JP2000253879A - Ｌ−リジンの製造法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 従来よりもさらに改良された発酵法によるＬ
−リジンの製造法、及びそれに用いるコリネ型細菌を提
供する。 【解決手段】 Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型細菌
に、グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子
を導入し、細胞内のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性
を増強することによって、Ｌ−リジン生産能を向上させ
る。
−リジンの製造法、及びそれに用いるコリネ型細菌を提
供する。 【解決手段】 Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型細菌
に、グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子
を導入し、細胞内のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性
を増強することによって、Ｌ−リジン生産能を向上させ
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、発酵法によるＬ−
リジンの製造法に関する。Ｌ−リジンは飼料添加物等と
して広く用いられている。
リジンの製造法に関する。Ｌ−リジンは飼料添加物等と
して広く用いられている。
【０００２】
【従来の技術】従来、Ｌ−リジンは、Ｌ−リジン生産能
を有するブレビバクテリウム属やコリネバクテリウム属
に属するコリネ型細菌を用いて発酵法により工業生産さ
れている。これらのコリネ型細菌は、生産性を向上させ
るために、自然界から分離した菌株または該菌株の人工
変異株が用いられている。
を有するブレビバクテリウム属やコリネバクテリウム属
に属するコリネ型細菌を用いて発酵法により工業生産さ
れている。これらのコリネ型細菌は、生産性を向上させ
るために、自然界から分離した菌株または該菌株の人工
変異株が用いられている。
【０００３】また、組換えＤＮＡ技術によりＬ−リジン
の生合成酵素を増強することによって、Ｌ−リジンの生
産能を増加させる種々の技術が開示されている。例え
ば、Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型細菌において、
Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフィードバック阻
害が解除されたアスパルトキナーゼをコードする遺伝子
（変異型lysC）、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺
伝子（dapB）、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子
（dapA）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝
子（lysA）遺伝子、及びジアミノピメリン酸デヒドロゲ
ナーゼ遺伝子（ddh）（WO96/40934）、LysA及びDDH（特
開平9−322774号）、LysC、LysA及びホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppc）（特開平10-16
5180号）、変異型lysC、dapB、dapA、lysA及びアスパラ
ギン酸アミノトランスフェラーゼ利遺伝子（aspC）（特
開平10-215883号）を導入することにより、同細菌のＬ
−リジン生産能が向上することが知られている。また、
エシェリヒア属細菌においては、dapA、変異型lysC、da
pB、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（dd
h）（又はテトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ遺
伝子（dapD）及びスクシニルジアミノピメリン酸デアシ
ラーゼ遺伝子（dapE））を順次増強するとＬ−リジン生
産能が向上することが知られている（WO 95/16042）。
の生合成酵素を増強することによって、Ｌ−リジンの生
産能を増加させる種々の技術が開示されている。例え
ば、Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型細菌において、
Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフィードバック阻
害が解除されたアスパルトキナーゼをコードする遺伝子
（変異型lysC）、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺
伝子（dapB）、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子
（dapA）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝
子（lysA）遺伝子、及びジアミノピメリン酸デヒドロゲ
ナーゼ遺伝子（ddh）（WO96/40934）、LysA及びDDH（特
開平9−322774号）、LysC、LysA及びホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppc）（特開平10-16
5180号）、変異型lysC、dapB、dapA、lysA及びアスパラ
ギン酸アミノトランスフェラーゼ利遺伝子（aspC）（特
開平10-215883号）を導入することにより、同細菌のＬ
−リジン生産能が向上することが知られている。また、
エシェリヒア属細菌においては、dapA、変異型lysC、da
pB、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（dd
h）（又はテトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ遺
伝子（dapD）及びスクシニルジアミノピメリン酸デアシ
ラーゼ遺伝子（dapE））を順次増強するとＬ−リジン生
産能が向上することが知られている（WO 95/16042）。
【０００４】一方、グルタミン酸生産性コリネ型細菌に
おけるグルタミン酸の生産性の向上を目的とする技術と
して、コリネバクテリウム属細菌由来のグルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを保有した
細胞が開示されている（特開昭61-268185号公報）。グ
ルタミン酸デヒドロゲナーゼは、トリカルボン酸サイク
ルの中間体であるα−ケトグルタル酸を酸化してＬ−グ
ルタミン酸を生成する反応を触媒する酵素であり、同酵
素をコードする遺伝子を増幅することによってＬ−グル
タミン酸の生産能が向上する。また、他のグルタミン酸
生合成酵素遺伝子とともにグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼ遺伝子を増強すると、Ｌ−グルタミン酸の生産量が向
上することが示されている（特開昭63-214189号）。
おけるグルタミン酸の生産性の向上を目的とする技術と
して、コリネバクテリウム属細菌由来のグルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを保有した
細胞が開示されている（特開昭61-268185号公報）。グ
ルタミン酸デヒドロゲナーゼは、トリカルボン酸サイク
ルの中間体であるα−ケトグルタル酸を酸化してＬ−グ
ルタミン酸を生成する反応を触媒する酵素であり、同酵
素をコードする遺伝子を増幅することによってＬ−グル
タミン酸の生産能が向上する。また、他のグルタミン酸
生合成酵素遺伝子とともにグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼ遺伝子を増強すると、Ｌ−グルタミン酸の生産量が向
上することが示されている（特開昭63-214189号）。
【０００５】しかし、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活
性とＬ−リジンの生産能との関係は、知られていない。
性とＬ−リジンの生産能との関係は、知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来よりも
さらに改良された発酵法によるＬ−リジンの製造法、及
びそれに用いる微生物を提供することを課題とする。
さらに改良された発酵法によるＬ−リジンの製造法、及
びそれに用いる微生物を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決するために鋭意検討を行った。そして、Ｌ−リジ
ン生合成経路において、アスパラギン酸アミノトランス
フェラーゼによるオキサロ酢酸からアスパラギン酸を生
成する反応に必要なアミノ基の供給がＬ−リジン生合成
の律速になっているのではないかと予想した。このアミ
ノ基は、前記反応に伴うＬ−グルタミン酸からα−ケト
グルタル酸への脱アミノ反応により供給される。また、
ジアミノピメリン酸にアミノ基が転移されてＬ−リジン
が生成する反応において、副基質としてＬ−グルタミン
酸が必要になる。この反応はスクシニルジアミノピメリ
ン酸トランスアミナーゼにより触媒されるが、ここで転
移されるアミノ基もＬ−グルタミン酸からα−ケトグル
タル酸への脱アミノ反応により供給される。そこで、生
成したα−ケトグルタル酸をグルタミン酸に戻すグルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼの反応に着目し、グルタミン酸
デヒドロゲナーゼ（以下、「GDH」ともいう。）をコー
ドする遺伝子をＬ−リジン生産能を有するコリネ型細菌
に導入し、GDH活性を増幅したところ、同細菌のＬ−リ
ジンの生産能を向上させることができることを見出し、
本発明を完成するに至った。
を解決するために鋭意検討を行った。そして、Ｌ−リジ
ン生合成経路において、アスパラギン酸アミノトランス
フェラーゼによるオキサロ酢酸からアスパラギン酸を生
成する反応に必要なアミノ基の供給がＬ−リジン生合成
の律速になっているのではないかと予想した。このアミ
ノ基は、前記反応に伴うＬ−グルタミン酸からα−ケト
グルタル酸への脱アミノ反応により供給される。また、
ジアミノピメリン酸にアミノ基が転移されてＬ−リジン
が生成する反応において、副基質としてＬ−グルタミン
酸が必要になる。この反応はスクシニルジアミノピメリ
ン酸トランスアミナーゼにより触媒されるが、ここで転
移されるアミノ基もＬ−グルタミン酸からα−ケトグル
タル酸への脱アミノ反応により供給される。そこで、生
成したα−ケトグルタル酸をグルタミン酸に戻すグルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼの反応に着目し、グルタミン酸
デヒドロゲナーゼ（以下、「GDH」ともいう。）をコー
ドする遺伝子をＬ−リジン生産能を有するコリネ型細菌
に導入し、GDH活性を増幅したところ、同細菌のＬ−リ
ジンの生産能を向上させることができることを見出し、
本発明を完成するに至った。
【０００８】すなわち本発明は、以下のとおりである。 （１）細胞中のGDH活性が増強され、かつＬ−リジン生
産能を有するコリネ型細菌。 （２）前記GDH活性の増強が、前記細菌細胞内のGDHをコ
ードする遺伝子のコピー数を高めることによるものであ
る（１）のコリネ型細菌。 （３）前記GDHをコードする遺伝子がコリネ型細菌由来
である（２）のコリネ型細菌。 （４）さらに、アスパルトキナーゼ活性、ジヒドロジピ
コリン酸レダクターゼ活性、ジヒドロジピコリン酸シン
ターゼ活性、及びジアミノピメリン酸デカルボキシラー
ゼ活性の少なくとも一つが増強された（１）のコリネ型
細菌。 （５）前記（１）〜（４）のいずれか一項に記載のコリ
ネ型細菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−リジンを生
成蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを採取すること
を特徴とするＬ−リジンの製造法。
産能を有するコリネ型細菌。 （２）前記GDH活性の増強が、前記細菌細胞内のGDHをコ
ードする遺伝子のコピー数を高めることによるものであ
る（１）のコリネ型細菌。 （３）前記GDHをコードする遺伝子がコリネ型細菌由来
である（２）のコリネ型細菌。 （４）さらに、アスパルトキナーゼ活性、ジヒドロジピ
コリン酸レダクターゼ活性、ジヒドロジピコリン酸シン
ターゼ活性、及びジアミノピメリン酸デカルボキシラー
ゼ活性の少なくとも一つが増強された（１）のコリネ型
細菌。 （５）前記（１）〜（４）のいずれか一項に記載のコリ
ネ型細菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−リジンを生
成蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを採取すること
を特徴とするＬ−リジンの製造法。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】＜１＞本発明のコリネ型細菌 本発明のコリネ型細菌は、Ｌ−リジン生産能を有し、細
胞中のGDH活性が増強されたコリネ型細菌である。
胞中のGDH活性が増強されたコリネ型細菌である。
【００１１】本発明でいうコリネ型細菌としては、バー
ジーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バク
テリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bac
teriology）第8版599頁（1974）に定義されている一群
の微生物であり、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞子
形成能を有しない桿菌であり、従来ブレビバクテリウム
属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌と
して統合された細菌を含み（Int. J. Syst. Bacterio
l., 41, 255 (1981)）、またコリネバクテリウム属と非
常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリ
ウム属細菌を含む。Ｌ−リジンの製造に好適に用いられ
るコリネ型細菌の菌株としては、例えば以下に示すもの
が挙げられる。
ジーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バク
テリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bac
teriology）第8版599頁（1974）に定義されている一群
の微生物であり、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞子
形成能を有しない桿菌であり、従来ブレビバクテリウム
属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌と
して統合された細菌を含み（Int. J. Syst. Bacterio
l., 41, 255 (1981)）、またコリネバクテリウム属と非
常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリ
ウム属細菌を含む。Ｌ−リジンの製造に好適に用いられ
るコリネ型細菌の菌株としては、例えば以下に示すもの
が挙げられる。
【００１２】 コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム ATCC13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ATCC15806 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991 コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC13032 （ブレビバクテリウム・ディバリカタム） ATCC14020 （ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム）ATCC13869 〔コリネバクテリウム・リリウム） ATCC15990 （ブレビバクテリウム・フラバム） ATCC14067 コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965 ブレビバクテリウム・サッカロリティクム ATCC14066 ブレビバクテリウム・インマリオフィルム ATCC14068 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC15354 コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス AJ12340(FERM BP-1539)
【００１３】これらを入手するには、例えばアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲を受ける
ことができる。すなわち、各微生物ごとに対応する登録
番号が付与されており、この登録番号を引用して分譲を
受けることができる。各微生物に対応する登録番号はア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタロ
グに記載されている。また、AJ12340株は、通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所にブダペスト条約に
基づいて寄託されている。
・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲を受ける
ことができる。すなわち、各微生物ごとに対応する登録
番号が付与されており、この登録番号を引用して分譲を
受けることができる。各微生物に対応する登録番号はア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタロ
グに記載されている。また、AJ12340株は、通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所にブダペスト条約に
基づいて寄託されている。
【００１４】また、上記菌株以外にも、これらの菌株か
ら誘導されたＬ−リジン生産能を有する変異株等も、本
発明に利用できる。この様な人工変異株としては次の様
なものがある。Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン
（以下、「AEC」と略記する）耐性変異株（例えば、ブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11082（NRR
L B-11470）、特公昭56-1914号、特公昭56-1915号、特
公昭57-14157号、特公昭57-14158号、特公昭57-30474
号、特公昭58-10075号、特公昭59-4993号、特公昭61-35
840号、特公昭62-24074号、特公昭62-36673号、特公平5
-11958号、特公平7-112437号、特公平7-112438号参
照）、その成長にＬ−ホモセリン等のアミノ酸を必要と
する変異株（特公昭48-28078号、特公昭56-6499号）、A
ECに耐性を示し、更にＬ−ロイシン、Ｌ−ホモセリン、
Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラ
ニン、Ｌ−バリン等のアミノ酸を要求する変異株（米国
特許第3708395号及び第3825472号）、ＤＬ−α−アミノ
−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタ
ム、アスパラギン酸−アナログ、スルファ剤、キノイ
ド、Ｎ−ラウロイルロイシンに耐性を示すＬ−リジン生
産変異株、オキザロ酢酸脱炭酸酵素（デカルボキシラー
ゼ）または呼吸系酵素阻害剤の耐性を示すＬ−リジン生
産変異株（特開昭50-53588号、特開昭50-31093号、特開
昭52-102498号、特開昭53-9394号、特開昭53-86089号、
特開昭55-9783号、特開昭55-9759号、特開昭56-32995
号、特開昭56-39778号、特公昭53-43591号、特公昭53-1
833号）、イノシトールまたは酢酸を要求するＬ−リジ
ン生産変異株（特開昭55-9784号、特開昭56-8692号）、
フルオロピルビン酸または34℃以上の温度に対して感受
性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭55-9783号、特
開昭53-86090号）、エチレングリコールに耐性を示し、
Ｌ−リジンを生産するブレビバクテリウム属またはコリ
ネバクテリウム属の生産変異株（米国特許第4411997
号）。
ら誘導されたＬ−リジン生産能を有する変異株等も、本
発明に利用できる。この様な人工変異株としては次の様
なものがある。Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン
（以下、「AEC」と略記する）耐性変異株（例えば、ブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11082（NRR
L B-11470）、特公昭56-1914号、特公昭56-1915号、特
公昭57-14157号、特公昭57-14158号、特公昭57-30474
号、特公昭58-10075号、特公昭59-4993号、特公昭61-35
840号、特公昭62-24074号、特公昭62-36673号、特公平5
-11958号、特公平7-112437号、特公平7-112438号参
照）、その成長にＬ−ホモセリン等のアミノ酸を必要と
する変異株（特公昭48-28078号、特公昭56-6499号）、A
ECに耐性を示し、更にＬ−ロイシン、Ｌ−ホモセリン、
Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラ
ニン、Ｌ−バリン等のアミノ酸を要求する変異株（米国
特許第3708395号及び第3825472号）、ＤＬ−α−アミノ
−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタ
ム、アスパラギン酸−アナログ、スルファ剤、キノイ
ド、Ｎ−ラウロイルロイシンに耐性を示すＬ−リジン生
産変異株、オキザロ酢酸脱炭酸酵素（デカルボキシラー
ゼ）または呼吸系酵素阻害剤の耐性を示すＬ−リジン生
産変異株（特開昭50-53588号、特開昭50-31093号、特開
昭52-102498号、特開昭53-9394号、特開昭53-86089号、
特開昭55-9783号、特開昭55-9759号、特開昭56-32995
号、特開昭56-39778号、特公昭53-43591号、特公昭53-1
833号）、イノシトールまたは酢酸を要求するＬ−リジ
ン生産変異株（特開昭55-9784号、特開昭56-8692号）、
フルオロピルビン酸または34℃以上の温度に対して感受
性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭55-9783号、特
開昭53-86090号）、エチレングリコールに耐性を示し、
Ｌ−リジンを生産するブレビバクテリウム属またはコリ
ネバクテリウム属の生産変異株（米国特許第4411997
号）。
【００１５】＜２＞GDH活性の増幅 コリネ型細菌細胞中のGDH活性を増幅するには、GDHをコ
ードする遺伝子断片を、該細菌で機能するベクター、好
ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組み換え
ＤＮＡを作製し、これをＬ−リジン生産能を有するコリ
ネ型細菌に導入して形質転換すればよい。形質転換株の
細胞内のGDHをコードする遺伝子のコピー数が上昇する
結果、GDH活性が増幅される。
ードする遺伝子断片を、該細菌で機能するベクター、好
ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組み換え
ＤＮＡを作製し、これをＬ−リジン生産能を有するコリ
ネ型細菌に導入して形質転換すればよい。形質転換株の
細胞内のGDHをコードする遺伝子のコピー数が上昇する
結果、GDH活性が増幅される。
【００１６】GDHをコードする遺伝子は、コリネ型細菌
の遺伝子を用いることも、エシェリヒア属細菌等の他の
生物由来の遺伝子のいずれも使用することができる。コ
リネ型細菌のGDHをコードする遺伝子（gdh遺伝子）の塩
基配列は既に明らかにされている（Molecular Microbio
logy (1992) 6 (3), 317-326）ので、その塩基配列に基
づいて作製したプライマー、例えば配列表配列番号１及
び２に示すプライマーを用いて、コリネ型細菌染色体Ｄ
ＮＡを鋳型とするＰＣＲ法（ＰＣＲ：polymerase chain
reaction； White,T.J. et al ;Trends Genet. 5,185
(1989)参照）によって、gdh遺伝子を取得することがで
きる。コリネ型細菌等の他の微生物のGDHをコードする
遺伝子も、同様にして取得され得る。
の遺伝子を用いることも、エシェリヒア属細菌等の他の
生物由来の遺伝子のいずれも使用することができる。コ
リネ型細菌のGDHをコードする遺伝子（gdh遺伝子）の塩
基配列は既に明らかにされている（Molecular Microbio
logy (1992) 6 (3), 317-326）ので、その塩基配列に基
づいて作製したプライマー、例えば配列表配列番号１及
び２に示すプライマーを用いて、コリネ型細菌染色体Ｄ
ＮＡを鋳型とするＰＣＲ法（ＰＣＲ：polymerase chain
reaction； White,T.J. et al ;Trends Genet. 5,185
(1989)参照）によって、gdh遺伝子を取得することがで
きる。コリネ型細菌等の他の微生物のGDHをコードする
遺伝子も、同様にして取得され得る。
【００１７】染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌
から、例えば、斎藤、三浦の方法（H.Saito and K.Miur
a Biochem.Biophys.Acta, 72,619,(1963)、生物工学実
験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９
９２年参照）等により調製することができる。
から、例えば、斎藤、三浦の方法（H.Saito and K.Miur
a Biochem.Biophys.Acta, 72,619,(1963)、生物工学実
験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９
９２年参照）等により調製することができる。
【００１８】ＰＣＲ法により増幅されたgdh遺伝子は、
エシェリヒア・コリ及び／又はコリネ型細菌の細胞内に
おいて自律複製可能なベクターＤＮＡに接続して組換え
ＤＮＡを調製し、これをエシェリヒア・コリ細胞に導入
しておくと、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・
コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、
プラスミドベクターが好ましく、宿主の細胞内で自立複
製可能なものが好ましく、例えば pUC19、pUC18、pBR32
2、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010等が挙げられ
る。
エシェリヒア・コリ及び／又はコリネ型細菌の細胞内に
おいて自律複製可能なベクターＤＮＡに接続して組換え
ＤＮＡを調製し、これをエシェリヒア・コリ細胞に導入
しておくと、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・
コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、
プラスミドベクターが好ましく、宿主の細胞内で自立複
製可能なものが好ましく、例えば pUC19、pUC18、pBR32
2、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010等が挙げられ
る。
【００１９】コリネ型細菌の細胞内において自律複製可
能なベクターとしては、pAM330（特開昭58-67699号公報
参照）、pHM1519（特開昭58-77895号公報参照）等が挙
げられる。また、これらのベクターからコリネ型細菌中
でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断
片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに
挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両
方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使
用することができる。
能なベクターとしては、pAM330（特開昭58-67699号公報
参照）、pHM1519（特開昭58-77895号公報参照）等が挙
げられる。また、これらのベクターからコリネ型細菌中
でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断
片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに
挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両
方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使
用することができる。
【００２０】このようなシャトルベクターとしては、以
下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクターを保持
する微生物及び国際寄託機関の受託番号をかっこ内に示
した。
下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクターを保持
する微生物及び国際寄託機関の受託番号をかっこ内に示
した。
【００２１】これらのベクターは、寄託微生物から次の
ようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリ
ゾチーム及びＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで
遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリ
コールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロ
マイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
ようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリ
ゾチーム及びＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで
遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリ
コールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロ
マイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
【００２２】GDH遺伝子とベクターを連結して組み換え
ＤＮＡを調製するには、GDH遺伝子を含むＤＮＡ断片の
末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結
は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが
普通である。
ＤＮＡを調製するには、GDH遺伝子を含むＤＮＡ断片の
末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結
は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが
普通である。
【００２３】上記のように調製した組換えＤＮＡをコリ
ネ型細菌に導入するには、これまでに報告されている形
質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・
コリＫ−１２について報告されているような、受容菌細
胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方
法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1
970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告され
ているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを
調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,
G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。
あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母に
ついて知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組
換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフ
ェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌
に導入する方法（ Chang,S.andChoen,S.N.,Molec. Gen.
Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Ho
pwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hick
s,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75
1929 (1978)）も応用できる。また、コリネ型細菌の形
質転換は、電気パルス法（杉本ら、特開平2-207791号公
報）によっても行うことができる。
ネ型細菌に導入するには、これまでに報告されている形
質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・
コリＫ−１２について報告されているような、受容菌細
胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方
法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1
970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告され
ているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを
調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,
G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。
あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母に
ついて知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組
換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフ
ェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌
に導入する方法（ Chang,S.andChoen,S.N.,Molec. Gen.
Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Ho
pwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hick
s,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75
1929 (1978)）も応用できる。また、コリネ型細菌の形
質転換は、電気パルス法（杉本ら、特開平2-207791号公
報）によっても行うことができる。
【００２４】GDH活性の増強は、gdh遺伝子を上記宿主の
染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達
成できる。コリネ型細菌に属する微生物の染色体ＤＮＡ
上にgdh遺伝子を多コピーで導入するには、染色体ＤＮ
Ａ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換
えにより行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列
としては、レペッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在
するインバーティッド・リピートが利用できる。あるい
は、特開平2-109985号公報に開示されているように、gd
h遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて
染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。
いずれの方法によっても形質転換株内のgdh遺伝子のコ
ピー数が上昇する結果、GDH活性が増幅される。
染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達
成できる。コリネ型細菌に属する微生物の染色体ＤＮＡ
上にgdh遺伝子を多コピーで導入するには、染色体ＤＮ
Ａ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換
えにより行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列
としては、レペッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在
するインバーティッド・リピートが利用できる。あるい
は、特開平2-109985号公報に開示されているように、gd
h遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて
染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。
いずれの方法によっても形質転換株内のgdh遺伝子のコ
ピー数が上昇する結果、GDH活性が増幅される。
【００２５】GDH活性の増強は、上記の遺伝子増幅によ
る以外に、染色体ＤＮＡ上又はプラスミド上のgdh遺伝
子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換
することによっても達成される（特開平1-215280号公報
参照）。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモ
ーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラ
ムダファージのＰRプロモーター、ＰLプロモーター等が
強力なプロモーターとして知られている。これらのプロ
モーターへの置換により、gdh遺伝子の発現が強化され
ることによってGDH活性が増強される。発現調節配列の
改変は、gdh遺伝子のコピー数を高めることと組み合わ
せてもよい。
る以外に、染色体ＤＮＡ上又はプラスミド上のgdh遺伝
子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換
することによっても達成される（特開平1-215280号公報
参照）。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモ
ーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラ
ムダファージのＰRプロモーター、ＰLプロモーター等が
強力なプロモーターとして知られている。これらのプロ
モーターへの置換により、gdh遺伝子の発現が強化され
ることによってGDH活性が増強される。発現調節配列の
改変は、gdh遺伝子のコピー数を高めることと組み合わ
せてもよい。
【００２６】また、本発明のコリネ型細菌は、GDH活性
に加えて、他のＬ−リジン生合成経路又は解糖系等の酵
素の活性が増強されてもよい。そのような酵素及び同酵
素をコードする遺伝子の例としては、Ｌ−リジン及びＬ
−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害が解除
されたアスパルトキナーゼαサブユニット蛋白質又はβ
サブユニット蛋白質をコードする遺伝子（WO94/25605国
際公開パンフレット）、コリネ型細菌由来の野生型ホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（特開昭
60-87788号公報）、コリネ型細菌由来の野生型ジヒドロ
ジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子（特公平6-55
149号公報）、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝
子（特開平7-75578号公報）等が知られている。これら
の酵素活性の増強は、GDH活性の増強と同様にして行う
ことができる。
に加えて、他のＬ−リジン生合成経路又は解糖系等の酵
素の活性が増強されてもよい。そのような酵素及び同酵
素をコードする遺伝子の例としては、Ｌ−リジン及びＬ
−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害が解除
されたアスパルトキナーゼαサブユニット蛋白質又はβ
サブユニット蛋白質をコードする遺伝子（WO94/25605国
際公開パンフレット）、コリネ型細菌由来の野生型ホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（特開昭
60-87788号公報）、コリネ型細菌由来の野生型ジヒドロ
ジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子（特公平6-55
149号公報）、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝
子（特開平7-75578号公報）等が知られている。これら
の酵素活性の増強は、GDH活性の増強と同様にして行う
ことができる。
【００２７】上記のようなＬ−リジン生合成系酵素遺伝
子が強化されたコリネ型細菌としては、Ｌ−リジン及び
Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害が解除された
アスパルトキナーゼをコードする遺伝子（変異型lys
C）、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子（dap
B）、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子（dap
A）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（l
ysA）遺伝子、及びジアミノピメリン酸デヒドロゲナー
ゼ遺伝子（ddh）（WO96/40934）、LysA及びDDH（特開平
9−322774号）、LysC、LysA及びホスホエノールピルビ
ン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppc）（特開平10-165180
号）、変異型lysC、dapB、dapA、lysA及びアスパラギン
酸アミノトランスフェラーゼ利遺伝子（aspC）（特開平
10-215883号）を、それぞれ強化したコリネ型細菌が開
示されている。
子が強化されたコリネ型細菌としては、Ｌ−リジン及び
Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害が解除された
アスパルトキナーゼをコードする遺伝子（変異型lys
C）、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子（dap
B）、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子（dap
A）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（l
ysA）遺伝子、及びジアミノピメリン酸デヒドロゲナー
ゼ遺伝子（ddh）（WO96/40934）、LysA及びDDH（特開平
9−322774号）、LysC、LysA及びホスホエノールピルビ
ン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppc）（特開平10-165180
号）、変異型lysC、dapB、dapA、lysA及びアスパラギン
酸アミノトランスフェラーゼ利遺伝子（aspC）（特開平
10-215883号）を、それぞれ強化したコリネ型細菌が開
示されている。
【００２８】ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ム野生型株であるAJ12036株（FERMBP-734）に変異型lys
Cを含むプラスミドp399AK9Bを導入した株AJ12691は、１
９９２年４月１０日に通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所（郵便番号３０５日本国茨城県つくば市東
一丁目１番３号）に受託番号FERM P-12918として寄託さ
れ、１９９５年２月１０日にブダペスト条約に基づく国
際寄託に移管され、FERM BP-4999の受託番号で寄託され
ている。
ム野生型株であるAJ12036株（FERMBP-734）に変異型lys
Cを含むプラスミドp399AK9Bを導入した株AJ12691は、１
９９２年４月１０日に通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所（郵便番号３０５日本国茨城県つくば市東
一丁目１番３号）に受託番号FERM P-12918として寄託さ
れ、１９９５年２月１０日にブダペスト条約に基づく国
際寄託に移管され、FERM BP-4999の受託番号で寄託され
ている。
【００２９】エシェリヒア・コリJM109株にdapBを含む
プラスミドpCRDAPBを導入して得られた形質転換株AJ131
07株は、１９９５年５月２６日より通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５日本国茨城
県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM BP-5114
の受託番号で、ブダペスト条約に基づき国際寄託されて
いる。
プラスミドpCRDAPBを導入して得られた形質転換株AJ131
07株は、１９９５年５月２６日より通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５日本国茨城
県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM BP-5114
の受託番号で、ブダペスト条約に基づき国際寄託されて
いる。
【００３０】エシェリヒア・コリJM109株にdapAを含む
プラスミドpCRDAPAを導入して得られた形質転換株AJ131
06株は、１９９５年５月２６日より通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５日本国茨城
県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM BP-5113
の受託番号で、ブダペスト条約に基づき国際寄託されて
いる。
プラスミドpCRDAPAを導入して得られた形質転換株AJ131
06株は、１９９５年５月２６日より通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５日本国茨城
県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM BP-5113
の受託番号で、ブダペスト条約に基づき国際寄託されて
いる。
【００３１】変異型lysC、dapB、dapAの各遺伝子は、上
記寄託菌株から常法によって調製することができる。ま
た、lysAは、コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタム野生株ATCC13869株の染色体DNA
から、配列表の配列番号３及び４に記載の塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCRによ
り、アルギニル−tRNAシンターゼをコードするargS、ly
sA及びこれらを含むオペロンのプロモーターを含むＤＮ
Ａ断片として、取得することができる。
記寄託菌株から常法によって調製することができる。ま
た、lysAは、コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタム野生株ATCC13869株の染色体DNA
から、配列表の配列番号３及び４に記載の塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCRによ
り、アルギニル−tRNAシンターゼをコードするargS、ly
sA及びこれらを含むオペロンのプロモーターを含むＤＮ
Ａ断片として、取得することができる。
【００３２】上記のＬ−リジン生合成系酵素遺伝子及び
gdh遺伝子は、同一のベクター上に保持させてもよく、
それぞれ別個に２又はそれ以上のベクターに保持させて
もよい。また、本発明のコリネ型細菌は、Ｌ−リジンの
生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成
する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損してい
てもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐して
Ｌ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒す
る酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼがある
（WO 95/23864参照）。
gdh遺伝子は、同一のベクター上に保持させてもよく、
それぞれ別個に２又はそれ以上のベクターに保持させて
もよい。また、本発明のコリネ型細菌は、Ｌ−リジンの
生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成
する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損してい
てもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐して
Ｌ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒す
る酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼがある
（WO 95/23864参照）。
【００３３】＜３＞Ｌ−グルタミン酸の生産 GDH活性が増幅され、かつＬ−リジン酸生産能を有する
コリネ型細菌を好適な培地で培養すれば、Ｌ−リジンが
培地に蓄積する。
コリネ型細菌を好適な培地で培養すれば、Ｌ−リジンが
培地に蓄積する。
【００３４】本発明の微生物を用いてＬ−リジンを製造
するのに用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及
び必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の
培地である。炭素源としては、グルコース、ラクトー
ス、ガラクトース、フラクトース、シュクロース、廃糖
蜜、澱粉加水分解物などの炭水化物、エタノールやイノ
シトールなどのアルコール類、酢酸、フマール酸、クエ
ン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
するのに用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及
び必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の
培地である。炭素源としては、グルコース、ラクトー
ス、ガラクトース、フラクトース、シュクロース、廃糖
蜜、澱粉加水分解物などの炭水化物、エタノールやイノ
シトールなどのアルコール類、酢酸、フマール酸、クエ
ン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
【００３５】窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウ
ム、酢酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、アンモ
ニア、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、酵母エキス、
コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物などの有
機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いること
ができる。
アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウ
ム、酢酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、アンモ
ニア、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、酵母エキス、
コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物などの有
機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いること
ができる。
【００３６】無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫
酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添
加される。有機微量栄養素としては、ビタミンＢ1など
の要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有さ
せることが望ましい。
酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添
加される。有機微量栄養素としては、ビタミンＢ1など
の要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有さ
せることが望ましい。
【００３７】培養は、振とう培養、通気撹拌培養等によ
る好気的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、培
養温度は３０℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜９に制御
する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるい
はアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用するこ
とができる。
る好気的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、培
養温度は３０℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜９に制御
する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるい
はアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用するこ
とができる。
【００３８】発酵液からのＬ−リジンの採取は、通常イ
オン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わ
せることにより実施できる。
オン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わ
せることにより実施できる。
【００３９】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。
説明する。
【００４０】＜１＞コリネ型細菌由来のgdh遺伝子の単
離とgdh遺伝子導入用プラスミドの作製コリネバクテリ
ウム・グルタミカムの既知のgdh遺伝子配列（Molecular
Microbiology (1992) 6 (3), 317-326）をもとに配列
番号１及び２に示すプライマーを作製し、野生型ブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869の染色
体DNAを鋳型としてＰＣＲを行い、gdh遺伝子断片を得
た。ＤＮＡの合成はApplied Biosystems社製ＤＮＡ合成
機 model 380Bを使用し、ホスホアミダイト法を用いて
（Tetrahedron Letters(1981),22,1859参照）常法に従
って合成した。PCR反応は、宝酒造（株）製ＤＮＡサー
マルサイクラー PJ2000型を用い、TaqDNAポリメラーゼ
を用い、供給者により指定された方法に従って行なっ
た。増幅された遺伝子断片は、TAクローニングベクター
pCR2.1（Invitrogen社製）にクローン化した。構築した
プラスミドをpCRGDHと命名した。
離とgdh遺伝子導入用プラスミドの作製コリネバクテリ
ウム・グルタミカムの既知のgdh遺伝子配列（Molecular
Microbiology (1992) 6 (3), 317-326）をもとに配列
番号１及び２に示すプライマーを作製し、野生型ブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869の染色
体DNAを鋳型としてＰＣＲを行い、gdh遺伝子断片を得
た。ＤＮＡの合成はApplied Biosystems社製ＤＮＡ合成
機 model 380Bを使用し、ホスホアミダイト法を用いて
（Tetrahedron Letters(1981),22,1859参照）常法に従
って合成した。PCR反応は、宝酒造（株）製ＤＮＡサー
マルサイクラー PJ2000型を用い、TaqDNAポリメラーゼ
を用い、供給者により指定された方法に従って行なっ
た。増幅された遺伝子断片は、TAクローニングベクター
pCR2.1（Invitrogen社製）にクローン化した。構築した
プラスミドをpCRGDHと命名した。
【００４１】更に、クローン化したDNA断片をコリネ型
細菌に導入するために、同ＤＮＡ断片をシャトルベク夕
ーpVK7（特開平1O-215883号公報参照）に接続した。pCR
GDHを制限酵素EcoRI（宝酒造(株)製）にて切断して、同
じくEcoRIにて切断したpVK7と接続した。DNAの接続はDN
Aライゲーションキット（宝酒造(株)製）を用いて行っ
た。構築したプラスミドをpGDHmと命名した。pGDHmは、
マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を保持する。pG
DHmの構築過程を図１に示す。
細菌に導入するために、同ＤＮＡ断片をシャトルベク夕
ーpVK7（特開平1O-215883号公報参照）に接続した。pCR
GDHを制限酵素EcoRI（宝酒造(株)製）にて切断して、同
じくEcoRIにて切断したpVK7と接続した。DNAの接続はDN
Aライゲーションキット（宝酒造(株)製）を用いて行っ
た。構築したプラスミドをpGDHmと命名した。pGDHmは、
マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を保持する。pG
DHmの構築過程を図１に示す。
【００４２】pVK7は、以下のようにして、エシェリヒア
・コリ用ベクターであるpHSG299（Kmr；Takeshita, S.
et al., Gene, 61, 63-74, (1987)参照）にブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタムのクリプティックプラ
スミドであるpAM330を結合することによって構築した。
pAM330は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
ATCC13869株より調製した。pHSG299を一箇所切断酵素で
あるAvaII（宝酒造（株）製）にて切断し、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼにて平滑末端化したのち、HindIII（宝酒
造（株）製）にて切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにて
平滑末端化したpAM330と接続した。pHSG299に対するpAM
330の挿入方向により、生成した２種類のプラスミドをp
VK6、pVK7と命名し、pVK7を以下の実験に用いた。pVK7
は、E. coli及びブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタムの細胞中で自律複製可能であり、かつ、pHSG299
由来のマルチプルクローニングサイトとlacZ’を保持し
ている。
・コリ用ベクターであるpHSG299（Kmr；Takeshita, S.
et al., Gene, 61, 63-74, (1987)参照）にブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタムのクリプティックプラ
スミドであるpAM330を結合することによって構築した。
pAM330は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
ATCC13869株より調製した。pHSG299を一箇所切断酵素で
あるAvaII（宝酒造（株）製）にて切断し、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼにて平滑末端化したのち、HindIII（宝酒
造（株）製）にて切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにて
平滑末端化したpAM330と接続した。pHSG299に対するpAM
330の挿入方向により、生成した２種類のプラスミドをp
VK6、pVK7と命名し、pVK7を以下の実験に用いた。pVK7
は、E. coli及びブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタムの細胞中で自律複製可能であり、かつ、pHSG299
由来のマルチプルクローニングサイトとlacZ’を保持し
ている。
【００４３】＜２＞gdh搭載プラスミドのブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムＬ−リジン生産菌への導
入 （１）lysAの取得及びそれを含有するプラスミドの作製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株ATCC
13869株より常法に従い、染色体DNAを調製した。染色体
DNAよりPCRにより、argS、lysA及びこれらを含むオペロ
ンのプロモーターを含むＤＮＡ断片を増幅した。増幅に
用いたDNAプライマーとしては、コリネバクテリウム・
グルタミカムにおいて既知となっている配列（Molecula
r Microbiology 4(11), 1819-1830 (1990)、Molecular
and General Genetics 212, 112-119 (1988)参照）を基
にしてアルギニル−tRNAシンターゼ及びＤＤＣをコード
する約3.6kbの領域を増幅すべく、配列表の配列番号３
及び４に記載の塩基配列を有する各々23merの合成ＤＮ
Ａを用いた。ＤＮＡの合成はApplied Biosystems社製Ｄ
ＮＡ合成機 model 380Bを使用し、ホスホアミダイト法
を用いて（Tetrahedron Letters(1981),22,1859参照）
常法に従って合成した。また、PCR反応は、宝酒造
（株）製ＤＮＡサーマルサイクラー PJ2000型を用い、T
aqDNAポリメラーゼを用い、供給者により指定された方
法に従って行なった。増幅された3579bpの遺伝子断片の
クローン化用のベクターにはpHSG399を用いた。pHSG399
を制限酵素SmaI（宝酒造(株)製）にて切断し、増幅され
たlysAを含むＤＮＡ断片と接続した。この様にして取得
したATCC13869由来のlysAを有するプラスミドをp399LYS
Aと命名した。
リウム・ラクトファーメンタムＬ−リジン生産菌への導
入 （１）lysAの取得及びそれを含有するプラスミドの作製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株ATCC
13869株より常法に従い、染色体DNAを調製した。染色体
DNAよりPCRにより、argS、lysA及びこれらを含むオペロ
ンのプロモーターを含むＤＮＡ断片を増幅した。増幅に
用いたDNAプライマーとしては、コリネバクテリウム・
グルタミカムにおいて既知となっている配列（Molecula
r Microbiology 4(11), 1819-1830 (1990)、Molecular
and General Genetics 212, 112-119 (1988)参照）を基
にしてアルギニル−tRNAシンターゼ及びＤＤＣをコード
する約3.6kbの領域を増幅すべく、配列表の配列番号３
及び４に記載の塩基配列を有する各々23merの合成ＤＮ
Ａを用いた。ＤＮＡの合成はApplied Biosystems社製Ｄ
ＮＡ合成機 model 380Bを使用し、ホスホアミダイト法
を用いて（Tetrahedron Letters(1981),22,1859参照）
常法に従って合成した。また、PCR反応は、宝酒造
（株）製ＤＮＡサーマルサイクラー PJ2000型を用い、T
aqDNAポリメラーゼを用い、供給者により指定された方
法に従って行なった。増幅された3579bpの遺伝子断片の
クローン化用のベクターにはpHSG399を用いた。pHSG399
を制限酵素SmaI（宝酒造(株)製）にて切断し、増幅され
たlysAを含むＤＮＡ断片と接続した。この様にして取得
したATCC13869由来のlysAを有するプラスミドをp399LYS
Aと命名した。
【００４４】更に、p399LYSAをKpnI（宝酒造(株)製）と
BamHI（宝酒造(株)製）で切断することにより、lysAを
含むＤＮＡ断片を抽出した。このＤＮＡ断片を、pHSG29
9をKpnIとBamHIで切断したものと連結した。得られたプ
ラスミドをp299LYSAと命名した。p299LYSA構築の過程を
図２に示す。
BamHI（宝酒造(株)製）で切断することにより、lysAを
含むＤＮＡ断片を抽出した。このＤＮＡ断片を、pHSG29
9をKpnIとBamHIで切断したものと連結した。得られたプ
ラスミドをp299LYSAと命名した。p299LYSA構築の過程を
図２に示す。
【００４５】（２）変異型lysC、dapA及びdapBを併せ持
つプラスミドの作製 WO96/40934号国際公開パンフレットに記載のブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタム由来のdapAを有するプ
ラスミドpCRDAPAをKpnIおよびEcoRIにて切断し、dapAを
含むＤＮＡ断片を抽出し、ベクタープラスミドpHSG399
をKpnIおよびEcoRIにて切断したものと接続した。得ら
れたプラスミドをp399DPSと命名した。p399DPSをEcoR
I、SphIにて分解し、平滑末端化した後、dapAの断片を
抽出した。この断片を、WO96/40934号国際公開パンフレ
ットに記載のブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ム由来の変異型lysCを含むプラスミドp399AK9をSalIに
て切断し平滑末端化したものとライゲーションし、変異
型lysCとdapAが共存したプラスミドp399CAを構築した。
つプラスミドの作製 WO96/40934号国際公開パンフレットに記載のブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタム由来のdapAを有するプ
ラスミドpCRDAPAをKpnIおよびEcoRIにて切断し、dapAを
含むＤＮＡ断片を抽出し、ベクタープラスミドpHSG399
をKpnIおよびEcoRIにて切断したものと接続した。得ら
れたプラスミドをp399DPSと命名した。p399DPSをEcoR
I、SphIにて分解し、平滑末端化した後、dapAの断片を
抽出した。この断片を、WO96/40934号国際公開パンフレ
ットに記載のブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ム由来の変異型lysCを含むプラスミドp399AK9をSalIに
て切断し平滑末端化したものとライゲーションし、変異
型lysCとdapAが共存したプラスミドp399CAを構築した。
【００４６】尚、上記プラスミドpCRDAPAは、エシェリ
ヒア・コリAJ13106（FERM BP-5113）から常法によって
調製することができる。また、p399AK9は、p399AK9BをB
amHIで切断し、コリネ型細菌中でプラスミドを自律複製
可能にする能力をもつＤＮＡ断片（以下「Brevi.-ori」
と記す）を切り出し、セルフライゲーションすることに
より、得ることができる。また、p399AK9Bは、エシェリ
ヒア・コリAJ12691（FERM BP-4999）から常法によって
調製することができる。
ヒア・コリAJ13106（FERM BP-5113）から常法によって
調製することができる。また、p399AK9は、p399AK9BをB
amHIで切断し、コリネ型細菌中でプラスミドを自律複製
可能にする能力をもつＤＮＡ断片（以下「Brevi.-ori」
と記す）を切り出し、セルフライゲーションすることに
より、得ることができる。また、p399AK9Bは、エシェリ
ヒア・コリAJ12691（FERM BP-4999）から常法によって
調製することができる。
【００４７】次に、WO96/40934号国際公開パンフレット
に記載のブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由
来のdapBを有するプラスミドpCRDAPBをEcoRIにて切断、
平滑末端化した後、SacIにて切断し、dapBを含む2.0kb
のＤＮＡ断片を抽出した。dapA及び変異型lysCを有する
プラスミドp399CAをSpeIにて切断、平滑末端化した後、
SacIにて切断し、抽出したdapB断片と接続し、変異型ly
sC、dapA及びdapBを含むプラスミドを得た。このプラス
ミドをp399CABと命名した。pCRDAPBは、エシェリヒア・
コリAJ13107（FERM BP-5114）から常法によって調製す
ることができる。
に記載のブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由
来のdapBを有するプラスミドpCRDAPBをEcoRIにて切断、
平滑末端化した後、SacIにて切断し、dapBを含む2.0kb
のＤＮＡ断片を抽出した。dapA及び変異型lysCを有する
プラスミドp399CAをSpeIにて切断、平滑末端化した後、
SacIにて切断し、抽出したdapB断片と接続し、変異型ly
sC、dapA及びdapBを含むプラスミドを得た。このプラス
ミドをp399CABと命名した。pCRDAPBは、エシェリヒア・
コリAJ13107（FERM BP-5114）から常法によって調製す
ることができる。
【００４８】次に、p399CABにBrevi.-oriを導入した。p
HM1519由来のBrevi.-oriを有するプラスミドpHK4を制限
酵素BamHI（宝酒造（株）製）にて切断し、切断面を平
滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造
（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。平滑
末端化後、リン酸化済みKpnIリンカー（宝酒造（株）
製）を接続し、pHK4よりBrevi.-ori部分のDNA断片をKpn
Iのみによる切断によって切り出される様改変した。こ
のプラスミドをKpnIにより切断し、生じたBrevi.-ori D
NA断片を同じくKpnIにて切断したp399CABに接続し、コ
リネ型細菌中で自律増殖可能でかつ変異型lysC、dapAお
よびdapBを併せ持つプラスミドを作製し、pCABと命名し
た。pCABの構築の過程を図３に示す。
HM1519由来のBrevi.-oriを有するプラスミドpHK4を制限
酵素BamHI（宝酒造（株）製）にて切断し、切断面を平
滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造
（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。平滑
末端化後、リン酸化済みKpnIリンカー（宝酒造（株）
製）を接続し、pHK4よりBrevi.-ori部分のDNA断片をKpn
Iのみによる切断によって切り出される様改変した。こ
のプラスミドをKpnIにより切断し、生じたBrevi.-ori D
NA断片を同じくKpnIにて切断したp399CABに接続し、コ
リネ型細菌中で自律増殖可能でかつ変異型lysC、dapAお
よびdapBを併せ持つプラスミドを作製し、pCABと命名し
た。pCABの構築の過程を図３に示す。
【００４９】（３）変異型lysC、dapA、dapB及びlysAを
併せ持つプラスミドの作製lysAを有するプラスミドp299
LYSAをKpnI及びBamHIにて切断し、平滑末端化した後、l
ysAの断片を抽出した。この断片を、pCABをHpaI（宝酒
造（株）製）にて切断し平滑末端化したものとライゲー
ションし、コリネ型細菌中で自律増殖可能でかつ変異型
lysC、dapA、dapB、及びlysAを併せ持つプラスミドを作
製し、pCABLと命名した。pCABLは、マーカーとしてクロ
ラムフェニコール耐性遺伝子を保持する。pCABL構築の
過程を図４に示す。尚、pCABL中で、lysAの断片はdapB
を含むＤＮＡ断片内のHpaI部位に挿入されているが、こ
のHpaI部位は、dapBのプロモーターよりも上流に位置し
ており、dapBは分断されていない。
併せ持つプラスミドの作製lysAを有するプラスミドp299
LYSAをKpnI及びBamHIにて切断し、平滑末端化した後、l
ysAの断片を抽出した。この断片を、pCABをHpaI（宝酒
造（株）製）にて切断し平滑末端化したものとライゲー
ションし、コリネ型細菌中で自律増殖可能でかつ変異型
lysC、dapA、dapB、及びlysAを併せ持つプラスミドを作
製し、pCABLと命名した。pCABLは、マーカーとしてクロ
ラムフェニコール耐性遺伝子を保持する。pCABL構築の
過程を図４に示す。尚、pCABL中で、lysAの断片はdapB
を含むＤＮＡ断片内のHpaI部位に挿入されているが、こ
のHpaI部位は、dapBのプロモーターよりも上流に位置し
ており、dapBは分断されていない。
【００５０】（４）gdh遺伝子で形質転換されたコリネ
型細菌Ｌ−リジン生産菌の作製上記のようにして作製し
たプラスミドpCABLで、ブレビバクテリウム・ラクトフ
ァーメンタムＬ−リジン生産菌であるAJ11082（NRRL B-
11470）を形質転換し、AJ11802/pCABLを得た。AJ11082
株は、AEC耐性の性質を有する。
型細菌Ｌ−リジン生産菌の作製上記のようにして作製し
たプラスミドpCABLで、ブレビバクテリウム・ラクトフ
ァーメンタムＬ−リジン生産菌であるAJ11082（NRRL B-
11470）を形質転換し、AJ11802/pCABLを得た。AJ11082
株は、AEC耐性の性質を有する。
【００５１】次に、上記形質転換体AJ11802/pCABLを、p
GDHmで形質転換した。pCABLがブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタム細胞中での複製起点としてpHM1519
由来のものを利用し、マーカー遺伝子としてクロラムフ
ェニコール耐性遺伝子を使用しているのに対し、pGDHm
はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム細胞中で
の複製起点としてpAM33O由来のものを利用し、マーカー
としてカナマイシン耐性遺伝子を用いているため、両プ
ラスミドがブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
細胞中で安定に保持される。この様にしてＬ−リジン生
合成系遺伝子を含むプラスミドとgdh遺伝子を含むプラ
スミドが共存した菌株、AJ11082/pCABL/pGDHmを取得し
た。
GDHmで形質転換した。pCABLがブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタム細胞中での複製起点としてpHM1519
由来のものを利用し、マーカー遺伝子としてクロラムフ
ェニコール耐性遺伝子を使用しているのに対し、pGDHm
はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム細胞中で
の複製起点としてpAM33O由来のものを利用し、マーカー
としてカナマイシン耐性遺伝子を用いているため、両プ
ラスミドがブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
細胞中で安定に保持される。この様にしてＬ−リジン生
合成系遺伝子を含むプラスミドとgdh遺伝子を含むプラ
スミドが共存した菌株、AJ11082/pCABL/pGDHmを取得し
た。
【００５２】＜３＞各形質転換体のGDH活性の測定 AJ11082、AJ11082/pCABL及びAJ11082/pCABL/pGDHmのGDH
活性を測定した。GDH活性は、E. R. Bormanらの方法（M
olecular Microbiology (1992) 6 (3), 317-326）に従
って行った。フラスコ培養液約10mlを、1500rpmで20秒
遠心してCaCO3を除いた後、上清を3000rpmで６分遠心し
て集菌した。集めた菌体を、200mM KP Buffer(pH 6.9)
で２回洗浄した後、KP Buffer 300μlに懸濁し、超音波
破砕した。破砕液を3000rpmで10分遠心した後、上清を
粗酵素液として以降の酵素反応実験に使用した。反応液
(100mM Tris-HCl (pH 8.0), 20mM NH4Cl, 10mMα-ケト
グルタル酸, 0.25mM NADPH）に粗酵素液を加え、340nm
での吸光度の変化を測定した。結果を表１に示す。表
中、lysC*は変異型lysC遺伝子を表す。また、GDH活性
は、AJ11082の活性を１としたときの相対値で示した。
その結果、AJ11082/pCABL/pGDHmは、AJ11082/pCABLに比
べ、GDH活性が約７倍上昇していた。
活性を測定した。GDH活性は、E. R. Bormanらの方法（M
olecular Microbiology (1992) 6 (3), 317-326）に従
って行った。フラスコ培養液約10mlを、1500rpmで20秒
遠心してCaCO3を除いた後、上清を3000rpmで６分遠心し
て集菌した。集めた菌体を、200mM KP Buffer(pH 6.9)
で２回洗浄した後、KP Buffer 300μlに懸濁し、超音波
破砕した。破砕液を3000rpmで10分遠心した後、上清を
粗酵素液として以降の酵素反応実験に使用した。反応液
(100mM Tris-HCl (pH 8.0), 20mM NH4Cl, 10mMα-ケト
グルタル酸, 0.25mM NADPH）に粗酵素液を加え、340nm
での吸光度の変化を測定した。結果を表１に示す。表
中、lysC*は変異型lysC遺伝子を表す。また、GDH活性
は、AJ11082の活性を１としたときの相対値で示した。
その結果、AJ11082/pCABL/pGDHmは、AJ11082/pCABLに比
べ、GDH活性が約７倍上昇していた。
【００５３】
【表１】 表１ ──────────────────────────────── 菌株／プラスミド 導入遺伝子 GDH活性（相対値） ──────────────────────────────── AJ11082 1.0 AJ11082/pCABL lysC*,dapA,dapB,lysA 1.0 AJ11082/pCABL/pGDHm lysC*,dapA,dapB,lysA,gdh 7.3 ────────────────────────────────
【００５４】＜４＞Ｌ−リジンの製造 AJ11O82、AJ11082/pCABL及びAJ11082/pCABL/pGDHmをＬ
−リジン生産培地にて培養し、そのＬ−リジン生産能を
評価した。Ｌ−リジン生産培地の組成は以下に示す通り
である。
−リジン生産培地にて培養し、そのＬ−リジン生産能を
評価した。Ｌ−リジン生産培地の組成は以下に示す通り
である。
【００５５】〔Ｌ−リジン生産培地〕炭酸カルシウム以
外の下記成分（１Ｌ中）を溶解し、ＫＯＨでｐＨ８．０
に調製し、１１５℃で１５分殺菌した後、別に乾熱殺菌
した炭酸カルシウムを５０ｇ加える。
外の下記成分（１Ｌ中）を溶解し、ＫＯＨでｐＨ８．０
に調製し、１１５℃で１５分殺菌した後、別に乾熱殺菌
した炭酸カルシウムを５０ｇ加える。
【００５６】 グルコース 100 g （ＮＨ4）2ＳＯ4 55 g ＫＨ2ＰＯ4 1 g ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 1 g ビオチン 500 μg チアミン 2000 μg ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.01 g ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.01 g ニコチンアミド 5 mg 蛋白質加水分解物（豆濃） 30 ml 炭酸カルシウム 50 g
【００５７】上記組成の培地に各形質転換体及び親株を
植菌し、31.5℃にて往復振盪培養を行った。培養４０時
間、７２時間後のＬ−リジン生成量、及び７２時間後の
生育（OD562）を表２に示す。生育は１０１倍希釈した
後、562nmにてＯＤを測定することにより定量した。そ
の結果、表２に示す通り、GDH強化株においてはＬ−リ
ジンの生産能の向上が確認された。
植菌し、31.5℃にて往復振盪培養を行った。培養４０時
間、７２時間後のＬ−リジン生成量、及び７２時間後の
生育（OD562）を表２に示す。生育は１０１倍希釈した
後、562nmにてＯＤを測定することにより定量した。そ
の結果、表２に示す通り、GDH強化株においてはＬ−リ
ジンの生産能の向上が確認された。
【００５８】
【表２】 表２ ──────────────────────────────────── 菌株／プラスミド 導入遺伝子 L-リシ゛ン生産量(g/L) 生育 40時間後 72時間後 (OD562/101 ) ──────────────────────────────────── AJ11082 22.0 29.8 0.450 AJ11082/pCABL lysC*,dapA,dapB,lysA 26.2 46.5 0.379 AJ11082/pCABL/pGDHm lysC*,dapA,dapB,lysA,gdh 27.0 48.5 0.401 ────────────────────────────────────
【００５９】
【発明の効果】本発明により、コリネ型細菌のＬ−リジ
ンの生産能を向上させることができる。
ンの生産能を向上させることができる。
【００６０】
【配列表】 Sequence Listing
【００６１】 <110> 味の素株式会社(Ajinomoto Co., Inc.) <120> Ｌ−リジンの製造法 <130> P-6282 <141> 1999-03-09 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0
【００６２】 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer amplifying gdh gene <400> 1 gctagcctcg ggagctctct aggag 25
【００６３】 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying gdh gene <400> 2 gatctttccc agactctggc cacgc 25
【００６４】 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying lysA gene <400> 3 gtggagccga ccattccgcg agg 23
【００６５】 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying lysA gene <400> 4 ccaaaaccgc cctccacggc gaa 23
【図１】 gdhを有するプラスミドpGDHmの構築の過程を
示す図。
示す図。
【図２】 lysAを有するプラスミドp299LYSAの構築の過
程を示す図。
程を示す図。
【図３】 変異型lysC、dapA、dapB及びBrevi.-oriを有
するプラスミドpCABの構築の過程を示す図。
するプラスミドpCABの構築の過程を示す図。
【図４】 変異型lysC、dapA、dapB、lysA及びBrevi.-o
riを有するプラスミドpCABLの構築の過程を示す図。
riを有するプラスミドpCABLの構築の過程を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者 木村 英一郎 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 (72)発明者 中松 亘 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 Ｆターム(参考） 2B150 DA48 DD11 DD26 4B024 AA03 BA72 CA03 DA10 EA04 FA15 GA11 GA19 HA01 4B064 AE25 CA02 CA19 CC24 CE11 DA11 4B065 AA22X AA24Y AA26X AB01 AC14 AC20 BA02 BA24 CA17 CA43
Claims (5)
- 【請求項１】 細胞中のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ
活性が増強され、かつＬ−リジン生産能を有するコリネ
型細菌。 - 【請求項２】 前記グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性
の増強が、前記細菌細胞内のグルタミン酸デヒドロゲナ
ーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めることによる
ものである請求項１記載のコリネ型細菌。 - 【請求項３】 前記グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコ
ードする遺伝子がコリネ型細菌由来である請求項２記載
のコリネ型細菌。 - 【請求項４】 さらに、アスパルトキナーゼ活性、ジヒ
ドロジピコリン酸レダクターゼ活性、ジヒドロジピコリ
ン酸シンターゼ活性、及びジアミノピメリン酸デカルボ
キシラーゼ活性の少なくとも一つが増強された請求項１
記載のコリネ型細菌。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか一項に記載のコ
リネ型細菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−リジンを
生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを採取するこ
とを特徴とするＬ−リジンの製造法。
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