CN1997747B - 使用属于埃希氏菌属的细菌产生l-苏氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了使用属于埃希氏菌属的细菌产生L-苏氨酸的方法，其中所述细菌具有L-苏氨酸生产能力并且已被修饰以增强一个或多个基因的表达，所述基因选自glk、pgi、pfkA、tpiA、gapA、pgk、eno和pykA基因，其编码糖酵解途径的酶。

Description

使用属于埃希氏菌属的细菌产生L-苏氨酸的方法 

技术领域

本发明涉及生物技术，具体涉及通过发酵产生L-氨基酸的方法，并更具体地涉及源自大肠杆菌细菌的基因。所述基因用于改进L-氨基酸生产能力，例如，L-苏氨酸的生产能力。 

背景技术

常规地，已通过利用由天然来源获得的微生物的菌株或其突变体，尤其是被修饰以增强L-氨基酸生产能力的突变体的发酵方法工业上生产L-氨基酸。 

例如，通过用重组DNA转化微生物扩增生物合成基因(参见，例如，美国专利No.4,278,765)已实现了L-氨基酸生产能力的增强。这些技术基于增加酶的活性，所述酶涉及氨基酸合成和/或使目标酶对产生的L-氨基酸或其副产物的反馈抑制脱敏(desensitizing)(参见，例如，美国专利Nos.4,346,170，5,661,012和6,040,160)。 

已知多种菌株用于通过发酵产生L-苏氨酸。有涉及L-苏氨酸生物合成的酶活性增加的菌株(美国专利5,175,107；5,661,012；5,705,371；5,939,307；EP0219027)，对一些化学品如L-苏氨酸及其类似物有抗性的菌株(WO0114525A1，EP301572A2，US5,376,538)，具有对产生的L-氨基酸或其副产物的反馈抑制脱敏的目标酶的菌株(美国专利5,175,107；5,661,012)，含有失活的苏氨酸降解酶的菌株(美国专利5,939,307；6,297,031)。 

已知的苏氨酸-生产菌株VKPM B-3996(美国专利5,175,107，和5,705,371)是目前最好的已知的苏氨酸生产物。为了构建菌株VKPM B-3996，将如下所述的一些突变和质粒导入亲代菌株大肠杆菌K-12(VKPM B-7)。突变体thrA基因(突变thrA442)编码天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I(aspartokinasehomoserine dehydrogenase I)，其赋予对于苏氨酸反馈抑制的抗性。突变体ilvA基因(突变ilvA442)编码具有低活性的苏氨酸脱氨酶(deaminase)，其导致低速率的异亮氨酸生物合成和异亮氨酸饥饿(isoleucine starvation)的泄漏表型 (leaky phenotype)。在具有ilvA442突变的细菌中，thrABC操纵子的转录不被异亮氨酸抑制，并由此对于苏氨酸生产非常有效。tdh基因的失活导致苏氨酸降解的防止。将蔗糖同化作用(saccharose assimilation)的遗传定子(geneticdeterminant)(scrKYABR基因s)转移到所述菌株中。为了增加控制苏氨酸生物合成的基因表达，将含有突变体苏氨酸操纵子thrA442BC的质粒pVIC40导入中间体菌株(intermediate strain)TDH6。在该菌株的发酵过程中积累的L苏氨酸的量达到多至85g/l。 

相对于大肠杆菌K-12，本发明人得到了具有突变thrR的突变体(本文称为rhtA23)，其在基本培养基中赋予对于高浓度苏氨酸或高丝氨酸的抗性(Astaurova，O.B.等，Appl.Bioch.and Microbiol.，21，611-616(1985))。此突变通过各自的大肠杆菌生产菌株，如菌株VKPM-3996也改进了L-苏氨酸(SU专利No.974817)、高丝氨酸和谷氨酸(glutamate)(Astaurova，O.B.等，Appl.Bioch.and Microbiol.，27，556-561，1991，EP1013765A)的生产。此外，本发明人已发现，rhtA基因存在于大肠杆菌染色体18min，靠近glnHPQ操纵子，其编码谷氨酰胺运输系统的元件(component)，而且发现所述rhtA基因与ORF1(ybiF基因，GenBank登记号AAA218541中编号764至1651，gi：440181)相同，该ORF1位于pexB和ompX基因之间(美国专利申请公开Nos.2003/148473，2003/157667)。已将表达由ORF1编码的蛋白质的单位称为rhtA(rht：resistanceto homoserine and threonine(对于高丝氨酸和苏氨酸的抗性))基因。而且，本发明人已发现，rhtA23突变在相对于ATG起始密码子的-1位置为A-取代-G的取代(AB STRACTS of17^thInternational Congress of Biochemistry和MolecularBiology in conjugation with1997Annual Meeting of the American Society forBiochemistry和Molecular Biology，San Francisco，Califomia August24-29，1997，abstract No.457，EP1013765A)。 

在由此研究并很大程度上优化主流苏氨酸生物合成途径的条件下，可通过改进产生能量和各种代谢物前体的中心代谢途径，如糖酵解(glycolysis)(Embden-Meyerhof途径)的效率，来完成苏氨酸-生产菌株的进一步改进。 

所述糖酵解途径包括如下的酶：由glk基因编码的葡糖激酶(glucokinase)(EC2.7.1.2)，由pgi基因编码的磷酸葡萄糖异构酶(phosphoglucose isomerase)(EC5.3.1.9)，由pfkA基因编码的磷酸果糖激酶-1(phosphofructokinase-1)(果糖-6-P1-激酶(fructose-6-P1-kinase))(EC2.7.1.11)，由fbaA基因编码的果糖 -1，6--二磷酸醛缩酶(fructose-1，6-bisphosphate aldolase)(EC4.1.2.13)，由tpiA基因编码的磷酸丙糖异构酶(triose-phosphate isomerase)(EC5.3.1.1)，由gapA基因编码的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)(EC1.2.1.12)，由pgk基因编码的磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate Kinase)(EC2.7.2.3)，由gpmA基因编码的磷酸甘油酸变位酶(phosphoglycerate mutase)(EC2.7.5.3)，由eno基因编码的烯醇化酶(enolase)(EC4.2.1.11)和由pykA和pykF基因编码的丙酮酸激酶(pyruvate kinase)的同功酶(isoenzyme)(EC2.7.1.40)(Escherichia coli and Salmonella，Second Edition，Editor in Chief：F.C.Neidhardt，ASM Press，Washington D.C.，1996)。 

已公开了通过发酵棒状杆菌的细菌生产L-赖氨酸或其它含有L-赖氨酸的饲料添加剂的方法，其中将内源glk基因的等位基因在适于形成glk基因产物葡糖激酶的条件下过表达(PCT申请WO03054198A1)。也公开了通过大肠杆菌生产莽草酸(shikimic acid)及其衍生物的方法，所述大肠杆菌具有将碳源转化为莽草酸的能力并用包含基因的重组DNA转化，所述基因编码葡萄糖易化蛋白(glucose facilitator protein)和来自Zymomonas mobilis的葡糖激酶(PCT申请WO0229078A2)。而且，已公开了细胞内代谢中间物，尤其是赤藓糖-4-磷酸(erythrose4-phosphate)的微生物制剂的方法，和一些物质，尤其是芳香族氨基酸如L-苯丙氨酸的微生物制剂的替换方法，其中在产生这些物质的微生物中转二羟丙酮基酶(transaldolase)的活性增加(美国专利6,316,232)。′232专利作为优选的实施方案公开了酮糖移转酶(transketolase)的活性或PEP-依赖性摄取糖的转运蛋白的活性和/或葡糖激酶的活性得到另外地增加。使用的微生物包括属于埃希氏菌属、沙雷氏菌属(Serratia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)或短杆菌属(Breibacterium)的那些细菌。 

已公开了产生L-氨基酸，尤其是L-赖氨酸的方法，其包括培养改变的细菌细胞，尤其是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，其与未改变的细菌细胞相比具有增加的NADPH的量，其中所述改变的细菌细胞具有增加的通过戊糖磷酸途径(pentose phosphate pathway)的氧化支路(oxidative branch)的碳流量(carbon flux)(PCT申请WO0107626A2)。此出版物作为方法的优选实施方案公开了改变的细菌细胞，其由于6-磷酸葡萄糖异构酶酶活性的量的减少而具有减少的经过糖酵解途径的碳流量，这由pgi基因中的突变产生。也公开了使用棒状杆菌的细菌产生L-赖氨酸的类似方法，所述细菌消除了磷酸 葡糖异构酶(pgi)酶的细胞内活性(美国专利6,586,214)。 

已公开了产生L-赖氨酸的方法，其包括培养L-赖氨酸-生产棒状杆菌的细菌，其中由pfkA基因编码的6-磷酸果糖激酶(6-phosphofructokinase)的细胞内活性增加(欧洲专利申请EP1195431A1)。同时，已公开了发酵制备L-氨基酸，尤其是L-赖氨酸的方法，其包括培养棒状杆菌的细菌以产生所需的L-氨基酸，其中至少编码6-磷酸果糖激酶的基因(pfkA基因)和/或编码1-磷酸果糖激酶的基因(fruK基因)被衰减(PCT申请WO02074944A1)。此出版物作为方法的优选实施方案公开了使用棒状杆菌的细菌制备L-赖氨酸，其中除了pfkA和/或fruK基因的衰减之外，同时增强并且尤其是过表达一个或多个选自如下的基因：编码反馈-抗性天冬氨酸激酶的lysC基因、编码二氢吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase)的dapA基因、编码磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase)的gap基因、编码丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase)的pyc基因、编码苹果酸：苯醌氧化还原酶(malate：quinone oxidoreductase)的mqo基因、编码磷酸葡萄糖脱氢酶(glucose phosphatedehydrogenase)的zwf基因、编码赖氨酸输出蛋白(lysine exporter)的lysE基因、编码zwal蛋白质的zwa1基因、编码磷酸丙糖异构酶的基因tpi和编码3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因。 

已描述了通过发酵棒状杆菌的细菌制备L-氨基酸，如L-赖氨酸和L-苏氨酸的方法，其中扩增了至少zwf基因(PCT申请WO0170995A1)。此出版物作为方法的优选实施方案公开了使用棒状杆菌的细菌制备L-氨基酸，其中除了zwf基因的衰减之外，扩增了或同时过表达一个或多个选自如下的基因：编码二氢吡啶二羧酸合酶的dapA基因、编码反馈-抗性天冬氨酸激酶的lysC基因、编码3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase)的gap基因、编码丙酮酸羧化酶的pyc基因、编码transketolase的tkt基因、编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶(gluconate6-phosphate dehydrogenase)的gnd基因、编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因、zwal基因、编码烯醇化酶的eno基因。 

已公开了产生L-氨基酸，包括L-苏氨酸的棒状杆菌的细菌，其具有存在于天然位点(基因座)的至少一个拷贝和开放阅读框(ORF)的多至三个附加拷贝，所述ORF选自下组，其中包括eno、gap、pgk和tpi基因(PCT申请WO03014330A2、WO03040373A2)。 

已公开了通过发酵棒状杆菌的细菌制备L-谷氨酸的方法，其中编码D- 丙氨酸消旋酶(D-alanine racemase)(alr)的核苷酸序列被衰减，并且尤其是被消除(PCT申请WO0208437A2)。此出版物作为方法的优选实施方案公开了使用棒状杆菌的细菌制备L-谷氨酸，其中，除了编码D-丙氨酸消旋酶(alr)的核苷酸序列的衰减之外，增强并尤其是过表达一个或多个选自下组的基因，其中除其它基因之外还包括gap和eno基因。 

已公开了使用微生物，尤其是棒状杆菌的细菌或大肠杆菌产生精细化学品(fine chemical)或代谢物，如L-苏氨酸的方法，其中永久改变了至少一种蛋白质的磷酸化能力(phosphorylatability)以至于通过微生物合成的至少一种精细化学品的生物合成，由于蛋白质的至少一个氨基酸的突变与野生型相比增加(PCT申请WO03023016A2)。所述蛋白质的一个实例是突变体烯醇酶(enoS330E)。 

在编码糖酵解途径的酶的基因中，已将四个基因用于利用肠杆菌科的细菌，尤其是大肠杆菌来改进L-苏氨酸生产。它们是fbaA、gpmA(pgm)、pykF和pfkB基因。 

因此，已公开了通过发酵肠杆菌科微生物制备L-氨基酸，尤其是L-苏氨酸的方法，其产生所需的L-氨基酸而且其中增强尤其是过表达了fba基因或编码此基因的核苷酸序列(PCT申请WO03004664A2)。同时，在PCT申请WO03004662A2中相同的申请人公开了通过发酵肠杆菌科的微生物来发酵制备L-氨基酸，尤其是L-苏氨酸的方法，其产生所需的L-氨基酸而且其中衰减尤其是消除了一个或多个选自下组的基因，其中除其它基因之外还包括fba基因或编码它的核苷酸序列，但它不包含实施例。 

而且，已公开了通过发酵肠杆菌科微生物制备L-氨基酸，尤其是L-苏氨酸的方法，其产生所需的L-氨基酸而且其中增强尤其是过表达了pgm基因或编码它的核苷酸序列(PCT申请WO03004598A2)。同时，在PCT申请WO03004662A2中相同的申请人公开了通过发酵肠杆菌科的微生物来发酵制备L-氨基酸，尤其是L-苏氨酸的方法，其产生所需的L-氨基酸而且其中衰减尤其是消除了一个或多个选自下组的基因，其中除其它基因之外还包括pgm基因或编码这些的核苷酸序列，但它不包含实施例。 

而且，已公开了通过发酵肠杆菌科微生物制备L-氨基酸，尤其是L-苏氨酸的方法，其产生所需的L-氨基酸而且其中增强尤其是过表达了pykF基因或编码它的核苷酸序列(PCT申请WO03008609A2)。同时，在PCT申请 WO03008600A2中相同的申请人公开了通过发酵肠杆菌科的微生物来发酵制备L-氨基酸，尤其是L-苏氨酸的方法，其产生所需的L-氨基酸而且其中衰减尤其是消除了一个或多个选自下组的基因，其中除其它基因之外还包括pykF基因或编码这些的核苷酸序列，但它不包含实施例。 

而且最后，已公开了通过发酵肠杆菌科微生物制备L-氨基酸，尤其是L-苏氨酸的方法，其产生所需的L-氨基酸而且其中增强尤其是过表达了pfkB基因或编码它的核苷酸序列(PCT申请WO03008610A2)。同时，在不包含实施例的PCT申请WO03008600A2中相同的申请人公开了通过发酵肠杆菌科的微生物来发酵制备L-氨基酸，尤其是L-苏氨酸的方法，其产生所需的L-氨基酸而且其中衰减尤其是消除了一个或多个选自下组的基因，其中除其它基因之外还包括pfkB基因或编码这些的核苷酸序列。 

目前还没有公开使用属于埃希氏菌属并具有增强的基因表达的细菌用于生产L-苏氨酸，所述基因编码糖酵解途径的酶，诸如glk、pgi、pfkA、tpiA、gapA、pgk、eno和pykA。 

发明内容

本发明的一个目的在于增强L-苏氨酸-生产菌株的生产能力并提供使用这些菌株生产L-苏氨酸的方法。 

通过如下发现实现此目的：编码糖酵解途径的酶的基因，诸如glk、pgi、pfkA、tpiA、gapA、pgk、eno和pykA，一经克隆到低拷贝载体上，当用携带该基因的质粒转化菌株时，增强L-苏氨酸-生产菌株的L-苏氨酸生产。由此完成了本发明。 

本发明的一个目的是提供属于埃希氏菌属的L-苏氨酸-生产细菌，其中所述细菌已被修饰以增强一个或多个糖酵解酶的活性。 

本发明的又一个目的是提供属于埃希氏菌属的L-苏氨酸生产细菌，其中所述细菌已被修饰以增强一个或多个基因的表达，所述基因选自glk、pgi、pfkA、tpiA、gapA、pgk、eno和pykA，其编码糖酵解途径的酶，或编码这些的核苷酸序列。 

本发明的又一个目的是提供如上所述的细菌，其中通过增加所述基因的拷贝数，或修饰所述基因的表达控制序列以便于增强所述基因的表达来增强一个或多个基因的表达。

本发明的又一个目的是提供如上所述的细菌，其中通过用含有一个或多个基因的低拷贝数载体转化所述细菌来增加拷贝数。 

本发明的又一个目的是提供如上所述的细菌，其中所述基因源自属于埃希氏菌属的细菌。 

本发明的又一个目的是提供如上所述的细菌，其中所述细菌已被进一步修饰以增强一个或多个基因的表达，所述基因选自： 

-突变体thrA基因，其编码抗苏氨酸反馈抑制的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I； 

-thrB基因，其编码高丝氨酸激酶； 

-thrC基因，其编码苏氨酸合酶； 

-rhtA基因，其编码推定的跨膜蛋白质。 

本发明的又一个目的是提供如上所述的细菌，其中所述细菌已被修饰以增加突变体thrA基因、thrB基因、thrC基因和rhtA基因的表达量。 

而且本发明的又一个目的是提供产生L-苏氨酸的方法，其包括在培养基中培养如上所述的细菌以在培养基中产生并积累L-苏氨酸，并从培养基中收集L-苏氨酸。 

附图说明

图1显示合成的突变体启动子P_A3m的结构。 

优选实施方案的说明 

本发明的细菌是属于埃希氏菌属的L-苏氨酸-生产细菌，其中所述细菌已被修饰以增强一个或多个糖酵解酶的活性。具体地，本发明的细菌是属于埃希氏菌属的L-苏氨酸-生产细菌，其中所述细菌已被修饰以增强编码糖酵解途径的酶的一个或多个基因的表达，所述基因选自glk、pgi，pfkA，tpiA，gapA，pgk、eno和pykA，或编码这些的核苷酸序列。 

在本发明中，“L-苏氨酸-生产细菌”指一种细菌，当将本发明的细菌在培养基中培养时，其具有在培养基中积累L-苏氨酸的能力。可通过繁殖赋予或增强L-苏氨酸-生产能力。如本文中使用的短语＂L-苏氨酸-生产细菌＂也指一种细菌，其能够在培养基中以比野生型或亲代大肠杆菌菌株，如大肠杆菌K-12菌株更大的量产生并积累L-苏氨酸。

短语＂属于埃希氏菌属细菌＂是指根据微生物领域的技术人员已知的分类法(classification)将细菌归类为埃希氏菌属。如在本发明中使用的属于埃希氏菌属的微生物的实例包括，但不局限于，大肠杆菌(E.coli)。 

然而，能用于本发明的属于埃希氏菌属的细菌无具体限制，例如，本发明中包含了由Neidhardt，F.C.等(Escherichia coli and Salmonella typhimurium，American Society for Microbiology，Washington D.C.，1208，表1)描述的细菌。 

短语＂被修饰以增强基因的表达＂指所述基因的表达量比未修饰的菌株，例如野生型菌株的表达量高。所述修饰的实例包括增加每个细胞待表达基因的数目，增加基因的表达水平等。例如，通过限制染色体DNA，然后使用基于基因序列构建的探针进行Southern印迹，荧光原位杂交(fluorescence in situhybridization)(FISH)等测定了表达基因的拷贝数的数量。通过不同方法，包括Northern印迹、定量RT-PCR等测定基因表达的水平。此外，可使用，例如，大肠杆菌K-1作为野生型菌株用于比较。作为增强基因表达的结果，在培养基中积累的L-苏氨酸的量增加。 

根据本发明的糖酵解途径的酶显示为：由glk基因编码的葡糖激酶(EC2.7.1.2)，由pgi基因编码的磷酸葡糖异构酶(EC5.3.1.9)，由pfkA基因编码的磷酸果糖激酶-1(果糖-6-P1-激酶)(EC2.7.1.11)，由tpiA基因编码的磷酸丙糖异构酶(EC5.3.1.1)，由gapA基因编码的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(EC1.2.1.12)，由pgk基因编码的磷酸甘油酸激酶(EC2.7.2.3)，由eno基因编码的烯醇酶(EC4.2.1.11)和由pykA基因编码的丙酮酸激酶的同功酶(EC2.7.1.40)。 

在本发明中，术语＂葡糖激酶＂指能够催化生成葡萄糖-6-磷酸的ATP-依赖性葡萄糖磷酸化反应的酶。术语＂磷酸葡糖异构酶＂指能够催化将葡萄糖-6-磷酸转化为果糖-6磷酸的反应的酶。术语＂磷酸果糖激酶-1(果糖-6-P1-激酶)＂指能够催化生成葡萄糖-1，6-二磷酸的葡萄糖-6-磷酸的ATP-依赖性磷酸化反应的酶。术语＂磷酸丙糖异构酶＂指将磷酸二羟丙酮(dihydroxyacetone phosphate)和甘油醛-3-磷酸(glyceraldehyde-3-phosphate)互变的酶。术语＂甘油醛-3-磷酸脱氢酶＂指能够催化将甘油醛-3-磷酸NAD⁺-依赖性转化为1，3-二磷酸甘油酸(1，3-diphosphoglucerate)反应的酶。术语＂磷酸甘油酸激酶＂指能够催化释放3-磷酸甘油酸和ATP的1，3-二磷酸甘油酸的脱磷酸反应的酶。术语＂烯醇酶＂指能够催化释放磷酸烯醇丙酮酸的2-磷酸甘油酸脱水反应的酶。术语＂丙酮酸激酶＂指能够催化释放ATP的由磷酸烯醇丙酮酸生成丙酮酸的反应的酶。

可将源自属于埃希氏菌属的细菌的任何基因和源自其它细菌，如棒状杆菌的细菌，属于芽孢杆菌属的细菌等的基因用作编码糖酵解酶的基因。其中，优选源自属于埃希氏菌属的细菌的基因。 

作为编码大肠杆菌的葡糖激酶的基因，已阐明了glk基因(GenBank登记号NC_000913.1序列中的核苷酸编号2506481至2507446，gi：16130320；SEQID NO：1)。所述glk基因位于大肠杆菌菌株K12的染色体上b2387和b2389ORFs之间。作为编码大肠杆菌的磷酸葡糖异构酶的基因，已阐明了pgi基因(GenBank登记号NC_000913.1，gi：16131851序列中的核苷酸编号4231337至4232986，gi：16131851；SEQ ID NO：3)。所述pgi基因位于大肠杆菌菌株K12的染色体上lysC基因和ykbE之间。作为编码大肠杆菌的磷酸果糖激酶-1的基因，已阐明了pfkA基因(GenBank登记号NC_000913.1序列中的核苷酸编号4105132至4106094，gi：16131754；SEQ ID NO：5)。所述pfkA基因位于大肠杆菌菌株K12的染色体上的yiiP ORF和sbp基因之间。作为编码大肠杆菌的磷酸丙糖异构酶的基因，已阐明了tpiA基因(GenBank登记号NC_000913.1序列中的核苷酸编号4108320至4109087，gi：16131757；SEQ ID NO：9)。所述tpiA基因位于大肠杆菌菌株K12的染色体上的cdh基因和yiiQ ORF之间。作为编码大肠杆菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因，已阐明了gapA基因(GenBank登记号NC_000913.1序列中的核苷酸编号1860795至1861790，gi：16129733；SEQ ID NO：11)。所述gapA基因位于大肠杆菌菌株K12的染色体上的yeaA和yeaD ORFs之间。作为编码大肠杆菌的磷酸甘油酸激酶的基因，已阐明了pgk基因(GenBank登记号NC_000913.1序列中的核苷酸编号3069479至3070642，gi：16130827；SEQ ID NO：13)。所述pgk基因位于大肠杆菌菌株K12的染色体上的fbaA和epd基因之间。作为编码大肠杆菌的烯醇酶的基因，已阐明了eno基因(GenBank登记号NC_000913.1序列中的核苷酸编号2904665至2905963，gi：16130686；SEQ ID NO：17)。所述eno基因位于大肠杆菌菌株K12的染色体上的b2778ORF和pyrG基因之间。作为编码大肠杆菌的丙酮酸激酶II的基因，已阐明了pykA基因(分别为GenBank登记号NC_000913.1序列中的核苷酸编号1935673至1937115和1753722至1755134，gi：16129807和gi：16129632；SEQ ID NOs：19和21)。所述pykA基因位于大肠杆菌菌株K12的染色体上的yebK ORF和msbB基因之间。因此，可利用根据报道的基因的核苷酸序列制备的引物通过PCR(聚合酶链式反应；参考White，T.J.等， Trends Genet.，5，185(1989))获得上述基因。 

源自大肠杆菌的glk基因通过编码如下蛋白(A)或(B)的DNA举例说明： 

(A)蛋白质，其包括SEQ ID NO：2显示的氨基酸序列；或 

(B)蛋白质，其包括氨基酸序列，该氨基酸序列包括在SEQ ID NO：2显示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或增加一个或几个氨基酸，并且其具有葡糖激酶的活性。 

源自大肠杆菌的pgi基因通过编码如下蛋白(C)或(D)的DNA举例说明： 

(C)蛋白质，其包括SEQ ID NO：4显示的氨基酸序列；或 

(D)蛋白质，其包括氨基酸序列，该氨基酸序列包括在SEQ ID NO：4显示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或增加一个或几个氨基酸，并且其具有磷酸葡糖异构酶的活性。 

源自大肠杆菌的pfkA基因通过编码如下蛋白(E)或(F)的DNA举例说明： 

(E)蛋白质，其包括SEQ ID NO：6显示的氨基酸序列；或 

(F)蛋白质，其包括氨基酸序列，该氨基酸序列包括在SEQ ID NO：6显示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或增加一个或几个氨基酸，并且其具有磷酸果糖激酶-1(果糖-6-P1-激酶)的活性。 

源自大肠杆菌的tpiA基因通过编码如下蛋白(G)或(H)的DNA举例说明： 

(G)蛋白质，其包括SEQ ID NO：8显示的氨基酸序列；或 

(H)蛋白质，其包括氨基酸序列，该氨基酸序列包括在SEQ ID NO：8显示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或增加一个或几个氨基酸，并且其具有磷酸丙糖异构酶的活性。 

源自大肠杆菌的gapA基因通过编码如下蛋白(I)或(J)的DNA举例说明： 

(I)蛋白质，其包括SEQ ID NO：10显示的氨基酸序列；或 

(J)蛋白质，其包括氨基酸序列，该氨基酸序列包括在SEQ ID NO：10显示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或增加一个或几个氨基酸，并且其具有甘油醛-3-磷酸脱氢酶的活性。 

源自大肠杆菌的pgk基因通过编码如下蛋白(K)或(L)的DNA举例说明： 

(K)蛋白质，其包括SEQ ID NO：12显示的氨基酸序列；或 

(L)蛋白质，其包括氨基酸序列，该氨基酸序列包括在SEQ ID NO：12显示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或增加一个或几个氨基酸，并且其具有磷酸甘油酸激酶的活性。

源自大肠杆菌的eno基因通过编码如下蛋白(M)或(N)的DNA举例说明： 

(M)蛋白质，其包括SEQ ID NO：14显示的氨基酸序列；或 

(N)蛋白质，其包括氨基酸序列，该氨基酸序列包括在SEQ ID NO：14显示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或增加一个或几个氨基酸，并且其具有烯醇酶的活性。 

源自大肠杆菌的pykA基因通过编码如下蛋白(O)或(P)的DNA举例说明： 

(O)蛋白质，其包括SEQ ID NO：16显示的氨基酸序列；或 

(P)蛋白质，其包括氨基酸序列，该氨基酸序列包括在SEQ ID NO：16显示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或增加一个或几个氨基酸，并且其具有丙酮酸激酶的活性。 

取决于蛋白质的三维结构中氨基酸残基的位置或类型，＂几个＂氨基酸的数目有差别。对蛋白质(A)而言，其可为，例如，2至30，优选2至15，而且更优选2至5。这是因为一些氨基酸相互具有高同源性，所以蛋白质的三维结构或其活性不受所述变化的影响。因此，蛋白质(B)相对于构成葡糖激酶的完整氨基酸序列可具有不小于30至50％，优选50至70％，而且更优选70至90％之间，还更优选大于90％，而且最优选大于95％的同源性，并且其具有葡糖激酶的活性。将同样的方法应用于其它蛋白质(C)、(E)、(G)、(I)、(K)、(M)和(O)。 

例如，通过例如用定点突变(site-directed mutagenesis)方法修饰编码酶的DNA的核苷酸序列，以使在具体位点上的一个或多个氨基酸残基涉及缺失、取代、插入和增加来得到编码与上述糖酵解途径的每种酶基本上相同的蛋白质的DNAs。通过常规已知的突变处理得到如上所述修饰的DNA。所述处理包括羟胺处理编码本发明蛋白质的DNA或用紫外光照射(UV irradiation)或用试剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine)或亚硝酸(nitrous acid)处理含有所述DNA的细菌。 

通过在适当的细胞中表达具有如上所述突变的DNA，并分析任何表达产物的活性来得到编码与葡糖激酶基本上相同的蛋白质的DNA。编码与葡糖激酶基本上相同的蛋白质的DNA也可通过从编码具有突变的葡糖激酶的DNA中，或携带它的细胞中分离DNA获得，所述DNA可在严紧性条件下与具有下列核苷酸序列的探针杂交，所述核苷酸序列含有，例如，SEQ ID NO：1显示的核苷酸序列，并编码具有葡糖激酶活性的蛋白质。本文中＂严紧性条件＂ 指形成所谓特异性杂合体而不形成非特异性杂合体的条件。难以通过使用任何数字值清楚地表达此条件。然而，例如，严紧性条件可通过如下条件来举例说明：在该条件下具有高同源性的DNAs，例如，具有不小于50％，优选50至70％，而且更优选70至90％之间，还更优选大于90％，而且最优选大于95％的同源性的DNAs，能够相互杂交，但具有低于上述同源性的DNAs不能相互杂交。 

为了评估蛋白质或DNA同源性的程度，可使用几种计算方法，如BLAST搜索，FASTA搜索和CrustalW。BLAST(基本局部比对搜索工具(Basic LocalAlignment Search Tool))是使用程序blastp、blastn、blastx、megablast、tblastn和tblastx的探索式搜索算法(heuristic search algorithm)；这些程序把重要性归因于它们使用Karlin，Samuel和Stephen F.Altschul的统计方法的发现(＂Methodsfor assessing the statistical significance of molecular sequencefeaturesby using general scoring schemes＂.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1990，87：2264-68；＂Applications and statistics for multiple high-scoring segments inmolecular sequence＂.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1993，90：5873-7)。FASTA搜索方法由W.R.Pearson描述(＂Rapid and Sensitive sequence Comparison withFASTP and FASTA＂，Methods in Enzymology，1990183：63-98)。ClustalW方法由Thompson J.D.，Higgins D.G.和Gibson T.J.描述(＂CLUSTAL W：improvingthe sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequenceweighting，position-specific gappenalties and weight matrix choice＂，NucleicAcids Res.1994，22：4673-4680)。 

可替换地，严紧性条件可通过如下条件举例说明：在该条件下DNAs在相当于Southern杂交中的普通洗涤条件的盐浓度，即，1x SSC，0.1％SDS，优选0.1x SSC，0.1％SDS，在60℃相互杂交。洗涤步骤的持续时间依赖于印迹使用的膜的类型，并且通常由制造商推荐。例如，在严紧性条件下洗涤Hybond^TM N+尼龙膜(Amersham)的推荐时间为15分钟。优选地，洗涤可进行2至3次。 

也可将SEQ ID NO：1的核苷酸序列的部分序列用作探针。可使用基于SEQ ID NO：1的核苷酸序列产生的引物作为引物，和含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的DNA片段作为模板，通过PCR制备探针。当将具有大约300bp长度的DNA片段用作探针时，洗涤条件可包括，例如，50℃、2xSSC和0.1％ SDS。 

如上所述的核苷酸的取代、缺失、插入或增加也包括突变，其例如，由于含有葡糖激酶的细菌的种或属的多样性而天然存在(突变体或变体)。 

与如上所述的葡糖激酶类似地获得编码与糖酵解途径的其它酶基本上相同的蛋白质的DNA。 

＂用编码蛋白质的DNA转化细菌＂指例如，通过常规方法将DNA导入细菌细胞。用此DNA转化细菌细胞将导致编码本发明蛋白质的基因表达的增加并将增强细菌细胞中的蛋白质活性。转化的方法包括任何迄今已报道的公知方法。例如，已报道用氯化钙处理受体细胞以使细胞对于DNA的通透性(permeability)增加的方法用于大肠杆菌K-12(Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))并且可以使用。 

增强基因表达的方法包括增加基因拷贝数。将基因导入能够在属于埃希氏菌属的细菌中起作用的载体增加基因的拷贝数。优选地，使用低拷贝载体。所述低-拷贝载体通过pSC101、pMW118、pMW119等举例说明。术语＂低拷贝载体＂用于载体，其拷贝数多至每个细胞5个拷贝。 

也可通过例如，同源重组、Mu整合等的方法将基因的多拷贝导入细菌的染色体来实现基因表达的增强。例如，一轮(round)的Mu整合允许将基因的多至3个拷贝导入细菌的染色体。 

也可通过例如，将本发明的DNA置于强启动子的控制下来修饰基因的表达控制序列以便于增强基因的表达，来实现基因表达的增强。例如，lac启动子、trp启动子、trc启动子、λ噬菌体的P_R或P_L启动子被称为强启动子。通过RNA合成起始(RNA synthesis initiation)的作用频率来定义启动子的强度。评价启动子强度的方法由例如，Deuschle U.，Kammerer W.，Gentz R.，Bujard H.(Promoters in E.coli：a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures.EMBO J.，5，2987-2994(1986))描述。 

强启动子可与增加基因拷贝组合使用。 

可替换地，可通过，例如，将突变导入启动子以增加位于该启动子下游的基因的转录水平来增强启动子。此外，已知核糖体结合位点(ribosomebinding site)(RBS)和起始密码子之间的间隔区(spacer)，而且尤其是恰位于起始密码子上游的序列中的几个核苷酸的取代严重地影响它们RNA可翻译性。例如，依赖于起始密码子之前的三个核苷酸的性质，得到20-倍范围的表达水 平(Gold等，Annu.Rev.Microbiol.，35，365-403，1981；Hui etal.，EMBO J.，3，623-629，1984)。较早前，本发明的作者显示，rhtA23突变是在相对于ATG起始密码子的-1位置的A-取代-G的取代(ABSTRACTS of17th InternationalCongress of Biochemistry和Molecular Biology in conjugation with1997AnnualMeeting of the American Society for Biochemistry和Molecular Biology，SanFrancisco，Califomia August24-29，1997，abstract No.457)。因此，可以看出，rhtA23突变增强了rhtA基因表达，并且因此，增加了对于苏氨酸、高丝氨酸和一些运输到细胞外的其它物质的抗性水平。 

而且，也可能将核苷酸取代导入细菌染色体上糖酵解的一个或多个基因的启动子区以使其应被修饰为较强的启动子。可例如，以与在国际专利公开WO00/18935和日本专利公开号1-215280中公开的使用温度敏感性质粒的基因取代相同的方式，实现表达控制序列的改变。 

增加编码糖酵解途径的酶的一个或多个基因的拷贝数也可以通过将基因的多拷贝导入细菌的染色体DNA来实现。为了将基因的多拷贝导入细菌的染色体，通过使用其多拷贝存在于染色体DNA的序列作为靶物(target)来进行同源重组(homologous recombination)。作为其多拷贝存在于染色体DNA的序列，可以使用存在于可转座元件末端的重复DNA、反向重复序列(invertedrepeats)。而且，如日本专利Laid-openNo.2-109985中公开的，可能将具体基因掺入转座子，并使其被转移以将所述基因的多个拷贝导入染色体DNA。 

制备质粒DNA、消化和连接DNA、转化、选择寡核苷酸作为引物等的方法可为本领域的技术人员公知的普通方法。这些方法，例如，在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，和Maniatis，T.，＂Molecular Cloning A Laboratory Manual，Second Edition＂，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中描述。 

本发明的细菌可通过将上述DNAs导入天然具有产生L-苏氨酸的能力的细菌来获得。可替换地，本发明的细菌可通过将产生L-苏氨酸的能力赋予已经含有所述DNAs的细菌来获得。 

本发明包含的亲代菌株的实例包括，但不局限于，属于埃希氏菌属的苏氨酸-生产细菌，可以使用诸如大肠杆菌菌株TDH-6/pVIC40(VKPM B-3996)(美国专利5,175,107，美国专利5,705,371)、大肠杆菌菌株NRRL-21593(美国专利5,939,307)、大肠杆菌菌株FERM BP-3756(美国专利5,474，918)、大肠杆菌菌株FERM BP-3519和FERM BP-3520(美国专利5,376,538)、大肠杆菌菌 株MG442(Gusyatiner等，Genetika(俄文)，14，947-956(1978))、大肠杆菌菌株VL643和VL2055(EP1149911A)等。 

菌株TDH-6在thrC基因中是有缺陷的，又是蔗糖-同化的(sucrose-assimilative)，而且ilvA基因具有泄漏突变。此菌株在rhtA基因中具有突变，其赋予对于高浓度苏氨酸或高丝氨酸的抗性。菌株B-3996(TDH-6/pVIC40)含有质粒pVIC40，其已通过如下方法获得：将thrA*BC操纵子插入由RSF1010-来源的载体，所述操纵子包括编码天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的突变体thrA基因，该酶具有基本上脱敏的苏氨酸反馈抑制。菌株B-3996于1987年11月19日保藏在All-Union Scientific Center of Antibiotics(Nagatinskaya Street3-A，113105Moscow，Russian Federation)，于1987年4月7日得到登录号RIA1867。该菌株也于1987年4月7日以登录号B-3996保藏在工业微生物俄罗斯国家保藏中心(Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms)(VKPM)(Dorozhny proezd.1，Moscow113545，RussianFederation)。 

优选地，本发明的细菌优选被进一步修饰以增强一个或多个下述基因连同编码糖酵解途径的酶的一个或多个基因的表达： 

-突变体thrA基因，其编码抗苏氨酸反馈抑制的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I； 

-thrB基因，其编码高丝氨酸激酶； 

-thrC基因，其编码苏氨酸合酶； 

本发明的另一个优选实施方案是除了增强编码糖酵解酶的基因以外，被修饰以增强编码推定的跨膜蛋白质的rhtA基因的细菌。本发明最优选的实施方案是被修饰以增加编码糖酵解酶的基因，突变体thrA基因、thrB基因、thrC基因和rhtA基因表达的细菌。 

本发明产生L-苏氨酸的方法包括如下步骤：在培养基中培养本发明的细菌，使L-苏氨酸在培养基中积累，并从培养基中收集L-苏氨酸。 

在本发明中，培养、收集并从培养基中纯化L-苏氨酸等可以类似于使用微生物产生L-苏氨酸的常规发酵方法的方式进行。 

用于培养的培养基可为合成的或天然培养基，只有该培养基包括碳源和氮源和矿物和，如果需要的话，微生物生长所需的适量营养物。碳源可包括各种碳水化合物，如葡萄糖和蔗糖，和各种有机酸。取决于选择的微生物的 同化作用的模式，可使用醇，包括乙醇和甘油。作为氮源，使用各种铵盐如氨和硫酸铵，其它氮化合物如胺类，天然氮源如蛋白胨、大豆水解物，和消化的发酵微生物。作为矿物，使用单磷酸钾(potassium monophosphate)、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钙等。作为维生素，使用硫胺素、酵母提取物等。如果需要可将附加营养物加入培养基。例如，如果微生物生长需要异亮氨酸(异亮氨酸营养缺陷型)，可将足量的异亮氨酸加入培养基。 

培养优选在需氧条件下进行，如在20至40℃，优选30至38℃的温度振荡培养和通气搅拌培养。培养的pH通常为5-9，优选6.5-7.2。可用氨、碳酸钙、各种酸、各种碱和缓冲液调节培养的pH。通常，1至5-天的培养导致在液体培养基中积累L-苏氨酸。 

培养之后，可通过离心或膜过滤将固体如细胞从液体培养基中去除，然后可通过离子-交换、浓缩和结晶方法收集并纯化L-苏氨酸。 

实施例 

下面参考如下非限制的实施例更具体地说明本发明。将大肠杆菌菌株VKPM B-3996(美国专利5,175,107)用作亲代菌株以评价应用编码糖酵解途径的酶的基因的扩增对于L-苏氨酸生产的作用。 

质粒pMW119及其衍生物与质粒pVIC40(复制子pRSF1010)相适应，因此含有编码糖酵解途径的酶的基因的两个质粒：pVIC40，和pMW119的衍生物，可同时在细菌中保持。在发酵结果的表中，提供了来自至少(请确认)三次独立实验的数据。 

实施例1：从大肠杆菌中克隆glk基因，和glk基因的增强表达对于L-苏氨酸生产的作用。 

使用大肠杆菌菌株MG1655(VKPM B-6195)的染色体DNA作为模板和引物P1(SEQ ID NO：17)和P2(SEQ ID NO：18)通过PCR得到glk基因。菌株MG1655可由美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC700926)得到。引物P1含有引入其5’-端的BamHI限制酶的识别位点。引物P2含有引入其5’-端的SacI限制酶的识别位点。用BamHI和SacI限制酶处理所得到的含有glk基因的DNA片段(968bp)并克隆入质粒pMW119，该质粒事先被修饰，以用λ噬菌体的启动子P_R取代启动子P_lac，然后用相同 的限制酶处理。由此构建了在启动子P_R控制下的含有glk基因的质粒pMW-P_R-g1k。使用此质粒可实现非调控的高水平glk基因表达。 

将pMW-P_R-glk质粒导入链霉素-抗性的产苏氨酸大肠杆菌菌株B-3996(美国专利5,175,107)。由此，得到菌株B-3996(pMW-P_R-glk)。 

大肠杆菌菌株B-3996和B-3996(pMW-P_R-glk)两者都在37℃在含有链霉素(100μg/ml)和氨苄青霉素(100μg/ml)的L-琼脂平板上生长18-24小时。为了获得种子培养物，将菌株在旋转摇床(250rpm)上在32℃在含有2ml含4％葡萄糖的L-肉汤的20x200mm试管中生长18小时。然后，用0.1ml(5％)的种子材料接种发酵培养基。发酵在2ml用于发酵的基本培养基中在20x200mm试管中进行。细胞在32℃、在250rpm的振荡下生长24小时。 

培养之后，通过TLC测定培养基中L-苏氨酸的积累量。用移动相2-丙醇(propan-2-ol)：丙酮：水：25％氨水＝25：25：7：6(v/v)将Sorbfil平板(StockCompany Sorbopolymer，Krasnodar，Russia)显色(develop)。将水合茚三酮(ninhydrin)的丙酮溶液(2％)用作显示试剂(visualizing reagent)。结果在表1中提供。 

发酵培养基的组成(g/l)如下： 

葡萄糖         40.0 

(NH₄)₂SO₄       10.0 

KH₂PO₄          1.0 

MgSO₄.7H₂O       0.4 

FeSO₄.7H₂O       0.02 

MnSO₄.5H₂O       0.02 

硫胺素HCl       0.0002 

酵母提取物     1.0 

CaCO₃           20.0 

L-异亮氨酸     0.05 

葡萄糖和硫酸镁分开灭菌。CaCO₃在180℃干热灭菌2h。pH调至7.0。灭菌后将抗生素加入培养基。

表1. 

如表1所示，glk基因表达的增强改进了菌株B-3996的L-苏氨酸生产能力。 

实施例2：从大肠杆菌中克隆pfkA基因，和pfkA基因的增强表达对于L-苏氨酸生产的作用。 

使用大肠杆菌菌株MG1655(VKPM B-6195)的染色体DNA作为模板和引物P3(SEQ ID NO：19)和P4(SEQ ID NO：20)通过PCR得到pfkA基因。引物P3含有引入其5’-端的BamHI限制酶的识别位点。引物P4含有引入其5’-端的SacI限制酶的识别位点。通过在+4℃过夜连接将所得到的含有pfkA基因的DNA片段(987bp)直接克隆入载体pCR2.1(Invitrogen)。然后将含有pfkA基因的BamHI-SacI DNA片段再克隆入质粒pMW119，该质粒事先被修饰以用λ噬菌体的启动子P_R取代启动子P_lac，然后用BamHI和SacI限制酶处理。由此构建了在启动子P_R控制下的含有pfkA基因的质粒pMW-P_R-pfkA。使用此质粒可实现非调控的高水平pfkA基因表达。 

将pMW-P_R-pfkA质粒导入链霉素-抗性的产苏氨酸大肠杆菌菌株B-3996(美国专利5,175,107)。由此，得到菌株B-3996(pMW-P_R-pfkA)。 

如上所述评价大肠杆菌菌株B-3996和B-3996(pMW-P_R-pfkA)的L-苏氨酸积累(参见实施例1)。结果在表2中提供。 

表2. 

由于在试管发酵中pfkA基因的增强表达对于L-苏氨酸生产的作用不显著，在具有1.0升容量的实验室发酵罐中进行批式发酵。 

为此目的，将大肠杆菌菌株VKPM-3996和VKPM-3996(pM-PR-pfkA)在37℃在含有链霉素(100μg/ml)的L-琼脂平板上生长18-24小时。然后将一接 种环细胞转移到50ml的L-肉汤，其组成如下：胰蛋白胨-10g/l，酵母提取物-5g/l，NaCl-5g/l。将在37℃在摇床(240rpm)上生长5小时内的细胞(50ml，OD₅₄₀-2o.u.)用于接种450ml的培养基用于发酵。批式发酵在在具有1.0升容量的实验室发酵罐中在通气(1/1vvm)及以1200rpm的速率搅拌下在37℃进行。使用8％氨水自动地将pH值保持在6.6。结果在表3中提供。 

发酵培养基的组成(g/l)： 

葡萄糖         100.0 

NH₄Cl          1.75 

KH₂PO₄         1.0 

MgSO₄.7H₂O     0.8 

FeSO₄.7H₂O     0.01 

MnSO₄.5H₂O     0.01 

Mameno(TN)     0.15 

甜菜碱(betaine)1.0 

L-异亮氨酸     0.2 

葡萄糖和硫酸镁分开灭菌。pH调至6.6。 

表3. 

 

如表3所示，pfkA基因表达的增强改进了菌株B-3996的L-苏氨酸生产能力。 

实施例3：从大肠杆菌中克隆fbaA基因，和fbaA基因的增强表达对于L-苏氨酸生产的作用。 

使用大肠杆菌菌株MG1655(VKPM B-6195)的染色体DNA作为模板和引物P5(SEQ ID NO：21)和P6(SEQ ID NO：22)通过PCR得到fbaA基因。引物P5含有引入其5’-端的BamHI限制酶的识别位点。引物P6含有引入其5’-端的SacI限制酶的识别位点。用BamHI和SacI限制酶处理所得到的含有fbaA 基因的DNA片段(1155bp)并克隆入质粒pMW119，该质粒事先被修饰以用λ噬菌体的启动子P_R取代启动子P_lac，然后用相同的限制酶处理。由此构建了在启动子P_R控制下的含有fbaA基因的质粒pMW-P_R-fbaA。使用此质粒可实现非调控的高水平fbaA基因表达。 

将pMW-P_R-fbaA质粒导入链霉素-抗性的产苏氨酸大肠杆菌菌株B-3996(美国专利5,175,107)。由此，得到菌株B-3996(pMW-P_R-fbaA)。 

如上所述评价大肠杆菌菌株B-3996和B-3996(pMW-P_R-fbaA)的L-苏氨酸积累(参见实施例1)。结果在表4中提供。 

表4. 

如表4所示，fbaA基因表达的增强改进了菌株B-3996的L-苏氨酸生产能力。 

实施例4：从大肠杆菌中克隆tpiA基因，和tpiA基因的增强表达对于L-苏氨酸生产的作用。 

使用大肠杆菌菌株MG1655(VKPM B-6195)的染色体DNA作为模板和引物P7(SEQ ID NO：23)和P8(SEQ ID NO：24)通过PCR得到tpiA基因。引物P7含有引入其5’-端的BamHI限制酶的识别位点。引物P8含有引入其5’-端的SacI限制酶的识别位点。用BamHI和SacI限制酶处理所得到的含有tpiA基因的DNA片段(774bp)并克隆入质粒pMW119，该质粒事先被修饰以用λ噬菌体的启动子P_R取代启动子P_lac，然后用相同的限制酶处理。由此构建了在启动子P_R控制下的含有tpiA基因的质粒pMW-P_R-tpiA。使用此质粒可实现非调控的高水平tpiA基因表达。 

将pMW-P_R-tpiA质粒导入链霉素-抗性的产苏氨酸大肠杆菌菌株B-3996(美国专利5,175,107)。由此，得到菌株B-3996(pMW-P_R-tpiA)。 

如上所述评价大肠杆菌菌株B-3996和B-3996(pMW-P_R-tpiA)的L-苏氨酸积累(参见实施例1)。结果在表5中提供。

表5. 

由于在试管发酵中tpiA基因的增强表达对于L-苏氨酸生产的作用不显著，如上所述在具有1.0升容量的实验室发酵罐中进行批式发酵(参见实施例2)。结果在表6中提供。 

表6. 

如表6所示，tpiA基因表达的增强改进了菌株B-3996的L-苏氨酸生产能力。 

实施例5：从大肠杆菌中克隆gapA基因，和gapA基因的增强表达对于L-苏氨酸生产的作用。 

为了研究gapA基因的增强表达对于L-苏氨酸生产的作用，将gapA基因克隆入质粒pMW119，处于源自大肠杆菌噬菌体T3的A3启动子的突变体合成启动子(A3m)的控制下(Yamada，M.等Promoter sequence analysis inBacillus and Escherichia coli：construction of strong promoter in E.coli.Gene，99(1)，109-114(1991))。引入A3启动子序列的突变导致此组成型聚合酶全酶Es⁷⁰-依赖性启动子的启动子强度降低。形成该突变体合成启动子A3m的寡核苷酸序列显示于SEQ ID NO：25和26。启动子A3m的结构描绘于图1。 

使用大肠杆菌菌株MG1655(VKPM B-6195)的染色体DNA作为模板和引物gapA-5′(SEQ ID NO：27)和gapA-ter(SEQ ID NO：28)通过PCR得到gapA基因。引物gapA-5′含有引入其5’-端的BamHI限制酶的识别位点。引物gapA-ter含有引入其5’-端的XbaI限制酶的识别位点。用BamHI和XbaI限制酶处理所得到的含有带5′-非翻译区直到P1起始转录位点(start transcriptionsite)且不带自身启动子区的gapA基因的DNA片段(1.2kbp)，与具有EcoRI和BamHI限制位点的粘性末端的合成A3m启动子连接，并克隆入事先用 EcoRI和XbaI限制酶处理的载体pMW119中。由此得到质粒pMW119-PA3m-gapA。通过测序确认gapA基因的结构。 

用质粒pMW119-PA3m-gapA转化大肠杆菌细胞HB101(Sambrook J.和Russell D.W.2001.Molecular cloning：a laboratory manual，3rd ed.Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)。菌株MG1655可由美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC33694)得到。并根据由Peng，L，和Shimizu，K.(Appl.Microbiol.Biotechnol.61，163-178(2003))描述的步骤测定菌株HB101和HB101(pMW-PA3m-gapA)中对数生长期的GAPDA活性。结果在表7中提供。 

表7. 

 

如表7所示，携带质粒的HB101细胞具有大于2-倍的更高的GAPDH活性。 

然后将pMW-PA3m-gapA质粒导入链霉素-抗性的产苏氨酸大肠杆菌菌株B-3996(美国专利5,175,107)。由此，得到菌株B-3996(pMW-PA3m-gapA)。 

大肠杆菌菌株B-3996和B-3996(pMW119-pA3-gapA)两者都在37℃在LB-琼脂平板上，或在菌株B-3996(pMW119-pA3-gapA)的情况下含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB-琼脂平板上过夜生长。然后将一接种环(OD595～2-3o.u.)每种菌株的过夜细胞培养物转移到2ml的基本的试管发酵培养基中，其组成如下：酵母提取物-2.0g/l，(NH₄)₂SO₄-16.0g/1，K₂HPO₄-0.7g/1，MgSO₄·7H₂O-1.0g/1，MnSO₄·5H₂O-0.01g/l，FeSO₄·7H₂O-0.01g/l，硫胺素HCl(B₁)-0.2mg/l，葡萄糖-4％，CaCO₃(白垩(chalk))-30.0g/l，L-异亮氨酸-50mg/l，氨苄青霉素-100μg/ml(仅仅在菌株3996(pMW119-pA3-gapA)的情况下)。将细胞在32℃在恒定旋转(250rpm)下生长48h。 

培养之后，通过纸层析(paper chromatography)测定培养基中L-苏氨酸的积累量。移动相具有如下组成：正丁醇(n-butanol)：乙酸：水＝4：1：1。通过含有CdCl₂(0.5％)的茚三酮的乙醇溶液(1％)将氨基酸着色。在37℃保温1小时后，在OD₅₀₈测定样品。结果在表8中提供。

表8. 

如表8所示，gapA基因表达的增强改进了菌株B-3996的L-苏氨酸生产能力。 

实施例6：从大肠杆菌中克隆eno基因，和eno基因的增强表达对于L-苏氨酸生产的作用。 

使用大肠杆菌菌株MG 1655(VKPM B-6195)的染色体DNA作为模板和引物P9(SEQ ID NO：29)和P10(SEQ ID NO：30)通过PCR得到eno基因。引物P9含有引入其5’-端的BamHI限制酶的识别位点。引物P10含有引入其5’-端的SacI限制酶的识别位点。用BamHI和SacI限制酶处理所得到的含有eno基因的DNA片段(1298bp)并克隆入质粒pMW119，该质粒事先被修饰以用λ噬菌体的启动子P_R取代启动子P_lac，然后用相同的限制酶处理。由此构建了在启动子P_R控制下的含有eno基因的质粒pMW-P_R-eno。使用此质粒可实现非调控的高水平eno基因表达。 

将pMW-P_R-eno质粒导入链霉素-抗性的产苏氨酸大肠杆菌菌株B-3996(美国专利5,175,107)。由此，得到菌株B-3996(pMW-P_R-eno)。 

如上所述评价大肠杆菌菌株B-3996和B-3996(pMW-P_R-eno)的L-苏氨酸积累(参见实施例1)。结果在表9中提供。 

表9. 

如表9所示，eno基因表达的增强改进了菌株B-3996的L-苏氨酸生产能力。 

实施例7：从大肠杆菌中克隆pgi基因，和pgi基因的增强表达对于L- 苏氨酸生产的作用。 

使用大肠杆菌菌株MG1655(VKPM B-6195)的染色体DNA作为模板和引物P11(SEQ ID NO：31)和P12(SEQ ID NO：32)通过PCR得到pgi基因。引物P11含有引入其5’-端的BamHI限制酶的识别位点。引物P12含有引入其5’-端的SacI限制酶的识别位点。用BamHI和SacI限制酶处理所得到的含有pgi基因的DNA片段(1657bp)并克隆入质粒pMW119，该质粒事先被修饰以用λ噬菌体的启动子P_R取代启动子P_lac然后用相同的限制酶处理。由此构建了在启动子P_R控制下的含有pgi基因的质粒pMW-P_R-pgi。使用此质粒可实现非调控的高水平pgi基因表达。 

将pMW-P_R-pgi质粒导入链霉素-抗性的产苏氨酸大肠杆菌菌株B-3996(美国专利5,175,107)。由此，得到菌株B-3996(pMW-P_R-pgi)。 

如上所述评价大肠杆菌菌株B-3996和B-3996(pMW-P_R-pgi)的L-苏氨酸积累(参见实施例1)。结果在表10中提供。 

表10. 

如表10所示，pgi基因表达的增强改进了菌株B-3996的L-苏氨酸生产能力。 

实施例8：从大肠杆菌中克隆pgk基因，和pgk基因的增强表达对于L-苏氨酸生产的作用。 

使用大肠杆菌菌株MG1655(VKPM B-6195)的染色体DNA作为模板和引物P13(SEQ ID NO：33)和P14(SEQ ID NO：34)通过PCR得到pgk基因。引物P13含有引入其5’-端的BamHI限制酶的识别位点。引物P14含有引入其5’-端的SacI限制酶的识别位点。用BamHI和SacI限制酶处理所得到的含有pgk基因的DNA片段(1163bp)并克隆入质粒pMW119，该质粒事先被修饰以用λ噬菌体的启动子P_R取代启动子P_lac，然后用相同的限制酶处理。由此构建了在启动子P_R控制下的含有pgk基因的质粒pMW-P_R-pgk。使用此质粒可实现非调控的高水平pgk基因表达。

将pMW-P_R-pgk质粒导入链霉素-抗性的产苏氨酸大肠杆菌菌株B-3996(美国专利5,175,107)。由此，得到菌株B-3996(pMW-P_R-pgk)。 

如上所述评价大肠杆菌菌株B-3996和B-3996(pMW-P_R-pgk)的L-苏氨酸积累(参见实施例1)。结果在表11中提供。 

表11. 

如表11所示，pgk基因表达的增强改进了菌株B-3996的L-苏氨酸生产能力。 

虽然已参考优选的实施方案详述了本发明，但对于本领域的技术人员来说显而易见的是，在不背离本发明的范围的前提下，可以进行各种改变并可以使用等效物(equivalent)。上述每篇文献以其整体并入本文作为参考。 

工业实用性 

根据本发明，可改进L-氨基酸如L-苏氨酸的生产。 

Claims (13)

1.产生L-苏氨酸的方法，其包括在培养基中培养产生L-苏氨酸的大肠杆菌以在培养基中产生并积累L-苏氨酸，并从培养基中收集L-苏氨酸，其中所述大肠杆菌已被修饰以增强一个编码糖酵解途径的酶的基因或编码它的核苷酸序列的表达，所述基因选自glk、pgi、pfkA、tpiA、gapA、pgk、eno和pykA，其中所述基因源自大肠杆菌，

其中所述glk、pgi、pfkA、tpiA、gapA、pgk、eno和pykA基因编码分别由SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14和16的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.根据权利要求1的方法，其中所述glk、pgi、pfkA、tpiA、gapA、pgk、eno和pykA基因分别由SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13和15的核苷酸序列组成。

3.根据权利要求1的方法，其中通过增加所述基因的拷贝数，或修饰所述基因的表达控制序列以便于增强所述基因的表达来增强一个基因的表达。

4.根据权利要求3的方法，其中通过用含有所述基因的低拷贝载体转化细菌来增加拷贝数。

5.根据权利要求1的方法，其中所述大肠杆菌已被进一步修饰以增强一个基因的表达，所述基因选自：

-突变体thrA基因，其编码抗苏氨酸反馈抑制的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I；

-thrB基因，其编码高丝氨酸激酶；

-thrC基因，其编码苏氨酸合酶；

-rhtA基因，其编码推定的跨膜蛋白质。

6.权利要求1的方法，其中所述大肠杆菌已被修饰以增强glk基因的表达，所述glk基因编码由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的蛋白质。

7.权利要求1的方法，其中所述大肠杆菌已被修饰以增强pgi基因的表达，所述pgi基因编码由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成的蛋白质。

8.权利要求1的方法，其中所述大肠杆菌已被修饰以增强pfkA基因的表达，所述pfkA基因编码由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成的蛋白质。

9.权利要求1的方法，其中所述大肠杆菌已被修饰以增强tpiA基因的表达，所述tpiA基因编码由SEQ ID NO：8的氨基酸序列组成的蛋白质。

10.权利要求1的方法，其中所述大肠杆菌已被修饰以增强gapA基因的表达，所述gapA基因编码由SEQ ID NO：10的氨基酸序列组成的蛋白质。

11.权利要求1的方法，其中所述大肠杆菌已被修饰以增强pgk基因的表达，所述pgk基因编码由SEQ ID NO：12的氨基酸序列组成的蛋白质。

12.权利要求1的方法，其中所述大肠杆菌已被修饰以增强eno基因的表达，所述eno基因编码由SEQ ID NO：14的氨基酸序列组成的蛋白质。

13.权利要求1的方法，其中所述大肠杆菌已被修饰以增强pykA基因的表达，所述pykA基因编码由SEQ ID NO：16的氨基酸序列组成的蛋白质。