CN1986777B - 活体催化工程菌及利用α-酮酸生产L型非天然疏水性氨基酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种活体催化工程菌及利用α-酮酸生产L型非天然疏水性氨基酸的方法。它是使用遗传诱变和强迫进化的方法，获得了一株能有效催化相应的α-酮酸生成L-tert-亮氨酸、δ-二甲基-戌氨酸和L-高苯丙氨酸的工程菌菌株(E.coli XW4)。利用E.coli XW4工程菌有效催化α-酮酸，直接生成L-tert-亮氨酸、δ-二甲基-戍氨酸和L-高苯丙氨酸。直接利用活细菌催化α-酮酸生成非天然氨基酸，无须制酶，省去酶的制备，减少基因克隆、表达和蛋白纯化过程。细菌活细胞可再生、重复使用。此外，不需要蛋白纯化设备以及减少高技术人员的需求。因此，可大大降低生产成本。
Description
技术领域：
本发明涉及的是L型非天然疏水性氨基酸的生产方法，特别是活体催化工程菌及其利用α-酮酸催化生产L型非天然疏水性氨基酸的方法。
背景技术：
L-tert-亮氨酸、δ-二甲基-戍氨酸和L-高苯丙氨酸等都是非天然氨基酸。这些氨基酸都是许多多肽药物合成的前体分子，如L-tert-亮氨酸，它的侧链头上具有三个甲基，是微管解聚抑制剂3’-(tert-丁基)-3’-脱酚基类似物合成的前体分子，同时还是HIV病毒I型蛋白酶多肽抑制剂的重要组成成分；高苯丙氨酸是半胱氨酸蛋白酶和生物流泵多肽抑制剂的组分。将这类非天然氨基酸导入药物多肽分子中可以极大地扩展多肽药物分子的结构和功能的歧异性，大大地增强了药物的效果和活体内抗水解作用。
与天然氨基酸不同，这三种L型非天然氨基酸不能通过生物发酵生产。目前国外主要是利用酶法进行生产，如利用苯丙氨酸脱氢酶(德国)或疏水氨基酸氨基转移酶(美国)将α-酮酸转变成相应的氨基酸。国内尚未见报道。酶法生产成本很高，主要表现在(1)需要克隆相应的酶基因并在合适的寄主中高效表达；(2)需要相应的设备和技术纯化酶蛋白；(3)酶的稳定性较差，容易失活，且不能反复使用；(4)需要较多的高素质的技术人员操作。如果能直接利用细菌活细胞将α-酮酸转变成相应的非天然氨基酸，则可减少基因克隆、表达和蛋白纯化过程。此外，细菌活细胞可再生、多次使用。
发明内容：
本发明的目的是提出一种利用具有活体催化功能的工程菌有效催化α-酮酸，直接生成L-tert-亮氨酸、δ-二甲基-戍氨酸和L-高苯丙氨酸，省去酶的制备，大大降低生产成本。
本发明是这样实现的。使用遗传诱变和强迫进化的方法，获得了一株能有效催化相应的α-酮酸生成L-tert-亮氨酸、δ-二甲基-戌氨酸和L-高苯丙氨酸的工程菌菌株。该工程菌于2006年6月12日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M206053(Escherichia coli XW4)，以下简称E.coli XW4。
E.coli XW4工程菌株的菌学特性：
形态特性：E.coli XW4菌株为大肠杆菌，菌体呈短杆状、无芽胞，具鞭毛能运动，革兰氏染色为阴性。
生理生化特性：大肠杆菌是生活在人和动物肠道中的埃希氏属细菌。E.coliXW4菌株具有大肠杆菌的生理生化特性，但能在去掉氮源并含有维生素B1和L-tert-亮氨酸或L-亮氨酸的M9基本培养基上生长，即能利用L-tert-亮氨酸或L-亮氨酸作为氮源。而野生型大肠杆菌则不能生长。
E.coli XW4菌株的获得：
首先使用遗传诱变方法，用达半致死剂量(LD50＝10mM)的亚硝酸钠处理大肠杆细菌(E.coli TG1)。让经过亚硝酸钠处理的细菌在加有20mM L-tert-亮氨酸但不含其它氮源的培养基上生长。待细菌生长后，用薄层层析(TLC)和逆向高压液相层析(HPLC)检测到细菌能利用培养基中的非天然氨基酸。然后使用逐渐减少选择性培养基中L-tert-亮氨酸的含量(15、10、5、2、1、0.5mM)的办法继续培养筛选菌株。当培养基中L-tert-亮氨酸的含量降到0.1mM时，分离单菌落并进行催化活性鉴定，最后得到工程菌株E.coli XW4。该活体菌株具有利用α-酮酸、直接催化生成L-tert-亮氨酸、δ-二甲基-戍氨酸和L-高苯丙氨酸的功能。
上述选择性培养基成分为：去掉氮源的M9基本培养基+维生素B1+L-tert-亮氨酸。在上述培养基中可以用δ-二甲基-戍氨酸、或者用L-高苯丙氨酸替代L-tert-亮氨酸。
活体催化α-酮酸生产L型非天然疏水性氨基酸的方法为：
在含有0.5-5mM非天然氨基酸作氮源的选择性培养基中36-38℃培养E.coli XW4菌株，然后按1∶200接种到LB培养基中培养10-15小时，离心收集细胞并用生理盐水洗去残存的培养基成分，得到活菌株。直接将活菌株细胞加入含有1∶1的谷氨酸和三种相应的α-酮酸的pH8.0反应体系内，使其细菌终浓度达0.8-1.4×109细胞/毫升。35-38℃条件下反应1-2小时后，离心收集上清液并进行非天然氨基酸产物的分离。
生成L型非天然疏水性氨基酸的催化反应机制是在底物为谷氨酸和相应α-酮酸的催化反应体系中，E.coli XW4菌株活体细菌经转氨作用将相应α-酮酸转变为非天然氨基酸，其反应式为：
其中α-酮酸分别为γ-三甲基丙酮酸、δ-二甲基戍酮酸或高苯丙酮酸，生成物非天然氨基酸即为上述的L-tert-亮氨酸、δ-二甲基-戍氨酸和L-高苯丙氨酸。反应产物可经过提取、分离、浓缩、包装成产品。
天然氨基酸即为上述的L-tert-亮氨酸、δ-二甲基-戍氨酸和L-高苯丙氨酸。反应产物可经过提取、分离、浓缩、包装成产品。
本发明具有明显的优点，直接利用活细菌催化α-酮酸生成非天然氨基酸，无须制酶，减少基因克隆、表达和蛋白纯化过程。细菌活细胞可再生、重复使用。此外，不需要蛋白纯化设备以及减少高技术人员的需求。因此，可大大降低生产成本。
附图说明
图1为工程菌E.coliW4催化非天然氨基酸生成的TLC检测结果。
具体实施方式
实施例
在含有0.5mM非天然氨基酸作氮源的选择性培养基中37℃培养E.coli XW4菌株，然后按1∶200接种到LB培养基中培养12小时，离心收集细胞并用生理盐水洗去残存的培养基成分，得到活菌株。直接将活菌株细胞加入含有1∶1的谷氨酸和三种相应的α-酮酸的pH8.0反应体系内，使其细菌终浓度达109细胞/毫升。37℃条件下反应0.5小时后，离心收集上清液并进行非天然氨基酸产物的分离。
反应体系为：
活细菌 109细胞/毫升 谷氨酸 5mM
α-酮酸 5mM TrisHC 200mM(pH8.0)
图1为工程菌E.coliW4催化非天然氨基酸生成的TLC检测结果。
其中C1为对照用的L-tert-亮氨酸，C2为对照用的谷氨酸，1和9：活细胞+谷氨酸+γ-三甲基丙酮酸，2和10：活细胞+谷氨酸+高苯丙酮酸，3和11：活细胞+谷氨酸+δ-二甲基戍酮酸，4：活细胞+谷氨酸，5：活细胞+γ-三甲基丙酮酸，6：活细胞+高苯丙酮酸，7：活细胞+δ-二甲基戍酮酸。
用L-谷氨酸和天然或非天然氨基酸相对应的α-酮酸作底物，在pH8.0和37℃条件下，按照上述反应体系进行催化反应，工程菌E.coli XW4不仅通过转氨酶反应催化非天然氨基酸的生成，而且能催化疏水性天然氨基酸的形成。表1中列出了工程菌XW4通过转氨酶反应催化天然氨基酸的实验结果。
表1：E.coli XW4活细胞催化20种α-酮酸形成氨基酸的实验结果
| 氨基酸 | 原始菌株 | 工程菌株 | 产物生成率(％) |
| 缬氨酸(Val)正缬氨酸(Nva)蛋氨酸(Met)亮氨酸(Leu)正亮氨酸(Nle)异亮氨酸(Ile)苏氨酸(Thr)丝氨酸(Ser)丙氨酸(Ala)甘氨酸(Gly)组氨酸(His)精氨酸(Arg)赖氨酸(Lys)半胱氨酸(Cys)天门冬氨酸(Asp)天门冬酰氨(Asn)酪氨酸(Tyr)色氨酸(Trp)高苯丙氨酸(Home-phe)苯丙氨酸(Phe)L-tert-亮氨酸δ-二甲基-戍氨酸 | - - - - - - - - - - - - - - + + - - - - - - | + + + + + + - - - - - - - - + + + + + + + + | 40 35 30 48 50 36 0 0 0 0 0 0 0 0 ND ND 16 18 28 40 50 14 |
表内+、-的含义：+表示能进行催化反应，-表示不能进行催化反应。ND表示未确定。
从表中可以看出，该菌株能有效地催化相应的α-酮酸生产五种非天然氨基酸，L-tert-亮氨酸、δ-二甲基-戍氨酸、高苯丙氨酸、正亮氨酸和正缬氨酸。同时也能催化七种天然氨基酸与相应α-酮酸的转化。
Claims (3)
1.一种活体催化工程菌E.coli XW4，其保藏号为CCTCC NO：M206053。
2.根据权利要求1所述的一种活体催化工程菌E.coli XW4催化α-酮酸生产L型非天然疏水性氨基酸的方法，其特征在于在含有0.5-5mM非天然氨基酸作氮源的选择性培养基中36-38℃培养E.coli XW4菌株，然后按1∶200接种到LB培养基中培养10-15小时，离心收集细胞并用生理盐水洗去残存的培养基成分，得到活菌株，直接将活菌株细胞加入含有1∶1的谷氨酸和γ-三甲基丙酮酸或δ-二甲基戍酮酸或高苯丙酮酸的pH8.0反应体系内，使其细菌终浓度达0.8-1.4x109细胞/毫升，35-38℃条件下反应1-2小时后，离心收集上清液并进行非天然氨基酸产物的分离。
3.根据权利要求1所述的一种活体催化工程菌E.coli XW4催化α-酮酸生产L型非天然疏水性氨基酸的方法，其特征在于在含有0.5mM非天然氨基酸作氮源的选择性培养基中37℃培养E.coli XW4菌株，然后按1∶200接种到LB培养基中培养12小时，离心收集细胞并用生理盐水洗去残存的培养基成分，得到活菌株，直接将活菌株细胞加入含有1∶1的谷氨酸和γ-三甲基丙酮酸或δ-二甲基戍酮酸或高苯丙酮酸的pH8.0反应体系内，使其细菌终浓度达109细胞/毫升，37℃条件下反应0.5小时后，离心收集上清液并进行非天然氨基酸产物的分离。
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