe Phe Gln Glu Arg Tyr Ser

460 465 470GAA ACC ACC CTT ACT GAT AAC CCC GAT TTC CTC ATG TTA GCC AGC GCC 2664Glu Thr Thr Leu Thr Asp Asn Pro Asp Phe Leu Met Leu Ala Ser Ala475 480 485 490TTC GGC ATC CAT GGC CAA CAC ATC ACC CGG AAA GAC CAG GTT GAA GCG 2712Phe Gly Ile His Gly Gln His Ile Thr Arg Lys Asp Gln Val Glu Ala

495 500 505GCA CTC GAC ACC ATG CTG AAC AGT GAT GGG CCA TAC CTG CTT CAT GTC 2760Ala Leu Asp Thr Met Leu Asn Ser Asp Gly Pro Tyr Lau Leu His Val

510 515 520TCA ATC GAC GAA CTT GAG AAC GTC TGG CCG CTG GTG CCG CCT GGC GCC 2808Ser Ile Asp Glu Leu Glu Asn Val Trp Pro Leu Val Pro Pro Gly Ala

525 530 535AGT AAT TCA GAA ATG TTG GAG AAA TTA TCA TGA 2841Ser Asn Ser Glu Met Leu Glu Lys Leu Ser

540 545

(2)SEQ ID NO：6的信息

(i)序列特征

(A)长度：22个碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)说明：/desc＝“合成DNA”

(iii)假设：否

(iv)反义：否

(xi)序列说明：SEQ ID NO：6TAACATCACT GAGATCATGT TG 22

(2)SEQ ID NO：7的信息

(i)序列特征

(A)长度：21个碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)说明：/desc＝“合成DNA”

(iii)假设：否

(iv)反义：是

(xi)序列说明：SEQ ID NO：7TCTTTTCTTG CATCTTGTTC G 21

(2)SEQ ID NO：8的信息

(i)序列特征

(A)长度：22个碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)说明：/desc＝“合成DNA”

(iii)假设：否

(iv)反义：否

(xi)序列说明：SEQ ID NO：8TCTGTTTCTC AAGATTCAGG AC 22

(2)SEQ ID NO：9的信息

(i)序列特征

(A)长度：19个碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)说明：/desc＝“合成DNA”

(iii)假设：否

(iv)反义：是

(xi)序列说明：SEQ ID NO：9CGCCGGTAAA CCAAAACCC 19

Claims

1.一种制备L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养有生产L-氨基酸能力的微生物，在培养基中产生和积累L-氨基酸以及收集L-氨基酸的步骤，其中上述微生物生产磷酸烯醇丙酮酸的能力比较野生株来说强强了。

2.根据权利要求1的L-氨基酸的制备方法，其中上述氨基酸选自L-色氨酸，L-苯丙氨酸，L-酪氨酸，L-苏氨酸和L-异亮氨酸。

3.根据权利要求1或2的L-氨基酸制备方法，其中微生物是大肠杆菌属的细菌。

4.根据权利要求1或2L-氨基酸的制备，其中微生物是棒形细菌。

5.根据权利要求1至4任一项的L-氨基酸的制备方法，其中增强微生物产生磷酸烯醇丙酮酸能力的方法是增强细菌细胞中磷酸烯醇丙酮酸合成酶的活性。

6.根据权利要求1至4任一项的L-氨基酸的制备方法，其中增强微生物产生磷酸烯醇丙酮酸能力的方法是增加细菌细胞中磷酸烯醇丙酮酸合成酶基因的表达量。

7.根据权利要求1至4任一项的L-氨基酸的制备方法，其中增强微生物产生磷酸烯醇丙酮酸能力的方法是增加细菌细胞中磷酸烯醇丙酮酸合成酶基因的拷贝数。