JP2003204783A - 発酵法による目的物質の製造法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 Ｌ−アミノ酸、抗生物質、ビタミン、成長因
子、生理活性物質などの目的物質を微生物を利用して製
造する方法において、従来の方法と異なる原理によって
目的物質の生産性を改善する方法を提供する。 【解決手段】 微生物を培地中に培養し、該培地中に目
的物質を生成蓄積させ、該目的物質を採取する、微生物
を利用した目的物質の製造法において、前記微生物とし
て、目的物質の生産能を有し、かつ、ＲＮＡポリメラー
ゼ活性が増強された微生物を用いることにより、目的物
質の生産性を改善する。
子、生理活性物質などの目的物質を微生物を利用して製
造する方法において、従来の方法と異なる原理によって
目的物質の生産性を改善する方法を提供する。 【解決手段】 微生物を培地中に培養し、該培地中に目
的物質を生成蓄積させ、該目的物質を採取する、微生物
を利用した目的物質の製造法において、前記微生物とし
て、目的物質の生産能を有し、かつ、ＲＮＡポリメラー
ゼ活性が増強された微生物を用いることにより、目的物
質の生産性を改善する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、微生物を利用した
目的物質の製造法に関し、詳しくは、Ｌ−アミノ酸、抗
生物質、ビタミン、成長因子、生理活性物質などの目的
物質を微生物を利用して製造する方法において、目的物
質の生産性を改善するための手段を開示するものであ
る。
目的物質の製造法に関し、詳しくは、Ｌ−アミノ酸、抗
生物質、ビタミン、成長因子、生理活性物質などの目的
物質を微生物を利用して製造する方法において、目的物
質の生産性を改善するための手段を開示するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】微生物を利用した物質の製造法の代表的
なものとして発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法が知ら
れている。Ｌ−アミノ酸は、調味料や、食品として用い
られるだけでなく、医療を目的とする様々な栄養混合物
のコンポーネントとして利用される。さらに、動物用飼
料添加物として、製薬業および化学工業における試薬と
して、微生物によるＬ−リジンやＬ−ホモセリンなどの
Ｌ−アミノ酸産生のための成長因子として利用される。
発酵法によってＬ−アミノ酸を製造できる微生物として
は、コリネ型細菌、エシェリヒア属細菌、バチルス属細
菌、セラチア属細菌等が知られている。
なものとして発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法が知ら
れている。Ｌ−アミノ酸は、調味料や、食品として用い
られるだけでなく、医療を目的とする様々な栄養混合物
のコンポーネントとして利用される。さらに、動物用飼
料添加物として、製薬業および化学工業における試薬と
して、微生物によるＬ−リジンやＬ−ホモセリンなどの
Ｌ−アミノ酸産生のための成長因子として利用される。
発酵法によってＬ−アミノ酸を製造できる微生物として
は、コリネ型細菌、エシェリヒア属細菌、バチルス属細
菌、セラチア属細菌等が知られている。
【０００３】発酵法によってＬ−アミノ酸を製造するに
は、野生型微生物（野生株）を用いる方法、野生株から
誘導された栄養要求株を用いる方法、野生株から種々の
薬剤耐性変異株として誘導された代謝調節変異株を用い
る方法、栄養要求株と代謝調節変異株の両方の性質を持
った株を用いる方法等がある。
は、野生型微生物（野生株）を用いる方法、野生株から
誘導された栄養要求株を用いる方法、野生株から種々の
薬剤耐性変異株として誘導された代謝調節変異株を用い
る方法、栄養要求株と代謝調節変異株の両方の性質を持
った株を用いる方法等がある。
【０００４】さらに近年はＬ−アミノ酸の発酵生産に、
組換えＤＮＡ技術を用いることが行われてきた。この技
術ではＬ−アミノ酸生合成系酵素をコードする遺伝子を
増強することにより宿主微生物のＬ−アミノ酸生合成系
を強化することを、その原理としている。これらの事情
については例えば「アミノ酸発酵 学会出版センター１
９８６年」に解説されている。
組換えＤＮＡ技術を用いることが行われてきた。この技
術ではＬ−アミノ酸生合成系酵素をコードする遺伝子を
増強することにより宿主微生物のＬ−アミノ酸生合成系
を強化することを、その原理としている。これらの事情
については例えば「アミノ酸発酵 学会出版センター１
９８６年」に解説されている。
【０００５】また、Ｌ−アミノ酸以外にも微生物を用い
た発酵法で生産されている物質は多い。例えば抗生物質
や、ビタミン等もその例である。これらの物質の発酵生
産においても、組換えＤＮＡ技術の利用は、目的物質又
はその前駆体の生合成系酵素をコードする遺伝子の増強
が主なものである。
た発酵法で生産されている物質は多い。例えば抗生物質
や、ビタミン等もその例である。これらの物質の発酵生
産においても、組換えＤＮＡ技術の利用は、目的物質又
はその前駆体の生合成系酵素をコードする遺伝子の増強
が主なものである。
【０００６】上記のような微生物の育種技術により、目
的物質の生産性は著しく改善されてきている。一方、微
生物が産生する物質は、その物質の生合成系以外にも種
々の生化学的反応の影響を受け、微生物の生育によって
も左右される。したがって、目的物質の生産効率を向上
させるために、培地や培養方法等の培養条件に関する検
討が種々行われている。しかし、ＲＮＡポリメラーゼ活
性と微生物の生育や目的物質の生産性との関係について
は、検討がなされていない。
的物質の生産性は著しく改善されてきている。一方、微
生物が産生する物質は、その物質の生合成系以外にも種
々の生化学的反応の影響を受け、微生物の生育によって
も左右される。したがって、目的物質の生産効率を向上
させるために、培地や培養方法等の培養条件に関する検
討が種々行われている。しかし、ＲＮＡポリメラーゼ活
性と微生物の生育や目的物質の生産性との関係について
は、検討がなされていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、Ｌ−アミノ
酸、抗生物質、ビタミン、成長因子、生理活性物質など
の目的物質を微生物を利用して製造する方法において、
従来の方法と異なる原理によって目的物質の生産性を改
善する方法を提供することを課題とする。
酸、抗生物質、ビタミン、成長因子、生理活性物質など
の目的物質を微生物を利用して製造する方法において、
従来の方法と異なる原理によって目的物質の生産性を改
善する方法を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意研究を行った結果、微生物のＲＮＡ
ポリメラーゼ活性を増強すると、同微生物の生育が向上
し、目的物質の生産量が増大することを見出し、本発明
を完成するに至った。すなわち本発明は、以下のとおり
である。
解決するために鋭意研究を行った結果、微生物のＲＮＡ
ポリメラーゼ活性を増強すると、同微生物の生育が向上
し、目的物質の生産量が増大することを見出し、本発明
を完成するに至った。すなわち本発明は、以下のとおり
である。
【０００９】（１）目的物質の生産能を有し、かつ、Ｒ
ＮＡポリメラーゼ活性が増強された微生物。 （２）前記目的物質がＬ−アミノ酸である（１）の微生
物。 （３）ＲＮＡポリメラーゼ活性の増強が、ｒｐｏＡ、ｒ
ｐｏＢ、ｒｐｏＣ及びｒｐｏＤの各遺伝子のコピー数を
高めることによるものである（１）の微生物。 （４）微生物がエシェリヒア属細菌又はコリネ型細菌で
ある（１）の微生物。 （５）前記（１）〜（４）のいずれかの微生物を培地に
培養し、該培養物中に目的物質を生成蓄積せしめ、該培
養物から目的物質を採取することを特徴とする目的物質
の製造法。
ＮＡポリメラーゼ活性が増強された微生物。 （２）前記目的物質がＬ−アミノ酸である（１）の微生
物。 （３）ＲＮＡポリメラーゼ活性の増強が、ｒｐｏＡ、ｒ
ｐｏＢ、ｒｐｏＣ及びｒｐｏＤの各遺伝子のコピー数を
高めることによるものである（１）の微生物。 （４）微生物がエシェリヒア属細菌又はコリネ型細菌で
ある（１）の微生物。 （５）前記（１）〜（４）のいずれかの微生物を培地に
培養し、該培養物中に目的物質を生成蓄積せしめ、該培
養物から目的物質を採取することを特徴とする目的物質
の製造法。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明により製造される目的物質は、微生物によって生
産され得る物質であれば特に制限されず、例えばＬ−ス
レオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ロイシ
ン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−フェニルアラ
ニン等の種々のＬ−アミノ酸が挙げられる。その他に
も、グアニル酸、イノシン酸等の核酸類、ビタミン類、
抗生物質、成長因子、生理活性物質など、微生物により
生合成される物質が挙げられる。また、現在微生物を利
用して生産されていない物質であっても、微生物によっ
て生産され得るものであれば本願発明が利用できること
はいうまでもない。
本発明により製造される目的物質は、微生物によって生
産され得る物質であれば特に制限されず、例えばＬ−ス
レオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ロイシ
ン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−フェニルアラ
ニン等の種々のＬ−アミノ酸が挙げられる。その他に
も、グアニル酸、イノシン酸等の核酸類、ビタミン類、
抗生物質、成長因子、生理活性物質など、微生物により
生合成される物質が挙げられる。また、現在微生物を利
用して生産されていない物質であっても、微生物によっ
て生産され得るものであれば本願発明が利用できること
はいうまでもない。
【００１１】本発明に用いる微生物は特に制限されず、
従来発酵法による有用物質の生産に用いられている微生
物であれば使用することができる。また、従来、産業上
利用されていない微生物であっても、目的物質を生産す
る能力を有する限り、本発明を適用することができる。
本発明の微生物は、本来目的物質を生産する能力を有す
るものであってもよいし、変異法や組換えＤＮＡ技術な
どを利用した育種により目的物質を生産する能力を付与
されたものであってもよい。
従来発酵法による有用物質の生産に用いられている微生
物であれば使用することができる。また、従来、産業上
利用されていない微生物であっても、目的物質を生産す
る能力を有する限り、本発明を適用することができる。
本発明の微生物は、本来目的物質を生産する能力を有す
るものであってもよいし、変異法や組換えＤＮＡ技術な
どを利用した育種により目的物質を生産する能力を付与
されたものであってもよい。
【００１２】具体的には、エシェリヒア・コリ等のエシ
ェリヒア属細菌、ブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタム等のコリネ型細菌、バチルス・サブチリス等のバ
チルス属細菌、セラチア・マルセッセンス等のセラチア
属細菌等が挙げられるが、これらに制限されない。
ェリヒア属細菌、ブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタム等のコリネ型細菌、バチルス・サブチリス等のバ
チルス属細菌、セラチア・マルセッセンス等のセラチア
属細菌等が挙げられるが、これらに制限されない。
【００１３】より具体的には以下の菌株が挙げられる。
例えば目的物質がＬ−スレオニンの場合はエシェリヒア
・コリVKPM B-3996(RIA 1867)(米国特許第5,175,107号
参照）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム A
J12318（FERM BP-1172)(米国特許第5,188,949号参照）
等であり、Ｌ−リジンの場合はエシェリヒア・コリ AJ1
1442（NRRL B-12185, FERM BP-1543)(米国特許第4,346,
170号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タムAJ11082（NRRL B-11470）、ブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタム AJ3990（ATCC31269)(米国特許第
4,066,501号参照）等であり、Ｌ−グルタミン酸の場合
はエシェリヒア・コリ AJ12624 (FERM BP-3853)(フラン
ス特許出願公開第2,680,178号参照）、ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムAJ12475（FERM BP-2922)
(米国特許第5,272,067号参照）等であり、Ｌ−ロイシン
の場合はエシェリヒア・コリ AJ11478（FERM P-5274)
(特公昭62-34397号参照）、ブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタム AJ3718（FERMP-2516)(米国特許第3,9
70,519号参照）等であり、Ｌ−イソロイシンの場合はエ
シェリヒア・コリKX141（VKPM B-4781）(欧州特許出願
公開第519,113号参照）、ブレビバクテリウム・フラバ
ム AJ12149（FERM BP-759)(米国特許第4,656,135号参
照）等であり、Ｌ−バリンの場合はエシェリヒア・コリ
VL1970（VKPM B-4411)）(欧州特許出願公開第519,113
号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
AJ12341（FERM BP-1763)(米国特許第5,188,948号参
照）等であり、Ｌ−フェニルアラニンの場合は、エシェ
リヒア・コリ AJ12604（FERM BP-3579)(欧州特許出願公
開第 488,424号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトフ
ァーメンタム AJ12637（FERM BP-4160)(フランス特許出
願公開第 2,686,898号参照）等である。
例えば目的物質がＬ−スレオニンの場合はエシェリヒア
・コリVKPM B-3996(RIA 1867)(米国特許第5,175,107号
参照）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム A
J12318（FERM BP-1172)(米国特許第5,188,949号参照）
等であり、Ｌ−リジンの場合はエシェリヒア・コリ AJ1
1442（NRRL B-12185, FERM BP-1543)(米国特許第4,346,
170号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タムAJ11082（NRRL B-11470）、ブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタム AJ3990（ATCC31269)(米国特許第
4,066,501号参照）等であり、Ｌ−グルタミン酸の場合
はエシェリヒア・コリ AJ12624 (FERM BP-3853)(フラン
ス特許出願公開第2,680,178号参照）、ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムAJ12475（FERM BP-2922)
(米国特許第5,272,067号参照）等であり、Ｌ−ロイシン
の場合はエシェリヒア・コリ AJ11478（FERM P-5274)
(特公昭62-34397号参照）、ブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタム AJ3718（FERMP-2516)(米国特許第3,9
70,519号参照）等であり、Ｌ−イソロイシンの場合はエ
シェリヒア・コリKX141（VKPM B-4781）(欧州特許出願
公開第519,113号参照）、ブレビバクテリウム・フラバ
ム AJ12149（FERM BP-759)(米国特許第4,656,135号参
照）等であり、Ｌ−バリンの場合はエシェリヒア・コリ
VL1970（VKPM B-4411)）(欧州特許出願公開第519,113
号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
AJ12341（FERM BP-1763)(米国特許第5,188,948号参
照）等であり、Ｌ−フェニルアラニンの場合は、エシェ
リヒア・コリ AJ12604（FERM BP-3579)(欧州特許出願公
開第 488,424号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトフ
ァーメンタム AJ12637（FERM BP-4160)(フランス特許出
願公開第 2,686,898号参照）等である。
【００１４】本発明に用いる微生物は、目的物質の産生
能を有し、かつ、ＲＮＡポリメラーゼ活性が増強された
微生物である。ＲＮＡポリメラーゼは、α、β、β’及
びσの各サブユニットから構成され、α、β、β’は各
々ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣの各遺伝子によりコー
ドされている。エシェリヒア・コリでは、ｒｐｏＢ及び
ｒｐｏＣはオペロンを形成している。また、σサブユニ
ットは、複数種存在し、エシェリヒア・コリではσ32、
σ72等が知られており、それぞれｒｐｏＨ、ｒｐｏＤに
よりコードされている。これらのうち、ｒｐｏＤは増殖
期に特異的に機能するものであり、本発明には好まし
い。
能を有し、かつ、ＲＮＡポリメラーゼ活性が増強された
微生物である。ＲＮＡポリメラーゼは、α、β、β’及
びσの各サブユニットから構成され、α、β、β’は各
々ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣの各遺伝子によりコー
ドされている。エシェリヒア・コリでは、ｒｐｏＢ及び
ｒｐｏＣはオペロンを形成している。また、σサブユニ
ットは、複数種存在し、エシェリヒア・コリではσ32、
σ72等が知られており、それぞれｒｐｏＨ、ｒｐｏＤに
よりコードされている。これらのうち、ｒｐｏＤは増殖
期に特異的に機能するものであり、本発明には好まし
い。
【００１５】ＲＮＡポリメラーゼ活性を増強するには、
ＲＮＡポリメラーゼの各サブユニットをコードする遺伝
子断片を、目的の微生物で機能するベクター、好ましく
はマルチコピー型ベクターと連結して組換えＤＮＡを作
製し、これを目的微生物に導入して形質転換すればよ
い。各遺伝子の細胞内のコピー数が上昇する結果、ＲＮ
Ａポリメラーゼ活性が増強される。
ＲＮＡポリメラーゼの各サブユニットをコードする遺伝
子断片を、目的の微生物で機能するベクター、好ましく
はマルチコピー型ベクターと連結して組換えＤＮＡを作
製し、これを目的微生物に導入して形質転換すればよ
い。各遺伝子の細胞内のコピー数が上昇する結果、ＲＮ
Ａポリメラーゼ活性が増強される。
【００１６】ＲＮＡポリメラーゼの各サブユニットをコ
ードする遺伝子としては、エシェリヒア・コリ等のエシ
ェリヒア属細菌、コリネ型細菌等、いずれの微生物の遺
伝子も用いることができる。エシェリヒア・コリではｒ
ｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ、ｒｐｏＤの各遺伝子の塩
基配列は明らかにされているので（ｒｐｏＡ：GenBank/
EMBL/DDBJ Accession J01685、ｒｐｏＢ，ｒｐｏＣ：Ge
nBank/EMBL/DDBJ Accession J01678、ｒｐｏＤ：GenBan
k/EMBL/DDBJ Accession J01687）、これらの塩基配列に
基づいてプライマーを合成し、エシェリヒア・コリの染
色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により取得することが
可能である。
ードする遺伝子としては、エシェリヒア・コリ等のエシ
ェリヒア属細菌、コリネ型細菌等、いずれの微生物の遺
伝子も用いることができる。エシェリヒア・コリではｒ
ｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ、ｒｐｏＤの各遺伝子の塩
基配列は明らかにされているので（ｒｐｏＡ：GenBank/
EMBL/DDBJ Accession J01685、ｒｐｏＢ，ｒｐｏＣ：Ge
nBank/EMBL/DDBJ Accession J01678、ｒｐｏＤ：GenBan
k/EMBL/DDBJ Accession J01687）、これらの塩基配列に
基づいてプライマーを合成し、エシェリヒア・コリの染
色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により取得することが
可能である。
【００１７】ｒｐｏＡ遺伝子を増幅するためのプライマ
ーとしては配列番号１及び２に示すプライマーが、ｒｐ
ｏＢＣオペロンを増幅するためのプライマーとしては配
列番号３及び４に示すプライマーが、ｒｐｏＤ遺伝子を
増幅するためのプライマーとしては配列番号５及び６に
示すプライマーが挙げられる。
ーとしては配列番号１及び２に示すプライマーが、ｒｐ
ｏＢＣオペロンを増幅するためのプライマーとしては配
列番号３及び４に示すプライマーが、ｒｐｏＤ遺伝子を
増幅するためのプライマーとしては配列番号５及び６に
示すプライマーが挙げられる。
【００１８】ＰＣＲ法により増幅された各遺伝子は、エ
シェリヒア・コリやコリネ型細菌等細胞内において自律
複製可能なベクターＤＮＡに接続して組換えＤＮＡを調
製し、これをエシェリヒア・コリ細胞に導入しておく
と、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞
内において自律複製可能なベクターとしては、プラスミ
ドベクターが好ましく、宿主の細胞内で自立複製可能な
ものが好ましく、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG29
9、pHSG399、pHSG398、RSF1010等が挙げられる。
シェリヒア・コリやコリネ型細菌等細胞内において自律
複製可能なベクターＤＮＡに接続して組換えＤＮＡを調
製し、これをエシェリヒア・コリ細胞に導入しておく
と、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞
内において自律複製可能なベクターとしては、プラスミ
ドベクターが好ましく、宿主の細胞内で自立複製可能な
ものが好ましく、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG29
9、pHSG399、pHSG398、RSF1010等が挙げられる。
【００１９】コリネ型細菌の細胞内において自律複製可
能なベクターとしては、pAM330（特開昭58-67699号公報
参照）、pHM1519（特開昭58-77895号公報参照）等が挙
げられる。また、これらのベクターからコリネ型細菌中
でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断
片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに
挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両
方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使
用することができる。
能なベクターとしては、pAM330（特開昭58-67699号公報
参照）、pHM1519（特開昭58-77895号公報参照）等が挙
げられる。また、これらのベクターからコリネ型細菌中
でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断
片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに
挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両
方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使
用することができる。
【００２０】このようなシャトルベクターとしては、以
下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクターを保持
する微生物及び国際寄託機関の受託番号をかっこ内に示
した。
下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクターを保持
する微生物及び国際寄託機関の受託番号をかっこ内に示
した。
【００２１】これらのベクターは、寄託微生物から次の
ようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリ
ゾチーム及びＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで
遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリ
コールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロ
マイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
ようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリ
ゾチーム及びＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで
遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリ
コールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロ
マイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
【００２２】ＲＮＡポリメラーゼの各サブユニットをコ
ードする遺伝子とベクターを連結して組換えＤＮＡを調
製するには、各遺伝子を含むＤＮＡ断片の末端に合うよ
うな制限酵素でベクターを切断し、同ＤＮＡ断片とベク
ターを連結する。連結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガ
ーゼを用いて行うのが普通である。各サブユニットをコ
ードする遺伝子は、単一のベクターにすべてを挿入して
もよく、異なる２種又は３種以上のベクターに別々に挿
入してもよい。後記実施例では、ｒｐｏＡ遺伝子及びｒ
ｐｏＢＣオペロンを同一のベクターに挿入して得た組換
えベクターと、ｒｐｏＤ遺伝子を別のベクターに挿入し
て得た組換えベクターの２種の組換えベクターを用い
て、コリネ型細菌にこれらの各遺伝子を導入した。
ードする遺伝子とベクターを連結して組換えＤＮＡを調
製するには、各遺伝子を含むＤＮＡ断片の末端に合うよ
うな制限酵素でベクターを切断し、同ＤＮＡ断片とベク
ターを連結する。連結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガ
ーゼを用いて行うのが普通である。各サブユニットをコ
ードする遺伝子は、単一のベクターにすべてを挿入して
もよく、異なる２種又は３種以上のベクターに別々に挿
入してもよい。後記実施例では、ｒｐｏＡ遺伝子及びｒ
ｐｏＢＣオペロンを同一のベクターに挿入して得た組換
えベクターと、ｒｐｏＤ遺伝子を別のベクターに挿入し
て得た組換えベクターの２種の組換えベクターを用い
て、コリネ型細菌にこれらの各遺伝子を導入した。
【００２３】上記のように調製した組換えＤＮＡを微生
物に導入して形質転換するには、これまでに報告されて
いる用いる微生物に応じた形質転換法に従って行えばよ
い。例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２について報
告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処
理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,
A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス
・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階
の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入す
る方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Ge
ne, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズ
ブチリス、放線菌類及び酵母について知られているよう
な、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り
込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にし
て組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Chang,
S.and Choen,S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (197
9);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature, 27
4, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用で
きる。コリネ型細菌には、電気パルス法（特開平2-2077
91号公報参照）が有効である。
物に導入して形質転換するには、これまでに報告されて
いる用いる微生物に応じた形質転換法に従って行えばよ
い。例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２について報
告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処
理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,
A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス
・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階
の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入す
る方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Ge
ne, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズ
ブチリス、放線菌類及び酵母について知られているよう
な、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り
込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にし
て組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Chang,
S.and Choen,S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (197
9);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature, 27
4, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用で
きる。コリネ型細菌には、電気パルス法（特開平2-2077
91号公報参照）が有効である。
【００２４】ＲＮＡポリメラーゼ活性の増強は、ＲＮＡ
ポリメラーゼの各サブユニットをコードする遺伝子を微
生物の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっ
ても達成できる。微生物の染色体ＤＮＡ上にＤＮＡ断片
を多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー
存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。
染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペ
ッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーテ
ィッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-10
9985号公報に開示されているように、ＲＮＡポリメラー
ゼの各サブユニットをコードする遺伝子をトランスポゾ
ンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピ
ー導入することも可能である。いずれの方法によっても
形質転換株内のＲＮＡポリメラーゼの各サブユニットを
コードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、ＲＮＡポ
リメラーゼ活性が増殖される。
ポリメラーゼの各サブユニットをコードする遺伝子を微
生物の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっ
ても達成できる。微生物の染色体ＤＮＡ上にＤＮＡ断片
を多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー
存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。
染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペ
ッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーテ
ィッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-10
9985号公報に開示されているように、ＲＮＡポリメラー
ゼの各サブユニットをコードする遺伝子をトランスポゾ
ンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピ
ー導入することも可能である。いずれの方法によっても
形質転換株内のＲＮＡポリメラーゼの各サブユニットを
コードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、ＲＮＡポ
リメラーゼ活性が増殖される。
【００２５】ＲＮＡポリメラーゼ活性の増強は、上記の
遺伝子増幅による以外に、ＲＮＡポリメラーゼの各サブ
ユニットをコードする遺伝子のプロモーター等の発現調
節配列を強力なものに置換することによっても達成され
る（特開平1-215280号公報参照）。たとえば、ｌａｃプ
ロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモータ
ー、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰRプロモ
ーター、ＰLプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ａｍ
ｙＥプロモーター、ｓｐａｃプロモーター等が強力なプ
ロモーターとして知られている。これらのプロモーター
への置換により、ＲＮＡポリメラーゼの各サブユニット
をコードする遺伝子の発現が強化されることによってＲ
ＮＡポリメラーゼ活性が増殖される。発現調節配列の増
強は、各遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせて
もよい。
遺伝子増幅による以外に、ＲＮＡポリメラーゼの各サブ
ユニットをコードする遺伝子のプロモーター等の発現調
節配列を強力なものに置換することによっても達成され
る（特開平1-215280号公報参照）。たとえば、ｌａｃプ
ロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモータ
ー、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰRプロモ
ーター、ＰLプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ａｍ
ｙＥプロモーター、ｓｐａｃプロモーター等が強力なプ
ロモーターとして知られている。これらのプロモーター
への置換により、ＲＮＡポリメラーゼの各サブユニット
をコードする遺伝子の発現が強化されることによってＲ
ＮＡポリメラーゼ活性が増殖される。発現調節配列の増
強は、各遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせて
もよい。
【００２６】本発明の微生物は、本発明の効果が損なわ
れない限り、ＲＮＡポリメラーゼ活性が増強されている
ことに加えて、目的物質の生合成系酵素が増強されてい
るなど、他の性質が付与されていてもよい。目的物質の
生合成系酵素としては、例えば目的物質がＬ−グルタミ
ン酸である場合には、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、
グルタミンシンテターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イ
ソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラター
ゼ、クエン酸シンターゼ、ピルビン酸カルボキシラー
ゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、エノ
ラーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセリン酸
キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルクトース
ビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グ
ルコースリン酸イソメラーゼ等がある。
れない限り、ＲＮＡポリメラーゼ活性が増強されている
ことに加えて、目的物質の生合成系酵素が増強されてい
るなど、他の性質が付与されていてもよい。目的物質の
生合成系酵素としては、例えば目的物質がＬ−グルタミ
ン酸である場合には、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、
グルタミンシンテターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イ
ソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラター
ゼ、クエン酸シンターゼ、ピルビン酸カルボキシラー
ゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、エノ
ラーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセリン酸
キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルクトース
ビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グ
ルコースリン酸イソメラーゼ等がある。
【００２７】また、本発明の微生物は、目的物質の生合
成経路から分岐して目的物質以外の化合物を生成する反
応を触媒する酵素の活性が低下あるいは欠損していても
よい。例えば、目的物質がＬ−グルタミン酸である場合
には、前記酵素としては、α−ケトグルタル酸デヒドロ
ゲナーゼ、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトラ
ンスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シ
ンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトラン
スフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−グルタミン
酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼ
等が挙げられる。
成経路から分岐して目的物質以外の化合物を生成する反
応を触媒する酵素の活性が低下あるいは欠損していても
よい。例えば、目的物質がＬ−グルタミン酸である場合
には、前記酵素としては、α−ケトグルタル酸デヒドロ
ゲナーゼ、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトラ
ンスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シ
ンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトラン
スフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−グルタミン
酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼ
等が挙げられる。
【００２８】さらに、本発明の微生物は、目的物質の生
産にとって好ましい他の性質が付与されていてもよい。
例えば目的物質がＬ−グルタミン酸であり、微生物がコ
リネ型細菌である場合には、界面活性剤等のビオチン作
用抑制物質に対する温度感受性変異を付与することによ
り、過剰量のビオチンを含有する培地中にてビオチン作
用抑制物質の非存在下でＬ−グルタミン酸を生産させる
ことができる（WO96/06180号参照）。このようなコリネ
型細菌としては、WO96/06180号に記載されているブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029が挙げら
れる。AJ13029株は、1994年９月２日付けで工業技術院
生命工学工業技術研究所に、受託番号FERMP-14501とし
て寄託され、１９９５年８月１日にブダペスト条約に基
づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5189が付与
されている。
産にとって好ましい他の性質が付与されていてもよい。
例えば目的物質がＬ−グルタミン酸であり、微生物がコ
リネ型細菌である場合には、界面活性剤等のビオチン作
用抑制物質に対する温度感受性変異を付与することによ
り、過剰量のビオチンを含有する培地中にてビオチン作
用抑制物質の非存在下でＬ−グルタミン酸を生産させる
ことができる（WO96/06180号参照）。このようなコリネ
型細菌としては、WO96/06180号に記載されているブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029が挙げら
れる。AJ13029株は、1994年９月２日付けで工業技術院
生命工学工業技術研究所に、受託番号FERMP-14501とし
て寄託され、１９９５年８月１日にブダペスト条約に基
づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5189が付与
されている。
【００２９】また、Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸生
産能を有するコリネ型細菌に、ビオチン作用抑制物質に
対する温度感受性変異を付与することにより、過剰量の
ビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質の
非存在下でＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸を同時生産
させることができる（WO96/06180号参照）。このような
菌株としては、WO96/06180号に記載されているブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタムAJ12993株が挙げら
れる。同株は１９９４年６月３日付けで工業技術院生命
工学工業技術研究所に、受託番号FERM P-14348で寄託さ
れ、１９９５年８月１日にブダペスト条約に基づく国際
寄託に移管され、受託番号FERM BP-5188が付与されてい
る。
産能を有するコリネ型細菌に、ビオチン作用抑制物質に
対する温度感受性変異を付与することにより、過剰量の
ビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質の
非存在下でＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸を同時生産
させることができる（WO96/06180号参照）。このような
菌株としては、WO96/06180号に記載されているブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタムAJ12993株が挙げら
れる。同株は１９９４年６月３日付けで工業技術院生命
工学工業技術研究所に、受託番号FERM P-14348で寄託さ
れ、１９９５年８月１日にブダペスト条約に基づく国際
寄託に移管され、受託番号FERM BP-5188が付与されてい
る。
【００３０】本発明の微生物の構築に必要な染色体ＤＮ
Ａの調製、遺伝子断片とプラスミドとの連結、ＰＣＲ、
プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質
転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設
定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を
採用することができる。これらの方法は、Sambrook,J.,
Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Clon
ing A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されて
いる。
Ａの調製、遺伝子断片とプラスミドとの連結、ＰＣＲ、
プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質
転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設
定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を
採用することができる。これらの方法は、Sambrook,J.,
Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Clon
ing A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されて
いる。
【００３１】上記のようにして目的物質の生産能が向上
した微生物を培地中に培養し、該培地中に目的物質を生
成蓄積せしめ、該培養物から目的物質を採取することに
より、目的物質を製造することができる。
した微生物を培地中に培養し、該培地中に目的物質を生
成蓄積せしめ、該培養物から目的物質を採取することに
より、目的物質を製造することができる。
【００３２】培地は、使用する微生物に応じて従来より
用いられてきた周知の培地を用いてかまわない。つま
り、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他
の有機成分を含有する通常の培地である。本発明を実施
するための特別な培地は特に必要とされない。
用いられてきた周知の培地を用いてかまわない。つま
り、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他
の有機成分を含有する通常の培地である。本発明を実施
するための特別な培地は特に必要とされない。
【００３３】炭素源としては、グルコース、ラクトー
ス、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解
物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアル
コール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸
類等を用いることができる。
ス、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解
物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアル
コール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸
類等を用いることができる。
【００３４】窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウ
ム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガ
ス、アンモニア水等を用いることができる。
アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウ
ム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガ
ス、アンモニア水等を用いることができる。
【００３５】有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、
Ｌ−ホモセリン、Ｌ−チロシンなどの要求物質または酵
母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの
他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウ
ム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
Ｌ−ホモセリン、Ｌ−チロシンなどの要求物質または酵
母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの
他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウ
ム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００３６】培養は、利用される微生物に応じて従来よ
り用いられてきた周知の条件で行ってかまわない。例え
ば、好気的条件下で１６〜１２０時間培養を実施するの
がよく、培養温度は２５℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５
〜８に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の
酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を
使用することができる。
り用いられてきた周知の条件で行ってかまわない。例え
ば、好気的条件下で１６〜１２０時間培養を実施するの
がよく、培養温度は２５℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５
〜８に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の
酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を
使用することができる。
【００３７】培養終了後の培地液からの目的物質の採取
は、本願発明において特別な方法が必要とされることは
ない。すなわち、本発明は従来より周知となっているイ
オン交換樹脂法、沈澱法その他の方法を組み合わせるこ
とにより実施できる。
は、本願発明において特別な方法が必要とされることは
ない。すなわち、本発明は従来より周知となっているイ
オン交換樹脂法、沈澱法その他の方法を組み合わせるこ
とにより実施できる。
【００３８】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。
説明する。
【００３９】＜１＞エシェリヒア・コリのＲＮＡポリメ
ラーゼ遺伝子の単離とＲＮＡポリメラーゼ遺伝子導入用
プラスミドの作製 E. coli W3110株の全ゲノムＤＮＡを、斎藤、三浦の方
法（Biochem.Biophys.Acta.,72,619(1963)）により調製
した。このゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによりＲ
ＮＡポリメラーゼの各サブユニットをコードする遺伝子
を増幅した。
ラーゼ遺伝子の単離とＲＮＡポリメラーゼ遺伝子導入用
プラスミドの作製 E. coli W3110株の全ゲノムＤＮＡを、斎藤、三浦の方
法（Biochem.Biophys.Acta.,72,619(1963)）により調製
した。このゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによりＲ
ＮＡポリメラーゼの各サブユニットをコードする遺伝子
を増幅した。
【００４０】プライマーは、公知のＲＮＡポリメラーゼ
サブユニット遺伝子の塩基配列（ｒｐｏＡ：GenBank/EM
BL/DDBJ Accession J01685、ｒｐｏＢ，ｒｐｏＣ：GenB
ank/EMBL/DDBJ Accession J01678、ｒｐｏＤ：GenBank/
EMBL/DDBJ Accession J01687）に基づいて合成した。
サブユニット遺伝子の塩基配列（ｒｐｏＡ：GenBank/EM
BL/DDBJ Accession J01685、ｒｐｏＢ，ｒｐｏＣ：GenB
ank/EMBL/DDBJ Accession J01678、ｒｐｏＤ：GenBank/
EMBL/DDBJ Accession J01687）に基づいて合成した。
【００４１】ｒｐｏＡ遺伝子を増幅するためのプライマ
ーとして配列番号１及び２に示すプライマーを、ｒｐｏ
ＢＣオペロンを増幅するためのプライマーとして配列番
号３及び４に示すプライマーを、ｒｐｏＤ遺伝子を増幅
するためのプライマーとして配列番号５及び６に示すプ
ライマーを、それぞれ使用した。
ーとして配列番号１及び２に示すプライマーを、ｒｐｏ
ＢＣオペロンを増幅するためのプライマーとして配列番
号３及び４に示すプライマーを、ｒｐｏＤ遺伝子を増幅
するためのプライマーとして配列番号５及び６に示すプ
ライマーを、それぞれ使用した。
【００４２】ｒｐｏＤ遺伝子を取得するために、前記染
色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５及び６に示すプライ
マーを用いたＰＣＲにより得られた断片をEcoRIで消化
した後、プラスミドpVC7（後述）のEcoRI部位に挿入
し、プラスミドpVCDを作製した。次に、ｒｐｏＢＣ遺伝
子を取得するために、前記染色体ＤＮＡを鋳型とし、配
列番号３及び４に示すプライマーを用いてＰＣＲを行
い、得られた断片をＤＮＡブランティングキット（宝酒
造（株）製）を用いて平滑末端化し、前記pVCDのsmaI部
位に挿入し、pVCBCDを構築した。続いて、rpoA遺伝子を
取得するために、前記染色体ＤＮＡを鋳型として配列番
号１及び２に示すプライマーを用いてＰＣＲを行い、得
られた断片を上記と同様に平滑末端化した。pVCBCDをSa
cIで消化した後に、上記と同様に平滑末端化し、それを
平滑末端化したrpoA遺伝子断片と結合させて、プラスミ
ドpVCBCADを構築した。
色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５及び６に示すプライ
マーを用いたＰＣＲにより得られた断片をEcoRIで消化
した後、プラスミドpVC7（後述）のEcoRI部位に挿入
し、プラスミドpVCDを作製した。次に、ｒｐｏＢＣ遺伝
子を取得するために、前記染色体ＤＮＡを鋳型とし、配
列番号３及び４に示すプライマーを用いてＰＣＲを行
い、得られた断片をＤＮＡブランティングキット（宝酒
造（株）製）を用いて平滑末端化し、前記pVCDのsmaI部
位に挿入し、pVCBCDを構築した。続いて、rpoA遺伝子を
取得するために、前記染色体ＤＮＡを鋳型として配列番
号１及び２に示すプライマーを用いてＰＣＲを行い、得
られた断片を上記と同様に平滑末端化した。pVCBCDをSa
cIで消化した後に、上記と同様に平滑末端化し、それを
平滑末端化したrpoA遺伝子断片と結合させて、プラスミ
ドpVCBCADを構築した。
【００４３】前記pVC7は、以下のようにして、エシェリ
ヒア・コリ用ベクターであるpHSG399（Cmr；Takeshita,
S. et al., Gene, 61, 63-74, (1987)参照）にブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタムのクリプティック
プラスミドであるpAM330を結合することによって構築し
た。pAM330は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タムATCC13869株より調製した。pHSG399を一箇所切断酵
素であるAvaII（宝酒造（株）製）にて切断し、Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼにて平滑末端化したのち、HindIII
（宝酒造（株）製）にて切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラー
ゼにて平滑末端化したpAM330と接続した。pVC7は、E. c
oli及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの
細胞中で自律複製可能であり、かつ、pHSG299由来のマ
ルチプルクローニングサイトとlacZ’を保持している。
ヒア・コリ用ベクターであるpHSG399（Cmr；Takeshita,
S. et al., Gene, 61, 63-74, (1987)参照）にブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタムのクリプティック
プラスミドであるpAM330を結合することによって構築し
た。pAM330は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タムATCC13869株より調製した。pHSG399を一箇所切断酵
素であるAvaII（宝酒造（株）製）にて切断し、Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼにて平滑末端化したのち、HindIII
（宝酒造（株）製）にて切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラー
ゼにて平滑末端化したpAM330と接続した。pVC7は、E. c
oli及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの
細胞中で自律複製可能であり、かつ、pHSG299由来のマ
ルチプルクローニングサイトとlacZ’を保持している。
【００４４】＜２＞ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子で形質転
換されたコリネ型細菌のＬ−アミノ酸生産菌の作製及び
Ｌ−アミノ酸の製造 （１）コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産株へのpVCB
CADの導入とＬ−グルタミン酸生産 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029を
電気パルス法（特開平2-207791号公報参照）によりプラ
スミドpVCBCADで形質転換した。pVCBCADを保持する株は
5μg/mlのクロラムフェニコールを、それぞれ含む培地
で選択した。
換されたコリネ型細菌のＬ−アミノ酸生産菌の作製及び
Ｌ−アミノ酸の製造 （１）コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産株へのpVCB
CADの導入とＬ−グルタミン酸生産 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029を
電気パルス法（特開平2-207791号公報参照）によりプラ
スミドpVCBCADで形質転換した。pVCBCADを保持する株は
5μg/mlのクロラムフェニコールを、それぞれ含む培地
で選択した。
【００４５】得られた形質転換株AJ13029/pVCBCADを用
いてＬ−グルタミン酸生産のための培養を以下のように
行った。5μg/mlのクロラムフェニコールを含むＣＭ２
Ｂプレート培地にて培養して得たAJ13029/pVCBCADの菌
体を、同じ濃度の薬剤を含む表１に示す組成の種培養培
地に接種し、３１．５℃で２４時間振とう培養して種培
養を得た。表１に示す組成の本培養培地を５００ml容ガ
ラス製ジャーファーメンターに３００mlずつ分注し加熱
殺菌した後、上記種培養を４０ml接種した。撹拌速度を
８００〜１３００rpm、通気量を１／２〜１／１vvmと
し、培養温度３１．５℃にて培養を開始した。培養液の
ｐＨはアンモニアガスで７．５に維持した。培養を開始
してから８時間後に培養温度を３７℃にシフトした。コ
ントロールとしてコリネバクテリウム属細菌AJ13029株
をpVC7で形質転換した菌株を上記と同様にして培養し
た。
いてＬ−グルタミン酸生産のための培養を以下のように
行った。5μg/mlのクロラムフェニコールを含むＣＭ２
Ｂプレート培地にて培養して得たAJ13029/pVCBCADの菌
体を、同じ濃度の薬剤を含む表１に示す組成の種培養培
地に接種し、３１．５℃で２４時間振とう培養して種培
養を得た。表１に示す組成の本培養培地を５００ml容ガ
ラス製ジャーファーメンターに３００mlずつ分注し加熱
殺菌した後、上記種培養を４０ml接種した。撹拌速度を
８００〜１３００rpm、通気量を１／２〜１／１vvmと
し、培養温度３１．５℃にて培養を開始した。培養液の
ｐＨはアンモニアガスで７．５に維持した。培養を開始
してから８時間後に培養温度を３７℃にシフトした。コ
ントロールとしてコリネバクテリウム属細菌AJ13029株
をpVC7で形質転換した菌株を上記と同様にして培養し
た。
【００４６】
【表１】
表１
──────────────────────────────────
濃 度
成 分 ────────────────────
種培養 本培養
──────────────────────────────────
グルコース ５ g/dl １５ g/dl
ＫＨ2ＰＯ4 ０．１ g/dl ０．２ g/dl
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０４g/dl ０．１５g/dl
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ mg/dl １．５ mg/dl
ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ １ mg/dl １．５ mg/dl
大豆蛋白加水分解液 ２ ml/dl ５ ml/dl
ビオチン ５０ μｇ/l ２００ μg/dl
サイアミン塩酸塩 ２００ μｇ/l ３００ μg/dl
──────────────────────────────────
【００４７】培養終了後、培養液中のＬ−グルタミン酸
蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ
−２１０により測定した。このときの結果を表２に示し
た。
蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ
−２１０により測定した。このときの結果を表２に示し
た。
【００４８】
【表２】
表２
─────────────────────────────
菌 株 L-ク゛ルタミン酸生成量(g/L) 培養時間(ｈ)
─────────────────────────────
AJ13029/pVC7 ８３ ３０
AJ13029/pVCBCAD ８９ ２３
─────────────────────────────
【００４９】（２）コリネ型細菌のＬ−リジン生産株へ
のpVCBCADの導入とＬ−リジン生産 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11082
に、前記と同様にしてpVCBCADを導入してAJ11082/pVCBC
ADを得た。5μg/mlのクロラムフェニコールを含むＣＭ
２Ｂプレート培地にて培養して得たAJ13029/pVCBCADの
菌体を、同じ濃度の薬剤を含む下記組成のＬ−リジン生
産培地に接種し、31.5℃にて培地中の糖が消費されるま
で振とう培養した。コントロールとしてブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムAJ11082株をpVC7で形質転
換した菌株を上記と同様にして培養した。
のpVCBCADの導入とＬ−リジン生産 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11082
に、前記と同様にしてpVCBCADを導入してAJ11082/pVCBC
ADを得た。5μg/mlのクロラムフェニコールを含むＣＭ
２Ｂプレート培地にて培養して得たAJ13029/pVCBCADの
菌体を、同じ濃度の薬剤を含む下記組成のＬ−リジン生
産培地に接種し、31.5℃にて培地中の糖が消費されるま
で振とう培養した。コントロールとしてブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムAJ11082株をpVC7で形質転
換した菌株を上記と同様にして培養した。
【００５０】〔Ｌ−リジン生産培地〕炭酸カルシウム以
外の下記成分（１Ｌ中）を溶解し、KOHでpH8.0に調製
し、115℃で15分殺菌した後、別に乾熱殺菌した炭酸カ
ルシウムを50ｇ加える。
外の下記成分（１Ｌ中）を溶解し、KOHでpH8.0に調製
し、115℃で15分殺菌した後、別に乾熱殺菌した炭酸カ
ルシウムを50ｇ加える。
【００５１】
グルコース 100 g
（ＮＨ4）2ＳＯ4 55 g
ＫＨ2ＰＯ4 1 g
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 1 g
ビオチン 500 μg
チアミン 2000 μg
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.01 g
ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.01 g
ニコチンアミド 5 mg
蛋白質加水分解物（豆濃） 30 ml
炭酸カルシウム 50 g
【００５２】培養終了後、培養液中のＬ−リジン蓄積量
を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ−２１
０により測定した。このときの結果を表３に示した。
を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ−２１
０により測定した。このときの結果を表３に示した。
【００５３】
【表３】
表３
─────────────────────────────
菌 株 Ｌ−リジン生成量(g/dl) 培養時間(ｈ)
─────────────────────────────
AJ13029/pVC7 ２８．９ ７２
AJ13029/pVCBCAD ３０．１ ６０
─────────────────────────────
【００５４】（３）コリネ型細菌のＬ−リジン及びＬ−
グルタミン酸生産株へのpVCBCADの導入とＬ−リジン及
びＬ−グルタミン酸同時生産 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12993
に、前記と同様にしてpVCBCADを導入してAJ12993/pVCBC
ADを得た。5μg/mlのクロラムフェニコールを含むＣＭ
２Ｂプレート培地にて培養して得たAJ13029/pVCBCADの
菌体を、同じ濃度の薬剤を含む前記Ｌ−リジン生産培地
に接種して31.5℃にて培養した。培養を開始してから１
２時間後に培養温度を３４℃にシフトし、培地中の糖が
消費されるまで振とう培養した。コントロールとしてコ
リネバクテリウム属細菌AJ12993株をpVC7で形質転換し
た菌株を上記と同様にして培養した。
グルタミン酸生産株へのpVCBCADの導入とＬ−リジン及
びＬ−グルタミン酸同時生産 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12993
に、前記と同様にしてpVCBCADを導入してAJ12993/pVCBC
ADを得た。5μg/mlのクロラムフェニコールを含むＣＭ
２Ｂプレート培地にて培養して得たAJ13029/pVCBCADの
菌体を、同じ濃度の薬剤を含む前記Ｌ−リジン生産培地
に接種して31.5℃にて培養した。培養を開始してから１
２時間後に培養温度を３４℃にシフトし、培地中の糖が
消費されるまで振とう培養した。コントロールとしてコ
リネバクテリウム属細菌AJ12993株をpVC7で形質転換し
た菌株を上記と同様にして培養した。
【００５５】培養終了後、培養液中のＬ−リジン及びＬ
−グルタミン酸蓄積量を旭化成工業社製バイオテックア
ナライザーＡＳ−２１０により測定した。このときの結
果を表４に示した。
−グルタミン酸蓄積量を旭化成工業社製バイオテックア
ナライザーＡＳ−２１０により測定した。このときの結
果を表４に示した。
【００５６】
【表４】
表４
───────────────────────────────────
菌 株 L-リシ゛ン生成量(g/dl) L-ク゛ルタミン酸生成量(g/dl) 培養時間
───────────────────────────────────
AJ12993/pVC7 １０．５ １８．９ ６０
AJ12993/pVCBCAD １１．２ ２０．１ ４５
───────────────────────────────────
【００５７】
【発明の効果】本発明により、目的物質を産生する微生
物の生育及び目的物質の生産性を向上させることができ
る。
物の生育及び目的物質の生産性を向上させることができ
る。
【００５８】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> 味の素株式会社（Ajinomoto Co., Inc.）
<120> 発酵法による目的物質の製造法
<130> P-6307
<141> 1999-07-19
<160> 6
<170> PatentIn Ver. 2.0
【００５９】
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer for
amplifying rpoA gene of Escherichia coli
<400> 1
gagaaagcga agcagtc 17
【００６０】
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer for
amplifying rpoA gene of Escherichia coli
<400> 2
ctctgcagca gcttctgctt 20
【００６１】
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer for
amplifying rpoBC operon of Escherichia coli
<400> 3
gccaaccctt ccggttgcag 20
【００６２】
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer for
amplifying rpoBC operon of Escherichia coli
<400> 4
cgattactcg ttatcagaac 20
【００６３】
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer for
amplifying rpoD gene of Escherichia coli
<400> 5
gcgcgaattc atggagcaaa acccgcagtc 30
【００６４】
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer for
amplifying rpoD gene of Escherichia coli
<400> 6
gcgcgaattc ttaatcctcc aggaagctac 30
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｒ 1:13） Ｃ１２Ｐ 13/14
(Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｃ１２Ｒ 1:13）
(Ｃ１２Ｐ 13/14
Ｃ１２Ｒ 1:13）
(72)発明者 倉橋 修
神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素
株式会社発酵技術研究所内
Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 AA20 BA71 BA72
BA74 DA10 EA04 FA13 FA15
GA11
4B064 AE03 AE19 AE25 CA02 CA19
CC24 DA10 DA16
4B065 AA22X AA24X AA26Y AB01
BA03 BA24 CA17
Claims (5)
- 【請求項１】 目的物質の生産能を有し、かつ、ＲＮＡ
ポリメラーゼ活性が増強された微生物。 - 【請求項２】 前記目的物質がＬ−アミノ酸である請求
項１記載の微生物。 - 【請求項３】 ＲＮＡポリメラーゼ活性の増強が、ｒｐ
ｏＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ及びｒｐｏＤの各遺伝子のコ
ピー数を高めることによるものである請求項１記載の微
生物。 - 【請求項４】 微生物がエシェリヒア属細菌又はコリネ
型細菌である請求項１記載の微生物。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか一項に記載の微
生物を培地に培養し、該培養物中に目的物質を生成蓄積
せしめ、該培養物から目的物質を採取することを特徴と
する目的物質の製造法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20526799A JP2003204783A (ja) | 1999-07-19 | 1999-07-19 | 発酵法による目的物質の製造法 |
| AU60184/00A AU6018400A (en) | 1999-07-19 | 2000-07-14 | Process for producing target substance by fermentation method |
| PCT/JP2000/004774 WO2001005979A1 (fr) | 1999-07-19 | 2000-07-14 | Methode d'elaboration d'une substance cible par fermentation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20526799A JP2003204783A (ja) | 1999-07-19 | 1999-07-19 | 発酵法による目的物質の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003204783A true JP2003204783A (ja) | 2003-07-22 |
Family
ID=16504161
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20526799A Pending JP2003204783A (ja) | 1999-07-19 | 1999-07-19 | 発酵法による目的物質の製造法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003204783A (ja) |
| AU (1) | AU6018400A (ja) |
| WO (1) | WO2001005979A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005333907A (ja) * | 2004-05-28 | 2005-12-08 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | ５−アミノレブリン酸の製造法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PH22618A (en) * | 1980-06-06 | 1988-10-28 | Biogen Nv | Improved vectors and method for making such vectors and for expressing cloned genes |
| JPH06102024B2 (ja) * | 1986-04-16 | 1994-12-14 | 味の素株式会社 | 新規プロモーター及び該プロモーターを用いた遺伝子発現方法 |
| JP4032441B2 (ja) * | 1995-08-30 | 2008-01-16 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸の製造方法 |
-
1999
- 1999-07-19 JP JP20526799A patent/JP2003204783A/ja active Pending
-
2000
- 2000-07-14 AU AU60184/00A patent/AU6018400A/en not_active Abandoned
- 2000-07-14 WO PCT/JP2000/004774 patent/WO2001005979A1/ja active Application Filing
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005333907A (ja) * | 2004-05-28 | 2005-12-08 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | ５−アミノレブリン酸の製造法 |
| JP4520219B2 (ja) * | 2004-05-28 | 2010-08-04 | 協和発酵バイオ株式会社 | ５−アミノレブリン酸の製造法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2001005979A1 (fr) | 2001-01-25 |
| AU6018400A (en) | 2001-02-05 |
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